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Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento Marluce Aparecida Assunção Oliveira Bióloga, Especialista em Microbiolgia Especialista em Gestão Institucional - MBA Mestre em Ciências Biológicas - Microbiologia Doutoranda em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical Chefe do Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas Fundação Ezequiel Dias - LACEN/MG

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Page 1: Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratament Diagnóstico laboratorial

Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação

I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento

Marluce Aparecida Assunção Oliveira

Bióloga, Especialista em MicrobiolgiaEspecialista em Gestão Institucional - MBA

Mestre em Ciências Biológicas - Microbiologia Doutoranda em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical

Chefe do Serviço de Doenças Bacterianas e FúngicasFundação Ezequiel Dias - LACEN/MG

Page 3: Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratament Diagnóstico laboratorial

Sorovar específica

• Resposta predominantemente humoral (anticorpos).

Antigenicidade

• Atígenos de superfície (LPS); • Compartilhamento de antígenos.

Resposta imune a Leptospira spp.

-

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Bacteriuria

Imunidade

Bacteremia

Fases

Diagnóstico sorológico

IgGIgM

Concentração de anticorpos

anosmeses40 semana

30

semana20 semana

10 semanaEscala de tempo

Evolução da resposta humoral (anticorpos)

Isolamento e PCR

(adap. Royal Tropical Institute, Netherlands)

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Diagnóstico Laboratorial

1ª fase da doença ou fase leptospirêmica (04 - 07dias).

• Cultivo.• Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

2ª fase da doença ou fase imunogênica (04 - 30 dias).

• Pesquisa em campo escuro.• MAT (Teste de aglutinação microscópica).

• ELISA (Ensaio imunoenzimático).• PCR (Reação em cadeia da polimerase).

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CULTURA

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Cultura de Leptospira spp.

O isolamento de leptospiras

depende do material

biológico de escolha e do

tempo de evolução da

doença.

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Cultivo de Leptospira spp.

Meio semi-sólido

Meio líquido

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Hemocultura• Exame qualitativo

• Fase de leptospiremia: primeiros 10 dias de doença

antes do início da antibióticoterapia;

• Coleta em condições assépticas;

• 1,2 e 3 gotas de sangue total em três respectivos tubos;

• Incubação 28-30oC / abrigo da luz / aprox. 4 meses;

• Acompanhamento semanal por microscopia de campo

escuro.

5 mL meio de cultura semi sólido

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MICROAGLUTINAÇÃO

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Sorovares e cepas - Microaglutinação. SOROVARES CEPAS

andamana CH 11 australis Ballico

autumnalis Akiyami A ballum Mus-127

bataviae Swart bratislava Jez Bratislava canicola Hond Utrecht

castellonis Castellon 3 celledoni Celledoni cynopteri 3522 C

copenhageni M20 djasiman Djasiman

grippothyphosa Moskva V hardjo Hardjoprajitno

hebdomadis Hebdomadis icterohaemorrhgiae Icterohaemorrhgiae-RGA

javanica Veldrat Batavia 46 panama CZ 214 K

patoc Paatoc-I pomona Pomona

pyrogenes Salinem shermani 1342 K tarassovi Perepelitssin

wolffi 3705

Meio líquido

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Triagem - Exame qualitativo.

Leitura após incubação. Preparo da lâmina para visualização das

reações de cada sorovar/paciente

Leitura microscópica

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Visualização microscópica

Sem aglutinação

25% aglutinado 50% aglutinado

75% aglutinado 100% aglutinado

Microscopia de campo escuro (leitura):

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Titulação - Exame quantitativo

Soro

1709

CN = 100 l PBS + sorovar a ser titulado.

100 l soro diluído 1:50 + 100 l sorovar a ser titulado.

CN 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L

1:25.600

100L 100L

Hardjo

Icteroh.

Autum.

PatocWolffi

AstralisCanic.

Taras.

1:100, 1:200, 1:400 ..... ..... ......

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ELISA - IgM

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• Fase sólida com antígeno ou anticorpo mobilizado; • conjugado (ante imunoglobulina humana ligado a uma enzima); • adição do substrato;• formação de cor;• leitura por espectrofotometria (determina a relação entre a intensidade da cor e a quantidade do que está sendo medido).

ELISA-IgM para o diagnóstico de leptospira

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ELISA - exame qualitativo

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Perfil de reatividade - MAT e ELISA-IgM

Numero de soros positivos/2009

14,4%

36,1%

22,3%

17,2%

7,8%

2,2%

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ELISA - IgM reagente e MAT ≥ 800.

ELISA - IgM reagente e MAT reagente ≤ 800.

ELISA - IgM reagente.

ELISA indeterminada e MAT reagente ≤ 800.

ELISA indeterminada.

ELISA - IgM não reagente e MAT reagente ≤ 800

(IgM e IgG).

Perfil de reatividade

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ELISA IgM Sensibilidade 100%

ELISA IgM Especificidade 86 %

ELISA IgM Valor Preditivo Positivo 71%

ELISA IgM Valor Preditivo Negativo 100%

MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM

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ELISA IgM Sensibilidade 99,5% (IC 95% 98,0-100,0%)

ELISA IgM Especificidade 90,0% (IC 95% 88,5-91,5)

ELISA IgM Valor Preditivo Positivo

74,5% (IC 95% 66,7-80,9%)

ELISA IgM Valor Preditivo Negativo

99,8% (IC 95% 99,1-100%)

MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM

Concordância 92,3% (IC95% 89,6-94,4%).

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PANBIO BIOMANGUINHOS0

100

200

300

400

500

600

427 445

127 95

COM DIAG. DIFERENCIALSEM DIAG. DIFERENCIAL

Amostras com diagnóstico diferencial

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9% 2%

90%

KIT ELISA - IgM Panbio

REAGENTE INDETERMINADO NÃO REAGENTE

N= 127 (R-11; I-2; NR-114)

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IN DO CO ELISA MAT DF

9 0,429 0,261 REAGENTE andamana1/200; ballum1/100; shermani1/400; tarassovi1/400;

FEBRE MACULOSA IgM: IFI REAGENTE

3 0,636 0,224 REAGENTE andamana1/200; australis1/100; ballum1/100; bratislava1/100;

sejroe1/100; hardjo1/100; icterohaemorrhagiae1/100; patoc1/100; tarassovi1/800

HEPATITE C (ANTI-HCV): ELISA REAGENTE

23 0,183 0,163 REAGENTE NÃO REAGENTE LEISHMANIOSE VISCERAL : IFI

REAGENTE

14 0,299 0,163 REAGENTE NÃO REAGENTE FEBRE MACULOSA IgG: IFI REAGENTE

9 0,2 0,163 REAGENTE NÃO REAGENTE LEISHMANIOSE VISCERAL : IFI

REAGENTE

IN: curso da doença; DO: leitura do teste; CO ponto de corte; DF: diagnóstico diferencial.

ELISA- IgM BIOMANGUINHOS x MAT

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Conclusões

• Baseado no VPN : o método de ELISA - IgM é um bom método para triagem de amostras de pacientes com suspeita de leptospirose diminuindo assim o número de amostras examinadas pelo método de microaglutinação .

• É necessário a realização da microaglutinação para todas as amostras que apresentarem resultados indeterminado ou reagente na ELISA - IgM.

• Quando expandido o intervalo entre inicio de sintomas e data de coleta, verificamos maior sensibilidade da ELISA - IgM, assim, todo amostra coletada antes de 10 dias de curso da doença deverá ser encaminhada 2ª amostra após uma semana da data da coleta da 1ª.

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-Todas as amostras (soro) de pacientes com suspeitas de leptospirose são analisadas (triadas) pelo método ELISA-IgM.

-Somente as amostras (soro) que apresentarem resultados indeterminado ou reagente quando analisadas pelo método de ELISA-IgM serão analisadas pelo método de Aglutinação Microscópica (MAT).

-Amostras (soro) de pacientes com um mês ou mais de início de sintomas serão processadas as duas metodologias, ELISA-IgM e MAT.

Diagnóstico de Leptospirose - Lacen MG (desde 2011)

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- Todos os laudos que apresentarem resultados não reagente para leptospirose constarão apenas a descrição do resultado do ELISA-IgM, os que apresentarem resultados indeterminados ou reagente pelo método de ELISA-IgM constarão da descrição dos resultados do ELISA-IgM e MAT.

-Todas as amostras (soro) devem ser encaminhadas juntamente com a ficha SINAN, e a data de coleta e início de sintomas são informações fundamentais para a análise dos resultados laboratoriais, portanto, de preenchimento obrigatório.

Diagnóstico de Leptospirose (desde 2011)

Sempre que possível ofereça [email protected]

Obrigada