diagnóstico molecular

Prof. Rúben Fernandes

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Introdução ao Diagnóstico Molecular

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Programa

1-O diagnóstico molecular

2-Técnicas de diagnóstico molecular

3-Fluorescência

4-Biomarcadores

5-Citogenética clássica e molecular

6-Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

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Diagnóstico molecular em medicina

O diagnóstico químico e molecular desempenha hoje um papel fundamental em medicina.

Pode-se assumir que os dados obtidos dos laboratórios clínicos contribuem para cerca de 50 a 80% do diagnóstico médico.

Além dos métodos clássicos de diagnóstico em bioquímica clínica (ensaios enzimáticos, fotometria, electroquímica, espectrometria de absoração atómica, métodos colorimétricos, …) os métodos imunológicos e genéticos ganharam uma importância nas últimas décadas.

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A tecnologia de análise de ácidos nucleicos também tem contribuído para o desenvolvimento do diagnóstico molecular

Tem-se verificado ainda, um aumento crescente do nosso conhecimento acerca das doenças genética e dos princípios moleculares da doença

O termo diagnóstico molecular pode ser usado em várias situações

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Definição sensu latu:

Utilização de métodos analíticos que são usados em laboratórios clínicos para determinar, em amostras de pacientes, a presença de moléculas ou da sua função.

Definição sensu strictum:

O termo diagnóstico molecular pode ser usado como abreviatura de diagnóstico genético molecular. E pode ser usado para a determinação das alterações no material genético (sequenciação), interpretação da sua informação (expressão genética) ao nível molecular (DNA ou mRNA).

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Importância/utilidade

- doenças genéticas- doenças infecciosas (virologia e bacteriologia)

Devido à grande sensibilidade e especificidade das técnicas e rapidez de detecção

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Doenças monogénicas e poligénicas

Doenças monogénicas

mutação ou perda de função de um único gene

padrão de hereditariedade (recessivo / dominante)

Doenças poligénicas

múltiplas modificações genéticas

maior frequência em algumas famílias mas

sem um padrão de herança genética típico/reconhecível

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Um exemplo típico de doença monogénica recessiva:

Fibrose quística – 1:600 – perda de função do canal Cl-

Gene CFTR (cystic fibrosis transmembrance conductance regulator)

-Para cada célula diploide, a alteração só se manifesta se ocorrer a perda da função do gene em ambos cromossomas homólogos;

-No entanto podem ocorrer heterozigóticos para o gene defeituoso – mas uma quantidade de suficiente de proteína funcional é produzida

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Fibrose quística

Cl-ATP

AMPc

Cl-

Cl-

Cl-ATP

AMPc

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Fibrose quística

Estatisticamente, ¼ da descendência de portadores desta condição será afectada (homozigóticos) para o gene com perda de função

Dadas as suas características, diagnóstico da FQ é obtido apenas por genética molecular

No entanto, apenas algumas mutações causam mais de 80% de perda de função da proteína

Existem ainda muitas mutações que causam proteínas imperfeitas

O diagnóstico é muito complexo

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As doenças dominantes (um único alelo é suficiente para desencadear a doença) são ainda mais raras que as recessivas

São geralmente causadas por novas mutações

A doença genética dominante mais frequente é talvez a cardiomiopatia hipertrófica (CMH) que é causada por mutações em diferentes proteína do músculo cardíaco.

As proteínas mais frequentemente afectadas são as proteínas do sarcómero, como por exemplo a β-miosina.

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Gene Name

MYH7 ß - Myosin heavy chain

MYBPC3 Cardiac myosin-binding protein C

TNNT2 Cardiac troponin T

TNNI3 Cardiac troponin I

TPM1 Tropomyosin 1 α

ACTC α Cardiac actin 1

MYL3 Essential myosin light chain 3

MYL2 Regulatory myosin light chain 2

LAMP2 Lysosome-associated membrane protein 2

PRKAG2 Noncatalytic AMP-activated protein kinase gamma 2

GLA Galactosidase alpha (Fabry)

CAV3 Caveolin 3 (Muscular dystrophy)

MTTG Mitochondrial transfer RNA glycine

MTTI Mitochondrial transfer RNA isoleucine

MTTK Mitochondrial transfer RNA lysine

TTR Transthyretin (Amyloidosis)

TNNC1 Troponin C

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Cardiomiopatia hipertrófica

Uma das complicações frequentes é a fibrilação ventricular, que conduz à morte cardíaca e afecta sobretudo homens saudáveis e desportistas.

Ataca sobretudo homens de meia idade o risco de morte aumenta com a idade devido ao aumento da insuficiência cardíaca;

Conhecem-se centenas de mutações que poderão causar CMH mas nenhuma delas é relativamente frequente (?)

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Causadas pela interacção de diferentes mutações em diferentes genes;

Individualmente as mutações não apresentam grandes efeitos, mas em conjunto podem ter consequências catastróficas;

Os diferentes genes ou alelos associados à doença referem-se como factores de risco;

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Ex: enfarte do miocárdio:

Um dos principais factores de risco é a hipercolesterolémia familiar

mutações

a) receptor da LDL (LDLR)

b) ou no seu ligando a ApoB100

forma mais suave de hipercolesterolémia

c) polimorfismos e mutações da ApoE

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Variabilidade individual

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Variabilidade individual / diagnóstico molecular

-Biologia forense-Tipagem HLA-Farmacogenómica-Susceptibilidade a doenças infecciosas-Virologia / bacteriologia / …-Epidemiologia/filogenia molecular-Resistências

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1. Biologia Forense

Base de dados de DNA do FBI: CODIS

Combined DNA Index System

Lançado em 1998

Utilizado para resolver crimes em série

Requer:

>4 marcadores RFLP

e/ou13 marcadores STR

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Biologia Forense

Base de dados de DNA do FBI: CODIS

STRs – short tandem repeats

AATG

Homozigóticos se ambos os alelos tiverem o mesmo tamanho

Heterozigóticos se os alelos tiverem tamanhos diferentes

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Cuidado !Primers diferentes produzem produtos de PCR (amplicões) de diferentes tamanhos para o mesmo alelo STR

195 bp / GTAA

170 bp / TCAT

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2 in

diví

duos

dife

rent

es

amelogenin

D19

D3

D8 TH01

VWA D21FGA

D16 D18 D2

amelogeninD19

D8 TH01VWA

D21FGA

D16D18 D2

D3

Identificação humana com um kit de multiplex STR

Análise simultânea de 10 STRs e identificação sexual

(AmpFlSTR® SGM Plus™ kit)

probabilidade de correspondência ao acaso: ~1 em 3 trilhões Tempo de todo o

processo de identificação: 5 horas

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2. Tipagem HLA

Sistema antigénio leucocitário humano (#6)

A espécie humana exibe um grande polimorfismo no gene HLA e os seus produtos (MHC I e MHC II) apresentam os antigénios às células T.

O sistema HLA contribui para a rejeição dos órgãos transplantados.

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Tipagem HLA

Um transplante só é levado a cabo se houver compatibilidade do sistema HLA.

A tipagem do sistema HLA pode

ser feito por FACS ou por geno-

tipagem.

FACS – Fluorescence activated cell sorting

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Tipagem HLA

Genotipagem do sistema HLA:

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1-Obtenção do sangue periférico

3-Amplificação dos alelos HLA2-Extracção de mRNA

4-Marcação fluorescente dos produtos amplificados

5-Hibridação num

microarray

6-Análise dos resultados e consulta de base de dados

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Tipagem HLA

Tipagem celular do sistema HLA:

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1-Obtenção do sangue periférico

2-Extracção dos leucócitos 3-Reacção imunológica in vitro com

atc marcados com fluorescência

4-Leitura no citómetro de

fluxo

5-Interpretação dos histogramas

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3. Farmacogenómica

Farmacogenética vs. Farmacogenómica

•É um campo da Farmacologia clínica

•Estuda a influência de factores genéticos na resposta à administração de fármacos

• Para cada gene isoladamente, interpretando os resultados experimentais

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Farmacogenómica

Farmacogenética vs. Farmacogenómica

•É o estudo de conjuntos “completos” de genes com relevância farmacológica

•De como evidenciam as suas variações

•De como essas variações interagem para produzir diferentes fenótipos

•De como esses fenótipos afectam a resposta à administração de fármacos

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100 mil pacientes morrem anualmente nos EUA devido a efeitos tóxicos ou secundários da administração de fármacos. Uma das principais razões está no polimorfismo genético.Amalia M. Issa, Nature Reviews, 2002, 1, 300-308 Pharmacogenomics, 2004, 5, 571-579

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Amalia M. Issa, Nature Reviews, 2002, 1, 300-308 Pharmacogenomics, 2004, 5, 571-579

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Farmacogenómica

Poucas são os sistemas enzimáticos que estão envolvidos no metabolismo de fármacos, como é o exemplo das oxidases do citocromo P450.

O complexo Citocromo oxidase P450 é extremamente polimórfico e é o responsável pela grande variabilidade individual ao metabolismo de um grande número de fármacos.

Actualmente, uma pequena quantidade de DNA pode ser usada para genotipar polimorfismos do CYP450

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Farmacogenómica

Genotipagem dos polimorfismos da citocromo oxidase P450

(Roche-AmpliChip®)

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4. Susceptibilidade a doenças infecciosas

A variabilidade individual também se apresenta bastante importante na questão da sensibilidade a doenças infecciosas.

Muitos microrganismos reconhecem receptores celulares específicos do hospedeiro como “portas” de entrada neste. Muitos agentes patogénicos usam ainda os sistemas celulares do hospedeiro para sua replicação e secreção.

Tanto os receptores celulares como os marcadores de susceptibilidade intracelular podem ser analisados ao nível genómico.

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Susceptibilidade a doenças infecciosas

4.1. Susceptibilidade genética

A síndrome da imunodeficiência grave combinada (SCID) é uma doença que está presente à nascença e deve-se à deficiência em ADA (Adenosina desaminase)

Maior susceptibilidade às infecções

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SCID

Diagnóstico:

Imunológico (Citometria de fluxo, ELISA, RIA, Western):

- Função imunológica do sangue- Níveis de células B e T- Níveis de IgG, IgA, IgM

Bioquímico-Actividade da enzima

Efectuam-se ensaios in vitro em culturas celulares e os metabolitos são analisados por electroforese capilar (ou HPLC, TLC bidimensional)

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Terapêutica da SCID

Terapia genética/celular

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Terapêutica da SCID

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Susceptibilidade a doenças infecciosas

4.2. Resistência genética

A síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) em alguns indivíduos pode ser mais dificilmente adquirida devido à mutação num gene de um receptor celular (CCR5), denominada de ∆ 32

Menor susceptibilidade ao HIV

HIV-1 interacts with a cell-surface receptor, primarily CD4, and through conformational changes becomes more closely associated with the cell through interactions with other cell-surface molecules, such as the chemokine receptors CXCR4 and CCR5.

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Diagnóstico da “resistência” ao HIV

Gene CKR-5 wildtype responsável pelo fenótipo normal da CCR5 a o gene mutado EU CKR-5 responsável pelo fenótipo de susceptibilidade reduzida ao HIV.

Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some Multiply-Exposed

Individuals to HIV-1 Infection Liu et al. (1996). Cell, 86, 367–377,.

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Diagnóstico da “resistência” ao HIV

A detecção da delecção 32 do gene receptor CCR5 (CKR5) faz-se mediante PCR convencional:

Electroforese de produtos amplificados por PCR. 1 – marcador; 2 – indivíduo homozigótico para o CKR5-WT; 3 e 5 – homozigóticos para a mutação (EU CKR5); 4 e 6 – heterozigóticos (CKR5-WT/EU CKR5).Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some Multiply-Exposed Individuals to HIV-1 Infection Liu et al. (1996). Cell, 86, 367–377.

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5. Diagnóstico molecular de agentes infecciosos

O diagnóstico molecular de agentes infecciosos (vírus, bactérias, leveduras e fungos filamentosos, microparasitas) tem vindo a ganhar terreno relativamente aos métodos microbiológicos convencionais (culturais, bioquímicos, imunológicos, celulares, …)

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HIV

Diagnóstico:

Imunológico (Western-blotting, ELISA)

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HIV

Diagnóstico:

Imunológico (Western-blotting, ELISA)

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HIV

Diagnóstico:

Genético (RT-PCR)

Além do diagnóstico – carga viral

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6. Epidemiologia molecular/filogenia molecular

A identificação de surtos infecciosos tem utilizado importantes ferramentas da filogenia e da biologia molecular:

Importância:

-Doenças infecciosas de origem hospitalar/comunitário-Doenças infecciosas de origem alimentar

Técnicas de genotipagem (molecular fingerprinting)

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Epidemiologia molecular

AfectadoNão afectado ?

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Afectado

Não afectado

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Afectado

Não afectado

A mesma estirpe?

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Existem vários métodos de fingerprinting molecular

MEE - multilocus enzyme electrophoresis; REA – restriction enzyme analysis;PFGE - pulsed field gel electrophoresis; RAPD – random amplified polymorphic DNA;AFLP – amplified fragment length polymorphism; MLST – multiple locus sequence subtyping; MLVA - multiple locus variable number of tandem repeat analysis;MBMS –microarray-based multi-target sequencing

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Enterobacterial repetitive intragenic consensus (ERIC) fingerprinting profiles of multidrug-resistant (MDR) Escherichia coli (A) and Klebsiella pneumoniae (B) isolated from bloodstream-infected patients from two distinct Portuguese hospitals A and B. Dendrograms were generated by UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic averages) analysis of the agarose gels contrastained by rainbow algorithm with Pearson’s correlation coefficient. Bloodstream infections caused by multidrug-resistant Enterobacteriaceae: report from twodifferent Portuguese hospitals. Fernandes et al. (2008). J Hospital Infection, 70(1):93-5.

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7. Resistência aos xenobióticos

As estirpes bacterianas possuem uma genética que lhes permite a rápida aquisição de genes de resistência a poluentes ambientais, metais pesados, antibióticos entre outros.

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Genética molecular da resistência

Mutações espontâneas em genes endógenos￭Genes estruturais: aumento do espectro da actividade enzimática, modificação do alvo, defeitos no transporte￭Genes reguladores: aumento da expressão

Aquisição de genes exógenos:￭Geralemente genes que codificam enzimas inactivadoras ou alvos modificados e genes reguladores￭Mecanismos de transferência de DNA: conjugação (contacto célula-célula); transformação (uptake do DNA em solução); transdução (transferência de DNA por bacteriófagos)

Expressão dos genes de resistência￭Indução reversível/os sistemas de repressão podem afectar os fenótipos de resistência

diagnóstico molecular

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