Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação de

rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada

Iara Maíra de Oliveira Viana1

Paula Rocha Chellini2

1Farmacêutica Industrial. Aluna da Pós-Graduação em Biociências Forenses, pela Universidade Católica de

Goiás/IFAR 2Mestre em Estatística pela Universidade Federal de Minas Gerais. Farmacêutica Bioquímica pela Universidade

Federal de Juiz de Fora.

Resumo

A tuberculose é um problema de saúde prioritário no Brasil, que juntamente com outros 21 países em

desenvolvimento, concentram 80% dos casos da doença no mundo. Devido a frequentes recidivas e a

multirresistência a fármacos, seu tratamento representa uma grande preocupação mundial. No intuito de

aumentar a adesão do paciente ao tratamento e reduzir a resistência bacteriana, têm sido propostas formas

farmacêuticas contendo associações de fármacos. Entretanto, ainda não existem métodos analíticos descritos em

compêndios oficiais para análise de algumas dessas associações. Dessa forma, foi desenvolvido método analítico

para determinação concomitante dos tuberculostáticos rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa

combinada. As análises foram realizadas em cromatógrafo Agilent® 1200 provido de detector ultravioleta (DAD)

a 238 nm e coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm; 5 µm), mantida a 30 ºC; eluição em gradiente,

sendo que na primeira etapa utilizou-se tampão fosfato pH 6,8: acetonitrila (95:5 v/v), e na segunda fase do

gradiente utilizou-se a proporção de (1:1 v/v); fluxo de 1,2 mL/min e volume de injeção de 20 µL. O método

desenvolvido foi validado em relação à linearidade, precisão, exatidão, seletividade e robustez, conforme

procedimentos recomendados pela Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA. A linearidade do

método foi confirmada para rifampicina e para isoniazida na faixa de 80 a 120%, resultando em coeficiente de

correlação superiores a 0,99. Além disso, os valores obtidos com os testes de precisão e exatidão foram

satisfatórios.

Palavras-chaves: Tuberculostáticos. Rifampicina. Isoniazida. Cromatografia a líquido de alta eficiência.

Validação.

Abstract

Tuberculosis is a priority health problem in Brazil, which along with 21 other developing countries concentrate

80% of cases of the disease worldwide. Due to frequent relapses and multidrug resistance, its treatment is a

major global concern. In order to increase patient adherence to treatment and reduce bacterial resistance, have

been proposed dosage forms containing drug associations. However, there are no analytical methods described in

official compendia for the analysis of some of these associations. Thus, was developed an analytical method for

simultaneous determination of rifampicin and isoniazid in antituberculosis combined fixed dose tablets. Analyses

were performed in chromatograph Agilent®

1200 equipped with an ultraviolet detector (DAD) at 238 nm and

column Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm, 5 mm), maintained at 30 °C; gradient elution, where in the

first step was used phosphate buffer pH 6.8: acetonitrile (95:5 v/v), and in the second step was used the ratio of

(1:1 v/v); flow of 1.2 mL/min and injection volume of 20 µL. The method was validated with respect to linearity,

precision, accuracy, selectivity and robustness according to procedures recommended by Resolution RE Nº 899

of May 29, 2003 of ANVISA. The linearity of the method was confirmed to isoniazid and rifampicin in the range

of 80 to 120%, resulting in a correlation coefficient greater than 0.99. Furthermore, the values obtained with the

precision and accuracy tests were satisfactory.

Keywords: Tuberculostatic. Rifampicin. Isoniazid. High performance liquid chromatography. Validation.

1 INTRODUÇÃO

A tuberculose é uma doença infecciosa evitável e curável, causada pela bactéria

Mycobacterium tuberculosis. É transmitida de pessoa a pessoa através de perdigotos de

pacientes com doença respiratória ativa e sua forma mais comum é a pulmonar, podendo

também ocorrer em outros órgãos ou tecidos [1].

Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de um terço da população mundial é

infectado pela bactéria causadora da doença, entretanto, somente uma parcela desenvolve a

tuberculose. Em 2010, a estimativa para a incidência global da doença foi de 128 casos por

100.000 habitantes. No Brasil, a incidência de tuberculose no mesmo ano foi de cerca de 43

casos por 100.000 habitantes. Pessoas com deficiência no sistema imunológico possuem

maior risco de desenvolvê-la, o que explica sua alta incidência em portadores do vírus da

imunodeficiência humana (HIV, do inglês Human Immunodeficiency Virus). A tuberculose é

a principal causa de morte nesse grupo, correspondendo a aproximadamente um em cada

quatro mortes de pessoas HIV positivas [1].

Por muito tempo, o tratamento da tuberculose no Brasil consistiu na associação de

rifampicina, isoniazida e pirazinamida. Porém, após o segundo Inquérito Nacional, que

aconteceu em 2009, notou-se um aumento da resistência à isoniazida. O Ministério da Saúde

então propôs um novo sistema de tratamento da doença. As dosagens de pirazinamida e

isoniazida foram reduzidas, introduziu-se um quarto fármaco (o cloridrato de etambutol) na

etapa inicial do tratamento e formulou-se um comprimido com quatro fármacos de dose fixa

combinada [2,3].

Atualmente o esquema básico para adultos e adolescentes consiste em dois meses de

tratamento com rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol, seguidos de

quatro meses de tratamento com rifampicina e isoniazida [2]. O tratamento preconizado para

crianças (menores de dez anos) continua sendo com três fármacos [3].

A mudança no esquema de tratamento contra a tuberculose agregou benefícios como

redução do número de comprimidos a ser ingerido pelo paciente, impossibilidade da

utilização isolada dos fármacos e simplificação da gestão farmacêutica em todos os níveis [2].

O acréscimo de um fármaco aumenta a proteção contra a expressão fenotípica de possíveis

mutações genéticas da bactéria Mycobacterium tuberculosis [3]. Além disso, a administração

conjunta de medicamentos nos pacientes sensíveis, por meio de medicamentos dose fixa

combinada ou formulação conjunta, assegura melhores picos séricos e facilita a sua

supervisão [4].

A execução de ensaios analíticos garante que os medicamentos tenham qualidade

assegurada [5]. Sem essa avaliação da qualidade, todo o tratamento pode ser comprometido.

Entretanto, não existem métodos analíticos descritos na literatura para quantificação

simultânea de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada. A

Farmacopeia Brasileira 5ª edição e a Farmacopeia Britânica 2011 descrevem métodos

analíticos para determinação da qualidade de comprimidos contendo apenas um dos fármacos,

rifampicina ou isoniazida [6,7]. Já a Farmacopeia Americana 2012 descreve método para

análise simultânea dos fármacos, porém para a forma farmacêutica cápsula [8].

Conforme Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA, o método

analítico para quantificação do princípio ativo em produtos farmacêuticos, não descrito em

farmacopeias ou formulários oficiais, deve ser validado [9]. Esse processo comprova, pelo

fornecimento de evidência objetiva, de que os requisitos para a aplicação ou uso específico

pretendido do método analítico foram atendidos [10]. É importante que todo método analítico

tenha seu desempenho confirmado por meio de procedimentos de validação intralaboratoriais.

Considerando que a validação por procedimentos interlaboratorias tem limitações, já que

envolvem um alto custo e determinam principalmente a exatidão e a precisão dos métodos, a

validação intralaboratorial é essencial para determinação de parâmetros de desempenho como

linearidade, faixa de trabalho, seletividade, limite de detecção e limite de quantificação [11].

Segundo Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA devem ser

avaliados os parâmetros especificidade, linearidade, intervalo, repetibilidade, precisão

intermediária, exatidão e robustez durante a validação de método analítico para quantificação

do princípio ativo em produtos farmacêuticos [9].

Considerando o exposto, o presente trabalho apresenta o desenvolvimento e validação

de método analítico para a quantificação simultânea de rifampicina e isoniazida em

comprimidos de dose fixa combinada, associação utilizada na segunda etapa do tratamento

preconizado pelo Ministério da Saúde.

2 METODOLOGIA

2.1 Amostra

Foram utilizados comprimidos de dose fixa combinada de rifampicina e isoniazida

(contendo 150 mg e 75 mg por comprimido de fármaco respectivamente) produzidos pela

Lupin LTD e doados pela Secretaria de Estado da Saúde de Minas Gerais/Brasil.

2.2 Soluções

2.2.1 Solução tampão fosfato pH 6,8

No preparo da solução tampão pH 6,8 dissolveu-se de 1,4019 g de fosfato de sódio

dibásico anidro em aproximadamente 600 mL de água ultrapura e em seguida transferiu-se

para balão volumétrico de 1 L. Adicionou-se 1 mL de trietilamina e completou-se volume

com água ultrapura. Ajustou-se o pH para 6,8 utilizando solução de ácido fosfórico diluído.

Obteve-se, portanto, tampão fosfato de sódio dibásico 10 mM com trietilamina 0,1%.

2.2.2 Solução diluente

A solução diluente foi preparada pela mistura de solução tampão pH 6,8 e acetonitrila

na proporção (95:5 v/v).

2.2.3 Solução amostra

Inicialmente determinou-se o peso médio dos comprimidos contendo rifampicina e

isoniazida, utilizando 20 unidades, e os pulverizou. Em seguida, pesou-se quantitativamente o

equivalente a 1/10 do peso médio e transferiu-se para balão volumétrico de 100 mL.

Adicionou-se cerca de 10 mL de solução diluente e manteve-se a solução em banho ultrassom

por 10 minutos. Em seguida, completou-se o volume do balão volumétrico com solução

diluente.

2.2.4 Solução padrão 100%

Pesou-se quantitativamente 30 mg de rifampicina substância química de referência

(SQR) e 15 mg de isoniazida SQR e transferiu-se para balão volumétrico de 200 mL.

Adicionou-se cerca de 20 mL de solução diluente e manteve-se a solução em banho ultrassom

por 10 minutos. Em seguida, completou-se o volume do balão volumétrico com solução

diluente. Obteve-se solução contendo 150 µg/mL de rifampicina e 75 µg/mL de isoniazida.

2.2.5 Solução padrão 200%

Pesou-se quantitativamente 30 mg de rifampicina SQR e 15 mg de isoniazida SQR e

transferiu-se para balão volumétrico de 100 mL. Adicionou-se, utilizando pipeta volumétrica,

5 mL de acetonitrila e cerca de 10 mL de solução tampão fosfato pH 6,8 e manteve-se a

solução em banho ultrassom por 10 minutos. Completou-se o volume do balão volumétrico

com solução tampão fosfato pH 6,8. Obteve-se solução contendo 300 µg/mL de rifampicina e

150 µg/mL de isoniazida. Essa solução padrão 200% foi utilizada na construção da curva

analítica.

2.3 Método de ensaio

No desenvolvimento e otimização do método analítico foram testados diversos

tampões e proporções dos solventes da fase móvel, e a melhor condição de análise (Tabela 1)

foi definida com base nos valores de fator de retenção, da resolução e do fator de cauda dos

picos [12]. Os parâmetros cromatográficos otimizados foram: eficiência (número de pratos

teóricos), tempo de corrida, composição e vazão de fase móvel, temperatura, volume de

injeção e condições de detecção por espectrofotometria no ultravioleta (comprimento de

onda). As análises foram realizadas em cromatógrafo a líquido Agilent® 1200 provido de

detector de arranjos diodos (DAD).

Tabela 1 – Condições cromatográficas do método analítico para determinação de rifampicina

e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada

Parâmetro Condições Cromatográficas

Comprimento de onda 238 nm

Volume de injeção 20 µL

Coluna Zorbax Eclipse XDB – C18 (150 x 4,6 mm; 5µm)

Temperatura 30 °C

Fluxo 1,2 mL/min

Fase móvel Tampão Na2HPO4 10 mM e 0,1% trietilamina (pH 6,8)

Acetonitrila

A eluição foi realizada em gradiente de acordo com as informações contidas na tabela

2, sendo o solvente A uma mistura de tampão e acetonitrila (95:5 v/v) e o solvente B

acetonitrila.

Tabela 2 – Gradiente utilizado para possibilitar determinação simultânea de rifampicina e

isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada

Tempo (min) Solvente A Solvente B Eluição

0 – 2 100% 0% Isocrática

2 – 4 100% → 52% 0% → 48% Gradiente linear

4 – 7 52% 48% Isocrática

7 – 8 52% → 100% 48% → 0% Gradiente linear

8 – 10 100% 0% Reequilíbrio

2.4 Validação

Os parâmetros linearidade, precisão, exatidão, seletividade e robustez foram

estabelecidos em ensaios com soluções padrão e amostra. A adequação do método foi

avaliada em função dos parâmetros de desempenho estabelecidos na Resolução RE Nº 899 de

29 de maio de 2003 da ANVISA e respectivos critérios de aceitabilidade [9].

2.4.1 Linearidade

Preparou-se uma curva de calibração a partir de três soluções padrão 200% (contendo

300 µg/mL de rifampicina e 150 µg/mL de isoniazida), cujos níveis de concentração foram

80, 90, 100, 110 e 120%. Foram preparadas triplicatas independentes de cada nível por meio

da transferência quantitativa de alíquotas dessas soluções padrão 200%, utilizando bureta de

10 mL, para balões volumétricos de 10 mL. Foram transferidos 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0 mL da

solução padrão 200% para o preparo dos níveis de concentração 80, 90, 100, 110 e 120%

respectivamente. Completaram-se os balões volumétricos com solução diluente. As soluções

foram preparadas e analisadas em ordem aleatória.

A linearidade foi avaliada conforme descrito por SOUZA e JUNQUEIRA. Primeiro

avaliou-se se o método dos mínimos quadrados ordinários era adequado. Foram testadas as

premissas da regressão linear simples pelos testes de distribuição normal dos resíduos (teste

de Ryan & Joiner), de homocedasticidade dos resíduos (teste de Brown & Forsythe) e

independência dos resíduos (teste de Durbin-Watson). O gráfico dos resíduos da regressão

foram construídos e examinados para investigação de perfis que indicassem

heterocedasticidade ou desvio da linearidade [13, 14]. Os outliers foram verificados pelo teste

de resíduos padronizados Jacknife. O teste de Jacknife foi aplicado sucessivamente até que

novos outliers não fossem encontrados ou até exclusão de, no máximo, 22,2% dos resultados

em relação ao original [15]. Em seguida, a análise da variância (ANOVA) foi aplicada para

avaliar o desvio da linearidade e significância da regressão. Quando não há desvio da

linearidade e a regressão é significativa, conclui-se que o modelo linear é adequado [13, 14].

2.4.2 Seletividade

Seletividade foi avaliada em ensaios com soluções padrão 100%, amostra e branco. A

solução padrão 100% e a solução amostra foram preparadas conforme item 2.2.4 e item 2.2.3

respectivamente. Já o branco consistiu apenas no preparo da solução diluente, conforme item

2.2.2, pois não foi possível identificar os excipientes presentes nos comprimidos de dose fixa

combinada de rifampicina e isoniazida produzidos pela Lupin LTD. Após preparo, as três

soluções foram injetadas em cromatógrafo a líquido conforme descrito no item 2.3. Os perfis

cromatográficos obtidos com a solução padrão 100% e solução amostra foram comparados,

verificando se os tempos de retenção dos fármacos rifampicina e isoniazida eram semelhantes.

O perfil cromatográfico do branco foi utilizado para identificar possíveis interferentes

provenientes do diluente utilizado. Para isso o perfil cromatográfico do branco foi comparado

com os perfis cromatográficos da solução padrão 100% e da solução amostra. Além disso,

avaliou-se a pureza dos picos dos fármacos rifampicina e isoniazida com auxílio de detector

de arranjo de diodos.

2.4.3 Exatidão e precisão

A exatidão e precisão do método analítico foram avaliados conforme Resolução RE Nº

899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA.

Devido à indisponibilidade dos constituintes da matriz do comprimido doado, optou-se

por estudar a exatidão pelo método da adição de padrão. Assim, quantidades conhecidas de

rifampicina SQR e isoniazida SQR foram adicionados ao medicamento, sendo preparadas

soluções em três níveis de concentração 90, 100 e 110% com três réplicas de cada. Para o

preparo dessas soluções, inicialmente determinou-se o peso médio dos comprimidos contendo

rifampicina e isoniazida, utilizando 20 unidades, e os pulverizou. Em seguida, pesou-se

quantitativamente o equivalente a 1/25 do peso médio e transferiu-se para balão volumétrico

de 50 mL. Adicionou-se 5, 10 e 15 mL de solução de padrão 100% recém preparada a cada

balão volumétrico de 50 mL. Completou-se o volume dos balões volumétricos com solução

diluente. Preparou-se também duas soluções amostra 80%. A partir das leituras das soluções

amostra 90, 100 e 110%, soluções amostra 80% e da solução padrão 100% foi estimada a

recuperação aparente. A recuperação deve ser entre 98 e 102% [16].

A precisão do método foi verificada através da precisão intracorrida e da precisão

intercorrida. Em um primeiro dia foram realizadas seis determinações a 100% sob mesmas

condições de análise (em um curto período de tempo e com o mesmo analista e

equipamentos). Já em um segundo dia foram preparadas outras seis soluções amostra

utilizando balança diferente e por outro analista. As precisões sob as duas condições (precisão

intracorrida e precisão intercorrida) foram expressas em termos de desvios padrão relativos,

sendo o critério de aceitação desvio padrão relativo menor que 5% [9].

2.4.4 Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a

pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos [9]. Para avaliação da robustez do

método variou-se três parâmetros: temperatura, fluxo e coluna cromatográfica. Os ensaios

foram realizados de forma univariada conforme tabela 3 e os resultados foram comparados

por meio de análise de variância (ANOVA). Foram necessários 3 dias de análise, sendo que

em cada dia foram preparadas 3 soluções amostra e 1 solução padrão 100%. No primeiro dia

as soluções foram injetadas nas condições dos ensaios de 1 a 3. No segundo dia foram

preparadas novas soluções, que foram utilizadas nos ensaios de 4 a 6 e, em um terceiro dia,

preparou-se soluções para realizar os ensaios 7 e 8. Os ensaios 2, 5 e 7 correspondem às

análises nominais realizadas para servir de comparação para os demais ensaios. Os teores de

rifampicina e isoniazida obtidos nos ensaios de 1 a 3 foram comparados entre si, bem como os

ensaios 4 a 6, e os ensaios 7 e 8.

Tabela 3 – Ensaios realizados para análise da robustez do método analítico para determinação de

rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada

Parâmetro Ensaio

1 2 3 4 5 6 7 8

Temperatura

(ºC) 25 30 35 30 30 30 30 30

Fluxo (mL/min) 1,2 1,2 1,2 1,1 1,2 1,3 1,2 1,2

Lote da coluna 799511

8-595

799511

8-595

799511

8-595

799511

8-595

799511

8-595

799511

8-595

799511

8-595

993967

-902

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

No desenvolvimento do método foram avaliados vários comprimentos de onda,

utilizando o modo varredura (200 – 400 nm) do equipamento. Foi observado que o máximo

de absorção da rifampicina ocorre no comprimento de onda de 238 nm e 338 nm, e o máximo

da isoniazida em 265 nm. Como em 238 nm foram observados valores adequados de sinais

para ambos os fármacos, esse foi o comprimento de onda selecionado.

Para escolha do pH foram testados diferentes tampões e avaliados os resultados de

tempo de retenção, resolução ente os picos e o fator de cauda.

Os perfis dos gráficos de resíduos (Figura 1) demonstraram que não houve tendências

óbvias, indicando que há bom ajuste ao modelo linear escolhido. Os intervalos de confiança

dos resíduos sugeriram a presença de outlier apenas no gráfico do analito rifampicina, que

foram confirmados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife, portanto não houve

indicação de um número maior que 22,2% de outliers para cada curva.

Figura 1 – Gráficos de resíduos obtidos pelas curvas de cada fármaco,

rifampicina e isoniazida.

-200

-100

0

100

200

75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125

ei

Concentração (%)

Gráfico de resíduos - Rifampicina

-100

-50

0

50

100

75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125

ei

Concentração (%)

Gráfico de resíduos - Isoniazida

A tabela 4, a seguir, contem os dados obtidos nos experimentos para avaliação da

linearidade. Foi confirmado que os resíduos da regressão seguem a distribuição normal, são

homocedásticos e independentes, que são as premissas da regressão linear. Dessa forma, o

teste de F pode ser aplicado para avaliação da regressão e do desvio da linearidade. Além

disso, obteve-se coeficiente de correlação (r) satisfatório na faixa de linearidade definida,

0,9979 para rifampicina e 0,9957 para isoniazida. Os resultados indicam que há bom ajuste ao

modelo linear. A significância da regressão (p < 0,001) e desvios de linearidade não

significativos (p > 0,05) determinaram linearidade na faixa de 80 a 120% para ambos os

fármacos (Figura 2).

Tabela 4 - Estatísticas para avaliação da linearidade para as curvas da rifampicina e da isoniazida.

Estatística Rifampicina Isoniazida

Faixa de Linearidade

80% a 120%

120 a 180 µg/mL 60 a 90 µg/mL

Número de observações total

ninicial 15 15

Número de observações, após exclusão de

outliers

n

14 15

Normalidade

R

0,9780 0,9620

p

p > 0,10 p > 0,10

Homocedasticidade

tL

0,235 - 0,434

p

p > 0,05 p > 0,05

Independência

d

2,036 2,667

p

p>0,01 p>0,01

Coeficiente de correlação da curva final

r

0,9979 0,9957

Regressão

F

2843,104 1505,811

p

p < 0,001 p < 0,001

Desvio da linearidade

F

0,117 0,188

p p > 0,05 p > 0,05

ninicial = número de observações antes da avaliação de outliers; n = número de observações,

após exclusão de outliers pelo teste Jacknife; R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner; p

= significância; tL = estatística t de Levene; d = estatística de Durbin-Watson; r = coeficiente

de correlação da curva linear final obtida para cada fármaco e F = razão entre as variâncias

(teste ANOVA).

Figura 2 – Gráficos finais da linearidade obtidos para cada fármaco,

rifampicina e isoniazida.

y = 58,989x - 94,613

R² = 0,9958

r = 0,99794000

4600

5200

5800

6400

7000

75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125

Resp

ost

a

Concentração (%)

Gráfico Final da Linearidade - Rifampicina

y = 18,98x - 5,5163

R² = 0,9914

r = 0,9957

1400

1600

1800

2000

2200

2400

75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125

Resp

ost

a

Concentração (%)

Gráfico Final da Linearidade - Isoniazida

O método analítico é seletivo e possui adequada resolução entre os picos (Figura 3).

Nenhum pico é observado quando injetada a solução branco, indicando que não existem

interferentes provenientes dos solventes utilizados na análise. Além disso, os perfis

cromatográficos da solução padrão e da solução amostra, preparadas na mesma concentração,

são semelhantes. Os tempos de retenção médios observados foram de 9,838 ± 0,373 minutos

para rifampicina e de 3,041 ± 0,461 minutos para isoniazida obtidos pela injeção da solução

padrão. Para a solução amostra, os tempos de retenção médios foram 9,810 ± 0,389 de

minutos para rifampicina e de 3,034 ± 0,480 minutos para isoniazida. O ruído observado na

linha de base dos cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco é devido

ao uso da eluição em gradiente (Figura 4).

Figura 3 – Cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco no teste seletividade

0

200

400

600

800

1000

1200

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Padrão

Amostra

Branco

Tempo (min)

mA

u

Figura 4 – Linha de base dos cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco

no teste seletividade

0

25

50

75

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Padrão

Amostra

Branco

Tempo (min)

mA

u

Tabela 5 – Desvios padrões relativos obtidos nas análises de soluções amostras

preparados para avaliação do teste precisão

Parâmetro Rifampicina Isoniazida

Precisão intracorrida 1º dia 0,56 % 2,01 %

Precisão intracorrida 2º dia 2,29 % 1,61 %

Precisão intercorrida 1,63 % 3,23 %

As concentrações médias esperadas e observadas, bem como as porcentagens de

recuperação de cada fármaco, encontram-se na tabela 5. As porcentagens de recuperação dos

fármacos rifampicina e isoniazida foram superiores a 98% e inferiores a 102% (Tabela 6) e os

valores de DPR foram menores que 5%, portanto o método para análise simultânea dos dois

fármacos não é inexato.

Tabela 6 – Concentrações médias esperadas e observadas e porcentagens de recuperação de cada fármaco

obtidas no teste exatidão

Fármaco Nível de

concentração

Concentração

esperada (mg/mL)

Concentração

observada (mg/mL) Recuperação (%)

Rifampicina

90 % 0,1417 0,1404 99,1

100 % 0,1563 0,1535 98,2

110 % 0,1713 0,1699 99,1

Isoniazida

90 % 0,0653 0,0656 100,5

100 % 0,0727 0,0731 100,5

110 % 0,0804 0,0815 101,4

Na verificação da robustez do método analítico, constatou-se que pequenas variações

de temperatura, no fluxo e no lote da coluna cromatográfica não impactam significativamente

o método. Não houve diferenças estatisticamente significativas a 95% de confiança (p > 0,05).

A tabela 7 apresenta o teor de cada fármaco obtido em cada ensaio. Além disso, ela apresenta

os valores de F obtidos, valor de p e o F crítico correspondente a cada grupo de ensaios. Os

ensaios foram realizados conforme descrito no item 2.4.4 e tabela 3: nos ensaios de 1 a 3

variou-se a temperatura, nos ensaios 4 a 6 variou-se o fluxo e no ensaio 8 utilizou-se coluna

com lote diferente da coluna da validação. O resultado do ensaio 8 foi comparado com o

resultado obtido com o ensaio 7. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que, quando

aplicado o método analítico para determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos

de dose fixa combinada, a temperatura do método pode variar entre 30 ºC ± 5 ºC, o fluxo

entre 1,2 mL/min ± 0,1 mL/min e que pode-se utilizar coluna cromatográfica de outro lote

sem causar grandes variações no resultado analítico.

Tabela 7 – Resultados obtidos nos experimentos realizados para análise da robustez do método para

determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada

Estatística Ensaio

1 2 3 4 5 6 7 8

Teor de Rifampicina 102,4% 102,0% 102,6% 102,6% 102,0% 102,0% 101,4% 101,4%

F 6,457 x 10-1

5,272 x 10-2

1,485 x 10-2

p 0,557 0,949 0,909

Fcrítico 5,143 5,143 7,709

Teor de Isoniazida 99,7% 99,6% 99,7% 94,2% 94,2% 94,2% 92,4% 92,1%

F 2,506 x 10-3

7,760 x 10-4

1,914 x 10-1

p 0,997 0,999 0,684

Fcrítico 5,143 5,143 7,709

4 CONCLUSÕES

O método analítico desenvolvido para quantificação simultânea de rifampicina e

isoniazida em comprimidos dose fixa combinada, associação utilizada na segunda etapa do

tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde, é seletivo e específico e cumpriu com os

requisitos de linearidade, precisão, exatidão e robustez. Esse método permitirá a verificação

da qualidade dos comprimidos disponibilizados pelo Sistema Único de Saúde. Além disso, o

novo método poderá ser útil no trabalho de verificação da qualidade dos produtos

farmacêuticos realizado pelos Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACENs) juntamente

com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

5 AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos da

Faculdade de Farmácia da UFMG e ao Grupo de Revisão da Farmacopeia Brasileira 5ª edição

pela colaboração no trabalho.

REFERÊNCIAS

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Coordenadoria de Controle de Doenças. Secretaria de Estado da Saúde. São Paulo, SP, Brasil.

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[3] SVS/MS. Informe Técnico de Tuberculose. Julho, 2010. Disponível em: <

http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/informe_tb_julho10_certo_22_07_2010.pdf>.

Acesso em: 25 de julho de 2012.

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Brasil: histórico e medidas de controle. Rev. Saúde Pública, v.41, p.34-42, 2007.

[5] BRASIL. Resolução RDC N° 17, de 16 de abril de 2010. Dispõe sobre as Boas Práticas de

Fabricação de Medicamentos. Diário Oficial da União, Brasília, 19 de abril de 2010.

[6] FARMACOPEIA BRASILEIRA. 5ª edição, v.2, Brasília, 2010. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/pdf/volume1.pdf>. Acesso em: 24 de julho

de 2012.

[7] BRITISH PHARMACOPOEIA 2011 (BP 2011). The Stationary Office on behalf of the

Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA), London (GB), UK, 2011.

[8] UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY (USP 35 - NF

30). The United States Pharmacopeial Convention, Rockville (MD), USA, 2012.

[9] BRASIL. Resolução RE N° 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos

analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, 02 de junho de 2003.

[10] BRASIL. Resolução RDC N° 11, de 16 de fevereiro de 2012. Dispõe sobre o

funcionamento de laboratórios analíticos que realizam análises em produtos sujeitos à

Vigilância Sanitária e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, 22 de

fevereiro de 2012.

[11] SOUZA, Scheilla Vitorino Carvalho de. Procedimento para validação intralaboratorial

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