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Page 1: Determinação dos Ácidos Benzóico e Sórbico por CLAE · bebidas não alcoólicas, utilizar diluição de 1:20, e para alcoólicos, diluição de 1:10. Caso necessário ajustar

MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO/MAPA SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA/SDA

COORDENAÇÃO GERAL DE APOIO LABORATORIAL/CGAL LABORATÓRIO NACIONAL AGROPECUÁRIO EM GOIÁS/LANAGRO-GO

Código: IT LABV 228

Revisão: 02

INSTRUÇÃO DE TRABALHO

Determinação dos Ácidos Benzóico e Sórbico por CLAE

Emissão: 16/10/2013

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1. Objetivo Os ácidos benzóico e sórbico podem ser separados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC, sigla em inglês). Esta técnica baseia-se na separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária (coluna C18) e outra móvel (eluente) conforme a interação destes com as referidas fases. 2. Aplicação Determinação simultânea de conservadores (ácido sórbico e ácido benzóico) em bebidas. 3. Referências Normativas e/ou Bibliográficas - ANVISA, 1988. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução CNS/MS nº

04, de 24 de novembro de 1988. - ANVISA, 2007. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RDC nº 05,

de 15 de janeiro de 2007. - Harmonização de Metodologias Analíticas para Vinhos, SGT/8, MERCOSUL,

1996-1997. - RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – OIV (Recherche

dês antiseptiques et dês inhibiteurs de fermetation) MA-F-AS4-02RECANT 5. 4. Termos e Definições ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária LABV Laboratório de Análises Físico-Químicas de Bebidas e Vinagres CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência FOR Formulário HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência IT Instrução de Trabalho Lanagro-GO Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás POP Procedimento Operacional Padrão RQ Responsável pela Qualidade

Nome Função Assinatura Data Elaboração: Liliamarta Novato Colaboradora

Análise crítica: Alessandra Pulcineli RQ substituta

Aprovação: Francisco Jairo R. Fonseca RT

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RT Responsável Técnico UGQ Unidade de Gestão da Qualidade 5. Descrição da Instrução de Trabalho 5.1. Material 5.1.1. Equipamentos - Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) modelo S-200 composto por:

Sistemas com Bomba Quaternária, Injetor Automático, Forno de Coluna, Detector UV/VIS, LINK, NCI 900, Black Box e computador;

- Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) modelo FLEXAR composto por: Sistemas com Bomba Quaternária Flexar LC Pumps, Injetor Automático, Detector UV/VIS Flexar PDA LC, e computador;

- Pré-coluna RP-18 (dimensões: 15x3.2 mm; tamanho de partícula: 7 µm) e coluna C18 (dimensões: 250mmx4,6mm; tamanho da partícula: 5µm);

- Micropipetas (faixas de 20 a 200 µL e 100 a 1000 µL); - pHmetro; - Bomba de vácuo; - Banho de ultrasom; - Agitador magnético; 5.1.2. Vidrarias e outros materiais - Béqueres de vários tamanhos; - Balões volumétricos de volumes variados; - Vials de 2mL; - Membranas filtrantes (diâmetro: 44mm e poro: 0,22µm; diâmetro: 13mm e poro:

0,22 µm e 0,45µm; diâmetro: 13mm e poro: 0,22µm); - Ponteiras para micropipetas (20 a 200 µL e 100 a 1000 µL); - Conjunto para filtração: filtro e kitazato; - Barra magnética; - Seringa. 5.1.3. Reagentes e soluções - Acetato de amônio 0,01 M pH ~ 4,2 - Ácido acético glacial - Metanol (grau cromatográfico) - Ácido benzóico ou benzoato de sódio - Ácido sórbico ou sorbato de potássio - Água ultra-pura 5.2. Descrição da Metodologia

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5.2.1. Preparação de fase móvel - Preparar a solução de acetato de amônio 0,01M pesando aproximadamente 1,55

do reagente para 2L de solução: dissolver o acetato de amônio com água ultra-pura, acertar o pH em ~ 4,2 com ácido acético glacial, transferir para balão volumétrico de 2000 mL e completar o volume. Filtrar a solução em membrana de 0,22 µm, através de conjunto para filtração acoplado a bomba de vácuo. Registrar no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções, o controle da solução.

- Acoplar os frascos dos reagentes nas bombas do cromatógrafo seguindo a ordem:

* Bomba A – Metanol * Bomba B – Água ultra-pura * Bomba D – Acetato de amônio 0,01 M - Seguir a IT BV 232 – Operação e Controle do Cromatógrafo Líquido ou IT

LABV 384 – Operação e Controle do Cromatógrafo Líquido – Modelo FLEXAR, conforme equipamento utilizado, para procedimento de purga das bombas antes do início das análises.

5.2.2. Preparo dos padrões a) Solução-mãe: - Pesar em béqueres separadamente cerca de 25mg de ácido benzóico e de ácido

sórbico. Nota 1: Quando for utilizado benzoato de sódio, cálcio ou potássio ou sorbato de sódio, cálcio ou potássio, pesar quantidade suficiente para se obter cerca de 25mg de ácido benzóico e sórbico, respectivamente. - Diluir cada padrão com 10mL de Metanol e transferir para balão volumétrico de

250mL. - Preencher o balão com os componentes do eluente, seguindo a mesma

proporção entre eles: 40% de Metanol: 100mL-20mL (usados na diluição) – 80mL 30% de Acetato de amônio: 75mL 30% de Água ultra-pura: até o menisco do balão. - Filtrar a solução em membrana de 0,22µm, através de conjunto para filtração

acoplado a bomba de vácuo ou em filtro descartável de acetato de celulose (diâmetro: 13mm e poro: 0,22µm) acoplado em seringa. Registrar no FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções, o controle da solução.

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- A solução apresentará concentração de aproximadamente 100mg/L dos

conservantes. - Preparar os vials da curva padrão seguindo volumes estabelecidos no FOR BV

285 – Preparo da curva de calibração – CLAE. - Injetar os pontos em triplicata. b) Solução controle Preparar solução de padrão na concentração determinada como ponto de controle para ser analisada em triplicata, juntamente com a sequência de amostras. Anotar os resultados obtidos no FOR UGQ 066 – Coleta de dados - carta controle. Seguir os critérios de verificação descritos na IT UGQ 025 – Montagem de carta controle para análise dos resultados. Além de permitir o controle intralaboratorial a cada dia de análise, também permite a indicação do tempo de retenção esperado. c) Preparação da amostra - Pré-tratamento: desgaseificação e filtração em membrana 0,45 µm - Tomar a alíquota da amostra considerando o tipo de bebida a ser analisada. Para

bebidas não alcoólicas, utilizar diluição de 1:20, e para alcoólicos, diluição de 1:10. Caso necessário ajustar a diluição da amostra para adequar o resultado dentro da faixa de trabalho do método validado.

5.2.3. Preparação da condição de separação Através da criação do método de ensaio conforme estabelecido na IT BV 232 – Operação e Controle do Cromatógrafo Líquido, estabelecer as seguintes condições de separação: - Fase estacionária: C-18 - Fase móvel: água: metanol: acetato de amônio (30:40:30) - Condição de eluição: isocrática - Vazão: 1 mL/min - Temperatura do forno: 30°C (quando houver) - Volume injetado: 10µL - Detector UV/Vis: 225nm (ácido benzóico) e 235nm (ácido sórbico) - Tempos de retenção: 10-12 min. (ácido benzóico) e 12-14 min. (ácido sórbico) - Tempo de corrida: 15 min. - Faixa de trabalho: ≈ 5 a 30mg/100mL Nota 2: Condições cromatográficas e de fase móvel podem ser alteradas de acordo com a coluna utillizada. 5.3. Cálculos e expressão de resultados

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No cromatógrafo modelo S-200 módulo “Reprocess - Results” e no cromatógrafo modelo FLEXAR módulo “Pos Run” do software dos equipamentos encontram-se os cromatogramas com os resultados para cada amostra. O cálculo é efetuado automaticamente pelo software a partir da curva de calibração previamente elaborada. Existe a possibilidade de ocorrer uma pequena variação entre os tempos de retenção de um dia de trabalho para o outro, sendo neste caso utilizado a solução de controle para confirmação dos tempos de retenção do dia. Quando ocorrerem variações nos tempos de retenção é necessário que se proceda ao ajuste na integração dos picos, ou no método de integração se as variações persistirem. Os resultados obtidos através da curva de calibração são expressos em mg/L, devendo ser posteriormente convertidos em g/100g ou g/100mL de acordo com limite legal para a matriz analisada, considerando-se o fator de diluição da amostra. Nota 3: Se as variações nos tempos de retenção persistirem, mesmo após a integração dos picos, deverão ser realizados ajustes no método. 6. Controle de registros FOR UGQ 056 – Controle de preparo de soluções FOR UGQ 066 – Coleta de dados - carta controle FOR BV 285 – Preparo da curva de calibração – CLAE 7. Controle de alterações

Item alterado

Revisão alterada

Data da alteração Descrição da alteração

Quadro de Aprovação 01 09/10/13

Alteração do colaborador responsável pela aprovação desta revisão e alteração da função do responsável pela análise crítica.

5.1.1. 5.3. 01 09/10/13 Inclusão do cromatógrafo líquido modelo Flexar.

5.1.2. 01 09/10/13 Inclusão da membrana filtrante de 0,22 µm. 5.2.1. 01 09/10/13 Inclusão da IT LABV 384.

5.3. 01 09/10/13 Adequação do procedimento descrito no item para contemplar uso de outro equipamento.

Anexos Item não se aplica a este documento.