diagnóstico laboratorial anemias hereditárias prof. paulo roberto de melo reis

Diagnóstico Laboratorial

Anemias Hereditárias

Prof. Paulo Roberto de Melo Reis

Conteúdo do eritrócito

250 a 350 milhões de moléculas de hemoglobina

Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

Genética da hemoglobina

Cadeia beta Cadeia alfa 141 aa 146 aa


Hemoglobinas fisiológicas

A combinação de duas

cadeias alfa ( ) com

duas beta ( ) formam as

hemoglobinas. Portanto,

a hemoglobina tem

estrutura tretamérica.

22Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

Tipos de Hb após 6 meses de vida

Tipos de Hb Composição Concentração

A 2296 – 98%

A2 222 – 4%

FETAL 220 – 1%

Dados: Paulo César Naoum – Hemoglobinopatias e Talassemias


ANEMIA

TRATAMENTO

Avaliação entre 30 e 60 dias

Responsiva Não responsiva

Cura

Refratária ao tratamento

Anemia hereditáriaTalassemia ( alfa, beta)

Hemoglobinopatia

Anemia adquiridaSideroblástica

Conduta terapêutica na anemia microcítica hipocrômica

Ferro Normal e ferritina


É um grupo heterogêneo de distúrbios hereditários que ocorre por alterações gênicas dos cromossomos e que apresentam como conseqüência alterações de membrana, deficiência de produção enzimática e de preenchimento hemoglobínico do eritrócito,

tanto qualitativa quanto quantitativamente.



A história familiar e descendência tomam caráter decisivo na elucidação das anemias hereditárias, em especial as hemoglobinopatias e talassemias.



Defeitos de membrana

EsferocitoseOvalocitose

Estomatocitose

Defeitos metabólicos

Piruvato quinasePirimidina 5-nucleotidase

G-6-FDGlutitiona redutase

Defeitos na hemoglobina

Síntese deficiente:

Talassemia ;

Variantes anormais:

HbS,

HbC


Prevalência de anemias hereditárias no Brasil

Talassemia alfa– mínima 20 - 25% Talassemias alfa – menor 3 – 6% Deficiência de G6FD 3% em brancos

15% em negros Hb AS 2% em brancos

10% em negros Talassemia Beta menor - Descente de Italiano

1% 6%

Hb AC 0,5 % 3% em negros

Esferocitose 1:500 Eliptocitose 1:500 Talassemia Beta maior 2,5:100.000


PRINCIPAIS TIPOS DE TALASSEMIAS

TALASSEMIA ALFA

TALASSEMIAS BETA

TALASSEMIAS INTERATIVAS

FENÓTIPOS TALASSÊMICOS


ORIGEM DAS TALASSEMIAS

Talassemia alfa Ásia e áfrica

Talassemia beta Mediterrâneo


Talassemia beta

As talassemias beta ocorrem por falha do gene que sintetiza a globina beta, situados no cromossoma 11.

A diminuição da globina beta prejudica sua associação com a globina alfa

NORMAL TAL. BETA TAL.+ TAL. 0

MENOR MAIOR MAIOR

Definição


CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA DAS TALASSEMIAS BETA

HEMOGLOBINA (g/dl) < 7 7 - 10 10 - 13 > 13

RETICULÓCITO 2 - 15 2 - 10 2 - 5 0,5 - 2

ERITROBLASTO + + + + +/ + - - - - - -

ERITRÓCITOS + + + + + + + / -

ALTERADOS

ICTERÍCIA + + + / - - - - - - -

ESPLENOMEGALIA + + + + + - / + - - -

ALTERAÇÕES + + +/ + + + + - - - - - -

ESQUELÉTICAS

NECESSIDADE DE + + + + / - - - - - - -

TRANSFUSÕES

MAIOR INTERMÉDIA MENOR MÍNIMA


Talassemia Beta


Talassemia beta


Pontilhado basófilo


Talassemia beta


Talassemia Beta


TALASSEMIA ALFA

CONSEQÜÊNCIAS da LESÃO GENÉTICA NO CROMOSSOMO 16

O DESEQUILÍBRIO /.

Sobra cadeia que tetramerizam-se FORMANDO Hb H (4)


RESUMO DAS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS

()

Hb Fetal 0 - 1%

Hb A2 2,0 - 4%

Hb A 96 - 98%

Conseqüências da redução de síntese de cadeias alfa

ALFA TALASSEMIA

Traços de Hb H na eletroforese

Precipitados de Hb H nos eritrócitos

Discreta microcitose

Anemia ()


RESUMO DAS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS

( )

DOENÇA DE Hb H

Hb H (10 - 20%) na eletroforese

Precipitados de Hb H nos eritrócitos

Anemia microcítica - hipocrômica (+, ++)

HCM

Hb A2

Esplenomegalia

Síndrome hidrópica (Hidropsia Fetal)

Hb Bart’s 80 - 100%

Hb H 10%

Anemia eritroblástica (++++)


Talassemia alfa Relações laboratoriais

Mínima Menor Doença da Hb H

Hidropisia fetal

VCM 74-85 72-80 60-72 80-100

Hb 11-15 10-13 8-10 <7

% Hb H

Traços-2%

2 -5 5-20 0-20


Talassemia alfaResumo:

Hemoglobina H:

Tetrâmero de cadeias beta

Hb H = 4

Hemoglobina de Bart´s:

Tetrâmero de cadeias gama

Hb Bart´s = 4


Talassemia alfa Hidropisia fetal


Hemoglobinas variantes

É um grupo de anormalidades hereditárias em que a produção de hemoglobina normal é suprimida e substituída, parcial ou totalmente, pela formação de uma ou mais das muitas variantes hemoglobínicas.


Hemoglobina S

• É causada por uma mutação no gene beta da globina.

• Há substituição de um base nitrogenada do códon GAC para GTC, resultando na substituição do ácido glutâmico (Glu) pela valina (Val) na posição 6 da globina beta.


HISTÓRICO DA DOENÇA FALCIFORME

1835 - CRUZ JOBIM (BR)

1846 - LEBBY (USA)

1896 - HODENPY (USA)

1908 – JESSE ACIOLY(BR)

PACIENTES NEGROS COM ANEMIA GRAVE

ICTERÍCIA

DORES AGUDAS


Hemoglobina C


• Há substituição do ácido glutâmico (Glu) pela lisina (Lis) na posição 6 da globina beta.


CÉLULAS EM ALVO NA Hb C/TAL BETA


Hemoglobina D

• D Los Angeles o ác. glutâmico (Glu) é substituído pela glutamina (Gln) na posição 121 da globina beta.

•D Bushman A Glicina (Gli) é substituída pela

arginina (Arg) na posição 16 da globina beta.

Apresenta a mesma mobilidade eletroforética da Hb S

OUTRAS


Hemoglobina E


•Há substituição do lisina (Lis) é substituída pelo

ácido glutâmico (Glu) na posição 26 da globina beta.

Tem mobilidade eletroforética ligeiramente a frente da Hb C – causando confusão.


HEMOGLOBINAS VARIANTES

CERCA DE 400 TIPOS DIFERENTES SEM CONSEQUÊNCIAS PATOLÓGICAS. Ex. Hb N, Hb J, Hb G, Hb Porto Alegre

APENAS Hb S E Hb C CAUSAM PATOLOGIA

Hb S (SS, SC, SD, S/Tal) FALCIZAÇÃO DO ERITRÓCITO

Hb C (SC, CC, S/Tal) CRISTALIZAÇÃO DA Hb

Métodos para diagnosticar hemoglobinopatias e talasemias

Métodos auxiliares:

1. Resistência globular a salina 0,36%

2. Dosagem de Hb Fetal

3. Pesquisa de Hb Fetal

4. Teste de Falcização

5. Pesquisa de Talassemia Alfa (Hb H)

6. Pesquisa de Corpos de Heinz

Métodos básicos:

1. Eletroforese Alcalina

2. Eletroforese Ácida3. Dosagem de A2


Talassemias LABORATÓRIO ESPECÍFICO

presença de Hb H: Tal. alfa

aumento de Hb A2: tal. beta menor

diminuição ou ausência de Hb A: ta l. beta maior

elevação > 20% de Hb fetal: tal. beta maior

reticulocitose: anemias hemolíticas

aumento de bilirrubina indireta: anemias hemolíticas


Triagem

Interpretação: Deficiência de hemoglobinização

Teste de resistência globular a salina 0,36%


Dosagem de Hemoglobina Fetal

Método de:

1) Singer – concentrações

2) Betke - concetrações


Coloração intra-eritrocitária de Hemoglobina Fetal

Método de Kleihauer e Betke (modificado por Shepard e cols., 1962)

Princípio:

A hemoglobina Fetal é acido-resistente e não sofre eluição. Cora-se pela eritrosina. As outras hemoglobinas são eluidas e não se coram pela eritrosina


Teste de falcização das hemácias

Princípio:

O metabisulfito de sódio reduz a tensão de oxigênio e fazendo com que hemoglobina S tome a forma característica de foice, ou de meia-lua.

Metabissulfito de sódio a 2%


Pesquisa intra-eritrocitáriaHemoglobina H

Pesquisa intra-eritrocitária – Azul brilhante de cresil

100 ul sangue

200 ul ACB

Incubar 2 horas


Talassemia alfa Hemoglobina H



Corpos de Heinz Hemoglobinas instáveis



Pesquisa intra-eritrocitáriaHemoglobina H Corpos de Heinz

Hemoglobinas instáveis

100 ul sangue

200 ul ACB

Incubar 2 horas


Reticulócitos

100 ul sangue

100 ul ACB

Incubar 30 minutos


Reticulócitos

Azul brilhante de cresil


Comparação

Hb H Corpos de Heinz Reticulócitos


Eletroforese

Eletro = Eletricidade

Forese = Separação


Eletroforese

É a migração de partículas quando

colocadas em campo elétrico.


Eletroforese

A migração indica o sinal da carga da partícula.

Este sinal será oposto ao do pólo para onde irá migrar.


Eletroforese de hemoglobina ACETATO DE CELULOSE:

Preparação do hemolisado

Tampão TRIS - pH=8,6

Padrão ( hemolisado controle)



Preparação do hemolisado teste e padrão:

50 ul de sangue

100 ul de saponina a 1%



A hemoglobina H é instável e os solventes

usados para remoção do estroma das

hemácias ( éter, clorofórmio, toluol, etc)

desnaturam a Hb H

Importante


- +

A AC A2 A

HbH

Eletroforese de Hemoglobina.Hemoglobina H


Eletroforese de hemoglobina

Eletroforese em acetato de celulose – TEB pH=8,6

Hemolisado com saponina a 1%.Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

Talassemia alfa Detalhe

Hb H


Eletroforese de Hemoglobina.Padrão normal

- +

Ap AC A2 A


ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS

AP AC A2/C S/D F A PERFIL

AA

AS

SS

AC

CC

AF


Perfil eletroforético comparativo


Eletroforese em acetado de celulose - Tampão TEB pH=8,6.

Hemolisado com solução de saponina a 1%.

SC AC AS SC AA


ELETROFORESE DE Hb BART’S E Hb H


ELETROFORESE DE Hb EM RN E ADULTO


ELETROFORESE DE Hb EMBRIONÁRIAS


HEMOGLOBINAS NORMAIS APÓS SEIS MESES DE VIDA

Hb A 96 a 98%

Hb A2 2 a 4%

Hb Fetal 0 a 1%Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

VARIANTES RARAS NÃO PATOLÓGICAS

Hb PORTO ALEGRE



Hb N BALTIMORE



Hb G FILADELFIA E Hb F TEXAS


MUTAÇÕES NAS REGIÕES EXTERNAS

ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM ACETATO DE CELULOSE


MUTAÇÕES NAS REGIÕES EXTERNAS

FAMÍLIA COM Hb C/TAL BETA



Eletroforese em ágar ácido – fosfato pH=6,2

Hemolisado com saponina a 1%.

Indicação: Diferenciar HBS da HBD-HBC da HBE


Padrão laboratorial

Hemoglobina S Homozigótica Heterozigótica HbS 89 a 99% 20 a 40% HbA Ausente 60 a 80% HbA2 1,5 a 3% 1,5 a 3% HbF 1 a 2 % 1 a 2 %

Hemoglobina C

HbC 100 % 20 a 40 %HbA Ausente 60 a 80% HbF < 7% Ausente


Ordem de migração de algumas hemoglobinas

- • HbA2 • HbD e HbS• HbL e HbP• HbG• HbQ• HbF• HbA• HbM e HbK• HbJ• HbN• Hb de Bart, HbI e HbH. +


Outras hemoglobinas

• HbG Norfolk• Hb de Bart• Hb Lepore• Hb Porto Alegre• Hb Gun Hill• Hb Freiburg• HbM Boston • HbM Saskatoon• HbM Iwate• HbM Hyde Park• HbF Texas• HbF Roma• Etc


Hemoglobinopatias

HbD – Homozigoto HbD/HbD - Semelhante a HbS, porém, pela ausência do fenômeno drepanótico.

O estigma HbA/HbD é assintomático.Ocorre: Índia e pequena % de negros nos EUA

HbE – Homozigoto HbE/HbE. O estigma HbA/HbE é assintomático.Ocorre: Sudeste Asiático.

HbS/HbC = 50% de cada.


Eletroforese

Ap AC A2 /C S A Hb SS Hb CC Hb SC

antes da transfusão

Eletroforese

após a transfusão

Ap AC A2 /C S A Hb SS Hb CC Hb SC

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