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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
DISSEMINAÇÃO DE DETERMINANTES GENÉTICOS DE
RESISTÊNCIA EM ISOLADOS CLÍNICOS DE TRÊS
UNIDADES HOSPITALARES DE LISBOA
Joana Filipa Cerqueira Costa
DISSERTAÇÃO
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA
2013
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
DISSEMINAÇÃO DE DETERMINANTES GENÉTICOS DE
RESISTÊNCIA EM ISOLADOS CLÍNICOS DE TRÊS
UNIDADES HOSPITALARES DE LISBOA
Joana Filipa Cerqueira Costa
DISSERTAÇÃO
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA
Orientadores:
Professora Doutora Aida Duarte (Faculdade de Farmácia da
Universidade de Lisboa)
Professora Doutora Ana Reis (Faculdade de Ciências da Universidade de
Lisboa)
2013
DISSEMINAÇÃO DE DETERMINANTES GENÉTICOS DE
RESISTÊNCIA EM ISOLADOS CLÍNICOS DE TRÊS
UNIDADES HOSPITALARES DE LISBOA
Joana Filipa Cerqueira Costa
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA
2013
Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Microbiologia do Instituto de
Investigação de Ciências Médicas e Farmacêuticas (iMed.UL) sob a orientação
direta da Prof.ª Doutora Aida Duarte no âmbito do Mestrado em Microbiologia
Aplicada da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa.
A Prof.ª Doutora Ana Reis foi a orientadora interna designada no âmbito do
Mestrado em Microbiologia Aplicada da Faculdade de Ciências da
Universidade de Lisboa.
AGRADECIMENTOS
À Prof.ª Doutora Aida Duarte pela orientação e pela sua constante motivação e ajuda ao longo
deste trabalho. Agradeço a confiança depositada em mim e no meu trabalho, por tudo o que
me ensinou e por me ter ajudado a desenvolver espírito crítico que certamente contribuiu para
o meu crescimento tanto a nível pessoal como profissional.
À Prof.ª Doutora Ana Reis pela disponibilidade e interesse demonstrados ao longo do trabalho
e pela sua constante motivação para a realização do mesmo.
À Neusa Figueiredo pela ajuda no laboratório, motivação que me transmitiu e pelos momentos
de descontração.
À Cláudia, Paula, Lavínia, D. Teresa, D. Conceição e Sr. Augusto pela ajuda e disponibilidade
demonstradas no laboratório.
Ao Instituto de Investigação de Ciências Médicas e Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia
da Universidade de Lisboa (iMed.UL) pela disponibilização dos meios necessários à realização
deste trabalho.
À minha irmã Ana e ao meu cunhado João pela ajuda em todas as etapas do meu crescimento
e em particular pelos conselhos e ajuda na realização deste trabalho.
Aos meus pais, pelo apoio e amor incondicional. Pela educação que me deram, por
incentivarem sempre os meus estudos e por me terem dado as condições para chegar até aqui
e fazerem de mim a pessoa que sou.
Ao Francisco, por todo o amor e por ser o meu apoio em tudo na vida.
APRESENTAÇÕES REALIZADAS DURANTE A DISSERTAÇÃO
Comunicações em forma de painel em congressos internacionais:
Costa, J., Dias, J., Peixoto, F., Pacheco, T., Pessanha, M.A., Marques, T., Duarte, A.;
Emergence of Escherichia coli sequence type 131 with KPC-2 carbapenemase in a Portuguese
Hospital. 23º European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID),
Berlim, Alemanha - 27 a 30 de Abril de 2013.
Comunicações em forma de painel em congressos nacionais:
Costa, J., Dias, J., Peixoto, F., Pacheco, T., Pessanha, M.A., Marques, T., Duarte, A.;
Emergence of Escherichia coli sequence type 131 with KPC-2 carbapenemase in a Portuguese
Hospital. 5th Postgraduate iMed.UL Students Meeting, Faculdade de Farmácia da Universidade
de Lisboa - 18 de Julho de 2013.
Caneiras, C., Costa, J., Almeida, E., Duarte, A.; High prevalence of CTX-M-15-producing
Klebsiella pneumoniae isolates since 2003, in Portugal. 5th Postgraduate iMed.UL Students
Meeting, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa - 18 de Julho de 2013.
RESUMO
A ocorrência de infeções causadas por bactérias resistentes aos antibióticos β-lactâmicos tem
aumentado significativamente nos últimos anos em bactérias da família Enterobacteriaceae,
principalmente em algumas espécies como Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. Estas
infeções são particularmente preocupantes em ambiente hospitalar, onde se encontram
indivíduos mais suscetíveis à infeção.
Este estudo teve como principal objetivo compreender os mecanismos envolvidos na
disseminação de estirpes bacterianas multirresistentes e identificar possíveis reservatórios que
permitem a perpetuação das mesmas em ambiente hospitalar. O estudo incidiu principalmente
sobre 26 isolados de K. pneumoniae e 7 isolados E. coli provenientes de diferentes amostras
recolhidas de doentes de três unidades hospitalares de Lisboa que englobam o Centro
Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO).
Determinou-se o perfil de suscetibilidade dos isolados aos antibióticos, genes de resistência e
ambiente genético dos mesmos, estabeleceu-se uma relação clonal entre os isolados por
determinação da sequence type (ST), e estudaram-se os mecanismos envolvidos na
transferência horizontal de genes através de técnicas de transferência genética como
conjugação e transformação por eletroporação.
Entre os isolados de E. coli, 4 eram produtores de uma carbapenemase KPC-2, variante mais
comum entre as enzimas da família KPC, frequentemente associadas a isolados de K.
pneumoniae. Este gene de resistência foi identificado num plasmídeo de aproximadamente 9
kb pertencente ao grupo de incompatibilidade IncF que foi transferido por eletroporação para a
estirpe de E. coli JM109, demonstrando o papel deste plasmídeo na disseminação do gene de
resistência blaKPC-2. Foi também identificada a sequência de inserção ISKpn6 a jusante do gene
blaKPC-2, sequência que faz parte de um transposão Tn4401 associado à disseminação mundial
destes genes. Verificou-se ainda que estes isolados pertencem à ST131, clone pandémico de
E. coli descrito como sendo responsável pela disseminação da enzima CTX-M-15.
Dos isolados de K. pneumoniae estudados, 19 eram produtores de uma β-lactamase de
espectro alargado CTX-M-15, a β-lactamase de espectro alargado (ESBL) mais disseminada
em todo o mundo. Dos 6 isolados para os quais se determinou a ST, identificou-se a ST15 em
5 isolados, um dos STs mais prevalentes em K. pneumoniae produtoras de enzimas da família
CTX-M. Identificaram-se ainda as sequências de inserção ISEcp1 e IS903 a montante e a
jusante do gene blaCTX-M-15, respetivamente, sequências que desempenham um papel
importante na mobilização deste gene.
Este estudo demonstrou a existência de disseminação intra- e inter-hospitalar de organismos
produtores de ESBLs que pode ser explicada pela facilidade de aquisição de elementos
genéticos móveis contendo os genes de resistência e pela sua propagação em clones
específicos. Torna-se urgente a implementação de medidas de controlo e prevenção de
disseminação destes organismos.
ABSTRACT
The occurrence of infections caused by resistant bacteria to β-lactam antibiotics has increased
significantly in recent years in Enterobacteriaceae, especially in some species such as
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. These infections are of particular concern in
hospitals, where patients are more susceptible to infections. The aim of this study was to
understand the mechanisms involved in the spread of multiresistant bacterial strains and
identify possible reservoirs that allow their perpetuation in the hospitals. The study focused
mainly on 26 isolates of K. pneumoniae and 7 isolates of E. coli isolated from different samples
collected from patients in three hospitals in Lisbon comprising the Centro Hospitalar de Lisboa
Ocidental (CHLO). The antibiotic susceptibility profile of the isolates was determined as well as
the resistance genes and their genetic environment. A clonal relationship was established
among the isolates by the determination of the sequence type (ST). The mechanisms involved
in the horizontal transfer of resistance genes were studied by conjugation and electroporation
techniques. Among the E. coli isolates, 4 were KPC-2 producers, the most common variant
among the KPC enzymes family, often associated with K. pneumoniae isolates. The plasmid
size was approximately 9 kb and it belongs to the IncF incompatibility group. This plasmid was
transferred by electroporation into the E. coli JM109 strain, demonstrating the role of this
plasmid in the spread of the blaKPC-2 gene. The insertion sequence ISKpn6 downstream the
blaKPC-2 gene was also identified. This insertion sequence is part of the transposon Tn4401
associated with the worldwide spread of the blaKPC genes. These isolates belong to ST131, an
E. coli pandemic clone described as being responsible for the spread of the CTX-M-15
enzymes. Among the K. pneumoniae isolates, 19 produced the extended spectrum β-lactamase
CTX-M-15, the most widespread extended spectrum β-lactamase (ESBL) worldwide. The ST
was determined in 6 isolates of which 5 isolates belong to ST15, one of the most prevalent STs
in K. pneumoniae CTX-M-producers. The insertion sequences ISEcp1 and IS903 were also
indentified upstream and downstream of the blaCTX-M-15 gene, respectively. These sequences
play an important role in the mobilization of these genes. This study demonstrated an intra- and
inter-hospital dissemination of ESBL-producing organisms that can be explained by the facility
of acquisition of mobile genetic elements containing the resistance genes and its propagation in
specific clones. It is necessary to implement measures to control and prevent the spread of
these organisms.
ÍNDICE
INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 1
Problemática da resistência aos antibióticos em Enterobacteriaceae ............................. 1
Antibióticos β-lactâmicos .................................................................................................. 1
Mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos ............................................... 2
β-lactamases de espectro alargado ................................................................................. 3
Mecanismos de disseminação de ESBLs em Enterobacteriaceae .................................. 6
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 10
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................ 11
Isolados Clínicos ......................................................................................................................... 11
Caracterização fenotípica dos isolados ...................................................................................... 11
Determinação do perfil de suscetibilidade aos antibióticos ............................................ 11
Caracterização genotípica dos isolados ..................................................................................... 12
Extração de DNA ............................................................................................................ 12
Tipificação molecular dos isolados ................................................................................. 12
M13-PCR fingerprinting e BOX-PCR fingerprinting ........................................... 12
Multilocus Sequence Typing (MLST) ................................................................. 12
Determinantes genéticos de resistência ..................................................................................... 13
Determinação do ambiente genético dos genes de resistência ................................................. 13
Identificação dos grupos de incompatibilidade de plasmídeos ................................................... 14
Extração de DNA plasmídico ...................................................................................................... 14
Transferência genética ................................................................................................................ 14
Conjugação..................................................................................................................... 14
Transformação................................................................................................................ 15
Purificação dos produtos de PCR e do DNA extraído do gel de agarose .................................. 16
Sequenciação e análise das sequências nucleotídicas .............................................................. 16
RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 17
Suscetibilidade aos antibióticos .................................................................................................. 17
Tipificação molecular dos isolados.............................................................................................. 21
Determinantes genéticos de resistência ..................................................................................... 24
Disseminação de determinantes genéticos de resistência ......................................................... 28
Determinação do ambiente genético dos genes de resistência ..................................... 28
Identificação dos grupos de incompatibilidade de plasmídeos ...................................... 30
Extração de DNA plasmídico .......................................................................................... 30
Transferência genética ................................................................................................... 33
Conjugação ........................................................................................................ 33
Transformação por eletroporação ..................................................................... 33
CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 37
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................ 38
ANEXOS ...................................................................................................................................... 45
1
INTRODUÇÃO
Problemática da resistência aos antibióticos em Enterobacteriaceae
A emergência de bactérias multirresistentes no ambiente hospitalar tem sido progressiva nas
últimas décadas, constituindo uma ameaça à saúde pública em todo mundo. A ocorrência
destas bactérias determina um aumento considerável no período de hospitalização, da
morbilidade e mortalidade e, paralelamente contribui para um aumento dos custos hospitalares.
Os pacientes hospitalizados, principalmente nas unidades de cuidados intensivos, são
particularmente suscetíveis à infeção hospitalar, dadas as suas condições clínicas, que exigem
procedimentos invasivos e terapia antimicrobiana.(1)
As infeções causadas por bactérias Gram-negativas são particularmente preocupantes uma
vez que estes organismos são altamente eficientes na aquisição de genes que codificam para
mecanismos de resistência, especialmente na presença de pressão seletiva causada pelo
antibiótico. Entre os microrganismos responsáveis por infeções adquiridas em meio hospitalar,
as bactérias da família Enterobacteriaceae são as mais identificadas.(2;3)
Antibióticos β-lactâmicos
A utilização excessiva ou inadequada dos antibióticos em humanos e animais acelerou o
aparecimento e a propagação de bactérias resistentes aos antibióticos.
Existem 4 principais mecanismos de ação dos antibióticos na célula bacteriana: inibição da
síntese da parede celular, inibição da síntese proteica, inibição da síntese de ácidos nucleicos
e inibição das vias metabólicas.(4)
Os antibióticos que inibem a síntese da parece celular
incluem o grupo dos β-lactâmicos: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemos e monobactamos
(Figura 1) e os glicopéptidos como a vancomicina e a teicoplanina.(5;6)
Figura 1: Estrutura dos principais grupos de antibióticos β-lactâmicos. O anel β-lactâmico está delineado
por um quadrado cinzento. (Figura adaptada de Rubtsova, M.Y., et al. 2010.(111)
)
Estes antibióticos atuam em fases diferentes da biossíntese da camada do peptidoglicano,
principal constituinte da parede celular das bactérias, afetando a integridade da parede celular
e levando à lise celular. Em bactérias Gram-negativas a camada de peptidoglicano é pouco
abundante e situa-se entre a membrana interna e a membrana externa da parede celular
enquanto em bactérias Gram-positivas o peptidoglicano tem uma espessura superior sendo
que a parede celular destas bactérias não possui membrana externa (Figura 2).
2
Figura 2: Esquema da estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
(Figura adaptada de Prescott, L. M., et al. 2005.(116)
)
O peptidoglicano é um heteropolímero constituído por cadeias lineares de dois açúcares
aminados, N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetil-murâmico (NAM), dispostos
alternadamente e unidos por ligações glicosídicas β (1→4). A cada molécula de NAM ligam-se
cadeias peptídicas normalmente de 4 aminoácidos, através de uma ligação amida. Estas
cadeias peptídicas estabelecem com as cadeias lineares vizinhas pontes interpeptídicas
(cross-linking), geralmente entre o grupo –NH2 do 3º aminoácido e o grupo –COOH do 4º
aminoácido da cadeia peptídica vizinha. A composição dos aminoácidos e as ligações
interpeptídicas são variáveis de espécie para espécie. A biossíntese do peptidoglicano é
constituída por 3 fases: fase citoplasmática, fase membranar e fase parietal. É na fase parietal
que as moléculas de NAM e NAG são colocadas na parede celular da bactéria em crescimento
e se dá a ligação entre estas moléculas e a parede existente. Essa ligação é mediada por
transglicolases, ocorrendo posteriormente a ligação entre o terceiro e o quarto aminoácido de
cadeias peptídicas vizinhas mediada por D-D-carboxitranspeptidases.
A vancomicina e a teicoplanina actuam na fase membranar da biossíntese do peptidoglicano,
por ligação aos resíduos terminais de D-alanina da cadeia nascente do peptidoglicano,
bloqueando o cross-linking necessário para a síntese da parede celular. Os antibióticos β-
lactâmicos impedem a biossíntese do peptidoglicano na fase parietal, inibindo irreversivelmente
as enzimas D-D-carboxitranspeptidases, presentes no folheto externo da membrana
citoplasmática, designadas por PBP (penicillin-binding-proteins) e que desempenham um papel
importante nos cross-linking parietais. Como resultado da paragem da síntese do
peptidoglicano, há indução de autolisinas bacterianas, ocorrendo a lise celular.(7)
Mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos
Os antibióticos β-lactâmicos constituem a primeira linha de opção terapêutica no tratamento de
infeções causadas por bactérias Gram-negativas devido ao seu largo espectro antimicrobiano e
baixa toxicidade para o homem.(8)
Contudo, a resistência a estes antibióticos tem sido
progressivamente descrita, constituindo um problema do ponto de vista clínico.
3
Diversos mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos têm sido descritos
nomeadamente: a modificação do alvo do antibiótico como mutações que alteram a estrutura
das PBPs; diminuição da concentração intracelular do antibiótico por alterações da
permeabilidade da membrana externa (ausência ou diminuição da expressão de genes que
codificam porinas e/ou bombas de efluxo, responsáveis pela expulsão do antibiótico do interior
da célula) e a produção de enzimas capazes de hidrolisar os antibióticos β-lactâmicos, como as
β-lactamases, inativando o antibiótico antes deste atingir o seu local de ação.
Entre os diferentes mecanismos que conferem resistência aos antibióticos β-lactâmicos, a
produção de β-lactamases é o mecanismo mais comum em bactérias Gram-negativas.(9)
As β-
lactamases hidrolisam a ligação amida do anel β-lactâmico do antibiótico, tornando-o inativo.
As β-lactamases podem ser classificadas com base na sua estrutura molecular (classificação
de Ambler)(10)
ou com base nas suas semelhanças funcionais (classificação de Bush-Jacoby-
Medeiros).(11)
A classificação de Ambler baseia-se nas sequências de aminoácidos das β-
lactamases, dividindo-as em quatro classes (A, B, C e D). As classes A, C e D englobam as
enzimas que possuem um resíduo serina no centro ativo para hidrolisar os β-lactâmicos
enquanto as enzimas da classe B possuem iões de zinco no seu centro ativo para a hidrólise
dos antibióticos β-lactâmicos, sendo designadas por metalo-β-lactamases. A classificação
funcional proposta por Bush tem em conta os substratos e os perfis de inibição agrupando as
enzimas de modo a que possam ser relacionadas com o seu fenótipo. Esta classificação é
importante no sentido em que permite relacionar as propriedades de uma enzima específica
com os perfis de resistência observados nos isolados clínicos. Nesta classificação as β-
lactamases são divididas em 4 grupos, cada um com vários subgrupos, com base nas
propriedades específicas de cada enzima. O grupo 1 corresponde ao grupo das
cefalosporinases e corresponde à classe C da classificação de Ambler. As enzimas deste
grupo hidrolisam todos os β-lactâmicos exceto os carbapenemos e não são inibidas pelo ácido
clavulânico. O grupo 2 corresponde às classes A e D de Ambler e representa o maior grupo de
β-lactamases, englobando vários tipos de β-lactamases (penicilinases, cefalosporinases,
oxacilinases e carbapenemases) inibidas pelo ácido clavulânico. Estão também incluídas neste
grupo as β-lactamases de espectro alargado (ESBLs). O grupo 3 compreende as β-lactamases
com iões de zinco no centro activo (metalo-β-lactamases) e corresponde à classe B da
classificação de Ambler. As enzimas deste grupo hidrolisam os carbapenemos e não são
inibidas pelo ácido clavulânico nem pelo tazobactam mas sim pelo EDTA (ácido etilenodiamino
tetra-acético). O grupo 4 faz também parte da classificação funcional e compreende as
penicilinases não inibidas pelo ácido clavulânico, que são raramente encontradas. Assim, este
grupo tem sido retirado de esquemas mais recentes devido à pouca informação disponível e
consequente caracterização incompleta deste grupo de enzimas.(12)
β-lactamases de espectro alargado
As β-lactamases podem ser codificadas por genes cromossomais ou por genes localizados em
elementos móveis como plasmídeos e transposões. A primeira β-lactamase plasmídica, TEM-1,
4
foi descrita numa estirpe de E. coli na década de 1960.(13)
Esta enzima é responsável pela
resistência à ampicilina, penicilina e cefalosporinas de 1ª geração como a cefalotina. Poucos
anos depois de ser descrita pela primeira vez, verificou-se uma disseminação mundial desta
enzima, facilitada pela sua localização em plasmídeos, sendo atualmente encontrada em
diferentes espécies da família Enterobacteriaceae e também em Pseudomonas aeruginosa,
Haemophilus influenzae, e Neisseria gonorrhoeae.(14)
Outra β-lactamase muito comum é a SHV-1 que foi pela primeira vez descrita num isolado de
K. pneumoniae.(117)
Esta enzima confere resistência à penicilina e cefalosporinas de 1ª geração
e pode ser codificada por genes cromossomais, como acontece na maioria dos isolados de K.
pneumoniae, e por genes localizados em plasmídeos, como acontece na maioria dos isolados
de E. coli.(14;15 )
Durante os anos seguintes foram desenvolvidas novas classes de antibióticos β-lactâmicos,
sendo que em 1980 foi introduzida uma nova classe de antibióticos, as cefalosporinas de 3ª
geração como a cefotaxima e a ceftazidima, para o tratamento de infeções causadas por
bactérias Gram-negativas.(14)
Como resultado da pressão seletiva causada por esses
antibióticos, surgiram novas variantes de β-lactamases com a capacidade de conferir
resistência a esses antibióticos. Devido ao seu largo espectro de actividade, estas enzimas
foram designadas β-lactamases de espectro alargado (ESBL). As ESBLs TEM e SHV terão
então derivado das β-lactamases TEM-1, TEM-2 e SHV-2 por mutações pontuais que
aumentam o seu espectro hidrolítico sobre cefalosporinas de largo espectro.(20)
A primeira β-
lactamase de espectro alargado foi descrita em 1983 numa estirpe de K. pneumoniae, na
Alemanha.(16)
A produção de β-lactamases de espectro alargado (ESBL) tornou-se o principal mecanismo de
resistência aos antibióticos β-lactâmicos e tem sido descrita mundialmente em vários géneros
da família Enterobacteriaceae, nomeadamente em E. coli e K. pneumoniae, e também noutras
famílias de bactérias nomeadamente em P. aeruginosa.(17)
Têm sido usadas várias definições para o termo ESBL, não existindo uma definição única.
Contudo, alguns autores propõem que ESBL é qualquer β-lactamase, geralmente adquirida e
não inerente a uma espécie, que confere resistência às cefalosporinas (mas não aos
carbapenemos), e que é inibida pelo ácido clavulânico.(18)
Atualmente já foram descritas mais
de 150 ESBLs diferentes a nível mundial.(14)
Os tipos de ESBLs mais frequentes são a TEM, SHV e CTX-M. Durante as décadas de 1980 e
1990, as ESBLs mais prevalentes eram a TEM e a SVH, principalmente associadas a K.
pneumoniae, enquanto que as CTX-M eram menos prevalentes.(20;14)
Apesar de ter sido
descrita uma enzima do tipo CTX-M pela primeira vez na Alemanha em 1989(19)
, só a partir da
primeira década de 2000 se tem verificado uma predominância destas enzimas em relação às
outras ESBLs.(21)
As enzimas CTX-M têm sido identificadas tanto em ambiente hospitalar como
na comunidade, sendo E. coli o principal organismo descrito como produtor destas enzimas.(22)
5
As enzimas CTX-M são agrupadas em cinco principais clusters: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8,
CTX-M-9, CTX-M-25, de acordo com a sua sequência de aminoácidos, embora haja autores
que considerem a existência de mais um cluster que inclui a CTX-M-45.(23;24)
Análises filogenéticas permitem concluir que as enzimas CTX-M não derivam de outras
enzimas por mutações pontuais mas sim da mobilização de genes cromossomais de Kluyvera
spp. que terão sido incorporados em elementos genéticos móveis.(21)
Estes genes iniciais
teriam uma maior atividade sobre a cefotaxima em comparação com a ceftazidima, perfil
hidrolítico que se verifica nas primeiras enzimas CTX-M descritas. Estas enzimas terão depois
adquirido mutações pontuais, provavelmente devido à pressão seletiva exercida pelos
antibióticos, que levou a um aumento da sua atividade hidrolítica em relação à ceftazidima(25;26)
,
como é o caso da CTX-M-15, atualmente considerada a ESBL mais disseminada no mundo(27)
,
representando 65% de todas as β-lactamases.(68)
Esta enzima foi pela primeira vez descrita na
Índia em 2001(29)
e deriva da CTX-M-3 por alteração de um aminoácido. Em Portugal foi pela
primeira vez descrita em 2003 num isolado de K. pneumoniae.(28)
Além da TEM, SHV e CTX-M, existem outras β-lactamases de espectro alargado como por
exemplo as enzimas PER, GES, VEB pertencentes à classe A da classificação de Ambler e as
enzimas OXA pertencentes à classe D da classificação de Ambler(24)
, que conferem resistência
à ampicilina e à cefalotina.(14)
Outra família de β-lactamases são as AmpC, pertencentes à
classe C da classificação de Ambler. Ao contrário das outras ESBLs, as β-lactamases AmpC
não são inibidas pelo ácido clavulânico mas sim pela cloxacilina. Muitas bactérias Gram-
negativas principalmente da família Enterobacteriaceae produzem AmpC cromossomais que
são indutíveis e podem aumentar o seu nível de expressão através da ocorrência de mutações
que lhes conferem resistência a cefalosporinas de espectro alargado como a cefotaxima,
ceftazidima e ceftriaxona. Este facto confere um problema em infeções por bactérias da família
Enterobacteriaceae no sentido em que um isolado inicialmente suscetível a estes antibióticos
se pode tornar resistente após a terapia. Fenómenos de recombinação genética mediada por
sequências de inserção terão levado à moblilização do gene AmpC para plasmídeos. A
ocorrência de bactérias com enzimas AmpC plasmídicas tem sido cada vez mais comum nos
últimos anos principalmente em isolados de E.coli, K. pneumoniae, e P. mirabilis.(30)
As AmpC
plasmídicas mais comuns pertencem às famílias CMY, FOX e DHA, sendo a CMY-2 a β-
lactamase AmpC mais disseminada a nível mundial.(31)
As carbapenemases são as β-lactamases com o espectro de atividade mais alargado(32)
, tendo
a capacidade de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas, monobactamos e carbapenemos como o
iminepeno e meropenemo. Estas enzimas pertencem às classes A, B e D da classificação de
Ambler. As carbapenemases da classe A incluem as famílias SME, IMI, NMC, GES e KPC,
sendo as da família KPC as mais prevalentes. A classe B (metalo-β-lactamases) engloba as
famílias IMP, VIM, SPM, GIM e SIM que foram inicialmente identificadas em P. aeruginosa,
tendo-se verificado nos últimos anos um aumento deste grupo de β-lactamases em
Enterobacteriaceae em todo o mundo. A classe D inclui as carbapenemases da família OXA.(33)
6
Os carbapenemos são considerados a primeira linha de tratamento de infeções causadas por
microrganismos da família Enterobacteriaceae produtores de β-lactamases de espectro
alargado, sendo que o seu uso no tratamento de infeções provocou uma pressão seletiva nas
bactérias patogénicas, levando à emergência das carbapenemases. A emergência de bactérias
resistentes aos carbapenemos é preocupante, uma vez que as opções terapêuticas se tornam
limitadas.(34)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) é a carbapenemase mais
prevalente e amplamente distribuída no mundo, sendo a KPC-2 a variante mais comum.(34;36)
A
maioria das β-lactamases KPC são codificadas por plasmídeos e são particularmente difíceis
de detetar no laboratório porque muitos isolados têm concentrações inibitórias mínimas ao
imipenemo e meropenemo que embora altas permanecem no nível “susceptivel”.(32)
A primeira
KPC, KPC-1 foi descrita num isolado clínico de K. pneumoniae na Carolina do Norte em
1996.(35)
A descoberta da primeira KPC-1 foi rapidamente seguida pelo aparecimento de uma
variante, a KPC-2. Recentemente por resequenciação concluiu-se que o gene blaKPC-1 é
idêntico ao gene blaKPC-2.(35;37)
Em 2001 foi descrita uma nova variante, a KPC-3 num isolado de
K. pneumoniae nos Estados Unidos(38)
, que difere da KPC-2 por uma alteração num
aminoácido.(33)
Desde a descoberta da KPC-1/2, foram descritas cinco variantes (KPC-3 a
KPC-7) em diferentes continentes, que diferem da KPC-1/2 no máximo em dois
aminoácidos.(39;40)
Os isolados de K. pneumoniae produtores de KPC disseminaram por todo o mundo e atingiram
proporções epidémicas nos Estados Unidos, Israel e Grécia, sendo que o número de casos
tem vindo a aumentar em todos os países da Europa.(69;70;71;72)
Embora a maioria das KPCs tenha sido identificada em isolados de K. pneumoniae, estas
enzimas já foram também identificadas noutros géneros e espécies da família
Enterobacteriaceae como E. coli(41)
Enterobacter spp.(42)
, Citrobacter spp.(43)
, Salmonella
spp.(44)
, Serratia marcescens(45)
e Proteus mirabilis.(46)
Mais recentemente foram também
descritas em isolados de P. aeruginosa e Pseudomonas putida.(47;48)
Em isolados de E. coli o gene blaKPC-2 foi já descrito em França(49)
, Israel(50)
, América do Sul(51)
,
Grécia(52)
e China(53)
, tendo sido pela primeira vez identificado um isolado clínico de E.coli
produtor de KPC-2 em Portugal no presente estudo.
Mecanismos de disseminação de ESBLs em Enterobacteriaceae
As bactérias da família Enterobacteriaceae têm sido os principais organismos responsáveis
não só por infeções nosocomiais como também por infeções adquiridas na comunidade. O uso
abusivo de antibióticos em humanos e animais, as infeções cruzadas a nível hospitalar, a
mobilidade de pacientes entre instituições de saúde, o comércio e as migrações terão
contribuído para a rápida disseminação de ESBLs tanto nos hospitais como na comunidade.
A disseminação de ESBLs está relacionada com a disseminação de clones específicos e/ou
plasmídeos, transposões ou integrões contendo os genes de resistência.(54)
Alguns clones terão favorecido a disseminação de ESBLs como é o caso do clone de E. coli
O25:H4-ST131, estirpe que se pensa ser responsável pela disseminação da enzima CTX-M-
15.(54)
Os isolados pertencentes a este clone possuem frequentemente plasmídeos IncFII, pelo
7
que a propagação dos genes blaCTX-M-15 parece estar relacionada com este grupo de
plasmídeos que permitem a persistência e disseminação dos mesmos.(24)
Em K. pneumoniae, o clone ST258 tem sido apontado como o responsável pela disseminação
dos genes blaKPC.(55)
Recentemente têm sido identificados outros clones associados à
disseminação das enzimas CTX-M em isolados de K. pneumoniae como é o caso do ST11 e
ST15.(24)
O “sucesso” destes clones deve-se em parte à sua capacidade de adquirir
plasmídeos, que transportam genes de resistência, principalmente plasmídeos dos grupos
IncFII, IncN e IncL/M.(56)
Os plasmídeos têm então um papel muito importante na disseminação de ESBLs entre
bactérias da mesma espécie ou espécies de famílias diferentes.(54)
Plasmídeos são fragmentos circulares de DNA de cadeia dupla extracromossomais, com
capacidade de replicação autónoma.(57)
Estão presentes em praticamente todas as espécies
bacterianas e embora não sejam essenciais para a célula bacteriana, podem conferir novas
funções que poderão ser vantajosas em determinadas condições ambientais, como o caso dos
genes de resistência aos antibióticos e genes que codificam para fatores de virulência
(adesinas, toxinas). O tamanho dos plasmídeos é muito variável, podendo ir desde 3 kilo pares
de bases (kb) a mais de 400 kb. Os plasmídeos conjugativos, ao contrário dos não
conjugativos, contêm genes que codificam para proteínas capazes de favorecer a sua
transferência para outras bactérias através da formação de pili, contribuindo para a proliferação
dos genes de resistência entre bactérias (Figura 3).
Figura 3: Esquema da transferência de plasmídeos entre bactérias. Há o reconhecimento entre as
bactérias dadora e recetora; contacto e formação de pili; corte de uma das cadeias do DNA plasmídico;
replicação do DNA plasmídico, transferência da cadeia simples para a célula recetora e síntese da cadeia
complementar; no final obtenção de duas bactérias dadoras. (Figura adaptada de
http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Vectores/vectores.html)
Outros elementos genéticos que podem transportar genes de resistência são os integrões e os
transposões que podem estar localizados em plasmídeos. Os integrões mais comuns são os
8
da classe I, constituídos por dois segmentos terminais conservados 5’CS e 3’CS (conserved
sequences) separadas por uma região variável. É na região variável que as cassetes
genéticas, moléculas circulares de DNA que contêm os genes de resistência aos antibióticos,
se podem inserir por recombinação, através do local attl do integrão. O número de cassetes
genéticas inseridas varia de integrão para integrão. A região conservada 5’CS contém o gene
int que codifica para uma integrase, o local de inserção das cassetes genéticas attI e um
promotor que permite a expressão das cassetes genéticas. A região conservada 3’CS contém
os genes qacEΔ1, que confere resistência a compostos quaternários de amónio, o gene suI,
que confere resistência a sulfonamidas e dois outros genes designados orf5 e orf6 (Figura
4).(58,59)
Figura 4: Esquema de um integrão da classe I: segmentos terminais conservados 5´CS e 3´CS; gene da
integrase int; local de inserção da cassete genética attl; sequência de inserção da cassete genética attC;
gene responsável pela resistência a compostos quaternários de amónio qacEΔ1; gene suI, que confere
resistência a sulfonamidas; genes orf5 e orf6 (open reading frames), cuja função não é totalmente
conhecida. (Figura adapta de Bennett, P. M. 2008.(59)
)
Os transposões são elementos genéticos capazes de se mover no genoma, de um local do
cromossoma para outro local no cromossoma ou de um local do cromossoma para um
plasmídeo e vice versa, ou de um plasmídeo para outro plasmídeo. Os transposões são
constituídos por duas sequências de inserção (IS) que flanqueiam uma sequência de DNA que
contém os genes que conferem resistência aos antibióticos. As duas sequências de inserção
localizadas nas extremidades do transposão são essenciais para a transposição deste
elemento genético.(59)
Estas estruturas incorporadas em plasmídeos conjugativos estarão na base da disseminação
de genes de resistência como os genes blaCTX-M.(24)
Estudos demonstram que a ISEcp1,
localizada a montante do gene blaCTX-M, é responsável pela mobilização deste gene. Esta
sequência desempenha então um papel importante na seleção e disseminação dos genes
blaCTX-M. Apesar de já terem sido identificadas outras sequências além da ISEcp1 a montante
dos genes blaCTX-M, como as ISCR1, IS10 e IS26, a ISEcp1 é a sequência de inserção mais
encontrada a montante de diferentes genes blaCTX-M.(60)
Apesar da informação acerca das
9
sequências de inserção a jusante deste gene serem menos conhecidas, a IS903 tem também
sido muitas vezes associada aos genes blaCTX-M.(61;62;63)
A disseminação mundial do gene blaKPC-2 deve-se em parte à sua localização num transposão
do tipo Tn3, o Tn4401. Este transposão tem aproximadamente 10 kb, é delimitado por duas
sequências repetidas invertidas e contém os genes da transposase (TnpA), da resolvase
(TnpR), o gene blaKPC-2 e duas sequências de inserção ISKpn7 (a montante do gene blaKPC-2) e
a ISKpn6 (a jusante do gene blaKPC-2). São ainda conhecidas 3 isoformas do Tn4401, que
diferem numa sequência de 100 a 200 pb a montante do gene blaKPC-2 (isoformas a, b e c).(64)
Foram já encontradas em estirpes clínicas de K. pneumoniae outras deleções a montante do
gene blaKPC, o que demonstra que esta região do transposão é instável e que existem outras
isoformas do Tn4401.(65)
Recentemente foi descrito um novo ambiente genético do gene
blaKPC-2 na China, que consiste numa região idêntica ao Tn4401 contendo o gene blaKPC-2 e a
sequência de inserção ISKpn6 a jusante do gene e uma sequência de inserção ISKpn8 a
montante do gene blaKPC-2. Neste ambiente genético foi ainda encontrado o gene blaTEM
truncado, localizado entre a ISKpn8 e o gene blaKPC-2.(66;67)
10
OBJETIVOS
Neste trabalho estudaram-se isolados bacterianos multirresistentes obtidos de diferentes
amostras biológicas pelo Laboratório de Patologia Clínica do Centro Hospitalar de Lisboa
Ocidental (CHLO), num intervalo de tempo de aproximadamente um ano (desde fevereiro de
2011 a março de 2012), de doentes dos três hospitais que o constituem: Hospital de São
Francisco Xavier, Hospital de Santa Cruz e Hospital de Egas Moniz. O principal objetivo foi
compreender os mecanismos que as bactérias utilizam na disseminação dos determinantes
genéticos de resistência aos antibióticos e também conhecer possíveis reservatórios destas
bactérias que poderão permitir a perpetuação das mesmas em ambiente hospitalar
aumentando a probabilidade de transmissão cruzada quer entre doentes da mesma unidade
quer entre as três unidades hospitalares.
No cumprimento destes objetivos foi realizada a caracterização fenotípica e genotípica de
isolados do mesmo doente identificados em datas diferentes, assim como de isolados
provenientes de diferentes doentes hospitalizados nas três unidades hospitalares. Na
caracterização fenotípica estudou-se a suscetibilidade aos antibióticos marcadores de
resistência com e sem inibidores pelo método de difusão em disco e determinou-se a C.M.I
(Concentração Mínima Inibitória) para alguns antibióticos pelo método Etest. Na caracterização
genotípica identificaram-se os genes de resistência através de reações de PCR com primers
específicos e posterior sequenciação; determinou-se a origem de replicação dos plasmídeos e
a existência de elementos móveis (transposões e integrões), pela técnica de PCR; efetuou-se a
tipificação molecular pela técnica de PCR fingerprinting e determinou-se por MLST a relação
clonal entre os isolados. Realizaram-se ainda técnicas de transferência genética
nomeadamente a conjugação e a transformação por eletroporação com o objetivo de conhecer
os mecanismos implicados na transferência horizontal de genes de resistência entre diferentes
isolados.
11
MATERIAL E MÉTODOS
Isolados Clínicos
Estudaram-se 42 isolados clínicos multirresistentes de K. pneumoniae (n=26), E. coli (n=7),
Enterobacter cloacae (n=8), Enterobacter amnigenus (n=1) identificados em diferentes
amostras biológicas pelo Laboratório de Patologia Clinica do CHLO, de doentes dos três
hospitais que o constituem, entre 2011 e 2012. Este estudo incidiu principalmente sobre
isolados de K. pneumoniae e E. coli por apresentarem um perfil multirresistente característico
de organismos produtores de β-lactamases de espectro alargado e representarem os três
hospitais em estudo.
Caracterização fenotípica dos isolados Determinação do perfil de suscetibilidade aos antibióticos
Inocularam-se os isolados bacterianos em meio de cultura Drigalsky, meio seletivo para
bactérias Gram-negativas, que cresceram a 37ºC durante 24 horas. Para cada isolado,
efetuou-se uma suspensão em água bidestilada estéril até se obter uma turvação equivalente
ao grau 0,5 da escala Mac Farland (1x106
UFC/mL) e procedeu-se à inoculação desta
suspensão em meio de cultura Müeller-Hinton. Com o auxílio de uma pinça colocaram-se os
discos de antibiótico sobre a superfície do meio inoculado. Testou-se assim a suscetibilidade
de cada isolado aos antibióticos pelo método de difusão em disco (método de Kirby-Bauer),
com discos de ciprofloxacina (5 μg), gentamicina (10 μg), cefoxitina (30 μg), cefotaxima (30 μg),
ceftazidima (30 μg), amoxicilina com ácido clavulânico (20/10 μg), cefepima (30 μg), imipenemo
(10 μg), meropenemo (10 μg), doripenemo (10 μg) e ertapenemo (10 μg). Após incubação a
37ºC durante 24 horas, interpretaram-se os halos de inibição de acordo com os critérios do
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (2013).(73)
Testou-se ainda a
suscetibilidade aos antimicrobianos com a adição de inibidores, nomeadamente ácido borónico
(20 mg/mL) e cloxacilina (10 mg/mL), com o objetivo de detetar carbapenemases do grupo A e
β-lactamases AmpC, respetivamente. Para tal, adicionou-se 10 µL do agente inibidor a cada
disco de antibiótico.
Determinaram-se também as concentrações mínimas inibitórias pelo método Etest em meio de
cultura Müeller-Hinton. Este método consiste na utilização de uma fita de plástico impregnada
com concentrações crescentes de antimicrobiano numa das suas faces. Na face oposta, está
impressa a escala das concentrações testadas (µg/mL), possibilitando a leitura do resultado.
Depois de inoculado o meio de cultura, dispuseram-se as tiras sobre o meio, colocando a face
da fita que contém o antimicrobiano voltada para a superfície do agar, permitindo a difusão do
gradiente antimicrobiano no agar, e, após incubação a 37ºC durante 24 horas, determinou-se a
suscetibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado.(112;113)
Utilizaram-se as tiras com cefotaxima (CT), ceftazidima (TZ), cefepima (PM), imipenemo (IP) e
meropenemo (MP). Utilizaram-se também as tiras com cefotaxima/cefotaxima + ácido
clavulânico (CT/CTL), ceftazidima/ceftazidima + ácido clavulânico (TZ/TZL) e
12
cefepima/cefepima + ácido clavulânico (PM/PML) para confirmar a presença de β-lactamases
de espectro alargado e a tira com imipenemo/imipenemo + EDTA (IP/IPI) para a pesquisa de
metalo-β-lactamases.
Caracterização genotípica dos isolados
Extração de DNA
Extraiu-se o DNA total de cada isolado pelo método de boiling-centrifugation: efetuou-se uma
suspensão bacteriana densa em 1 mL de água bidestilada estéril e aqueceu-se a 95ºC durante
10 minutos provocando a lise das paredes celulares e membranas e libertação dos
componentes celulares. Por centrifugação a 12000 rpm durante 4 minutos removeram-se os
resíduos celulares, recolheu-se o sobrenadante e conservou-se a -20ºC.
Tipificação molecular dos isolados
M13-PCR fingerprinting e BOX-PCR fingerprinting
De modo a identificar os perfis genómicos de cada isolado e estabelecer relações clonais entre
eles efetuou-se a caracterização genotípica dos isolados pelas técnicas de M13-PCR
fingerprinting(74)
e BOX-PCR fingerprinting.(75)
Para as reações de PCR usaram-se Ready-To-
GoTM
RAPD Analysis Beads (GE Healthcare) e utilizaram-se os termocicladores Biometra® T-
Personal e T-Gradient. Analisaram-se os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose
a 2%, em tampão TBE 1X (Tris 45 mM, ácido borónico 45 mM, EDTA 1 mM), corado com
brometo de etídio. Os primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo
(Tabela 1).
Multilocus Sequence Typing (MLST)
Realizou-se a técnica de MLST para 4 isolados de E. coli e 6 isolados de K. pneumoniae. As
reações de PCR realizaram-se num volume total de 25 µL e utilizou-se a NZYTaq 2X Green
Master Mix (NZYTech). Após análise dos produtos de PCR em gel de agarose a 1%, em
tampão TAE 1X (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM), procedeu-se à purificação e
sequenciação dos produtos de PCR.
Isolados de E. coli
Nos isolados de E. coli amplificaram-se os fragmentos dos genes adk (adenilato cinase), fumC
(fumarato hidratase), gyrB (DNA girase), icd (isocitrato/isopropilmalato desidrogenase), mdh
(malato desidrogenase), purA (adenilossuccinato desidrogenase), recA (local de ligação ao
ATP/GTP).(76)
Compararam-se as sequências nucleotídicas obtidas com as já existentes na base de dados da
University College Cork (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli).
Os primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo (Tabela 2).
13
Isolados de K. pneumoniae
Nos isolados de K. pneumoniae amplificaram-se os fragmentos dos genes gapA (gliceraldeído
3-fosfato desidrogenase), infB (fator de iniciação da tradução 2), mdh (malato desidrogenase),
pgi (fosfoglucose isomerase), phoE (fosfoporina E), rpoB (subunidade β da RNA polimerase B)
e tonB (transdutor energético periplasmático).(77)
Compararam-se as sequências nucleotídicas obtidas com as já existentes na base de dados do
Instituto Pasteur (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html).
Os primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo (Tabela 3).
Determinantes genéticos de resistência
Para os isolados que apresentaram resistência ou baixa suscetibilidade aos carbapenemos,
pesquisou-se inicialmente a presença de carbapenemases, usando primers específicos para o
gene blaKPC.(78)
Para os isolados que apresentaram resistência à cefotaxima (CTX) e à
ceftazidima (CAZ) pesquisou-se inicialmente a presença do gene blaCTX.(79)
Pesquisou-se ainda
a presença de genes que codificam para outras β-lactamases de espectro alargado,
nomeadamente os genes blaTEM(80)
, blaSHV(81)
, blaDHA(82)
, blaCMY(83)
, blaOXA-48(84)
, blaOXA-58(85)
e
blaFOX.(114)
Nos isolados de K. pneumoniae com resistência aos carbapenemos pesquisaram-se ainda os
genes que codificam para as porinas OmpK35(86)
e OmpK36(87)
, com o objetivo de estudar
alterações na permeabilidade da célula que pudessem intervir na resistência a estes
antibióticos. Os primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo (Tabela 4).
Nas reações de PCR usaram-se a DyNAzymeTM II PCR Master MIX (Finnzymes) e a NZYTaq
2X Green Master Mix (NZYTech), para um volume total de 20 µL e 25 µL respetivamente. Após
análise dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 1%, em tampão TAE (1X),
corado com brometo de etídio, procedeu-se à purificação e sequenciação dos produtos de
PCR.
Determinação do ambiente genético dos genes de resistência
Pesquisou-se a presença de alguns elementos do transposão Tn4401, associado ao gene
blaKPC-2.(88)
Pesquisaram-se as sequências de inserção ISKpn7 e ISKpn6, localizadas a
montante e a jusante do gene blaKPC-2, respetivamente, bem como os genes da transposase
(tnpA) e da resolvase (tnpR).(89)
Foram ainda desenhados no laboratório 3 conjuntos de primers
para a região a montante do gene blaKPC-2(115)
encontrada num novo ambiente genético do gene
blaKPC-2.(66)
Os primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo (Tabela 5).
Pesquisou-se também a presença das sequências de inserção ISEcp1 e IS903,
frequentemente associadas ao gene blaCTX-M.(90)
14
Pesquisou-se ainda a presença de integrões de classe I(91)
, usando primers específicos para a
amplificação dos segmentos conservados 5’ e 3’ a montante e a jusante da cassete genética
contendo os genes de resistência aos antibióticos.
Nas reações de PCR utilizou-se a NZYTaq 2X Green Master Mix (NZYTech), para um volume
total de 25 µL. Analisaram-se os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 1%,
em tampão TAE (1X), e procedeu-se à purificação e sequenciação dos produtos de PCR. Os
primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo (Tabela 6).
Identificação dos grupos de incompatibilidade de plasmídeos
Identificaram-se os grupos de incompatibilidade dos plasmídeos através da técnica de Replicon
Typing.(92)
Realizaram-se 5 reações de PCR multiplex e 3 reações de PCR simplex com dezoito
pares de primers específicos para as origens de replicação dos diferentes grupos de
incompatibilidade: IncHI1, IncHI2, IncI1-Iγ, IncX, IncL/M, IncN, IncFIA, IncFIB, IncW, IncY, IncP,
IncFIC, IncA/C, IncT, IncFIIAs, IncK, IncB/O, IncF.
Nas reações de PCR utilizou-se a NZYTaq 2X Green Master Mix (NZYTech), para um volume
total de 25 µL. Após análise dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 1%,
em tampão TAE (1X), procedeu-se à purificação e sequenciação dos produtos de PCR. Os
primers e as condições de PCR utilizadas estão descritos em anexo (Tabela 7).
Extração de DNA plasmídico
Na extração de DNA plasmídico utilizou-se a técnica desenvolvida por Kado e Liu (1981)(93)
, que
consiste numa desnaturação do DNA cromossomal por lise alcalina utilizando SDS (dodecil
sulfato de sódio), seguida de remoção de proteínas e outros compostos celulares por extração
com fenol-clorofórmio. O DNA plasmídico foi visualizado em gel de agarose a 0.7%, em tampão
TAE (1X) e corado com brometo de etídio. De seguida cortaram-se as bandas pretendidas do
gel de agarose, purificaram-se e pesquisou-se a presença dos genes que codificam para as β-
lactamases, previamente identificadas nos isolados.
Transferência genética
Conjugação
Após incubação dos isolados em meio Müeller-Hinton a 37ºC durante 24 horas, colocaram-se
cerca de 4 colónias da estirpe dadora em 5 mL de meio Brain Heart Infusion (BHI) e cerca de 4
colónias da estirpe recetora em 5 mL de meio BHI. Incubou-se com agitação a 37ºC, durante 3
horas. Utilizou-se como estirpe recetora E. coli J53 azida de sódio resistente.
Conjugação em Meio Líquido
Colocou-se 1 mL da cultura da estirpe dadora com 1 mL da cultura da estirpe recetora em 5 mL
de meio BHI. Incubou-se a 37ºC durante 24 horas sem agitação para permitir a conjugação.
Agitou-se no vórtex a mistura de estirpe recetora e dadora e inoculou-se 100 µL em meio
15
gelosado Müeller-Hinton suplementado com azida de sódio a 1 mg/mL (composto químico para
o qual a estirpe recetora é resistente e a dadora sensível) e cefotaxima 1 mg/mL (antibiótico
para o qual a estirpe recetora é sensível e a dadora resistente). O meio Müeller-Hinton
suplementado com azida de sódio a 1 mg/mL foi distribuído pelas caixas de petri e depois de
solidificado espalhou-se à superfície 100 µL da solução de cefotaxima 1 mg/mL, de forma a
selecionar os transconjugantes. Incubou-se a 37ºC durante 24 horas e efetuou-se o
antibiograma das estirpes transconjugantes.
Conjugação em Meio Sólido
Inoculou-se 50 µL da cultura da estirpe dadora e 50 µL da cultura da estirpe recetora à
superfície do meio gelosado Müeller-Hinton, sobrepondo as culturas para haver contacto direto
entre as duas estirpes e incubou-se a 37ºC durante 24 horas. Com a zaragatoa retiraram-se
todas as colónias da zona das culturas sobrepostas e colocaram-se em 10 mL de água
bidestilada estéril. Agitou-se no vórtex e inoculou-se 100 µL em meio gelosado Müeller-Hinton
suplementado com azida de sódio a 1 mg/mL e cefotaxima 1 mg/mL, como descrito
anteriormente, de forma a selecionar os transconjugantes. Incubou-se a 37ºC durante 24 horas
e efetuou-se o antibiograma das estirpes transconjugantes.
Transformação
Preparação de células competentes
Inoculou-se a estirpe E. coli JM109 em 10 mL de meio Luria-Bertani (LB) e incubou-se a 37ºC
durante 24 horas com agitação. Inoculou-se 250 mL de meio LB com 1mL de pré-inóculo e
incubou-se a 37ºC com agitação até se obter uma densidade ótica, a 600 nm, de 0,5 a 0,6.
Centrifugou-se a 5000 rpm (Beckman, rotor JA-14) a 4ºC durante 10 minutos e retirou-se o
sobrenadante. Lavou-se o sedimento com 50 mL de glicerol 10% (p/v) estéril por frasco de
centrífuga, centrifugou-se nas mesmas condições e repetiu-se a lavagem com glicerol.
Ressuspendeu-se o sedimento no glicerol remanescente após decantação e distribuíram-se
alíquotas de 40 µL em tubos eppendorf estéreis, colocados a -80ºC.
Eletroporação
Para a técnica de eletroporação utilizou-se DNA plasmídico extraído pela técnica desenvolvida
por Kado e Liu (1981), purificado com acetato de sódio e ressuspendido em água estéril.
Adicionou-se 1 µL de DNA previamente purificado ao tubo eppendorf contendo 40 µL de
células competentes e colocou-se na cubeta de eletroporação, com o cuidado de manter as
cubetas de eletroporação e os eppendorfs com as células competentes sempre no gelo.
Colocou-se a cubeta no electroporador e apertou-se o botão de choque. Após o choque,
adicionou-se 1 mL de meio BHI e retirou-se a solução da cubeta, passando-a para um tubo
falcon de 15 mL. Incubaram-se os tubos a 37ºC com agitação por 1 hora e plaqueou-se 100 µL
em meio Müeller-Hinton. Incubou-se a 37ºC durante 24 horas.
16
Purificação dos produtos de PCR e do DNA extraído do gel de agarose
Os produtos de PCR e o DNA extraído do gel de agarose foram purificados através do kit
NZYGelpure (Nzytech genes & enzymes).
Sequenciação e análise das sequências nucleotídicas
As sequências nucleotídicas foram sequenciadas pelo serviço da “STAB Vida” e
posteriormente comparadas com as existentes na base de dados recorrendo aos programas
informáticos BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e Clustal Omega
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
17
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Suscetibilidade aos antibióticos
Com o objetivo de determinar os perfis de resistência dos 42 isolados de Enterobacteriaceae
em estudo realizaram-se antibiogramas pelo método de difusão em disco, em meio de cultura
Müeller-Hinton. Os serviços hospitalares de onde foram isolados e os valores registados a
partir dos antibiogramas encontram-se em anexo (Tabela 8) e representados na Figura 5 para
os principais grupos de antibióticos testados.
Figura 5: Percentagem de isolados resistentes, sensíveis e com níveis intermédios de resistência aos
antibióticos gentamicina (GM), ciprofloxacina (CIP), amoxicilina com ácido clavulânico (AMC), cefoxitina
(FOX), ceftazidima (CAZ), cefotaxima (CTX) e imipenemo (IPM). O gráfico foi construído com os valores
registados a partir dos antibiogramas de 39 dos 42 isolados em estudo, uma vez que para os isolados 5,
8, e 14 de E. cloacae o número de antibióticos testados não foi suficiente para a construção do gráfico.
Verificou-se uma elevada percentagem de isolados resistentes à fluoroquinolona ciprofloxacina
(92,31%) e ao aminoglicosídeo gentamicina (76,92%) bem como para os antibióticos β-
lactâmicos amoxicilina com ácido clavulânico (92,31%), ceftazidima (87,18%) e cefotaxima
(76,92%). O imipenemo é o antibiótico com a maior percentagem de sensibilidade (76,92%). A
maioria dos isolados sensíveis ao imipenemo corresponde a isolados de K. pneumoniae que
apresentam resistência às cefalosporinas CAZ e CTX. Os isolados resistentes ao imipenemo
correspondem a 4 isolados de E. coli que apresentam também resistência às cefalosporinas
CAZ e CTX.
Estes resultados permitiram então estabelecer três principais grupos de bactérias
multirresistentes: um composto por 4 isolados de E. coli resistentes aos carbapenemos, em
particular ao IPM, e às cefalosporinas CTX e CAZ e um grupo composto por 19 isolados de K.
pneumoniae resistentes às cefalosporinas CTX e CAZ e sensíveis aos carbapenemos, perfil
que nos remeteu para a presença de β-lactamases de espectro alargado CTX-M.
Foi ainda selecionado um grupo composto por 7 isolados de K. pneumoniae das quais 4
apresentaram resistência à CTX e à CAZ e 3 apresentaram níveis intermédios ou suscetíveis à
CTX mas resistência à FOX e cefepima (FEP). Os 7 isolados foram selecionados
76,92
92,31 92,31
56,41
87,18
76,92
10,26
2,560,00 0,00 0,00 0,00
5,13
12,8220,52
7,69 7,69
43,59
12,8217,95
76,92
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
GM CIP AMC FOX CAZ CTX IPM
Pe
rce
nta
gem
de
iso
lad
os
(%)
Antibióticos
Resistente
Intermédio
Sensível
18
principalmente por apresentaram suscetibilidade ou níveis intermédios de resistência a dois
carbapenemos (imipenemo e meropenemo) e apresentarem resistência a outros dois
carbapenemos (doripenemo e ertapenemo).
Relativamente aos isolados de Enterobacter, selecionaram-se 5 isolados em que 3 deles
apresentaram resistência às cefalosporinas CTX, FOX e CAZ e resistência a alguns
carbapenemos nomeadamente ao imipenemo e ao ertapenemo, e 2 isolados porque
apresentaram suscetibilidade aos carbapenemos mas resistência às cefalosporinas FOX e
CAZ. Os valores obtidos a partir dos antibiogramas encontram-se em anexo (Tabela 8).
Realizaram-se ensaios com e sem inibidores de β-lactamases. Nos ensaios com inibidores
adicionou-se 10 μL do agente inibidor ao disco de antibiótico, nomeadamente ácido borónico e
cloxacilina com o objetivo de identificar carbapenemases do grupo A e β-lactamases AmpC,
respetivamente. Nestes ensaios, considera-se um resultado positivo quando se obtém um
aumento do halo de inibição superior a 5 mm com a adição do agente inibidor, relativamente ao
halo sem a adição do inibidor.
Embora se iniciasse o estudo com 7 isolados de E. coli, 2 não apresentaram um perfil de
resistência às cefalosporinas, típico de organismos produtores de β-lactamases de espectro
alargado, pelo que foram excluídos. 4 isolados (1, 2, 3 e 49) apresentaram o mesmo perfil de
suscetibilidade aos antibióticos (Figura 6a), com resistência a todos os antibióticos testados,
incluindo cefalosporinas e carbapenemos. O isolado 37 apresentou um perfil diferente dos
anteriores, com suscetibilidade aos carbapenemos e resistência à CTX e à CAZ (Figura 6b),
característica que permitiu prever que se trataria de um organismo produtor de uma β-
lactamases de espectro alargado do tipo CTX-M.
Figura 6: Antibiogramas dos isolados de E. coli. a) Perfil de resistência do isolado 49 à gentamicina (GM),
ciprofloxacina (CIP), ceftazidima (CAZ), imipenemo (IPM), cefotaxima (CTX), cefoxitina (FOX) e
amoxicilina + ácido clavulânico (AMC); b) Perfil de resistência do isolado 37.
Relativamente aos ensaios com inibidores, verificou-se um aumento significativo do halo de
inibição com a adição de ácido borónico aos discos de meropenemo, ertapenemo e
doripenemo (Figura 7) nos isolados 1, 2, 3 e 49 o que nos permitiu prever que se tratavam de
bactérias produtoras de carbapenemases da família KPC. Não se verificou alteração no
19
tamanho do halo de inibição com a adição de cloxacilina nem com o disco de antibiótico
contendo imipenemo + EDTA (EIP), o que permitiu concluir que os isolados não possuíam β-
lactamases AmpC nem metalo-β-lactamases.
Figura 7: Perfil de resistência do isolado 49 ao meropenemo (MEM), doripenemo (DOR), ertapenemo
(ETP) com e sem adição de ácido borónico (AB) e ao imipenemo + EDTA (EIP).
Para confirmar a presença de β-lactamases de espectro alargado nos isolados de E. coli
determinaram-se também as concentrações mínimas inibitórias pelo método Etest, utilizando
para o isolado 37 as tiras cefotaxima (CT), cefotaxima/cefotaxima + ácido clavulânico
(CT/CTL), ceftazidima (TZ), ceftazidima/ceftazidima + ácido clavulânico (TZ/TZL), cefepima
(PM), cefepima/cefepima + ácido clavulânico (PM/PML) e para os isolados 1, 2, 3 e 49 as tiras
imipenemo (IP), meropenemo (MP) e imipenemo + EDTA (IP/IPI). Estes 4 isolados
apresentaram concentrações mínimas inibitórias (CMIs) de 8-24 mg/L para o imipenemo e
meropenemo (Figura 8), relacionado com a produção de uma carbapenemase, não se tendo
verificado alterações significativas com a tira contendo imipenemo + EDTA, pelo que se excluiu
a hipótese de se tratar de um isolado produtor de uma metalo-β-lactamase.
Figura 8: Concentrações mínimas inibitórias do isolado 49 de E. coli entre 8-24 mg/L relativamente ao
imipenemo (IP) e ao meropenemo (MP).
O isolado 37 apresentou CMIs > 256 mg/L para a CT, TZ e PM, confirmando o seu perfil de β-
lactamase de espectro alargado. Utilizando as tiras CT/CTL, TZ/TZL, PM/PML é possível definir
um isolado como sendo ESBL positivo comparando com os seguintes valores de referência:
20
- valores de CT ≥ 0,5 e a razão CT/CTL ≥ 8, ou:
- valores de TZ ≥ 1 e a razão TZ/TZL ≥ 8, ou:
- valores de PM ≥ 0,25 e a razão PM/PML ≥ 8.
Os resultados obtidos para o isolado 37 utilizando as tiras TZ/TZL e PM/PML encontram-se na
Figura 9, e permitem-nos confirmar a presença de uma ESBL.
Figura 9: Resultados obtidos para o isolado 37 utilizando as tiras de Etest com ceftazidima (TZ),
ceftazidima/ceftazidima + ácido clavulânico (TZ/TZL), cefepima (PM) e cefepima/cefepima + ácido
clavulânico (PM/PML). CMI > 256 mg/L nas tiras TZ e PM; na tira TZ/TZL verifica-se um valor de TZ > 32
e TZL = 0,38 sendo a razão > 84; na tira PM/PML verifica-se um valor de PM > 16 e PML = 0,125 sendo a
razão > 128.
Realizaram-se também ensaios com os inibidores nos isolados de K. pneumoniae, tendo-se
adicionado cloxacilina aos discos contendo FOX, AMC, CAZ, CTX, FEP e IPM. Não se verificou
alteração do tamanho dos halos de inibição em nenhum isolado de K. pneumoniae
relativamente aos halos sem a adição do inibidor, o que nos permitiu excluir a hipótese de se
tratarem de isolados produtores de β-lactamases do tipo AmpC. O outro inibidor testado, ácido
borónico, foi adicionado ao IPM, MEM, DOR e ETP não se tendo verificado alteração do
tamanho dos halos de inibição em nenhum isolado à exceção do grupo de 7 isolados nas quais
se verificou um aumento do halo de inibição no disco com doripenemo + ácido borónico, o que
nos fez suspeitar da presença de uma carbapenemase.
Foi também utilizado o método Etest para confirmar o perfil de organismos produtores de β-
lactamases de espectro alargado, sendo que os valores das CMIs obtidos para a CT variaram
entre 8 mg/L a > 256 mg/L, para a TZ variaram entre 12 mg/L a > 256 mg/L e para a PM
21
variaram entre 24 mg/L a > 256 mg/L, níveis que permitem considerar os isolados resistentes a
estes antibióticos. Uma vantagem do método Etest é a possibilidade de confirmação da
presença de uma ESBL pelo aparecimento de uma zona “fantasma” ou deformação da elipse
no lado CT, TZ ou PM. Este facto resulta de uma sinergia entre o antibiótico β-lactâmico e a
difusão do ácido clavulânico para a zona CTL, TZL e PML. Foi possível observar o
aparecimento desta zona “fantasma” no isolado 24 de K. pneumoniae pertencente ao grupo de
isolados com um perfil de resistência às cefalosporinas e suscetibilidade aos carbapenemos
(Figura 10).
Figura 10: Isolado 24 de K. pneumoniae com aparecimento de uma zona “fantasma” na tira com
cefepima/cefepima + ácido clavulânico (PM/PML).
Tipificação molecular dos isolados
Com o objetivo de distinguir os perfis genómicos e avaliar a relação clonal entre os isolados
utilizaram-se métodos moleculares de tipificação nomeadamente M13-PCR e BOX-PCR
fingerprinting e a técnica de MLST (Multilocus Sequence Typing).
Relativamente aos isolados de E. coli, o método M13 fingerprinting permitiu estabelecer uma
relação genética entre os isolados 1, 2 e 49 (Figura 11a) e o método BOX fingerprinting revelou
uma semelhança entre o isolado 3 e os restantes isolados de E. coli. Foi então possível
estabelecer uma relação entre os isolados de E. coli 1, 2, 3, 49 e 37 por apresentarem o
mesmo perfil eletroforético. Estes isolados, relacionados entre si, (Tabela 1) eram provenientes
do Hospital de Santa Cruz. Os isolados 1 e 2 foram identificados de amostras de urina, do
mesmo doente, em que a 1ª amostra foi obtida na unidade de nefrologia e a 2ª amostra, 3
meses depois, no serviço de urgência. Os isolados 3, 49 e 37 foram identificados de diferentes
amostras biológicas provenientes de diferentes doentes e serviços hospitalares.
Quanto a K. pneumoniae, no grupo de 19 isolados previamente selecionados, foi possível
observar dois perfis distintos: B e C (Figura 11b), sendo o perfil B constituído por 13 isolados
bacterianos identificados em doentes diferentes e internados nas três unidades hospitalares, e
o perfil C encontrado no mesmo doente, com 4 dias de diferença, que esteve hospitalizado
neste período em duas unidades hospitalares (Hospital de Egas Moniz e Hospital de São
Francisco Xavier). Relativamente aos isolados de Enterobacter e ao grupo de 7 isolados de K.
pneumoniae previamente selecionado, os métodos de tipificação utilizados não foram
suficientes por si só para se conseguir estabelecer uma relação entre os isolados. A
informação relativa ao hospital, serviços hospitalares de onde foram obtidas as amostras, datas
das colheitas dos isolados e perfil eletroforético estão descritos na Tabela 1.
22
Figura 11: Perfis eletroforéticos obtidos pelos métodos de tipificação molecular M13 e BOX fingerprinting
em gel de agarose 2%. a) Perfil dos isolados de E. coli 1, 2 e 49 obtidos por M13 fingerprinting; b) Perfil
dos isolados de K. pneumoniae 25, 26, 28, 30, 31, 36, 39, 40, 23, 24, 35, 38, 41, 42 e 48 obtidos por BOX
fingerprinting onde é possível distinguir dois perfis diferentes, B e C, compostos por 13 e 2 isolados,
respectivamente. M: marcador de massas moleculares GeneRulerTM
1kb DNA ladder.
Tabela 1: Estirpe, data da colheita, amostra, serviço hospitalar e unidade hospitalar de onde foram
obtidos os isolados estudados e perfil eletroforético. (X: Isolados com perfis eletroforéticos distintos entre
si.)
Perfil
eletroforético
1 Escherichia coli 02-12-2011 Urina Nefrologia HSC A
2 Escherichia coli 14-03-2012 Urina Urgência geral HSFX A
3 Escherichia coli 26-12-2011 Sec.Resp. Cirurgia cardiotoracica HSC A
49 Escherichia coli 27-02-2012 Urina Transplante renal HSC A
37 Escherichia coli 09-11-2011 Pus Nefrologia HSC A
25 Klebsiella pneumoniae 14-09-2011 Urina internamento UCI HEM B
26 Klebsiella pneumoniae 22-09-2011 Urina Transplante renal HSC B
28 Klebsiella pneumoniae 13-07-2011 Sec.Bronq. Hematologia HSFX B
30 Klebsiella pneumoniae 13-07-2011 Urina UCIC Ortopedia HSFX B
31 Klebsiella pneumoniae 16-09-2011 Urina Oncologia HSFX B
36 Klebsiella pneumoniae 05-10-2011 Urina Urologia HEM B
39 Klebsiella pneumoniae 21-11-2011 Urina internamento UCI HEM B
40 Klebsiella pneumoniae 16-11-2011 Urina Internamento medicina IV HSFX B
23 Klebsiella pneumoniae 26-08-2011 Expetoração Internamento UCI HEM C
24 Klebsiella pneumoniae 30-08-2011 Expetoração Internamento cirurgia geral HSFX C
35 Klebsiella pneumoniae 21-10-2011 Urina Urologia HEM B
38 Klebsiella pneumoniae 20-11-2011 Urina Internamento UCI Cirurgia cardiotoracica HSC B
41 Klebsiella pneumoniae 13-11-2011 Hemo Urgência geral HSFX B
42 Klebsiella pneumoniae 13-11-2011 Hemo Urgência geral HSFX B
48 Klebsiella pneumoniae 09-03-2011 Urina Internamento cirurgia cardiotoracica HSC B
7 Klebsiella pneumoniae 28-03-2011 Sec.Resp. Internamento cirurgia cardiotoracica HSC X
17 Klebsiella pneumoniae 29-04-2011 Urina Internamento infecciologia HEM X
29 Klebsiella pneumoniae 01-02-2011 Urina Hematologia HSFX X
33 Klebsiella pneumoniae 23-09-2011 Pus Internamento UCI HSFX X
43 Klebsiella pneumoniae 25-11-2011 Urina Transplante renal HSC X
46 Klebsiella pneumoniae 28-11-2011 Urina Hematologia HSFX X
47 Klebsiella pneumoniae 07-01-2012 LPA Cirurgia geral UCI HEM X
Isolados HospitalServiço hospitalarAmostraData
colheitaEstirpe
23
Isolados adk fumC gyrB icd mdh purA recA ST
1, 3, 49, 37 53 40 47 13 36 28 29 131
Para uma melhor caracterização dos isolados bacterianos e para confirmar a sua relação
clonal, realizou-se a técnica de MLST para os perfis mais representativos obtidos pelos
métodos anteriores. Esta técnica consiste na amplificação de fragmentos internos de sete
genes housekeeping, genes constitutivos, característicos da espécie em estudo, que,
consoante as alterações nucleotídicas fornecem um perfil alélico para cada isolado. Os perfis
são analisados numa base de dados que permite então identificar os diferentes sequence types
(STs), por homologia com os perfis já descritos.
Utilizou-se esta técnica para os isolados 1, 3, 49 e 37 de E. coli (perfil A) e para os isolados de
K. pneumoniae 35 e 40 (perfil B) e 24 (perfil C). Aplicou-se também para os isolados de K.
pneumoniae 7, 17 e 29 que apresentaram pelos antibiogramas um perfil de resistência às
cefalosporinas e níveis intermédios e de resistência aos carbapenemos.
Nos isolados 1, 3, 49 e 37 de E. coli identificou-se a ST131, clone mundialmente disseminado e
apontado como sendo responsável pela disseminação da enzima CTX-M-15(54)
(Tabela 2).
Tabela 2: Perfil alélico obtido para os isolados 1, 3, 49 e 37 de E. coli, tendo em conta as sequências
nucleotídicas dos genes housekeeping adk (adenilato cinase), fumC (fumarato hidratase), gyrB (DNA
girase), icd (isocitrato/isopropilmalato desidrogenase), mdh (malato desidrogenase), purA
(adenilossuccinato desidrogenase) e recA (local de ligação ao ATP/GTP).
Nos isolados 35, 40, 7, 17 e 29 de K. pneumoniae identificou-se a ST15, clone que
recentemente tem vindo a ser associado à disseminação das enzimas CTX-M em isolados de
K. pneumoniae.(24)
No isolado 24, identificou-se uma ST diferente, resultado concordante com
os perfis obtidos pelo método de tipificação BOX fingerprinting. A ST identificada neste isolado
não está descrita na base de dados utilizada, sendo a ST mais próxima da encontrada a ST20,
cujas sequências nucleotídicas dos genes estudados diferem do isolado 24 apenas no gene
mdh (Tabela 3).
Tabela 3: Perfil alélico obtido para os isolados 35, 40, 24, 7, 17 e 29 de K. pneumoniae, tendo em conta
as sequências nucleotídicas dos genes housekeeping gapA (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase),infB
(factor de iniciação da tradução 2), mdh (malato desidrogenase), pgi (fosfoglucose isomerase), phoE
(fosfoporina E), rpoB (subunidade β da RNA polimerase B) e tonB (transdutor energético periplasmático).
(NE: perfil não encontrado na base de dados.)
24
Determinantes genéticos de resistência
Com o objetivo de estudar os mecanismos de resistência dos isolados bacterianos
pesquisaram-se os genes de resistência nomeadamente as carbapenemases KPC, OXA-48,
OXA-58 e as β-lactamases de espectro alargado CTX, TEM, SHV, DHA, CMY e FOX,
realizando reações de PCR.
Nos isolados de Enterobacter (designados por 28, 29, 30 e 32 na Figura 12) não foi encontrado
nenhum gene de resistência pesquisado, blaCTX e blaKPC, pelo que estes isolados não foram
utilizados em estudos posteriores. Nestes isolados podem estar presentes outros mecanismos
de resistência como alterações da permeabilidade da membrana, por alterações nos genes que
codificam porinas e/ou bombas de efluxo que permitam expulsar os antibióticos do interior da
célula.
De acordo com a Tabela 4, onde se resume os resultados obtidos para os genes de resistência
identificados verifica-se que nos isolados 1, 2, 3 e 49 de E. coli se obteve a amplificação do
gene blaKPC (Figura 12), resultado concordante com os valores encontrados nos antibiogramas
para os carbapenemos testados e com o aumento do halo de inibição no disco contendo ácido
borónico. Por sequenciação identificou-se o gene blaKPC-2. Obteve-se ainda a amplificação do
gene blaTEM, tendo-se identificado por sequenciação a β-lactamase TEM-1. Não se obteve
amplificação dos genes blaCTX, blaOXA-48, blaOXA-58 e blaSHV. Das 13 variantes até hoje descritas
da enzima KPC, a KPC-2 é a mais disseminada a nível mundial, principalmente em isolados de
K. pneumoniae. A presença de uma carbapenemase KPC-2 num isolado de E. coli pertencente
ao clone mundialmente disseminado ST131, foi descrito pela primeira vez em 2010 na
Irlanda.(94)
O clone de E. coli O25b:H4-ST131 tem sido associado à disseminação da enzima
CTX-M-15 em todo o mundo pelo que a presença do gene blaKPC-2 neste grupo clonal é
preocupante, podendo contribuir para a rápida disseminação deste gene.
Figura 12: Produtos de PCR relativos à amplificação do gene blaKPC de 871 pb (pares de bases) em gel
de agarose 1%. Resultados positivos nos isolados 1, 2, 3 e 49 de E. coli e resultados negativos nos
isolados 28, 29, 30 e 32 de Enterobacter. M: marcador de massas moleculares GeneRulerTM
1kb DNA
ladder.
25
Obteve-se a amplificação do gene blaCTX para o isolado 37 de E. coli e para os isolados 25, 26,
28, 30, 31, 36, 39, 40, 35, 24, 38, 41, 42 e 48 de K. pneumoniae que apresentaram resistência
às cefalosporinas CTX e CAZ e suscetibilidade aos carbapenemos (Figura 13). Os produtos de
PCR dos isolados 37, 36, 40, 35 e 24 foram purificados e por sequenciação identificou-se o
gene blaCTX-M-15. Entre as enzimas da família CTX-M, a enzima CTX-M-15 é a enzima mais
disseminada em todo o mundo em Enterobacteriaceae(27)
, sendo responsável pela resistência
verificada nestes isolados às cefalosporinas de 3ª e 4ª geração como a CTX, CAZ e FEP. Foi
ainda identificado o gene blaTEM neste conjunto de isolados. Foi sequenciado o gene do isolado
37 de E. coli e dos isolados 40 e 24 de K. pneumoniae, e identificado o gene blaTEM-1,
responsável pela resistência às penicilinas e cefalosporinas de 1ª geração. No isolado 37 de E.
coli não foi encontrado o gene blaSHV, contrariamente aos isolados 35, 40 e 24 de K.
pneumoniae, nos quais este gene foi encontrado. Por sequenciação dos genes blaSHV
identificou-se o gene blaSHV-28 nos isolados 35 e 40 e o gene blaSHV-12 no isolado 24. A enzima
SHV-12 foi descrita pela primeira vez em 1997(95)
em isolados de E. coli e K. pneumoniae e
deriva da variante SHV-5 por substituição de um aminoácido. Estudos demonstram que esta
enzima tem uma maior atividade hidrolítica para as cefalosporinas, nomeadamente a CAZ e a
CTX, comparativamente às variantes SHV-1 e SHV-2.(96)
A β-lactamase de espectro alargado
SHV-28, encontrada em dois isolados de K. pneumoniae deriva da enzima SHV-1 por
substituição num aminoácido e tem uma atividade hidrolítica preferencial para a CTX
relativamente à CAZ(97)
, perfil que se verifica nestes isolados em estudo (35 e 40). O gene
blaOXA-48 não foi encontrado em nenhum isolado de E. coli nem de K. pneumoniae.
Figura 13: Produtos de PCR relativos à amplificação do gene blaCTX de 544 pb em gel de agarose 1%.
Resultado positivo no isolado 37 de E. coli e nos isolados 23, 24, 25, 26, 28, 30, 31, 35, 36, 38, 39, 40, 41,
42 e 48 de K. pneumoniae. M: marcador de massas moleculares GeneRulerTM
1kb DNA ladder.
Relativamente aos 7 isolados de K. pneumoniae que apresentaram suscetibilidade ou níveis
intermédios de resistência ao IPM e MEM e resistência ao DOR e ao ETP (isolados 7, 17, 29,
43, 33, 46 e 47), não se obteve amplificação dos genes que codificam para as
carbapenemases blaKPC e blaOXA-48 e para as cefalosporinases blaDHA, blaCMY e blaFOX. Nos 4
26
isolados deste grupo (designados por 7, 17, 29 e 43) que apresentaram resistência à CTX e à
CAZ obteve-se a amplificação dos genes blaCTX, blaTEM e blaSHV.
Os genes pertencentes ao isolado 17 foram sequenciados, tendo-se identificado os genes
blaCTX-M-15, blaTEM-1 e blaSHV-1. Nos 3 isolados (designados por 33, 46 e 47) que apresentaram
níveis intermédios ou suscetíveis à CTX mas resistência à FOX e à FEP foi identificado apenas
o gene blaSHV-1, gene responsável pela resistência às penicilinas e cefalosporinas de 1ª
geração.
Tabela 4: Principais genes de resistência identificados nos isolados estudados, bem como os hospitais de
onde foram obtidos. (+: amplificação positiva; - : amplificação negativa; NA: não aplicável; NP: não
pesquisado.)
Sendo um dos mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos a alteração da
permeabilidade da membrana externa por ausência ou diminuição da expressão de genes que
codificam porinas e visto que, nos 7 isolados de K. pneumoniae que apresentaram
suscetibilidade ou níveis intermédios de resistência ao IPM e MEM e resistência ao DOR e ao
ETP, apresentaram resultados negativos para a presença da carbapenemase KPC, foi
pesquisada a presença das porinas OmpK35 e OmpK36, as duas principais porinas produzidas
por K. pneumoniae. A maioria dos isolados clínicos de K. pneumoniae não produtores de
KPC CTX OXA-48 OXA-58 SHV TEM
1 Escherichia coli HSC KPC-2 - - - - +
2 Escherichia coli HSFX KPC-2 - NP - NP NP
3 Escherichia coli HSC KPC-2 - - - - +
49 Escherichia coli HSC KPC-2 - - - - +
37 Escherichia coli HSC NA CTX-M-15 - NP - TEM-1
25 Klebsiella pneumoniae HEM NA + - NP NP NP
26 Klebsiella pneumoniae HSC NA + - NP NP NP
28 Klebsiella pneumoniae HSFX NA + - NP NP NP
30 Klebsiella pneumoniae HSFX NA + - NP NP NP
31 Klebsiella pneumoniae HSFX NA + - NP NP NP
36 Klebsiella pneumoniae HEM NA CTX-M-15 - NP NP NP
39 Klebsiella pneumoniae HEM NA + - NP NP NP
35 Klebsiella pneumoniae HEM NA CTX-M-15 - NP SHV-28 +
40 Klebsiella pneumoniae HSFX NA CTX-M-15 - NP SHV-28 TEM-1
24 Klebsiella pneumoniae HSFX NA CTX-M-15 - - SHV-12 TEM-1
38 Klebsiella pneumoniae HSC NA + - NP NP NP
41 Klebsiella pneumoniae HSFX NA + - NP NP NP
42 Klebsiella pneumoniae HSFX NA + - NP NP NP
48 Klebsiella pneumoniae HSC NA + NP NP NP NP
7 Klebsiella pneumoniae HSC - + - - + +
17 Klebsiella pneumoniae HEM - CTX-M-15 - - SHV-1 TEM-1
29 Klebsiella pneumoniae HSFX - + - - + +
43 Klebsiella pneumoniae HSC - + - NP + +
33 Klebsiella pneumoniae HSFX - - - NP SHV-1 -
46 Klebsiella pneumoniae HSFX - - - NP + -
47 Klebsiella pneumoniae HEM - - - NP + -
β-lactamasesEstirpe HospitalIsolados
27
ESBLs expressam as duas porinas OmpK35 e OmpK36, enquanto que a maioria dos isolados
clínicos produtores de ESBLs, expressam apenas a porina OmpK36.(98)
Foram já identificados
isolados de K. pneumoniae com perda de expressão das duas porinas OmpK35 e OmpK36. A
ausência de porinas é apontada como uma importante causa de resistência aos antibióticos,
particularmente aos antibióticos β-lactâmicos.(99)
Estirpes que não possuem nenhuma destas
porinas apresentam uma maior resistência do que estirpes que expressam apenas uma ou as
duas porinas.(100)
Alguns estudos revelam que a porina OmpK35 permite a eficiente entrada da
cefoxitina, cefotaxima e carbapenemos nas células bacterianas mas tem havido alguma
controvérsia no papel desta porina na penetração das cefalosporinas em K. pneumoniae.(101)
Estudos recentes indicam que a presença da porina OmpK35 está mais relacionada com a
suscetibilidade à ceftazidima do que com a suscetibilidade à cefotaxima e ceftriaxona,
enquanto que a expressão da porina OmpK36 é mais observada em isolados suscetíveis à
cefotaxima.(102)
A perda da porina OmpK36 está então associada ao aumento da resistência à
cefoxitina e outras cefalosporinas em estirpes produtoras de ESBLs e ao aumento da
resistência aos carbapenemos em estirpes produtoras de β-lactamases AmpC plasmídicas.(103)
Foi descrita uma variante da porina OmpK36 em isolados de K. pneumoniae, com a inserção
de dois aminoácidos adicionais num local conservado da proteína. Esta alteração da proteína
terá um papel importante na permeabilidade da célula, contribuindo para a resistência dos
isolados ao ertapenemo e reduzida suscetibilidade ao meropenemo.(104)
O gene que codifica a porina OmpK35 foi encontrado em todos os isolados estudados (7, 17,
29, 33, 43, 46 e 47), enquanto a OmpK36 foi encontrada em 5 isolados (7, 17, 29, 43 e 46).
Nos isolados 33 e 47 apenas foi identificada a porina OmpK35 o que pode explicar a sua maior
suscetibilidade à ceftazidima relativamente aos restantes isolados. A ausência da porina
OmpK36 pode em parte ser responsável pelo aumento da resistência aos carbapenemos. Nos
restantes isolados, uma análise mais detalhada seria necessária em termos de expressão ou
não da porina, uma vez que os resultados obtidos são apenas de presença/ausência, podendo
o gene estar presente e não estar a ser expresso.
Tendo em conta estes resultados, selecionaram-se os seguintes isolados para prosseguir no
estudo: 1, 2, 3 e 49 de E. coli ST131 produtores de uma carbapenemase KPC-2, o isolado 37
de E. coli ST131 produtor de uma β-lactamase de espectro alargado CTX-M-15, com o perfil
eletroforético A, o isolado 24 de K. pneumoniae, com o perfil eletroforético C e com um ST
distinto dos restantes, os isolados 35 e 40 de K. pneumoniae com o perfil eletroforético B e
ST15 e os isolados 7, 17, 29 e 43 de K. pneumoniae com perfis eletroforéticos distintos (X) e
com o mesmo ST15, todos eles produtores de uma β-lactamase de espectro alargado CTX-M-
15.
28
Disseminação de determinantes genéticos de resistência
Determinação do ambiente genético dos genes de resistência
A disseminação de β-lactamases de espectro alargado em Enterobacteriaceae está
relacionada com a disseminação de clones específicos e com a capacidade de aquisição de
elementos genéticos móveis como plasmídeos, transposões ou integrões, portadores de genes
de resistência.
A mobilização do gene blaKPC-2 tem sido associada à sua localização num transposão do tipo
Tn3, designado Tn4401. Este transposão contém os genes que codificam para a transposase
(tnpA) e para a resolvase (tnpR) e duas sequências de inserção ISKpn7 e ISKpn6 que
flanqueiam o gene blaKPC-2(64)
(Figura 14). Este transposão já foi descrito em isolados de
Enterobacteriaceae(56;65;105;106;107)
e P.aeruginosa(65;108)
de diferentes áreas geográficas e de
diferentes STs, inserido em plasmídeos de diferentes tamanhos e de diferentes grupos de
incompatibilidade(56;105;65)
, o que demonstra a sua elevada capacidade de transferência entre
isolados bacterianos. Foram já descritas três isoformas do transposão Tn4401 (isoformas a, b e
c), que diferem deste transposão por deleções entre 100 a 200 pb a montante do gene blaKPC-
2.(64)
Figura 14: Representação esquemática do transposão Tn4401 constituído por duas sequências invertidas
repetidas esquerda e direita (IRL e IRR), o gene que codifica para a resolvase (tnpR) e para a
transposase (tnpA), a sequência de inserção ISKpn7 a montante do gene blaKPC-2, o gene blaKPC-2 e a
sequência de inserção ISKpn6 a jusante do gene blaKPC-2. A posição das setas indica a orientação da
transcrição dos genes. (Figura adaptada de Naas, T., et al. 2008.(65)
)
Outras variantes deste transposão têm sido descritas, principalmente com alterações na região
a montante do gene blaKPC-2, o que indica que esta região do transposão é bastante instável. Na
China foi descrito um novo ambiente genético do gene blaKPC-2(66,67)
que consiste numa região
idêntica à do transposão Tn4401 que inclui os genes que codificam para o blaKPC-2 e uma
sequência de inserção em parte idêntica à ISKpn6 já descrita, designada ISKpn6-like a jusante
do gene. Uma nova estrutura, ISKpn8 foi identificada a montante do gene blaKPC-2. Foi ainda
encontrado o gene blaTEM truncado entre a sequência ISKpn8 e o gene blaKPC-2 (Figura 15).
Figura 15: Representação esquemática do novo ambiente genético descrito para o gene blaKPC-2
constituído pelos genes que codificam para a resolvase (tnpR) e transposase (tnpA) do transposão Tn3, a
sequência de inserção ISKpn8 a montante do gene blaKPC-2, a sequência ISKpn6-like a jusante do gene e
29
o gene blaTEM truncado entre a sequência ISKpn8 e o blaKPC-2. A posição das setas indica a orientação da
transcrição dos genes. (Figura adaptada de Shen, P., et al. 2009.(66)
)
Para os isolados de E. coli 1, 2, 3 e 49 nos quais foi identificado o gene que codifica para a
carbapenemase KPC-2 pesquisou-se então a presença dos elementos que constituem o
transposão Tn4401 através de reações de PCR usando primers específicos para os genes que
codificam para as sequências de inserção ISKpn7, ISKpn6 e ainda para os genes da
transposase e da resolvase, tnpA e tnpR. Obteve-se apenas a amplificação da sequência de
inserção a jusante do gene blaKPC-2, ISKpn6 que por sequenciação revelou ser idêntica à já
descrita na literatura como fazendo parte do transposão Tn4401. Não se verificou amplificação
dos genes que codificam para a resolvase, transposase nem para a sequência de inserção
ISKpn7. Assim, foram desenhados no laboratório primers para o novo ambiente genético
descrito na China e representado na Figura 15. Foram desenhados 3 conjuntos de primers: um
para uma zona interna da sequência de inserção ISKpn8, outro para uma zona compreendida
entre a ISKpn8 e o gene blaTEM truncado e outro para a zona compreendida entre o gene blaTEM
truncado e o gene blaKPC-2, descritos na seguinte Tabela:
Tabela 5: Primers desenhados no laboratório e condições de PCR utilizadas para a determinação do
ambiente genético do gene blaKPC-2. ISKpn8: região interna da sequência de inserção ISKpn8; ISKpn8T:
região compreendida entre a ISKpn8 e o gene blaTEM truncado; KPCT: região compreendida entre o gene
blaTEM truncado e o gene blaKPC-2. F: primer forward; R: primer reverse.
Não se verificou amplificação de nenhuma destas regiões, pelo que não foi possível identificar
os genes localizados a montante do gene blaKPC-2.
O ambiente genético do gene blaCTX-M-15 foi também estudado. Sabe-se que a emergência e
disseminação destas enzimas envolvem a aquisição de elementos móveis como a sequência
de inserção ISEcp1.(25)
Esta sequência de inserção tem um papel muito importante na
mobilização dos genes blaCTX-M e é a IS mais encontrada a montante de diferentes genes
blaCTX-M.(24)
Outros elementos móveis estão também envolvidos na mobilização destes genes
como a IS26 e a IS903 localizada a jusante do gene blaCTX-M. Foi então pesquisada a presença
dos genes que codificam para as sequências de inserção ISEcp1 e IS903 para o isolado 37 de
E. coli e para os isolados 24, 35, 40, 7, 17, 29 e 43 de K. pneumoniae. Em todos eles foi
identificado o gene que codifica para a sequência de inserção ISEcp1 a montante do gene
blaCTX-M-15. A sequência de inserção IS903 foi encontrada em todos os isolados exceto no
isolado 37 de E. coli e no isolado 24 de K. pneumoniae, isolado este com um perfil genético e
ST distinto dos restantes isolados de K. pneumoniae. Em todos os isolados de K. pneumoniae
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-CATCCGAAAGTGGCAAAACC-3'
R: 5'-TGAAGCGGTCGGTGAACTG-3'
F: 5'-CAGTTCACCGACCGCTTCA-3'
R: 5'-TCATGCCATCCGTAAGATGC-3'
F: 5'-GGTGCCTCACTGATTAAGCA-3'
R: 5'-CCAACTCCTTCAGCAACAAA-3'
Primers
72ºC, 10min.KPCT 94ºC, 10min. 30 94ºC, 45seg. 62ºC, 45seg. 72ºC, 1min,30seg.
72ºC, 10min.
ISKpn8T 94ºC, 10min. 34 94ºC, 45seg. 56ºC, 45seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 10min.
ISKpn8 94ºC, 10min. 34 94ºC, 45seg. 56ºC, 45seg. 72ºC, 1min.
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
CiclosExtensão final
30
ST15 foram encontradas as duas sequências de inserção, ISEcp1 e IS903 a montante e a
jusante do gene blaCTX-M-15, sequências descritas como responsáveis pela mobilização deste
gene para diferentes plasmídeos e também de plasmídeos para o cromossoma bacteriano.
Foi ainda pesquisada a presença de integrões nos isolados 49 e 37 de E. coli e 35, 40, 24, 7,
17, 29 e 43 de K. pneumoniae, através de reações de PCR com primers específicos para a
amplificação dos segmentos terminais conservados 5’ e 3’ que separam a região variável do
integrão onde se localizam os genes de resistência aos antibióticos. Verificaram-se resultados
positivos para todos os isolados estudados, e por sequenciação identificou-se a presença de
um integrão de classe I contendo as regiões terminais conservadas 5’ e 3’ separadas por uma
região contendo o gene dhfrV, responsável pela resistência ao trimetoprim, no isolado 49 de E.
coli.
Identificação dos grupos de incompatibilidade de plasmídeos
Para investigar os mecanismos envolvidos na disseminação dos plasmídeos transportadores
dos genes de resistência descritos, foi pesquisada a origem de replicação dos plasmídeos
através da técnica Replicon Typing.(57)
Realizaram-se 5 reações de PCR multiplex e 3 reacções
de PCR simplex com dezoito pares de primers específicos para as origens de replicação dos
diferentes grupos de incompatibilidade. Nas reações de PCR multiplex pesquisaram-se os
grupos de incompatibilidade IncHI1, IncHI2, IncI1-Iγ; IncX, IncL/M, IncN; IncFIA, IncFIB, IncW;
IncY, IncP, IncFIC; IncA/C, IncT, IncFIIAs e nas 3 reacções de PCR simplex pesquisaram-se os
grupos de incompatibilidade IncK, IncB/O e IncF.
Nos isolados 1, 2, 3 e 49 de E. coli obtiveram-se resultados positivos para a amplificação dos
genes que codificam para os grupos de incompatibilidade IncFIA, IncFIB e IncF e no isolado 37
de E. coli obtiveram-se resultados positivos para a amplificação dos genes que codificam para
os grupos de incompatibilidade IncFIA e IncF. Em K. pneumoniae obteve-se resultado positivo
para a amplificação do grupo IncN no isolado 7. Em todos os outros isolados não se obteve
resultado positivo para nenhum dos grupos de incompatibilidade pesquisado. Estes resultados
são concordantes com os descritos na literatura que revelam que a disseminação do gene
blaCTX-M-15 em E. coli está relacionada com plasmídeos do grupo de incompatibilidade
IncFII(27;109)
, e que em isolados de K. pneumoniae produtores da β-lactamase CTX-M, os
grupos de incompatibilidade de plasmídeos mais encontrados são os grupos IncFII, IncN e
IncL/M.(56)
Extração de DNA plasmídico
Para determinar a presença de plasmídeos nos isolados bacterianos, realizou-se a técnica de
extração de DNA plasmídico desenvolvida por Kado e Liu (1981), para os isolados 49 e 37 de E.
coli e 24, 35, 40, 7, 17, 29 e 43 de K. pneumoniae.
Foi possível a identificação de plasmídeos em todos os isolados estudados, sendo que nos
isolados 49 e 37 de E. coli e 43 de K. pneumoniae se observa a presença de mais do que um
plasmídeo (Figura 16). No entanto, tendo em conta que as moléculas de DNA plasmídico
31
podem existir em diferentes conformações com diversos graus de superenrolamento, estes
isolados podem não apresentar vários plasmídeos mas sim várias isoformas do mesmo
plasmídeo resultando na visualização de várias bandas no gel de agarose. Os isolados 49
(portador de uma carbapenemase KPC-2) e 37 (portador de uma β-lactamase de espectro
alargado CTX-M-15) de E. coli apresentam duas isoformas do plasmídeo com o mesmo
tamanho, sendo que o isolado 49 apresenta uma forma mais pequena, de aproximadamente 9
kb, que não se verifica no isolado 37.
Nos isolados 35 e 40 de K. pneumoniae idênticos tanto pelos métodos de tipificação anteriores
como em termos de genes de resistência que transportam (CTX-M-15 e SHV-28), é possível a
identificação de dois plasmídeos de diferentes tamanhos, sendo o tamanho do plasmídeo do
isolado 40 semelhante ao do isolado 17, portador de uma CTX-M-15, SHV-1 e TEM-1. O
plasmídeo do isolado 24, que transporta os genes de resistência CTX-M-15, SHV-12 e TEM-1,
é superior ao dos restantes isolados. Esta análise permite demonstrar a variabilidade de
plasmídeos presente entre os diferentes isolados, plasmídeos estes que, tendo a capacidade
de aquisição de diferentes genes de resistência são um veículo para a disseminação dos
mesmos.
Figura 16: Visualização do DNA plasmídico em gel de agarose 0,7%. a) Visualização de DNA plasmídico
extraído nos isolados 49 e 37 de E. coli e 24, 7, 29 e 43 de K. pneumoniae; b) visualização de DNA
plasmídico extraído nos isolados 35, 40 e 17 de K. pneumoniae. É possível a observação dos fragmentos
cromossomais e do RNA. M: marcador de massas moleculares GeneRulerTM
1kb DNA ladder.
Para avaliar se os genes de resistência identificados nos isolados são ou não transportados
pelos plasmídeos, recorreu-se à extração e purificação dos mesmos e realizaram-se reações
de PCR para os genes de resistência, usando o DNA plasmídico extraído do gel de agarose.
As bandas extraídas do gel foram designadas por 37.1 e 37.2 (designado por 37.1 o plasmídeo
de maior massa molecular e 37.2 o plasmídeo de menor massa molecular), 40.1, 24.1, 35.1,
7.1, 17.1, 29.1, 43.2 (plasmídeo de menor massa molecular), 49.1, 49.2 e 49.3 (designado por
49.1 o plasmídeo de maior massa molecular e 49.3 o plasmídeo de menor massa molecular).
32
Através do DNA plasmídico extraído e purificado efetuaram-se reações de PCR para
amplificação dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV e para a sequências de inserção ISEcp1 e IS903
nas amostras 24.1, 37.1, 37.2, 40.1, 35.1, 7.1, 17.1, 29.1 e 43.2 e reações de PCR para
amplificação dos genes blaKPC nas amostras 49.1, 49.2 e 49.3. Nas amostras 24.1, 37.1, 37.2,
40.1, 35.1, 7.1, 17.1, 29.1 e 43.2 verificou-se amplificação do gene blaTEM, confirmando a sua
localização no plasmídeo. Não foram obtidos resultados positivos para a amplificação dos
genes blaCTX-M, blaSHV nem das sequências de inserção pesquisadas, o que indica que estes
genes poderão não ter uma localização plasmídica mas sim cromossomal. Sabe-se que a
sequência de inserção ISEcp1 localizada a montante do gene blaCTX-M está relacionada com a
mobilização deste gene de plasmídeos para plasmídeos e também de plasmídeos para o
cromossoma. Essa mobilização pode ter ocorrido nos isolados, uma vez adquirido o plasmídeo
contendo o gene de resistência, já que esta sequência de inserção também não foi localizada
no DNA plasmídico através das reações de PCR efetuadas. Contudo, os resultados não são
suficientes para afirmar que estes genes não estão localizados no plasmídeo, uma vez que ao
ser removido do gel, o DNA plasmídico pode ter sido fragmentado impossibilitando os primers
de emparelharem e amplificarem a zona correspondente. Nas amostras 49.1, 49.2 e 49.3,
verificou-se amplificação do gene blaKPC. Os resultados para as amostras 24.1, 37.1, 37.2, 7.1,
29.1, 43.2, 49.1, 49.2 e 49.3 encontram-se na Figura 17. A amplificação dos genes blaTEM nas
amostras 37.1 e 37.2 e do gene blaKPC nas amostras 49.1, 49.2 e 49.3 corrobora a hipótese da
existência de diferentes isoformas do mesmo plasmídeo e não da presença de plasmídeos
diferentes nestes isolados.
Figura 17: Produtos de PCR para a amplificação dos genes blaCTX-M de 544 pb (a), blaTEM de 1058 pb (b) e
blaSHV de 886 pb (c), para as amostras 24.1, 37.1, 37.2, 7.1, 29.1 e 43.2, e do gene blaKPC de 871 pb para
as amostras 49.1, 49.2 e 49.3 (d), em gel de agarose 1%. As reações de PCR foram efetuados com o
DNA plasmídico extraído e purificado do gel ilustrado na Figura 16. Resultado positivo para a amplificação
dos genes blaTEM nas amostras 24.1, 37.1, 37.2, 7.1, 29.1 e 43.2 e do gene blaKPC nas amostras 49.1, 49.2
33
e 49.3; resultado negativo para a amplificação dos genes blaCTX-M e blaSHV nas amostras 24.1, 37.1, 37.2,
7.1, 29.1 e 43.2. CC: controlo positivo para o gene blaCTX-M; CT: controlo positivo para o gene blaTEM; CS:
controlo positivo para o gene blaSHV; CK: controlo positivo para o gene blaKPC. M: marcador de massas
moleculares GeneRulerTM
1kb DNA ladder.
Transferência genética
Realizaram-se técnicas de transferência genética como a conjugação e a transformação por
eletroporação com o objetivo de testar a capacidade de transferência horizontal de genes de
resistência entre os diferentes isolados bacterianos.
Conjugação
Efetuaram-se as técnicas de conjugação tanto em meio sólido como em meio líquido para os
isolados bacterianos 1, 3 e 49 de E. coli produtores de uma carbapenemase KPC-2, o isolado
37 de E. coli contendo uma β-lactamase de espectro alargado CTX-M-15 e os isolados 24, 35,
40, 7, 17, 29 e 43 de K. pneumoniae, contendo também uma β-lactamase de espectro alargado
CTX-M-15. Utilizou-se como estirpe recetora a E. coli J53 azida de sódio resistente. Para a
seleção dos transformantes preparou-se meio gelosado suplementado com azida de sódio a 1
mg/mL no qual foi espalhado à superfície 100 µl de cefotaxima 1 mg/mL depois de distribuído
pelos meios e solidificado. A técnica de conjugação não foi eficiente para nenhum isolado
devido a um problema de seleção dos transconjugantes. Depois de incubadas a 37ºC durante
24 horas as colónias obtidas não eram características da estirpe recetora mas sim da estirpe
dadora e no controlo negativo (meio suplementado com azida de sódio no qual se plaquearam
as bactérias dadoras) verificou-se crescimento quando estes isolados deveriam ser sensíveis.
Os resultados obtidos mostram que a quantidade de azida de sódio colocada no meio de
cultura não foi suficiente para inibir o crescimento das bactérias dadoras, comprometendo
assim a correta seleção das bactérias transconjugantes.
Transformação por eletroporação
Realizou-se também a técnica de transformação por eletroporação com os isolados 49 e 37 de
E. coli e 24, 40, 7 e 17 de K. pneumoniae. O DNA utilizado corresponde ao DNA plasmídico
extraído pela técnica Kado e Liu (1981) e purificado com acetato de sódio e ressuspendido em
água estéril. Para a realização desta técnica prepararam-se células competentes da estirpe E.
coli JM109. As células competentes foram eletroporadas com DNA plasmídico correspondente,
incubadas a 37ºC durante 1 hora e plaqueadas em meio Müeller-Hinton contendo discos de
antibiótico para os quais as bactérias portadoras do plasmídeo eram resistentes: cefoxitina,
ceftazidima, cefotaxima, amoxicilina + ácido clavulânico e imipenemo para o isolado 49,
produtor de uma carbapenemase KPC-2, e cefoxitina, ceftazidima, cefotaxima e amoxicilina +
ácido clavulânico para os restantes isolados, produtores de uma β-lactamase de espectro
alargado CTX-M-15. Obteve-se uma transformação eficiente apenas para o isolado 49 de E.
coli, com um perfil de resistência aos antibióticos da estirpe transformada semelhante ao da
34
bactéria dadora, exceto para a gentamicina e ciprofloxacina, antibióticos para os quais a
resistência não foi adquirida pela bactéria eletroporada (Figura 18).
Figura 18: a) Antibiograma do isolado 49 de E. coli para os antibióticos gentamicina (GM), ciprofloxacina
(CIP), ceftazidima (CAZ), imipenemo (IPM), cefotaxima (CTX), cefoxitina (FOX) e amoxicilina + ácido
clavulânico (AMC); (b) antibiograma da estirpe JM109 transformada por eletroporação.
Extraiu-se o DNA da estirpe JM109 transformada por eletroporação e realizou-se uma reação
de PCR para amplificação do gene blaKPC. Verificou-se um resultado positivo para a
amplificação do gene e por sequenciação confirmou-se a presença da carbapenemase KPC-2
na estirpe transformada. Procedeu-se à extração de plasmídeos na estirpe transformada,
tendo-se obtido um plasmídeo de aproximadamente 9 kb comprovando a eficiente
transformação da estirpe JM109 (Figura 19a). Com o DNA plasmídico obtido e depois de
purificado, realizou-se uma reação de PCR para o gene blaKPC, para comprovar a sua
localização no plasmídeo (Figura 19b).
Figura 19: a) Visualização do DNA plasmídico extraído da estirpe JM109 transformada por eletroporação
em gel de agarose 0,7%; b) 1-produto de PCR para a amplificação do gene blaKPC de 871 pb do isolado
49 de E. coli (controlo positivo), 2- produto de PCR para a amplificação do gene blaKPC da estirpe JM109
transformada em gel de agarose 1%. A reação de PCR foi efetuada com DNA plasmídico extraído e
purificado da estirpe JM109 transformada. M: marcador de massas moleculares NZYDNA ladder III
(Nzytech genes & enzymes).
35
Identificou-se ainda a origem de replicação do plasmídeo extraído da estirpe transformada
através de reações de PCR para os grupos de incompatibilidade já descritos tendo-se
identificado os grupos IncFIA, IncFIB e IncF, também presentes na estirpe dadora (isolado 49
de E. coli). Estes resultados demonstram que a transferência do gene de resistência blaKPC-2
está associada a plasmídeos do grupo de incompatibilidade IncF, revelando a importância
destes plasmídeos na disseminação do gene.
Os principais resultados obtidos para os isolados de E. coli e K. pneumoniae relativamente ao
hospital do qual foram obtidos, genes de resistência que transportam, ambiente genético e
origem de replicação plasmídica encontram-se descritos na Tabela 6.
Tabela 6: Principais resultados obtidos para os isolados estudados. Os isolados foram agrupados com
base nas suas características comuns. (X: Perfis eletroforéticos distintos entre si; ND: não detetado; NA:
não aplicável; NP: não pesquisado.)
Uma análise conjunta dos resultados permite estabelecer uma relação direta entre os isolados
1, 2, 3 e 49 de E. coli produtores de uma carbapenemase KPC-2 provenientes do Hospital de
Santa Cruz e das urgências do Hospital de São Francisco Xavier entre os dias 2 de dezembro
de 2011 e 14 de março de 2012. Os isolados 1 e 2 pertencem ao mesmo doente, que em
Dezembro deu entrada no Hospital de Santa Cruz, onde esteve internado na unidade de
nefrologia com uma infeção urinária, tendo sido recolhida a amostra 1. Em março deu entrada
nas urgências e foi recolhido o isolado 2 de uma amostra de urina. Estes isolados são iguais
entre si e iguais aos isolados 3 e 49 provenientes de doentes diferentes no mesmo intervalo de
tempo, o que pressupõe a ocorrência de transmissão cruzada entre doentes na mesma
unidade hospitalar. O doente do qual foram obtidos os isolados 1 e 2 atua como um possível
reservatório que pode possibilitar a permanência destas bactérias em ambiente hospitalar.
Sequence
Type
KPC CTX SHV TEM ISKpn6 ISKpn7 ISKpn8 ISEcp1 IS903
1 Escherichia coli HSC A 131 KPC-2 - - + + - - NP NP IncF
2 Escherichia coli HSFX A ND KPC-2 - NP NP + - - NP NP NP
3 Escherichia coli HSC A 131 KPC-2 - - + + - - NP NP IncF
49 Escherichia coli HSC A 131 KPC-2 - - + + - - NP NP IncF
37 Escherichia coli HSC A 131 NA CTX-M-15 - TEM-1 NP NP NP + - IncF
25 Klebsiella pneumoniae HEM B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP ND
26 Klebsiella pneumoniae HSC B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP ND
28 Klebsiella pneumoniae HSFX B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP ND
30 Klebsiella pneumoniae HSFX B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP ND
31 Klebsiella pneumoniae HSFX B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP ND
36 Klebsiella pneumoniae HEM B ND NA CTX-M-15 NP NP NP NP NP NP NP ND
39 Klebsiella pneumoniae HEM B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP ND
35 Klebsiella pneumoniae HEM B 15 NA CTX-M-15 SHV-28 + NP NP NP + + ND
40 Klebsiella pneumoniae HSFX B 15 NA CTX-M-15 SHV-28 TEM-1 NP NP NP + + ND
38 Klebsiella pneumoniae HSC B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP NP
41 Klebsiella pneumoniae HSFX B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP NP
42 Klebsiella pneumoniae HSFX B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP NP
48 Klebsiella pneumoniae HSC B ND NA + NP NP NP NP NP NP NP NP
24 Klebsiella pneumoniae HSFX C 20 NA CTX-M-15 SHV-12 TEM-1 NP NP NP + - ND
7 Klebsiella pneumoniae HSC X 15 - + + + NP NP NP + + IncN
17 Klebsiella pneumoniae HEM X 15 - CTX-M-15 SHV-1 TEM-1 NP NP NP + + ND
29 Klebsiella pneumoniae HSFX X 15 - + + + NP NP NP + + ND
43 Klebsiella pneumoniae HSC X ND - + + + NP NP NP + + ND
33 Klebsiella pneumoniae HSFX X ND - - SHV-1 - NP NP NP NP NP ND
46 Klebsiella pneumoniae HSFX X ND - - + - NP NP NP NP NP ND
47 Klebsiella pneumoniae HEM X ND - - + - NP NP NP NP NP ND
Origem de
replicação
plasmídica
Perfil
genómicoIsolados Estirpe Hospital
β-lactamases Ambiente genético
36
Verifica-se também uma relação entre o grupo de 13 isolados de K. pneumoniae produtores de
uma β-lactamase de espectro alargado CTX-M-15, geneticamente semelhantes pelos métodos
de tipificação molecular realizados, do qual foram selecionados os isolados 35 e 40 como
representantes do grupo. Estes isolados foram obtidos entre os dias 9 de março de 2011 e 21
de novembro de 2011, de doentes diferentes, nas três unidades hospitalares em estudo, o que
mostra o potencial de disseminação destas bactérias e capacidade de perpetuação das
mesmas em ambiente hospitalar, aumentando a possibilidade de transmissão cruzada entre
doentes nos três hospitais. O mesmo se verifica com o grupo de 4 isolados de K. pneumoniae,
semelhantes entre si, também produtores de uma β-lactamase de espectro alargado CTX-M-15
e representados pelos isolados 7, 17, 29 e 43 provenientes de doentes diferentes entre os dias
1 de fevereiro de 2011 e 25 de novembro de 2011, nas três unidades hospitalares.
37
CONCLUSÃO
Neste estudo identificou-se a enzima CTX-M-15, β-lactamase de espectro alargado mais
disseminada mundialmente, num isolado de E. coli pertencente ao ST131 e em isolados de K.
pneumoniae pertencentes a diferentes doentes das três unidades hospitalares em estudo,
pertencentes ao ST15, clone associado à disseminação desta enzima em isolados de K.
pneumoniae. A disseminação do gene de resistência blaCTX-M-15 entre os isolados bacterianos
pode ser explicada devido à facilidade de aquisição de elementos genéticos móveis como
plasmídeos contendo os genes de resistência, principalmente pertencentes aos grupos de
incompatibilidade IncF e/ou integrões contendo determinadas sequências de inserção
responsáveis pela mobilização dos genes de resistência como o caso da ISEcp1 detetada a
montante do gene CTX-M-15 em todos os isolados estudados.
Foi detetada pela primeira vez em Portugal a carbapenemase KPC-2 em isolados de E. coli
obtidos de um dos hospitais em estudo, enzima que tem sido associada principalmente a
isolados de K. pneumoniae mas atualmente já foi encontrada em diferentes géneros e espécies
da família Enterobacteriaceae. O gene blaKPC foi detetado num integrão por sua vez localizado
num plasmídeo do grupo de incompatibilidade IncF, que foi transferido para uma estirpe de E.
coli sensível, experiência que demonstra o papel dos plasmídeos na aquisição deste gene de
resistência. Identificou-se o ST131, clone pandémico associado à disseminação das enzimas
CTX-M-15, pelo que a transferência do gene blaKPC para este complexo clonal pode constituir
um problema de saúde pública.
Neste estudo verificou-se que existe uma disseminação intra- e inter-hospitalar de bactérias da
família Enterobacteriaceae multirresistentes, o que aumenta a probabilidade de infeções por
transmissão cruzada entre doentes da mesma unidade hospitalar e entre as três unidades.
Para um controlo da transmissão e disseminação é necessário definir os principais
reservatórios destas bactérias, as vias de transmissão e os fatores de risco para a infeção.
Como foi demonstrado neste estudo, o ambiente hospitalar atua como um reservatório de
microrganismos patogénicos, pelo que é necessária a implementação de medidas de
isolamento rigoroso dos infetados ou colonizados bem como práticas de limpeza, desinfeção e
esterilização do material, superfícies e equipamentos médicos utilizados no tratamento dos
doentes. É de igual modo importante reforçar programas educativos para os profissionais de
saúde principalmente no que diz respeito a medidas de higiene para evitar a transferência
horizontal de bactérias entre profissionais de saúde, paciente e ambiente.(110)
É também
necessário um alerta para o uso racional dos antibióticos de modo a controlar a pressão
antibiótica exercida nas terapêuticas dos doentes. Torna-se urgente a implementação de testes
de diagnóstico rápidos para deteção de genes de resistência, clones e elementos genéticos
móveis que constituem veículos de disseminação de determinantes genéticos entre isolados
bacterianos.
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106. Leavitt, A., Chmelnitsky, I., Ofek, I., Carmeli, Y., and Navon-Venezia, S. (2010). Plasmid pKpQIL encoding KPC-3 and TEM-1 confers carbapenem resistance in an extremely drug-resistant epidemic Klebsiella pneumoniae strain. J. Antimicrob. Chemother. 65, 243–248.
107. Miriagou, V., et al. (2003). Imipenem resistance in a Salmonella clinical strain due to plasmid-mediated class A carbapenemase KPC-2. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 1297–1300. 108. Poirel, L., Lagrutta, E., Cleary, T., Munoz-Price, L.S., and Nordmann, P. (2010). Emergence of KPC-producing Pseudomonas aeruginosa, United States. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 3072. 109. Lavollay, M., Mamlouk, K., Frank, T., et al. (2006). Clonal dissemination of a CTX-M-15 β-lactamase-producing Escherichia coli strain in the Paris area, Tunis, and Bangui. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2433 - 2438. 110. Oliveira, A.C., and Damasceno, Q.S. (2012). O papel do ambiente hospitalar na disseminação de bactérias resistentes. Rev. Epidemiol. Control. Infect. 2(1), 28-31.
111. Rubtsova, M.Y., el al. (2001). Multiparametric Determination of Genes and Their Point Mutations for Identification of Beta-Lactamases. Biochemistry (Mosc).75(13), 1628-49.
112. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) - Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 15º Suplemento informativo; M100-S15; 25(1). 113. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing; Approved standard M100-S17; 17th ed; 2007; Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pa. 114. Gonzalez, L. M., Perez-Diaz, J.C., Ayala, J., Casellas, J.M., Martinez-Beltran, J., Bush, K. and Baquero, F. (1994). Gene sequence and biochemical characterization of FOX-1 from Klebsiella pneumoniae, a new AmpC-type plasmid-mediated beta-lactamase with two molecular variants. Antimicrob. Agents Chemother. 38(9), 2150-7.
44
115. Gomez, S.A., Pasteran, F.G., Faccone, D., Tijet, N., Rapoport, M., Lucero, C., Lastovetska, O., Albornoz, E., Galas, M., Melano, R.G., Corso, A. and Petroni, A. (2011). Clonal dissemination of Klebsiella pneumoniae ST258 harbouring KPC-2 in Argentina. Clin. Microbiol. Infect. 17(10),1520-4. 116. Prescott, L.M., et al. (2005). Microbiology. 6
th edition. McGraw Hill.
117. Pitton, J.S. (1972). Mechanisms of bacterial resistance to antibiotics. Review of Physiology. 65, 15
(93).
45
ANEXOS
Tabela 1: Primers e condições de PCR utilizadas nas técnicas de tipificação molecular M13-PCR
fingerprinting e BOX-PCR fingerprinting.
Tabela 2: Primers e condições de PCR utilizadas na técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST) para
os isolados de E. coli. F: primer forward; R: primer reverse.
Tabela 3: Primers e condições de PCR utilizadas na técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST) para
os isolados de K. pneumonia. F: primer forward; R: primer reverse.
Desnaturação Annealing Extensão
M13 5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3' 94°C, 2 min. 35 94°C, 20 seg. 50°C, 1 min. 72°C, 20 seg.
BOX 5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3' 95°C, 5 min. 39 95°C, 20 seg. 60°C, 1 min. 72°C, 20 seg.
72°C, 5 min.
Primers
Extensão final
72°C, 5 min.
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
Ciclos
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG-3'
R: 5'-CCGTCAACTTTCGCGTATTT-3'
F: 5'-TCACAGGTCGCCAGCGCTTC-3'
R: 5'-GTACGCAGCGAAAAAGATTC-3'
F: 5'-TCGGCGACACGGATGACGGC-3'
R: 5'-ATCAGGCCTTCACGCGCATC-3'
F: 5'-ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA-3'
R: 5'-GGACGCAGCAGGATCTGTT-3'
F: 5'-ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG-3'
R: 5'-TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTT-3'
F: 5'-CGCGCTGATGAAAGAGATGA-3'
R: 5'-CATACGGTAAGCCACGCAGA-3'
F: 5'-CGCATTCGCTTTACCCTGACC-3'
R: 5'-TCGTCGAAATCTACGGACCGGA-3'
PrimersGenes
adk 72ºC, 5min. 54ºC, 1min.
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
Ciclos
95ºC, 2min. 30 60ºC, 1min.
95ºC, 2min. 30 54ºC, 1min.
recA
95ºC, 2min.
95ºC, 2min.
95ºC, 2min.
95ºC, 2min.
95ºC, 2min.
30
30
fumC
gyrB
icd
mdh
purA
30
30
30
95ºC, 1min.
95ºC, 1min.
95ºC, 1min.
95ºC, 1min.
95ºC, 1min.
95ºC, 1min.
95ºC, 1min.
72ºC, 5min.
72ºC, 5min.
72ºC, 5min.
54ºC, 1min.
60ºC, 1min.
54ºC, 1min.
60ºC, 1min.
72ºC, 2min.
72ºC, 2min.
72ºC, 2min.
72ºC, 2min.
72ºC, 2min.
72ºC, 2min.
72ºC, 2min.
72ºC, 5min.
72ºC, 5min.
72ºC, 5min.
Extensão final
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-TGAAATATGACTCCACTCACGG-3'
R: 5'-CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT-3'
F: 5'-CTCGCTGCTGGACTATATTCG-3'
R: 5'-CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC-3'
F: 5'-CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3'
R: 5'-CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-3'
F: 5'-GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC-3'
R: 5'-CGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT-3'
F: 5'-ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG-3'
R: 5'-TGATCAGAACTGGTAGGTGAT-3'
F: 5'-GGCGAAATGGCWGAGAACCA-3'
R: 5'-GAGTCTTCGAAGTTGTAACC-3'
F: 5'-CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT-3'
R: 5'-ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG-3'
Genes Primers
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
CiclosExtensão final
72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg. 50ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg. 60ºC, 30seg.
50ºC, 30seg.
72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg. 50ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg. 50ºC, 30seg.
72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
gapA
infB
mdh
pgi
tonB
phoE
rpoB
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg. 50ºC, 30seg.
72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg. 50ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
94ºC, 5min. 35 94ºC, 30seg.
46
Tabela 4: Primers e condições de PCR utilizadas para a amplificação dos principais genes de resistência
estudados e para as porinas OmpK35 e OmpK36. F: primer forward; R: primer reverse.
Tabela 5: Primers e condições de PCR utilizadas para a determinação do ambiente genético do gene de
resistência blaKPC. F: primer forward; R: primer reverse.
Tabela 6: Primers e condições de PCR utilizadas para a determinação do ambiente genético do gene de
resistência blaCTX e dos integrões de classe I. F: primer forward; R: primer reverse.
Tabela 7: Primers e condições de PCR utilizadas na técnica de Replicon Typing para as origens de
replicação dos diferentes grupos de incompatibilidade. F: primer forward; R: primer reverse.
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-TATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCT-3'
R: 5'-ACTGCCCGTTGACGCCCAAT-3'
F: 5'-SCSATGTGCAGYACCAGTAA -3'
R: 5'-CCGCRATATGRTTGGTGGTG-3'
F: 5'-GAAAGGGCCTCGTGATAC-3'
R: 5'-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3'
F: 5'-CACTCAAGGATGTATTGTG-3'
R: 5'-TTAGCGTTGCCAGTGCTCG-3'
F: 5'-ATATTCTGGCAGTGGTGATCC-3'
R: 5'-GCTTTGGTGTAATCGTTGTCG-3'
F: 5'-TAGCAGGCGCAGCAAATGC-3'
R: 5'-TGCAACCACGTCGTCGGTA-3'
Genes Primers
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
CiclosExtensão final
72ºC, 10min.
blaCTX 94ºC, 3min. 20 94ºC, 1min. 60ºC, 1min. 72ºC, 3min. 72ºC, 7min.
bla KPC 94ºC, 10min. 30 94ºC, 45seg. 62ºC, 45seg. 72ºC, 1min,30seg.
72ºC, 9min.
bla SHV 94ºC, 10min. 30 94ºC, 35seg. 62ºC, 45seg. 72ºC, 1min, 30seg. 72ºC, 10min.
bla TEM 94ºC, 3min. 35 94ºC, 1min. 56ºC, 1min. 72ºC, 1min.
72ºC, 10min.
OmpK36 94ºC, 10min. 35 94ºC, 30seg. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 10min.
OmpK35 94ºC, 10min. 35 94ºC, 30seg. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-CTCCCTGTTGCTGGCTTTTGA-3'
R: 5'-GATGGCGCGGTTGAAGTATTC-3'
F: 5'GGCACGGCAAATGACTA-3'
R: 5'-GAAGATGCCAAGGTCAATGC-3'
Genes Primers
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
CiclosExtensão final
72ºC, 10min.
ISKpn6 94ºC, 10min. 34 94ºC, 45seg. 55ºC, 45seg. 72ºC, 45seg. 72ºC, 10min.
ISKpn7 94ºC, 10min. 34 94ºC, 45seg. 61ºC, 45seg. 72ºC, 1min.
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-AAAAATGATTGAAAGGTGGT-3'
R: 5'-CCGTGACACTGTTTCAGGTTC-3'
F: 5'-TGGACAACAGATTACACCCG-3'
R: 5'-CGGTTGTAATCTGTTGTCCA-3'
F: 5'-GGCATCCAAGCAGCAAG-3'
R: 5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'72ºC, 5min. 72ºC, 10min.
Genes Primers
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
CiclosExtensão final
Integrão
classe I94ºC, 10min. 45 94ºC, 1min. 55ºC, 1min.
72ºC, 1min. 72ºC, 10min.
IS903 95ºC, 3min. 29 95ºC, 1min. 54ºC, 1min. 72ºC, 1min. 72ºC, 10min.
ISEcp1 95ºC, 3min. 29 95ºC, 1min. 60ºC, 1min.
Desnaturação Annealing Extensão
F: 5'-GGAGCGATGGATTACTTCAGTAC-3'
R: 5'-TGCCGTTTCACCTCGTGAGTA-3'
F: 5'-TTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACAC-3'
R: 5'-GGCTCACTACCGTTGTCATCCT-3'
F: 5'-CGAAAGCCGGACGGCAGAA-3'
R: 5'-TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT-3'
F: 5'-AACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGAT-3'
R: 5'-TGAGAGTCAATTTTTATCTCATGTTTTAGC-3'
F: 5'-GGATGAAAACTATCAGCATCTGAAG-3'
R: 5'-CTGCAGGGGCGATTCTTTAGG-3'
F: 5'-GTCTAACGAGCTTACCGAAG-3'
R: 5'-GTTTCAACTCTGCCAAGTTC-3'
72ºC, 5min.
IncN 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncL/M 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
72ºC, 5min.
IncX 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncI1-Iγ 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
Genes Primers
Condições da Reacção de PCR
Desnaturação
inicial
Nª de
ciclos
CiclosExtensão final
72ºC, 5min.
IncHI2 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 3min. 72ºC, 5min.
IncHI1 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
47
F: 5'-CCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTG-3'
R: 5'-GTATATCCTTACTGGCTTCCGCAG-3'
F: 5'-GGAGTTCTGACACACGATTTTCTG-3'
R: 5'-CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT-3'
F: 5'-CCTAAGAACAACAAAGCCCCCG-3'
R: 5'-GGTGCGCGGCATAGAACCGT-3'
F: 5'-AATTCAAACAACACTGTGCAGCCTG-3'
R: 5'-GCGAGAATGGACGATTACAAAACTTT-3'
F: 5'-CTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAA-3'
R: 5'-TCACGCGCCAGGGCGCAGCC-3'
F: 5'-GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG-3'
R: 5'-TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT-3'
F: 5'-GAGAACCAAAGACAAAGACCTGGA-3'
R: 5'-ACGACAAACCTGAATTGCCTCCTT-3'
F: 5'-TTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCAT-3'
R: 5'-CGTTGATTACACTTAGCTTTGGAC-3'
F: 5'-CTGTCGTAAGCTGATGGC-3'
R: 5'-CTCTGCCACAAACTTCAGC-3'
F: 5'-GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC-3'
R: 5'-TCTTTCACGAGCCCGCCAAA-3'
F: 5'-GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC-3'
R: 5'-TCTGCGTTCCGCCAAGTTCGA-3'
F: 5'-TGATCGTTTAAGGAATTTTG-3'
R: 5'-GAAGATCAGTCACACCATCC-3'
72ºC, 5min.
IncF 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 52ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncB/O 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
72ºC, 5min.
IncK 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncFIIAs 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
72ºC, 5min.
IncT 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncA/C 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
72ºC, 5min.
IncFIC 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncP 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
72ºC, 5min.
IncY 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncW 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
72ºC, 5min.
IncFIB 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min. 72ºC, 5min.
IncFIA 94ºC, 5min. 30 94ºC, 1min. 60ºC, 30seg. 72ºC, 1min.
48
Tabela 8: Isolados estudados, serviço hospitalar de onde foram obtidos e valores dos antibiogramas.
Antibióticos: GM (gentamicina), CIP (ciprofloxacina), FOX (cefoxitina), AMC (amoxicilina+ácido
clavulânico), CAZ (ceftazidima), CTX (cefotaxima), IPM (imipenemo), MEM (meropenemo), DOR
(doripenemo), ETP (ertapenemo), FEP (cefepima); inibidores: clox (cloxacilina), AB (ácido borónico), ED
(EDTA). (ND: não determinado; NA: não aplicável.)
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