DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL DAS ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS

Bruna Baranski, Camila Ramos, Daniele Seo, Luiz Fernando Maksemovicz, Tatiana Venancio

Universidade Presbiteriana MackenzieCurso de Ciências Biológicas e da Saúde

Disciplina de CitogenéticaProfa Dra. Leda Navajas Haim

• O diagnóstico pré-natal permite a detecção de doenças genéticas durante a gravidez

• É principal foco do diagnóstico genético

• A maioria dos resultados levam à um diagnóstico normal

• Tem como objetivo o fornecimento de informações para que a família possa fazer escolhas

INTRODUÇÃO

HISTÓRICO DO DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL

1966 – Steele e Breg mostram que a constituição

cromossômica de um feto podia ser determinada pela

análise da cultura das células do líquido amniótico.

Conseguiram cultivar células de líquido amniótico de

gestantes de 20-37 semanas com risco de gerarem prole

com eritroblastose fetal.

HISTÓRICO DO DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL

Estudos colaborativos realizados na América do Norte e

Europa constataram que a amniocentese realizada no

segundo trimestre (entre as 16ª e 20ª semanas de

gestação) é um procedimento seguro.

1979 - Introdução das técnicas de diagnóstico pré-natal

no Brasil.

Assim, isso justificou o emprego do diagnóstico pré-

natal de anormalidades citogenéticas, como um

procedimento de rotina em países do hemisfério norte.

FERRAMENTAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO PELA ANÁLISE DE DNA

DIAGNÓSTICO INDIRETO

DIAGNÓSTICO DIRETO

Análise de ligação

Análise de RFLP

Oligonucleotídeos Alelo-Específicos

ANÁLISE DE LIGAÇÃO

DIAGNÓSTICO INDIRETO

VANTAGENS• Único teste pode levar a descoberta de

múltiplas mutações

• Não há necessidade de conhecimento da mutação causadora da doença

• O gene da doença e seus produtos não precisam ser conhecidos

DESVANTAGENS• Necessidade de tipagem de inúmeros membros da família• Possibilidade de recombinação e cruzamentos não-informativos• Os marcadores nem sempre são informativos

• Utilizada para diagnosticar qualquer doença genética mapeada

• Utiliza marcadores ligados, porém não envolve o exame direto das mutações causadoras da doença

• A precisão do diagnóstico depende da proximidade dos marcadores aos genes das doenças

DIAGNÓSTICO DIRETO

ANÁLISE DE RFLP

• Alteração na sequência de reconhecimento de uma enzima de restrição em consequência da mutação causadora da doença

•A própria mutação cria um polimorfismo de sítio de restrição

•O RFLP resultante reflete a mutação causadora da doença diretamente

VANTAGENS• Não é necessária informação genética

familiar• Marcadores são sempre informativos• Não há erros resultantes de

recombinações

DESVANTAGENS• Mutação causadora da doença precisa ser reconhecida• Um único teste não é capaz de descobrir múltiplas mutações•Apenas 5% das mutações causadoras de doença afetam sítios de restrição conhecidos

DIAGNÓSTICO DIRETO

OLIGONUCLEOTÍDEOS ALELO-ESPECÍFICOS

• Utilização de sonda de oligonucleotídeo sintetizada para hibridização na sequência mutada

• Um erro de pareamento de uma base evita a hibridização

VANTAGENS• Não é necessária informação genética

familiar• Marcadores são sempre informativos

• Não limita-se a mutações que causam alterações de sítios de restrição

DESVANTAGENS

• Mutação causadora da doença precisa ser reconhecida• Um único teste não é capaz de descobrir múltiplas mutações

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICOS PRÉ-NATAIS DAS ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS

Diagnóstico pré-implantação

Cordocentese

Punção de vilosidades coriônicas

Amniocentese

TESTES INVASIVOS

Ultra-sonografia

Triagem de soro materno

Isolamento de células fetais da circulação materna

TESTES NÃO - INVASIVOS

INDICAÇÕES PARA DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL POR TESTES INVASIVOS

• Idade materna avançada

• Filho anterior com anomalia cromossômica de novo

• Presença de anomalias cromossômicas estruturais em um dos pais

• História familiar de defeito genético que pode ser diagnosticado ou excluído por análise bioquímica ou de DNA

• História familiar de distúrbio ligado ao X para o qual não há teste diagnóstico pré-natal específico.

• Risco de defeito no tubo neural

• Triagem do soro materno e ultra-som

TESTES INVASIVOS

AMNIOCENTESE

PROCEDIMENTO:

PIERCE (2004)

AMNIOCENTESE

TESTES INVASIVOS

•Período: 15a e 17a semanas depois do último período menstrual

•Risco de complicações < 0,5%

•Importante a monitoração aplicada à punção

VANTAGENS

• Segurança e baixo índice de complicações (exame rotineiro)

• Avaliar problemas genéticos

• Não há necessidade da paciente ficar internada

• Células do líquido amniótico retiradas podem ser cultivadas para testes bioquímicos (FISH) ou iagnóstico de DNA

• Teste fornece resultados altamente precisos

DESVANTAGENS

• Processo doloroso• Possibilidade de adquirir infecções• Possibilidade de ferir o feto, a

placenta ou o cordão umbilical com a agulha

• Possibilidade de ocorrer rompimento da cavidade amniótica

• Possibilidade de ocorrência de dores de parto e contrações precoces

• Possibilidade de risco de aborto• Mosaicismo cromos~sômico pode

levar a erro de diagnóstico

TESTES INVASIVOS

PUNÇÃO DE VILOSIDADES CORIÔNICAS - CVS

PROCEDIMENTO:

PIERCE (2004)

PUNÇÃO DE VILOSIDADES CORIÔNICAS - CVS

TESTES INVASIVOS

•Período: 10a e 12a semana de gestação

•Risco de complicações < 1,0%

•Importante a monitoração aplicada à punção Ultra-som usado antes da CVS para determinar o melhor enfoque para a coleta

VANTAGENS

•É um método rápido e seguro

•Fornece diagnóstico mais precocemente na gravidez (10 e 11 semanas pós-LMP), sendo importante para casais que cogitam a interrupção da gravidez

•Para a análise são necessárias mínimas quantidades de tecido

•Detecção de alterações cromossômicas

DESVANTAGENS•Risco de aborto de 1% a 1,5%, acima da taxa normal comparado ao 0,5% da amniocentese

•Exame doloroso para a mãe

•Mosaicismo confinado à placenta (cerca de 1% a 2%) confunde diagnóstico, pois o mosaicismo observado da placenta não está realmente presente no feto

•AFP do líquido amniótico não pode ser medida

TESTES INVASIVOS

CORDOCENTESE

PROCEDIMENTO:

Fonte: Disponível em <http://www.cpdt.com.br/_site/servicos_sub.asp?sub=16&uid=37>, acessado em 13 de setembro de 2009.

CORDOCENTESE

TESTES INVASIVOS

•Período: 19a e 21a semanas depois do último período menstrual

•Risco de complicações: 2% a 3%

•Importante a monitoração aplicada à punção

VANTAGENS•Análise citogenética dos fetos com anomalias estruturais detectadas por ultra-som quando diagnóstico rápido é necessário

•Diagnóstico de doenças hematológicas

•Confirmação de mosaicismo: distinção rápida entre mosaicismo fetal verdadeiro e mosaicismo falso causado pela contaminação materna de amostra de líquido amniótico

DESVANTAGENS

•Processo doloroso para mãe

•Risco de aborto baixa, porém maior que o da amniocentese e da CVS

TESTES INVASIVOS

PROCEDIMENTO:

•É realizado antes de se transferir os embriões para o útero

•O casal realiza a IVF e são retirados uma célula de cada embrião produzido (fase de 6 a 8 células)

•Esta célula é examinada para saber se aquele determinado embrião apresenta algum problema

-PCR → diagnosticar doenças monogênicas

-FISH → diagnosticar aneuploidias

•Somente os embriões sem problemas são implantados no útero da mãe

•Questionamentos éticos → embriões afetados são descartados

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO

TESTES INVASIVOS

•Período: 3 dias após a fertilização → embrião com 6 ou 8 células

VANTAGENS

•Método rápido e seguro

•Permite implantação somente de embriões não-afetados

•Evita a questão da interrupção da gravidez

•Diagnóstico também pode ser realizado no estágio de blastocisto de 100 células, utilizando células do trofoectoderma do blastocisto

•Comumente usado para casais que tenham recorrido ao diagnóstico in vitro e desejam testar condições genéticas

DESVANTAGENS•Dropout alélico: problema ocasional, um dos dois alelos pode ser detectável, o que faria o heterozigoto parecer homozigoto devido à falha na amplificação parcial pela PCR quando utilizando DNA de uma única célula

•Tecido extra – embrionário (também chamado de trofoectoderma do blastocisto) é diagnosticado, ao invés do próprio embrião

•Disponibilidade da técnica ainda é limitada

TESTES NÃO-INVASIVOS

ULTRA-SONOGRAFIA

PROCEDIMENTO:

Fonte:Disponível em <http://www.alvesbaby.com.br/imgdic/ultrasonografia_1.jpg>, acessado em 16 de setembro de 2009.

Fonte:Disponível em <http://www.msdbrazil.com/msd43/m_manual/images/img_ultrasonografia.gif>, acessado em 16 de

setembro de 2009.

TESTES NÃO - INVASIVOS

ULTRA-SONOGRAFIA

•Técnica mais comum utilizada para visualização fetal•Contribui na eficiência da amniocentese, CVS e da cordocentese•Crescimento fetal•Malformações

VANTAGENS

•Não agressiva nem para a mãe nem para o feto (SEGURA - não há contato com o feto)•Grande nível de aceitação pelas pacientes•Resultado é imediato•Produz imagens em tempo real•Permite um diagnóstico muito claro quanto à formação do feto, detecção de alterações anatômicas•Baixo custo•Investigação do efeito de agentes teratogênicos

DESVANTAGENS

•Depende muito da habilidade do operador do aparelho•Resolução espacial muito abaixo daquela obtida com TC ou RMN •Não se dispõe, até o momento, de bons contrastes.

TESTES NÃO-INVASIVOS

TRIAGEM DE SORO MATERNO

• α -Fetoproteína (AFP): no líquido amniótico até ± 14ª semana de gestação

drasticamente após 14ª semana

• Nivel de AFP no líquido amniótico é elevado- Feto com NTD- Fornece teste pré-natal confiável para esta condição

•Dosagem de AFP Ultra-sonografia Diagnóstico de NTDs abertos (espinha bífida aberta e anencefalia)

VANTAGENS

• Procedimento de triagem populacional não-invasivo e seguro para os NTD

• Alta sensibilidade do teste

DESVANTAGENS

•Esta técnica não é considerada diagnóstico confirmatório, mas um marcador de risco•Necessidade de ultra-sonografia para confirmação de diagnóstico de NTDs

VANTAGENS• Procedimento de triagem populacional

não-invasivo e seguro para os NTD

• Alta sensibilidade do teste (< para detecção de NTD que para diagnóstico da AFP amniótica)

• Não impõe nenhum risco de perda fetal

• Serve como medida efetiva de triagem que aumenta a detecção pré-natal de fetos com várias anormalidades, como NTD, trissomia do 18 e síndrome de Down

DESVANTAGENS

•Pode indicar a necessidade de teste diagnóstico•Triagem falso-positiva pode ser provocada por subestimação da idade gestacional, gestação múltipla inesperada ou hemorragia de placenta

TESTES NÃO-INVASIVOS

•MSAFP: AFP difunde através das membranas fetais até soro materno

•Período: 15a e 17a semanas depois do último período menstrual

•Risco < 6% (1/15)

•Mulher com MSAFP → Escolher se submeter a amniocentese para determinar realmente presença de feto com NTD

•MSAFP baixa Síndrome de Down

TRIAGEM DE SORO MATERNO

TESTES NÃO-INVASIVOS

ISOLAMENTO DE CÉLULAS FETAIS DA CIRCULAÇÃO MATERNA

•Gravidez → Pequeno número de células fetais (hemácea nucleada por exemplo) entra na corrente sanguínea materna

•Período: 6a a 8a semanas depois do último período menstrual

•PROCEDIMENTO:

- Separação de grande variedade de células fetais no sangue materno por diversas técnicas

-Seleção de células fetais no sangue materno com o uso de anticorpos monoclonais

• FISH: Análise cromossômica, como trissomias do 13, 18 e 21

• PCR: Testar no limitado de doenças monogênicas

VANTAGENS• Requer pequena amostra de sangue

materno

• Não impõe risco ao feto

• Diagnóstico pré-natal de alguns distúrbios monogênicos e análise cromossômica

DESVANTAGENS•Persistência dos linfócitos fetais na circulação materna pode confundir o uso de amostragem de células fetais nas gestações subsequentes•Técnica está em estágio inicial de desenvolvimento

Frequência das aberrações comossômicas encontradas nesses testes

Aberrações estruturais

•Translocações reciprocas ou robertsonianas são as mais encontradas (RYU, 2001);

•A maior parte dessas translocações são herdadas de um dos pais. Podem também ser novos rearranjos cromossômicos;

•As aberrações estruturais também podem ser inversões, deleções, aumento do material genético ou presença de cromossomos marcadores.

Importância

•O diagnóstico pré-natal é importante para dar informações sobre a gravidez às mulheres que pertencem ao grupo de risco da população.

•A indicação de testes mais invasivos como amniocentese é para mulheres em idade materna avançada, com parentes com anormalidades cromossômicas, mulheres que já tiveram bebês com aberrações comossômicas entre outros.

•Na população a taxa de nascidos com aberrações cromossômicas é de 0.5%.

ANÁLISE DE CASO

Casal não-consangüíneo; mulher de 37 anos, no 26º mês de gestação indicada ao hospital para realização de exames, após resultados de um ultrassom realizado na semana anterior: feto (sexo masculino) apresentava micrognatia, orelhas e nariz pequenos, ventriculomegalia, hipoplasia cerebelar, rim policístico e diversas anomalias cardíacas graves;

Amniocentese realizada. Cariotipagem convencional de 15 células revelou que o feto possuía um cromossomo 6 anormal, com o braço p mais curto do que o usual (Fig. 1);

Cariótipo dos pais normal, indicando uma origem “de novo” do rearranjo estrutural cromossômico;

(C. Colmant et al. - França - Prenatal Diagnosis Journal / Wiley InterScience - Junho 2009)

ANÁLISE DE CASO

Deleção do braço curto do cromossomo 6 é de ocorrência rara, e é normalmente diagnosticada após o nascimento. Neste caso o diagnóstico é obtido por procedimento pré-natal;

Após aconselhamento multidisciplinar, baseado no prognóstico pobre em relação aos achados do ultrassom, e no rearranjo estrutural cromossômico, o casal decidiu optar pelo aborto, possível neste caso (legislação francesa);

Autópsia confirmou os problemas propostos pelo ultrassom, como graves anomalias cerebrais, renais e cardíacas.

ANÁLISE DE CASO

Após gestação terminada, feita cultura de linfócitos de sangue do cordão umbilical. Realizado FISH (cromossomo 6 “whole cromossome painting”), indicando que o cromossomo 6 anormal era composto apenas por material de cromossomo 6;

A partir de uma cultura de fibroblastos do feto, foi retirada uma amostra de DNA total para se realizar um CGH array, que confirmou uma deleção intersticial em 6p (Fig. 2);

Perda cobria 15.2 Mb, de 6p24.3 a 6p22.3. Nenhum outro desbalanço foi identificado, e o cariótipo foi estabelecido: 46,XY,del(6)(p24.3p22.3)dn;

ANÁLISE DE CASO

ssddss(Fig. 1 - Cariotipagem convencional RHG, revelando um cromossomo 6 anormal, der(6), com o braço p mais curto do que o normal)

(Fig. 2 – CGH array, mostrando a deleção intersticial 6p22.3-p24.3)

ANÁLISE DE CASO

Reportado uma rara deleção intersticial “de novo” do 6p, cobrindo 15.2 Mb, caracterizada por: cariotipagem, FISH e CGH array. Até a data de publicação (junho/2009) apenas 2 casos de deleção no 6p haviam sido diagnosticados por exames pré-natais;Muitos genes referentes ao 6p desempenham um papel importante no desenvolvimento, e monossomias do 6p humano resultam em uma variedade de anormalidades relacionadas à organogênese, como nos rins, coração e sistema nervoso (apresentado pelo feto);

Este relato pode ser útil para a pesquisa de genes envolvidos no desenvolvimento humano e para aconselhamento genético.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

JORDE, L. B.; CAREY, J. C.; BAMSHAD, M. J.; WHITE, R. L. Genética Médica. 3a edição, Rio de Janeiro: Elsevier, p.326 - 339, 2004.

NAZARETH, H. R. S.; JUNIOR, W. P.; ANDRADE, J. A. D. Diagnóstico Pré-Natal de Aberrações Cromossômicas. Primeira Experiência Brasileira. Rev. Brasil. Genet. IV, 3, p. 459 – 470, 1981.

NUSSBAUM, R. L.; McINNES, R. R.; WILLARD, H. F. THOMPSON & THOMPSON Genética Médica. 6a edição, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 316 – 329, 2002.

PIERCE, B. A. Genética um enfoque conceitual. 1a edição, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 129 – 154, 2004.

PINTO, W. J. Diagnóstico pré-natal, p. 549 – 569, 2004. In: MIR, L. et. al. Genômica. 1a edição, São Paulo: Atheneu, 1191p., 2004.

COLMANT, C; BRISSET, S; TACHDJIAN, G; GAUTIER, V; FTOUKI, M; LAROUDIE, M; DRUART, L; FRYDMAN, R; PICONE, O. Interstitial deletion 6p22.3-p24.3 characterized by CGH array in a foetus with multiple malformations. Prenatal Diagnosis 29: 908–910, 2009.