desenvolvimento e padronizaÇÃo da tÉcnica de ...pelicano.ipen.br/posg30/textocompleto/martha do...

BR9939131

Instituto de PetquimmaEnergéticas e Nuclear»»

AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADEDE SÃO PAULO

DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE

RADIOIMUNOENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE

PRÒ-INSULINA HUMANA E SUA APLICAÇÃO

NO ESTUDO DO DIABETES MELLITUS TIPO II

ASSOCIADO À OBESIDADE

MARTHA DO NASCIMENTO

Tese apresentada como parte dos requisitospara obtenção do Grau de Doutor em Ciênciasna Área de Tecnologia Nuclear.

Orientadora:Dra. Vânia Cairá Borghi

3 0 - 4 4São Paulo

1996

TESE REALIZADA NOS LABORATÓRIOS DO INSTITUTO

DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES E NO

LABORATÓRIO DE NUTRIÇÃO HUMANA E DOENÇAS

METABÓLICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO.

ABREVIATURAS

Bq. . .

cpm. . .

CV. . .

CT. . . .

DMD. .

DP

EGPA-

HbA1c

HPLC-

I M C .

K g . . . .

mCi . .

mg. . .

ml_. . .

OMS- .

PEG- •

R I E . . .

Rm. . .

WHO. •

M9 • • • •

pCi. . .

pL - - .

uUI . .

. Bequerel. Uma desintegração por segundo

. Contagem por minuto.

. Coeficiente de variação.

. Corante traçador

. Dose mínima detectável

• Desvio Padrão.

• Eletroforese em gel de poliacrilamida.

• Hemoglobina glicosilada

• Cromatografia líquida de alta resolução

. índice de massa corpórea

. 10.3 gramas

. Milicurie.

. 10'3gramas.

. Mililitro. 1CT3 litros.

. Organização Mundial de Saúde

• Polietileno-glicol.

. Radioimunoensaio

• Migração eletroforética relativa

- World Health Organization

• 10"6 gramas.

- 3,7 x 1 o4 desintegrações por segundo.

• Microlitro. 10"6 litros.

. Micro unidade internacional

DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE

RADIOIMUNOENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE PRÓ-INSULINA

HUMANA E SUA APLICAÇÃO NO ESTUDO DO DIABETES MELLITUS

TIPO II ASSOCIADO À OBESIDADE.


RESUMO

A disponibilidade de um imunoensaio para a dosagem de pró-insulina

é importante para definir seu significado fisiológico e fisiopatológico em humanos. A

concentração de pró-insulina no soro está elevada em pacientes com Diabetes Mellitus

Tipo I e Tipo II portanto, um aumento na sua concentração pode servir como indicador

precoce de disfunção da célula j3. Recentemente, foram encontrados no Diabetes

Tipo II, um aumento na concentração de pró-insulina e seu derivado de conversão

31,32-des, correlacionado com pressão sanguínea diastólica como um fator de risco

para doenças cardiovasculares.

No entanto, o desenvolvimento de um radioimunoensaio (RIE) sensível

e específico para a pró-insulina tem sido difícil devido à sua concentração baixa e aos

intermediários de conversão presentes no soro. Além disso, outros peptídeos, como a

insulina e o peptídeo-C, reagem cruzadamente no ensaio.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um RIE para pró-insulina

altamente específico, empregando proinsulina biossintética humana (hPI) como

imunógeno, padrão e traçador.

A pró-insulina foi radioiodada empregando-se o método do iodogen e

apresentou grande estabilidade após purificação em QAE-Sephadex A-25. A eficiência

da purificação, assim como a estabilidade do traçador foram analisadas pela

eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA).

O antissoro foi obtido em cobaia com injeções subcutâneas

repetidas em múltiplos sítios, constituídas de volumes iguais de pró-insulina (50 ug em

salina) e adjuvante de Freund (completo para a imunização primária e incompleto

para as imunizações subseqüentes). O sangue total foi colhido duas semanas após o

terceiro reforço e o antissoro foi avaliado quanto à sua reação cruzada com a insulina

e o peptídeo-C. Como o antissoro não foi suficientemente específico para pró-insulina

ele foi adsorvido contra insulina e peptídeo-C conjugados a Sepharose- 4B CNBr

ativada, após o que, não apresentou reação cruzada com a insulina e o peptídeo-C

(<0,01%) e reconheceu a junção entre a cadeia B da insulina e o peptídeo-C (65,66-

split-pró-insulina).

O RIE foi realizado empregando-se um sistema de ensaio em não-

equilíbrio que permitiu a medida da pró-insulina em 28 h, otimizando as concentrações

dos reagentes, as condições de reação de ligação e o procedimento de separação da

pró-insulina livre e ligada ao antissoro.

O antissoro ou soro normal de cobaia para o branco (50 uL) e a hPI

padrão ou soro desconhecido (200 uL) foram incubados a 4°C por 24 h. Em seguida,

acrescentou-se a 125 l-hPI (50 uL, aproximadamente 10.000 cpm) e incubou-se o

ensaio por mais 3 h. Acrescentou-se em seguida, o soro normal de cobaia, segundo

antissoro e PEG e incubou-se por mais um período de 1 h a 23°C. O precipitado foi

coletado por centrifugação a 3500 G por 15 min a 4°C.

A técnica de separação do RIE, segundo antissoro assistido pelo PEG,

reduziu não somente o tempo de incubação do ensaio, mas também foi crítica para a

completa separação da pró-insulina ligada da livre.

O controle de qualidade realizado para este RIE mostrou que o ensaio

é específico, preciso e acurado, permitindo a realização de ensaios válidos.

A sensibilidade do RIE desenvolvido é semelhante à da maioria dos

ensaios descritos nos trabalhos publicados, permitindo o diagnóstico de casos de

hiperproinsulinemia, como insulinomas e insuficiência renal crônica.

Entretanto, como a maioria daqueles métodos, nosso ensaio não foi

suficientemente sensível para medir os níveis de pró-insulina em indivíduos normais

sem o emprego de técnicas de concentração. A técnica de extração e concentração

empregando cartuchos de Sep-Pak C-JS e concentrador Savant Speed-Vac mostrou-

se simples, rápida e acurada permitindo o processamento de várias amostras

simultaneamente.

O radioimunoensaio desenvolvido foi aplicado no estudo do diabetes

mellitus Tipo II associado à obesidade. Verificou-se que a obesidade não esteve

relacionada com o aumento na concentração sérica de pró-insulina intacta em pacientes

com diabetes Tipo II. Os níveis de pró-insulina e relação molar PI/1 aumentados nos

pacientes diabéticos obesos ou de peso normal confirmaram a existência de uma

desordem no processo de secreção das células P no diabetes mellitus Tipo II.

Embora o nosso radioimunoensaio não identifique o derivado de

conversão 31,32-des pró-insulina, ele pode ser utilizado no estudo das disfunções das

células p pancreáticas.

DEVELOPMENT AND PADRONIZATION OF RADIOIMMUNOASSAY

TECHNIQUE FOR HUMAN PROINSULIN AND ITS APPLICATION IN THE

STUDY OF TYPE II DIABETES MELLITUS ASSOCIATED TO OBESITY.


ABSTRACT

The availability of immunoassay methodology for proinsulin is important

to define its physiological and pathophysiological significance in humans. Serum

concentrations of proinsulin are elevated in patients with Type II Diabetes Mellitus

(NIDDM) and recently diagnosed Type I, so a raised circulating concentration of proinsulin

may serve as an early indicator of p-cell disfunction. Recently, in NIDDM, the serum

concentrations of proinsulin and its B-chain-C-peptide junctional split form, des (31-

32), were found to correlate with diastolic blood pressure, a risk factor for cardiovascular

disease.

The development of a sensitive and specific radioimmunoassay (RIA)

methodology for proinsulin has been difficult due to its low concentration in serum and

the presence of proinsulin conversion intermediates in fluids and tissues. Also other

potentially cross-reactive peptides, including insulin and C-peptide, can interfere in the

assay.

This work describes a highly specific human proinsulin RIA developed

by using biosynthetic human proinsulin (hPI) as immunogen, standard and tracer.

Proinsulin was radioiodinated by the iodogen method, presenting great

stability after QAE-Sephadex A-25 purification. The efficiency of the purification as well

as the stability of the tracer were analysed with 7% polyacrilamide gel electrophoresis

(PAGE).

The antiserum was raised in a guinea pig with repeated subcutaneous

injections formed from equal volumes of proinsulin (50 ug in saline) and Freund's adjuvant

(complete for the primary immunization and incomplete for subsequent injections) in

multiple sites. Total blood was taken two weeks after the third booster and the antiserum

was evaluated for cross-reactivity with insulin and C-peptide.

As the antiserum was not sufficiently specific for proinsulin it was

adsorbed against insulin and C-peptide conjugated to Sepharose-4B CNBr activated to

improve its specificity. The antiserum purified does not cross-react with insulin and C-

peptide (<0,01%), recognizing the junction between the insulin B-chain and C-peptide

(65,66-split-proinsulin).

The RIA was carried out using a non-equilibrium system that allows

the measurement of proinsulin in 28 h by optimizing the concentrations of reactants,

the conditions for the binding reaction and the procedure for separating bound and free

proinsulin.

Antiserum or normal guinea pig serum for the blanks (50uL) and hPI

standards or serum (200 uL) were incubated at 4°C for 24 h. Afterward, the 125J-hPI

(50uL, aproximately 10.000 counts/min) was added and incubated for another 3 h. This

was followed by addition of normal guinea pig serum, second antibody and PEG and a

further 1 h incubation at 23°C. Precipitates were collected by centrifugation at 3500 G

for 15 min. at4°C.

Regarding the RIA separation technique, the addition of PEG to the

second antibody not only reduces significantly the incubation time but seems to be

critical for the complete separation of bound and free proinsulin as well.

When performed the quality control, this RIA shows specificity, accuracy

and precision, allowing the performance of valid assays.

The sensitivity of the RIA described is extremely close to that reported

in the published methods. Therefore, its sensitivity and its wide working range proved

suitable for the diagnosis of hyperproinsulinaemic states e.g., insulinomas and chronic

renal failure.

Like most of those methods our assay is not sufficiently sensitive to

measure fasting proinsulin levels in healthy individuals without the use of concentration

techniques. The employed extraction and concentration techniques by using Sep-Pak

C-|8 cartridges and Savant Speed-Vac concentrator were simple, fast and accurate.

The RIA developed was applied in the of type II diabetes mellitus

associated to obesity. We found that obesity wasn't associated to the elevation of serum

intact proinsulin concentration in type II diabetic patients. The higher concentration of

serum proinsulin and PI/I ratio, observed in type II diabetic patients, obese or normal

weight, confirmed the existence of a disorder in the p-cell secretory demand in type II

diabetes mellitus.

Althought our RIA doesn't identify the 31,32-des conversion

intermediates, it can be used in the study of islet p-cell dysfunction.

ÍNDICE

1. Introdução 001

2. Materiais

2.1. Materiais e equipamentos 014

2.2. Reagentes biológicos 016

2.3. Produtos químicos 017

2.4. Soluções

2.4.1. Soluções empregadas na obtenção do antissoro

anti-pró-insulina 018

2.4.2. Soluções empregadas na caracterização dos

antissoros anti-pró-insulina 019

2.4.3. Soluções empregadas na purificação dos

antissoros anti-pró-insulina 019

2.4.4. Solução empregada na determinação da concentração

de insulina acoplada a Sepharose 4B-CnBr ativada 020

2.4.5. Soluções empregadas na radioiodação da

pró-insulina 021

2.4.6. Soluções empregadas na purificação da pró-insulina

radioiodada 021

2.4.7. Soluções empregadas na eletroforese em gel de

poliacrilamida (EGPA) 021

2.4.8. Soluções empregadas no radioimunoensaio de

pró-insulina 023

3. Métodos

A- Preparo e controle de qualidade dos reagentes biológicos

específicos do radioimunoensaio

3.1. Obtenção de antissoro policlonal anti-pró-insulina humana

3.1.1. Animais 025

3.1.2. Esquema de imunização 025

3.2. Avaliação dos antissoros anti-pró-insulina humana

3.2.1. Evolução da resposta 027

3.2.2. Determinação do título dos antissoros 027

3.2.3. Determinação da especificidade dos antissoros 027

3.2.4. Purificação dos antissoros 029

3.2.5. Caracterização dos antissoros 030

3.3. Preparo do traçador

3.3.1. Análise qualitativa da pró-insulina não radioiodada 031

3.3.2. Técnica de radioiodação 031

3.3.3. Cálculo da atividade específica do traçador 032

3.3.4. Purificação da pró-insulina radioiodada 032

3.3.5. Análise da imunorreatividade 033

3.3.6. Análise da pureza do traçador 034

3.3.7. Análise da estabilidade do traçador 036

3.4. Preparo do padrão de pró-insulina e da curva dose

resposta do radioimunoensaio 037

B- Determinação das condições ótimas para o radioimunoensaio

3.5. Determinação do tempo de incubação do ensaio 038

3.6. Determinação da técnica de separação ideal do

radioimunoensaio 039

3.7. Determinação da ótima diluição do antissoro e do traçador 040

3.8. Determinação do meio de incubação da curva dose resposta .... 041

3.9. Obtenção de soro isento de pró-insulina 041

3.10. Estudo comparativo dos padrões de pró-insulina 042

3.11. Radioimunoensaio de pró-insulina

3.11.1. Sequência operacional 042

3.11.2. Determinação da concentração de pró-insullina em

amostras de soro humano 043

3.12. Controle de qualidade do radioimunoensaio

3.12.1. Especificidade 045

3.12.2. Exatidão 046

3.12.3. Precisão 046

3.12.4. Sensibilidade 047

3.13. Análise da técnica de extração da pró-insulina do soro

humano 047

3.14. Análise da técnica de concentração do soro 049

3.15. Aplicação clínica do radioimunoensaio

3.15.1. Coleta das amostras de soros normais e com secreção

insulínica alterada 049

3.15.2. Validação do radioimunoensaio 049

3.15.3. Aplicação do radioimunoensaio no estudo do Diabetes

Mellitus Tipo II 050

3.15.4. Análise bioquímica das amostras 051

3.15.4.1. Dosagem da insulina 052

3.15.4.2. Dosagem do peptídeo-C 053

3.15.5. Dosagem da pró-insulina 053

3.15.6. Análise estatística 053

4. Resultados



4.1. Avaliação dos antissoros anti-pró-insulina humana

4.1.1. Evolução da resposta e determinação do título dos

antissoros 055

4.1.2. Purificação dos antissoros 055

4.1.3. Caracterização dos antissoros 056

4.2. Preparo e controle de qualidade do traçador

4.2.1. Análise qualitativa da pró-insulina não radioiodada 058

4.2.2. Técnica de radioiodação e cálculo da atividade

específica do traçador 059

4.2.3. Purificação da pró-insulina radioiodada e análise da

imunorreatividade 061

4.2.4. Análise da pureza do traçador 062

4.2.5. Análise da estabilidade do traçador 063


4.3. Determinação do tempo de incubação do ensaio 066



4.5. Determinação da diluição otimizada do traçador 069

4.6. Determinação do meio de incubação da curva dose resposta .... 069

4.7. Estudo comparativo dos padrões de pró-insulina 070

4.8. Controle de qualidade do radioimunoensaio

4.8.1. Especificidade 072

4.8.2. Exatidão 073

4.8.3. Precisão 073

4.8.4. Sensibilidade 077

4.9. Análise da técnica de extração da pró-insulina do soro

humano 079

4.10. Análise da técnica de concentração do soro 079

4.11. Validação do radioimunoensaio 080

4.12. Aplicação do radioimunoensaio no estudo do Diabetes

Mellitus Tipo II associado à obesidade 084

5. Discussão



5.1. Avaliação dos antissoros anti-pró-insulina humana 090

5.2. Preparo e controle de qualidade do traçador. 093


5.3. Obtenção de soro isento de pró-insulina e análise do

padrão do radioimunoensaio 095



5.5. Controle de qualidade do radioimunoensaio 096

5.6. Análise da técnica de extração e concentração da pró-insulina

do soro 098

5.7. Validação do radioimunoensaio 098

5.7.1. Indivíduos normais 099

5.7.2. Insuficiência renal crônica 100

5.7.3. Insulinoma 101

5.8. Aplicação do radioimunoensaio no estudo do Diabetes Mellitus

Tipo II associado a obesidade 102

6. Conclusões 107

7. Referências bibliográficas : 109

8. Anexo 128

1. INTRODUÇÃO

A pró-insulina foi, inicialmente, descrita por Steiner e cols. em 1967

em tumor de célula p humano (1,2) e em tecido de ilhota de rato (2) como a molécula

precursora da síntese intracelular da insulina, sendo identificada, a seguir, na urina e

na circulação por imunoensaios (3-8).

O isolamento deste precursor em grandes quantidades e a

determinação de sua estrutura primária por Chance e cols. em 1968 (9) revelaram

uma cadeia única polipeptídica de aproximadamente 9100 daltons contendo 86

aminoácidos. Nesta cadeia, uma seqüência de 35 aminoácidos conectava a porção

amino terminal da cadeia A com aquela carboxi terminal da cadeia B da insulina. Estudos

posteriores demonstraram que este peptídeo de conexão, denominado peptídeo-C,

era clivado durante o processo de síntese com perda de dois pares de resíduos básicos

levando à formação de insulina e do próprio peptídeo-C, biologicamente inativo, os

quais eram co-secretados pela célula p pancreática (9-11).

A pró-insulina, por sua vez, é formada nas células p pancreáticas a

partir de um polipeptídeo de aproximadamente 11.500 daltons, a pré-pró-insulina, que

corresponde a uma extensão de 23 aminoácidos na porção amino terminal da cadeia

B da insulina (12). Este pré-segmento é removido no retículo endoplasmático rugoso

por clivagem proteolítica dando origem à molécula da pró-insulina que é então

translocada para o aparelho de Golgi em cujos grânulos, é finalmente, convertida em

insulina e peptídeo-C (13).

Nagamatsu e Grodsky demonstraram que a exposição prévia das

ilhotas do pâncreas à glicose, ativa o mecanismo de conversão da pró-insulina através

de uma clivagem proteolítica na seqüência de aminoácidos Arg 31, Arg 32 e Lys 64,

Arg 65 (14).

Duas endopeptidases ativas catalizam esta clivagem: PC2(Tipo II) e

PC3(Tipo I). A endopeptidase PC2 age preferenciamente na junção entre a cadeia A

da insulina e o peptídeo-C, resultando na formação do intermediário de conversão

Arg65, Gly66-split proinsulina, enquanto a endopeptidase PC3 age preferencialmente

na junção entre a cadeia B da insulina e o peptídeo-C, produzindo Arg32,Glu33-split

proinsulina. A atividade das endopeptidases são reguladas por um gradiente ácido

entre o aparelho de Golgi e os grânulos secretórios e por íons cálcio (15). Após o

estímulo pela glicose ocorre um aumento na biossíntese de pró-insulina com um

aumento coordenado na biossíntese de PC3, indicando ser a PC3 a endopeptidase

chave que regula o processamento da pró-insulina (16).

Subsequentemente, os intermediários de conversão são clivados

novamente pela carboxypeptidase-H onde, a perda de um resíduo dibásico de

aminoácido resulta na formação do intermediário de conversão Lys64,Arg65-des ou

Arg31,Arg32-des pró-insulina (17). Em seguida, há uma nova clivagem com a perda

de dois pares de resíduos básicos levando à formação de insulina e peptídeo-C

(Figura 1).

SPUT32.33PROINSUUN

Carboxypeptidase-H

DES31.32PRCHNSULIN

PC3 (Type-I) Endopeptidase PC2 (Type-lt) Endopeptidase

PROINSUUN

PC2 (Type-ll) Endopeptidase

+ Carboxypeptidase-H

C-PEPTIDE

INSUUN

PC3 (Type-I) Endopeptidase

+ Carboxypeptidase-H

SPLIT 65,66PHOINSUUN

Carboxypeptidase-H

DES 64, 65PROINSUUN

Figura 1- Mecanismos de conversão da pró-insulina humana nas células (3 pancreáticas.Fonte: Diabetes 43:511-517,1994.

3

Estudos "in vitro e "in vivo" revelaram que ocorre clivagem

preferencialmente na ligação Arg32,Glu33 da pró-insulina proporcionando uma relação

de aproximadamente 3:1 entre a Arg31 ,Arg32-des pró-insulina e a Lys64,Arg65-des

pró-insulina (18).

Aproximadamente 2,5% da pró-insulina escapa do processo de

clivagem e portanto, uma quantidade relativamente pequena deste precursor hormonal

pode ser detectada nos grânulos maduros e na circulação sanguínea (19).

Estudos realizados administrando-se pró-insulina por via subcutânea

indicaram que houve formação de aproximadamente 10% de intermediários de

conversão (64,65-des e 31,32-des pró-insulina) que apresentaram atividade biológica,

a pró-insulina, no entanto, não foi processada no compartimento vascular (18).

A potência hipoglicêmica da pró-insulina foi avaliada em vários estudos

(20-22) que foram revistos por Galloway e cols., que observaram que a potência

metabólica da pró-insulina humana foi de aproximadamente 15%-25% em relação à

da insulina (23).

O processo de "clearance" da pró-insulina e de seus intermediários de

conversão, estudado por Tillil e cols. (21) empregando cachorros, revelou que este

processo foi de 19%, 22% e 37% para pró-insulina, 31,32-des e 64,65-des pró-insulina,

respectivamente, em relação à insulina. Estudos em humanos demonstraram que o

"clearance" correspondeu a 20%-30% em relação ao da insulina (24), implicando

portanto, na meia vida maior da pró-insulina e seus intermediários de conversão

comparados à molécula de insulina.

Este processo ocorre preferencialmente nos rins (25) e estudos

realizados por Zilker e cols. (26) indicaram que 61% ocorreram por via renal e 39% por

processo extrarenal. O processo extrarenal ocorre predominantemente no fígado que

é, também, o maior responsável pelo "clearance" da insulina (27).

Em estados de resistência à insulina, o "clearance" pode estar

diminuído, dificultando a determinação das causas responsáveis pela alteração na

concentração de insulina periférica, se devidas a mudanças na secreção, no "clearance"

ou em ambos (28,29). Portanto, a análise dos níveis periféricos de insulina não podem

4

ser adotados para refletir alterações na secreção de insulina pelas células |3 pancreáticas

(30).

O peptídeo-C por outro lado, fornece informações a respeito das

mudanças na secreção de insulina, mas se trata de um hormônio biologicamente inativo.

Por causa de sua meia vida relativamente longa e de sua distribuição em

compartimentos periféricos, sua concentração pode subestimar a secreção de insulina

em situações onde sua concentração aumentar rapidamente e superestimar sua

secreção quando ocorrer uma diminuição rápida (31).

Portanto, a disponibilidade de uma metodologia para medir a

concentração de pró-insulina sérica era importante para definir seu significado fisiológico

e fisiopatológico em humanos. Porém, a baixa concentração da pró-insulina circulante

aliada ao fato de conter as estruturas da insulina e do peptídeo-C com os quais está

antigenicamente relacionada, dificultou a determinação exata da pró-insulinemia. Esta

determinação esteve ainda sujeita a outras incertezas devido à presença de diferentes

formas moleculares da pró-insulina que representam os intermediários de sua

conversão.

Os métodos inicialmente desenvolvidos para estimar a pró-insulinemia

humana se baseavam numa abordagem indireta. Eles separavam a pró-insulina da

insulina através de técnicas cromatográficas adequadas e mediam sua

imunorreatividade em radioimunoensaio de insulina, empregando padrões de insulina

ou de pró-insulina de origem animal ou mesmo humana.

Dessa forma, os primeiros relatos da literatura empregando técnicas

de filtração em gel e radioimunoensaios de insulina se referem à pró-insulina circulante

como sendo cerca de 20% da insulina total imunorreativa em indivíduos normais (32,33),

elevando-se para até 50% duas horas após a administração de glicose (4).

Posteriormente, esta estimativa foi reduzida para 15% no trabalho de revisão realizado

por Rubenstein e cols. (34), empregando um padrão de pró-insulina.

Outro tipo introduzido de separação entre a pró-insulina e a insulina foi

o da degradação pelo emprego de uma protease específica, sendo a pró-insulina

determinada em radioimunoensaio de insulina (35). Entretanto, demonstrou-se que a

degradação da insulina era parcial e que a insulina não degradada contribuía para a

superestimativa da pró-insulina (36).

Apesar desses métodos serem muito trabalhosos e inadequados para

a análise de um grande número de amostras, eles foram amplamente utilizados na

década de 70.

Determinou-se, nesses trabalhos, que a relação molar entre a pró-

insulina e a insulina (PI/1) permaneceu inalterada em indivíduos normais, obesos, na

tolerância à glicose prejudicada, na gravidez e no diabetes gestacional.

Em contraste, foi encontrada uma percentagem aumentada de pró-

insulina no diabetes tipo II (diabetes não-insulino-dependente) (17,36,37), na

hiperglicemia associada com hipoinsulinemia (38), na obesidade associada a

intolerância a carboidratos (39) e em insuficiência renal crônica (40,41). Provavelmente

no último exemplo, a alta proporção de pró-insulina em relação à insulina seja devida

ao papel crítico dos rins como órgão principal envolvido em sua depuração (25).

A maioria dos pacientes com insulinoma avaliados por técnicas similares,

também exibiu níveis de pró-insulina marcadamente elevados (8,32,33,35,42-44)

mesmo quando a insulinemia se manteve normal ou até diminuída, condições em que

a medida da pró-insulina tem valor diagnóstico (45).

Valores de pró-insulinemia igualmente aumentados foram descritos

na hiperpró-insulinemia familiar (46-48) que é uma condição herdada de modo

autossômico dominante. Essa condição é caracterizada pela síntese da molécula de

pró-insulina estruturalmente anormal que não é convertida à insulina.

Outra técnica desenvolvida e empregada durante a década de 70 para

a determinação da pró-insulina foi o radioimunoensaio indireto em duas etapas

desenvolvido por Heding (49) a partir de 1976 que envolvia, inicialmente, a ligação da

insulina e da pró-insulina a anticorpos anti-insulínicos imobilizados em uma fase

sólida seguida de remoção do peptídeo-C livre. Numa segunda etapa, a pró-insulina

era quantificada pelo emprego de anticorpos anti-peptídeo-C.

Apesar dessa técnica ser demorada e muito trabalhosa, ela foi

empregada por Heding (49,50) para a determinação da pró-insulinemia em indivíduos

6

normais e diabéticos Tipo I que apresentaram níveis de pró-insulina mais elevados do

que os indivíduos normais.

Uma técnica similar foi desenvolvida por Ward e cols. (51) que extraíram

a pró-insulina do plasma com antissoro anti-peptídeo-C humano e PEG.

Subsequentemente, a pró-insulina foi separada do imuno-precipitado e ensaiada no

radioimunoensaio de insulina, usando padrão de pró-insulina.

Essas técnicas, porém, mostraram-se inadequadas já que foi

demonstrado que qualquer contaminação do imunoprecipitado com peptídeo-C livre

resultaria em valores erroneamente elevados de pró-insulina.

Embora esses estudos tivessem proporcionado achados importantes,

os métodos foram incapazes de separar a pró-insulina de seus intermediários de

conversão. Além disso, o uso de padrões inadequados como a insulina e extratos não

homogêneos de pró-insulina lançaram dúvidas sobre as conclusões obtidas até então

(52).

Entretanto, somente a partir de 1981 com a produção de pró-insulina

humana, empregando tecnologia de DNA recombinante (53), é que sistemas de

radioimunoensaio homólogos deste pró-hormônio puderam ser desenvolvidos (54-59),

pois até então, a quantidade de pró-insulina humana altamente purificada disponível

era insuficiente para se obter e caracterizar anticorpos sensíveis e específicos.

Da mesma forma, o padrão de pró-insulina humana original, preparado

em 1970 na Universidade de Chicago (60) já havia sido substituído em 1984 por três

outras preparações equipotentes, sendo uma delas pró-insulina DNA recombinante

(61). Em 1986 foi estabelecido, pela Organização Mundial de Saúde, o primeiro

Reagente Internacional de Referência para pró-insulina humana, empregando também

a pró-insulina biossintética (62).

Cohen e cols. (54), em 1985, foram os primeiros a utilizar pró-insulina

humana biossintética empregando um radioimunoensaio direto. A técnica de

cromatografia de afinidade foi usada para extrair a pró-insulina e seus intermediários

de conversão e obtiveram um anticorpo específico contra a junção entre a cadeia B da

insulina e o peptideo-C que fora purificado para não reconhecer insulina ou

7

peptídeo C. Este método determinou, portanto, a pró-insulina intacta e seu intermediário

de conversão 65,66-split pró-insulina.

Por meio desta metodologia pôde-se observar que, 60 min após a

administração oral de glicose, houve um aumento de, aproximadamente, três vezes

no nível de pró-insulina do plasma de indivíduos normais.

Deacon e Conlon (55) tentaram simplificar o procedimento empregando

um anticorpo específico contra a junção entre a cadeia B da insulina e o peptídeo-C, e

que não apresentou reação cruzada com a insulina ou com o peptídeo C. Este método

determinou a pró-insulina intacta e seu intermediário de conversão 65,66-des pró-

insulina. Como o ensaio não foi suficientemente sensível para medir a pró-insulina em

indivíduos normais, 1 mL de soro foi extraído com etanol e a pró-insulina foi concentrada

em sistema Savant Speed Vac.

Embora os resultados também indicassem um aumento nos níveis de

pró-insulina após o estímulo pancreático, os valores observados foram

consideravelmente maiores do que os descritos por Cohen e cols. (54).

Em 1986, Cohen e cols. desenvolveram um outro radioimunoensaio

empregando anticorpos específicos contra a junção entre a cadeia B da insulina e o

peptídeo-C e a cadeia A da insulina e o peptídeo-C que foram purificados para não

reconhecer o peptídeo-C. Devido à sensibilidade do método ser insuficiente para a

dosagem de pró-insulina em indivíduos normais, empregou-se cromatografia de

afinidade para extrair a pró-insulina do soro.

Esse método foi utilizado na dosagem de pacientes com insulinoma e

no estudo de hiperproinsulinemia familiar. Quando se empregou anticorpos contra

ambas as junções A-Peptídeo C e B-peptídeo C em um ensaio simultâneo, observou-

se que o intermediário de conversão encontrado predominantemente no soro humano

foi o 32,33-split pró-insulina.

Recentemente, este radioimunoensaio foi empregado, também, por

Oohashi e cols. (63) para o estudo de um caso de hiperproinsulinemia familiar.

Hampton e cols. também obtiveram um antissoro específico que não

reconheceu a insulina ou o peptídeo-C após purificação, porém, este não foi

8

caracterizado quanto à reação cruzada com os intermediários de conversão (57). Os

resultados obtidos no estudo em jejum de indivíduos normais, diabéticos Tipo II e

insulinoma indicaram que, embora o ensaio não fosse suficientemente sensível para

dosar a pró-insulina em normais, houve um aumento na relação molar pró-insulina/

insulina nos grupos estudados em relação aos indivíduos normais.

Yoshioka e cols. desenvolveram um radioimunoensaio específico

empregando um anticorpo contra a junção entre a cadeia B da insulina e o peptídeo-C

que reconheceu tanto o intermediário de conversão 65,66-split quanto o 64,65-des

pró-insulina na mesma proporção (58). Estudando os níveis de pró-insulina do soro

após o teste de estímulo pancreático seus resultados também indicaram um aumento

nos níveis de pró-insulina após a administração de glicose em indivíduos normais,

assim como uma elevação desproporcional de pró-insulina em relação à insulina em

diabéticos Tipo II, tanto em jejum quanto após o estímulo, quando comparados com

não diabéticos.

A proporção de moléculas de pró-insulina ou intermediários de

conversão encontrada nesses estudos em pacientes com diabetes Tipo II foi,

geralmente, da ordem de 20 a 30% em relação à insulina. Entretanto, o emprego de

diferentes populações de pacientes e diferentes metodologias empregadas dificultou

a comparação entre eles.

Bowsher e cols. (59) obtiveram um radioimunoensaio específico

empregando dois anticorpos específicos; um contra a junção entre a cadeia A da

insulina e o Peptídeo-C e outro, contra a junção entre a cadeia B da insulina e o

Peptídeo-C, e estudaram a pró-insulina em indivíduos normais e após estímulo

pancreático. Os resultados também indicaram um aumento nos níveis de pró-insulina

após o estímulo pancreático, e baseados na diferente especificidade dos anticorpos,

concluíram que o intermediário de conversão 32,33-split pró-insulina compreendeu

uma porção significante da pró-insulina circulante após o estímulo com glicose.

Esse radioimunoensaio foi utilizado por Ipp e cols. (64) que observaram

um aumento nos níveis de pró-insulina em pacientes com insulinoma.

Haffner e cols. (65) empregando, também, este radioimunoensaio para

9

medir a pró-insulina e um outro radioimunoensaio específico para insulina, empregando

anticorpo anti-insulina que não reconhece a pró-insulina, observaram que a pró-insulina

estava fortemente relacionada com o aumento de triglicérides no soro e aumento da

pressão arterial em indivíduos não diabéticos, sugerindo que a pró-insulina pode ser

empregada como um indicador de descompensação metabólica em indivíduos pré-

diabéticos.

. Esse mesmo grupo estudou a síndrome de resistência à insulina que

é caracterizada por níveis de HDL colesterol baixos, níveis de triglicérides elevados,

hipertensão e tolerância à glicose prejudicada. Os indivíduos não diabéticos com a

síndrome de resistência à insulina não somente apresentaram hiperinsulinemia como

marcador de resistência à insulina, mas também, apresentaram um aumento na

concentração de pró-insulina em relação à insulina, o quê pode refletir uma falência

relativa ou o mal funcionamento das células p (66). Os autores sugerem que a pró-

insulina pode ser não somente um marcador de falência das células na etiologia do

diabetes Tipo II, mas também, pode estar associada com o aumento de risco

cardiovascular em indivíduos diabéticos ou não.

As bases do radioimunoensaio foram enunciadas por Berson e Yalow

a partir de 1957 (67) e culminaram com o desenvolvimento de um RIE para a

determinação de insulina no plasma humano em 1959 (68).

O princípio do radioimunoensaio baseia-se na competição entre

determinado antígeno marcado isotopicamente (traçador) e o mesmo antígeno não

marcado (padrão ou desconhecido) pelos sítios de ligação de seus anticorpos

específicos, formando um complexo antígeno-anticorpo.

Como nesse sistema as concentrações de traçador e de antígeno são

mantidas constantes, constroem-se curvas de calibração adicionado-se, ao sistema,

concentrações variáveis e conhecidas de antígeno padrão. Conseqüentemente, a

proporção de complexo radioativo formado (antígeno marcado-anticorpo) é

inversamente proporcional à concentração de antígeno não marcado.

Dessa forma, a concentração de um antígeno específico é

determinada, em amostras de extratos ou fluídos biológicos (soro, plasma, urina, etc),

10

pela leitura direta na curva de calibração obtida pela incubação simultânea das

amostras e dos padrões com o traçador e o anticorpo específico. Compara-se, portanto,

o efeito inibitório do antígeno presente na amostra ensaiada na ligação do traçador ao

anticorpo específico com o mesmo efeito inibitório dos padrões conhecidos.

Os elementos essenciais para a realização de um radioimunoensaio

consistem, portanto, no preparo do traçador e das soluções padrão, na obtenção do

antissoro específico e na escolha de técnicas adequadas para, após o término da

reação, separar as frações livre e ligada ao anticorpo.

A separação é seguida pela determinação da radioatividade de uma

ou de ambas as frações em contador de cintilação adequado. A partir das contagens

obtidas, constrói-se graficamente a curva dose-resposta onde os valores da

concentração das amostras ensaiadas são lidos pela comparação de sua radioatividade

com a dos padrões de concentração conhecida (69,70).

A importância deste método reside, de um lado, em permitir a dosagem

de pequenas concentrações de determinadas substâncias, da ordem de até nano e

picogramas, na presença de elevadas concentrações de outras, como ocorre na corrente

sanguínea. Por outro lado, a determinação qualitativa das substâncias é altamente

específica, decorrente do caráter imunológico da reação.

Portanto, as características principais do radioimunoensaio, sua

sensibilidade, especificidade e precisão elevadas, aliadas à sua praticabilidade para

ensaiar convenientemente grande número de amostras biológicas, permitiram seu

rápido desenvolvimento e seu amplo emprego nos últimos 30 anos.

Apesar da grande contribuição desse avanço tecnológico, a medida

da pró-insulinemia continuou complexa, pois, devido à possível reação cruzada do

antissoro com os intermediários de conversão, amostras que contenham uma mistura

de moléculas íntegras e intermediárias fornecerão resultados diferentes, dependendo

do antissoro empregado. Além disso, principalmente em condições normais, quando

os níveis da pró-insulina endógena, freqüentemente, se encontram abaixo do limite de

detectabilidade dos ensaios, há necessidade de se extrair a pró-insulina do soro e

concentrar as amostras antes de suas dosagens.

11

Com a evolução dos imunoensaios, outros métodos baseados nos

princípios do radioimunoensaio (RIE) foram desenvolvidos visando a aumentar sua

sensibilidade, tais como os ensaios imunorradiométricos (IRMA), imunoenzimáticos

(EIA) e imunoquimiométrico (ICMA).

Hartling e cols. (71) em 1986, desenvolveram um ensaio

imunoenzimatico empregando anticorpos anti-insulina e anti-peptídeo-C que detectou

tanto a pró-insulina quanto os intermediários de conversão 31,32-des e 64,65-des pró-

insulina. O estudo de pacientes com insulinoma mostrou que, nestes casos, ocorre um

aumento de pró-insulina em relação aos indivíduos normais e revelou a estabilidade

da pró-insulina em amostras de soro estocadas a -20°C por período de 1 ano.

Em 1989 Sobey e cols. (72) descreveram um método

imunorradiométrico mais sensível empregando anticorpos monoclonais altamente

específicos contra a pró-insulina intacta e seus intermediários de conversão,

65,66-split e 32,33-split.

Estudando indivíduos normais e com diabetes Tipo II, obesos e não

obesos, observaram que, no diabetes, aproximadamente 50% de todas as moléculas

relacionadas com a insulina foram constituídas por pró-insulina intacta e 32,33-split

pró-insulina e que a relação entre elas foi de 1 para 3. Quanto aos indivíduos normais,

esta proporção foi de aproximadamente 25%, mesmo para os indivíduos obesos (73).

Esta metodologia foi empregada por Temple e cols. (74) que

observaram que a pró-insulina intacta e o intermediário de conversão 32,33-split reage

cruzadamente em relação molar de 1 para 1 com a insulina em radioimunoensaios

comerciais que empregam anticorpos policlonais.

Portanto, se a pró-insulina e seus intermediários de conversão forem

interpretados como sendo insulina no radioimunoensaio convencional de insulina, a

atividade biológica menor destes pró-hormônios poderia mascarar o verdadeiro

significado da insulina encontrada no diabetes Tipo II.

Nagi e cols. (75), utilizando este mesmo IRMA verificaram que, em

pacientes diabéticos Tipo II, a pró-insulina e a 32,33-split pró-insulina compreendeu

aproximadamente 60% de todas as moléculas relacionadas à insulina e que, nesses

12

pacientes, estas moléculas estavam relacionadas com fatores de risco cardiovascular

associado com hipertensão, triglicérides aumentados e níveis de HDL colesterol

diminuídos.

Recentemente, Ostrega e cols. (76) validaram o IRMA desenvolvido

por Sobey e cols. através de comparação empregando cromatografia líquida de alta

resolução (HPLC). Eles concluíram que a maioria dos derivados de conversão da pró-

insulina idenficados como 32,33-split pró-insulina tratava-se, na verdade, de 31,32-

des pró-insulina e que esta forma foi encontrada predominantemente no soro de

indivíduos normais ou pacientes com diabetes Tipo II.

Reaven e cols. (77) utilizando o ensaio imunoenzimático que detecta a

pró-insulina intacta e seus intermediários de conversão 31,32-des e 64,65-des pró-

insulina, observaram que a resposta das células P em pacientes com diabetes Tipo II

era anormal, sendo que as causas deste defeito ainda não foram esclarecidas.

Amostras de soro analisadas em HPLC mostraram que a pró-insulina

intacta compreende aproximadamente 40% do total de moléculas relacionadas a pró-

insulina e a forma derivada 31,32-des compreende aproximadamente 50-60% da pró-

insulina total, tanto para indivíduos normais quanto para diabéticos Tipo II (77,78).

Uma nova metodologia para a dosagem de pró-insulina é o ensaio

imunoquimiométrico (ICMA) que foi desenvolvido por Kao e cols. (79) que reconhece a

pró-insulina intacta mas que não diferencia seus intermediários de conversão.

O método foi aplicado na determinação de pró-insulina em pacientes

com insuficiência renal crônica e no diagnóstico de insulinoma. Observou-se que 70%

dos pacientes com insuficiência renal apresentavam valores de pró-insulina acima do

normal e que a pró-insulina não somente é útil para o diagnóstico de insulinoma, mas

que este diagnóstico pode ser mais acurado do que o obtido com a análise da insulina

e do peptídeo-C.

Pode-se concluir, pelo que foi exposto, que existem vários aspectos

que ainda não foram esclarecidos no estudo do diabetes e que, cada vez mais, a pró-

insulina e seus intermediários de conversão se definem como um marcador da disfunção

da célula p assim como estão relacionados a fatores de risco cardiovascular em

13

população não diabética.

Visto que não existem conjuntos diagnósticos disponíveis no mercado,

o presente trabalho tem por objetivo o desenvolvimento e a padronização de um

radioimunoensaio específico para a determinação da pró-insulinemia humana. A

determinação da pró-insulinemia em indivíduos normais e com níveis elevados de pró-

insulina (insulinomas e insuficientes renais crônicos) permitirá a validação do

radioimunoensaio e este será aplicado no estudo de indivíduos com diabetes tipo II

associado à obesidade.

14

2. MATERIAIS

2.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS

- Agitador magnético com placa aquecedora, modelo 258, marca Fanem, São

Paulo.

- Agitador mecânico do tipo "vortex", modelo 251, marca Fanem, São Paulo.

- Balança analítica, modelo H2OT, com precisão de 0,01 mg, marca Mettler,

Zurique, Suiça.

- Balança semi-analítica, modelo P1000N, com precisão de 0,1 g, marca Mettler,

Zurique, Suíça.

- Bomba peristáltica, modelo 59-4698-01-AB, marca Pharmacia, Uppsala, Suécia.

- Bomba de vácuo, Millipore, modelo XX-6000000, E.U.A.

-Cartuchos de octadecil-silica, Sep-Pak C-|8, Waters Chromatography, marca

Millipore, Massachusetts, E.U.A.

- Centrífuga refrigerada automática, modelo Spin VI, marca Incibrás, São Paulo.

- Centrífuga refrigerada automática, modelo Super Speed RC-2B, marca Sorvall,

Conecticut, E.U.A.

- Centrífuga evaporadora Speed-Vac SS4, marca Savant, E.U.A.

- Coletor de frações automático, modelo Frac-200, marca Pharmacia, Uppsala,

Suécia.

- Coluna cromatográfica de vidro de 1,0 x 30,0 cm, marca Pharmacia, Uppsala,

Suécia.

- Concentrador Speed-Vac SS4, marca Savant Instruments, Farmingdale, N.Y.,

15

Federal da Alemanha.

- Filtro com poros de 0,25 um de diâmetro, marca Millipore, Massachusetts,

E.U.A.

- Membrana adesiva "Parafilm", marca American National Can, Greenwich,

Inglaterra.

- Freezer de baixa temperatura (-20°C), marca Prosdócimo, São Paulo.

- Freezer de baixa temperatura (-40°C), marca Metalfrio, São Paulo.

- Fonte de alta tensão, modelo GPS 200/400, marca Pharmacia Uppsala, Suécia.

- Impressora, modelo LaserJet III, marca Hewlett Packard, Minneapolis, E.U.A.

- Lâmpada fluorescente de 15 W, marca Philips, São Paulo.

- Microcomputador, modelo AT-386, marca Samsung, Minneapolis, E.U.A.

- Micropipetas de 10, 20, 25 uL, marca Dade, Flórida, E.U.A.

- Peagômetro, modelo B 374, marca Micronal, São Paulo.

- Pipetas automáticas reguláveis de vários volumes, marca Eppendorf,

Hamburgo, Alemanha.

- Pipetas tipo Pasteur, construídas nas oficinas do IPEN-CNEN/SP, São Paulo,

Brasil.

- Pipetas sorológicas e volumétricas de vários volumes, marca Pyrex, São Paulo,

- Provetas de vários volumes, marca Pyrex, São Paulo.

- Refrigeradores, marcas Prosdócimo, Consul e Metalfrio, São Paulo.

- Repipetador automático, marca Eppendorf, Hamburgo, Alemanha.

- Seringas descartáveis de 10 mL, marca Ibras-CBO, São Paulo.

- Seringas de 10 uL, marca Hamilton, Reno, E.U.A.

- Suporte para filtros, marca Millipore, Massachussets, E.U.A.

- Tubos cilíndricos de vidro de 5 x 110 cm, construídos nas oficinas do IPEN-

16

2.2. REAGENTES BIOLÓGICOS

- Adjuvante completo de Freund, Difco Laboratories, Detroit, E.U.A.

- Adjuvante incompleto de Freund preparado em nossos laboratórios

- Albumina bovina (AB) fração V Ria Grade em pó, Sigma Chemical Company

(n2 A-7888), St. Louis, E.U.A.

- Gama globulina bovina, Sigma Chemical Company, St. Louis, E.U.A.

- Antissoro monoclonal anti-insulina humana, Linco Research Inc, St. Louis,

E.U.A. (Lot SP 21-4).

- Segundo anticorpo produzido em cabras, anti-gama globulina de cobaia, por

Pel-Freez System Laboratories (Lote n2 12890-3CC).

- Pró-insulina humana biossintética (padrão primário de Referência

Internacional) fornecido pelo "National Institute for Biological Standards and

Control-NIBSC", Reino Unido (código 84/611).

- Pró-insulina (Lote n* 509-EM4), insulina (Lote n* 615-7U7-208) e peptídeo-C

(Lote n° A18-TU8-44D) humano biossintético obtidos por doação da Elli Lilly

Laboratories, E.U.A.

- Derivados de conversão da pró-insulina: split (32,33), split (65,66), des (31,32)

e des (64,65) obtidos por doação da Elli Lilly Laboratories, E.U.A.

- Insulina porcina tipo III (lote n9 MLS3.142) obtida por doação da Biobrás

Bioquímica do Brasil, Montes Claros, MG, Brasil.

- Insulina porcina padrão do conjunto diagnóstico (RIE) fornecido pela CIS Bio

International, France.

- Conjunto diagnóstico (RIE) para dosagem de Peptídeo-C, fornecido pela DPC

(Diagnostic Products Corporation), E.U.A.

17

2.3. PRODUTOS QUÍMICOS

- Acetonitrila, p.a, Merck, São Paulo.

- Ácido bórico, Merck, São Paulo

- Ácido tricloroacético, Merck, São Paulo.

- Ácido acético glacial, Merck, São Paulo.

- Ácido clorídrico, p.a., Merck, São Paulo.

- Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), p.a. Cario Erba, São Paulo.

- Ácido trifluoroacético, p.a., Merck, São Paulo.

- Acrilamida 97%, Bio Rad, California, E.U.A.

- Arlacel A

- Azul de bromofenol, Merck, São Paulo.

- Brometo de cianogênio, Sigma, E.U.A.

- Carvão ativado p.a., artigo 2186, Merck, São Paulo

- Carbonato de sódio p.a., Merck, São Paulo

- Citrato de sódio p.a., Merck, São Paulo

- Cloreto de sódio, p.a., Merck, São Paulo.

- Coomassie brilliant blue R-250, Sigma, E.U.A.

- Etanol, p.a., Merck, São Paulo

- Fosfato de sódio monobásico e dibásico, p.a., Merck, São Paulo.

- Folin-Ciocalteau, Merck, São Paulo.

- Glicina , p.a., Merck, São Paulo.

- Glicose, p.a., Merck, São Paulo.

- Hidróxido de sódio, p.a., Cario Erba, São Paulo.

- lodogen, p.a., Sigma, E.U.A.

18

- N.N.N'.N'-tetrametilenodiamina (TEMED), p.a., Bio Rad, California, E.U.A.

- Óleo mineral Nujol, Schering Plough, Rio de Janeiro.

- Polietilenoglicol 8000, Sigma, E.U.A.

- Riboflavina, Roche, São Paulo.

- Sepharose 4B, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia.

- Sacarose em cristais, p.a., Merck, São Paulo.

- Sulfato de cobre p.a., Merck, São Paulo

- Tetraborato de sódio, Reagen, São Paulo

- Thimerosal, Sigma Chemicals Company, St. Louis, E.U.A.

- Tris-hidroximetil-aminometano (TRIS), p.a., Merck, São Paulo.

2.4. SOLUÇÕES

2.4.1. SOLUÇÕES EMPREGADAS NA OBTENÇÃO DO ANTICORPO

ANTI-PRÓ-INSUUNA.

- Solução fisiológica:

Cloreto de sódio 9 g

Água destilada q.s.p 1 L

- Adjuvante incompleto de Freund

Óleo mineral 9 partes

Arlacel A 1 parte

A solução foi autoclavada e congelada até o seu uso.

19

2.4.2. SOLUÇÕES EMPREGADAS NA CARACTERIZAÇÃO DOS

ANTISSOROS ANTI- PRÓ-INSUUNA:

- Fosfo-salina (fosfato de sódio 0,01 M, pH 7,6, NaCI 0,15M e thimerosal

0,01%):

Fosfato de sódio monobásico . H20 0,18 g

Fosfato de sódio dibásico . 2 H20 1,55 g

Cloreto de sódio 8,5 g

Thimerosal 0,1 g


- Fosfo-salina-EDTA 0,01 M

EDTA0.1M 10 mL

Fosfo-salina q.s.p 100 mL

2.4.3. SOLUÇÕES EMPREGADAS NA PURIFICAÇÃO DOS

ANTISSOROS ANTI-PRÓ-INSULINA.

- Hidróxido de sódio 2 M

Hidróxido de sódio 8 g

Água destilada q.s.p 100 mL

- Tampão borato de sódio 0,1 M; NaCI 0,5M pH 8,1

Tetraborato de sódio . 10 H20 2,89 g

Ácido bórico. 4,39 g



20

- Tampão borato de sódio 0,1 M; NaCI 0,5 M; Glicina 0,2M pH8,0

Tetraborato de sódio . 10 H20 2,89 g

Ácido bórico 4,39 g


Glicina 15,0 g


- Tampão Acetato de sódio 0,1 M; NaCI 0,5 M pH 4,0

Acetato de sódio 1,23 g

Ácido acético glacial 2,37 mL



2.4.4. SOLUÇÃO EMPREGADA NA DETERMINAÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO DE INSULINA ACOPLADA À SEPHAROSE

4B-CnBr ATIVADA.

Solução A:

Carbonato de sódio 10 g

Hidróxido de sódio 0,5M 100 mL

Solução B:

Sulfato de cobre . 5H20 2,5 g

Citrato de sódio 5% 100 mL

As soluções A e B foram misturadas no momento do uso na proporção

de 50/1 (v/v).

21

2.4.5. SOLUÇÕES EMPREGADAS NA RADIOIODAÇÃO DA

PRÓ-INSULINA

- Tampão fosfato de sódio 0,05M, pH 7,4:




2.4.6. SOLUÇÃO EMPREGADA NA PURIFICAÇÃO DA PRÓ-

INSULINA RADIOIODADA (cromatografia em QAE-Sephadex

A'25).

- Tampão Tris-HCI 0.08M; 0,08M NaCI pH 8,6, contendo 1% de AB.

Tris 9,67 g



- Tampão Tris-HCI 0.08M; 0,3M NaCI pH 8,6, contendo 1% de AB.

Tris 9,67 g



2.4.7. SOLUÇÕES EMPREGADAS NA ELETROFORESE EM GEL

DE POUACRILAMIDA:

- Ácido clorídricol N:

Ácido clorídrico p.a 9 mL


22

•SoluçãoA, pH8,9:

TRIS ...36,60 g

TEMED 0,23 mL

Ácido clorídrico 1 N 48 mL


Solução C:

Acrilamida 28 g

Bis-acrilamida 0,74 g


Solução E:

Riboflavina 4 g


Solução F:

Sacarose 20 g


Solução para polimerização (poliacrilamida a 7 %):

Solução A 1 mL

Solução C 2 mL

Solução E 1 mL

Água destilada 4 mL

• Tampão TRIS-glicina 0,4 M, pH 8,3:

TRIS 6g

Glicina 28,8 g


Diluído 10 vezes em água destilada imediatamente antes do uso.

23

- Solução de azul de bromofenol:

Azul de bromofenol 0,1 mg


-TCAa12 ,5%:

Ácido tricloroacético 12,5 g


- Solução de "coomassie blue" a 0,2%:

"Coomassie blue" 0,20 g

Etanol p.a 45 mL

Ácido acético glacial 10 mL


- Solução de "coomassie brilliant blue R-250" a 0,05%:

Solução de "coomassie blue" a 0,2% 10 mL

Ácido acético a 7% 30 mL

- Solução descorante (ácido acético a 7 %):

Ácido acético glacial 7 mL


2.4.8. SOLUÇÕES EMPREGADAS NO RADIOIMUNOENSAIO DA

PRÓ-INSULINA:

- Tampão fosfato de sódio 0,04 M, pH 7,4 (Tampão de ensaio)



Thimerosal 0,20 g


24

- Tampão fosfato de sódio 0,025 M , EDTA 0,02 M pH 7,5 (Tampão de

separação)


Fosfato de sódio dibásico . 7 H2O.... 5,63 g

EDTA 7,44 g

Thimerosal 0,20 g


25

3. MÉTODOS

A- PREPARO E CONTROLE DE QUALIDADE DOS REAGENTES

BIOLÓGICOS ESPECÍFICOS DO RADIOIMUNOENSAIO.

3.1- OBTENÇÃO DE ANTISSORO POLICLONAL ANTI-PRÓ-iNSULINA

HUMANA

3.1.1. ANIMAIS

O antissoro policlonal específico para uso no radioimunoensaio foi

obtido empregando-se a técnica de imunização descrita por Vaitukaitis e cols. (80).

Cobaias machos albinas (220 g) foram injetadas subcutaneamente em sítios múltiplos

da região dorsal com 2 ml de uma emulsão formada por volumes iguais de solução

fisiológica contendo pró-insulina e de adjuvante de Freund. Utilizou-se adjuvante de

Freund completo na primeira imunização, e incompleto nas injeções de reforço.

3.1.2. ESQUEMA DE IMUNIZAÇÃO

Empregaram-se dois esquemas de imunização. No primeiro esquema,

cinco animais foram imunizados com 50 ug de pró-insulina e no segundo esquema, 10

animais foram imunizados com uma dose cinco vezes maior (250 ug) do imunógeno.

Essas mesmas doses foram repetidas nas injeções de reforço (Figura 2).

Como no primeiro esquema de imunização, após a injeção primária,

uma das cinco cobaias veio à óbito, passou a ser oferecida água contendo 5% de

glicose às demais. Mesmo com este procedimento, não se pôde evitar no segundo

esquema de imunização a morte de cinco animais, uma hora após a injeção primária.

Portanto, foi necessária a aplicação por via intraperitoneal de 3 ml de glicose 50% aos

animais remanescentes, para evitar uma mortalidade maior.

26

Primeiro esquema

(50 ug pró-insulina)

Segundo esquema

(250 ug pró-insulina)

Imunização primária

4 semanas

Injeção de reforço

3 semanas

2- Injeção de reforço

3 semanas

3§ a 6ã Injeções de reforço

com intervalos de 3 semanas

3 semanas

Sangria Total

Imunização primária

6 semanas

5 Injeção de reforço

3 semanas

2- Injeção de reforço

9 semanas

3ê Injeção de reforço

3 semanas

Sangria Total

Figura 2- Esquemas de imunização empregados na obtençãodos antissoros anti-pró-insulina.

Decorridas três e cinco semanas, respectivamente, após as injeções

primárias do primeiro e segundo esquemas de imunização, foram colhidas amostras

de sangue, por meio de punção cardíaca, para a análise do título de seus antissoros.

Duas semanas após as injeções de reforço, foram colhidos 2 ml de sangue de todos

os animais, pela mesma via e com a mesma finalidade.

Três semanas após a última injeção de reforço, o sangue total

(aproximadamente 25 ml) foi colhido desses animais e os antissoros foram avaliados.

27

3.2. AVALIAÇÃO DOS ANTISSOROS ANT1-PRÓ-INSULINA HUMANA

3.2.1. EVOLUÇÃO DA RESPOSTA

A evolução da resposta dos antissoros ao longo do tempo de

imunização foi avaliada, incubando-se cada antissoro (100 uL na diluição de 1:100)

com o traçador 125 l-hPI (100 uL contendo aproximadamente 10.000 cpm) por 24 h a

4°C em tampão fosfo-salina contendo EDTA 0,01 M e 0,1% de soro normal de cobaia

(volume final de 300 uL).

Os anticorpos ligados ao traçador foram precipitados pela adição de

um segundo antissoro de cabra, anti-gama globulina de cobaia, seguidos de incubação

por mais 24 h a 4°C. Após centrifugação durante 20 min. a 1880 G, os sobrenadantes

foram descartados vertendo-se os tubos, e a radioatividade do precipitado foi

determinada em contador gama automático. A eficiência do contador Abbott, EUA

estabelecida pelo fabricante foi de 65% (81).

3.2.2. DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DOS ANTISSOROS

Os antissoros obtidos ao longo do tempo de imunização foram titulados

no sistema de ensaio descrito no item 3.2.1. A incubação, no entanto, foi realizada por

72 h nas diluições variando de 1:100 a 1:256.000.

3.2.3. DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DOS ANTISSOROS

A especificidade dos antissoros foi analisada em curvas de título, na

presença de insulina (500 mUI/L) e de peptídeo-C (10 pmol/mL).

Como os antissoros não foram suficientemente específicos para a pró-

insulina, eles foram adsorvidos contra Insulina-Sepharose e Peptídeo-C-Sepharose

empregando-se cromatografia de afinidade.

3.2.3.1. Preparo da Sepharose 4B-CNBr ativada e acoplamento àinsulina e ao peptídeo-C.

A Sepharose 4B foi ativada de acordo com o método descrito por

Cuatrecasas e Anfinsen (82). A resina foi colocada em béquer contendo o mesmo

volume de água destilada, colocado sobre um agitador magnético, e o pH foi

constantemente monitorado através de um eletrodo de pH colocado na suspensão. O

CNBrfoi adicionado na proporção de 150 mg por grama de resina seca e rapidamente

titulou-se a reação com NaOH 2 M elevando-se o pH para aproximadamente 11. A

temperatura foi mantida constante em torno de 20°C empregando-se um banho de

gelo. O tempo aproximado de reação foi de 8-12 min. Quando o pH manteve-se

constante (pH 11), foi acrescentada grande quantidade de gelo à suspensão que foi

transferida para funil de Buchner sob vácuo e lavada com tampão borato 0,1 M pH 8,1

frio. Assim que o tampão foi aspirado vedou-se a saída do funil com parafilm e adicionou-

se a solução de proteína a ser acoplada (3,6 mg de insulina e 1,0 mg de peptídeo-C

por grama de resina seca (54). Em seguida, a suspensão foi transferida para um

frasco e permaneceu sob agitação a 4°C pelo período de um "overnight".

Após o acoplamento, o tampão foi substituído pelo tampão de

acoplamento acrescido de glicina 0,2 M pH 8,0 para o bloqueio dos grupos ativos

remanescentes e permaneceu sob agitação por mais um "overnight" a 4°C. Procedeu-

se, então, à retirada da proteína adsorvida à Sepharose e do agente bloqueante, com

lavagens sucessivas empregando-se os tampões borato e acetato de sódio num total

de 500 mL de cada tampão por grama de gel.

Determinou-se a existência de insulina nos filtrados obtidos após cada

etapa de lavagem, através da detecção em espectrofotometria U.V. em 276 nm, até

que a presença de insulina não fosse mais detectada. O peptídeo-C não pôde ser

analisado já que sua molécula não contêm aminoácidos aromáticos que contribuam

para a absorbância na região ultra-violeta (83).

A concentração de insulina imobilizada à Sepharose após o

acoplamento, foi avaliada empregando-se o método de Lowry modificado (84).

29

3.2.3.2. Determinação da insulina imobilizada à Sepharose

A suspensão de insulina-Sepharose foi lavada com água destilada

para a retirada do tampão borato e a seguir centrifugada por 3 min. a 300 G. A seguir,

1 mL de resina foi ressuspensa em 1 mL de água destilada e a concentração proteica

foi determinada. O mesmo processo foi aplicado à Sepharose não ativada que foi

empregada na construção da curva de dose resposta.

A curva de dose resposta foi construída dissolvendo-se insulina

biossintética humana (5mg/mL) em solução de HCI 0,005 N que foi adicionada à

Sepharose não ativada obtendo-se uma série de amostras contendo 0,1 a 1,0 mg/mL.

À resina em suspensão, acrescentou-se 0,4 mL da solução descrita

no item 2.4.2 e a suspensão permaneceu sob agitação por 20 min. à temperatura

ambiente. Em seguida, acrescentou-se 0,2 mL de reagente de Folin-Ciocalteau 1N

que permaneceu incubando por mais 120 min. Após a retirada do sobrenadante, a

resina foi lavada com 1 mL de água destilada que foi reunida ao sobrenadante inicial.

Em seguida determinou-se a densidade óptica a 750 nm e a concentração de insulina

acoplada foi determinada empregando-se a curva de dose resposta.

3.2.4. PURIFICAÇÃO DOS ANTISSOROS

O conjugado proteína-Sepharose foi empregado na cromatografia de

afinidade para a purificação dos antissoros anti-pró-insulina.

Os antissoros foram incubados por 18 h com 0,5 mL do conjugado

insulina-Sepharose por mL de antissoro, seguido por uma incubação adicional com o

Peptídeo-C-Sepharose (0,3 ml_/mL de antissoro) de 18 h a 4°C sob agitação (54). O

antissoro foi separado da resina por centrifugação a 300 G por 3 min., armazenado a

-20°C e empregado no radioimunoensaio.

30

3.2.5. CARACTERIZAÇÃO DOS ANTISSOROS

A avidez dos antissoros purificados foi estimada por construção de

curvas dose resposta do radioimunoensaio em equilíbrio, calculando-se suas constantes

de afinidade (Ka) pela análise de Scatchard (85), com a ajuda do programa

computacional "Statistical Graphics System" para a redução dos dados (86).

Essas curvas foram construídas empregando-se pró-insulina padrão

(100 ul_) nas concentrações variando de 0,016 a 16 pmol/mL e 100 uL de tampão de

ensaio (volume final de 300 uL). As amostras foram incubadas por 96 h a 4°C, seguidas

de incubação adicional por 24 h com o segundo antissoro. O precipitado foi coletado

por centrifugação a 1500 G durante 30 min. a 4°C.

Os antissoros que apresentaram os valores de Ka mais elevados, foram

submetidos à análise de sua cinética de precipitação, permanecendo incubados por

período que variou de 1 a 126 h a 4°C com emprego de polietileno glicol 20% para a

separação da fração ligada. Os dados obtidos foram analisados utilizando-se um

programa computacional para análise compartimentai e cinética, ANACOMP versão

1.0(87).

A seguir, determinou-se os valores percentuais da reação cruzada

desses antissoros com a insulina, peptídeo-C e com os intermediários de conversão

da pró-insulina: 65,66-split, 32,33-split, 64,65-des e 31,32-des.

Esses valores foram estimados a partir das curvas dose resposta,

como a razão da concentração de pró-insulina pela concentração de insulina, peptídeo-

C e dos intermediários de conversão da pró-insulina, necessários para o deslocamento

de 50% do traçador. As curvas dose resposta foram construídas em tampão em sistema

de ensaio em não-equilíbrio e separadas pelo segundo antissoro assistido pelo PEG,

conforme descrito no item 3.11.1.

31

3.3. PREPARO DOTRAÇADOR

3.3.1. ANÁLISE QUALITATIVA DA PRÓ-INSUUNA NÃO

RADIOIODADADA

A qualidade da pró-insulina não radioiodada foi analisada pela

eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) para fins de controle da estabilidade do

pró-hormônio.

A pró-insulina (65ug) foi dissolvida em tampão fosfato de sódio 0.05M

pH 7,4 e submetida a EGPA conforme descrito no item 3.3.6.

3.3.2. TÉCNICA DE RADIOIODAÇÃO

A pró-insulina humana biossintética foi marcada empregando-se o

método de lodogen desenvolvido por Fraker e Speck (88) e modificado para obtenção

de traçadores com maior atividade específica (89).

Os tubos de iodação de polipropileno foram recobertos com 16 ug de

iodogen dissolvido em 200 uL de clorofórmio posteriormente evaporado sob atmosfera

de nitrogênio à temperatura ambiente, lacrados com parafilme e estocados em

dessecador a -40°C.

Imediatamente antes da marcação, os tubos foram lavados com

200 uL de tampão fosfato de sódio 0,05 M pH 7,4. Cinco microgramas da pró-insulina

dissolvidas em 100 uL do mesmo tampão fosfato foram incubados com 37 MBq de

Na125| (1 m c j ) durante 5 min. no tubo de iodação em banho de gelo.

O rendimento das marcações foi determinado pela percentagem de

radioatividade precipitada com ácido tricloroacético (TCA) a 10% (90).

32

3.3.3. CÁLCULO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DO TRAÇADOR

A atividade específica (AE) do traçador, expressa em Bq/ug, foi

calculada a partir do rendimento da marcação, considerando a massa do pró-hormônio

radioiodado e a atividade do Na 1 2 5 l utilizada (91).

3.3.4. PURIFICAÇÃO DA PRÓ-INSUUNA RADIOIODADA (125l-hPI)

O pró-hormônio radioiodado foi purificado por cromatografia de troca

aniônica em coluna de QAE-Sephadex A-25 de acordo com o método descrito por

Deacon e Conlon (55).

O gel (6 g) foi previamente intumescido com solução fisiológica durante

30 min. à temperatura ambiente, seguido de 2 h com tampão TRIS-HCI 0,08 M; NaCI

0,08 M, pH 7,0 em banho fervente. Em seguida, após atingir a temperatura ambiente,

o tampão foi substituído por outro de pH 8,6 e o gel foi então empacotado em coluna

de vidro de dimensões de 30 cm de altura e 1 cm de diâmetro, em sistema refrigerado

a4°C.

A coluna foi lavada com volume suficiente de tampão Tris-HCI 0,08 M;

NaCI 0,08 M; pH 8,6 contendo 1% de albumina bovina até atingir a saturação. Esta foi

confirmada pela dosagem da concentração da albumina bovina em espectrofotometria

U.V. em 280 nm antes e após a passagem do tampão pela coluna.

A mistura de reação foi aplicada à coluna, lavando-se o tubo de iodação

com 200 uL do tampão de eluição. A coluna foi eluída sob fluxo de 15 ml_/h com um

gradiente linear formado por 150 mL do tampão de equilíbrio e 150 mL do mesmo

tampão contendo NaCI 0,3 M.

Coletaram-se 120 frações de 2,5 ml cada, das quais foram retiradas

alíquotas de 50 uL. Essas alíquotas foram colocadas individualmente em cones de

papel alumínio para determinação da radioatividade em contador gama. A partir das

contagens obtidas traçaram-se os cromatogramas em escala linear, relacionando-se a

radioatividade, expressa em cpm, com o número da fração.

33

3.3.5. ANÁLISE DA IMUNORREATIVIDADE

As frações relacionadas aos picos principais revelados nos

cromatogramas foram avaliadas por sua imunorreatividade pela incubação com o

antissoro anti-pró-insulina em excesso (diluição final de 1:300) bem como sua pureza

pela precipitação com TCA e pela análise em EGPA, conforme descrito adiante no

item 3.3.6.

Neste ensaio foram pipetados 100 uL de tampão de ensaio contendo

0,1% de albumina bovina, 100 uL de 125l-pró-insulina (contendo aproximadamente

10.000 cpm) e 100 uL de antissoro, perfazendo um volume total de 300 uL Para cada

fração foi determinado também o valor do "branco" ou seja, o valor referente à ligação

inespecífica (ligação na ausência de antissoro). Este valor foi subtraído da

correspondente ligação específica de cada fração. Nestes tubos, o antissoro foi

substituído por soro normal de cobaia. Este teste foi realizado em duplicata.

Após incubação de 24 h, os anticorpos ligados ao traçador foram

precipitados pela adição de 100 uL de gama globulina bovina a 1% e 1 ml_ de PEG a

10%. O precipitado foi coletado por centrifugação a 1500 G durante 30 min. a 4°C e o

sobrenadante foi aspirado com a ajuda de bomba de vácuo. Em seguida, o precipitado

foi dissolvido com 300 uL de NaCI 0,3 M, e novamente precipitado com 1 ml_ de PEG

a 10%.

As frações que apresentaram elevada ligação específica com o

antissoro em excesso, baixa ligação inespecífica e maior percentagem de pureza

quando analisadas pela precipitação com TCA, foram reunidas e diluídas com tampão

de ensaio contendo 1 % de albumina bovina, divididas em alíquotas de 0,5 ml e mantidas

a -20°C, sendo utilizadas como traçadores nos radioimunoensaios.

34

3.3.6. ANÁLISE DA PUREZA DO TRAÇADOR

A qualidade da pró-insulina marcada bem como a eficiência da técnica

de iodação e purificação foram analisadas pela precipitação com TCA e pela

eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA). Analisou-se a pró-insulina imediatamente

após a marcação e após a sua purificação.

3.3.6.1. Precipitação de proteínas pelo TCA

Alíquotas da pró-insulina obtida após radioiodação e das frações

referentes aos principais picos radioativos do cromatograma, foram submetidas ao

teste de precipitação de proteínas pelo TCA a 10% (90).

A radioatividade dessas amostras foi determinada antes de serem

precipitadas, considerando-se este valor como sendo a radioatividade total das mesmas.

A seguir, adicionou-se a cada amostra 1 mL gelado de TCA a 10%, resultando, portanto,

uma solução final de TCA a 5%. As amostras foram então homogeneizadas e

centrifugadas a 1.300 G durante 5 min. obtendo-se, assim, um precipitado com volume

de, aproximadamente, 0,1 mL. O sobrenadante foi aspirado com a ajuda de bomba de

vácuo, e logo depois foram adicionados 0,9 mL de solução de NaOH 2N que dissolveram

o precipitado mediante agitação.

Finalmente, as amostras foram levadas novamente ao contador,

estimando-se a radioatividade das proteínas precipitadas.

Calculou-se, então, a percentagem média de precipitação dessas

proteínas, visto este teste ser realizado sempre em triplicata.

35

3.3.6.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA)

A EGPA foi desenvolvida de acordo com o método de Davis (92).

A solução de polimerização do gel de poliacrilamida a 7% foi preparada

empregando-se as soluções A, C e E na proporção descrita no item 2.4.7.

Utilizou-se tubos cilíndricos de vidro de 5 mm de diâmetro interno por

110 mm de comprimento, vedando-se uma das extremidades com membrana adesiva

do tipo "Parafilm". Os tubos foram dispostos em estante apropriada, de forma a serem

mantidos na posição vertical.

A solução de polimerização (poliacrilamida a 7%) foi transferida com

pipeta automática para os tubos, mantendo-se uma altura uniforme de aproximadamente

9 cm em todos eles. Para evitar a formação de menisco na extremidade superior dos

géis, adicionou-se cerca de 100 uL de água destilada sobre a solução de forma a

assegurar obtenção de bandas perfeitamente horizontais na separação eletroforética.

A seguir, para permitir a polimerização do gel, os tubos foram expostos

cerca de 7 cm de uma lâmpada fluorescente de 15 W durante 45 min. a 4°C. Finda sua

polimerização, a água destilada foi retirada com a ajuda de papel absorvente e as

amostras foram aplicadas por meio de pipetas automáticas.

Adicionou-se cerca de 30 uL da solução F para aumentar a densidade

das amostras e evitar sua mistura com o tampão de corrida antes do início da

eletroforese. Acrescentou-se, também, 10 uL da solução de azul de bromofenol para

indicar o final da corrida (corante traçador-CT). As amostras resultantes foram então

homogeneizadas por meio de pipeta automática.

Após a retirada do "Parafilm" da extremidade, os tubos foram

posicionados verticalmente na cuba eletroforética e, o espaço acima das amostras de

cada tubo foi completado com tampão TRIS-glicina 0,04 M, pH 8,3. Esse mesmo tampão

foi empregado para a corrida eletroforética.

A corrida foi efetuada com corrente anódica de 2 mA por gel a 4°C,

sendo interrompida quando a banda do corante traçador chegou até cerca de 3 cm da

extremidade inferior do gel.

36

Finda a eletroforese, os géis foram removidos dos tubos de vidro

através de injeção de água contínua, empregando-se seringa plástica com agulha de

aço inoxidável, de modo a desprender toda a superfície do gel do tubo.

Os géis não radioativos foram colocados em TCA a 12,5% por 30 min.

para a precipitação das proteínas, corados com "coomassie blue" a 0,05% e descorados

com ácido acético glacial a 7%. Logo após, foram lidos diretamente no densitômetro

na região ultravioleta, com feixe de luz no intervalo de 220 a 310 nm. O perfil de

absorbância por comprimento do gel foi obtido através de um registrador regulado

com velocidade em 1 mm/s, acoplado ao densitômetro.

Os géis contendo amostras radioativas foram cortados em fragmentos

de 3 mm com a ajuda do "gel-slicer". Cada segmento foi envolto em papel alumínio e

colocado em tubo de contador para a determinação de sua radioatividade. Os perfis

eletroforéticos foram traçados em escala linear sendo calculada a radioatividade de

cada pico em relação à radioatividade total do gel.

O cálculo do valor da migração eletroforética relativa (Rm) dos

componentes revelados em cada gel foi realizado em relação à migração do azul de

bromofenol.

3.3.7. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO TRAÇADOR

Com o traçador obtido em uma das diferentes radioiodações,

realizou-se estudos da sua estabilidade em função do tempo de estocagem a -20°C

decorridos 1, 2 e 3 meses após a radioiodação. Avaliou-se sua pureza pela EGPA e

sua adequação para ser empregado nos ensaios, através dos parâmetros relativos ao

radioimunoensaio, ligação inespecífica e específica, dose média efetiva (ED50) e a

sensibilidade.

37

3.4. PREPARO DO PADRÃO E DA CURVA DOSE RESPOSTA DO

RADIO1MUNOENSA1O

Os padrões disponíveis para o emprego na curva dose resposta do

radioimunoensaio foram preparados em nossos laboratórios seguindo-se os

procedimentos descritos abaixo:

1- solução estoque da pró-insulina biossintética produzida pela Eli Lilly

and Company e estabelecida pela Organização Mundial de Saúde

(OMS) como o primeiro padrão primário de Referência Internacional

(62), (código 84/611).

A ampola contendo 6 ug de pró-insulina liofilizada foi reconstituída

com 1 ml_ de água destilada, separada em 10 alíquotas de 100 uL

cada as quais foram armazenadas a -40°C. Obteve-se uma solução

com concentração final de 639 pmol/mL.

2- solução estoque da pró-insulina biossintética fornecida pela Eli Lilly

and Company como padrão secundário (código A18-TS9-17).

Esse padrão foi dissolvido no tampão de ensaio contendo 1 % de

albumina bovina, separado em alíquotas e armazenado a -40°C.

Obteve-se uma solução com concentração final de 1065 pmol/mL.

3- solução estoque da pró-insulina biossintética fornecida pela Eli Lilly

and Company empregada na obtenção do traçador e dos antissoros

anti-pró-insulina (código 509-EM4).

Esse padrão foi dissolvido no tampão de ensaio contendo 1 % de

albumina bovina, separado em alíquotas e armazenado a -40°C.

Obteve-se uma solução com concentração final de 1065 pmol/mL.

Para a obtenção do padrão na diluição requerida para os pontos da

curva dose resposta, pipetou-se 30 uL da solução padrão (cód. A18-TS9-17;

38

cód. 509-EM4) em tubo contendo 2 mL de soro isento de pró-insulina ou 30 uL da

solução padrão (cód. 84/611) em tubo contendo 1,2 mL do mesmo soro. Como resultado,

obteve-se o primeiro ponto da curva (16 pmol/mL) que foi, a seguir, submetido a uma

diluição seriada de 1/4. A curva dose resposta foi, então, desenhada com as seguintes

concentrações do padrão: 0,004; 0,016; 0,063; 0,25; 1,0; 4,0; 16 pmol/mL.

B. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA O

RADIOIMUNOENSAIO

A análise das curvas dose resposta obtidas neste estudo foram

realizadas pelo emprego do programa computacional para radioimunoensaio, Riakalk

versão 1.0 (93). Além disso, as curvas foram submetidas à análise de regressão linear

empregando-se o programa computacional estatístico PRIMER (94). Os parâmetros

estimados pelo programa, inclinação e intercecção da reta, foram comparados

empregando-se o teste t de Student.

3.5. DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO DO ENSAIO

Visando a obter ensaios com sensibilidade elevada, realizou-se uma

análise comparativa entre sistemas em equilíbrio e em não-equilíbrio, que, de per si,

são mais sensíveis.

O antissoro foi incubado com o traçador em sistema de ensaio em

equilíbrio de 24 e de 126 h, e em não-equilíbrio por 24 h com o padrão e mais 3 h, ou

mais 6 h com o traçador.

Nessas curvas, 100 uL do antissoro foi incubado a 4°C com 100 uL da

pró-insulina padrão e com 100 uL da 125|_np| contendo, aproximadamente,

10.000 cpm.

O ensaio foi realizado em triplicata, e a ligação inespecífica dele foi

determinada incubando-se tubos onde o antissoro estava ausente.

39

A separação do ensaio foi realizada segundo Deacon e Conlon (55),

empregando-se 100 uL de gama globulina bovina (1 Omg/mL) e 1 ml_ de PEG a 20%. O

precipitado foi coletado por centrifugação a 1750 G durante 30 min. a 4°C.

3.6. DETERMINAÇÃO DA TÉCNICA DE SEPARAÇÃO IDEAL DO

RADIOIMUNOENSAIO.

Relatos da literatura se referem à separação do radioimunoensaio de

pró-insulina pelas técnicas de precipitação da fração ligada pelo PEG (55), pelo segundo

antissoro (54,56,58) e pela combinação deste antissoro assistido pelo PEG (57 e 59).

Devido à necessidade de importação do segundo anticorpo e a

disponibilidade do PEG 6000 em nossos laboratórios, realizou-se um estudo

comparativo dessas três técnicas e da determinação das condições ideais de emprego

de cada uma delas.

Esse estudo foi realizado com o antissoro e com o traçador incubados

em equilíbrio por 96 h a 4°C. Nessas condições, foram estimados os valores das

ligações específicas (Bo) e inespecíficas (NSB) ocorridas entre eles.

Inicialmente, foi determinada a concentração ideal do PEG 6000,

seguindo-se o procedimento descrito por Deacon e Conlon (55) e acrescentando-se

uma etapa adicional de lavagem da fração precipitada, conforme padronizado para o

RIE de hTSH (95).

A seguir, foi determinado o tempo ideal de reação com o segundo

anticorpo. As curvas de título foram obtidas incubando-se 100 uL do antissoro anti-

pró-insulina com 100 uL do traçador e 100 uL de tampão de ensaio contendo 0,1% de

albumina bovina durante 24 h a 4°C. O segundo antissoro foi diluído nesse mesmo

tampão, porém, contendo 1 % de soro normal de cobaia no lugar de albumina bovina

e incubados por mais 24 h a 4°C.

Determinado o título, procedeu-se à investigação do tempo de

incubação ideal do segundo anticorpo, após períodos de incubação variando de 1 a

24 h a 4°C.

40

Objetivando diminuir os valores de NSB e, consequentemente, obter

ensaios mais sensíveis com aceleração do tempo de separação do ensaio, avaliou-se

o emprego daquele segundo antissoro combinado com diferentes concentrações de

PEG, incubados por períodos variando de 1 a 24 h.

Essa separação foi realizada segundo Bowsher e cols. (59),

empregando-se 1 mL de PEG 8000, 100 uL do segundo antissoro (1:9) e 100 uL do

soro normal de cobaia (1:400).

Após terem sido determinadas as condições ideais para o emprego de

cada uma dessas 3 técnicas de separação, realizou-se um estudo comparativo de seu

emprego na separação das curvas dose resposta do radioimunoensaio incubadas no

sistema de ensaio em não-equilíbrio.

O estabelecimento dos critérios para o emprego da técnica do segundo

antissoro assistido pelo PEG na separação da curva dose resposta obtida empregando-

se soro isento de pró-insulina, foi concluído pela avaliação do título do segundo antissoro,

na presença de concentração do soro normal de cobaia variando de 1:100 a 1:500.

3.7. DETERMINAÇÃO DA DILUIÇÃO OTIMIZADA DO ANTISSORO E DO

TRAÇADOR.

Depois de ter sido estabelecido o sistema de ensaio em não-equilíbrio,

determinado o tempo de incubação com o traçador e estabelecida a melhor técnica de

separação, realizou-se o estudo da concentração ideal de antissoro e de traçador a

serem empregadas no radioimunoensaio.

Determinou-se, para cada traçador, a ótima diluição do antissoro

incubando-se 100 uL de 125l-pró-insulina contendo aproximadamente 10.000 cpm,

100 uL de tampão de ensaio e 100 uL de antissoro nas diluições de 1:100 a 1:64.000,

durante 3 h a 4°C. O ensaio foi realizado em triplicata e sua ligação inespecífica foi

determinada incubando-se tubos onde o antissoro estava ausente.

Após o período de incubação, o hormônio livre foi separado do ligado

ao anticorpo pelo método do segundo antissoro assistido pelo PEG, seguido de

41

incubação por mais 1 h a 23°C, centrifugação e contagem do precipitado.

A ótima diluição do antissoro foi aceita como aquela que forneceu uma

ligação de aproximadamente 30% com o traçador.

A ótima diluição do traçador foi analisada incubando-se o antissoro a

4°C em sistema de ensaio em não-equilíbrio por 24 h com 100 uL da pró-insulina

padrão e por mais 3 h com 100 uL da 125|-pró-insulina contendo aproximadamente

5.000, 10.000 e 15.000 cpm. A separação do ensaio foi realizada pelo método do

segundo antissoro assistido pelo PEG seguido de incubação por 1 h a 23°C,

centrifugação e contagem do precipitado.

3.8. DETERMINAÇÃO DO MEIO DE INCUBAÇÃO DA CURVA DOSE

RESPOSTA

A fim de se manter a uniformidade das condições de incubação entre

as amostras desconhecidas e os padrões, foram comparadas curvas dose resposta

do radioimunoensaio preparadas em soro humano normal, tampão de ensaio contendo

0,1% de albumina bovina e em soro humano normal isento da pró-insulina (verificar

item 3.9).

Nessas curvas, 100 uL do antissoro foi incubado a 4°C, em sistema de

não-equilíbrio por 24 h com 100 uL da pró-insulina padrão, e por mais 3 h com 100 uL

do traçador contendo aproximadamente 10.000 cpm. A separação do ensaio foi

realizada pelo método do segundo antissoro assistido pelo PEG, seguido de

centrifugação e contagem do precipitado.

3.9. OBTENÇÃO DE SORO ISENTO DE PRÓ-INSULINA

O soro humano obtido em banco de sangue, foi tratado com carvão

ativado a 5%, permanecendo sob agitação durante 30 min. a 4°C (96). A seguir, o soro

foi centrifugado a 2500 G durante 1 h a 4°C para a remoção do carvão. Essa precipitação

foi repetida 3 vezes, após o quê, o soro foi filtrado através de membrana de Millipore

42

com diâmetro de 0,45 u para remoção das partículas finas do carvão. O soro contendo

0,01% de tiomersal foi separado em alíquotas que foram armazenadas a -20°C até

sua utilização nas curvas de dose resposta do radioimunoensaio.

3.10. ESTUDO COMPARATIVO DOS PADRÕES DE PRÓ-INSULINA

Realizou-se um estudo comparativo das curvas de dose resposta

obtidas a partir do uso dos três padrões de pró-insulina preparados: código 84/611,

A18-TS9-17 e 509-EM-4 (item 3.4)

Nessas curvas, 50 uL do antissoro foi incubado a 4°C, em sistema de

não-equilíbrio por 24 h com 200 uL da pró-insulina padrão e por mais 3 h com 50 uL do

traçador contendo, aproximadamente, 10.000 cpm. A separação do ensaio foi realizada

pelo método do segundo antissoro pelo PEG seguido de centrifugação e contagem do

precipitado.

Estimou-se a potência radioimunológica dos padrões secundários 509-

EM4 e A18-TS9-17, em relação ao padrão de referência 84/611, pela relação entre os

valores de EDSQ-

O padrão código 509-EM4 armazenado a -20°C foi analisado dois anos

após seu preparo em comparação com o mesmo padrão recém-preparado.

3.11. RADIOIMUNOENSAIO DE PRÓ-INSULINA

3.11.1. SEQUÊNCIA OPERACIONAL

Os ensaios foram realizados pela incubação, durante 24 h a 4°C, de

uma mistura de reação contendo pró-insulina padrão na concentração de 0,004 a 16

pmol/ml_ preparada em soro isento de pró-insulina, ou igual volume das amostras com

teor desconhecido de pró-insulina, e antissoro na diluição apropriada. Em seguida,

acrescentou-se a 125l-pró-insulina contendo aproximadamente 10.000 cpm, seguido

de incubação por mais 3 h a 4°C.

43

O antissoro e o traçador foram diluídos no tampão de ensaio contendo

0,1% de albumina bovina.

Após este período, procedeu-se à separação da pró-insulina livre

daquela ligada ao anticorpo conforme descrito na Tabela 1. O segundo antissoro, soro

de cobaia normal e o PEG foram diluídos no tampão de separação (fosfato de sódio

0,025 M contendo EDTA 0,02 M pH 7,5) contendo 0,1% de albumina bovina.

No ensaio foi determinado, também, o valor do "branco" ou seja, o

valor referente à ligação inespecífica e o valor da dose zero.

O ensaio para definir a curva de dose resposta foi realizado em triplicata

enquanto que as amostras sanguíneas foram ensaiadas em duplicata.

3.11.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PRÓ-INSULINA NAS

AMOSTRAS DE SORO HUMANO

Após a separação do ensaio e determinação da radioatividade dos

tubos, calculou-se a percentagem de ligação da "^i-pró-insulina ao anticorpo específico

em relação à radioatividade total. Estes valores de ligação foram corrigidos pela

subtração da ligação inespecífica.

Empregou-se o programa computacional para radioimunoensaio,

RIAKALK, para a análise dos parâmetros NSB e Bo, dose efetiva para valor de 50% da

resposta máxima (ED50) e dose mínima detectável (DMD) correspondente ao valor de

Bo subtraído de 2,5 desvios padrão.

A concentração das amostras desconhecidas foi determinada pelo

programa tendo como base, a leitura nesta curva dose resposta.

44

Tabela 1- Protocolo do radioimunoensaio de proinsulina.

NSB Bo Padrões Desconhecidos

200 pLSoro isentode pró-insulina

Antissoro

soro de cobaia

normal

Padrões

Amostras

200 pL

50 pL

50 uL 50 pL 50 pL

200 pL

200 pL

Incubação de 24 h a 4°C

1251-pró- 50 pL 50pL 50 pL 50pL

insulina

(10.000 cpm)


100 uL segundo antissoro

100 pL soro de cobaia normal (1:100)

1 mLPEG 10%


Centrifugação a 3500 G por 30 min. a 4°C

Inversão dos tubos e contagem dos precipitados

45

3.12. CONTROLE DE QUALIDADE DO RIE

O radioimunoensaio desenvolvido foi avaliado através da análise dos

seguintes parâmetros: especificidade, exatidão, precisão e sensibilidade (97-100).

3.12.1. ESPECIFICIDADE

Para verificar a identidade entre o hormônio presente nas amostras

sanguíneas e o hormônio padrão, uma amostra com elevado teor endógeno de pró-

insulina, procedente de um indivíduo portador de insulinoma, foi submetida ao

radioimunoensaio nas seguintes diluições: 1:1,5; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16.

As diluições foram realizadas em soro isento de pró-insulina de acordo

com o descrito na Tabela 2, e para cada diluição foram ensaiadas dez replicatas. Foi

calculada a média dos 10 resultados obtidos para cada diluição e seu desvio padrão,

bem como as concentrações obtidas a partir do produto de cada média pelo fator de

diluição respectivo.

Calculou-se, também, a correlação linear entre os volumes de amostra

e as concentrações médias obtidas empregando-se o programa computacional

estatístico PRIMER e examinou-se a significância do coeficiente de correlação obtido.

Tabela 2- Preparo das diluições referentes a avaliação da especificidade dométodo.

Diluição

1:1,51:21:41:81:16

Volume deamostra

(mL)

1,51,20,60,30,15

Volume de soroisento de pró-insulina

(mL)

0,71,21,82,12,25

46

3.12.2. EXATIDÃO

Realizou-se a avaliação da recuperação da pró-insulina adicionada

em quantidades crescentes a uma mistura de soros de indivíduos normais com

concentração de pró-insulina previamente determinada (0,026 pmol/mL), conforme

indicado na Tabela 3. Essa análise foi realizada em decuplicata.

A recuperação das diferentes amostras foi estimada pela diferença

entre o valor médio determinado a partir da curva dose resposta e o valor teórico

(obtido pela soma da concentração de pró-insulina já presente no soro e da pró-insulina

padrão adicionada). Calculou-se, também, a recuperação percentual média para cada

amostra e seu desvio padrão.

Determinou-se o coeficiente de correlação entre os valores teóricos e

os obtidos e examinou-se sua significância empregando-se o programa computacional

estatístico PRIMER.

Tabela 3- Concentrações de pró-insulina adicionadas a uma amostra de pró-insulinemia conhecida (0,026 pmol/mL).

Pró-insulina adicionadaul_ pmol/mL

1 0,0164 0,063

16 0,25063 1,000

250 4,000

3.12.3. PRECISÃO

A avaliação da reprodutibilidade intra-ensaio deste método foi analisada

num mesmo ensaio através de um número elevado de replicatas (n=15) de amostras

controle com diferentes teores de pró-insulina. Devido à impossibilidade de se obter

47

um volume suficiente de soros de pacientes, principalmente com valores elevados de

pró-insulina para compor essas amostras, elas foram preparadas a partir da pró-insulina

padrão biossintética, visto que, a avaliação da especificidade do método revelou

identidade perfeita entre esta pró-insulina e aquela endógena.

As amostras controle foram preparadas em soro isento de pró-insulina

contendo o padrão nas concentrações de 0,04; 0,1 e 0,3 pmol/mL, as quais foram

aliquotadas e armazenadas a -20°C. Calculou-se a concentração média e o desvio

padrão para cada nível, bem como seu respectivo coeficiente de variação.

A reprodutibilidade inter-ensaio foi avaliada pela dosagem das mesmas

amostras empregadas no estudo da reprodutibilidade intra-ensaio. Essas amostras

foram dosadas em duplicata em quinze ensaios diferentes. O valor médio para cada

nível foi calculado, bem como seu desvio padrão, permitindo a determinação do

coeficiente de variação.

3.12.4. SENSIBILIDADE

Os parâmetros relacionados à sensibilidade dos ensaios foram

estimados pelo emprego do programa computacional RIAKALK versão 1.0. Esses

parâmetros se referem às ligações inespecíficas (NSB) e da dose zero (Bo), dose

efetiva para valor de 50% da resposta máxima (ED50) e dose mínima detectável (DMD),

correspondente ao valor de Bo subtraído de 2,5 desvios padrão. Esses dois últimos

parâmetros (ED50 e DMD) refletem a sensibilidade dos ensaios.

3.13. ANÁLISE DA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO DA PRÓ-INSULINA DO SORO

Como a sensibilidade da curva dose resposta não permitiu a leitura

direta de amostras séricas de indivíduos normais, extraiu-se a pró-insulina do soro

antes de concentrá-la em sistema "Savant Speed-Vac SS4".

Empregou-se a metodologia adotada por Cohen e cols. (56) a qual

utiliza cartuchos de octadecil-silica Sep-Pak C-|8> aP°s modificações e otimização (101).

48

Excluiu-se três etapas de lavagem com 20% ACN : 0,8% TFA : 79,2% H2O;

20% diclorometano e 100% de ACN empregadas pelo autor para a remoção de

substâncias que interferiam com o processo de liofilização da amostra extraída e

posterior dissolução do resíduo.

Nesse método modificado, os cartuchos foram lavados com 5 mL de

acetonitrila (ACN) e, a seguir, com 5 mL de água. As amostras séricas foram introduzidas

nos cartuchos com auxílio de seringa sob fluxo gravitacional de 0,3 mL/min.

A seguir, os cartuchos foram submetidos a uma etapa de lavagem

com 5 mL de uma solução contendo 99% H2O: 15% ácido trifluoroacético (TFA). A

pró-insulina foi então eluída do cartucho com 5 ml de uma solução contendo

40% ACN : 59,4% H2O : 0,6% TFA.

A recuperação da extração da pró-insulina do soro humano foi avaliada

em cinco replicatas empregando-se o traçador 125|-hPI contendo aproximadamente

200.000 cpm em 1 mL de soro. Estimou-se a atividade do traçador presente na mistura

de soro aplicada e imediatamente recolhida do cartucho.

Este estudo foi repetido empregando-se a pró-insulina não marcada,

adicionada a 1 mL de soro isento de pró-insulina nas concentrações de 0,016; 0,031;

0,062 e 0,125 pmol/mL. Cada amostra foi extraída em duplicata e o eluato, contendo

a pró-insulina, foi recolhido em tubos de polipropileno (13 x 100 mm) siliconizados. A

solução eluente foi evaporada no sistema "Savant Speed-Vac SS4" e o precipitado

obtido foi ressuspenso para metade do volume original (0,5mL) com tampão de ensaio

contendo 0,1% de albumina bovina. A concentração da pró-insulina foi estimada pelo

radioimunoensaio, empregando-se a curva dose resposta preparada no mesmo tampão

de ensaio.

O coeficiente de correlação, entre as concentrações de pró-insulina

adicionadas e as concentrações obtidas após a extração, foi determinado e examinada

sua significância, empregando-se o programa computacional estatístico Primer.

49

3.14. ANÁLISE DA TÉCNICA DE CONCENTRAÇÃO DO SORO

Foram empregadas amostras séricas de 16 voluntários normais,

extraídas em cartuchos de Sep-Pak C-js. concentradas 2 vezes no sistema "Savant

Speed-Vac SS4" e submetidas à dosagem no radioimunoensaio de pró-insulina.

A reprodutibilidade do método de extração e concentração foi avaliada

empregando-se amostras controle de soro isento de pró-insulina contendo

0,05 pmol/mL de pró-insulina padrão.

3.15. APLICAÇÃO CLÍNICA DO RIE

3.15.1. COLETA DAS AMOSTRAS DE SOROS NORMAIS E COM

SECREÇÃO INSULÍNICA ALTERADA.

Amostras séricas de voluntários de ambos os sexos, de idade variável

e que não estavam recebendo qualquer tipo de medicação, foram colhidas após jejum

de 12 h. As amostras foram empregadas na validação do radioimunoensaio e no

estudo da pró-insulina circulante.

Para a dosagem da glicemia e da hemoglobina glicosilada (HbA1c),

colheu-se amostras de sangue em tubo contendo citrato e EDTA, respectivamente.

Para as demais análises (uréia, creatinina, colesterol, triglicérides,

insulina, peptídeo-C e pró-insulina), coletou-se amostras de sangue sem anticoagulante

em tubo seco. Após a retração do coágulo, essas foram centrifugadas a 1300 G

durante 10 min. à temperatura ambiente. O soro foi separado e armazenado a -20°C.

3.15.2. VALIDAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO

Empregou-se, na validação do radioimunoensaio, três grupos de

indivíduos compreendendo indivíduos normais, insuficientes renais crônicos e

insulinomas, cujas características clínicas são apresentadas na Tabela 4.

50

Os indivíduos foram considerados como normais quando a análise

bioquímica do soro indicou que todos os valores encontravam-se dentro do limite de

normalidade estabelecido para cada conjunto diagnóstico utilizado.

Os pacientes com insuficiência renal crônica foram analisados antes

da realização da hemodiálise e a doença foi confirmada pelas concentrações elevadas

de uréia e creatinina.

Os pacientes com insulinoma tiveram o tumor confirmado

cirurgicamente com exceção de um paciente onde aquele não estava evidenciado.

Tabela 4- Características clínicas dos pacientes.

n

Sexo (M/F)

Idade (anos)

*IMC (Kg/m2)

Normais

16

8/8

27 ± 5

22 ± 2

Insuficientesrenais

-20

11/9

35 ±12

22 ± 3

Insulinomas

6

3/3

38 ±11

*IMC- índice de massa corpórea

3.15.3. APLICAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO NO ESTUDO DO

DIABETES MELLITUS TIPO II ASSOCIADO À OBESIDADE.

Empregou-se, neste estudo, três grupos de pacientes comprendendo

mulheres obesas, pacientes diabéticos Tipo II obesos e não obesos cujas características

clínicas são apresentadas na Tabela 5.

A classificação dos indivíduos em obesos e diabéticos Tipo II foi

realizada segundo os critérios estabelecidos pelo National Institute of Health, E.U.A.

(102).

51

O índice de massa corpórea (IMC) foi calculado como o peso (Kg)

dividido pela altura (m) ao quadrado. Foram considerados obesos, os homens cujo

IMC foi superior a 27 e as mulheres cujo IMC foi superior a 25.

Os indivíduos diabéticos Tipo II (não-insulino-dependentes) foram

selecionados por apresentarem glicemia igual ou superior a 140 mg/mL e

HbA1c>8,0%.

Considerou-se, ainda, que todos os pacientes apresentavam função

renal normal, através da dosagem dos níveis séricos de uréia e creatinina.

As características clínicas individuais dos grupos estudados encontram-

se na Tabela 4 - Anexo a Tabela 6 - Anexo.

Tabela 5- Características clínicas dos pacientes.

n

Sexo (M/F)

Idade (anos)

*IMC (Kg/m2)

Obesos

22

0/22

36 ±11

35 ±6

Diabéticos nãoobesos

5

3/2

49 ±4

21 ±4

Diabéticosobesos

7

2/5

41 ±12

31 ±2

MMC- índice de massa corpórea

3.15.4. ANÁLISE BIOQUÍMICA DAS AMOSTRAS

As análises bioquímicas foram realizadas utilizando-se métodos

enzimáticos para a determinação da glicose, uréia, creatinina, colesterol e triglicerides,

com a ajuda do autoanalisador Technicon RA-1000-Bayer (EUA). A determinação da

hemoglobina glicosilada (HbA1 c) foi realizada pela técnica de cromatograf ia em coluna

utilizando-se o conjunto diagnóstico Sigma (EUA).

As dosagens de insulina e de peptídeo-C foram realizadas em nossos

52

laboratórios de acordo com as técnicas descritas abaixo.

3.15.4.1. Dosagem da insulina

Empregou-se o método de radioimunoensaio (103) utilizando-se um

primeiro antissoro monoclonal adquirido do laboratório Linco Research Inc. (EUA),

que apresentou somente 0,2% de reação cruzada com a pró-insulina.

O traçador do ensaio, 125l-insulina, foi preparado marcando-se cinco

microgramas de insulina porcina (NOVO Laboratories) pelo método da cloramina T

com 37 MBq (1 mCi) de 1 2 5 I e purificado em coluna de Sephadex G50 médio (104),

apresentando atividade específica de 5,5 MBq/ug.

Utilizou-se, como padrão do radioimunoensaio, a insulina porcina do

conjunto diagnóstico fornecido pela CIS Bio International (France), sendo que a curva

foi construída no intervalo de 5 a 400 uUI/mL. A separação do ensaio foi realizada pela

técnica do segundo antissoro assistido pelo PEG a 6,4%.

Os resultados das dosagens fornecidos em uUI/mL foram convertidos

para pmol/mL multiplicando-se os valores pelo fator 0,00718. Estimou-se, a partir desses

resultados, a relação molar pró-insulina/insulina (Pl/I), parâmetro este, empregado no

estudo comparativo da secreção insulínica dos pacientes analisados em relação aos

indivíduos normais.

A relação molar Pl/I é um índice do estado funcional das células p

pancreáticas e foi calculada como a razão entre a concentração de pró-insulina e

insulina.

No estudo dos insulinomas, as insulinemias foram determinadas em

radioimunoensaio no qual o primeiro anticorpo policlonal apresentou reação cruzada

com a pró-insulina.

53

3.15.4.2. Dosagem do Peptídeo-C

Empregou-se o conjunto diagnóstico comercial de radioimunoensaio

fornecido pelo laboratório DPC (Diagnostics Products Corporation, EUA) cujo anticorpo

apresentou reação cruzada com a pró-insulina humana variando de 18,4 a 20,0% nas

concentrações de 2,5 a 10 ng/mL. A curva padrão foi construída no intervalo de 0,2 a

52 ng/mL, e a separação do ensaio foi realizada pela técnica do segundo antissoro

assistido pelo PEG.

Antes de serem utilizados no radioimunoensaio, os padrões, os

controles e os soros desconhecidos foram submetidos a uma precipitação com

polietilenoglicol a 25% (v/v). Após centrifugação a 1700 G por 30 min., o sobrenadante

foi separado e utilizado no radioimunoensaio.

Os resultados das dosagens fornecidos em ng/mL foram convertidos

para pmol/mL multiplicando-se os valores pelo fator 0,331. Calculou-se, então, a relação

molar insulina/peptídeo-C para completar o estudo da secreção insulínica nas situações

em estudo em comparação com os indivíduos normais.

3.15.5. DOSAGEM DA PRÓ-INSULINA

A determinação da pró-insulinemia foi realizada nos pacientes com

secreção insulínica alterada empregando-se o radioimunoensaio desenvolvido; porém,

nos indivíduos com níveis de pró-insulina abaixo da região de confiança do ensaio

aplicou-se a técnica de extração da pró-insulina pelos cartuchos de Sep-Pak Ci 8 °.ue>

após concentração, foi quantificada no radioimunoensaio.

3.15.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os diversos grupos estudados foram analisados calculando-se os

valores da média ± desvio padrão da média (DP) com a ajuda do programa

computacional estatístico Instat (105). Para a comparação dos níveis médios de glicose,

54

insulina, peptídeo-C e pró-insulina empregou-se o test t pareado quando a distribuição

entre os grupos foi paramétrica.

Quando a distribuição não foi paramétrica, ou para a análise dos valores

percentuais, como é o caso da HbA1c, relação molar P/l e relação molar l/peptídeo-C,

calculou-se o valor da mediana, mínimo e máximo que foram comparadas empregando-

se o teste de Mann-Whitney (não paramétrico).

Em todos os testes foram considerados significantes, os valores

de p<0,05.

55

4. RESULTADOS

A. PREPARO E CONTROLE DE QUALIDADE DOS REAGENTES


4.1. AVALIAÇÃO DOS ANTISSOROS ANTI-PRÓ-INSULINA HUMANA

4.1.1. EVOLUÇÃO DA RESPOSTA E DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DOS

ANTISSOROS

Os dois esquemas de imunização nos quais empregaram-se 50 ug e

250 ug do imunógeno forneceram resultados semelhantes com relação à evolução do

título dos antissoros. Os títulos máximos foram obtidos em tomo de oito a nove semanas,

após o quê, permaneceram praticamente constantes. Após 12 semanas, uma das

cobaias imunizadas com 50 ug do imunógeno produziu antissoro anti-pró-insulina com

título suficientemente alto (1:24.000) para o radioimunoensaio (106).

A análise das curvas de título dos antissoros na presença de insulina e

de peptídeo-C mostraram que houve um deslocamento destas curvas para a esquerda,

indicando que os antissoros não foram suficientemente específicos, necessitando

portanto, serem purificados por cromatografia de afinidade (106).

4.1.2. PURIFICAÇÃO DOS ANTISSOROS

A concentração de insulina acoplada a Sepharose-4B CnBr ativada,

determinada pelo método de Lowry, revelou que houve um acoplamento de

13 ± 2% (n=2) da insulina a resina.

A cromatografia de afinidade empregando essas resinas mostrou-se

eficiente na purificação do antissoro adsorvido contra insulina-Sepharose e peptídeo-

C-Sepharose , embora o título do antissoro tenha sofrido uma redução passando de

56

1:24.000 para 1:15.000.

4.1.3. CARACTERIZAÇÃO DOS ANTISSOROS

O antissoro que apresentou o melhor título (1:24.000, antes de ser

purificado) foi o que também apresentou melhor avidez pela análise de Scatchard com

constante de afinidade (Ka) de 1,00 x 101^ L/mol.

Esse antissoro, quando submetido ao estudo da cinética de

precipitação, necessitou de apenas 24 h para atingir a ligação máxima com o traçador

(Figura 3).

100

opq

10b ' '1 16 24 48 72 96

j I

126 145Tempo(h)

Figura 3- Efeito do tempo de incubação sobre a ligação do antissoro com otraçador a 4°C.

Os valores de reação cruzada deste antissoro com a insulina, peptídeo-

C e os intermediários de conversão da pró-insulina foram obtidos pela análise da curva

57

de dose resposta do radioimunoensaio (Figura 4). Os valores percentuais apresentados

na Tabela 6 correspondem aos percentuais de reação cruzada, calculados,

relacionando-se os valores de ED50 das curvas dose resposta construídas com a

insulina, peptídeo-C e os 4 derivados de conversão da pró-insulina, com o valor de

ED50 da curva dose resposta construída com a pró-insulina padrão. Podemos observar

que o antissoro reconheceu muito pouco as formas 32,33-split e 31,32-des-pró-insulina,

mas apresentou 52% de reação cruzada com a forma 65,66-split-pró-insuIina.

Tabela 6- Valores percentuais da reação cruzada dos peptídeos com oantissoro anti pró-insulina purificado.

Peptídeo

pró-insulina

insulina

peptídeo-C

65,66-split

32,33-split

31,32-des

64,65-des

Reação cruzada

100

0,0001

0,005

52,0

6,5

7,1

N.D.*

*O peptídeo não deslocou a 125|.pró-jnsulina, mesmoquando empregado em concentrações muito elevadas.

58

om

100

60

60.

40.

20

Tvv \ * * • •

0,01 0,1 10 100

pmol/mL

Figura 4- Deslocamento da 125l-pró-insulina ao antissoro específico pela pró-insulina ( ), insulina ( -.-.-.- ), peptídeo-C ( ), 32,33-split(• A ) , 65,66-split ( X X ), 31,32-des( O O) e 64,65-des pró-insulina ( • • ) .

4.2. PREPARO E CONTROLE DE QUALIDADE DO TRAÇADOR

4.2.1. ANÁLISE QUALITATIVA DA PRÓ-INSULINA NÃO RADIOIODADA

A Figura 5 apresenta o eletroforetograma proveniente da pró-insulina

não radioiodada, submetida a EGPA logo após sua aquisição, onde se observa a

presença de um único componente, com valor de Rm de 0,63.

59

Figura 5- Eletroforese em gel de poliacrilamida da pró-insulina não radioiodada

à direita, e o respectivo branco da corrida eletroforética à esquerda. O valor do Rm do

seu único componente é indicado entre parênteses. CT indica a posição do corante

traçador, azul de bromofenol.

4.2.2. TÉCNICA DE RADIOIODAÇÃO E CÁLCULO DA ATIVIDADE

ESPECÍFICA DO TRAÇADOR

As marcações apresentaram rendimento que variou de 77,8 a 90,0%

para 18 preparações com atividade específica média do traçador de 6,0 ± 0,3 MBq/ug

(± DP), correspondendo a um grau de iodação menor do que um átomo de 1 2 5 I por

molécula de pró-insulina.

A Tabela 7 apresenta os resultados obtidos nas radioiodações da pró-

insulina.

60

Tabela 7- Resultados do preparo do traçador do radioimunoensaio: 125 !-hPI.

Marcaçãon9

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Rendimento(%)

87,97

86,06

86,88

88,63

90,01

87,58

81,59

82,63

82,75

88,66

77,92

80,99

82,96

83,26

83,61

80,05

77,80

80,85

Atividade específica(MBq/ug)

6,51

6,36

6,43

6,56

6,66

6,48

6,04

6,11

6,12

6,56

5,77

5,99

6,14

6,16

6,19

5,92

5,76

5,98

61

4.2.3. PURIFICAÇÃO DA PRÓ-INSUUNA RADIOIODADA (I25i-hpi) £

ANÁLISE DA IMUNORREATIVIDADE.

A Figura 6 exibe perfil cromatográfico típico da purificação da 125|.np|

em QAE-Sephadex A-25. Nesse cromatograma são indicadas, as ligações das frações

correspondentes aos picos principais com o antissoro em excesso.

a.o

100

20 40 60 80 100 120 140

DE FRAÇÕES

PQ

Figura 6- Cromatograma da purificação da 125l-hPI em QAE-Sephadex A-25,mostrando a radioatividade (— ) e a imunorreatividade (- - -) das frações. A áreahachurada corresponde às frações reunidas para serem empregadas como traçadordo radioimunoensaio.

62

4.2.4. ANÁLISE DA PUREZA DO TRAÇADOR

A Figura 7 mostra o eletroforetograma proveniente de uma preparação

da pró-insulina recém radioiodada e ainda não purificada. Nesse perfil eletroforético,

são observados três picos radioativos correspondentes a 1 2 5 l -hPI, a um componente

que migra junto com o corante traçador azul de bromofenol e ao 1 2 5 I livre.

Após a marcação, a radioatividade no pico da 12^|-pró-insulina

representava 73% da atividade total no gel (Fig.7 (a)), aumentando para 98% após a

purificação quando o iodo livre estava totalmente ausente (Fig.7 (b)).

A Tabela 8 exibe os resultados da análise eletroforética pela EGPA

dos traçadores purificados. Os demais traçadores não puderam ser analisados devido

à indisponibilidade de equipamentos. Como pôde ser observada nesta tabela, a pureza

determinada por esta análise apresentou um valor médio ± DP de 85,39 ± 4,66%.

A pureza estimada pela precipitação com TCA desses marcados

revelou um valor médio ± DP de 91,79 ± 4,18%. .

nO

6o

(a)

10 20 30(0.73)

Segmentos

10

(b)

10 20(0.69)

30

do gel

Figura 7- Eletroforetograma da 125 l -hPI radioiodada não purificada (a), e após a

purificação (b). Os valores de Rm do componente principal (125l-hPI) de cada gel são

indicados entre parênteses e as setas indicam a posição do corante traçador.

63

4.2.5. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO TRAÇADOR

A Figura 8 revela o estudo comparativo da análise da estabilidade dos

traçadores pela EGPA durante seu armazenamento a -20°C por, pelo menos, o período

correspondente a uma meia vida física do 125|.

O traçador manteve-se praticamente inalterado ao longo de,

aproximadamente, 90 dias de armazenamento quando apresentou um pequeno pico

de 1 2 5 I livre que migra à frente do corante traçador e um outro pico referente a um

componente não-imunorreativo, que migra junto com este corante (Tabela 9).

A Figura 9 exibe as curvas dose resposta do radioimunoensaio obtidas

com o mesmo traçador decorridos vários dias após seu preparo, indicando a estabilidade

elevada deste traçador e sua adequação para o emprego no radioimunoensaio.

Tabela 8- Valores da percentagem de pureza dos traçadores analisadospela precipitação com TCA e pela EGPA, com seus valoresde Rm respectivos.

Traçador

1

2

3

4

7

8

9

11

13

16

TCA

90,70

95,70

86,41

96,69

92,02

91,73

82,38

93,96

93,86

94,53

%Pureza

EGPA

97,84

86,40

86,40

81,99

85,31

80,54

82,27

82,56

83,42

87,18

Rm

0,69

0,63

0,63

0,74

0,76

0,73

0,75

0,72

0,77

0,71

64

Tabela 9- Resultados da análise eletroforética obtidos com o traçador aolongo de sua estocagem a -20°C.

Tempo de

armazenamento

(meses)

1

2

3

125|_hP|

(%)

86,84

80,35

75,69

Corante

traçador

(%)

1,99

2,76

2,92

125|

(%)

5,76

7,79

19,45

nO 5

6ao \Jtr\0 10 20

(0.69)0 10 20

(0.68)10 20

(0.70)

Segmentos do gel

Figura 8- Eletroforetogramas do traçador ao longo de sua estocagem após um,

dois e três meses da purificação (da esquerda para a direita). Os valores de Rm dos

componentes referentes a ̂ 25l-hPI e ao 125| d e cada gel são indicados entre parênteses

e as setas indicam a posição do corante traçador. Os valores percentuais de cada

componente são apresentados na Tabela 9.

65

100 h

80 r~

o 60

40 f~

20 H

0,004 0,016 0,083 0,25 4 16

pmol/mL

Tempo dearmazenamento

(dias)

NSB Bo ED50 DMD

(%) (pmol/mL) (pmol/mL)

72126134

3,124,823,60

23,9118,9325,81

0,260,300,28

0,040,050,06

Figura 9- Curvas dose resposta obtidas com o mesmo traçador após 72

( X X ), 126( • • ) e 134 ( O O ) dias de armazenamento a -20°C. Os

valores dos parâmetros relativos a essas curvas estão apresentados na tabela abaixo

da figura.

66


RADIOIMUNOENSAIO

4.3. DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO DO ENSAIO

O resultado da análise realizada com o antissoro nos sistemas de

ensaios em equilíbrio e em não-equilíbrio determinou que o tempo de incubação ideal

com o traçador foi de 3 h.

Além disso, pôde-se confirmar a rápida cinética desse antissoro que

não apresentou mudanças significantes a nível de p<0,05 para a inclinação, intercecção

das retas e ED50 em suas curvas dose resposta, quando incubados em equilíbrio por

24hou 126 h.

Verificou-se ainda que, a despeito dos valores de Bo diminuídos, o

sistema de ensaio em não-equilíbrio apresentou um aumento significativo na

sensibilidade das curvas dose resposta. Conforme verificado pelos valores de ED50

diminuídos, o tempo de incubação menor com o traçador resultou numa sensibilidade

ainda maior.

Nessas condições de incubação, o antissoro apresentou valores de

ED50 e DMD de 0,22 e 0,01 pmol/mL, respectivamente, para o ensaio em não-equilíbrio

de 3 h, contra 0,78 e 0,07 pmol/mL para o ensaio em equilíbrio de 24 h. Podemos

observar que as curvas submetidas à regressão linear não apresentaram diferença

significante a nível de p<0,05 tanto para a inclinação quanto para a intercecção das

retas, indicando que as retas eram paralelas.


RADIOIMUNOENSAIO.

Os resultados exibidos na Figura 10 confirmaram ser a concentração

do PEG, aquela indicada pela literatura (20%) (55), concentração esta que proporcionou

a precipitação máxima da pró-insulina complexada ao anticorpo com valor de NSB

67

dentro de limites aceitáveis (5,7%).

A investigação do tempo de incubação ideal do segundo antissoro

revelou a precipitação máxima da fração ligada após 24 h de reação a 4°C (NSB de

6,7%).

Pôde-se observar, ainda nesta figura, os resultados do emprego desse

segundo antissoro combinado com diferentes concentrações de PEG e com períodos

de incubação variável. Observou-se uma completa precipitação da fração ligada após

1 h de incubação do segundo antissoro assistido pelo PEG a 10% com valor adequado

de NSB (4,4%).

50

40-

O 3 0 -

&ç 2 0"

ic-0

0 2.5 5 10 20 40 5 10 20 40 0 1 3 6 16 24

Concentração PEG(%) Tempo(h)

Figura 10- Valores das ligações específicas (Bo) e inespecíficas (área em negrito)

obtidas pelo emprego de várias técnicas de separação: (a) PEG 6000 (b) PEG assistido

pelo segundo antissoro e (c) segundo antissoro.

O estudo comparativo do emprego dessas três técnicas de separação

na curva dose resposta do radioimunoensaio revelou uma sensibilidade maior quando

as separações foram realizadas pelo PEG a 20% ou pelo segundo antissoro assistido

pelo PEG a 10%, do que com o segundo antissoro sozinho (Tabela 10). Acurva separada

pelo PEG assistido pelo segundo anticorpo foi superponível àquela separada pelo

PEG a 20%, apresentando valores de ED50 de 0,19 e 0,21 pmol/mL, respectivamente,

68

contra 0,33 pmol/mL apresentado pela curva separada pelo segundo antissoro que foi

significativamente diferente a nível de p<0,05.

As curvas dose resposta submetidas à regressão linear revelaram que

não houve diferenças significantes a nível de p<0,05 tanto para a inclinação, quanto

para a intercecção das retas obtidas, utilizando-se a técnica de separação pelo PEG

ou pelo segundo antissoro assistido pelo PEG.

Entretanto, devido à necessidade de uma etapa adicional de lavagem

e precipitação, requerida na separação com PEG, diminuir a praticabilidade do ensaio

e poder afetar sua precisão, selecionou-se a técnica de separação pelo segundo

antissoro assistido pelo PEG.

Os resultados das curvas de título obtidas empregando-se soro isento

de pró-insulina, e separadas pelo segundo antissoro assistido pelo PEG na presença

de concentração de soro normal de cobaia variando de 1:100 a 1:500 revelaram uma

precipitação máxima da fração ligada com o segundo antissoro diluído a 1:9 e com o

soro normal de cobaia diluído a 1:200.

Essas diluições foram estabelecidas para a separação dos ensaios

pelo emprego desse lote particular do segundo antissoro Pel-Freez.

Tabela 10- Parâmetros estimados pelo Riakalk das curvas de dose resposta do

radioimunoensaio separadas pelo emprego de PEG a 20%, segundo

antissoro (29 Ac) após 24 h de incubação a 4°C e segundo antissoro

assistido pelo PEG (2Q Ac-PEG), após 1 h de incubação a 23°C.

Técnica de NSB Bo ED50 D M D

separação (%) (%) (pmol/mL) (pmol/mL)

PEG 4,14 29,26 0,21 0,0129Ac 3,30 27,42 0,33 0,0129 Ac-PEG 3,24 23,18 0,19 0,01

69

4.5. DETERMINAÇÃO DA DILUIÇÃO OTIMIZADA DO TRAÇADOR

Os resultados da análise da concentração ideal do traçador, pelo exame

comparativo das curvas de dose resposta indicou que as variações na atividade do

traçador não influenciaram os resultados das curvas dose resposta.

Visto não ter sido observada diferença significante a nível de p<0,05,

tanto na inclinação, quanto na intercecção das retas nos ensaios realizados com

atividades diferentes do traçador, estes foram efetuados com atividade elevada

(aproximadamente 10.000 cpm por tubo), de forma a se reduzir o tempo de contagem

do radioimunoensaio.

4.6. DETERMINAÇÃO DO MEIO DE INCUBAÇÃO DA CURVA DOSE RESPOSTA

A comparação do deslocamento da 125|-nPl pela pró-insulina padrão

na presença dos três meios analisados, soro humano normal, tampão do RIE e soro

humano normal isento de pró-insulina, resultou em curvas praticamente superponíveis

(Tabela 11).

As curvas dose resposta, quando submetidas à regressão linear,

revelaram que as retas não apresentaram diferenças significantes a nível de p<0,05

para a inclinação, intercecção, ou mesmo, para o ED50.

Entretanto, selecionou-se o meio em soro humano normal isento de

pró-insulina por ser o meio que mais se assemelha àquele das amostras desconhecidas.

70

Tabela 11-Parâmetros estimados pelo RIAKALK das curvas de dose resposta

do radioimunoensaio realizadas em: A- soro humano normal

B- soro humano normal isento de pró-insulina e C- Tampão do

radioimunoensaio.

Curva NSB Bo ED50 DMDpadrão (%) (%) (pmol/mL) (pmoI/mL)

A 3,51 10,60B 3,12 9,75C 3,52 12,16

0,230,240,23

0,050,020,01

4.7. ESTUDO COMPARATIVO DOS PADRÕES DE PRÓ-INSULINA

A Figura 11 exibe as curvas dose resposta do radioimunoensaio obtidas

empregando-se os três padrões de pró-insulina preparados.

A análise de regressão linear revelou que as curvas construídas com

os padrões 84/611,509-EM4 e A18-TS9-17 não apresentaram diferenças significantes

a nível de p< 0,05 tanto para a inclinação, como para a intercecção das retas.

Entretanto, a determinação da potência radioimunológica dos padrões

secundários 509-EM4 e A18-TS9-17, em relação ao padrão de referência 84/611,

estimada pela relação entre os valores de ED50 indicou ter, o padrão secundário

A18-TS9-17, potência imunológica menor do que aquela do padrão de referência

84/611 (Tabela 12).

Conclue-se, portanto, que o padrão 509-EM4 é adequado para

substituir o padrão Primário de Referência 84/611 o qual é fornecido em pequena

quantidade pela OMS.

O padrão secundário A18-TS9-17 também poderá ser utilizado para

este fim, desde que se considere sua potência radioimunológica relativa ao padrão

Primário.

71

A análise de regressão linear das curvas dose resposta construídas

com o padrão recém-preparado, e após 2 anos armazenado a -20°C não apresentou

diferenças significantes a nível de p<0,05 para a inclinação, intercecção ou para o

ED50, revelando a estabilidade deste padrão.

100

80

o

PQ

40

20

0,004 0,016 0,063 0,35 1 16

pnaoJ/ml*

Ensaio NSB Bo(pmol/mL)

DMD(pmol/mL)

ABC

3,653,653,65

17,217,217,2

0,100,090,15

0,0030,0170,001

Figura 11- Comparação de curvas padrão do RIE construídas a partir da pró-

insulina: A: lote n9 84/611 ( • • ) B: Lote nQ 509-EM4 (X X) C: Lote n9

A18-TS9-17 ( O O ). Os parâmetros respectivos estimados pelo RIAKALK estão

apresentados na Tabela abaixo da figura.

Tabela 12-Valores das potências radioimunológicas estimadas pelarelação entre os valores de ED50 do padrão primário (84/611) eos padrões secundários.

Lote ED50 potência(pmol/mL) radioimunológica

84/611 0,10 1,0509-EM4 0,09 0,9A18-TS9-17 0,15 1,5

72

4.8. CONTROLE DE QUALIDADE DO RADIO1MUNOENSAIO

4.8.1. ESPECIFICIDADE

Os valores de proinsulinemia de uma amostra com elevado teor de

pró-insulina submetida a diferentes diluições são apresentados na Tabela 13.

O cálculo da média dos 10 resultados obtidos para cada diluição e seu

desvio padrão, bem como as concentrações obtidas a partir do produto de cada média

pelo fator de diluição respectivo, estão apresentados na Tabela 14.

O coeficiente de correlação, determinado entre os volumes de amostra

e as concentrações médias obtidas, foi de 0,999, significante para p< 0,01.

A Figura 12 exibe uma curva padrão do radioimunoensaio de pró-

insulina indicando que os pontos correspondentes às amostras diluídas superpuseram-

se à curva construída com a pró-insulina humana padrão biossintética.

73

4.8.2. EXATIDÃO

O estudo da exatidão desta técnica revelou recuperações variando de

79% a 126% (Tabela 15). O coeficiente de correlação, determinado entre as

concentrações de pró-insulina adicionadas e aquelas de hormônio recuperado, foi de

0,999, significante para p<0,001.

4.8.3. PRECISÃO

A Tabela 16 exibe os valores do teste da precisão intra-ensaio em que

foram dosadas, num mesmo ensaio, 15 replicatas de amostras com teores de pró-

insulina mais baixo, apresentando valores médios de 0,040 ± 0,006 pmol/mL com

coeficiente de variação de 15%. O controle intermediário apresentou valores de

0,010 ± 0,008 pmol/mL com coeficiente de variação de 8% e o controle mais alto

apresentou valores médios de 0,403 ± 0,031 pmol/mL com coeficiente de variação de

8%.

Na análise da precisão inter-ensaio (Tabela 17), os resultados das

dosagens de amostras controle em 15 ensaios consecutivos, realizados com diferentes

traçadores, apresentou valores de 0,038 ± 0,005 pmol/mL, com coeficiente de variação

de 13% para o controle mais baixo. O controle intermediário apresentou valores de

0,079 ± 0,010 pmol/mL, com coeficiente de variação de 12% enquanto que o controle

mais alto apresentou valores médios de 0,298 ± 0,029 pmol/mL, com coeficiente de

variação de 10%.

74

Tabela 13- Valores da pró-insulinemia de uma amostra com teor elevado de

pró-insulina, submetida a diferentes diluições.

MédiaDP(±)CV

Concentração de

1:1.5

0,300,290,300,290,320,290,290,300,290,29

0,300,013,1%

1:2

0,220,220,220,240,240,250,230,250,250,23

0,240,015,1%

pró-insulina

Diluição

1:4

0,120,130,120,120,120,130,120,130,110,12

0,120,014,9%

na amostra

1:8

0,060,060,060,060,060,050,060,060,060,05

0,050,016,9%

(pmol/mL)

1:16

0,030,030,020,030,030,030,040,030,030,03

0,030,0114,9%

Tabela 14- Concentrações obtidas em cinco diluições diferentes de uma amostra

com teor elevado de pró-insulina.

Fator de

diluição

1:1,51:21:41:81:16

MédiaDP(±)CV

Concentração depró-insulina

na amostra diluída(pmol/mL)

0,2960,2350,1220,0580,030

Concentração finalde pró-insulina

(pmol/mL)

0,4440,4700,4880,4640,480

0,4690,0153,2%

75

100

60

o 60

40

20

I I I0.004 0,016 0,063 0,25 16

pmol/mL

Figura 12- Efeito da diluição da amostra comparado à curva padrão de pró-

insulina. ( X X ) amostras diluídas

Tabela 15- Concentrações obtidas na prova de recuperação da pró-insulina,

adicionando quantidades crescentes deste hormônio a uma amostra

de concentração de pró-insulina conhecida (0,026 pmol/mL).

Pró-insulinaadicionada(pmol/mL)

0,0190,0630,2501,0004,000

Pró-insulinadeterminada*

(pmol/mL)

n COP, •+• n n n ^\J,\JtL\J X U|UUO

0,041 ± 0,0050,089 ± 0,0090,349 ± 0,0420,950 ±0,1504,058 ±0,718

Pró-insulinarecuperada(pmol/mL)

0,0150,0630,3230,9504,032

Recuperação

%

7910012695

100

*Média ± DP

76

Tabela 16- Valores da concentração de pró-insulina das amostras controlecom teor baixo, médio e alto, determinados num mesmo ensaio.

Controle Controle Controle

baixo médio alto

(pmol/mL) (pmol/mL) (pmol/mL)

0,035

0,036

0,040

0,040

0,041

0,054

0,033

0,041

0,033

0,037

0,037

0,040

0,054

0,045

0,042

Média 0,040

DP(±) 0,006

CV 15%

0,089

0,093

0,099

0,105

0,089

0,101

0,091

0,114

0,107

0,089

0,108

0,093

0,092

0,095

0,104

0,10

0,008

8%

0,378

0,393

0,368

0,396

0,410

0,473

0,454

0,383

0,433

0,393

0,360

0,419

0,369

0,402

0,418

0,403

0,031

8%

11

Tabela 17- Valores de proinsulinemia (pmol/mL) relativos ao estudo daprecisão inter-ensaio.

MédiaDP(±)CV

N9deensaio

123456789

101112131415

Controlebaixo

0,0430,0360,0440,0390,0370,0310,0350,0400,0310,0350,0390,0340,0480,0430,032

0,0380,005

13%

Controlemédio

0,0980,0750,0790,0830,0740,0790,0930,0700,0690,0680,0890,0710,0720,0760,091

0,0790,010

12%

Controlealto

0,3110,3080,2950,3180,3210,3330,3000,2710,2630,2590,2690,2920,2610,3220,355

0,2980,029

10%

4.8.4. SENSIBILIDADE

Uma curva dose resposta típica do radioimunoensaio e seu perfil de

imprecisão são apresentados na Figura 13. Os parâmetros de sensibilidade de 20

curvas dose resposta, realizadas nas condições de ensaio estabelecidas, apresentaram

boa reprodutibilidade mesmo empregando diferentes traçadores (Tabela 18). Os valores

de NSB permaneceram constantes e abaixo de 4%. A sensibilidade do ensaio (DMD)

variou de 0,003 a 0,017 pmol/mL (0,008 ± 0,004 pmol/mL), enquanto que os valores

médios de ED50 foram de 0,12 ± 0,01 pmol/mL (média ± DP). A região de confiança

da curva variou de 0,03 a 0,39 pmol/mL, com um erro menor do que 20%.

78

SO

60

40.

*$80

.003 16.25

pmol/mL pmoI/oiL

Figura 13- Curva dose resposta típica do radioimunoensaio de pró-insulina (médiade determinações em triplicata - esquerda) e seu respectivo perfil de imprecisão (direita)traçados pelo RIAKALK.

Tabela 18- Parâmetros de sensibilidade das curvas padrão determinados comdiferentes traçadores e calculados pelo programa computacionalRIAKALK.

EnsaioNs

123456789

1011121314151617181920

Média±DP

NSB(%)

3,652,723,132,763,463,483,233,473,772,853,853,344,133,843,793,933,323,053,193,18

3,410,39

Bo(%)

17,2222,5627,3220,9223,9817,4717,0228,2422,9120,5524,2726,3724,2124,5025,2123,2219,9019,8720,0620,19

22,293,20

ED50(pmol/mL)

0,100,100,120,130,110,140,140,140,130,110,120,120,120,130,110,150,120,120,120,11

0,120,01

DMD(pmol/mL)

0,0030,0050,0050,0170,0060,0110,0170,0100,0100,0070,0060,0030,0110,0120,0030,0060,0050,0070,0060,004

0,0080,004

79

4.9. ANÁLISE DA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO DA PRÓ-INSULINA DO SORO

A recuperação média da pró-insulina extraída do soro empregando-se

cartuchos de Sep-Pak C-\Q foi de 90 ± 1% para a 125|_hPi, enquanto que os valores de

recuperação da pró-insulina não marcada variaram de 69 a 113 % (Tabela 19). O

coeficiente de correlação entre os valores teóricos de pró-insulina padrão e os obtidos

após a sua extração foi de 0,999, significante para p< 0,001.

Tabela 19- Valores da recuperação da pró-insulina adicionada ao soro isento

de pró-insulina submetido à extração em cartuchos de Sep-Pak C-jg-

Concentração teórica Concentração obtida*

(pmol/mL) (pmol/mL)

Recuperação

0,016

0,031

0,062

0,125

* Média ± DP

0,011 ±0,001

0,033 ± 0,004

0,058 ±0,011

0,141 ±0,004

69

106

93

113

4.10. ANÁLISE DA TÉCNICA DE CONCENTRAÇÃO DO SORO

Quando submetidas ao radioimunoensaio, observou-se que as

amostras de soro extraídas, lidas na região de confiança do ensaio (erro menor do que

20%), apresentaram valores de pró-insulina muito semelhantes após divisão pelo fator

de concentração empregado. Os resultados da determinação da pró-insulina no soro

de 18 indivíduos normais, após esse procedimento, estão apresentados na Tabela 20.

A amostra de soro controle, contendo 0,05 pmol/mL de pró-insulina

60

padrão, que foi extraída em 5 ensaios diferentes apresentou concentração média de

0,055 ± 0,007 pmol/mL, com coeficiente de variação de 12%.

Tabela 20- Concentrações de pró-insulina encontradas em soro de indivíduosnormais extraído em Sep-Pak C18, antes e após divisão pelofator de concentração.

Indivíduo

JSSSAATNSSMASIALNDVLMSDLOJSSMEPAMASSEJOBSNCPAMSKMKEM

Sexo

FMMMFFFMFFMMFMFM

Idade(anos)

27262425263234223127192938302526

Pró-insulina(concentrada 2

vezes)

0,0320,0320,0420,0500,0320,0300,0380,0340,0360,0440,0500,0460,0580,0420,0340,048

Pró-insulina(pmol/mL)

0,0160,0160,0210,0250,0160,0150,0190,0170,0180,0220,0250,0230,0290,0210,0170,024

Região de confiança do ensaio: 0,03-0,39 pmol/mL

4.11. VALIDAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO

As Tabelas 7 - Anexo a 9 - Anexo exibem as características metabólicas

individuais referentes aos grupos normais, insuficientes renais crônicos e insulinomas

estudados para a validação do radioimunoensaio.

As Tabelas 21 e 22 exibem os resultados dos valores médios ± DP ou

as medianas, mínimo e máximo; e a análise estatística comparativa entre as

características metabólicas dos indivíduos estudados.

81

As Figuras 14 e 15 ilustram os resultados médios ± DP na forma de

gráficos de barra.

No grupo de insuficientes renais crônicos observou-se, como era

esperado, um aumento significativo a nível de p< 0,01 nas concentrações de uréia e

creatinina em relação ao grupo dos indivíduos normais. Pôde-se observar, também,

uma diferença significante nos níveis de glicose, HbA1c, peptídeo-C e pró-insulina

(p<0,01), assim como nas relações molares Pl/I (p<0,05) e l/peptídeo-C(p<0,01).

Observando-se os indivíduos com insulinoma, verificou-se uma

diferença altamente significante a nível de p<0,001 para os níveis de glicose, insulina,

peptídeo-C e pró-insulina em relação ao grupo de indivíduos normais. Esta diferença

foi observada, também, na relação molar Pl/I, porém a relação l/peptídeo-C permaneceu

igual para os dois grupos.

82

0.050-1

Ia.g 0.025

§

0.000

0.15n

0.10-

Q.

<0

= 0.05(0

c

0.00

1.0-1

0.5-

0.0

Normal I.R.C.

- N.S.

Normal I.R.C.

p<0,05

Normal I.R.C.

Figura 14- Concentração basal média ± DP de pró-insulina, insulina e relação

molar PI/I em soro de indivíduos normais • e pacientes com insuficiência renal crônica

(IRC) •

83

I

0.4n

0.3-

0.2-

(0.£ o.iH

0.0-

1.0-

0.5-

0.0

p<0,0001

Normal Insulinoma

E

[pm

o

CO

c

Insu

li

0.4-

0.3-

0.2-

0.1-

n n~

p<0,0001

Normal Insulinoma

p<0,0001

Normal Insulinoma


molar PI/I em soro de indivíduos normais Q e pacientes com insulinoma | .

84

4.12. APLICAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO NO ESTUDO DO DIABETES

MELLITUS TIPO II ASSOCIADO À OBESIDADE.

As Tabelas 10 a 12 - Anexo exibem as características metabólicas

individuais referentes aos grupos dos obesos não diabéticos, e dos indivíduos com

Diabetes Tipo II não obesos e obesos. Explica-se os valores de HbA1c ausentes para

alguns pacientes devido à falta do conjunto diagnóstico.

As Tabelas 23 e 24 exibem os resultados dos valores médios ± DP ou

as medianas, mínimo e máximo, e a análise estatística comparativa realizada entre os

diversos grupos estudados.

As Figuras 16 e 17 ilustram os resultados médios ± DP na forma de

gráficos de barra.

Quando os grupos controle de mulheres normais e obesas foram

comparados, observou-se que houve diferença significante a nível de p<0,001 nos

níveis séricos de insulina, e a relação molar Pl/I apresentou diferença significante a

nível de p<0,05.

Os indivíduos diabéticos Tipo II não obesos e obesos, quando

comparados na mesma tabela, apresentaram, entre si, diferenças significantes a nível

de p<0,05 somente no nível sérico de insulina, porém a relação molar Pl/I não

apresentou diferença significante.

Os resultados comparativos dos indivíduos normais com indivíduos

diabéticos Tipo II não obesos revelaram diferenças significantes nos níveis de glicose

(p<0,001), HbA1c (p<0,05) e pró-insulina (p<0,05) acompanhado de diferença a nível

de p<0,05 para a relação molar Pl/I.

O grupo de diabéticos Tipo II obesos comparado ao grupo controle

dos obesos apresentou diferenças significantes a nível de p<0,01 nos níveis de glicose,

HbA1c, peptídeo-C e pró-insulina. O mesmo foi verificado nas relações molares Pl/I e

l/peptídeo-C. Entretanto, a concentração basal de insulina foi igual para os dois grupos.

85

Tabela 21- Comparação entre as características metabólicas dos pacientes com

insuficiência renal crônica e indivíduos normais.

Uréia

Creatinina

Glicose

HbA1c

Insulina

Peptídeo-C

Pró-insulina

Pl/I

l/pept.-C

Normais

26,5(15-44)

0,75(0,4-1,2)

88(76-103)

5,3(3,8-7,0)

0,06(0,04-0,08)

0,3(0,13-0,66)

0,02 ± 0,01

0,34(0,22-0,51)

5,3(3,8-7,0)

Insuficientesrenais

164(30-256)

11(2,3-15,6)

97(66-130)

7,8(4,7-10,8)

0,06(0,02-0,19)

2,32(0,07-4,86)

0,04 ± 0,01

0,44(0,19-1,5)

7,8(4,7-10,8)

significância(P)

<0,001

<0,001

<0,05

<0,01

NS<0,001

<0,001

<0,05

<0,01

Os valores correspondem à média ± DP e a mediana, mínimo

e máximo (entre parênteses).

Tabela 22- Comparação entre as características metabólicas dos pacientes

com insulinoma e indivíduos normais.

Glicose

Insulina

Peptídeo-C

Pró-insulina

Pl/I

l/pept.-C

Normais

86,9 ± 7,43

0,06(0,04-0,08)

0,30(0,13-0,66)

0,02(0,01-0,03)

0,34(0,22-0,51)

0,20(0,08-0,32)

Insulinoma

38,8 ±12,0

0,23(0,09-0,56)

1,27(0,43-1,86)

0,22(0,11-0,33)

0,90(0,60-1,40)

0,20(0,10-0,30)

significância

(P)

<0,0001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

NS

Os valores correspondem à média ± DP e a mediana, mínimo

e máximo (entre parênteses).

Tabela 23- Comparação entre as características metabólicas dos pacientesobesos em relação aos indivíduos normais e pacientes diabéticosobesos em relação a diabéticos não obesos.

glicose

HbA1c

Insulina

Peptídeo-C

Pró-insulina

Pl/I

I/Pept.-C

Não diabéticos

não obesos

86,9 ± 7,4

5,3(3,8-7,0)

0,06(0,04-0,08)

0,31(0,16-0,66)

0,02(0,01-0,03)

0,34(0,22-0,51)

0,20(0,08-0,32)

obesos

91,9 ±10,4

5,6(3,8-7,7)

0,10(0,05-1,38)

0,34(0,02-1,13)

0,02(0,01-0,04)

0,25(0,01-0,51)

0,33(0,10-10,4)

P

NS

NS

<0,001

NS

NS

<0,05

<0,05

Diabéticos

não obesos

270 ± 87

15,1(8,3-16,4

0,06 ± 0,01

0,51 ± 0,37

0,03 ± 0,01

0,54(0,29-0,73)

0,09(0,08-0,76)

obesos

313 ±89

9,5(8,0-17,3)

0,09 ± 0,01

0,78 ± 0,49

0,05 ± 0,02

0,49(0,35-1,2)

0,13(0,06-0,29)

P

NS

NS

<0,05

NS

NS

NS

NS

Os valores correspondem à média ± DP e a mediana, mínimo e máximo (entre parênteses).

09O)

Tabela 24- Comparação entre as características metabólicas dos indivíduosnão obesos e obesos em relação aos indivíduos diabéticos Tipo IInão obesos e obesos.

Glicose

HbA1c

Insulina

Peptídeo-C

Pró-insulina

Pl/I

I/Pept.-C

Não obesos

Controle Diabéticos

88(76-103) 326(174-340)

5,3(3,8-7,0) 15,1(8,3-16,4)

0,06(0,04-0,08) 0,06(0,05-0,08)

0,30(0,05-0,66) 0,59(0,09-0,99)

0,02(0,01-0,03) 0,03(0,02-0,05)

0,34(0,22-0,51) 0,54(0,29-0,73)

0,20(0,08-0,32) 0,09(0,08-0,76)

P

<0,0001

<0,01

NS

NS

<0,05

<0,05

NS

Obesos

Controle

91(78-109)

5,6(3,8-7,7)

0,1(0,05-1,38)

0,42 ± 0,34

0,024(0,01-0,04)

0,25(0,01-0,51)

0,33(0,10-10,4)

Diabéticos

319(185-471)

9,5(8,0-17,3)

0,09(0,07-0,11)

0,78 ± 0,49

0,05(0,02-0,10)

0,49(0,35-1,2)

0,13(0,06-0,29)

P

<0,0001

<0,0001

NS

<0,05

<0,01

<0,001

<0,01

Os valores correspondem à média ± DP e a mediana, mínimo e máximo (entre parênteses).

05

88

0.075-

0.000Normal Diabéticos

Normal Diabéticos

1.00-1

0.75-

0.50-

0.25-

0.00Normal Diabéticos


molar Pl/I em soro de indivíduos não obesos f j e obesos | .

89

0.075-1

0.000Não obesos Obesos

IT 0.4-2s

| 0.3-

g 0.2-MM

3g 0.1-•MM

n n-

NS

N.S.

IINão obesos Obesos

1.00-n

0.75-

0.50-

0.25-

0.00Não obesos Obesos


molar Pl/I em soro de indivíduos normais r j e pacientes com diabetes Tipo II | -

90

5. DISCUSSÃO

A- PREPARO E CONTROLE DE QUALIDADE DOS REAGENTES


5.1. AVALIAÇÃO DOS ANTISSOROS ANTI-PRÓ-INSULINA HUMANA.

A maior dificuldade no desenvolvimento de um sistema de

radioimunoensaio é a de obter-se antissoros com as características necessárias de

avidez e especificidade indispensáveis para a obtenção de radioimunoensaios sensíveis

e específicos (107).

Freqüentemente, é dito que a produção de anticorpos é mais uma arte

do que ciência e vários métodos têm sido empregados na tentativa de se obter antissoros

adequados (107). Entretanto, numerososos fatores podem influenciar o provável

sucesso dessa produção, desde a imunogenicidade do antígeno, a espécie animal

imunizada, esquema de imunização, até o emprego ou não de adjuvantes.

Outro fator, que aumenta a resposta do sistema imunitário na produção

de antissoros, é o emprego do adjuvante de Freund completo o qual contém bacilos da

tuberculose inativados. Quando injetados juntamente com o imunógeno, este potência

a resposta do organismo contra ele já que, retarda a absorção do antígeno no locai da

injeção, facilita a fagocitose do imunógeno pelos macrófagos, origina a formação local

de lesão granulomatosa e causa estímulo, tanto local quanto geral, do sistema retículo

endotelial.

Embora poucos laboratórios tenham desenvolvido radioimunoensaios

homólogos empregando antissoros contra pró-insulina biossintética (54,55,57-59), o

título fornecido pelo antissoro não purificado, obtido imunizando-se cobaias com

pequenas doses de pró-insulina (50 ug), foi semelhante aquele obtido por Deacon e

Conlon (55). Este porém, foi menor do que aquele obtido por Yoshioka e cols. (58) que

também empregaram cobaias, dose e esquema de imunização similares para a

91

obtenção do antissoro anti-pró-insulina.

Constatou-se que, assim como nós obtivemos títulos mais baixos

imunizando cobaias com doses maiores do imunógeno, o mesmo aconteceu com

relação aos antissoros obtidos imunizando cobaias (54), carneiros (57) e cabras (59),

empregando doses maiores do imunógeno, a partir de 100 ug.

Esse efeito foi descrito por Vaitukaitis e cols. (80) quando produziram

antissoros para hormônios peptídicos e esteroídicos com títulos altos, ministrando doses

pequenas do imunógeno, emulsificado em adjuvante de Freund, em sítios intradérmicos

de coelhos.

Embora não tenha sido possível estabelecer comparações entre os

diferentes procedimentos de imunização, empregados para a otenção dos antissoros,

obtivemos um antissoro com título e avidez adequados para o radioimunoensaio, pelo

emprego de doses baixas do imunógeno.

Este resultado revelou que é possível a imunização de um número

maior de animais, apresentando uma taxa de mortalidade reduzida em decorrência da

hipoglicemia que pode ser controlada pela administração de glicose via oral.

O emprego da cromatografia de afinidade como técnica de separação

de rotina iniciou-se em 1967 quando Axén e cols. (108) descreveram um procedimento

de acoplamento de moléculas contendo grupos amina primários a matrizes de

polissacarídeos ativadas por CNBr. Logo em seguida, Cuatrecasas (109) empregou

esta técnica acoplando insulina à Sepharose ativada e demonstrou que a atividade

biológica da insulina não foi alterada.

O resultado obtido no acoplamento da insulina à Sepharose ativada

em nossos laboratórios (13 ± 2%) foi semelhante ao encontrado por Cuatrecasas (109)

para o acoplamento do mesmo peptídeo (9%).

Porém, devido a grande toxicidade do CnBr associada a dificuldades

na execução da técnica de acoplamento, acreditamos que a resina ativada obtida

comercialmente seja a mais indicada, a despeito de seu custo mais alto.

Apesar de ter havido uma redução de 1:24.000 para 1:15.000 no título

do antissoro purificado, ele tomou-se altamente específico após sua adsorção contra

92

insulina e peptídeo-C-Sepharose.

O antissoro purificado obtido não reconheceu, nem a insulina ou o

peptídeo-C, mas reagiu cruzadamente com o intermediário de conversão da pró-insulina

65,66-split, indicando que o antissoro reconheceu, principalmente, a junção entre a

cadeia B e o peptídeo-C.

Este resultado sugere que existe uma especificidade similar ao

antissoro obtido por Cohen e cols. em 1985 (54) e ao anticorpo 18 D obtido em 1986

(56), os quais também reconheceram, principalmente, o intermediário de conversão

65,66-split-pró-insulina. Os antissoros obtidos por Deacon e cols. (55) e Yoshioka e

cols. (58), embora também reconhecessem, principalmente, a junção entre a cadeia B

e o peptídeo-C, apresentaram reação cruzada também com o intermediário de

conversão 64,65-des-pró-insulina.

Embora a possibilidade de clivagem da pró-insulina na corrente

sanguínea seja muito pequena (18), há evidências de que quantidades consideráveis

de intermediários de conversão existam no sangue (77,78), complicando a medida da

pró-insulina na circulação.

O desenvolvimento de ensaios imunoenzimático (71) e

imunorradiométrico (72), capazes de determinar individualmente a concentração de

pró-insulina intacta e seus intermediários de conversão, possibilitaram alguns

conhecimentos a mais, à respeito da biossíntese da insulina.

Observou-se, nestes estudos, uma concentração muito reduzida de

65,66-split pró-insulina presente no plasma, indicando que este derivado de conversão

não interfere com a especificidade do ensaio de pró-insulina. Observou-se, também,

que, por causa da enzima carboxypeptidase presente no plasma, a maioria das

moléculas circulantes relacionadas à pró-insulina foram a 64,65-des e a 31,32-des,

com predominância da forma 31,32-des pró-insulina (110). Estes resultados foram

confirmados recentemente através da análise em HPLC (76,78).

Como o antissoro obtido em nossos laboratórios identifica,

principalmente, o derivado de conversão 65,66-split, e ele está presente em

concentração muito reduzida no soro, podemos considerar que o radioimunoensaio

93

padronizado determina, basicamente, a concentração de pró-insulina intacta.

A análise do antissoro pelo estudo de sua avidez através da análise

de Scatchard revelou valor da constante de afinidade (Ka) de 10 1 0 L/mol.-Este valor é

concorde com o descrito na literatura para obtenção de ensaios sensíveis, que deve

ser, no mínimo, da ordem de 10^ L/mol (111). O estudo da cinética de precipitação

permitiu a padronização de um ensaio mais rápido, com um tempo total de incubação

de 28 h.

Esta característica diferenciou o ensaio dos demais radioimunoensaios

obtidos por Cohen e cols. (54,56), Deacon e Conlon (55) e Yoshioka e cols. (58) que

necessitaram de 96 a 120 h de incubação. O mesmo foi observado no radioimunoensaio

desenvolvido por Hampton e cols. (57) que necessitou de 50 h de incubação, ou no

ensaio obtido por Bowsher e cols. (59) que empregou 43 h de incubação, porém à

temperatura ambiente.

Portanto, o emprego deste antissoro permitiu o desenvolvimento de

um ensaio rápido e simples para a medida da pró-insulina em amostras séricas, sem a

necessidade da separação inicial da insulina e peptídeo-C, conforme relatos da literatura

(32,33,51).

5.2. PREPARO E CONTROLE DE QUALIDADE DO TRAÇADOR

O antígeno empregado na marcação deve ser extremamente puro (112)

a fim de permitir o preparo de um traçador adequado para seu uso em radioimunoensaio.

A pró-insulina fria, empregada neste trabalho, quando submetida à EGPA por ocasião

da sua primeira radioiodação, mostrou um único componente (Figura 5), sendo

confirmado, portanto, o elevado grau de pureza deste pró-hormônio.

Embora o método de marcação pelo lodogen seja amplamente

empregado na marcação de proteínas, somente Deacon e Conlon o empregaram na

marcação da pró-insulina, obtendo traçadores com atividade específica de 45 uCi/ug

(55).

A atividade específica determinada para 18 traçadores preparados em

94

nossos laboratórios apresentou valor médio de 6,0 ± 0,3 MBq/ug (168 ± 8 uCi/ug),

portanto, maior do que o obtido por Deacon e Conlon. Cohen e cols. (54) e Bowsher e

cols. (59) no entanto, obtiveram valores um pouco maiores, aproximadamente 210

uCi/ug, empregando o método de marcação pela lactoperoxidase.

A sensibilidade do radioimunoensaio é criticamente dependente da

qualidade do traçador. Embora a purificação do monoiodo-125l-tyr(A14)-hPI pelo uso

de HPLC tenha sido descrito (113), e Bowsher e cols. (59) tenham obtido ensaios

mais sensíveis empregando este método, este aparelho não está disponível em nossos

laboratórios. Além disso, este método tem a desvantagem de, o aparelho, tornar-se

altamente contaminado com radioatividade.

Entretanto, o emprego de cromatografia de troca aniônica em QAE-

Sephadex A-25 proporcionou o preparo de traçadores com elevada pureza, mantida

mesmo após 3 meses de estocagem a -20°C. Nesse período, o traçador apresentou

pequena liberação de ^25| e conservou seus valores de Rm característicos (Figura 8).

As curvas padrão obtidas com esse traçador, após longo período de

estocagem, mostraram-se paralelas (Figura 9) sendo que os valores de ligação

inespecífica mantiveram-se praticamente inalterados, variando de 3,1 a 3,6%, bem

como os da ligação específica que oscilaram de 23,9 a 25,8%.

Os valores de ED50 também não sofreram variação significante após

o tempo de estocagem, variando de 0,26 a 0,28 pmol/mL. A sensibilidade dos ensaios

realizados com este traçador também permaneceu inalterada variando de 0,04 a

0,06 pmol/mL

Portanto, o uso do lodogen, um método reprodutível, suave e barato

para marcação de proteínas seguido por purificação em QAE-Sephadex A-25 resultou

em traçadores com atividade específica e pureza elevadas bem como com estabilidade

adequada para seu emprego no radioimunoensaio.

95


RADIOIMUNOENSAIO.

5.3. OBTENÇÃO DE SORO ISENTO DE PRÓ-INSULINA E ANÁLISE DO

PADRÃO DO RADIOIMUNOENSAIO.

A identidade de condições entre o hormônio padrão e as amostras

desconhecidas é requisito indispensável para a realização de um radioimunoensaio

específico e preciso (114). Portanto, tornou-se necessário o preparo de um soro isento

de pró-insulina para diluir a pró-insulina padrão que estaria, então, em condições

semelhantes àquelas das amostras sanguíneas a serem dosadas.

O tratamento do soro com carvão ativado que foi a metodologia de

escolha, além de sua praticabilidade e custo reduzido, foi também a metodologia

empregada nos radioimunoensaios desenvolvidos por Deacon e Conlon (55), Hampton

e cols. (57) e Bowsher e cols. (59).

Em nossos estudos, o padrão de pró-insulina preparado em tampão

de ensaio contendo 1 % de albumina bovina e armazenado a -40°C permaneceu estável

por período de até 2 anos. Embora tenha sido descrito que o padrão fornecido pela

WHO sofre perdas anuais de 4,5% quando o padrão é estocado a -20°C (115), Bowsher

e cols. (59) também observaram estabilidade superior a 2 anos, quando o padrão foi

preparado em tampão de ensaio contendo 0,6% de NaCI e 3% de albumina bovina e

permaneceu estocado a esta temperatura.


RADIOIMUNOENSAIO.

O PEG precipita proteínas de alto peso molecular e acelera a reação

de ligação do antígeno ao anticorpo (116). Conseqüentemente, o PEG é amplamente

utilizado em radioimunoensaios como um reagente para facilitar a separação entre o

antígeno livre e o ligado. Neste estudo, o uso de PEG resultou em completa separação

96

em 1 h, enquanto, o tratamento com o segundo antissoro sozinho, requereu uma

incubação de 24 h. Embora o uso do PEG 20% tenha produzido níveis equivalentes

de Bo e de NSB em relação àqueles encontrados pelo PEG assistido pelo segundo

antissoro (Tabela 10), a necessidade de uma precipitação adicional diminui a

praticabilidade do ensaio e pode interferir na sua acuracidade.

A técnica de separação do ensaio adicionando PEG ao segundo

antissoro foi crítica para a separação completa entre a pró-insulina ligada e a livre,

além de reduzir, significativamente, o tempo de incubação do ensaio.

Os resultados indicaram que uma solução de PEG a 10% foi a

concentração ideal para a completa separação da curva dose resposta do

radioimunoensaio, sem afetar a ligação inespecífica do ensaio.

5.5. CONTROLE DE QUALIDADE DO RADIOIMUNOENSAIO.

Após o desenvolvimento e padronização do radioimunoensaio,

submeteu-se esta técnica a um rigoroso controle de qualidade, visando a garantir, ao

longo do tempo, a qualidade dos reagentes empregados bem como a detecção de

alguma falha na execução técnica do método.

O controle de qualidade foi realizado pela análise dos parâmetros de

especificidade, exatidão, precisão e sensibilidade do radioimunoensaio que são

indispensáveis para a validação do método (97-100).

Em relação a especificidade do método, os valores da concentração

de pró-insulina, determinados na amostra diluída, foram muito semelhantes quando

multiplicados pelos respectivos fatores de diluição, apresentando C.V. de 3,2% (Tabela

14). A existência de correlação significante entre o fator de diluição da amostra analisada

e a pró-insulina determinada (p<0,001) confirma a especificidade do radioimunoensaio.

A superposição dos pontos referentes às diferentes diluições da

amostra contendo elevado teor endógeno de pró-insulina, com os da curva padrão

construída a partir da pró-insulina humana biossintética (Figura 12) permitiu verificar a

idêntica imunorreatividade de ambas as pró-insulinas (endógena e padrão), condição

97

essencial para todo radioimunoensaio.

Estes resultados são concordes com aqueles descritos por Deacon e

Conlon (55) e Hampton e cols. (57) para a análise desse parâmetro do radioimunoensaio

de pró-insulina, por eles, desenvolvido.

A análise da exatidão do método apresentou, também, coeficiente de

correlação significativo para p<0,001 entre a concentração de pró-insulina adicionada

e aquela recuperada, apresentando recuperações variando de 79 a 126% (Tabela 15).

Estes valores de recuperação estão de acordo com os descritos por

Hampton e cols. (57), Yoshioka e cols. (58) e Bowsher e cols. (59) para o

radioimunoensaio em sistema de ensaio em não-equilíbrio.

No estudo da reprodutibilidade intra-ensaio obtiveram-se valores

aceitáveis de coeficiente de variação para os três níveis considerando-se um ensaio

em não-equilíbrio (Tabela 16). Os valores variaram de 8 a 15% para os controles mais

alto e mais baixo respectivamente. O mesmo pode ser observado no estudo da

reprodutibilidade inter-ensaio (Tabela 17), quando foram realizados ensaios com

diversos traçadores obtendo-se valores de coeficiente de variação que oscilaram de

10 a 13%.

Esta precisão foi semelhante à obtida por Bowsher e cols. (59) no

radioimunoensaio em não-equilíbrio, porém utilizando temperatura de incubação mais

alta, visando a diminuir o tempo de execução do ensaio. Outros autores que empregaram

um tempo de incubação maior, obtiveram valores de precisão um pouco melhores,

inferior a 12% (55,57,58).

Embora um dos inconvenientes do sistema de radioimunoensaio em

não- equilíbrio seja a diminuição na reprodutibilidade do método (117), nossos resultados

mostraram que foi possível obter um radioimunoensaio mais rápido, mesmo

empregando incubação à temperatura baixa (4°C) e manter a precisão dos resultados.

A sensibilidade do radioimunoensaio desenvolvido

(0,008 ± 0,004 pmol/mL) foi semelhante àquela descrita por alguns autores (54-56)

embora seja inferior àquela relatada por Yoshioka e cols. (58) e Bowsher e cols. (59)

que obtiveram DMD de 0,002 pmol/mL e 0,0035 pmol/mL, respectivamente.

98

Consequentemente, como a maioria dos radioimunoensaios de pró-insulina, o presente

ensaio não foi suficientemente sensível para medir os níveis de pró-insulina em

indivíduos normais sem o uso de técnicas de extração, e subsequente, concentração.

Entretanto, sua sensibilidade foi adequada para a medida da pró-insulina em pacientes

com pró-insulinemia.

Portanto, o radioimunoensaio desenvolvido mostrou-se específico,

preciso e exato pela análise de seu controle de qualidade, permitindo a realização de

ensaios e obtenção de resultados válidos.

5.6. ANÁLISE DA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DA PRÓ-

INSULINA DO SORO

A técnica de extração da pró-insulina utilizando cartuchos de Sep-Pak

C-|8 e sistema Savant Speed-Vac para concentrar ás amostras, apresentou uma

recuperação de 90% empregando a 125l-pró-insulina e 93 -113% empregando a pró-

insulina padrão. O resultado foi, portanto, melhor do que o encontrado por Cohen e

cols. que obtiveram 70% de recuperação empregando a 125l-hPI, e 75% empregando

a pró-insulina padrão (56).

A boa reprodutibilidade desta técnica foi observada através do C.V. de

12% encontrado para a amostra controle em 5 extrações realizadas em ensaios

diferentes, sendo empregada, portanto, como método de extração da pró-insulina

presente em baixas concentrações no soro dos indivíduos normais.

5.7. VALIDAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO

A validade deste radioimunoensaio foi confirmada por sua aplicação

na determinação da proinsulinemia em indivíduos normais e com níveis de pró-insulina

elevados, como insuficientes renais crônicos e pacientes com insulinoma.

99

5.7.1. INDIVÍDUOS NORMAIS

Os valores de pró-insulinemia de jejum, determinados nos indivíduos

normais empregando-se a técnica de extração da pró-insulina em Sep-Pak,

apresentaram valor médio e respectivo desvio padrão da média de

0,015 ± 0,004 pmol/mL (Tabela 20), com uma recuperação de, aproximadamente, 106%

para a amostra concentrada duas vezes.

Os resultados obtidos foram semelhantes aos descritos por Deacon e

Conlon (0,015 ± 0,009 pmol/mL) que utilizaram anticorpo contra a junção B-peptideo-

C e extração alcoólica da pró-insulina do soro (55). Cohen e cols. que também

empregaram um anticorpo semelhante e extração em Sep-pak, obtiveram valores

normais médios de 0,005 ± 0,002 pmol/mL, com uma recuperação de 75% (56) valores

esses, semelhantes aos obtidos por Yoshioka e cols. (0,006 ± 0,003 pmol/mL) e Bowsher

e cols (0,004 ± 0,0003 pmol/mL) que não empregaram técnicas de extração (58,59).

Embora Deacon e Conlon (55) e Cohen e cols. (56) tivessem

empregado antissoros anti-pró-insulina semelhantes, e um radioimunoensaio de insulina

que apresentava reação cruzada com a pró-insulina, eles encontraram diferentes valores

de relação molar entre pró-insulina e insulina (Pl/I) de 0,21 e 0,05, respectivamente.

Yoshioka e cols. (58) fez a correção desta reação cruzada da pró-

insulina no radioimunoensaio de insulina e encontrou valor de relação molar Pl/I de

0,16 empregando um antissoro anti-pró-insulina semelhante.

Haffner e cols. (66) encontrou um valor de relação molar de 0,9

empregando um radioimunoensaio de insulina que não reconhecia a pró-insulina e um

antissoro anti-pró-insulina que reconheceu os intermediários de conversão 32,33-split

e 31,32-des pró-insulina.

Nossos resultados apresentaram uma relação molar Pl/I de 0,34,

empregando o mesmo antissoro anti-insulina empregado por Haffner e cols., porém

nosso antissoro anti-pró-insulina não reconheceu os intermediários de conversão 32,33-

split e 31,32-des pró-insulina.

Temple e cols. (73) encontraram um valor de relação molar de 0,24 e

100

Nagi e cols, de 0,39 (75), empregando um ensaio imunorradiométrico específico para

a dosagem de pró-insulina e 32,33-split pró-insulina e outro específico para a dosagem

de insulina.

Estes valores revelaram, portanto, uma variação muito grande de

resultados entre um ensaio e outro o quê dificultou possíveis comparações.

5.7.2. INSUFICIÊNCIA RENAL CRÔNICA

O grupo de pacientes com insuficiência renal crônica apresentou

aumento significativo (p< 0,001) no nível basal de pró-insulina em relação aos indivíduos

normais com aumento na relação molar Pl/I de 0,34 para 0,44. A relação insulina/

peptideo-C também aumentou de 5,3 para 7,8. Esses dados são concordes com os

descritos por Jaspan e cols. que, embora tenham empregado métodos indiretos na

dosagem da pró-insulina, obtiveram resultados similares (41). Kao e cols. (79),

empregando ensaio imunoenzimático, também encontraram valores aumentados de

pró-insulina em 70% dos pacientes estudados, concluindo que, em pacientes com

insuficiência renal crônica, a pró-insulina não deve ser empregada para o diagnóstico

de insulinoma.

O "clearance" da pró-insulina ocorre preferencialmente nos rins,

segundo estudos realizados por Katz e cols. (25). No entanto, como o da insulina

ocorre predominantemente no fígado, também era esperado que a pró-insulina fosse

depurada por esta via (27).

Estudos realizados por Zilker e cols. (26) indicaram que esse

mecanismo de depuração fora dos rins na presença de insuficiência renal, parece não

ser suficiente. Seus resultados indicaram que houve uma redução de 2,6 vezes no

"clearance" da pró-insulina onde, 39% do processo foi extrarenal e 6 1 % renal.

Portanto, a causa provável desta elevação de pró-insulina e

peptídeo-C em relação à insulina, nos pacientes com insuficiência renal, deve-se ao

fato da falência dos rins em depurar estes peptídeos e o "clearance" hepático deles ser

mais lento que o da insulina.

101

5.7.3. INSULINOMA

As concentrações basais de pró-insulina encontradas nos pacientes

com insulinoma foram significativamente maiores (p< 0,001) do que as encontradas

em indivíduos normais, apresentando uma relação molar Pl/I de 0,90. Este valor é

semelhante àqueles relatados na literatura (42,44,56,57,64), cujas relações molares

foram de 0,77, 0,66, 0,55, 1,04 e 0,50, respectivamente, empregando, também,

antissoros contra insulina que reagiam cruzadamente com a pró-insulina e variados

métodos de detecção da pró-insulina.

Alsever e cols. (44) indicaram que a determinação de pró-insulina e

seus intermediários de conversão poderia ser útil na investigação de pacientes com

insulinoma que apresentam a concentração sérica de insulina dentro dos limites de

normalidade.

Ipp e cols. (64) demonstraram que pode haver flutuações na

concentração de insulina independentemente da concentração de pró-insulina em

pacientes com insulinoma. Portanto, ele sugere que ensaios específicos para a dosagem

de pró-insulina sejam empregados preferencialmente para o exame de insulinomas.

Kao e cols. (79) também confirmaram a maior acuracidade do diagnóstico de insulinoma

empregando-se a dosagem de pró-insulina.

Vários fatores podem contribuir para a hiperproinsulinemia

característica dos pacientes com insulinoma como: um aumento na síntese, um defeito

na conversão, estocagem e mecanismo de liberação ou uma combinação destes

eventos.

Evidências obtidas no estudo "in vitro" com tecido pancreático de

paciente portador de insulinoma, indicaram que ocorreu uma diminuição na fase de

estocagem da pró-insulina, permitindo sua secreção antes que o processo de conversão

para insulina tivesse ocorrido (118).

102

5.8. APLICAÇÃO DO RADIOIMUNOENSAIO NO ESTUDO DO DIABETES

MELLITUS TIPO H ASSOCIADO À OBESIDADE.

O processo de conversão da pró-insullina para insulina é, normalmente,

muito eficiente (119,120). Entretanto, em pessoas com diabetes mellitus Tipo II, os

níveis de pró-insulina e seus intermediários de conversão estão aumentados em relação

à insulina (58,73,75,77,121,122).

O "clearance" da pró-insulina é mediado principalmente pelos rins e

ele não sofre alterações no diabetes Tipo II desde que a função renal não esteja

prejudicada (121). No diabetes Tipo II ocorre, portanto, um aumento na concentração

sérica de pró-insulina e seus intermediários de conversão que induzem a uma piora na

deficiência de insulina, já que, este pró-hormônio e seus intermediários de conversão

são pouco ativos biologicamente se comparados à insulina (20-23), contribuindo para

o desenvolvimento da hiperglicemia.

Duas hipóteses para este aumento nos níveis de pró-insulina foram

sugeridas. A primeira seria a de que uma demanda aumentada na secreção de insulina

devido à hiperglicemia depletaria os grânulos maduros das células p\ resultando na

secreção de grânulos imaturos, ricos em pró-insulina (123). Outra hipótese proposta

seria a de um defeito no mecanismo enzimático de processamento da pró-insulina

(121).

Alarcón e cols. (124) estudaram, recentemente, esta última hipótese

empregando um modelo animal e verificaram que a hiperglicemia crônica levou a um

aumento na relação Pl/I, característica do diabetes Tipo II, mas que este aumento não

foi resultado de um defeito enzimático no processamento da pró-insulina. A secreção

aumentada de pró-insulina foi, ao contrário, uma consequência da demanda secretória

aumentada sobre as células p, induzida pela hiperglicemia.

A maioria das evidências indicam que a resistência à insulina

geralmente, inicia a sequência de acontecimentos que culminam no aparecimento do

diabetes Tipo II, e que a obesidade é um dos mais importantes fatores causadores

desta resistência (125).

103

O aumento nos níveis basais de insulina pode ser devido também ao

fato de que a degradação hepática da insulina em obesos é diminuída. No entanto, foi

demonstrado, recentemente, que ocorre um aumento na degradação da insulina pelos

tecidos adiposos em animais obesos, provavelmente como um contra-mecanismo para

limitar a hiperinsulinemia, ajudando a prevenir uma elevação excessiva de insulina

(126).

Quando o pâncreas mantém uma resposta secretória de insulina

suficientemente alta para contrabalancear a resistência à insulina, a tolerância à glicose

permanece normal ou levemente aumentada. Entretanto, quando as células p começam

a falhar, a tolerância à glicose deteriora-se rapidamente resultando no diabetes Tipo II.

Portanto, o desenvolvimento do diabetes Tipo II requer a presença de

dois defeitos fundamentais: resistência à insulina e secreção de insulina prejudicada,

que rompe o delicado equilíbrio pelo qual os tecidos alvo de insulina se comunicam

com as células (3 e vice-versa (122,127).

Estes autores concluíram que a hiperpró-insulinemia provavelmente

representa um estágio final da hiperglicemia severa, devido à super-estimulação das

células p pela glicose, e que a solicitação aumentada sobre as ilhotas que já apresentam

uma habilidade diminuída para responder, resulta na liberação de grânulos

incompletamente processados.

Embora vários estudos tenham descrito concentrações elevadas de

pró-insulina em pacientes com diabetes Tipo II (19,37-39,58,128-131), o emprego de

diferentes populações de pacientes e diferentes métodos de estudos tomaram difíceis

possíveis comparações entre os resultados obtidos. Além disso, a insulina foi

determinada empregando-se radioimunoensaios que apresentavam até 100% de reação

cruzada com a pró-insulina (74).

No presente estudo, foram avaliadas as concentrações de insulina,

peptídeo-C e pró-insulina sérica, dosadas através de radioimunoensaios específicos

para cada um dos peptídeos, em indivíduos no estado basal, com tolerância normal à

glicose, obesos e pacientes com diabetes Tipo II. O radioimunoensaio desenvolvido

identificou predominantemente a pró-insulina intacta, e o radioimunoensaio de insulina

104

apresentou somente 0,2% de reação cruzada com a pró-insulina.

Verificamos que em relação aos indivíduos de peso normal, os obesos

apresentaram concentração de glicose normal, porém acompanhada por um aumento

significante no nível basal de insulina, características verificadas nos casos de resistência

à insulina.

Os pacientes obesos não diabéticos e diabéticos apresentaram níveis

aumentados de insulina quando comparados a indivíduos de peso normal tanto

diabéticos quanto não diabéticos. Os níveis de pró-insulina, no entanto, foram

semelhantes para os dois grupos: diabéticos e não diabéticos.

Por outro lado, houve diferença significante na relação molar Pl/I entre

os indivíduos não diabéticos obesos e os de peso normal; enquanto não houve diferença

entre pacientes diabéticos obesos e pacientes diabéticos de peso normal (Figura 16).

Finalmente, pacientes diabéticos de peso normal e obesos

apresentaram níveis de insulina semelhantes à indivíduos não diabéticos, tanto obesos

como de peso normal. Houve porém, um aumento significante nos níveis basais de

pró-insulina e na relação molar Pl/I dos pacientes diabéticos obesos e de peso normal

quando comparados aos indivíduos normais tanto obesos quanto de peso normal (Figura

17).

Yoshioka e cols. (58) e Shiraishi e cols. (131) empregaram um

radioimunoensaio de pró-insulina semelhante ao nosso e um radioimunoensaio para

insulina, fazendo a correção da reação cruzada com a pró-insulina.

Assim como os nossos resultados, Yoshioka e cols. não observaram

diferenças significantes nos níveis de insulina entre os pacientes diabéticos de peso

normal e os indivíduos normais. O nível de pró-insulina e a relação molar Pl/I no entanto,

esteve aumentada nos pacientes diabéticos.

Entretanto, Shiraishi e cols. encontraram em indivíduos obesos, um

aumento significante nos níveis basais de insulina e pró-insulina em comparação a

indivíduos de peso normal. A relação molar Pl/I no entanto, permaneceu igual tanto

para os indivíduos obesos quanto para os de peso normal. Quando eles compararam

pacientes diabéticos obesos e de peso normal houve um aumento nos níveis basais

105

de insulina e pró-insulina nos diabéticos obesos. A relação Pl/I entretanto, foi igual

para os dois grupos.

Os autores concluíram, neste estudo, que a secreção de pró-insulina

estava desproporcionalmente aumentada na presença de intolerância à glicose, mas

não devido propriamente à obesidade. As células B pareciam funcionar normalmente

em indivíduos obesos enquanto a tolerância à glicose permanecia normal.

Saad e cols. (130), estudando a secreção de pró-insulina em soro de

índios Pima não diabéticos, observaram uma diminuição na relação molar Pl/I

relacionado com o aumento de massa corpórea. Verificou-se, desta maneira, que a

resistência crônica à insulina, encontrada nestes indivíduos, não estava associada a

um aumento desproporcional no nível de pró-insulina. Além disso, foi sugerido que as

ilhotas destes indivíduos processariam a insulina mais eficientemente (122).

Davies e cols. (132) empregaram um ensaio imunorradiométrico para

a dosagem de pró-insulina intacta, que apresentou 66% de reação cruzada com a

65,66-split pró-insulina. Os autores observaram, em indivíduos obesos, um aumento

significante nos níveis de insulina em relação a indivíduos de peso normal. Os níveis

de pró-insulina, no entanto, foram iguais com diminuição da relação molar Pl/I. Os

pacientes diabéticos obesos apresentaram aumento de pró-insulina, insulina e na

relação molar Pl/I quando comparados ao grupo controle de indivíduos obesos.

Uma possível diferença entre os nossos resultados e os de outros

autores (130,132) em relação aos dados observados por Shiraishi e cols. (131), pode

ser derivado do diferente grau de obesidade estudado. Shiraishi e cols. estudaram

indivíduos com IMC < 30, enquanto nós e os demais autores estudamos indivíduos

com maior grau de obesidade (> 30). Parece portanto, que em indivíduos não diabéticos,

à medida em que aumenta o grau de obesidade, diminui a secreção de pró-insulina ou

esta é processada mais eficientemente como propuseram Daniel Porte e cols. (122).

Temple e cols. (73), empregando um ensaio imunorradiométrico que

identifica a pró-insulina intacta e 32,33-split e um ensaio imunorradiométrico para insulina

que não reage cruzadamente com a pró-insulina, não observaram diferenças nos níveis

de insulina dos pacientes diabéticos Tipo II obesos ou de peso normal em relação aos

106

seus respectivos grupos controle. A concentração de pró-insulina e a relação molar

Pl/I no entanto, estiveram aumentadas nos pacientes diabéticos Tipo II tanto obesos

quanto de peso normal.

Quando os mesmos autores analisaram os pacientes diabéticos Tipo

II obesos em comparação aos diabéticos Tipo II de peso normal, não encontraram

diferenças significantes entre os níveis basais de insulina, pró-insulina ou na relação

molar Pl/I (74); resultados estes concordantes com os encontrados em nossos estudos.

Reaven e cols. (77) empregando um ensaio imunoenzimático que

reconheceu também o derivado de conversão 31,32-des e 64,65-des, e um

radioimunoensaio de insulina que foi corrigido para reação cruzada com pró-insulina,

observaram que houve sobreposição de valores nas concentrações de insulina em

indivíduos normais e pacientes com diabetes Tipo II. Houve, porém, aumentos na

concentração de pró-insulina no diabetes e na relação molar Pl/I.

Eles concluíram, também, que a concentração de insulina plasmática

é superestimada em pacientes com diabetes Tipo I I , quando medida por

radioimunoensaios convencionais e que, quanto maior a concentração de glicose

plasmática, maior é a contribuição da pró-insulina a qual é, geralmente, medida como

insulina.

Assim como Reaven e cols., Polonsky e cols. (133), empregando ensaio

imunoenzimático que reconheceu também os derivados de conversão 31,32-des e

64,65-des, observaram níveis plasmáticos de insulina semelhantes em indivíduos

obesos diabéticos ou não diabéticos. A concentração de pró-insulina, no entanto, foi

maior nos pacientes diabéticos com aumento, também, na relação molar Pl/I.

Portanto, apesar do radioimunoensaio por nós desenvolvido não

identificar o derivado de conversão 31,32-des, que juntamente com a pró-insulina intacta

corresponde ao principal componente relacionado à pró-insulina circulante, foi possível

empregar-se esse radioimunoensaio no estudo de pacientes diabéticos.

Os resultados observados foram semelhantes àqueles obtidos com o

emprego de ensaios imunorradiométricos e imunoenzimáticos, que indicaram a

existência de uma desordem no processo de secreção da pró-insulina pelas células p

pancreáticas no diabetes mellitus Tipo II.

107

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:

1. Foram desenvolvidas e padronizadas as etapas do radioimunoensaio

de pró-insulina humana, a saber: preparo do traçador, produção e purificação

do anticorpo, padronização dos métodos de ensaio e separação.

2. Evidenciou-se que o traçador preparado neste trabalho é puro e estável.

3. O antissoro anti-pró-insulina obtido apresentou título e avidez adequados

para o desenvolvimento do radioimunoensaio e tornou-se altamente

específico após adsorção contra insulina e peptídeo-C, reconhecendo a

junção entre a cadeia B da insulina e o peptídeo-C (65,66-split pró-insulina).

4. O estudo da constante de afinidade (Ka) e a cinética de ligação do antissoro,

permitiu uma acentuada redução no tempo de ensaio para a dosagem da

pró-insulina. Isso representou um avanço em relação a outros métodos

de radioimunoensaio que, tipicamente, empregam incubações a 4°C por

períodos superiores a 96 h.

5. O método de separação do ensaio empregando o segundo antissoro

assistido pelo PEG é um método simples e rápido para a separação

da pró-insulina livre daquela ligada ao anticorpo no sistema de

radioimunoensaio.

6. Como a maioria dos métodos de radioimunoensaio, nosso ensaio não

foi suficientemente sensível para a dosagem de níveis normais de pró-

insulina sem a necessidade de concentração prévia.

7. As técnicas de extração e concentração empregada foram simples, rápidas

e acuradas, permitindo o processamento de várias amostra simultaneamente.

8. O controle de qualidade do radioimunoensaio mostrou que o método é

altamente específico, reprodutível e acurado, com uma sensibilidade

> 0,03 pmoUmL (erro < 20%) para a medida dos níveis de pró-insulina.

9. A validade deste radioimunoensaio foi confirmada pela nítida discriminação

das concentrações de pró-insulina entre níveis normais e elevados desse

pró-hormônio (insulinoma e insuficiência renal crônica).

10. O radioimunoensaio desenvolvido foi aplicado no estudo do diabetes

Tipo II associado à obesidade:

• Verificou-se que a obesidade não contribuiu para o aumento na secreção

de pró-insulina em indivíduos normais e em pacientes com diabetes Tipo II.

• Nos pacientes diabéticos Tipo II observou-se um aumento nos níveis de

pró-insulina quando comparados aos indivíduos normais obesos ou de peso

normal, entretanto não existiram diferenças entre os níveis de insulina sérica.

• Portanto, a relação molar Pl/I esteve aumentada no diabetes, associado

ou não à obesidade, podendo ser empregado como indicador de falência

das células p pancreáticas.

11. Embora o radioimunoensaio desenvolvido não identifique o derivado

de conversão 32,33-des pró-insulina, encontrado no soro em proporção

semelhante à da pró-insulina intacta, ele pôde ser utilizado no estudo

da disfunção das células p pancreáticas.

109

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- STEINER, D.F.; OYER, P.E.- The biosynthesis of insulin and a probable

precursor of insulin by a human islet cell adenoma. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, |Z:473-480, 1967.

2- STEINER, D.F.; CUNNINGHAM, D.; SPIGELMAN, L; ATEN, B.- Insulin

biosynthesis: evidence for a precursor. Science. 1.57:697-700, 1967.

3- RUBENSTEIN, A.H.; CHO, S.; STEINER, D.F.- Evidence for proinsulin in

human urine and serum. Lancet. 1^1353-13555, 1968.

4- ROTH, J.; GORDEN, P.; PASTAN, I.- "Big" insulin: a new component of plasma

insulin detected by immunoassay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 61; 138-

145, 1968.

5- GORDEN, P. & ROTH, J.- Plasma insulin: fluctuation in the "big" insulin

component in man after glucose and other stimuli. J. Clin. Invest..

48_:2225-2234, 1969.

6- MELANI F.; RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F.- Circulating proinsulin.

Diabetes. 18_(Suppl. 1):340, 1969 (abstract 50).

7- MELANI, F.; RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F.- Human serum proinsulin.

J. Clin. Invest.. 4Ji497-507, 1970.

8- GUTMAN, R.A.; LAZARUS N.R.; PENHOS, J.C.; RECANT, L; FAJANS, S.Proinsulin (PI) and proinsulin-like material (PI-IM) in serum of patients

with islet cell tumors. Diabetes. 19(Suppl 1):360, 1970 (abstract 19).

110

9- CHANCE, R.E.; ELLIS, R.M.; BROMER, W.W.- Porcine proinsulin:

characterization and amino acid sequence. Science. 161:165-1617, 1968.

10- CLARK, J.L; CHO, S.; RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F.- Isolation of a

proinsulin connecting peptide fragment (C-peptide) from bovine and

human pancreas. Biochem. Biophys. Res. Commun.. 35:456-461, 1969.

11- OYER, P.E.; CHO, S.; PETERSON, J.D.; STEINER, D.F.- Studies on human

proinsulin. isolation and amino acid sequence of the human pancreatic C-

peptide. J. Bio). Chem. 246:1375-1386, 1971.

12- CHAN, S.J.; KLEIM, P.; STEINER, D.F.- Cell-free synthesis of rat preproinsulins:

characterization and partial amino acid sequence determination. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 73:1964-1968, 1976.

13- ORCI, L ; VASSALLI, J.; PERRELET, A.- The insulin factory. Sci. Am.. 259:50-

61, 1988.

14- NAGAMATSU, S.; GRODSKY, G.M. - Glucose-regulated proinsulin processing

in isolated islets from rat pancreas. Diabetes. 37:1426-1431, 1988.

15- DAVIDSON, H.W.; RHODES, C.J.; HUTTON, J.C.- Intraorganellar Ca and pH

control proinsulin cleavage in the pancreatic B-cell via two distinct site-specific

endopeptidases. Nature. 333:93-96, 1988.

16- RHODES, C.J.; LINCOLN, B.; SHOELSON, S.E.- Preferential cleavage of des-

31,32-proinsulin over intact proinsulin by the insulin secretory granule type II

endopeptidase. J. Biol. Chem.. 267(32):22719-22727, 1992.

111

17- DOCHERTY, K. & HUTTON, J.C.;- Carboxypeptidade activity in the insulin

secretory granule. FEBS Lett.. 1^:137-141, 1983.

18- GIVEN, B.D.; COHEN, R.M.; SHOELSON, S.E.; FRANK, B.H.; RUBENSTEIN,

A.H.; TAGER, H.S.- Biochemical and clinical implications of proinsulin

conversion intermediates. J.CIin. Invest. 76:1396-1405,1985.

19- HORWITZ, D.L.; STARR, J.I.; MAKO, M.E.; BLACKARD, W.G.; RUBENSTEIN,

A.H. - Proinsulin , insulin and C-peptide concentrations in human portal and

peripheral blood. J. Clin. Invest.. 55_: 1278-1283, 1975.

20- PEAVY D.E.; BRUNNER M.R.; DUCKWORTH W.C.;HOOKER C.S.; FRANK B.H.-

Receptor binding and biological potency of several split forms (conversion

intermediates) of human proinsulin. Studies in cultured IM-9 lymphocytes

and in vivo and in vitro in rats. J. Biol. Chem.. 2J50:13989-13994, 1985.

21- TILLIL, H.; FRANK, B.H.; PEKAR, A.H.; BROELSCH.C; RUBENSTEIN, A.H.;

POLONSKY, K.S.- Hypoglycemic potency and metabolic clearance rate of

intravenously administered human proinsulin and metabolites. Endocrinology.

127:2418-2422, 1990.

22- REVERS, R.R; HENRY, R.; SCHMEISER, L, KOLTERMAN, O.; COHEN.R.;

BERGENSTAL, R.; POLONSKY, K.; JASPAN, J.; RUBENSTEIN, A.;

FRANK.B.; GALLOWAY, J.; OLEFSKY, J.M.-The effects of byosynthetic

human proinsulin on carbohydrate metabolism. Diabetes. 3.3:762-770,1984.

23- GALLOWAY J.A.; Treatment of NIDDM with insulin agonists or substitutes.

Diabetes Care. 13:1209-1239, 1990.

112

24- BERGENSTAL, R.M.; COHEN, R.M.; LEVER, E.; POLONSKY, K.; JASPAN, J.;

BLIX, P.M.; REVERS, R.; OLEFSKY, J.M.; KOLETERMAN, O. STEINER,

K.;CHERRINGTON, A.; FRANK, B.; GALLOWAY, J.; RUBENSTEIN, A.H.-

The metabolic effects of biosynthetic human proinsulin in individuals with

type 1 diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab.. 58:973-979, 1984.

25- KATZ, A.I.; RUBENSTEIN, A.H. - Metabolism of proinsulin, insulin and C-peptide

in the rat. J. Clin. Invest.. 52:1113-1121, 1973.

26- ZILKER, T.R.; REBEL, CH.; KOPP, K.F.; WAHL, K.; ERMLER, R.; HEINZEL, G.;

HALES, C.N.; BOTTERMANN, P.- Kinetics of biosynthetic human proinsulin

in patients with terminal renal insufficiency. Horm. Metab. Res..

1 | (Suppl.): 43-48, 1988.

27- RUBENSTEIN, A.H.; POTTENGER, LA.; MAKO, M.; GETZ, G.S.; STEINER,

D.F.- The metabolism of proinsulin and insulin by the liver. J. Clin. Invest..

5J:912-921, 1972.

28- POLONSKY, K.S.; GIVEN, B.D.; HIRSCH, L; BEEBE, C; FRANK, B.H.;

GALLOWAY, J.A.; VAN CAUTER, E.- Quantitative study of insulin secretion

and clearance in normal and obese subjects. J. Clin. Invest.. 81 :̂435-441,

1988.

29- TILLIL, H.; SHAPIRO, E.T.; RUBENSTEIN, A.H.; GALLOWAY, J.A.; POLONSKY,

K.S.- Reduction of insulin clearance during hyperglycemic clamp: a dose-

response study in normal man. Diabetes. 37:1351-1357, 1988.

30- POLONSKY, K.S.- The p-cell in diabetes: From molecular genetics to clinical

research. Diabetes. 44:705-717, 1995.

113

31-POLONSKY, K.S.; LICINIO-PAIXÃO, J.; GIVEN, B.D.; PUGH, W.; RUE, P.;

GALLOWAY, J.; KARRISON, T; FRANK, B.- Use of biosynthetic human

C-peptide in the measurement of insulin secretion rates in normal volunteers

and type I diabetic patients. J. Clin. Invest.. 77:98-105, 1986.

32- GORDEN, P.; SHERMAN, B.; ROTH, J.- Proinsulin-like component of circulating

insulin in the basal state in patients and hamsters with islet cell tumors. ±

Clin. Invest., 5_Q:2113-2122,1971.

33- SHERMAN, B.M., PEK, S.; FAJANS, S.S; FLOYD, J.C.; CONN, J.W.- Plasma

proinsulin in patients with functioning pancreatic islet cell tumor. J. Clin.

Endocrinol. Metab.. 35:271-280, 1972.

34- RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F.; HORWITZ, D.L; MAKO, M.E.; BLOCK, M.B.;

STARR, J.I.; KUZUYA, H.; MELANI, F. Clinical significance of circulating

proinsulin and C-peptide. Recent. Proa. Horm. Res. 3_3_:435-475, 1977.

35- KITABCHI, A.E.; DUCKWORTH, W.C.; BRUSH, J.S.; HEINEMANN, M.- Direct

measurement of proinsulin in human plasma by the use of an insulin-

degrading enzyme. JJ_ÇJinJnyest., 50:1792-1799, 1971.

36- STARR, J.I.; JUHN, D.D.; RUBENSTEIN, A.H.- Degradation of insulin in serum

by insulin-specific protease. J. Lab. Clin. Med.. 86:631-637, 1975.

37- MAKO, M.E.; STARR, J.I.; RUBENSTEIN, A. - Circulating proinsulin in patients

with imaturity onset diabetes. Am. J. Med.. 3:865-869,1977.

38- GORDEN, P.; HENDRICKS, CM.; ROTH, J. -Circulating proinsulin like componen1

in man: increased proportion in hypoinsulinemic states. Diabetoloqia, 10:469

474, 1974.

114

39- DUCKWORTH, W.C.; KITABCHI, A.E.; HEINEMANN, M.- Direct measurement

of plasma proinsulin in normal and diabetic subjects. Am. J. Med.. 53:418-

427, 1972.

40- MAKO, M.E.; BLOCK, M.; STARR, J.I., NIELSON, E.; FRIEDMAN, E.r

RUBENSTEIN, A. - Proinsulin in chronic renal and hepatic failure: a reflection

of the relative contributions of the liver and kidney to its metabolism. Clin.

Res.. 2J..-631, 1973.

41- JASPAN, J.B.; MAKO, M.E.; KUZUYA, H.; BLIX, P.M.; HORWITZ, D.L.;

RUBENSTEIN, A.H. - Abnormalities in circulating beta cell peptides in chronic

renal failure: Comparison of C-peptide, proinsulin and insulin. J. Clin.

Endocrinol. Metab.. 45:441-446, 1977.

42- MELANI, R; RYAN, W.G.; RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F. - Proinsulin

secretion by a pancreatic beta-cell adenoma: Proinsulin and C-peptide

secretion. N. Engl. J. Med.. 283:713-719, 1970.

43- GUTMAN, R.A.; LAZARUS, N.R.; PENHOS, J.C.; FAJANS, S.; RECANT, L-

Circulating proinsulin-like material in patients with functioning insulinomas.

N. Engl. J. Med.. 284:1003-1008, 1971.

44- ALSEVER, R.N.; ROBERTS, J.P.; GERBER, J.G.; MAKO, M.E.; RUBENSTEIN,

A.H. - Insulinoma with low circulating insulin levels: The diagnostic

value of proinsulin measurements. Ann. Intern. Med.. 82_:347-350, 1975.

45- FAJANS, S.S.; FLOYD, J.C. - Diagnosis and medical management of insulinomas.

Ann. Rev. Med.. 30:313-329, 1979.

115

46- GABBAY, K.H.; DELUCA, K.; FISHER, J.N.; MAKO, M.E.; RUBENSTEIN, A.H. -

Familial hyperproinsulinemia. N. Engl. J. Med.. 294:911-915, 1976.

47- GABBAY, K.H.; BERGENSTAL, R.M.; WOLFF, J.; MAKO, M.E.; RUBENSTEIN,

A.H. - Familial characterization of circulating proinsulin-like material. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA. 7_6_:2881-2885, 1979.

48- ROBBINS, D.C.; SHOELSON, S.E.; RUBENSTEIN, A.H.- Familial

hyperproinsulinemia. Two cohorts secreting indistinguishable Type II

intermediates of proinsulin conversion. J. Clin. Invest.. 73:714-719, 1984.

49- HEDING, L.G.; RASMUSSEN, S.M. - Direct and specific determination of human

proinsulin in normal and diabetic serum. Diabetologia. 12:396,1976 (abstract

115).

50- HEDING, L.G. - Specific and direct radioimmunoassay for human proinsulin in

serum. Diabetologia. 13:467-474,1977.

51- WARD K.W.; PAQUETTE T.L.; FRANK B.H.; PORTE D. A sensitive

radioimmunoassay for human proinsulin, with sequential use of antisera to

C-peptide and insulin. Clin. Chem.. 32:726-733, 1986.

52- GRAY I.P.; SIDDLE K.; DOCHERTY K.; FRANK B.H.; HALES C.N.- Proinsulin in

human serum: problems in measurement and interpretation. Clin. Endocrinol..

21:43-47, 1984.

116

53- FRANK, B.H.; PETTEE, J.M.M; ZIMMERMAN, R.E.; BURCK, P.J.- The

production of human proinsulin and its transformation to human insulin and

C-peptide. In: D.H. e GROOS eds. Peptides: Synthesis-structure-functinn

Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Pierce Chemical

Co., Illinois, 1981, p. 729-38.

54- COHEN, R.M.; NAKABAYASHI, T; BLIX, P.M.; RUE, P.A.; SHOELSON, S.E.;

ROOT, M.A.; FRANK, B.H.; REVERS, R.R.; RUBENSTEIN, A.H.- A

radioimmunoassay for circulating human proinsulin. Diabetes. 34:84-91,

1985.

55- DEACON, C.F.; CONLON, J.M.- Measurement of circulating human proinsulin

concentrations using a proinsulin-specific antiserum. Diabetes. 34:491-497,

1985.

56- COHEN, R.M.; GIVEN, B.D.; LICINIO-PAIXÃO, J.; PROVOW, S.A.; RUE, P.A.;

FRANK, B.H.; ROOT, M.A.; POLONSKY, K.S.; TAGER, H.S.; RUBENSTEIN,

A.H.- Proinsulin radioimmunoassay in the evaluation of insulinomas and

familial hyperproinsulinemia. Metabolism. 35:1137-1146, 1986.

57- HAMPTON, S.M.; BEYZAVI, K.; TEALE , D.; MARKS, V.- A direct assay for

proinsulin in plasma and its applications in hypoglycaemia.Clin. Endocrinol..

_29:9-16, 1988.

58- YOSHIOKA, N.; KUZUIA, T.; MATSUDA, A.; TANIGUCHI, M.; IWAMOTO, Y-

Serum proinsulin levels at fasting and after oral glucose load in patients

with type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia. 3J[:355-

360, 1988.

117

59- BOWSHER, R.R.; WOLNY, J.D.; FRANK, B.H. - A rapid and sensitive

radioimmunoassay for the measurement of proinsulin in human serum.

Diabetes. 41:1084-1090, 1992.

60- RUBENSTEIN, A.H. ; STEINER, D.F. - Human proinsulin: Some considerations

in the developmetn of a specific immunoassay. In: R.A. CAMERINI-

DAVALOS; H.S. COLE, eds. Early diabetes. Academic Press, New York,

1970, p. 159-69.

61 - KRUSE, V.; HEDING, L.G.; JORGENSEN, K.H.; TRONIER, B.; CHRISTENSEN,

M.; THIM, L; FRANK, B.H.; ROOT, M A ; COHEN, R.M.; RUBENSTEIN, A.

Human proinsulin standards. Diabetologia. 27:414-415, 1984.

62- BRISTOW, A.F.; GAINES, DAS R.E. - Who international reference reagents for

human proinsulin and human insulin C-peptide. J. Biol. Stand.. 1J3:182-186,

1988.

63- OOHASHI, H.; OHGAWARA, H.; NANJO, K.; TASAKA, Y; CAO, Q-P; CHAN,

S.J.; RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F.; OMORI, Y.- Familial

hyperproinsulinemia associated with NIDDM. Diabetes Care. 1j3(10):1340-

1346, 1993.

64- IPP, E.; GRIFFITHS, S.M.; BOWSHER, R.R.; TARRIS, R.H.; ZHOU, D.B.;

TERLECKI, M.E.- Fluctuations in plasma proinsulin in an insulinoma.

Diabetes Care. 1.5_(7):931 -933, 1992.

65- HAFFNER, S.M.; MYKKANEN, L; STERN, M.P.; VALDEZ, R.A.; HEISSERMAN,

J.A.; BOWSHER, R.R.- Relationship of proinsulin and insulin to

cardiovascular risk factors in nondiabetic subjects. Diabetes. 42:1297-1302,

1993.

118

66- HAFFNER, S.M.; MYKKANEN, L; VALDEZ, R.A.; STERN, M.P.; MONTERROSA,

A.; BOWSHER, R.R.- Disproportionately increased proinsulin levels are

associated with the insulin resistance syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab.,

7.9J1806-1810,1994.

67- BERSON S.E. ; YALOW R.S.- Kinetics of reaction between insulin and insulin-

binding antibody. J. Clin. Invest.. 36:873-874, 1975.

68- YALOW R.S. ; BERSON S.A.- Assay of plasma insulin in human subjects by

immunolbgical methods. Nature. 1J34j 1648-1649,1959.

69- BERSON S.A.; YALOW R.S.- General principles of radioimmunoassay. Clin.

Chim. Acta. 22:51-69, 1968.

70- BORGHI V.C.- Dosagens hormonais in vitro com radioisótopos. Considerações

gerais e análise critica. Cienc. Cult.. 35_ (10): 1456-1466, 1983.

71- HARTLING, S.G.; DINESEN, BO; KAPPELGARD, A.M.; FABER, O.K.; BINDER,

C- Elisa for human proinsulin. Clin. Chim. Acta. 156:289-298, 1986.

72- SOBEY, W.J.; BEER, S.F.; CARRINGTON, CA.; CLARK, P.M.S.; FRANK, B.H.;

GRAY, P.; LUZIO, S.D.; OWENS, D.R.; SCHNEIDER, A.E.; SIDDLE, K.;

TEMPLE, R.C.; HALES, C.N.- Sensitive and specific two-site

immunoradiometric assays for human insulin, proinsulin, 65-66 split and 32-

33 split proinsulins. Biochem. J.. 260: 535-541,1989.

73- TEMPLE, R.C.; CARRINGTON, C.A.; LUZIO, S.D.; OWENS, D.R.; SCHNEIDER,

A.E.; SOBEY, W.J.; HALES, C.N.- Insulin deficiency in non-insulin-dependent

diabetes. Lancet. 1:293-295, 1989.

119

74- TEMPLE, R.C.; CLARK, P.M.S.; NAGI, D.K.; SCHNEIDER, A.E.; YUDKIN, J.S.;

HALES, C.N.- Radioimmunoassay may overestimate insulin in non-insulin-

dependent diabetics. ÇJin^Eridoçiinoi., §g:689-693, 1990.

75- NAGI, D.K.; HENDRA, T.J.; RYLE, A.J.; COOPER, T.M.; TEMPLE, R.C; CLARK,

P.M.S.; SCHNEIDER, A.E.; HALES, C.N.; YUDKIN, J.S.- The relationships

of concentrations of insulin, intact proinsulin and 32-33 split proinsulin

with cardiovascular risk factors in type 2 (non-insulin-dependent) diabetic

subjects. Diabetologia. 33:532-537,1990.

76- OSTREGA, D.; POLONSKY, K.; NAGI, D.; YUDKIN, J.; COX, L.J.; CLARK, P.M.S.;

HALES, C.N.- Measurement of proinsulin and intermediates. Validation of

immunoassay methods by high-performance liquid chromatography.

Diabetes. 44:437-440, 1995.

77- REAVEN, G.M.; CHEN, Y.DI; HOLLENBECK, C.B.; SHEU, W.H.H.; OSTREGA,

D.; POLONSKY, K.S.- Plasma insulin, C-peptide and proinsulin

concentrations in obese and nonobese individuals with varying degrees of

glucose tolerance. J. Clin. Endocrinol. Metab.. 76:44-48, 1993.

78- RODER, M.E.; VAAG, A.; HARTLING, S.G.; DINESEN, B.; LANNG, S.; BECK-

NIELSEN, H.; BINDER, C- Proinsulin immunoreactivity in identical twins

discordant for non-insulin-dependet diabetes mellitus. J. Clin. Endocr. Metab.;

JQ:2359-2363, 1995.

79- KAO, P C ; TAYLOR, R.L; SERVICE, F.J.- Proinsulin by immunocherniluminometric

assay for the diagnosis of insulinoma. J. Clin. End. Metab., 78(5):1048-

1051, 1994.

120

80- VAITUKAITIS, J.; ROBBINS, J.B.; NIESCHLAG, E.; ROSS, G.T. -A method for

producing specific antisera with small doses of immunogen. J. Clin.

EndocrinoL 33:988-991.1971.

81- ABBOTT LABORATORIES, Diagnostics Division. Operator's Manual. ANSR

Gamma Counter, Chicago, Diagnostics Division, 1981, p.5.

82- CUATRECASAS, P. ; ANFISEN, C.B.- Enzyme purification and related

tecnhiques. In: JAKOBY, W.B. ed. Methods in Enzymoloav. New York, N.Y.,

Academic Press, 1971. v. XXII, p. 345-378.

83- TAGER, H.S.; RUBENSTEIN, A.H.; STEINER, D.F.- Methods for the assessment

of peptide precursors. Studies on insulin biosynthesis. In: O'MALLE B.W.;

HARDMAN J.G. eds. Methods in Enzymology. New York, N.Y., Academic

Press, 1975. v. XXXVII, p. 327-345.

84- GOLOVINA, TO.; CHREDNIKOVA, T.V.; MEVKH, A.T.; NAGRADOVA, N.K.- A

convenient method for the estimation of sepharose-bound protein. Analytical

Biochemistry. 83:778-781,1977.

85- SCATCHARD, G.- The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann.

N.Y. Acad.Sci.. 5J.:660-672, 1949.

86- STATISTICAL GRAPHICS SYSTEM. Version 2.6.

87- MESQUITA, C.H. Modelo para determinação da absorção de substâncias

radioativas. Aplicação em radioiodosimetria e nutrição. São Paulo, 1991 •

Tese Doutoramento - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares.

121

88- FRAKER, P.J ; SPECK, J.C. Jr. - Protein and cell membrane iodinations with a

sparingly soluble chloroamide 1,3,4,6-tetrachloro-3 alfa, 6 alfa-

diphenilglycoluril. Biochem. Biophys. Res. Commun.. 80:849-857, 1978.

89- NASCIMENTO, M.; BORGHI, V.C.; WAJCHENBERG, B.L.- Aprimoramento da

técnica de marcação de pró-insulina biossintética humana para uso em

radioimunoensaio. In: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ENERGIA

NUCLEAR. Energia Nuclear: Anais do IV Congresso Geral de ... realizado

no Rio de Janeiro. 5-9 de julho. 1992. Rio de Janeiro, 1992. v.2, p.653-664.

90- TOWER, B.B. - The talc-resin-thrichloroacetic acid test for screening

radioiodinated polypeptide hormones. In: Methods in Enzvmoloav.. New

York, N.Y. Academic Press, 1980. v.70, p. 322-334.

91- ENGLEBIENNE, P. ; SLEGERS, G.- Estimation of the specific activity of

radioiodinated gonadotrophins: comparison of three methods. J. Immunol.

Methods.. 56:135-140, 1983.

92- DAVIS B. J.- Disc electrophoresis. II. Methods and application to human serum

proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci.. 121:404-427. 1964.

93- BORGHI, V. C ; LIN, H. L; LOPES, E. M. L. e MORAES, V. K.- Avaliação do

RIAKALK: um programa para microcomputadores de análise de dados do

radioimunoensaio. São Paulo, Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares. 1992 (Publicação IPEN 362).

94- PRIMER- Me Graw-Hill Inc. Version 1.0,1988.

122

95- LIN, H.L. ; BORGHI, V.C.- Controle de qualidade de radioimunoensio para

dosegem de tireotrofina em extratos hipofisários humanos. In: ASSOCIAÇÃO

BRASILEIRA DE ENERGIA NUCLEAR. Energia Nuclear: Anais do 4^

Congresso Geral de... realizado no Rio de Janeiro, 5-9 de julho de 1992.

Rio de Janeiro, 1992. v.2. p. 647-652.

96- ADRIAN, T.E.- Radioimmunoassay of gut regulatory peptides. In: BLOOM, S.R.,

LONG, R.G. eds. Methods in laboratory medicine. Praeger, New York, 1982,

v.2, p.30.

97- ALBUQUERQUE, R.H.- Controle de qualidade em radioimunoensaio. Arq. Bras.

Endocrinol. Metabol.. 25:120-124,1981.

98- EKINS, R.P.- Basic concepts in quality control. In: INTERNATIONAL ATOMIC

ENERGY AGENCY. Radioimmunoassav and related procedures.

Proceedings of an international symposium on ... held in Berlin, 1977. Vienna,

1978. v.2, p.6-20.

99- MIDGLEY, A.R.; NISWENDER, G.D.; REBAR, R.W.- Principles for the assessment

of the reliability of radioimmunoassay methods (precision, accuracy,

sensitivity, specificity). Acta Endocrinol. (Suppl.), 142:163-184, 1969.

100- RODBARD, D.- Quality control for RIA. In: INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY

AGENCY. Radioimmunoassay and related procedures in medicine.

Proceedings of an international symposium on ... held in Berlin, 1977. Vienna,

1978. v.2, p.21-38.

123

101 - NASCIMENTO, M..; BORGHI, V.C.; WAJCHENBERG, B.L.- Otimização da técnica

de extração da pró-insulina humana do soro para dosagem no

radioimunoensaio empregando cartuchos de fase reversa Sep-PakC18.

In: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ENERGIA NUCLEAR. Energia Nuclear:

Anais do V Congresso Geral de ... realizado no Rio de janeiro. 28 de agosto

a 2 de setembro. 1994. Rio de Janeiro, 1994. v. Ill, p.905-908.

102- NATIONAL DIABETES DATA GROUP. Classification and diagnosis of diabetes

mellitus and other categories of glucose intolerance. Diabetes. 28:1039-

1057, 1979.

103- HIGA, O.Z.; SOUZA, I.T.T. - Standardization of plasma insulin and growth

hormone. In: INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY.

Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine. Proceedings

of an international symposium on ...held in Vienna. 1974. Vienna, 1974. v. I,

p.291-307.

104- FREYCHET, P.; ROTH, J.; NEVILLE, D.M.- Monoiodoinsulin:Demonstration of its

biological activity and binding to fat cells and liver membranes. Biochem.

Biophys. Res. Commun.. 43:400-407, 1971.

105- Instat-Graphpad software . Version 2.00, 1993.

106- NASCIMENTO, M.; BORGHI, V.C.; BELLINI, M.H.; MESQUITA, C.H.;

WAJCHENBERG, B.L.- Avaliação comparativa dos procedimentos de

imunização para obtenção de antissoro anti-pró-insulina humana para

radioimunoensaio. São Paulo, Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares. 1992 (Publicação IPEN 374).

124

107- HURN, B.A. ; LANDON, J.- Antisera for radioimmunoassay. In: KIRKHAM, K.E.;

HUNTER, W.M. eds. Radioimunoassay methods. Churchill Livingstone.

Edinburgh and London, 1971, p. 121-142.

108-AXÉN, R.; PORATH, J.; ERNBACK, S.- Chemical coupling of peptides and

proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides. Nature,

214:1302-1304, 1967.

109- CUATRECASAS, P.- Interaction of insulin with the cell membrane: the primary

action of insulin. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 63j450-457, 1969.

110- HALBAN, P.A.- Proinsulin conversion intermediates: A possible source of

confusion. Diabetoloaia. 34:202-203, 1991.

111- YALOW, R.S. ; BERSON, S.A.- Introduction and general considerations. In:

ODELL, W.D.; DAUGHADAY, W.H. eds. Principles of competitive protein

binding assays. Philadelphia, J.B. Lippincott, 1971, p. 1-24.

112- HUNTER, W.M.- Preparation and assessment of radioactive tracers. Br. Med.

Bull.. 3^:18-23, 1974.

113- FRANK, B.H.; BURCK, P.J.; HUTCHINS, J.F.; ROOT, M.A.- The preparation

of iodine-labelled biosynthetic human proinsulin. In: PETERSON, K.G.;

SCHLUETER, K.J.; KARP, L , eds. Neue Insuline. Freiburg, FRG, Freiburger

Graphische Betriebe, 1982, p. 45-50.

114- YALOW, R.S.; BERSON, S.A.- Problems of validation of radioimmunosaays.

In: ODELL, W.D.; DAUGHADAY, W.H. eds. Principles of competitive protein

binding assays. Philadelphia, J.B. Lippincott, 1971, p.374-400.

125

115- BRISTOW, A.F. ; DAS, R.E.G.- Who international reference reagents for

human proinsulin and human insulin C-peptide. J. B. Standardization. 16:179-

186, 1988.

116- CHARD, T - Ammonium sulfate and polyethylene glycol as reagents to separate

antigen from antigen-antibody complexes. In: VANVUNAKIS, K.; LANGONE,

J J . eds. Methods in Enzvmoloay.. New York, Academic, 1980, v. 70,

p.280-291.

117- PRATT, J.J. ; WOLDRING, M.G.- Radioimmunoassay specificity and the "first-

come, first-served effect". ÇJ|niçjLÇJiimiçAAçta, 68:87-90,1976.

118- CREUTZFELDT, C ; TRACK, N.S.; CREUTZFELDT, W.- In vitro studies of the

rate proinsulin and insulin turnover in seven human insulinomas. Eur. J.

Clin. Invest.. 3_:371-384, 1973.

119- RHODES, C.J. ; HALBAN, P.A.- Newly-synthesized proinsulin/insulin and stored

insulin are released from pancreatic B-cells via a regulated, rather than a

constitutive pathway. J. Cell. BioL 105:145-153, 1987.

120- SIZONENKO, S.; IRMINGER, J.C.; BUHLER, L; DENG, S.; MOREL, P.; HALBAN,

P.- Kinetics of proinsulin conversion in human islets. Diabetes. 42:933-936,

1993.

121- PORTE, D.; KAHN, S.E.- Hyperproinsulinemia and amyloid in NIDDM: Clues to

etiology of islet p-cell dysfunction. Diabetes. 3_8:1333-1336, 1989.

122- PORTE, D. Jr.- (3-cells in type II diabetes mellitus. Diabetes. 4_0:166-180, 1991.

126

123-RHODES, C J . ; ALARCÓN, C - Whatp-cell defect could lead to

hyperproinsulinemia in NIDDM: some clues from recent advances made in

understanding the proinsulin conversion mechanism. Diabetes. 4_3_:511-517,

1994.

124- ALARCÓN, C ; LEAHY, J.L.; SCHUPPIN, G.T.; RHODES, C.J.- Increased

secretory demand rather than a defect in the proinsulin conversion

mechanism causes hyperproinsulinmia in a glucose-infusion rat model

of non-insulin-dependent diabetes mellitus. J. Clin. Invest.. 95_:1032-

1039, 1995.

125- BAGDADE, J.D.; BIERMAN, E.L.; PORTE, D.JR.- Significance of basal insulin

levels in the evaluation of the insulin response to glucose in diabetic and

nondiabetic subjects. J. Clin. Invest.. 46:1549-1557, 1967.

126-RAFECAS, I.; LOPEZ, J.A.F.; SALINAS, I.; FORMIGUERA, X.; REMESAR, X.;

FOX, M.; ALEMANY, M.- Insulin degradation by adipose tissue is increased

in human obesity. J. Clin. Endocrinol. Metab.. 80:693-695, 1995.

127- DEFRONZO, R.A.; BONADONNA, R.C.; FERRANNINI, E.- Pathogenesis of

NIDDM. A balanced overview. Diabetes Care. 15:318-368, 1992.

128-DEACON, C.F.; SCHLESER-MOHR; BALLMANN, M.; WILLMS, B.; CONLON,

J.M.; CREUTZFELDT, W.- Preferential release of proinsulin relative to insulin

in non-insulin-depend diabetes mellitus. Acta Endocrinol.. 119:549-554,1988.

129- WARD, W.K.; LA CAVA, E.C.; PAQUETTE, T.L.; BEARD, J.C.; WALLUM, B.J.;

PORTE, D. JR.- Disproportionate elevation of immunoreactive proinsulin in

type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus and in experimental insulin

resistance. Diabetologia. 30:698-702, 1987.

127

130- SAAD, M.; KAHN, S.E.; NELSON, R.; PETTIT, R.; KNOWLER, J.;SCHWARTZ,

M.W.; KOWALYK, S.; BENNET, P.; PORTE, D.Jr.- Disproportionately

elevated proinsulin in Pima Indians with non-insulin dependent diabetes

mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab.. 70:1247-1253, 1990.

131-SHIRAISHI, I.; IWAMOTO, Y.; KUZUYA.T.; MATSUDA.A.; KUMAKURA, S.-

Hyperinsulinaemia in obesity is not accompanied by an increase in serum

proinsulin/insulin ratio in groups of human subjects with and without glucose

intolerance. Diabetologia. 34:737-741, 1991.

132-DAVIS, S.N.; PIATTI, P.M.; MONTI, L; BROWN, M.D.; BRANCH, W.; HALES,

C.N.; ALBERTI, K.G.M.M.- Proinsulin and insulin concentrations following

intravenous glucose challenges in normal, obese and non-insulin-dependent

diabetic subjects. Metabolism. 42 (1):30-35, 1993.

133-POLONSKY, K.S.; GUMBINER, B.; OSTREGA, D.; GRIVER, K.; TAGER, H.;

HENRY, R.R.- Alterations in immunoreactive proinsulin and insulin clearance

induced by weight loss in NIDDM. Diabetes. 43_:871-877, 1994.

128

8- ANEXO

Tabela 1- Características clínicas dos indivíduos do grupo controle normal.

Indivíduo

JSSS

AAT

NSS

MASI

ALND

VLMS

DLO

JSS

MEPA

MASS

EJOBS

NCP

AMS

KMK

EM

Sexo

F

M

MMFFFMFFMMFMFM

Idade(anos)

27

26

24

25

26

32

34

22

31

27

19

29

38

30

25

26

Peso(Kg)

56,0

80,0

53,0

70,0

60,0

52,0

64,5

61,9

48,2

64,0

61,0

64,0

58,0

62,0

60,7

69,2

Altura(m)

1,63

1,80

1,72

1,70

1,60

1,50

1,61

1,711,52

1,62

1,82

1,75

1,63

1,72

1,60

1,75

*IMC(Kg/m2)

21

25

18

24

23

22

25

21

21

24

18

21

22

21

24

23

*IMC= índice de massa corpórea

129

Tabela 2- Características clínicas dos pacientes com insuficiência renal crônica.

Pacientes

NTJFLOBNSOMEHMSJNONMTRSEVSSMSCMFNPCCPVSSEMKMOEASLLFPPK

Sexo

MMMFMFMMMFFMMFFMFFFM

Idade(anos)

4828585616213648304139294643212923381743

Peso(Kg)

69,451,364,157,549,346,168,580,065,566,053,059,158,545,846,670,057,055,058,371,0

Altura(m)

1,681,781,681,531,721,621,691,681,771,581,541,651,721,521,511,801,601,601,751,66

IMC(Kg/rr>2)

2516232417172428212622222020202222211926

Tabela 3- Características clínicas dos pacientes com insulinoma.

Pacientes

EPBMELVMMGFAVEJCLPFL

Sexo

FMFMFM

Idade(anos)

523242203645

130

Tabela 4- Características clínicas das mulheres obesas

Pacientes

SLR

MLAL

RS

ONB

VAN

EMS

MSM

RSC

SMC

YAS

MAMG

PMC

MLTJ

SVS

DPS

FCPS

VSS

LSF

AAPR

RGGA

MAOM

JJC

MGSO

VNSC

Idade(anos)

38

52

17

52

40

38

50

25

40

44

20

37

18

28

41

34

33

27

50

29

41

43

30

14

Peso(Kg)

96,1

79,5

75,0

107,2

116,7

86.6

69,8

64,0

117,6

71,4

76,2

79,2

83,1

106,0

84,4

77,6

77,0

155,0

11,20

100,8

114,8

71,7

58,8

83,2

Altura(m)

1,65

1,56

1,59

1,60

1,67

1,60

1,51

1,44

1,71

1,55

1,64

1,49

1,66

1,64

1,58

1,59

1,57

1,73

1,58

1,67

1,61

1,54

1,49

1,76

IMC(Kg/m2)

35

33

30

52

42

34

31

31

40

30

28

36

30

39

34

30

31

27

45

36

44

30

26

27

131

Tabela 5- Características clínicas dos pacientes diabéticos Tipo II não obesos.

Pacientes

JFRFMM

TMBR

RPS

JAS

Sexo

MMF

F

M

Idade(anos)

53

45

52

50

45

Peso(Kg)

57,5

69,5

41,0

54,5

63,7

Altura(m)

1,68

1,66

1,60

1,54

1,65

IMC(Kg/m2)

20

25

16

23

23

Tabela 6- Características clínicas dos pacientes diabéticos Tipo II obesos.

Pacientes

LBB

NMN

MABS

MPC

MSC

IBN

CLV

Sexo

F

F

F

F

F

MM

Idade(anos)

24

43

33

60

38

35

54

Peso(Kg)

79,0

70,0

77,0

68,0

64,5

98,5

84,0

Altura(m)

1,54

1,50

1,62

1,51

1,47

1,70

1,74

IMC(Kg/m2)

33

31

29

30

30

34

28

Tabela 7- Características metabólicas dos indivíduos do grupo controle normal.

Indivíduo Uréia Creat. Colest. Trigl. Glicose HbA1c Pró-insulina Insulina Peptídeo-C Relação RelaçãoMolar Molar

(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dl) (%) (pmol/mL) (pmol/mL) (pmol/mL) Pl/I l/Pept.C

JSSS

AAT

NSS

MASI

ALND

VLMS

DLO

JSS

MEPA

MASS

EJ

OBS

NCP

AMS

KMK

EM

37

33

25

44

18

23

21

28

32

15

28

25

22

29

24

28

0,7

1,2

0,9

1,0

0,6

0,8

0,6

0,9

0,7

0,8

0,7

0,4

0,6

0,8

0,6

0,9

180

120

190

148

190

180

190

180

130

170

190

180

160

180

180

180

8,0

4,5

7,0

4,0

9,0

9,0

9,0

6,0

8,0

6,0

10,0

8,0

7,0

8,0

9,0

6,0

82

80

81

86

89

89

90

89

76

82

77

94

91

98

84

103

5,3

4,7

5,3

6,6

7,0

4,2

5,1

3,8

5,7

6,8

4,7

6,0

5,7

4,15,45,2

0,016

0,016

0,022

0,017

0,016

0,015

0,019

0,017

0,010

0,022

0,025

0,023

0,029

0,021

0,017

0,014

0,074

0,064

0,061

0,052

0,039

0,068

0,059

0,078

0,076

0,061

0,049

0,068

0,076

0,054

0,055

0,060

0,301

0,364

0,278

0,165

0,328

0,401

0,341

0,304

0,271

0,235

0,165

0,450

0,477

0,308

0,665

0,235

0,22

0,25

0,34

0,48

0,41

0,22

0,32

0,22

0,24

0,36

0,51

0,34

0,38

0,39

0,31

0,40

0,24

0,18

0,22

0,32

0,12

0,17

0,17

0,25

0,28

0,26

0,29

0,15

0,16

0,17

0,08

0,26

IO

Tabela 8- Características metabólicas dos pacientes com insuficiência renal crônica.

Pacientes

NTJFLOBNSOMEHMSJNONMTRSEVSSMSCMFNPCCPVSSEMKMOEASLLFPPK

Uréia Creat. Glicose

(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)

16449

1651181752022421641823742

14356

13630

177230172256137

14,83,5

10,76,4

13,712,111,614,89,63,72,7

13,74,36,52,3

15,613,211,611,35,8

113119117101939795

1131169090

109106—

8682786680

130

HbA1c

(%)

9,05,97,14,75,78,3—9,08,57,26,710,89,8—7,58,38,6—6,7

7,8

Pró-insulina

(pmol/mL)

0,0440,0460,0490,0400,0420,0310,0490,0300,0380,0260,0320,0410,0330,0390,0370,0480,0590,0300,0440,023

Insulina

(pmol/mL)

0,1170,1410,1190,0390,0280,0410,1880,0580,1070,0680,0240,1760,1720,1480,0570,0620,0550,0630,1190,042

Peptídeo-C

(pmol/mL)

4,8491,8573,0952,0361,4492,1522,3572,2741,7212,9162,6252,6842,5290,4870,1662,8964,0642,4991,2880,079

Relaçãomolar

Pl/I

0,380,330,411,021,500,760,260,520,360,381,330,230,190,260,650,771,070,480,370,55

Relaçãomolarl/Pept.C

0,020,080,040,020,020,020,080,020,060,020,010,060,070,300,340,020,010,020,090,53

COu

Tabela 9- Características metabólicas dos pacientes com insulinoma.

Pacientes Glicose Pró-insulina Insulina Peptídeo-C Relação Relação

Molar Molar

(mg/dL) (pmol/mL) (pmol/mL) (pmol/mL) PI/1 l/Pept.C

EPB

MELV

MMG

FAV

EJCL

PFL

31

38

62

40

32

30

0,06

0,09

0,33

0,12

0,26

0,26

0,09

0,19

0,56

0,12

0,31

0,26

0,43

0,64

1,69

1,37

1,86

1,17

0,7

0,5

0,6

1,0

0,8

1,0

0,2

0,3

0,3

0,1

0,2

0,2

Tabela 10- Características metabólicas das mulheres obesas.

Pacientes

SLRMLALRSONBVANEMSMSMRSCSMCYASMAMGPMCMLTJSVSDPSFCPSVSSLSFAAPRRGGAMAOMJJC

Uréia Creat. Glicose

(mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)

2423183725262627—51352321293037——34252030

0,60,70,70,81,00,60,90,8—0,70,90,80,90,70,70,90,80,60,71,00,70,6

969584

10210988

1068097

10697808378848696

10783

1038380

HbA1c

(%)

6,2—5,7—5,26,76,74,74,9

- 4,17,75,36,6———5,63,8————

Pró-insulina

(pmol/mL)

0,0140,0190,0210,0330,0350,0170,0150,0120,0300,0210,0290,0160,0240,0360,0290,0130,0340,0310,0250,0400,0270,011

Insulina

(pmol/mL)

0,0840,0550,1420,0980,3220,1720,2240,8181,3780,2990,1010,1050,0830,1210,0570,0550,0920,1190,0580,1190,0590,065

Peptídeo-C Relação

(pmol/mL)

0,1420,1030,0190,6090,7570,2120,4340,0790,0830,8310,7780,3380,4990,6120,1750,3380,0491,1320,1691,1190,5760,225

MolarPl/I

0,170,340,150,340,110,090,070,010,020,070,290,150,290,290,510,240,370,260,430,340,460,17

RelaçãoMolar

l/Pept.C

0,590,530,860,160,420,810,52

10,356,600,360,130,310,170,190,320,161,880,100,340,110,100,29

uw

Tabela 11- Características metabólicas dos pacientes diabéticos Tipo II não obesos.

Pacientes Uréia Creat. Glicose HbA1c Pró-insulina Insulina

(mg/dl)

Peptídeo-C Relação Relação

Molar Molar

(mg/dL) (mg/dL) (%) (pmol/mL) (pmol/mL) (pmol/mL) Pl/I l/Pept.C

JFR

FMM

TMBR

RPS

JAS

22

27

—

29

20

0,8

0,8

0,8

0,7

1,0

326

335

174

175

340

15,1

16,4

8,3

—

—

0,021

0,041

0,040

0,046

0,021

0,046

0,056

0,056

0,085

0,073

0,182

0,679

0,589

0,986

0,096

0,45

0,73

0,71

0,54

0,29

0,25

0,08

0,09

0,09

0,76

u

Tabela 12- Características metabólicas dos pacientes diabéticos Tipo II obesos.

Pacientes Uréia Creat. Glicose HbA1c Pró-insulina Insulina Peptídeo-C Relação Relação

Molar Molar

(mg/dl) (mg/dL) (mg/dL) (%) (pmol/mL) (pmol/mL) (pmol/mL) Pl/I l/Pept.C

LBB

NMN

MABS

MPC

MSC

IBN

CLV

25

26

28

40

—

—

46

0

0

0

1

0

1

,7

,6

,8

,0

,8

,1

244

306

322

471

319

342

185

17

9

9

8

11,

8

,3

,3

,8

,0

,9

,0

0,049

0,102

0,048

0,045

0,032

0,025

0,049

0

0

0

0

0

0

0

,079

,085

,079

,106

,090

,067

,101

0

0

0

1

0

1

0

,828

,635

,328

,738

,592

,026

,351

0,62

1,20

0,61

0,42

0,35

0,37

0,49

0,09

0,13

0,24

0,06

0,15

0,07

0,29

desenvolvimento e padronizaÇÃo da tÉcnica de ...pelicano.ipen.br/posg30/textocompleto/martha do...

Documents