detecçªo e controle de viroses em videira 90 introduçªo · doenças (tabela 1), caracterizadas...

9
Detecªo e Controle de Viroses em Videira Introduªo O polo Petrolina, PE/Juazeiro, BA Ø a principal regiªo produtora de uvas finas de mesa do Pas, contribuindo com mais de 90% das exportaıes brasileiras. O cultivo de videira (Vitis vinifera L.) nesta regiªo foi iniciado nos anos 1970 com a criaªo dos projetos de irrigaªo e, atualmente, a Ærea total cultivada estÆ em torno de 10.000 ha, dos quais 90% encontram-se em fase produtiva (ANU`RIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2006). Metade desta Ærea Ø ocupada com uvas apirŒnicas. Os ciclos produtivos da videira nesta regiªo sªo condicionados, principalmente, s condiıes edafoclimÆticas da regiªo e s prÆticas de manejo da cultura que, associadas irrigaªo, propiciam duas safras anuais. As doenas causadas por vrus sªo difceis de serem controladas, alØm de bastante destrutivas. O ataque desses patgenos, geralmente, resulta no declnio de plantas e, consequentemente, na reduªo da longevidade do parreiral, diminuiªo da produªo e da qualidade dos frutos. Entretanto, devido natureza dessas doenas, o estado fitossanitÆrio do material propagativo a ser utilizado na produªo de mudas e em enxertias Ø o fator mais importante. A disseminaªo desses patgenos pode ser potencializada quando se considera que a videira Ø, comercialmente, multiplicada por propagaªo vegetativa, o que propicia a possibilidade da ocorrŒncia de infecªo latente, na qual plantas infectadas nªo apresentam sintomas aparentes. Outros fatores que contribuem para o agravamento do problema sªo: presena de infecªo mista - presena de diferentes espØcies de vrus infectando uma mesma planta - suscetibilidade da cultivar a estes agentes, combinaªo copa/porta-enxerto e presena de vetores desses vrus na Ærea do parreiral, entre outros. A seguir, serªo discutidos mØtodos utilizados na diagnose de doenas virais em videiras e as estratØgias de controle. Petrolina, PE Dezembro, 2009 90 ISSN 1808-9976 On line On line On line On line On line Autor Mirtes Freitas Lima Eng. agrn., Ph.D., Pesqui- sadora Embrapa SemiÆrido. E-mail: [email protected] Principais Viroses da Videira Relatadas no Brasil Cerca de 50 vrus jÆ foram identificados em infecıes de videira em todo o mundo (MARTELLI; BOUDON-PADIEU, 2006; REGENMORTEL et al., 2000). No Brasil, as doenas mais importantes causadas por vrus e relatadas atØ o momento sªo: a) enrolamento da folha (Leafroll); b) malformaªo infecciosa ou doena dos entrens curtos (Fanleaf disease); c) mancha das nervuras (Fleck disease); d) lenho rugoso (Rugose wood complex) e, e) necrose das nervuras (Vein necrosis disease). O lenho rugoso compreende quatro doenas: intumescimento dos ramos (Corky bark); doena das caneluras do tronco do Rupestris (Rupestris stem pitting disease); acanaladura do lenho de Kober (Kober stem grooving) e acanaladura do lenho do LN33 (LN33 stem grooving). Para a maioria dessas doenas, os respectivos agentes etiolgicos jÆ foram identificados e associados ocorrŒncia de sintomas caractersticos em videiras, especialmente em plantas indicadoras (Tabela 1). Estas doenas sªo frequentes em Æreas vitcolas de todo o mundo, podendo infectar cultivares de copa e de porta-enxerto.

Upload: hacong

Post on 02-Jan-2019

217 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Detecção e Controle de Viroses em Videira

Introdução

O polo Petrolina, PE/Juazeiro, BA é a principal região produtora de uvas finas demesa do País, contribuindo com mais de 90% das exportações brasileiras. O cultivo devideira (Vitis vinifera L.) nesta região foi iniciado nos anos 1970 com a criação dos projetosde irrigação e, atualmente, a área total cultivada está em torno de 10.000 ha, dosquais 90% encontram-se em fase produtiva (ANUÁRIO BRASILEIRO DEFRUTICULTURA, 2006). Metade desta área é ocupada com uvas apirênicas. Osciclos produtivos da videira nesta região são condicionados, principalmente, àscondições edafoclimáticas da região e às práticas de manejo da cultura que,associadas à irrigação, propiciam duas safras anuais.

As doenças causadas por vírus são difíceis de serem controladas, além de bastantedestrutivas. O ataque desses patógenos, geralmente, resulta no declínio de plantas e,consequentemente, na redução da longevidade do parreiral, diminuição da produção eda qualidade dos frutos. Entretanto, devido à natureza dessas doenças, o estadofitossanitário do material propagativo a ser utilizado na produção de mudas e emenxertias é o fator mais importante. A disseminação desses patógenos pode serpotencializada quando se considera que a videira é, comercialmente, multiplicada porpropagação vegetativa, o que propicia a possibilidade da ocorrência de infecçãolatente, na qual plantas infectadas não apresentam sintomas aparentes. Outrosfatores que contribuem para o agravamento do problema são: presença de infecçãomista - presença de diferentes espécies de vírus infectando uma mesma planta -suscetibilidade da cultivar a estes agentes, combinação copa/porta-enxerto epresença de vetores desses vírus na área do parreiral, entre outros.

A seguir, serão discutidos métodos utilizados na diagnose de doenças virais emvideiras e as estratégias de controle.

Petrolina, PEDezembro, 2009

90

ISSN 1808-9976

On l

ine

On l

ine

On l

ine

On l

ine

On l

ine

Autor

Mirtes Freitas LimaEng. agrôn., Ph.D., Pesqui-sadora Embrapa Semiárido.

E-mail:[email protected]

Principais Viroses da Videira Relatadas no Brasil

Cerca de 50 vírus já foram identificados em infecções de videira em todo o mundo(MARTELLI; BOUDON-PADIEU, 2006; REGENMORTEL et al., 2000). No Brasil, asdoenças mais importantes causadas por vírus e relatadas até o momento são: a)enrolamento da folha (�Leafroll�); b) malformação infecciosa ou doença dos entrenóscurtos (�Fanleaf disease�); c) mancha das nervuras (�Fleck disease�); d) lenho rugoso(�Rugose wood complex�) e, e) necrose das nervuras (�Vein necrosis disease�).

O lenho rugoso compreende quatro doenças: intumescimento dos ramos (�Corkybark�); doença das caneluras do tronco do Rupestris (�Rupestris stem pittingdisease�); acanaladura do lenho de Kober (�Kober stem grooving�) e acanaladura dolenho do LN33 (�LN33 stem grooving�). Para a maioria dessas doenças, osrespectivos agentes etiológicos já foram identificados e associados à ocorrência desintomas característicos em videiras, especialmente em plantas indicadoras (Tabela 1).Estas doenças são frequentes em áreas vitícolas de todo o mundo, podendo infectarcultivares de copa e de porta-enxerto.

2 Detecção e Controle de Viroses em Videira

Tabela 1. Doenças de origem viral mais frequentes em videira no Brasil, seus agentes etiológicos e plantasindicadoras utilizadas na indexação biológica.

/1Plantas herbáceas utilizadas na indexação desses vírus./2GLRaV-7: não foi designado a nenhum gênero dentro da Família Closteroviridae./3Doença considerada de origem viral, entretanto, o agente causal dos sintomas em videira ainda não foi identificado./4 Doença cujo agente é possivelmente um vírus.Fonte: Rowhani et al. (2005).

3 Detecção e Controle de Viroses em Videira

a) O enrolamento da folha é a doença de origem viralmais disseminada e mais importante da videira, podendoinfectar cultivares de copa e de porta-enxerto. Até omomento, nove espécies de vírus (Grapevine leafroll-associated virus 1-9 - GLRaV 1-9), já foram associadas àdoença (ROWHANI et al., 2005). Em videiras tintasinfectadas, as folhas tornam-se avermelhadas e apenas otecido ao longo das nervuras permanece verde (Figura 1),enquanto que, em cultivares brancas, as folhas tornam-secloróticas. Nos dois casos, ocorre o enrolamento dosbordos das folhas para baixo, sintoma do qual originou onome da doença. As folhas tornam-se espessas equebradiças devido ao acúmulo de carboidratos, comoconsequência da degeneração do floema, resultando emmenores teores de sólidos solúveis totais nos frutos.

Além da disseminação por meio do material propagativo,espécies do gênero Ampelovirus, como o GLRaV-1 eGLRaV-3 são também disseminados de maneirasemipersistente por cochonilhas algodonosas (FamíliaPseudococcidae) e de carapaça (Família Coccidae). Demaneira geral, neste tipo de transmissão, o vírus é adquiridoquando estes insetos se alimentam em planta infectada porcerca de 15 min. Este tempo é denominado período deaquisição, durante o qual as cochonilhas adquirem eacumulam as partículas virais.

A transmissão para plantas sadias ocorre durante oprocesso de alimentação desses insetos virulíferos emvideiras por períodos de tempo bastante variáveis. Aalimentação em plantas doentes por períodos mais longosaumenta a eficiência de transmissão desses patógenos. Amultiplicação do vírus no vetor não ocorre, assim comotambém não há transmissão viral para os insetosdescendentes. No caso das espécies virais pertencentesao gênero Closterovirus, como o GLRaV-2, sãotransmitidos por afídeos, além do material propagativo(Tabela 1). No Brasil, o GLRaV-1 e o GLRaV-3 têm sido

Figura 1. Enrolamento e avermelhamento defolhas em videira (cultivar tinta).

frequentemente detectados.

b) A malformação infecciosa ou doença dos entrenóscurtos, causada pelo Grapevine fanleaf virus (GFLV),foi uma das primeiras viroses descritas em videira,podendo afetar os porta-enxertos americanos e outrasespécies de Vitis e/ou híbridos. Os sintomas podem serdiferenciados em mosaico amarelo (Figura 2), folha emleque e faixa das nervuras, dependendo da estirpe dovírus. O GFLV é disseminado por nematóides do gêneroXiphinema, destacando-se as espécies X. index e X.italiae, as quais podem reter o vírus por até 8 meses naausência de plantas hospedeiras (MARTELLI, 1986;MARTELLI; SAVINO, 1994).

Quando videiras velhas e infectadas pelo GFLV sãoeliminadas, parte de suas raízes que ainda permanecemno solo por muitos anos, constituem os reservatórios dovírus que pode ser transmitido pelos nematóides vetores.No Brasil, as espécies X. americanum (=X. brevicolle), X.index, X. brasiliensis e X. krugi já foram identificadas emvideiras (KUHN; FAJARDO, 2003). Entretanto, não háinformações sobre a incidência desses nematóides, assimcomo não há informações sobre o seu papel comoagentes disseminadores de vírus, em parreirais do País.Nas raízes de videira, os nematóides podem ser dissemi-nados pelo solo, água e por meio de práticas culturaisrealizadas dentro do parreiral. Naturalmente, o GFLVinfecta apenas a videira (Vitis spp.), entretanto,experimentalmente, pode ser transmitido pela fricção doextrato de plantas infectadas em folhas de plantasherbáceas dos gêneros Chenopodium, Gomphrena eCucumis, utilizadas na diagnose da malformaçãoinfecciosa.

Figura 2. Sintomas de mosaico amarelocausados pelo vírus da malformaçãoinfecciosa.

c) A mancha das nervuras causada pelo Grapevinefleck virus (GFkV) foi detectada em diversas áreasvitícolas de todo o mundo. Nas folhas, surgem manchas

Foto

: Gilm

ar B

acel

ar K

uhn.

Foto

: Gilm

ar B

acel

ar K

uhn.

4 Detecção e Controle de Viroses em Videira

d) O lenho rugoso é um termo que compreende quatrodoenças (Tabela 1), caracterizadas por anomalias nolenho, sendo transmitidas por enxertia e diferenciadas,segundo a expressão de sintomas, em diferentescultivares diferenciadoras de porta-enxerto:intumescimento dos ramos (�Corky bark�), associadaao Grapevine virus B (GVB); caneluras do tronco deRupestris (�Rupestris stem pitting�), associada aoRupestris stem pitting-associated virus (RSPaV) (Figura3); acanaladura do lenho de Kober (�Kober stemgrooving�), associada ao Grapevine virus A (GVA)(Figura 4) e, acanaladura do lenho de LN33 (�LN33 stemgrooving�), cujo agente causal ainda é desconhecido.

Figura. 3. Sintomas típicosda doença caneluras dotronco, em V. rupestris,cv. St. George.

Figura 4. Sintomas decaneluras no cilindrolenhoso de videira.

e) A necrose das nervuras ocorre em parreirais detodo o mundo, em cultivares de uva europeias eamericanas e em alguns porta-enxertos. O sintomasmais característico da doença é a necrose dasnervuras, principalmente naquelas secundárias eterciárias, visíveis na face dorsal da folha(MARTELLI, 1986). A doença é transmitida por meiode material propagativo infectado e o seu agenteetiológico é, possivelmente, um vírus.

Detecção de Vírus em VideiraDiversos métodos têm sido desenvolvidos para adetecção e identificação de vírus de plantas. Adiagnose de doenças virais em videira é baseada,principalmente, em resultados obtidos nos testes decampo e nos testes laboratoriais. Isso ocorre porque asintomatologia apresentada por plantas doentes nocampo pode ser complexa, envolver diversos agentesvirais e não ser característica de uma doença emparticular. A ocorrência de infecção latente é umoutro fator a ser considerado.

Dessa maneira, plantas infectadas e sem sintomasaparentes, podem propiciar a disseminação dessespatógenos quando utilizadas como matrizes. Alémdisso, um outro fator a ser levado em conta é quesintomas semelhantes aos de viroses apresentadospela planta podem não ter sido incitados por vírus,mas por outros patógenos ou mesmo por fatoresabióticos. A diagnose acurada, com a corretaidentificação do agente causal da doença, assim comoa sua distribuição no campo, são essenciais para oestabelecimento de medidas eficientes ao seucontrole. Por isso, métodos biológicos, sorológicos emoleculares têm sido utilizados na detecção eidentificação de vírus em videiras.

Métodos Biológicos

A diagnose de viroses em videiras era realizadaapenas por meio dos testes biológicos, que sãotrabalhosos e demandam muito tempo para aobtenção dos resultados. Entretanto, odesenvolvimento dos métodos sorológicos e,posteriormente, dos métodos moleculares, viabilizarama identificação desses patógenos em materialpropagativo infectado de forma rápida e acurada,prevenindo a sua disseminação por meio de mudas egemas, garantindo a movimentação do materialpropagativo de forma mais segura. Ainda hoje, osmétodos biológicos e os sorológicos são consideradosos mais tradicionais, constituindo-se em ferramentas

Foto

: Bev

erly

Fer

guso

n.Fo

to: M

irtes

Fre

itas

Lim

a.

cloróticas e translúcidas, irregulares, acompanhando aposição das nervuras. Este vírus é disseminado apenaspor meio de material propagativo infectado.

Essas doenças encontram-se disseminadas em áreasvitícolas de todo o mundo e, muito frequentemente,podem ocorrer em infecção mista numa mesmavideira, acarretando severos prejuízos. No Brasil,apenas a acanaladura do lenho de LN33 ainda não foi

detectada. Dentre estes agentes, o GVA e o GVBdo gênero Vitivirus são disseminados de maneirasemipersistente por cochonilhas algodonosas da FamíliaPseudococcidae e de carapaça da Família Coccidae.

5 Detecção e Controle de Viroses em Videira 5

fundamentais em programas voltados para a produçãode material livre de vírus. Embora os métodossorológicos e os moleculares permitam a identificaçãode vírus de forma precisa, além de seremextremamente sensíveis e rápidos, para que seobtenha uma diagnose plenamente confiável, autilização dos três métodos é, geralmente, necessária.

No método biológico, a transmissão de vírus ocorre pormeio da união de tecidos (enxertia) ou por inoculaçãomecânica, podendo ser realizado em dois grupos deplantas hospedeiras, denominadas indicadoras,empregadas de acordo com a doença a ser identificada.O primeiro grupo é formado por plantas lenhosas, quesão diferentes cultivares de copa ou de porta-enxerto devideira sensíveis a determinadas viroses e, o segundo, éconstituído por plantas herbáceas.

A indexação em plantas lenhosas é realizada para adetecção dos vírus que infectam a videira e são limitadosao floema, não sendo transmitidos mecanicamente. Estespertencem às famílias Closteroviridae (GLRaVs),Flexiviridae (RSPaV) e Tymoviridae (GFkV). A indexação éfeita por meio de enxertia de gemas de videiras candidatasem mudas de porta-enxertos e, também, em mudas dematerial de copa (Figura 5). As plantas enxertadas sãomantidas em casa de vegetação por cerca de doismeses e, posteriormente, transferidas para o campo,onde permanecem por até 3 anos, quando ocorre aavaliação dos sintomas. Alternativamente, as plantasenxertadas podem ser mantidas em casa de vegetação,pelo mesmo período de 3 anos até a avaliação.

Para o complexo rugoso da videira, após o arranquio dasplantas, a casca do porta-enxerto é removida paraverificação da presença de caneluras no lenho.

No caso das plantas herbáceas, a inoculação é feitamecanicamente. As folhas de videira infectadas comvírus são maceradas em tampão e o extrato éfriccionado na superfície das folhas dessas indicadoras,previamente pulverizadas com agentes abrasivos,como carborundo (500 mesh a 600 mesh) ou celite.Estes abrasivos provocam pequenos ferimentos no limbofoliar das plantas propiciando a penetração das partículasvirais no tecido vegetal. As plantas inoculadas sãomantidas em casa de vegetação. Quando o vírus étransmitido às plantas indicadoras, estas apresentamsintomas de 5 a 20 dias após a inoculação. Os vírus demaior importância transmitidos por este método pertencemaos gêneros Nepovirus (GFLV), Vitivirus (GVA e GVB) eClosterovirus (GLRaV-2) (ROWHANI et al., 2005). Asindicadoras mais utilizadas pertencem aos gênerosNicotiana, Chenopodium e Cucumis (Tabela 1).

Métodos Sorológicos

A sorologia apresenta diversos métodos para detecçãoviral que se caracterizam pelo emprego de anticorposespecíficos capazes de reconhecer proteínascapsidiais. Um dos métodos sorológicos mais comunspara detecção de vírus em material vegetal e insetosvetores é o ELISA (Enzyme-linked immunosorbentassay), utilizado na detecção de vírus em plantas pelaprimeira vez por Clark e Adams (1977). Neste, osanticorpos produzidos contra a proteína capsidial deum determinado vírus são empregados na suadetecção (Figura 6). Nesta reação, extratos prepara-dos pela maceração de tecido vegetal infectado emtampão são utilizados como antígeno.

No teste dot-blot ou dot-ELISA, o extrato das amostras éfixado em membrana de nitrocelulose, ao contrário doELISA tradicional, no qual as amostras são depositadas em

poços de placas de microtitulação. Alémdesta diferença, sistemas distintos desubstrato/enzima são usados nasreações.

A coleta do material vegetal a serutilizado no preparo dos extratos émuito importante. Considerando-se queos vírus apresentam distribuiçãoirregular dentro da planta, o estádiofenológico considerado e o tipo detecido a ser coletado devem estarassociados a maior concentraçãodestes patógenos na planta, visandofavorecer a sua detecção.Figura 5. Indexação em plantas lenhosas por enxertia. Corte realizado na muda do

porta-enxerto (a) para encaixe da gema do material a ser testado (b).

a b

a

a

b

Foto

s: B

ever

ly F

ergu

son.

6 Detecção e Controle de Viroses em Videira6

Figura 6. Detecção do GLRaV-3 por meiodo teste ELISA. Poços com coloraçãoamarela escura indicam amostraspositivas para o GLRaV-3 e poços semcoloração ou quase incolor indicamamostras negativas para esse vírus.

No preparo do extrato, tecido cambial ou pecíolos enervuras de folhas maduras coletadas no final do ciclovegetativo constituem fontes de antígeno ideais para adetecção de GLRaVs, GVA e GVB, enquanto que paraGFLV e GFkV, a detecção é mais acurada empreparações obtidas a partir de folhas novas,coletadas no início do ciclo vegetativo da cultura.

O resultado do ELISA é determinado por uma reaçãoenzimática (enzima fosfatase alcalina conjugada aoanticorpo) com um substrato específico e a avaliaçãoé realizada pela leitura da absorbância em uma leitorade placas, utilizando-se filtro de 405 nm. As amostrassão consideradas positivas quando o valor da sualeitura for pelo menos duas vezes superior àquele doextrato da planta sadia, utilizado como controlenegativo. Este método apresenta como vantagens: serrápido, podendo-se obter os resultados em um períodorelativamente curto, 24 a 48 horas, ser sensível epoder ser utilizado para a avaliação de um grandenúmero de amostras. A limitação do teste ELISAreside no fato de não haver anticorpos produzidos paraa identificação de todos os vírus que infectam videira.Neste caso, outros tipos de testes devem serutilizados nessa identificação. Dentre os vírusdescritos anteriormente, anticorpos produzidoscomercialmente podem ser encontrados para GFLV,GFkV, GVA, GVB e alguns GLRaVs.

O Western blot é uma técnica imunoeletroforéticautilizada na caracterização de proteínas virais(HAMMOND, 1993). Neste método, proteínas totaisextraídas de plantas infectadas são desnaturadas e,

posteriormente, separadas em gel de SDS-poliacrilamida. As frações da proteína são transferidasdo gel para uma membrana de nitrocelulose. Estatransferência pode ser ativa, pela aplicação de umavoltagem para propiciar a migração das proteínas dogel para a membrana, ou passiva, na qual esta ocorrepor capilaridade. O processo de detecção dasproteínas virais imobilizadas nas membranas envolve asua exposição aos anticorpos produzidos contra aproteína do vírus a ser detectado e a revelação damembrana utilizando-se reagentes específicos.

Métodos Moleculares

Dentre os métodos moleculares, ou seja, aquelesbaseados na detecção do ácido nucleico, a transcriçãoreversa associada à reação em cadeia da polimerase(RT-PCR) (MULLIS et al., 1986) é o mais utilizado. Osvírus anteriormente citados podem ser identificadospor meio desta técnica. A RT-PCR baseia-se naamplificação e detecção do material genético do vírusde RNA ou apenas PCR, no caso de DNA, emamostras vegetais infectadas. Neste método, pelomenos parte da sequência do genoma do vírus a serdetectado, precisa ser conhecida para dar origemaos oligonucleotídeos que serão utilizados na reação.O processo envolve as enzimas transcriptase reversae Taq DNA polimerase e a reação é automatizada pelaincubação em um termociclador programado paraexecutar a transcrição reversa do RNA em DNAcomplementar e os múltiplos ciclos da PCR, que visamà produção de um grande número de cópias dofragmento alvo deste DNA. Dessa forma, aamplificação seletiva de um fragmento do genoma dovírus, compreendido entre dois oligonucleotídeos, érealizada a partir do RNA do vírus utilizado comomolde. Vale ressaltar que mais de 90% dos vírus deplantas e todos os que infectam a videira possuemRNA como material genético.

O preparo do extrato da planta infectada a serutilizado na RT-PCR é muito importante, tendo emvista que os tecidos da videira contêm altasconcentrações de polissacarídeos e de compostosfenólicos que podem inibir a ação das enzimasutilizadas na PCR. A vantagem deste método é a suaalta sensibilidade, isto é, mesmo que o patógenoesteja presente na amostra vegetal em pequenasquantidades, a amplificação pela PCR propicia a suadetecção. Os produtos da reação são visualizados pormeio de eletroforese em um gel de agarose. Oemprego de brometo de etídeo, corante maisrecomendado e utilizado, forma um �complexo� com o

Foto

: Mirt

es F

reita

s Li

ma.

7 Detecção e Controle de Viroses em Videira

Controle das Viroses da Videira

7

DNA e permite que este possa ser visualizado sob luzultravioleta, na forma de uma banda (Figura 7).Quando nenhum DNA de tamanho esperado forvisualizado em gel de agarose, significa que a amostravegetal não está infectada com o patógeno ou, ainda,que a sua concentração encontra-se abaixo do limiarde detecção da técnica utilizada.

Figura 7. Análise em gel de agarose 1,5%, dos produtos da

RT-PCR realizada utilizando-se RNA total extraído de videira

infectada com RSPaV. A seta indica o fragmento específico

de DNA amplificado com 650 nucleotídeos (pb=pares de

base).

Outros métodos moleculares incluem a hibridização,Northern blot, utilizado na detecção de RNA(SAMBROOK et al., 1989). Neste, o ácido nucleicoviral imobilizado em membranas de nylon é detectadopor meio da utilização de sondas moleculares. Estassão constituídas por fragmentos da sequência dogenoma do vírus a ser detectado e podem sersintetizadas in vitro. As sondas podem ser radioativas,ou seja, marcadas com 32P ou, ainda, as chamadas�sondas frias� e, neste caso, marcadas comdigoxigenina. Para as amostras serem consideradaspositivas, deve haver complementaridade entre asequência utilizada como sonda e aquela do víruspresente na amostra testada, formando �duplexes�(DNA:RNA ou RNA:RNA). Os resultados positivos sãodetectados pela presença de manchas na membrana,que servem de suporte para a fixação do ácidonucleico extraído das amostras. Esta técnica éaltamente específica e requer mão-de-obraespecializada, sendo mais utilizada na caracterizaçãode isolados virais e, esporadicamente, como métododiagnóstico.

disseminados por meio da multiplicação vegetativa.Estes infectam as plantas de forma sistêmica,podendo ser detectados em todas as suas partes e,neste caso, quando as plantas-matrizes estãoinfectadas, as mudas produzidas a partir de materialpropagativo - estacas ou gemas - oriundo dessasmatrizes resultam em plantas infectadas.

Além da disseminação, a propagação vegetativapropicia, ainda, o acúmulo desses patógenos na plantaao longo dos anos, dando origem a doençascomplexas, podendo envolver diferentes espécies devírus. Considerando que não há medidas curativas quepossam ser utilizadas no campo para as doençascausadas por vírus, as estratégias para o seu manejodevem estar direcionadas à prevenção da ocorrênciada infecção. Estas incluem a erradicação de fontes deinóculo no campo, redução da disseminação da doençapor meio do controle do vetor, utilização de mudas ematerial vegetativo livres de vírus e incorporação deresistência ao vírus (NAYDU; HUGHES, 2008). Entreestas medidas, a utilização de material propagativolivre de doenças é extremamente importante paraculturas perenes como a videira, multiplicada,essencialmente, por via propagativa. Dessa maneira,na obtenção das mudas, é essencial a utilização dematerial propagativo com certificado fitossanitário deorigem, pois somente pelo plantio de mudas livres devírus, é possível realizar o controle de viroses emcampo.

Videiras afetadas apresentam uma série de sintomas,entre os quais redução de vigor, declínio e queda daprodutividade. Plantas doentes são, também, fonte deinóculo viral para a disseminação secundária porvetores como insetos e nematóides para plantassadias. Considerando estes fatores, os métodos maisimportantes e eficientes para o controle de viroses emculturas perenes inclui a aplicação de estratégiascomo a seleção sanitária, a obtenção de clones sadiose o controle de vetores.

Seleção SanitáriaA aquisição e o plantio de mudas certificadas, livres devírus, é de fundamental importância no estabelecimentode novas áreas, pois, esta medida diminui o risco daintrodução desses patógenos no parreiral e, assim, reduz asua disseminação via material propagativo infectado. Aqualidade sanitária do material propagativo a ser utilizadona produção de mudas é primordial, e a seleção sanitáriaconstitui a primeira etapa desse processo.

As estacas enraizadas e as gemas devem ser originadas deDos problemas fitossanitários que afetam a videira, osvírus constituem o principal grupo de patógenos

8 Detecção e Controle de Viroses em Videira

Controle de Vetores

8

plantas-matrizes livres dos vírus para os quais essas videirastenham sido indexadas. Estas matrizes devem ter sidosubmetidas a testes biológicos, sorológicos e/oumoleculares, para certificação da ausência de vírus.Dessa maneira, na obtenção dessas plantas, que são asfontes primárias de propagação, diversas etapas devemser realizadas, incluindo-se a seleção sanitária e aseleção clonal. O primeiro passo envolve a escolha deplantas dentro do parreiral, segundo determinadoscritérios tais como conformidade varietal, vigor vegetativo,produtividade e qualidade sanitária, observadas ao longode diversos ciclos vegetativos consecutivos.

As videiras livres de problemas fitossanitários e queapresentem boas características produtivas são ascandidatas ideais para serem selecionadas comoplantas-matrizes. Os clones oriundos dessas videirassão mantidos em campo e avaliados por alguns ciclosvegetativos. No processo de seleção clonal, os clonescandidatos permanecem no campo e são avaliados porum período de 2 a 3 anos. A avaliação sanitária dasplantas selecionadas é realizada com a utilização deferramentas diagnósticas tais como indexação emplantas lenhosas ou herbáceas, testes sorológicos emoleculares. Os clones selecionados segundo osresultados desses testes serão as fontes primárias quedevem ser cultivadas sob condições controladas, emcasa de vegetação telada.

Obtenção de Clones Sadios

A termoterapia associada à cultura de tecidos podeser utilizada na obtenção de plantas sadias a partir devideiras infectadas com vírus. O método baseia-se noprincípio de que a inativação desses patógenos emmaterial vegetal infectado é possível por meio de suaexposição prolongada a determinadas temperaturas.

Outro fator importante é que os vírus não seriamcapazes de atingir o ápice caulinar ou os meristemasdas brotações novas, emitidas durante o processo determoterapia, considerando que esta condiçãodesfavoreceria a multiplicação viral. Embora atermoterapia e o cultivo in vitro sejam métodostrabalhosos, onerosos, e que demandam um longoperíodo de tempo para que novas plantas sejamobtidas, e para que o processo de indexagem sejaconcluído, apresentam grande eficiência na obtenção devideiras livres de vírus. As plantas infectadas sãomantidas à temperatura de 37 °C a 38 °C por umperíodo que varia de 30 a 150 dias ou até mais, deacordo com o vírus a ser eliminado. Para o GFLV, esteperíodo varia de 30 a 42 dias; 90 dias para o GVB; 60a 120 dias para os vírus do enrolamento da folha(GLRaV) (GOHEEN, 1977); 150 dias para o GVA

(MARTELLI, 1993) e mais de 150 dias para o RSPaV(LEGIN et al., 1979).

As técnicas de cultura de tecidos são empregadasapós o tratamento termoterápico das plantas, quandoos ápices das brotações são extraídos - micropagaçãode segmentos caulinares de uma gema - ou osmeristemas são excisados e, posteriormente,cultivados em condições in vitro. As videirasregeneradas passam por um processo de indexaçãopara certificação do seu estado sanitário.

No Brasil, são escassas as informações disponíveissobre as espécies de cochonilhas presentes nasprincipais regiões vitícolas e a magnitude de atuaçãodestas como vetores de vírus. Apesar disso,recomenda-se que o seu controle seja feito noparreiral considerando, principalmente, se são vetores,estão virulíferos e podem transmitir vírus para plantassadias. Segundo Botton e Fajardo (2003), algumas dasespécies já identificadas em parreirais brasileiros sãoPseudococcus viburni, P. vitis, P. longispinus ePlanococcus citri. Ainda de acordo com Botton eFajardo (2003), o controle desses insetos é ainda umaprática pouco frequente, pois as cochonilhas sãodifíceis de serem observadas e permanecem no soloou sob a casca das videiras grande parte do tempo.Dessa maneira, o estabelecimento de medidasracionais é essencial, a exemplo do monitoramento dovetor em campo para detecção dos focos deinfestação, como também, do período de migração dasninfas do solo para a parte aérea das plantas(BOTTON; FAJARDO, 2003).

A realização de inspeções rotineiras - monitoramento -dos parreirais para detecção de pragas constitui abase do Manejo Integrado de Pragas (MIP), que é umdos componentes mais importantes da ProduçãoIntegrada da Uva (PI-Uva) (LOPES et al., 2009). Estasvisam dar suporte à definição do melhor momentopara a utilização do controle químico, na tentativa dereduzir a disseminação da doença quando estaencontra-se estabelecida no parreiral.

No caso do GFLV que é transmitido por nematóides,videiras infectadas devem ser eliminadas e as raízesremanescentes no solo devem ser arrancadas edestruídas, sendo que o replantio de mudas de videiraem solo infestado com nematóides, não deve serefetuado imediatamente; somente após um período de10 anos (MARTELLI; SAVINO, 1994). Nestas áreas enaquelas ainda não implantadas, métodos como opousio prolongado, a eliminação de plantas daninhas e a

9 Detecção e Controle de Viroses em Videira 9

Referências

ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA: brazilian fruityearbook. Santa Cruz do Sul: Gazeta Santa Cruz, 2006. 136 p.

BOTTON, M.; FAJARDO, T. V. M.; MORANDI FILHO, W. J.;GRUTZMACHER, A. D.; PRADO, E. Vetor encoberto,cochonilhas algodonosas em uva. Revista Cultivar Hortaliçase Frutas, Pelotas, v. 7, p. 28-29, 2003.

CLARK, M. F.; ADAMS, A. N. Characteristics of the microplatemethod of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection ofplant viruses. Journal of General Virology, [Spencers Wood],v. 34, p. 475�483, 1977.

GOHEEN, A. C. Virus and virus-like diseases of grapes.HortScience, Alexandria, v. 12, n. 5, p. 465-469, 1977.

HAMMOND, J. Western blotting and the use of membranesto adsorb antisera and to affinity purify antibodies. In:HAMPTON, R.; BALL, E.; BOER, S. de (Ed.). Serologicalmethods for detection and identification of viral and bacterialplant pathogens: a laboratory manual. St. Paul: APS Press,1993. p. 269-279.

KUHN, G. B.; FAJARDO, T. V. M. Doenças causadas por vírus,bactérias e nematóides e medidas de controle. In: KUHN, G.B.(Ed.). Uvas americanas e híbridas para processamentoem clima temperado. Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho,2003. (Sistema de Produção). Disponível em: <http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Uva/UvaAmericanaHibridaClimaTemperado/virus.htm>. Acesso em: 30 jul.2009.

LEGIN, R.; BASS, P.; VUITTENEZ, A. Premiers résultats deguérison par thermothérapie et culture in vitro d�une maladiede type cannelure (legno riccio) produite par le greffage ducultivar Servant de Vitis vinifera sur le poirte-greffe Vitisriparia x V. berlandieri Kober 5BB. Comparaison avecdiverses viroses de la vigne. Phytopathologia Mediterranea,Firenze, v. 18, p. 207-210, 1979.

LOPES, P. R. C.; HAJI, F. N. P.; BORGES, R. M. E.; ASSIS,J. S. Sistema de produção integrada. In: SOARES, J. M.;LEÃO, P. C. de S. (Ed.). A viticultura no Semiárido brasileiro.2. ed. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica;Petrolina: Embrapa Semiárido, 2009. p. 659-657.

MARTELLI, G. P. Rugose wood complex. In: MARTELLI, G. P.(Ed.). Graft-transmissible diseases of grapevines: handbook fordetection and diagnosis. Rome: FAO, 1993. p. 45-54.

______. Virus and virus-like diseases of the grapevine inmediterranean areas. FAO Plant Protection Bulletin, Rome, v.34, n. 1, p. 25-42, 1986.

MARTELLI, G. P.; BOUDON-PADIEU, E. (Ed). Directory ofinfectious diseases of grapevines and viruses and virus-likedisease of the grapevine: bibliographic report 1998-2004.[Rome]: CIHEAM-IAMB, 2006. 195 p. (Options Méditerranéennes.Série B. Studies and Research, 55).

MARTELLI, G. P.; SAVINO, V. Fanleaf degeneration. In:PEARSON, R. G.; GOHEEN, A. C. (Ed.). Compendium ofgrape diseases. St. Paul: APS Press, 1994. p. 48-49.

MULLIS, K. F.; FALOONA, F.; SCHARF, S.; SAIKI, R.;HORN, G.; ERLICH, H. Specific enzymatic amplification ofDNA in vitro: the polymerase chain reaction. QuantitativeBiology, Cold Spring Harbor, v. 51, p. 263-273, 1986.

NAYDU, R. A.; HUGHES, J. d�A. Methods for the detection ofplant virus diseases. Plant Virology in Sub-Saharan Africa.Disponível em: <www.iita.org/cms/details/virology>. Acesso em: 7jul. 2008.

REGENMORTEL, M. H. V.; FAUQUET, C. M.; BISHOP, D.H. L.; CARSTENS, E. B.; ESTES, M. K., LEMON, S. M.;MANILOFF, J.; MAYO, M. A.; MCGEOCH, D. J.; PRINGLE,C. R.; WICKNER. R. B. (Ed.). Virus taxonomy: classificationand nomenclature of viruses. San Diego: Academic Press,2000. 1162 p.

ROWHANI, A.; UYEMOTO, J. K.; GOLINO, D.; MARTELLI, G.P. Pathogen testing and certification of Vitis and Prunusspecies. Annual Review of Phytopathology, [Palo Alto], v. 43,p. 261�278, 2005.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecularcloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

fumigação do solo podem ser adotadas visando quebrar ociclo do nematóide vetor. Entretanto, devido ao alto custodo tratamento com nematicidas, este é recomendadoapenas em áreas muito limitadas, como em viveiros.

Esta publicação está disponibilizada no endereço:www.cpatsa.embrapa.brExemplares da mesma podem ser adquiridos na:Embrapa SemiáridoBR 428, Km 152, Zona RuralCaixa Postal 23 56302-970 Petrolina, PEFone: (87) 3862-1711 Fax: (87) [email protected]

1a edição (2009): Formato digital

Comitê depublicações

Expediente

CircularTécnica, 90

MINISTÉRIO DA AGRICULTURA,PECUÁRIA E ABASTECIMENTO

CGPE 8194

Presidente: Maria Auxiliadora Coêlho de Lima.Secretário-Executivo: Josir Laine Aparecida Veschi.Membros: Daniel Terao,

Tony Jarbas Ferreira Cunha,Magna Soelma Beserra de Moura,Lúcia Helena Piedade Kiill,Marcos Brandão Braga,Gislene Feitosa Brito Gama,Mizael Félix da Silva Neto.

Supervisor editorial: Sidinei Anunciação Silva .Revisão de texto: Sidinei Anunciação Silva.Tratamento das ilustrações: Nivaldo Torres dos Santos.Editoração eletrônica: Nivaldo Torres dos Santos.

Agradecimentos

Ao Dr. Gilmar B. Kuhn, ex-pesquisador da EmbrapaUva e Vinho, Bento Gonçalves, RS, pela concessão dasfotos (Figuras 1 e 2) que ilustram esta publicação.