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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
ROBERTO RESENDE DOS SANTOS
DETECÇÃO DE Sclerotinia sclerotiorum EM MEIO NEON-S
MODIFICADO EM SEMENTES DE SOJA E FEIJÃO
UBERLÂNDIA
2015
ROBERTO RESENDE DOS SANTOS
DETECÇÃO DE Sclerotinia sclerotiorum EM MEIO NEON-S
MODIFICADO EM SEMENTES DE SOJA E FEIJÃO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Uberlândia, como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Agronomia –
Mestrado, área de concentração em Fitopatologia,
para obtenção do título de “Mestre”.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Cezar Juliatti
UBERLÂNDIA
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil.
S237d
2015
Santos, Roberto Resende dos, 1960-
Detecção de Sclerotinia sclerotiorum em meio Neon-S modificado
em sementes de soja e feijão / Roberto Resende dos Santos. - 2015.
34 p.
Orientador: Fernando Cezar Juliatti.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia,
Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
Inclui bibliografia.
1. Agronomia - Teses. 2. Soja - Semente - Doenças e pragas - Teses.
3. Feijão - Semente - Doenças e pragas - Teses. 4. Sclerotinia
sclerotiorum - Teses. I. Juliatti, Fernando Cezar, 1957- . II. Universidade
Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Agronomia. III.
Título.
CDU: 631
ROBERTO RESENDE DOS SANTOS
DETECÇÃO DE Sclerotinia sclerotiorum EM MEIO NEON-S
MODIFICADOEM SEMENTES DE SOJA E FEIJÃO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Uberlândia, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Agronomia –
Mestrado, área de concentração em Fitopatologia,
para obtenção do título de “Mestre”.
UBERLÂNDIA, 24 de fevereiro de 2015.
____________________________________________________________
Dra. Nilvanira Donizete Tebaldi/UFU – MG
____________________________________________________________
Dra. Adriana de Andrade Figueiró/UFU – MG
____________________________________________________________
Dra. Juliana Araújo Santos Martins/IFTM – MG
____________________________________________________________
Prof. Dr. Fernando Cezar Juliatti/ ICIAG – UFU – MG
(Orientador)
UBERLÂNDIA
MINAS GERAIS - BRASIL
2015
Aos meus pais, Luiz de Oliveira Santos (In memoriam) e Maria José Resende Oliveira, pela
educação, e pelo amor incondicional durante toda a minha vida.
Aos meus filhos Alexandre e Lucas, por serem meus grandes amigos.
Aos meus irmãos Luis, Marino, Ana e José pelo carinho.
A Elisa Martins, pelo amor, companheirismo e incentivo durante estes anos.
AGRADECIMENTOS
A Deus, primeiramente, por me conceder o dom da vida.
Aos meus queridos pais, Luís de Oliveira Santos (in memoriam) e Maria José Resende Oliveira,
pela vida, dedicação, pelo apoio, amor, carinho e incentivo.
À esposa Elisa Martins pelo amor, carinho, pelas palavras de encorajamento, paciência, incentivo
e pelas horas dedicadas a me ajudar.
Ao Professor Dr. Fernando Cezar Juliatti, meu orientador, por ser um grande companheiro e
amigo.
À Iara de Carvalho Silva, considerada como minha segunda mãe, esteve sempre disposta a
colaborar e a orientar em minhas dúvidas, propondo-me soluções que foram fundamentais para a
realização deste Mestrado.
À Universidade Federal de Uberlândia, pela oportunidade e pelo suporte para realização do
curso.
Aos amigos do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, pelos momentos vividos e pela
aprendizagem.
Aos professores Prof. Dr. Jonas Jäger Fernandes (in memoriam) e Prof. Dr. David de Souza
Jaccoud Filho, Prof. Dr. Geraldo Alves de Souza e Prof. Dr. João Carlos, pelas palavra de
incentivo.
Aos funcionários Abadia, Eduardo, Júlio Graciliano, Marly, Maria Aparecida, Maria Auxiliadora
pela ajuda e pelas orientações.
A todos os professores do curso de Pós-Graduação em Agronomia da UFU pelos conhecimentos
transmitidos.
À Carina Bernardes, ao Gabriel e à Júlia, que sempre se dispuseram a colaborar e a acompanhar
o desenvolvimento desta dissertação.
À Sebastiana Resende e ao Márcio Botrel, lutando com afinco, realizamos nossos sonhos.
Aos amigos de empreitada, Aurilene, Adriana Figueró, Érika Sagata, Anakelly, Fausto
Fernandes, Júlia Araújo, Maristela, Igor Forigo e Breno Juliatti, companheiros no LAMIP.
Enfim, a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização deste trabalho, o meu
muito obrigado!
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Localização geográfica dos municípios fornecedores de amostras ..................... 11
Figura 2. Porcentagem de lotes com presença de Sclerotinia sclerotinium nos métodos
utilizados no período de 2008 a 2012 ................................................................................ 20
Tabela 1. Total de amostras de soja e feijoeiro ................................................................... 12
Tabela 2. Técnica Rolo de Papel ........................................................................................ 15
Tabela 3 Técnica Rolo de Papel: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por
cultivares em laudos de sementes de feijoeiro do LAMIP ................................................. 16
Tabela 4. Técnica Neon-S 2: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por
cultivares em laudos de soja do LAMIP ............................................................................ 17
Tabela 5. Técnica Neon-S 2: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por
cultivares em laudos de sementes de feijoeiro do LAMIP ................................................. 19
Tabela 6. Variância em relação aos métodos de detecção S. sclerotiorum em
lotes/amostras de sementes de feijoeiro e soja inoculadas naturalmente e artificialmente 21
Tabela 7. Porcentagem de detecção Sclerotinia sclerotiorum em diferentes lotes de
feijoeiro e soja infectados naturalmente e artificialmente .................................................. 22
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 01
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 03
2.1 Descrição do Problema ................................................................................................. 03
2.1.1 A Cultura da Soja ...................................................................................................... 03
2.1.2 A Cultura do Feijoeiro .............................................................................................. 04
2.2 A Doença do Mofo Branco .......................................................................................... 06
2.2.1 Características da Sclerotinia sclerotiorum .............................................................. 06
2.2.2 Sintomatologia .......................................................................................................... 07
2.3 Métodos de Detecção de Patógenos em Sementes ...................................................... 08
2.3.1 Rolo de Papel ............................................................................................................ 08
2.3.2 Neon – S .................................................................................................................... 08
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 10
3.1 Método NEON – S 2 ................................................................................................... 12
3.2 Rolo de Papel .............................................................................................................. 13
3.3 Método Neon – S ........................................................................................................ 13
3.4 Análises Estatísticas ..................................................................................................... 13
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 14
4.1 Análise Estatística ........................................................................................................ 21
5. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 23
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 24
i
RESUMO
SANTOS, Roberto R. Detecção de Sclerotinia sclerotiorum em Meio Neon-S Modificado em
Sementes de Soja e Feijão. Dissertação (Mestrado em Agronomia/Fitopatologia) –
Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia1, 2014. 26p.
O método de Neon-S tem sido utilizado para a detecção de Sclerotinia sclerotiorum em sementes
de soja e feijão a partir da safra de 2010. Porém, esse método possibilita a leitura de falsos
positivos devido ao aparecimento de fungos que também alteram o pH do meio. O objetivo deste
trabalho foi verificar se o aumento do período de incubação pode contribuir para otimizar a
confiabilidade do teste Neon-S em diferentes cultivares de soja e feijão. Foram avaliados nove
tratamentos em delineamento de blocos casualizados no esquema fatorial 3x3, com três
repetições, sendo três métodos de detecção: rolo de papel, Neon-S e Neon S2 e três cultivares:
Feijão Pérola infectados naturalmente; soja cultivar BRS Valiosa RR infectadas naturalmente e
soja cultivar Nidera 7255 RR inoculada artificialmente. Para a inoculação da soja Nidera 7255
RR, as sementes foram incubadas em meio de cultivo BDA por 72 h, após o cultivo do fungo por
sete dias na temperatura de 25 ºC. Os três métodos foram comparados, avaliando 400 sementes
por repetição, meio Neon-S com incubação de sete dias, Neon-S2 com incubação de quinze dias
e o rolo de papel por trinta dias, anotando-se a presença do fungo e a presença de escleródios
aderidos às sementes. No meio Neon-S e Neon-S2 foram utilizadas 20 sementes por placa (20
placas por repetição). No rolo de papel foram usadas 50 sementes por rolo. As sementes foram
incubadas 20 ºC em BOD, no escuro. Realizou-se a análise de variância dos dados e teste de
comparação de médias (Tukey 5%). A interação entre o método de detecção e a cultivar utilizada
foi significativo a 1% de probabilidade, indicando que o melhor método depende da cultivar
avaliada. Dentro das cultivares avaliadas, a soja infectada artificialmente foi a que apresentou os
maiores índices de infecção pelo patógeno. Usando os resultados de lotes de sementes,
comprovou-se a maior sensibilidade do Neon-S num montante de 637 lotes testados no período
de 2008 a 2012. Durante esse período, o teste de rolo apresentou 21,88% de amostras positivas,
enquanto que o Neon-S foi de 31,25%. Outro fator diferenciador em relação aos lotes analisados
foi a porcentagem de sementes contaminadas e ou infectadas, que variou de uma (0,25%) a cinco
(1,25%). Assim a detecção de S. sclerotiorum pelo método Neon-S2 pode ser otimizada com a
incubação por 15 dias, considerando que, neste caso, a formação de escleródios próximos às
sementes infectadas confirma a presença do patógeno e evita a leitura de falsos positivos. O
método Neon-S2 aumentou a sensibilidade de detecção de S. sclerotiorum em lotes de sementes
analisadas quando comparado ao método de rolo, porém, quando comparado com o método
Neon S, sua média foi maior, mas a diferença não foi significativa.
Palavras-chave: Glycine max, Phaseolus vulgaris. Sanidade de sementes. Mofo branco. Rolo de papel.
___________ 1Orientador: Prof. Dr. Fernando Cezar Juliatti – UFU
ii
ABSTRACT
SANTOS, Roberto R. Detection of Sclerotinia sclerotiorum in Modified NEON-S Medium in
Soybean and Common Beans Seeds. Dissertation (Masters Degree in Agriculture/Plant
Pathology) – University Federal de Uberlândia, Uberlândia1, 2014. 26f.
The Neon-S method has been used for the detection of Sclerotinia sclerotiorum in soybean and
common beans since the agricultural year 2010. However, this method yields false positive
readings due to other fungi that change medium pH. Thus, this study evaluated the contribution
of increasing incubation period on the optimization of Neon-S reliability in different cultivars of
soybeans and common beans. Nine treatments were evaluated in randomized blocks design, as a
3x3 factorial, with three replications. The factors were three detection methods (paper roll, Neon-
S, and Neon S2) and three cultivars: naturally infected Pérola beans; naturally infected soybean
cultivar BRS Valiosa RR, and artificially inoculated soybean cultivar Nidera 7255 RR).
Inoculation of soybean Nidera 7255 RR was done by incubating the seeds for 72 h on PDA
where the fungus was previously grown for seven days at 25 ºC. The three methods were
compared, evaluating 400 seeds per replication, after incubation for seven days in Neon-S, for
15 days in Neon-S2, and for 30 days in paper roll, determining the presence of the fungus, and
that of sclerotia adhered to the seeds. Twenty seeds were used per plate for media Neon-S and
Neon-S2 (20 plates per replication), and 50 seeds per roll for the paper roll. Seeds were
incubated at 20 ºC in BDO chamber in darkness. The data were submitted to the analysis of
variance and the averages compared by the Tukey test at 5% probability. The interaction
between detection method and cultivar was significant at 1% probability, indicating that the best
method depends on the cultivar under study. Among the cultivars evaluated, artificially infected
soybean presented the greatest indices of pathogen infection. A comparison of seed lots analyzed
at the Plant Disease Clinic–LAMIP – proved greater sensibility of Neon-S in a total of 637 lots
evaluated from 2008 to 2012. In that period, the paper roll test resulted in 21.88% positive
samples, while in Neon-S 31.25% of them were positive. Another distinguishing factor among
the lots analyzed was the percentage of infected and, or, contaminated seeds, which varied from
one (0.25%) to five (1.25%). Therefore, detection of S. sclerotiorum by the Neon-S2 method can
be optimized by incubation for 15 days, considering that, in this case, the formation of sclerotia
near the infected seeds confirm the presence of the pathogen, avoiding false positive readings.
Neon-S2 method increased detection sensibility of S. sclerotiorum in seed lots analyzed in
comparison with the paper roll method; however, in comparison with Neon S method, despite its
greater average, no significant differences were observed.
Keywords: Glycine max, Phaseolus vulgaris. Seed health. White mold. Paper roll.
__________ 1Supervisor: Prof. Dr. Fernando Cezar Juliatti – UFU
1
1. INTRODUÇÃO
A semente é considerada o mais importante insumo agrícola, pois serve como
multiplicador de plantas e a conseguinte comercialização da produção de grãos para
consumo humano e animal. A qualidade das sementes é essencial para garantir um
melhor padrão fisiológico e sanitário à lavoura, sendo um desafio para produção
agrícola, pois é a causa principal da disseminação de doenças. A conquista de novos
mercados implica em comercializar sementes de melhor qualidade sanitária e menor
utilização de defensivos, portanto, com ganhos ambientais e econômicos.
A doença conhecida como mofo branco, agente causal, Sclerotinia sclerotiorum
(Lib.) de Bary, tem ocasionado perdas significativas em inúmeras culturas agrícolas
de importância econômica no mundo. No Brasil, a sua detecção ocorreu, primeiramente,
no ano de 1921 na cultura da batata. Os danos da doença variam de acordo com os
níveis de susceptibilidade das culturas, com as condições climáticas e com o manejo
empregado. A S. sclerotiorum ataca mais de 75 famílias, 278 gêneros e 408 espécies de
plantas; tendo sido relatado no Brasil o ataque às culturas do feijão, soja, girassol,
algodão, canola, batata, tomate, alface, entre outras. Especialmente nessas culturas, a
doença tem ocasionado perdas crescentes nas principais regiões produtoras do País (Sul,
Sudeste e Centro-Oeste), que figuram como áreas das maiores produções agrícolas
(JULIATTI; JULIATTI, 2010).
"Não existem variedades de plantas imunes ao patógeno e o controle químico da
doença é realizado muitas vezes, sem o rigor técnico necessário, levando perdas ao
agricultor e redução nos padrões de controle, dentro dos limites aceitáveis." (JULIATTI;
JULIATTI, 2010; JACCOUD-FILHO et al., 2011).
O uso de sementes de baixa qualidade auxilia a entender como o mofo branco é
transmitido e como tem causado grandes perdas, pois estas podem estar infectadas com
o micélio dormente do patógeno ou contaminadas concomitantemente com escleródios.
O potencial de disseminação do patógeno a longa distância através das sementes é
significativo.
De acordo com a Portaria nº 47, de 26 de fevereiro de 2009, da Secretaria de
Defesa Agropecuária do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o nível
2
de tolerância do fungo em lotes de sementes está baseado na ausência de escleródios
associados às sementes (IBGE, 2013).
Os escleródios podem ser detectados em lotes de sementes, porém, sementes
infectadas com o micélio dificilmente são detectadas sem a ajuda de um laboratório
especializado. A fungigação via pivô central é uma prática que tem crescido muito nos
últimos anos. Entretanto, a aplicação de uma quantidade excessiva de fungicidas para
o controle de doenças gera riscos desnecessários, tanto no aspecto epidemiológico das
próprias doenças como em relação ao meio ambiente. Assim, a detecção de patógeno
em sementes é de grande importância, pois sementes com alta qualidade fitossanitária
contribuem para um menor consumo de produtos químicos durante o ciclo das culturas
e evita a introdução e/ou aumento de doença nas lavouras. Muitas vezes, a
disseminação do mofo branco em uma lavoura é ocasionada pela própria semente
infectada, uma vez que a semente pode apresentar o fungo, tanto interna como
externamente. Além de transportar externamente outros fungos, que podem diminuir o
vigor e a germinação das sementes. Tais patógenos tanto influenciam na emergência e
vigor da planta como são uma fonte de inóculo primário, que podem gerar epidemias
graves, se as condições climáticas forem favoráveis (VIEIRA et al., 2001).
Os critérios utilizados para a detecção de fungos em sementes de modo geral
seguem as mesmas regras adotadas pela International Seed Testing Association (ISTA)
e, em sua maioria, consistem em estimular os microrganismos a produzirem estruturas,
ou metabólitos, que permitam a sua identificação. Para o fungo S. sclerotiorum a
observação visual da presença de escleródios é feita pelas Regras de Análise de
Sementes, onde se usa o teste de papel de filtro (blotter test) para culturas como: soja,
girassol, algodão, feijão e ervilha (RAS, 2009).
Apesar das técnicas recomendadas diversos trabalhos têm sido desenvolvidos
e/ou ajustados a fim de minimizar alguns problemas nos testes já estabelecidos como
padrão. Como por exemplo, a redução do tempo de avaliação de amostras incubadas,
custos das análises e diminuição de riscos aos operadores na manipulação dos produtos
químicos como o 2,4D, no preparo de amostras. Métodos como o rolo de papel
modificado, método Neon modificado e uso de técnicas moleculares têm se mostrado
promissoras para o diagnóstico mais seguro e rápido do patógeno (BARROCAS, 2011).
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Descrição do Problema
2.1.1 A cultura da Soja
A produtividade de uma cultura é definida pela interação entre a planta, o
ambiente de produção e o manejo de pragas e doenças. Altos rendimentos de soja só são
obtidos quando as condições ambientais são favoráveis em todos os estádios de
crescimento das plantas, adubação correta, boa origem da semente aliada à qualidade
fisiológica (germinação e vigor), qualidade sanitária e controle fitossanitário bem
planejado e executado. O potencial de rendimento da soja é de 100 sacos ha-1. Porém
para obter altos rendimentos é necessária a utilização de boas práticas de manejo. As
principais práticas de manejo que devem ser consideradas são: semeadura na época
recomendada para a região da produção; escolha dos cultivares mais adaptados à região;
uso de espaçamentos e densidades adequados as cultivares; monitoramento e controle
de plantas daninhas, pragas, doenças e redução das possíveis perdas de colheita (CRUZ,
2008).
A área plantada com a oleaginosa na safra 2012/13 apresentou um incremento de
10,7% em comparação com o verificado na safra 2011/12, alcançado 27,7 milhões de
hectares. Em todos os estados da Federação o comportamento foi semelhante, com
exceção do Distrito Federal que permaneceu com 55,0 mil hectares. Esse aumento está
relacionado ao elevado nível das cotações da soja no mercado interno e externo e ao
bom desempenho com relação à comercialização realizada de forma antecipada,
atingindo níveis recordes (CONAB, 2013).
Na safra 2012/13 o atraso provocado pelo clima no início do plantio na Região
Centro-Oeste, principalmente no Mato Grosso e Goiás e a ocorrência de chuvas
coincidindo com a colheita, repercutiram nos níveis de produtividade da lavoura. O
excesso de chuvas provocou perdas no enchimento de grão pela baixa luminosidade e
na colheita, pela alta incidência de ferrugem asiática. Apesar disso, o desempenho nesta
safra indica um comportamento de produtividade bem próximo da safra passada, graças
ao bom desempenho observado no estado do Mato Grosso do Sul e Distrito Federal.
(CONAB, 2013).
Neste contexto, a Região Centro-Sul produziu 73,4 milhões de toneladas, um
incremento de 26,2%. Esse aumento advém tanto do aumento de área (9,9%), quanto de
4
produtividade (14,8%). Vale destacar a repercussão do desempenho favorável do clima
na produtividade em dois dos principais estados produtores da oleaginosa, Paraná e no
Rio Grande do Sul, que apresentaram neste incremento de 36 e 74,5% respectivamente.
Para Teles (2012):
Grande número de doenças fúngicas e bacterianas, além de viroses e nematóides,
ataca a cultura da soja. Dentre estas, aquelas causadas por fungos são consideradas
muito importantes, não somente por aparecerem em maior número, como pelos
prejuízos causados em termos de rendimento e qualidade das sementes (TELES, 2012).
Inúmeros fungos já foram identificados em sementes de soja, porém são poucos
os que merecem destaque por serem economicamente importantes, conforme relação a
seguir: Phomopsis spp. (anamorfo de Diaporthe spp.) Saccardo & Roumeguère.
Colletotrichum truncatum, (Schwein.) Andrus & W.D. Moore. Fusarium spp. Link
(principalmente F. semitectum), Berk. & Ravenel. Sclerotinia sclerotiorum De Bary,
Cercospora kikuchii, Hara. Cercospora sojina Hara. Aspergillus spp . (principalmente
A. flavus), (Haller) P. Micheli. Penicillium spp., Link, Magazin. Alternaria spp., Nees.
Chaetomium sp., Kunze. Cladosporium sp., Link. Corynespora cassiicola, (Berkeley &
M.A. Curtis) C.T. Wei. Curvularia sp., Boedijn. Epicoccum sp., Link. Macrophomina
phaseolina, (Tassi) Goidànich. Monilia sp., Bonorden. Periconia sp., Tode.
Peronospora manshurica (crosta de oosporos) (Naumov) Syd. Rhizoctonia solani, J.G.
Kühn. Rhizopus stolonifer, (Ehrenb.) Vuillemin. Septoria glycines, Hemmi.
Sclerotiorum rolfssii, Saccardo. Stemphylium sp. Wallroth. Trichoderma sp.
2.1.2 A Cultura do Feijoeiro
O feijoeiro é considerado a principal fonte de proteína na dieta alimentar da
população de baixa renda, constituindo juntamente com o arroz, a base da alimentação
da população brasileira. Dentre as culturas de inverno irrigadas por aspersão é a
principal nas regiões sudeste, centro-oeste e algumas áreas da região nordeste. O cultivo
na entressafra de verão, denominado feijão “de inverno”, cuja semeadura ocorre de
maio a junho é mais tecnificado que os demais, utilizando, além da irrigação outros
insumos devem ser, sementes de boa qualidade, fertilizantes, corretivos e defensivos o
que possibilitam a obtenção de produções três a cinco vezes superiores às obtidas em
outras épocas de plantio (BASSAN et al., 2001).
5
As regiões ideais para cultivo de feijoeiro devem possuir temperatura média,
durante o ciclo, entre 20 e 22 °C, sendo temperatura ótima de 21°C. Temperatura média
acima de 24 °C durante o florescimento e formação de legumes determinam efeitos
negativos no rendimento de grãos. Assim, a temperatura média durante o mês mais
quente do ciclo da cultura não deve ser superior a 24°C. Temperatura elevada no
florescimento aliada à deficiência hídrica, causa redução do rendimento de grãos e
aumento de variabilidade, sendo o efeito dependente da duração do aumento da
temperatura. O enchimento de grãos também é prejudicado, já que a elevada
temperatura, aumentando a respiração e reduzindo a fotossíntese líquida. O crescimento
do feijoeiro é limitado também pela última geada da primavera e pela primeira geada do
outono, que delimitam a estação de crescimento disponível (MALUF et al., 2001).
A área de feijoeiro cultivada está estimada em 1,12 milhão de hectares, para a
safra 2012-2013, configurando um decréscimo de 9,5% em relação à safra passada.
Todos estados produtores indicam plantios de áreas menores do que às cultivadas na
safra anterior, com exceção de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Maranhão e Distrito
Federal. As boas perspectivas de outras culturas como soja e milho que têm maior
estabilidade e liquidez, a comercialização instável e os riscos climáticos aliados à
cultura do feijoeiro têm inibido os produtores a manterem um crescimento estável para
esta cultura (CONAB, 2013). A produção nacional para o feijão da safra foi estimada
em 957,1 mil toneladas, representando uma redução de 22,5% (CONAB, 2013).
A exploração comercial do feijão cerca de 95% dos casos usualmente apresenta
um elevado nível de problemas sanitários após o florescimento das plantas. Perdas de
7% a 10% do rendimento final de sementes e grãos são devidas ao amassamento e à
queda de flores e de vagens pela ação mecânica de máquinas e implementos agrícolas
empregados na aplicação de fungicidas (VIEIRA- JUNIOR et al., 1998).
A maior parte das culturas destinadas à produção de alimentos está sujeita à
incidência de pragas e doenças, e a má qualidade das sementes representa uma das
principais causas da baixa produtividade das lavouras de feijoeiro no Brasil. Por esse
motivo, é crescente o interesse pelo tratamento químico das sementes, no qual se
objetiva conferir-lhes proteção e às plântulas delas originadas, contra a ação de
patógenos e insetos-pragas. Assim, proporciona-se a manutenção da qualidade sanitária
e fisiológica da semente, contribuindo para a obtenção do estande inicial almejado; além
disso, reduz-se drasticamente a disseminação desses organismos nocivos na área
(BARROS et al., 2005).
6
2.2 A Doença Mofo Branco
2.2.1 Características da Sclerotinia sclerotiorum
O patógeno Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary é o agente causador da
doença Mofo Branco que também é conhecida como: podridão branca da haste, a
Sclerotinia, murcha de Sclerotinia e podridão da haste. S. sclerotiorum pode causar
danos em mais de 400 espécies plantas dentre elas destacam-se várias plantas de
interesse econômico, a soja e o feijoeiro (WEBER, 2012).
A ocorrência de epidemias causadas por sclerotiorum na cultura de soja, em
regiões onde ocorrem condições climáticas amenas na safra de verão, principalmente
nas chapadas dos cerrados em áreas acima de 800 m de altitude, tem deixado em alerta
os produtores.
Este fitopatógeno pode sobreviver no solo de 3 a 10 anos, através de estruturas
de resistência conhecidas como esclerócio ou escleródio. Estas estruturas apresentam
formato irregular, variando de poucos milímetros de diâmetro e comprimento a
alguns centímetros, a princípio apresentam coloração branca, e posteriormente
tornam-se negros e duros. Os escleródios são formados por uma massa compacta e
melanizada de micélio e, após a germinação são geralmente os responsáveis pela
infecção iniciar da planta (SAGATA, 2010).
"O uso de sementes infectadas com micélio e/ou infestadas com escleródios são
as principais causas da introdução S. sclerotiorum nas lavouras. Os escleródios podem
germinar miceliogenicamente, carpogenicamente, produzindo apotécios que liberam
ascósporos." (VIEIRA et al., 2001)
O patógeno pode ser disseminado pela semente aderido à sua superfície;
infectando o seu interior; e/ou contaminando os lotes de sementes com restos de plantas
infectadas ou partículas de solo contaminadas, ou ainda com as estruturas de
resistência para aqueles patógenos que formam escleródios, como a Sclerotinia
sclerotiorum (JULIATTI; JULIATTI, 2010).
A disseminação do fungo ocorre de duas formas: pela associação do escleródio
com as sementes, restos vegetais contaminados na fase miceliogênica do fungo
infectando internamente o embrião da semente respondendo pela contaminação a longa
distância, e além disso se dissemina pelos apotécios que emergem ou brotam dos
escleródios do solo, liberando aproximadamente mais de dois milhões de ascósporos
7
por dez a quinze dias, contudo na fase carpogênica a contaminação ocorre a curtas
distâncias. A contaminação também pode ocorrer com o trânsito das máquinas agrícolas
que saem das áreas contaminadas para sadias dentro das lavouras, movimentando o solo
e restos vegetais contaminados (JULIATTI; JULIATTI, 2010).
A transmissão por semente pode ocorrer tanto através de micélio dormente
(interno) quanto por escleródios misturados às sementes. O fungo, devido à formação de
estruturas de resistência (escleródios), é de difícil erradicação após introduzido numa
área. No teste de sanidade de sementes usualmente realizado (papel de filtro/23°C/7
dias), dificilmente o fungo é detectado. Para a obtenção de melhores resultados, deve-se
utilizar temperaturas entre 10-15°C e 28 dias de incubação. A identificação é feita com
base na presença de micélio branco típico e formação de escleródios (GOULART,
1997).
O controle de mofo branco causado por S. sclerotiorum é muito difícil, devido à
capacidade que o fungo tem de formar, os escleródios, que podem permanecer no solo
por mais de cinco anos. O controle da doença é baseado no manejo cultural, de forma a
reduzir o potencial de inóculo, uma vez que, por se tratar de um patógeno de solo, o uso
de fungicidas químicos, além de dispendioso, não apresenta resultados satisfatórios
(HECKLER et al., 2009).
O controle de qualidade de sementes vem sendo reconhecida, de forma
crescente. Além dos aspectos de transmissão e suas consequências epidemiológicas,
a presença de certos patógenos nas sementes pode resultar em efeitos diretos, como
redução do potencial germinativo, do vigor, da emergência, do período de
armazenamento e até do rendimento (TELES, 2012).
No controle de qualidade de sementes, a importância do aspecto sanitário vem
sendo reconhecida de forma crescente. Considerando os expressivos avanços da área de
patologia de semente, vem crescendo também a necessidade de implantação e
credenciamento de laboratórios, para a realização de análises sanitárias (GOULART,
1997).
2.2.2 Sintomatologia
As doenças conhecidas como mofo branco ou podridão branca recebem esses
nomes em função dos sintomas e sinais externos causados na planta: presença de lesões
8
encharcadas nos órgãos afetados, de coloração parda e consistência mole, com micélio
branco, de aspecto cotonoso, cobrindo porções dos tecidos. (CAMPOS LEITE, 2003).
Os primeiros sintomas são manchas de anasarca que evoluem para coloração
castanho-claro e logo desenvolvem abundante formação de micélio branco e denso. Em
poucos dias, o micélio transforma-se em massa negra, rígida, o escleródio, que é a
forma de resistência do fungo. Os escleródios variam em tamanho de poucos milímetros
a alguns centímetros e são formados tanto na superfície como no interior da haste e das
vagens infectadas (SAGATA, 2010).
2.3 Métodos de Detecção de Patógenos em Sementes
2.3.1 Rolo de Papel
A desvantagem desse método é a dificuldade para separar as sementes infectadas
das sadias, podendo-se superestimar a incidência do patógeno S. sclerotiorum devido ao
contato entre as sementes ao se realizar o rolo de papel para posterior incubação.
2.3.2 Neon – S
O método do Meio Neon foi descrito originalmente por Steadman et al. (1994) e
Nasser et al. (1995) para detecção da viabilidade de escleródios do fungo S.
sclerotiorum. Posteriormente, foi utilizado para detecção do patógeno em sementes de
feijoeiro. O método consistia na utilização de meio de cultura Batata Dextrose Agar
(BDA) com azul de bromofenol, um indicador de pH, obtendo um meio de coloração
azul e que devido a liberação de ácido oxálico pelo fungo torna-se amarelo.
O método do Meio Neon foi modificado por Napoleão et al. (2006) e
denominado Neon-S, pois era necessário o aperfeiçoamento para análise de rotina.
Assim, foram testados indicadores, inibidores e antibióticos com ponto de fusão alto,
não necessitando acrescentá-los após o meio BDA autoclavado. Ademais se faz
necessário o ajuste do pH após o meio esterilizado, prática de difícil execução devido à
alta temperatura do meio liquefeito e a rapidez do meio em solidificar-se.
O método do Meio Neon-S possui em sua composição, juntamente com o meio
de cultura BDA, um antibiótico (cloranfenicol), o ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) e o
indicador de pH azul de bromofenol. O antibiótico inibe o crescimento de bactérias e o
ácido 2,4-D inibe a germinação de sementes das dicotiledôneas. Sem a presença do
9
fungo, o meio mantém-se azul e, com a presença do micro-organismo, torna-se amarelo.
Porém, alguns fungos como Rhizopus sp. e Aspergillus sp produzem ácidos que mudam
também a coloração do meio; assim, para a distinção destes fungos torna-se
necessário o emprego de microscópico estereoscópico (NAPOLEÃO et al., 2006).
"Em alguns trabalhos foram utilizados meios de cultura semi seletivos, contendo
o indicador de pH azul de bromofenol visando reduzir o tempo de detecção do
patógeno." (NAPOLEÃO, 2006).
A simples indicação das percentagens de pureza e de germinação de um lote de
sementes não é suficiente para caracterizar o seu verdadeiro estado fisiológico, pois,
nesses testes, além da pureza física, apenas é avaliada a capacidade que a semente
possui para formar plântulas normais sob condições ótimas à germinação. Na
tentativa de melhor identificar os lotes de sementes de alta qualidade fisiológica, a
concepção de vigor vem recebendo grande atenção como mais um parâmetro utilizado
para indicar o futuro desempenho dessas sementes no campo. Experiências têm
demonstrado que a consideração apenas desses atributos para se atestar a qualidade de
sementes tem sido insuficiente, principalmente na atual política agrícola brasileira, onde
se exige uma agricultura mais econômica e rentável, assumindo a semente papel
decisivo na diminuição de riscos. Nesse contexto, a sanidade de sementes apresenta-se
com significativa importância, uma vez que determinados microrganismos, associados a
elas, podem constituir-se em fator altamente negativo no estabelecimento inicial de uma
lavoura (GOULART, 1997).
Dessa forma, torna-se evidente que para se atestar a verdadeira qualidade de um
lote de sementes, deve-se obrigatoriamente considerar o somatório dos atributos físicos,
genéticos, fisiológicos e sanitários.
10
3. MATERIAL E MÉTODOS
As análises foram realizadas no Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas
– LAMIP da Universidade Federal de Uberlândia, no período de 2008 a 2013.
Foram avaliadas 637 amostras/lotes de sementes de soja e de feijão,
provenientes do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba (Figura 1, Tabela 1). Os laudos
foram separados por ano e arquivados de forma digital, foram feitas anotações a
respeito dos patógenos. As amostras foram recebidas em sacos de aproximadamente
1kg. Estas passaram por testes de sanidade, capazes de identificar o fundo S.
sclerotiorum.
Para comparar a eficiência entre os métodos Neon S, Neon S2 e rolo de papel foi
realizado um experimento entre os meses de maio e junho de 2013. Foram avaliados
nove tratamentos, utilizando o delineamento em blocos casualizados no esquema
fatorial 3x3 com três repetições. Dentre os tratamentos foram utilizadas as cultivares:
feijão pérola infectadas naturalmente, soja cultivar BRS Valiosa RR infectadas
naturalmente e soja cultivar Nidera 7255 RR inoculada artificialmente, sendo avaliadas
dentro dos três métodos de detecção. As amostras dessas cultivares são provenientes das
plantações de agricultores da região de Uberlândia, que foram armazenadas em câmara
fria até a realização dos testes. A cultivar Nidera 7255 RR teve as suas sementes
expostas à infecção em placas de petri contendo meio BDA (Batata Dextrose Agar) e
micélio do patógeno, após o cultivo do fungo por sete dias na temperatura de 25º C. A
exposição das sementes ao patógeno ocorreu por 72 horas de incubação, utilizando
quatro placas de petri com 100 sementes cada. As 400 sementes inoculadas foram
utilizadas para o teste de validação, comparando com os lotes infectados naturalmente.
Os métodos de detecção estão detalhados a seguir.
11
FIGURA 1. Localização geográfica dos municípios fornecedores de amostras.
12
TABELA 1. Total de amostras de soja e feijoeiro analisadas no LAMIP – UFU, 2008 a
2013.
Município Número de Amostras
Feijoeiro Soja
Araguari - 06
Ibiá 15 -
Patos de Minas - 395
Uberlândia - 194
Tupaciguara - 42
Total 637
3.1 Método Neon–S 2
O método Neon-S2 é uma modificação do Neon–S, nele o tempo de leitura é
alterado de sete dias para quinze dias. Essa modificação propiciou uma melhor
confiabilidade dos resultados.
Para a análise das amostras, primeiramente, houve um congelamento prévio
das sementes por 12 horas, optou-se por esse método devido às limitações ambientais e
preocupações com a saúde do manipulador, usando o 2,4D. Foram utilizados os
seguintes reagentes: 1000 ml de BDA (200g batata – 1000 ml de água destilada, 20g de
dextrose e 15 g de Agar bacteriológico) 50 mg de azul de bromofenol, autoclavado a
120 °C por 15 min, após o resfriamento de aproximadamente 50 °C acrescentou-se 50
mg de cloranfenicol, o meio foi vertido em placas de Petri de 10 cm de diâmetro. Foram
utilizadas 400 sementes por repetição de cada cultivar, sendo distribuídas de forma
aleatórias vinte sementes em cada placa, utilizando vinte placas de Petri por repetição.
As amostras permaneceram durante quinze dias em incubadora BOD com ausência de
luz a 20 °C. Para a detecção do fungo, foi observada a formação de halo amarelo em
torno da semente, devido à presença de ácido oxálico que altera a coloração do azul de
bromofenol para a cor amarela, além da formação de escleródios, quando se prolonga o
tempo de incubação. A nova forma de interpretação permite que sejam eliminados os
resultados falsos positivos.
13
3.2 Rolo de Papel
O método utiliza o rolo de papel de germinação Germitest (duas folhas de
papel), adicionando a água destilada esterilizada na proporção de 2,5 vezes a massa do
papel. As amostras foram incubadas em estufa BOD com ausência de luz a 20°C por
trinta dias.
Para a detecção do fungo, observou-se também a formação de escleródios nas
sementes. Para cada repetição foram utilizadas 400 sementes, distribuídas de forma
aleatórias em cinco rolos de papel contendo 50 sementes cada. O tempo de incubação
por trinta dias para realizar a leitura transforma-se no fator limitante dessa técnica.
3.3 Método Neon-S
O procedimento deste método foi o mesmo descrito no Neon-S 2, porém, o
tempo de leitura foi de sete dias após a incubação.
3.4 Análises Estatísticas
A estatística do teste de Tukey é dada pela seguinte fórmula:
∆ = q √QMRes
r
em que:
q é a amplitude total studentizada tabelada. QMRes é o quadrado médio do
resíduo, e r é o numero de repetições.
Após a leitura do teste comparativo entre lotes de sementes de feijoeiro e soja
infectados naturalmente e artificialmente realizou-se a análise de variância dos dados e
teste de comparação de médias (Tukey 5%) utizando o software SASM – Agri
desenvolvido por Canteri et all 2001. Os dados das três épocas de avaliação (sete,15 e
30 dias) foram transformados para arcseno √x/100.
14
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No ano de 2008, ao utilizar a técnica do rolo de papel não foi constatada a
presença de Mofo Branco nas sementes de soja, assim todos os lotes/cultivares
apresentaram isenção do patógeno (Tabela 2). Contudo, nos anos de 2009, 2010, 2011 e
2012 a presença do fungo foi detectada (Tabelas 2 e 4) em sementes de soja. A partir do
ano de 2010, e nos anos de 2011 e 2012 em plantas de feijão ao usar a técnica de Neon-
S modificado e Neon S2, houve um aumento de amostras com presença positiva do
patógeno (Figuras 2). Durante o período citado, o teste de rolo apresentou 21,88% de
amostras positivas, enquanto que o Neon-S2 foi de 31,25% (Figura 2). Outro fator
diferenciador em relação aos lotes analisados foi a porcentagem de sementes
contaminadas e/ou infectadas de cada lote, que variou de 0,25% a 1,25% (Tabelas 2, 3,
4 e 5).
Grabicoski (2012), com o objetivo de comparar métodos detecção de S.
sclerotiorum analisou três amostras de sementes de soja provenientes de áreas com
histórico da incidência de Mofo Branco no Paraná, através de Blotter Test, Rolo de
Papel e Neon-S. Na amostra I, foram detectadas dez sementes infectadas no método de
Rolo de Papel. Nos demais métodos, não foi detectada a presença do patógeno. Na
amostra II, observou-se apenas uma (01) semente com o patógeno pelo teste de Blotter
Test e Rolo de Papel e três pelo método Neon – S. Enquanto que na amostra III, houve
uma quantidade maior de sementes infectadas. Foi encontrado 45 sementes com o fungo
pelo método Blotter Test, 112 no método Rolo de Papel, e 15 no método Neon –S.
Percebe-se que no método Rolo de Papel constatou-se a presença do patógeno em todas
as amostras/lotes.
15
TABELA 2. Técnica Rolo de Papel: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por cultivares de soja em laudos do LAMIP – UFU,
2008 e 2009.
Cultivar
Total de Lotes
Testados
Número de Lotes
Positivos
Incidência (%) sementes
infectadas
Equivalente em Número
Sementes
2008 2009 2008 2009 2008 2009 2008 2009
BR 850 RR - 6,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
BRS 750 4,00 11,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
BRS 811 - 1,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
BRS MG 810C - 1,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
CD 237 RR - 2,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
Conquista - 4,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
Favorita 5,00 6,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
L8307 RR 41,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00 -
MS 6101 13,00 5,00 0,00 1,00 0,00 3,50 0,00 14,00
MS 7211 RR - 15,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
MS 7908 RR 12,00 17,00 0,00 1,00 0,00 0,50 0,00 2,00
MS 8001 -
23,00
- 1,00
1,00
1,00
- 0,25
0,25
1,25
- 1,00
1,00
5,00
MS 8200 2,00 10,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
MS 9350 1,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00 -
NA 7255 RR - 1,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
NA 8015 RR - 1,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00
Nk 7074 - 4,00 - 1,00 - 9,50 - 38,00
Pionner P984511 1,00 - 0,00 - 0,00 - 0,00 -
RBL 8307 RR - 75,00 - 1,00 - 0,25 - 1,00
Sambaiba - 2,00 - 1,00 - 1,25 - 5,00
Valiosa 24,00 22,00 0,00 1,00 0,00 1,25 0,00 5,00
Vencedora 4,00 4,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Total 107,00 212,00 0,00 9,00 - - 0,00 72,00 (%) – porcentagem
16
TABELA 3. Técnica Rolo de Papel: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por cultivares em laudos de sementes de feijoeiro do
LAMIP UFU, 2009.
Cultivar
Total de
Lotes
Testados
Número
de Lotes
Positivos
Incidência
(%) sementes
infectadas
Equivalente
em Número
Sementes
Perola 10,0 0,0 0,0 0,0
Total 10,0 0,0 - 0,0 (%) – porcentagem
17
TABELA 4. Técnica Neon-S e Neon-S 2: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por cultivares em laudos de soja do LAMIP –
UFU, 2010, 2011 e 2012.
Cultivar Total de Lotes Testados
Número de Lotes
Positivos
Incidência (%)
sementes infectadas
Equivalente em Número
Sementes
2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012
AN 7337 RR 2,00 - - 1,00 - - 0,25 - - 1,00 - -
ANTA 5,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 - -
BRS 810 - 5,00 - - 0,00 - - 0,00 - 0,00 -
BRS 810C 7,00 - - 2,00 - - 0,25 - - 1,00 - -
BRS MG 810C - 4,00 - - 2,00
1,00
- - 0,25
0,50
- - 1,00
2,00
-
Conquista 1,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 - -
Favorita 8,00 - 1,00
1,00
- - 0,25
0,75
- - 1,00
3,00
- -
L8307 RR 136,00 - - 2,00
3,00
5,00
10,00
34,00
- - 1,25
0,75
1,00
0,50
0,25
- - 1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
- -
MS 7211 RR 9,00 - - 1,00
1,00
1,00
- - 0,25
0,25
1,00
- - 1,00
1,00
4,00
- -
MS 7639 RR 3,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 - -
MS 7908 RR 7,00 - - 1,00
3,00
- - 0,50
0,25
- - 1,00
2,00
- -
MS 7908 RR - 7,00 5,00 - 0,00 1,00 - 0,00 0,25 - 0,00 1,00
MS 8200 4,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 - -
N 7255 Floema - 5,00 - - 1,00 - - 0,25 - - 1,00 -
NA 7255 3,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 - -
NA 7255 RR - - 1,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00
...continua
...continuação
18
NA 8500 3,00 9,00 - 1,00 1,00
1,00
- 0,25 0,25
0,50
- 1,00 1,00
2,00
-
Nideira 7100 RR - - 2,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00
NS 8290 - - 2,00 - - 1,00 - - 5,75 - - 23,00
NT 12 - 03,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 -
NT 7001 - 01,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 -
RBR NT 12 6,00 - - 2,00 - - 0,25 - - 1,00 - -
Valiosa 23,00 - - 0,00 - - 0,00 - - 0,00 - -
Valiosa RR - 10,00 - - 2,00
3,00
- - 0,50
0,75
- - 2,00
3,00
-
Total 217,00 44,00 10,00 69,00 11,00 2,00 - - - 32,00 12,00 24,00 (%) – porcentagem
19
TABELA 5. Técnica Neon-S e Neon-S 2: Detecção do patógeno Sclerotinia sclerotiorum por cultivares em laudos de sementes de feijoeiro
do LAMIP –UFU, 2010, 2011 e 2012.
Cultivar Total de Lotes Testados
Número de Lotes
Positivos
Incidência (%) sementes
infectadas
Equivalente em Número
Sementes
2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012
Estilo - - 4,00 - - 1,00
1,00
- - 5,00
7,50
- - 20,00
30,00
Perola 5,00 10,00 18,00 0,00 1,00
1,00
1,00
1,00
2,00
1,00
1,00
0,00 1,25
14,00
0,50
1,25
3,75
4,50
11,75
0 5,00
56,00
2,00
5,00
15,00
18,00
47,00
Total 5,00 10,00 22,00 0,00 2,00 8,00 - - - 0,00 61,00 137,00 (%) – porcentagem
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2008 Rolo de Papel 2009 Rolo de Papel 2010 Neon-S 2011 Neon-S 2012 Neon-S2
Método Utilizado
Po
rcen
tag
em (
%)
Amostras Positivas
Amostras Negativas
FIGURA 2. Porcentagem de lotes com a presença de Sclerotinia sclerotiorum nos métodos utilizados no período de 2008 a 2012.
21
4.1 Análise Estatística
Na tabela 6 são apresentados os resultados do teste F a 1% de probabilidade,
na qual se observa que a interação da cultivar utilizada e o método de detecção do fungo
Sclerotinia sclerotiorum são significativos. Este resultado indica que o melhor método
de detecção, depende do tipo de cultivar e do tipo de infecção, ou seja, se a semente é de
soja ou de feijão, e no caso da soja, se a semente foi infectada naturalmente ou se foi
realizada a inoculação artificial.
TABELA 6. Análise de variância da incidência (%) do fungo Sclerotinia sclerotium em
sementes de soja (infectada naturalmente e artificialmente) e feijão (infectada
naturalmente) em três métodos de detecção (rolo de papel, neon S e neon S2
modificado).
FV GL SQ QM F
Bloco 2 12,108 6,054 0,849 ns
Método 2 190,636 95,318 14,068 **
Cultivar 2 1.582,117 791,058 116,754 **
Método * Cultivar 4 295,209 73,802 10,893 **
Resíduo 16 108,407 6,775
CV = 39,15 ns, não significativo e significativo a 5% de probabilidade pelo teste F.
As médias de incidência do fungo Sclerotinia sclerotiorum para todos os
tratamentos estão apresentados na tabela 7. Em relação ao método de detecção só foi
observada diferença significativa pelo teste de tukey a 0,05 de probabilidade o
tratamento com a soja inoculada quando se utilizou o método do rolo de papel, sendo
que este resultado foi inferior aos outros dois métodos, os quais mostraram uma maior
incidência do fungo em estudo, e apesar do método S e S2 não terem apresentado
diferenças significativas, o método S2 apresentou uma maior média de incidência,
indicando que o aumento de quinze dias na leitura dos dados pode ter dado uma maior
confiabilidade aos resultados. Para as médias de infecção do fungo nos métodos S e S2,
a soja inoculada apresentou os maiores valores quando comparado à soja e ao feijão
positivo, este resultado pode ser explicado devido à inoculação ter ocorrido em todas as
sementes e, portanto, aumentando a probabilidade de ocorrência da doença em uma
maior quantidade de sementes. Quando se observa os resultados do rolo de papel, a
maior média também foi apresentada pela soja inoculada, porém, não diferiu
estatisticamente da soja positiva.
22
TABELA 7. Médias de incidência (%) do fungo Sclerotinia sclerotiorum em sementes
de soja e feijão em três métodos de detecção.
Método
Cultivar 1 S S2 Rolo de Papel
Feijão Positiva 0,00 aB 0,17 aB 0,00 aB
Soja Positiva 0,00 aB 0,33 aB 0,25 aAB
Soja Inoculada 12,83 aA 17,00 aA 1,92 bA
DMScultivar= 5,487 DMSmétodo = 5,487
1 médias seguidas por letras distintas minúsculas na linha e maiúsculas na coluna diferem entre si pelo
teste Tukey a 5% de probabilidade.
Henneberg e colaboradores (2012), com o objetivo de avaliar a eficiência dos
métodos de detecção de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de soja, realizou uma
pesquisa comparando cinco métodos: método do papel de filtro (“blotter test”), com três
temperaturas diferentes (7, 14 e 20ºC); rolo de papel; e meio agar‑bromofenol
(Neon‑S).
Não houve relação entre a percentagem da incidência na amostra e a sua
detecção na semente, independentemente do método que foi utilizado. Além disso, na
medida em que se aumentou a incidência da amostra, foi verificado um acréscimo no
número de sementes detectadas com S. sclerotiorum. Quando foi analisado a
repetibilidade dos resultados, foi observado que os métodos foram eficientes na
detecção do fungo S. sclerotiorum em sementes contaminadas artificialmente. Os
métodos não diferiram significativamente quanto à capacidade de detectar S.
sclerotiorum em sementes provenientes de áreas com incidência conhecida da doença,
não havendo relação entre a incidência do fungo no campo e a sua detecção na semente.
"Além disso, existem evidências que indicam que o método proposto pode
superestimar a incidência do fungo, caso ele se dissemine das sementes infectadas para
as vizinhas por contato." (PARISI et al. 2006)
23
5. CONCLUSÃO
1 – A modificação do método Neon S para Neon S2, aumentando o tempo de
incubação, contribuiu para uma melhor confiabilidade na interpretação da leitura,
verificando a formação de escleródios.
2 – O método permitiu aumentar a confiabilidade na detecção do patógeno o que
tornou ao Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas referência na área atendida
pelo mesmo (Triângulo Mineiro, Alto Paranaíba - MG).
24
6. REFERÊNCIAS
BARROCAS, E.N. Métodos de detecção de Sclerotinia Sclerotiorum em sementes.
In: SIMPÓSIO BRASILEIRO DE PATOLOGIA DE SEMENTES, Universidade
Federal de Lavras: UFLA, 2011.
BARROS, C.F. Ocorrência de fungos em amostras recebidas no laboratório de
micologia e proteção de plantas da Universidade Federal de Uberlândia no período
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