Universidade Federal do Rio Grande – FURGEscola de Química e Alimentos - EQA

Laboratório de Análises de Compostos Orgânicos e Metais – LACOMSeminários 2010

1

DETERMINAÇÃO DE FIPRONIL EM MEL EMPREGANDO

MICROEXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA

(DLLME) E CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Débora TomasiniOrientador: Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel

Rio Grande, 30 de setembro de 2010.

2

Tópicos abordados

• Importância e justificativa para a determinação de fipronil em mel;

•Instrumentação utilizada;

•Preparo de amostra;

• Otimização da DLLME:

-Tipo e volume de solvente extrator;

-Concentração do dispersor;

-Efeito do pH da solução da amostra;

-Concentração de NaCl;

- Influência do tempo de extração

• • Avaliação do método proposto

3

Introdução

1 http://portal.anvisa.gov.br/ , acessada em Maio 20102 Kadar, A.; Faucon, J. P.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9741.3 El Hassani, A. K.; et al. Pharmacol., Biochem. Behav. 2005, 82, 30.

4

Fipronil

Grupo químico: Pirazol

Classificação toxicológica: Classe II (AT)

Ingestão diária aceitável: 0,0002 mg/kg

Propriedades físico-químicas:

Kow logP= 4,0

Solubilidade em água: 1,9 g/L (pH 5,0 – 20ºC)

em acetona: 545,9 g/L

em hexano: 0,028 g/L

em diclorometano: 22,3 g/L

Estabilidade: Estável em pH 5 e 7. Levemente hidrolisado em pH9,0

5

6

Instrumentação utilizada

1100 series LC (Agilent Technologies Inc., USA) equipped with photodiode-array detector (DAD).

Wang, 2010

HPLC Waters (Milford, MA, USA) composto por bomba 600, detector PDA

2996, válvula injetora Rheodyne, com alça de 20 µL e sistema de aquisição de dados

Empower 2® software.

7

Preparo de amostra

Fortificação por 30minutos com

solução padrão de fipronil

•2,0 g de mel + 20 mL de água

Homogeneização

•Adição de 0,6 g de Na Cl

Homogeneização

•150 μL de RTIL + 50 μL de Triton X 114 -10% são injetados na

amostra aquosa

10 min. Agitação manual

•Centrifugação : 5 min / 10 000 rpm

5 μL da microgota formada são

injetados no HPLC

Wang, 2010:

8

Otimização da DLLME

•Volume de solvente extrator;

•Concentração do dispersor;

•pH da solução da amostra;

•Concentração de sal;

•Tempo de extração;

•Fator de enriquecimento (EF)

•Recuperação da extração (R)

9

Tipo e volume de solvente extrator

• Bom comportamento cromatográfico*;

• Maior densidade que a água;

• Capacidade de extrair os analitos;

• Baixa solubilidade em água;

• Capacidade de formar um sistema de duas fases estável quando o

solvente dispersor é injetado na solução aquosa

10

RTIL: Volumes testados:

•[C4MIM] [PF6] 125, 150, 175 e 200 μL •[C6MIM] [PF6]

Wang, 2010:

Figura 1: Efeito do volume do solvente extrator nas recuperações (a) e fatores deenriquecimento (b)

11

Solventes extratores testados:

• C2Cl4 (1,62 g mLμ 1)

• CCl4 (1,59 g mLμ 1)

• CHCl3 (1,47 g mLμ 1)

• CH2Cl2 (1,32 g mLμ 1)

• C6H4Cl2 (1,31 g mLμ 1)

• C6H5Cl (1,11 g mLμ 1)

Figura 2. Efeito do volume de solventeextrator (CCl4) na recuperação.

Volumes testados:

40, 60, 80, 100, 120, 140 μL

12

Concentração de dispersor

0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2% de Triton X 114

Wang, 2010:

Figura 3: Efeito da concentração do dispersor

13

Tipo e volume de solvente dispersor

Solventes dispersores testados:

• Acetona

• Acetonitrila

• Metanol

Volumes testados:

1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0 mL

Figura 4. Efeito do volume de solventedispersor (acetonitrila) na recuperação.

14

pH da solução da amostra

Figura 5. Efeito do pH da solução da amostra na recuperação para o autor doartigo (A) e os resultados obtidos para o fipronil (B)

(A) (B)

15

Concentração de NaCl

O NaCl não influenciou nas recuperações para o fipronil, mantendo-aspraticamente constantes, e por esta razão não foi adicionado o sal nos experimentos.

Figura 6: Efeito da concentração de NaClnas recuperações

Wang, 2010:

16

Influência do tempo de extração

Figura 7: Efeito do tempo de extração

Wang, 2010:

17

Avaliação do método

Curva trabalho e análises de amostras fortificadas :

18

Figura 8: Cromatogramas obtidos para o branco da amostra (A) e aamostra fortificada (B)

19

Nível de fortificação

(mg kg-1)

Recuperação

(%)

RSD

(%)

0,03

0,06

72,5

70,7

11,2

7,3

0,15 101,1 7,1

Tabela 1. Resultados de exatidão e precisão intralaboratorial dométodo para os 3 níveis analisados

Resultados obtidos para n= 9

O fator de pré-concentração do método foi 50;

Os limites de detecção e quantificação foram de 0,01 mg kg-1 e 0,03 mg kg-1, respectivamente.

A curva trabalho foi construída numa faixa linear de 0,03 mg kg-1 a 0,25 mg kg-1, com um valor de r> 0,99

Resultados de exatidão e precisão intralaboratorial:

20

Nível de fortificação

(mg kg-1)

Efeito Matriz

(%)

0,03

0,06

101,1%

92,8%

0,15 98,5%

Tabela 2. Avaliação do Efeito Matriz para o fipronil

100% ãoáreadopadr

cadoatofortifiáreadoextrEM

Efeito Matriz 4

4 Kruve, A. et al. J. Chromatogr., A. 2008, 1187, 58.

21

Figura 9: Cromatogramas obtidos da amostra fortificada,demonstrando a pureza do pico para o fipronil (A) e comparando-se aamostra fortificada com a solução padrão de fipronil (B)

(A)

(B)

22

Aplicabilidade do método para diferentes tipos de méis;

Comparação com o método QuEChERS:

QuEChERS DLLME

LOQ 0,6 mg/kg 0,3 mg/kg

R (%) 76,3 – 87,7 70,7-101,1

RSD (%) 5,9-10,8 7,1-11,2

Efeito Matriz (%) -12,9 / - 27,2 -7,2 / + 1,1

23

• O preparo de amostra por DLLME é rápido, simples e apresenta um baixo

consumo de solventes orgânicos.

• Através do fator de pré-concentração da técnica, foi possível atingir níveis

baixos de quantificação para o fipronil.

• Através das análises por HPLC-DAD foi possível escolher o comprimento de

onda de máxima absorção para o fipronil e determinar a pureza dos picos

cromatográficos, garantindo assim uma maior confiabilidade do método.

• O método mostrou-se exato e preciso, porém não apresentou robustez, não

sendo apropriado para análises de matrizes complexas como o mel;

• Não foi possível realizar a reprodutibilidade do método com a mesma massa de

mel utilizada;

Conclusões

1. Caldas, S. S; Demoliner, A.; Primel, E.G; J. Braz. Chem. Soc. 2009, 20, 1, 125.

2. Blasco, C; Fernández, M.; Pena, A.; Lino, C.; Silveira, M. I.; Font, G.; Picó, Y.; J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 8132.

3. Mukherjee, I.; Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2009, 83, 818.

4. http://portal.anvisa.gov.br/ , acessada em Maio 2010.

5. http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons, acessada em Maio 2010.

6. Belitz, H.D.; Grosch, W. Química de los alimentos. 2ª ed., Acribia, S.A: Espanha, 1997.

7. Kujawski, M. W.; Namiesnik, J.; Trends Anal. Chem. 2008, 27, 9, 785.

8. Pyrzynska, K.; Biesaga, M.; Trends Anal. Chem. 2009, 28, 7, 893.

9. Yao, L.; Jiang, Y.; D'arcy, B.; Singanusong, R.; Datta, N.; Caffin, N.; Raymont, K.; J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 210.

10. Hermosín, I.; Chicón, R. M.; Cabezudo, M. D.; Food Chem. 2003, 83, 263.

11. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE); Produção da Pecuária Municipal 2008, 2008. Produção da Pecuária Municipal - 2008

12. Sánchez-Brunete, C.; Miguel, E.; Albero, B.; Tadeo, J. L.; Spanish Journal of Agricultural Research. 2008, 6, 7.

13. Kadar, A.; Faucon, J. P.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9741.

14. Jiménez, J. J.; Bernal, J. L.; Nozal, M. J.; Martín, M. T.; Mayo, R. J. Chromatogr., A . 2008, 1187, 40.

15. El Hassani, A. K.; Dacher, M.; Gauthier, M.; Armengaud, C.; Pharmacol., Biochem. Behav. 2005, 82, 30.

16. Rial-Otero, R.; Gaspar, E. M.; Moura, I.; Capelo, J.L.; Talanta, 2007, 71, 503.

17. http://ec.europa.eu/sanco_pesticides, acessada em Maio 2010.

18. Korta, E.; Bakkali, A.; Berrueta, L. A.; Gallo, B.; Vicente, F. J. Chromatogr., A . 2001, 930, 21.

19. Sánchez-Brunete, C.; Albero, B.; Miguel, E. Tadeo, J. L.; J. AOAC International. 2002, 85, 1,128.

20. Rissato, S. R.; Galhiane, M. S.; Knoll, F. R. N.; Apon, B., M.; J. Chromatogr., A . 2004, 1048, 153.

21. Rezaee, M.; Assadi, Y.; Hosseini, M. R. M.; Aghaee, E.; Ahmadi, F.; Berijani, S.; J. Chromatogr., A. 2006, 1116, 1.

22. Caldas, S. S.; Costa, F. P.; Primel, E. G.; Anal. Chim. Acta. 2010, 665, 55.

23. Chen, H.; Chen, H.; Ying, J.; Huang, J.; Liao, L.; Anal. Chim. Acta. 2009, 632, 80.

24. Wang, Y.; You, J.; Ren, R.; Xiao, Y.; Gao, S.; Zhang, H.; Yu, H.; J. Chromatogr., A. no prelo

25. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos, RE nº 899, de 29 de maio de 2003.

26. Kruve, A.; Künnapas, A.; Herodes, K.; Leito, I.; J. Chromatogr., A. 2008, 1187, 58.

27. Ribani, M.; Bottoli, C. B. G.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F.; Quim. Nova, 2004, 27, 5, 771. 24

Referências: