diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação i simpósio baiano de dengue e...
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Diagnóstico laboratorial de leptospirose: triagem e confirmação
I Simpósio Baiano de Dengue e Leptospirose: Diagnóstico e Tratamento
Marluce Aparecida Assunção Oliveira
Bióloga, Especialista em MicrobiolgiaEspecialista em Gestão Institucional - MBA
Mestre em Ciências Biológicas - Microbiologia Doutoranda em Ciências da Saúde - Infectologia e Medicina Tropical
Chefe do Serviço de Doenças Bacterianas e FúngicasFundação Ezequiel Dias - LACEN/MG
Antígenos versus Anticorpos
Leptospira spp.
Sorovar específica
• Resposta predominantemente humoral (anticorpos).
Antigenicidade
• Atígenos de superfície (LPS); • Compartilhamento de antígenos.
Resposta imune a Leptospira spp.
-
Bacteriuria
Imunidade
Bacteremia
Fases
Diagnóstico sorológico
IgGIgM
Concentração de anticorpos
anosmeses40 semana
30
semana20 semana
10 semanaEscala de tempo
Evolução da resposta humoral (anticorpos)
Isolamento e PCR
(adap. Royal Tropical Institute, Netherlands)
Diagnóstico Laboratorial
1ª fase da doença ou fase leptospirêmica (04 - 07dias).
• Cultivo.• Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
2ª fase da doença ou fase imunogênica (04 - 30 dias).
• Pesquisa em campo escuro.• MAT (Teste de aglutinação microscópica).
• ELISA (Ensaio imunoenzimático).• PCR (Reação em cadeia da polimerase).
CULTURA
Cultura de Leptospira spp.
O isolamento de leptospiras
depende do material
biológico de escolha e do
tempo de evolução da
doença.
Cultivo de Leptospira spp.
Meio semi-sólido
Meio líquido
Hemocultura• Exame qualitativo
• Fase de leptospiremia: primeiros 10 dias de doença
antes do início da antibióticoterapia;
• Coleta em condições assépticas;
• 1,2 e 3 gotas de sangue total em três respectivos tubos;
• Incubação 28-30oC / abrigo da luz / aprox. 4 meses;
• Acompanhamento semanal por microscopia de campo
escuro.
5 mL meio de cultura semi sólido
MICROAGLUTINAÇÃO
Sorovares e cepas - Microaglutinação. SOROVARES CEPAS
andamana CH 11 australis Ballico
autumnalis Akiyami A ballum Mus-127
bataviae Swart bratislava Jez Bratislava canicola Hond Utrecht
castellonis Castellon 3 celledoni Celledoni cynopteri 3522 C
copenhageni M20 djasiman Djasiman
grippothyphosa Moskva V hardjo Hardjoprajitno
hebdomadis Hebdomadis icterohaemorrhgiae Icterohaemorrhgiae-RGA
javanica Veldrat Batavia 46 panama CZ 214 K
patoc Paatoc-I pomona Pomona
pyrogenes Salinem shermani 1342 K tarassovi Perepelitssin
wolffi 3705
Meio líquido
Triagem - Exame qualitativo.
Leitura após incubação. Preparo da lâmina para visualização das
reações de cada sorovar/paciente
Leitura microscópica
Visualização microscópica
Sem aglutinação
25% aglutinado 50% aglutinado
75% aglutinado 100% aglutinado
Microscopia de campo escuro (leitura):
Titulação - Exame quantitativo
Soro
1709
CN = 100 l PBS + sorovar a ser titulado.
100 l soro diluído 1:50 + 100 l sorovar a ser titulado.
CN 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L 100L
1:25.600
100L 100L
Hardjo
Icteroh.
Autum.
PatocWolffi
AstralisCanic.
Taras.
1:100, 1:200, 1:400 ..... ..... ......
ELISA - IgM
• Fase sólida com antígeno ou anticorpo mobilizado; • conjugado (ante imunoglobulina humana ligado a uma enzima); • adição do substrato;• formação de cor;• leitura por espectrofotometria (determina a relação entre a intensidade da cor e a quantidade do que está sendo medido).
ELISA-IgM para o diagnóstico de leptospira
ELISA - exame qualitativo
Perfil de reatividade - MAT e ELISA-IgM
Numero de soros positivos/2009
14,4%
36,1%
22,3%
17,2%
7,8%
2,2%
ELISA - IgM reagente e MAT ≥ 800.
ELISA - IgM reagente e MAT reagente ≤ 800.
ELISA - IgM reagente.
ELISA indeterminada e MAT reagente ≤ 800.
ELISA indeterminada.
ELISA - IgM não reagente e MAT reagente ≤ 800
(IgM e IgG).
Perfil de reatividade
ELISA IgM Sensibilidade 100%
ELISA IgM Especificidade 86 %
ELISA IgM Valor Preditivo Positivo 71%
ELISA IgM Valor Preditivo Negativo 100%
MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM
ELISA IgM Sensibilidade 99,5% (IC 95% 98,0-100,0%)
ELISA IgM Especificidade 90,0% (IC 95% 88,5-91,5)
ELISA IgM Valor Preditivo Positivo
74,5% (IC 95% 66,7-80,9%)
ELISA IgM Valor Preditivo Negativo
99,8% (IC 95% 99,1-100%)
MAT (Padrão ouro) versus ELISA - IgM
Concordância 92,3% (IC95% 89,6-94,4%).
PANBIO BIOMANGUINHOS0
100
200
300
400
500
600
427 445
127 95
COM DIAG. DIFERENCIALSEM DIAG. DIFERENCIAL
Amostras com diagnóstico diferencial
9% 2%
90%
KIT ELISA - IgM Panbio
REAGENTE INDETERMINADO NÃO REAGENTE
N= 127 (R-11; I-2; NR-114)
IN DO CO ELISA MAT DF
9 0,429 0,261 REAGENTE andamana1/200; ballum1/100; shermani1/400; tarassovi1/400;
FEBRE MACULOSA IgM: IFI REAGENTE
3 0,636 0,224 REAGENTE andamana1/200; australis1/100; ballum1/100; bratislava1/100;
sejroe1/100; hardjo1/100; icterohaemorrhagiae1/100; patoc1/100; tarassovi1/800
HEPATITE C (ANTI-HCV): ELISA REAGENTE
23 0,183 0,163 REAGENTE NÃO REAGENTE LEISHMANIOSE VISCERAL : IFI
REAGENTE
14 0,299 0,163 REAGENTE NÃO REAGENTE FEBRE MACULOSA IgG: IFI REAGENTE
9 0,2 0,163 REAGENTE NÃO REAGENTE LEISHMANIOSE VISCERAL : IFI
REAGENTE
IN: curso da doença; DO: leitura do teste; CO ponto de corte; DF: diagnóstico diferencial.
ELISA- IgM BIOMANGUINHOS x MAT
Conclusões
• Baseado no VPN : o método de ELISA - IgM é um bom método para triagem de amostras de pacientes com suspeita de leptospirose diminuindo assim o número de amostras examinadas pelo método de microaglutinação .
• É necessário a realização da microaglutinação para todas as amostras que apresentarem resultados indeterminado ou reagente na ELISA - IgM.
• Quando expandido o intervalo entre inicio de sintomas e data de coleta, verificamos maior sensibilidade da ELISA - IgM, assim, todo amostra coletada antes de 10 dias de curso da doença deverá ser encaminhada 2ª amostra após uma semana da data da coleta da 1ª.
-Todas as amostras (soro) de pacientes com suspeitas de leptospirose são analisadas (triadas) pelo método ELISA-IgM.
-Somente as amostras (soro) que apresentarem resultados indeterminado ou reagente quando analisadas pelo método de ELISA-IgM serão analisadas pelo método de Aglutinação Microscópica (MAT).
-Amostras (soro) de pacientes com um mês ou mais de início de sintomas serão processadas as duas metodologias, ELISA-IgM e MAT.
Diagnóstico de Leptospirose - Lacen MG (desde 2011)
- Todos os laudos que apresentarem resultados não reagente para leptospirose constarão apenas a descrição do resultado do ELISA-IgM, os que apresentarem resultados indeterminados ou reagente pelo método de ELISA-IgM constarão da descrição dos resultados do ELISA-IgM e MAT.
-Todas as amostras (soro) devem ser encaminhadas juntamente com a ficha SINAN, e a data de coleta e início de sintomas são informações fundamentais para a análise dos resultados laboratoriais, portanto, de preenchimento obrigatório.
Diagnóstico de Leptospirose (desde 2011)
Sempre que possível ofereça [email protected]
Obrigada