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MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO/MAPA SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA/SDA

COORDENAÇÃO GERAL DE APOIO LABORATORIAL/CGAL LABORATÓRIO NACIONAL AGROPECUÁRIO EM GOIÁS/LANAGRO-GO

Código: IT POA 248

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INSTRUÇÃO DE TRABALHO

Determinação de Amido e Carboidratos Totais em Produtos de Origem Animal por

Espectrofotometria UV/Vis

Emissão: 07/03/2014

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1. Objetivo Descrever a metodologia para quantificação do teor de amido e carboidratos totais em produtos de origem animal. Baseia-se na determinação espectrofotométrica a 620nm do composto colorido formado pela reação entre a antrona e a glicose, proveniente da hidrólise dos carboidratos totais. 2. Aplicação Este método é aplicado em produtos cárneos e pescados, no Laboratório POA do Lanagro-GO. 3. Referências Normativas e/ou Bibliográficas - BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução

Normativa nº 20, de 21 de julho de 1999: Oficializa os Métodos Analíticos Físico-Químicos, para Controle de Produtos Cárneos e seus Ingredientes - Sal e Salmoura. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 27 de julho de 1999. Seção 1, p. 10.

4. Termos e Definições FOR Formulário IT Instrução de Trabalho Lanagro-GO Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás POA Laboratório de Análises Físico-Químicas de Alimentos de Origem

Animal e Água RQ Responsável pela Qualidade RT Responsável Técnico UGQ Unidade de Gestão da Qualidade 5. Descrição da Instrução de Trabalho 5.1. Material

Nome Função Assinatura Data Elaboração: Camila Cheker Brandão RQ Substituta

Análise crítica: Rosana Aparecida de Freitas RQ

Aprovação: Zelita de Oliveira Lopes Brasil RT



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5.1.1. Equipamentos - Agitador vórtex - Balança analítica - Banho-maria - Centrífuga - Espectrofotômetro UV/Vis - Estufa - Processador de alimentos 5.1.2. Vidrarias e outros materiais - Balão volumétrico de 500mL - Bureta de 50mL - Cubeta de quartzo de 3mL - Faca, tábua de cortar carne - Funil - Micropipetas: faixa 50µL a 2000 µL - Pipetas volumétricas de 2 e 10mL - Tubo de centrífuga de 25mL - Tubos de ensaio 5.1.3. Reagentes e soluções - Solução de álcool etílico (C2H5OH) 80% (v/v); - Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,5N. Misturar, em capela, 14mL de ácido

sulfúrico p.a para 1 L de água destilada. Colocar sempre a água depois o ácido; - Éter etílico p.a; - Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 76:24. Misturar, em capela e banho de gelo,

76mL de ácido sulfúrico p.a em 24mL de água destilada. Colocar sempre a água depois o ácido;

- Solução de antrona (C14H10O): Dissolver 0,1g de antrona p.a em 100mL de ácido sulfúrico (H2SO4) 76:24. A solução é estável a 4ºC por vários dias, devendo ser descartada quando se tornar verde;

Nota 1: Uma vez que a antrona reage com celulose e outros contaminantes, é essencial lavar com álcool etílico p.a todos os frascos de vidro que serão postos em contato com ela. - Solução de D-glicose (C6H12O6) 0,01%. Esta solução é preparada no dia da

análise por diluição de solução estoque a 1% (m/v) de D-glicose p.a (a solução estoque pode ser preparada em uma solução de benzoato de sódio (C6H5COONa) a 0,1% (m/v), ou ser mantida gelada).



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Registrar o preparo das soluções no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções. 5.2. Descrição da metodologia 5.2.1. Elaboração da curva padrão Para elaboração da curva padrão, preparar inicialmente o extrato de carne, como se segue: - Pesar 0,5g ± 0,05g de carne mecanicamente separada de bovino, suíno ou de

aves ou músculo de pescado, diretamente no tubo de ensaio; - Adicionar 5mL de éter etílico, agitar em vórtex e centrifugar por 5 minutos a 1500

rpm, repetir essa etapa por 3 vezes; - Após as lavagens, secar o resíduo em estufa a 105ºC por 1 hora; - Monitorar a temperatura e o tempo da estufa, registrando no FOR UGQ 029 –

Controle de temperatura x tempo x metodologia; - Adicionar 10mL de solução de ácido sulfúrico 0,5N e colocar em banho-maria

fervente por 1 hora, tendo o cuidado de manter o nível da solução contida no tubo abaixo do nível de água do banho;

- Passar quantitativamente o conteúdo para um balão de 500mL e completar o volume com água destilada;

- Homogeneizar e deixar decantar; - Registrar o preparo no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções. Para fortificação com glicose para elaboração da curva padrão: - Pipetar alíquotas de 500, 750, 1000, 1250, 1500 e 2000µL da solução de D-

glicose a 0,01% para tubo de ensaio e adicionar o extrato de carne obtido acima, de modo que todos eles venham a conter um volume final de 2mL, obtendo-se assim as soluções padrões.

- Fazer um branco com 2mL de extrato de carne; - Adicionar 10mL de solução de antrona; - Colocar por 10 minutos em banho-maria fervente; - Retirar, esfriar e agitar antes da leitura; - Zerar o equipamento com o branco; - Proceder à leitura conforme descrito na IT POA 031 – Operação e Controle do

Espectrofotômetro UV/Vis. Ler as absorbâncias a 620nm; - Ler os padrões em triplicata e com as médias construir curvas padrão, lançando

no eixo das ordenadas (y) os valores de absorbância e no eixo das abscissas (x) as concentrações finais de glicose em cada tubo de 50, 75, 100, 125, 150 e



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200μg através das planilhas eletrônicas FOR POA 309 – Planilha de cálculo para Amido e FOR POA 310 – Planilha de cálculo para Carboidratos Totais.

- Obter a equação da curva padrão, imprimir e arquivar na pasta “curva de calibração de amido e carboidrato”.

Nota 2: Construir uma nova curva padrão toda vez que mudar o lote das soluções de glicose, ácido sulfúrico e antrona. 5.2.2. Preparo e leitura das amostras - Pesar 0,5g ± 0,05g de amostra perfeitamente homogeneizada, preparada de

acordo com a IT POA 032 – Características sensoriais e preparo de amostras de produtos lácteos e IT POA 052 – Características sensoriais e preparo de amostras de produtos cárneos e pescado, diretamente para tubo de centrífuga;

- Para carboidratos totais: Adicionar 5mL de éter etílico, agitar em vórtex e centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm, repetir essa etapa por 3 vezes;

- Para amido: Lavar adicionando 5mL de éter etílico, agitar em vórtex e centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm. Repetir essa etapa por 3 vezes e posteriormente, adicionar 5mL de solução a 80% (v/v) de álcool etílico à quente (em torno de 60° a 70°C aquecido em banho maria), repetindo essa etapa duas vezes;

- Após as lavagens, secar o resíduo em estufa a 105ºC por 1 hora. Monitorar a temperatura através do FOR UGQ 029 – Controle temperatura x tempo x metodologia;

- Adicionar 10mL de solução de ácido sulfúrico 0,5N e colocar em banho-maria fervente por 1 hora, tendo o cuidado de manter o nível da solução contida no tubo abaixo do nível de água do banho;

- Transferir quantitativamente o conteúdo do tubo para balão volumétrico de 500mL e completar o volume com água destilada;

- Homogeneizar e deixar decantar; - Pipetar 2mL desta solução para tubo de ensaio, previamente lavado com álcool

etílico (a presença de sujeira ou poeira no tubo pode produzir resultados errôneos), para amostras que contenham até 10% de carboidratos totais/amido. Para amostras que contenham acima de 10% de carboidratos totais/amido, pipetar 1mL da solução da amostra e mais 1mL de água destilada;

- Fazer um branco com 2mL de água destilada; - Adicionar 10mL de solução de antrona; - Levar ao banho-maria fervente por 10 minutos; - Retirar do banho e deixar esfriar; - Zerar o espectrofotômetro com o branco; - Proceder à leitura conforme descrito na IT POA 031 – Operação e Controle do

Espectrofotômetro UV/Vis, lendo a absorbância em 620nm;



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- Registrar o peso, a alíquota tomada e a absorbância de cada amostra em suas

respectivas Fichas de Análises. Nota 3: Para a confecção da carta controle, realizar vinte leituras do ponto 2000µL de D-glicose a 0,01% e seguir o estabelecido na IT UGQ 025 – Montagem de carta controle. 5.3. Cálculos e expressão de resultados Os resultados são calculados através das planilhas eletrônicas, FOR POA 309 – Planilha de cálculo para Amido e FOR POA 310 – Planilha de cálculo para Carboidratos Totais, para cálculo de amido e carboidratos totais, respectivamente, nas amostras. O resultado é expresso em %. 6. Controle de Registros FOR UGQ 029 – Controle de temperatura x tempo x metodologia FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções FOR POA 309 – Planilha de cálculo para Amido FOR POA 310 – Planilha de cálculo para Carboidratos Totais

7. Controle das Alterações

Item alterado Revisão alterada

Data da alteração Descrição da alteração

Quadro de aprovação 02 05/03/14

Alteração da função da responsável pela elaboração e alteração da responsável pela aprovação desta revisão.

3 02 26/02/14 Exclusão das referências da IT que não eram pertinentes.

Anexos Item não se aplica a este documento.

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