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Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & MetabologiaOnline version ISSN 16779487

Arq Bras Endocrinol Metab vol.46 no.2 São Paulo Apr. 2002

http://dx.doi.org/10.1590/S000427302002000200009

artigo original

Desenvolvimento e Validação de UmMétodo Imunofluorométrico Para aPesquisa de AnticorposAntiperoxidase Tiroidiana no Soro

Teresa S. Kasamatsu Rui M.B. Maciel

José Gilberto H. Vieira

Laboratório de Hormônios, Disciplina de Endocrinologia,

Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina, UNIFESP/PM, São Paulo, SP.

Recebido em 15/08/01 Revisado em 03/12/01

Aceito em 09/01/02

RESUMO

Desenvolvemos um ensaio onde TPO altamente purificada, obtida a partir de tecido humano, é adsorvida empoços de placas de microtitulação; após incubação com os soros a serem estudados, a revelação da presençade anticorpos específicos é feita com o emprego de anticorpo monoclonal antiIgG humana marcado comeurópio. A sensibilidade do teste é da ordem de 0,6U/mL, e as características de reprodutibilidade bastanteaceitáveis. Foram analisadas amostras de soro de 188 indivíduos normais de ambos os sexos (74 com >65anos), de 54 pacientes com doença de Graves (DG) e de 13 com tiroidite de Hashimoto (TH). O método foicomparado, com base em 97 amostras, com um RIE comercial, encontrandose alta concordância com índicekappa de 0,959. O estudo do valor de corte para definir a presença de anticorpos antiTPO em níveissignificativos baseouse na curva ROC, e foi fixado em 10U/mL. A freqüência de antiTPO positivo na populaçãonormal foi de 9,6% em indivíduos até 64 anos e de 16,5% nos com >65 anos; nos pacientes com DG 85,2%apresentaram antiTPO positivo, sendo 100% nos pacientes com TH. O ensaio descrito mostrouse sensível eespecífico e de fácil execução para a detecção de autoanticorpos contra a peroxidase tiroidiana presentes namaioria dos indivíduos com doença autoimune tiroidiana. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/2:167173)

Descritores: Anticorpos antitiroidianos; Anticorpos antiperoxidase tiroidiana; Anticorpos antitiroglobulina;Doenças autoimunes da tiróide

ABSTRACT

Development and Validation of an Immunofluorometric Assay for Serum Thyroid AntiPeroxydaseAntibodies. We developed an assay in which highly purified human TPO is adsorbed to microtiter plate wells; afterincubation with the study serum samples, presence of specific antibodies is revealed by a monoclonal europiumlabeled antibody against human IgG. The sensitivity of the test is 0.6U/mL, and the reproducibility quiteacceptable. We analyzed serum samples from: 188 normal subjects of both sexes, 74 of whom >65 years ofage; 54 patients with Graves' disease (GD) and 13 with Hashimoto thyroiditis (HT). Based on 97 routinesamples, the method was compared to a commercial RIA, and a high concordance was found, with a kappaindex of 0.959. The definition of a cutoff value for the presence of antiTPO antibodies was based on a ROCcurve and was set at 10U/mL. Positive antiTPO values were found in 9.6% of the normal subjects up to 64years of age, and in 16.5% of those >65 years. Patients with GD presented 85.2% of positivity, and those withHT showed 100% positivity. Thus, we described a sensitive and specific easy to perform assay, for detection ofautoantibodies against thyroid peroxidase in patients with thyroid autoimmune diseases. (Arq Bras EndocrinolMetab 2002;46/2:167173)

Keywords: Antithyroid antibodies; Antithyroperoxidase antibodies; Antithyroglobulin antibodies; Autoimunethyroid diseases

DESDE A PUBLICAÇÃO DE ROIT E COL. (1) relatando a presença de anticorpos circulantes contra antígenostiroidianos em pacientes com doenças autoimunes da tiróide, muita atenção tem sido dada ao tema, em funçãode sua potencial importância diagnóstica. Tal observação adquire valor na medida em que autoanticorposcontra antígenos tiroidianos podem ser encontrados em cerca de 2% da população feminina caucasiana (2), esua detecção pode ser útil como marcador da presença de doença autoimune tiroidiana, corroborando odiagnóstico clínico. Os anticorpos contra antígenos tiroidianos inicialmente estudados eram de dois tipos: osdirigidos contra a tiroglobulina e os dirigidos contra o chamado antígeno microssomal. Estes últimosconsiderados ativos na patogênese da doença autoimune tiroidiana em função de seu potencial em causar danocelular (3). Estudos bioquímicos, imunológicos e moleculares mostraram que o principal componente antigênicoda fração microssomal tiroidiana é a enzima tiroperoxidase (TPO) (47), uma das enzimas responsáveis pelasíntese dos hormônios tiroidianos.

A TPO é uma glicoproteína localizada na borda apical das células foliculares da tiróide, contém um sítio ativoheme, e está envolvida na biossíntese dos hormônios tiroidianos. Ela tem atividade catalítica, sendoresponsável pela iodação e acoplamento dos resíduos de tirosina da molécula da tiroglobulina, dando origemaos hormônios tiroidianos (8). A clonagem da TPO humana revelou que a molécula corresponde a uma proteínade 933 aminoácidos, sendo que 845 resíduos correspondem à porção extracelular; foi identificada também umasegunda forma, TPO2, onde ocorre uma deleção de 57 aminoácidos codificados no exon 10 (6).

Anticorpos contra TPO encontrados no soro de pacientes com doença tiroidiana autoimune são policlonais,predominantemente das subclasses IgG1 e IgG4, e reconhecem epítopos conformacionais da molécula (9). Apresença de anticorpos antiTPO da subclasse IgG2 só foi descrita em alguns pacientes, e anticorpos IgG3 sãopraticamente indetectáveis (10). A imunoglobulina IgG1 está relacionada a propriedades citotóxicas e fixadorasde complemento, dados que sugerem que os anticorpos antiTPO, além de serem um marcador da doença,podem estar envolvidos na própria indução da disfunção tiroidiana in vivo (11).

O desenvolvimento dos conhecimentos sobre a estrutura do "antígeno microssomal", bem como sobre o papeldos anticorpos endógenos a ele dirigidos, levaram ao desenvolvimento concomitante de melhores técnicas paraa pesquisa de sua presença, e conseqüente uso como teste laboratorial auxiliar na definição da presença dedoenças autoimunes tiroidianas. Testes baseados em imunofluorescência e hemaglutinação passiva foram osprimeiros a serem desenvolvidos, seguidos das técnicas de radioimunoensaio e de ensaios imunoenzimáticos(12,13). A melhor definição do antígeno a ser estudado mostrou que as limitações de sensibilidade eespecificidade, encontradas nos primeiros métodos, muitas vezes eram dependentes da presença, naspreparações de microssoma tiroidiano, de outros antígenos, em especial tiroglobulina (14). O desenvolvimentode métodos mais sofisticados de purificação da enzima a partir de tiróide humana ou suína, e a disponibilidadede TPO recombinante, permitiram o desenvolvimento de ensaios mais específicos e de maior sensibilidadediagnóstica (15,16).

Neste trabalho descrevemos um método imunofluorométrico para a medida de anticorpos antiTPO e suacomparação com um método comercial de referência. Adicionalmente comparamos os resultados obtidos com oensaio para anticorpos antiTPO com os obtidos com um ensaio para a pesquisa de anticorpos antitiroglobulinade mesmo desenho (17), objetivando o estudo comparativo das sensibilidades e especificidades diagnósticasdos dois testes.

MATERIAL E MÉTODOS

Pacientes: incluiu 114 indivíduos adultos, normais, funcionários da UNIFESP ou doadores de sangue, sendo 40do sexo masculino com média de idade de 29 anos (18 a 54 anos), e 74 do sexo feminino com média de idadede 33,4 anos (19 a 60 anos). Estudamos também 74 indivíduos seguidos no ambulatório de Geriatria daEPM/UNIFESP, todos com níveis de TSH normal, sendo 33 do sexo masculino, com média de idade de 78 anos(69 a 89 anos) e 46 do sexo feminino com média de idade de 76,6 anos (66 a 93 anos). Adicionalmente foramestudadas amostras de soro obtidas de 54 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de doença de Graves,sendo 12 do sexo masculino e 42 do sexo feminino, além de 13 pacientes do sexo feminino com diagnósticoclínico e laboratorial de tiroidite de Hashimoto. Estes pacientes são seguidos no Ambulatório de DoençasTiroidianas da Disciplina de Endocrinologia da EPM/UNIFESP.

Amostras de Soro para Comparação de Métodos: Foram empregadas 97 amostras de soro (anônimas) da rotinadiagnóstica do Laboratório Fleury, São Paulo, que tinham sido analisadas naquele laboratório quanto ao nível deanticorpos antiTPO por método de radioimunoensaio (Dynotest, Bramhs GMBH, Berlim, Alemanha).

Ensaio para anticorpos antiTiroglobulina (antiTg): empregamos método imunofluorométrico por nós descritoanteriormente (17), que emprega tiroglobulina humana purificada em nosso laboratório a partir de tecidohumano. A tiroglobulina purificada é adsorvida em placas de microtitulação Maxisorp (Nunc A/S, Roskilde,Dinamarca), o soro é diluído 1/100 antes da dosagem, sendo o padrão de referência o 65/93 fornecido peloNational Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Potters Bar, UK. A incubação do soro diluídocom a tiroglobulina adsorvida é feita por 2 horas, seguida de lavagem e adição de solução contendo monoclonalantiIgG humana marcado com európio. O monoclonal H1P1 foi produzido no Laboratório Fleury e apresentareatividade cruzada com todas as subclasses de IgG humana. A marcação com európio utiliza reagentesfornecidos por Wallac Oy, Turku, Finlândia.

Ensaio para anticorpos antiTPO: a técnica desenvolvida foi semelhante à descrita para a pesquisa de anticorposantitiroglobulina. Numa primeira etapa tiroperoxidase humana altamente purificada e obtida a partir de tecidotiroidiano, fornecida por Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA, foi diluída em tampãocarbonatobicarbonato 0,06M, pH 9,6, e 0,2mL da solução, contendo 100ng do antígeno, foram pipetadas emcada poço da placa de microtitulação (NuncPolysorp). Após incubação de 16 a 18 horas a 4°C as placas foramlavadas e tratadas com solução contendo 0,5% de albumina bovina e 0, 05% de gamaglobulina bovina. Opadrão de referência empregado foi o 66/387 fornecido pelo NIBSC, diluído para obtermos os pontos 3,9; 15,6;62,5; 250, e 1000U/mL; amostras e controles são diluídos 1/100 em tampão TrisHCl, e 0,1mL pipetados nosrespectivos poços, acrescidos de 0,1mL de tampão contendo 1% de soro de camundongo. Após incubação de 2horas a temperatura ambiente sob contínua agitação, as placas são lavadas e adicionase 0,2mL de diluição(1/3000 em relação à solução obtida na marcação) da antiIgG humana marcada com európio em tampão TrisHCl, com 0,5% de albumina bovina, 0,05% de gama globulina bovina e 1% de soro de camundongo. Após novaincubação, agora de 1 hora à temperatura ambiente e sob agitação, as placas são lavadas, adicionase 0,2mLde solução de leitura (Wallac), e procedese à leitura da fluorescência em fluorômetro temposincronizado(Wallac).

Métodos Estatísticos: com a finalidade de definir o valor de corte para positividade do teste, empregamos acurva ROC (Receiver Operation Characteristic Curve); no estudo dos grupos dois a dois empregamos o teste deMannWhitney para comparar as medianas; para comparação entre métodos empregamos a medida deconcordância Kappa. Foi considerado como nível de rejeição da hipótese de nulidade o valor de 0,05 (5%).

RESULTADOSCaracterísticas do ensaio imunofluorométrico para detecção de anticorpos antiTPO: o coeficiente de variaçãointraensaio, baseado no perfil de imprecisão, foi inferior a 7% entre os valores de 4 e 1000U/mL. O coeficientede variação interensaio foi de 22% para uma amostra com valor médio de 55U/mL, bem como para umaamostra com valor médio de 250U/mL (n = 8). A sensibilidade do método foi definida como a menor quantidadede anticorpos que pode ser diferenciada do ponto zero com erro inferior a 5%, e é da ordem de 0,6U/mL.

Resultados da comparação entre os métodos de radioimunoensaio (Dynotest) e imunofluorométrico paraanticorpos antiTPO: a comparação entre os dois métodos, baseado na determinação de 97 amostras emparalelo, mostrou concordância k = 0,959 (Kappa), sendo encontrada discordância em apenas dois casos, umonde o método em estudo era positivo e o radioimunoensaio negativo e outro com situação inversa.

Resultados da pesquisa dos anticorpos antiTPO e antiTg nas populações estudadas e definição dos limites denormalidade com base em curvas ROC: a curva ROC foi utilizada para a definição do limite de normalidade paraa pesquisa de anticorpos antiTg e antiTPO. A construção das curvas baseouse na especificidade diagnóstica(falso positivos) e sensibilidade diagnóstica (verdadeiros positivos). Para a definição foram considerados ogrupo de indivíduos normais e o de indivíduos com doenças autoimunes tiroidianas. As curvas estãorepresentadas nas figuras 1 e 2, e a área sob a curva foi de 0,899 para os anticorpos antiTPO e 0,684 para osanticorpos antiTg. O ponto de corte com melhor equilíbrio entre sensibilidade e especificidade diagnósticas foide 10U/mL para a pesquisa de anticorpos antiTPO e de 40U/mL para a pesquisa de anticorpos antiTg.Considerando estes limites de corte, no grupo de normais (n = 193), em 153 amostras (79,3%) os dois testesforam negativos, em 13 (6,7%) os dois foram positivos, em 18 (9,3%) apenas o teste antiTg foi positivo e em9 amostras (4,7%) apenas o teste antiTPO foi positivo. Nas 54 amostras de pacientes com doença de Graves,

em 8 (14,8%) ambos os testes foram negativos, em 27 (50%) ambos foram positivos e em 19 (35,2%) apenaso teste antiTPO foi positivo; neste grupo não foi observado nenhum caso de positividade somente para antiTg.Nas amostras de pacientes com tiroidite de Hashimoto (n = 13), 9 (69,2%) apresentaram positividade emambos os testes, e em 4 (30,8%) apenas o teste antiTPO foi positivo; também não foi observado nenhum casode positividade somente para antiTg. Na tabela 1 estão representados os valores das medianas, médias edesvios padrões para os três grupos estudados; o estudo estatístico mostrou que o grupo normal apresentavalores significativamente mais baixos que os dois grupos de pacientes com doenças autoimunes tiroidianas,para ambos os métodos (p < 0,05). Já o estudo dos valores obtidos nos dois grupos de patologias mostrou quenão são diferentes nem quanto aos valores de antiTg (p = 0,212), nem para os valores de antiTPO (p =0,849).

Distribuição de anticorpos antitiroidianos com a idade: separando os indivíduos normais em dois grupos, umaté 64 anos de idade e outro com 65 anos ou mais, observamos que a freqüência de antiTPO foi de 9,6% noprimeiro grupo e de 16,5% no segundo grupo (p < 0,05). Já a freqüência de anticorpos antiTg foi de 8,8% e25,3%, respectivamente (p < 0,05).

DISCUSSÃOO método aqui descrito apresenta níveis de sensibilidade analítica e características de precisão semelhantes aosdos melhores métodos descritos na literatura (16,18). Além disso, sua comparação com método comercialconsiderado de referência mostrou alta correlação de resultados, sendo que apenas dois soros (2,1%)apresentaram resultados discordantes. A definição dos valores de corte para os dois métodos estudadosbaseouse no uso da curva ROC, método que permite maior equilíbrio entre sensibilidade e especificidadediagnósticas (19,20). Analisando a população normal como um todo, com a aplicação dos valores calculados(10U/L para antiTPO e 40U/L para antiTg) encontramos uma incidência de testes considerados positivos em11,3% para antiTPO e 16% para antiTg. Estes valores são superiores quando comparados a outros publicadoscom o emprego de métodos de radioimunoensaio e imunoenzimaensaio, que mostraram valores entre 7 e 8,5%para antiTPO e 3,4% para antiTg (18,21,22). A explicação para esta diferença pode residir não só napopulação estudada, que, no nosso caso, incluiu uma porcentagem significativa de pacientes idosos, como nasdiferenças metodológicas relativas à sensibilidade analítica dos métodos e definição de valor de corte. De fato,a maioria dos soros considerados positivos na nossa população normal apresentava valores pouco elevados.Quanto ao encontro de maior incidência de soros positivos em população geriátrica, este foi um achadoesperado, desde que é conhecida a maior prevalência de resultados positivos nessa população (23).

Quando analisamos os resultados encontrados na população com doenças autoimunes da tiróide, encontramos,com a aplicação dos limites definidos pela curva ROC, para anticorpos antiTg, 50% de positividade empacientes com doença de Graves, e 69% em pacientes com tiroidite de Hashimoto. Já os resultados com o testepara anticorpos antiTPO foram de 85 e 100%, respectivamente, dados semelhantes aos recentemente descritosna literatura (16,18,24). Esta diferença significativa em termos de sensibilidade e especificidade diagnósticasentre os dois testes vem de encontro a dados já publicados (25), mas contradiz conclusão de trabalho anteriorde nosso grupo (26). Tal discrepância pode ser imputada ao uso, naquela ocasião, de ensaio baseado emhemaglutinação para a pesquisa de anticorpos antimicrossomais; o emprego de ensaio mais sensível eespecífico, como o empregado no presente trabalho, modificou as conclusões. Acreditamos que os dados aquiapresentados, associados aos já publicados na literatura, são conclusivos quanto à não necessidade de pesquisados dois anticorpos antitiróide, bastando a pesquisa de anticorpos antiTPO desde que realizada utilizandotécnica de alta sensibilidade e especificidade.

Em conclusão, neste trabalho apresentamos os dados obtidos no desenvolvimento e caracterização de métodosensível e específico para a pesquisa de anticorpos antiTPO, de fácil execução, com a utilização de quantidadesmínimas de antígeno altamente purificado. Empregamos a curva ROC para definir o limite de corte, e aaplicação do teste em população normal e portadora de doenças autoimunes da tiróide mostrou altaespecificidade e sensibilidade diagnóstica. Como já descrito na literatura encontramos incidência maior deanticorpos antitiroidianos em população geriátrica, e comprovamos que a adição de pesquisa de anticorpos antitiroglobulina não traz nenhum ganho em termos de sensibilidade diagnóstica.

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Teresa Sayoko Kasamatsu Disciplina de Endocrinologia Universidade Federal de São Paulo UNIFESP/EPM Caixa Postal 20.266 04034970 São Paulo, SP Fax: (011) 50845231 e.mail: tkasamatsuendo@pesquisa.epm.br

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