desenvolvimento e aplicação das análises toxicológicas no
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análises Toxicológicas
Desenvolvimento e aplicação das análises toxicológicas
no diagnóstico e prognóstico da intoxicação aguda por
paraquat e diquat
Rafael Menck de Almeida
Dissertação para obtenção do grau de MESTRE
Orientador Prof. Dr. Mauricio Yonamine
São Paulo, 2007
Rafael Menck de Almeida
Desenvolvimento e aplicação das análises toxicológicas no
diagnóstico e prognóstico da intoxicação aguda por
paraquat e diquat
Comissão julgadora da
Dissertação para obtenção do grau de Mestre
Prof. Dr. Mauricio Yonamine Orientador / presidente
Dra. Maria Zilda Nunes Carrazza
Prof. Dra. Elizabeth de Souza Nascimento
São Paulo (SP), 18 de dezembro de 2007.
Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Almeida, Rafael Menck de
A447d Desenvolvimento e aplicação das análises toxicológicas no
diagnóstico e prognóstico da intoxicação aguda por paraquat e
diquat / Rafael Menck de Almeida. – São Paulo, 2007.
111p.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas.
Orientador: Yonamine, Mauricio
1. Análises toxicológicas 2. Praguicidas : Toxicologia I.
T. II. Yonamine, Mauricio, orientador.
615.907 CDD
Dedico este trabalho
aos meus pais José Reinaldo e Rita
por me mostrarem que o trabalho,
honestidade e dedicação
são as melhores escolhas;
aos meus irmãos Rogéria e Dido pelo carinho e amizade;
à minha namorada Yara Popst pelo
carinho e compreensão nos momentos
difíceis para a conclusão desta dissertação.
Ao Prof. Dr. Mauricio Yonamine
Pela amizade, confiança e orientação nesta
dissertação e pelos ensinamentos que proporcionaram
meu crescimento pessoal e profissional.
AGRADECIMENTOS
A Deus por me conceder a vida.
Ao professor Maurício Yonamine pela amizade e orientação.
À FAPESP pelo financiamento do projeto e a CAPES pela concessão de
bolsa de estudos.
Às Professoras Doutoras Alice A. da Matta Chasin e Cristiana Leslie Correa
pelas importantes sugestões no exame de qualificação.
Ao Professor Dr. Ernani Pinto pela amizade e pelas importantes sugestões
no exame de qualificação.
À Professora Dra. Yoko Oshima Franco pelo incentivo na escolha da
Toxicologia.
Aos meus amigos pós-graduandos, Daniela, Carolina, Marli, Melissa, Felipe,
Alexandre, Sandrinha, Kaline, Daniela, Cristina, Leandro, Tiago, Rafael
Lanaro, Emerson, Larissa, Cecília, Stella, Paula, Vânia, Vanessa e Faby
pela convivência pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho.
Ao amigo de pós-graduação Sidnei (Nóia) pelo auxílio na síntese dos
padrões.
Aos colegas do Laboratório de Análises Toxicológicas, funcionários e
estagiários, Ângelo, Helena, Roseli, Karla, Dalva e Luzia, pela colaboração
e amizade.
Aos colegas da República Solar dos Príncipes, Rodrigo, Fabriciano, Sidnei,
Filmon, Renato, George, Tiago e Maurício pelo convívio e amizade.
Ao Donizetti, Jane, Mayra, Hécio e Zenaide pelo carinho e incentivo.
Ao Jorge e Elaine pelo auxílio na documentação junto à secretaria de pós-
graduação.
À Leila Bonadio pela revisão das referências.
“Nenhum vento sopra a favor de quem não sabe pra onde ir.”
SênecaSênecaSênecaSêneca
“A vida é uma peça de teatro que não permite ensaios. Por isso,
cante, chore, dance, ria e viva intensamente, antes que a
cortina se feche e a peça termine sem aplausos”
Charles ChaplinCharles ChaplinCharles ChaplinCharles Chaplin
SUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 17
2. GENERALIDADES ............................................................................................................ 24
2.1 HERBICIDAS ................................................................................................................... 24
2.2 ESTRUTURA QUÍMICA E PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS ................................................ 26
2.2 TOXICOCINÉTICA ............................................................................................................ 28
2.3 EFEITOS TÓXICOS ........................................................................................................... 30
2.4 SUPORTES AO PACIENTE INTOXICADO .............................................................................. 34
2.5 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DA INTOXICAÇÃO AGUDA POR PARAQUAT E DIQUAT ................. 36
3. OBJETIVO E PLANO DE TRABALHO............................................................................... 45
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 47
4.1 MATERIAL ...................................................................................................................... 47
4.1.1 Reagentes e cartuchos de extração ...................................................................... 47
4.1.2 Soluções-padrão .................................................................................................... 47
4.1.3 Equipamentos e Acessórios ................................................................................... 48
4.1.4 Amostras ................................................................................................................ 48
4.2 MÉTODOS ...................................................................................................................... 49
4.2.1 Método Enzimático-Espectrofotométrico para detecção de paraquat e diquat em
amostras biológicas ........................................................................................................ 49
4.2.1.1 Preparação da amostra ....................................................................................... 50
4.2.1.2 Oxidação de NADPH ........................................................................................... 51
4.2.1.3 Linearidade .......................................................................................................... 51
4.2.1.4 Análises de amostras de urina ............................................................................ 51
4.2.2 Análise quantitativa confirmatória por cromatografia em fase gasosa acoplada à
espectrometria de massa (GC-MS) ................................................................................ 52
4.2.2.1 Preparação dos padrões reduzidos ..................................................................... 52
4.2.2.2 Preparação da amostra ....................................................................................... 53
4.2.2.3 Condições Cromatográficas ................................................................................ 54
4.2.3 Otimização do método ........................................................................................... 55
4.2.3.1 Estudo do pH ótimo para reação e extração dos analitos ................................... 56
4.2.3.2 Estudo da influência do tempo de reação no rendimento da derivatização ........ 56
4.2.3.3 Determinação da quantidade necessária de NaBH4 ........................................... 56
4.2.4 Validação do método ............................................................................................. 57
4.2.4.1 Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ) ..................................................... 57
4.2.4.2 Linearidade .......................................................................................................... 57
4.2.4.3 Precisão intra-ensaio e interensaio ..................................................................... 58
4.2.4.5 Aplicação do método em amostras de pacientes com suspeita de intoxicação . 59
5. RESULTADOS ................................................................................................................... 61
5.1 RESULTADOS OBTIDOS COM O MÉTODO ENZIMÁTICO-ESPECTROFOTOMÉTRICO ................. 61
5.1.1 Resultado do estudo de oxidação de NADPH ....................................................... 61
5.1.2 Resultado da linearidade do método enzimático em amostras de urina ............... 62
5.1.3 Resultado da análise de amostras de urina de pacientes com suspeita de
intoxicação ...................................................................................................................... 64
5.2 RESULTADO DO MÉTODO CONFIRMATÓRIO EM GC-MS ..................................................... 64
5.2.1 Resultado da preparação dos padrões reduzidos ................................................. 65
5.2.2 Cromatograma característico e espectros de massa do paraquat e diquat
reduzidos ......................................................................................................................... 66
5.2.3 Resultados do estudo do pH ótimo para extração ................................................. 68
5.2.4 Resultados do estudo da influência do tempo de reação no rendimento da
derivatização ................................................................................................................... 68
5.2.5 Estudo da influência da quantidade necessária de NaBH4 ................................... 69
5.2.6 Resultados da validação do método para determinação de paraquat e diquat em
plasma e urina ................................................................................................................. 70
5.2.6.1 Limite de detecção e quantificação ..................................................................... 70
5.2.6.2 Linearidade ......................................................................................................... 70
5.2.6.3 Precisão intra-ensaio e interensaio ..................................................................... 71
5.2.6.4 Recuperação ....................................................................................................... 72
5.3 RESULTADO DAS AMOSTRAS DOS PACIENTES COM SUSPEITA DE INTOXICAÇÃO ................... 73
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 77
7. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 90
8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 92
ANEXOS .............................................................................................................................. 104
RESUMORESUMORESUMORESUMO Uma das classes químicas de herbicidas que merece particular atenção é a dos bipiridílicos, representada pelo paraquat e diquat. Atualmente, muitos países têm banido ou restringido o uso destes herbicidas devido à grande quantidade de casos de intoxicação acidental, suicídio e envenenamento (tentativa de homicídio) ocorridos no passado. Em contrapartida, o paraquat ainda é bastante utilizado em cerca de 130 nações, com prevalência em países subdesenvolvidos ou em vias de desenvolvimento. O presente trabalho tem por objetivo o estudo e o desenvolvimento de métodos analíticos semi-quantitativo e quantitativo em amostras biológicas (plasma e urina) e aplicação no diagnóstico e investigação da intoxicação aguda por paraquat e diquat. Análises semi-quantitativas de triagem foram realizadas pela técnica enzimática-colorimétrica. Análises confirmatórias foram realizadas pela técnica de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). Após o desenvolvimento e validação dos métodos, as análises foram aplicadas em amostras de pacientes suspeitos de intoxicação aguda por paraquat/diquat atendidos no Hospital Regional do Vale do Ribeira (Pariquera-Açu) e no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (SP). Foram avaliadas a efetividade do teste rápido semi-quantitativo e a correlação das concentrações plasmáticas e urinárias do paraquat/diquat obtidas com o método por GC-MS com o grau de intoxicação e o prognóstico de sobrevida dos pacientes após o diagnóstico e tratamento.
ABSTRACTABSTRACTABSTRACTABSTRACT One of the chemical classes of herbicides that deserve particular attention is that of bipyridyl, represented by paraquat and diquat. Currently, many countries have banned or restricted these herbicides since large number of accidental intoxication, poisoning and suicide attempt cases occurred in the past. In spite of this, paraquat is still used in more than 130 countries, with prevalence in developing countries. The aim of this work was the study and the development of a screening test and a quantitative analytical method in biological samples (plasma and urine) and their application in diagnosis and prognosis of acute paraquat and diquat intoxication. Semi-quantitative analyses were performed by an enzymatic-colorimetric technique. Confirmatory analyses were performed by a gas chromatographic-mass spectrometric (GC-MS) method. After the development and the validation of both methods, analyses were applied to samples from patients suspected of acute paraquat/diquat poisoning attended in Hospital Regional do Vale do Ribeira (Pariquera-Açu) and Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (SP). In this present paper, we also evaluated the effectiveness of the rapid test and the correlation of paraquat/diquat plasma and urinary concentrations obtained with the GC-MS method with the degree of intoxication and prognosis of survival of patients after diagnosis and treatment.
IIIIntroduçãontroduçãontroduçãontrodução
Introdução 17
1. INTRODUÇÃO
A classe dos herbicidas bipiridílicos é composta pelas seguintes
substâncias: chlormequat, difenzoquat, mepiquat, diquat e paraquat (Figura
1). O protótipo desse grupo e o mais utilizado no mundo como herbicida de
contato é sem dúvida o paraquat (CAVALLI, 2002). O paraquat foi
primeiramente sintetizado em 1882, mas sua propriedade como herbicida só
foi descoberta em 1959. A partir de 1962, seu uso difundiu-se por todo o
mundo devido principalmente à sua baixa ação residual e à possibilidade de
utilização para um grande e diversificado número de culturas (BRASIL,
2000).
N N
2Cl-
Paraquat
N N
2Br
Diquat
Cl(CH2)2N(CH3)3 Cl
Clormequat
NNCH3SO4-
Difenzoquat
NCl
Mepiquat
Figura 1. Estrutura química dos principais herbicidas bipiridílicos.
Atualmente o paraquat é amplamente utilizado em vários países do
mundo nas culturas de abacate, abacaxi, algodão, arroz, aspargo, banana,
batata, beterraba, cacau, café, cana-de-açúcar, chá, citros, coco, couve,
Introdução 18
feijão, maçã, milho, pastagens, pêra, pêssego, seringueiras, soja, sorgo,
trigo, uva e no controle de plantas classificadas como daninhas do ambiente
aquático (BROMILOW, 2003; ANVISA, 2003).
O paraquat é comercializado com os nomes de Dextrone X e
Gramoxone. É ingrediente do Dexuron, Pathclear e Weedol. O diquat é
comercializado com o nome de Aquacide e Reglone. Também é
ingrediente ativo do Pathclear e Weedol (MOFFAT et al., 2004). Portanto,
em algumas formulações comerciais, paraquat e diquat são utilizados em
associação.
Devido à dificuldade de encontrar dados a respeito da
comercialização de paraquat no mundo, optou-se por dados de uma
Organização Não Governamental (ONG). De acordo com levantamento
realizado pela Pesticide Action Network Europe (PAN), em 2003, foi
verificado que o grande mercado de paraquat se concentra nos países
subdesenvolvidos como El Salvador, Guatemala, Honduras, Nicarágua,
Brasil, Panamá e outros. De fato, as vendas do paraquat na América
Central, América do Sul e Ásia representam por volta de 75% da venda
mundial desse praguicida, enquanto na União Européia esse índice chega a
apenas 8% do consumo mundial (Figura 2) (PAN, 2007).
Introdução 19
Figura 2. Uso do paraquat por continente (PAN, 2007).
De acordo com uma pesquisa realizada em 2000,
surpreendentemente os Estados Unidos aparecem como o país que mais
utiliza paraquat no mundo, seguidos da Coréia do Sul, Brasil, China,
Tailândia, México, Japão, Malásia, Colômbia, Espanha, Índia e Guatemala
(Figura 3) (PAN, 2007).
Introdução 20
Figura 3. Países que mais utilizam paraquat no mundo (PAN, 2007).
Em decorrência da falta de antídoto especifico para reverter o quadro
clínico do paciente (SERRA et al., 2003), índices de mortalidade superior a
70% têm sido registrados na literatura após exposição aguda (SCHMITT,
2006; GELLER, 2007). Acidentes ocupacionais, quando ocorrem, envolvem
efeitos corrosivos devido ao contato com a pele, mucosas e olhos.
Entretanto, um grande número de intoxicações graves e fatalidades têm
sido relatados como conseqüência da ingestão de formulações líquidas de
paraquat (contendo de 20 a 40%). Na maioria das vezes, a ingestão é
intencional (tentativa de suicídio), mas acidentes, principalmente envolvendo
crianças, têm ocorrido quando o produto é manipulado ou armazenado
incorretamente (BAGCHI, 1993). Ocasionalmente, o paraquat também tem
sido utilizado como agente de envenenamento (TINOCO et al., 1993).
Introdução 21
Segundo WESSELING (2001), muitos países baniram o uso de
paraquat em seu território. O paraquat foi proibido na Suécia, Finlândia e
Áustria devido à toxicidade aguda e à falta de antídoto específico para
reverter este quadro de intoxicação. Na Noruega, os próprios fabricantes
cancelaram espontaneamente o registro para a produção do paraquat. Na
Alemanha e Holanda o paraquat foi banido devido à persistência deste no
solo.
Como visto anteriormente, o Brasil é um dos principais mercados
consumidores para o paraquat e conseqüentemente, casos de intoxicações
têm sido registrados em todo país (KOZIKOSKI, 1999; CAVALLI, 2002;
PIRES, 2005; SCHMITT, 2006; DE ANDRADE, PARÁ & OLIVEIRA, 2007).
Uma vez que a severidade e o prognóstico da intoxicação por
paraquat/diquat correlacionam-se bem com suas concentrações no sangue
e urina, métodos sensíveis e rápidos, capazes de determinar estes
compostos em material biológico são de grande importância nas
investigações clínicas e toxicológicas. Para a análise de triagem qualitativa,
métodos espectrofotométricos foram propostos com a utilização de ditionito
de sódio (KUO et al., 2001; FUKE et al., 1992; MOFFAT et al., 2004). Com
esse método, somente são detectadas concentrações acima de 2,0 mg/L.
Para a quantificação, a técnica de cromatografia líquida é geralmente
empregada (GILL et al., 1983; LEE et al., 1998; ARYS et al., 2000; CASTRO
et al., 2001; TAYLOR et al., 2001; PAIXÃO et al., 2002; FUKE et al., 2002;
LEE et al., 2004). Entretanto, nenhum trabalho se refere à detecção por
técnicas enzimáticas e poucos métodos foram desenvolvidos empregando a
Introdução 22
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-
MS) na determinação desses compostos em matrizes biológicas. Desta
forma, a proposta do presente trabalho foi o desenvolvimento e aplicação de
métodos analíticos para a identificação de paraquat e diquat em amostras
biológicas, utilizando a via enzimática-espectrofotométrica como técnica de
triagem e a cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de
massas (GC-MS) como técnica confirmatória. Os herbicidas foram
determinados em amostras de plasma e urina de pacientes com suspeitas
de intoxicação aguda admitidos no Hospital Regional do Vale do Ribeira
(Pariquera-Açu-SP) e no Hospital de Clínicas da Universidade de Campinas
(HC-Unicamp). Os resultados das análises foram avaliados,
correlacionando-se as concentrações plasmáticas e urinárias do
paraquat/diquat com o grau de intoxicação e o prognóstico de sobrevida dos
pacientes após o diagnóstico e tratamento.
GeneralidadesGeneralidadesGeneralidadesGeneralidades
Generalidades 24
2. GENERALIDADES
2.1 Herbicidas
Herbicidas são substâncias utilizadas para controlar ervas
classificadas como daninhas. Sua origem está no latim: herba que significa
erva e caedere que significa matar. A importância do uso dessas
substâncias na lavoura está no fato de que as ervas classificadas como
daninhas competem em nutrientes, água, luz e espaço com as outras
culturas.
De acordo com o modo de ação e o tempo de aplicação em relação
com o desenvolvimento da erva, os herbicidas podem ser classificados
como: residuais, de contato, sistêmicos, pré-plantação, pré-emergente, pós-
emergente, não-seletivo e seletivo (BUCHEL, 1983 apud CÓRDOVA, 2003):
• Residuais - permanecem no solo o tempo suficiente para matar as
ervas classificadas como daninhas no momento da germinação.
Estes produtos geralmente não são tóxicos para a planta cultivada.
Aplica-se depois do cultivo e antes do nascimento da cultura.
• De contato - matam as plantas nas quais entram em contato. Sua
ação tóxica é muito curta e se decompõe rapidamente.
• Sistêmicos – penetram na planta, distribuindo-se por todo
organismo. Também são denominados herbicidas por translocação.
Generalidades 25
• Pré-plantação – são aplicados logo após a preparação do solo,
porém antes da plantação.
• Pré-emergente – são aplicados antes da germinação das sementes
das ervas classificadas como daninhas.
• Pós-emergente – são aplicados após o nascimento das ervas
classificadas como daninhas e da planta cultivada.
• Não seletivo ou total – destroem toda a vegetação sobre qual se
aplica, podendo ser seletivo se aplicado em doses menores.
• Seletivos – em condições normais, destroem as ervas classificadas
como daninhas e não o cultivo. Em um tratamento seletivo devem-se
considerar vários fatores como a máxima uniformidade possível na
distribuição do produto, a natureza da planta, a dose exata
recomendada e o uso de produto de atividade específica.
A efetividade dos herbicidas pode variar segundo inúmeros fatores
como: absorção, natureza do solo, acidez do solo, disponibilidade dos
herbicidas no solo, natureza do herbicida, umidade, volatilização,
degradação, atividade solar, temperatura, precipitação, vento e outros
fatores (BUCHEL, 1983 apud CÓRDOVA, 2003).
O paraquat e diquat podem ser aplicados nas culturas como pós-
emergentes e dessecantes. O limite máximo de resíduo (LMR) para
paraquat varia de 0,05 a 0,2 mg/Kg e para o diquat de 0,02 a 0,5 mg/Kg,
com intervalos de segurança que variam de 1 a 7 dias para paraquat e de 1
Generalidades 26
a 16 dias para diquat. A ingestão diária aceitável (IDA) é de 0,004 mg/Kg
para paraquat e 0,002 mg/Kg para diquat. O paraquat está classificado
como classe 1 e o diquat classe 2 (ANVISA, 2003).
2.2 Estrutura Química e Propriedades Físico-químicas
Os compostos chlormequat, difenzoquat, mepiquat, diquat e paraquat
são herbicidas pertencentes à classe do bipiridílicos. Dentre estes
herbicidas, o mais utilizado é o paraquat, seguido do diquat. O paraquat
(1,1-dimetil-4,4-bipiridil) e o diquat (1,1-etileno-2,2-bipiridil) são compostos
quaternários de amônio. O diquat é constituído por dois anéis piridílicos
unidos pela posição orto e também pelo nitrogênio do anel que mantém a
dupla carga positiva da molécula. O paraquat por sua vez tem uma estrutura
maior sendo que os dois anéis piridílicos encontram-se unidos de maneira
que os átomos de nitrogênio encontram-se diametralmente opostos
(posição para) (Figura 4) (WHO, 1984).
Figura 4. Estrutura química do paraquat e diquat.
NN CH3CH3
++
Paraquat
N N+ +
Diquat
Generalidades 27
Os herbicidas diquat e paraquat são sólidos cristalinos, incolores,
higroscópicos e em suas formulações comerciais são líquidos de cor
marrom. Estes herbicidas, por serem sais de amônio quaternário têm
elevada polaridade, sendo altamente solúveis em água, ligeiramente
solúveis em metanol e praticamente insolúvel em solventes orgânicos.
Paraquat e diquat em formulações aquosas não são explosivos e
nem inflamáveis, são estáveis em meio levemente ácido ou neutro, mas
podem ser hidrolisados em soluções fortemente alcalinas. Na Tabela 1 são
apresentadas as propriedades físico-químicas do paraquat e do diquat.
Tabela 1 - Propriedades físico-químicas do paraquat e diquat (WHO, 1984).
Propriedades físico-químicas Diquat Paraquat
Densidade (g/L) (20º C) 1,200 1,240 – 1,260
Ponto de Fusão ºC 300 com decomposição ~300 com decomposição
Solubilidade em água (g/L) (20º C) 700 700
pH de formulações líquidas 6,0 – 7,0 6,5 – 7,5
Volatilidade Não volátil Não volátil
Pressão de vapor Não determinada Não determinada
Generalidades 28
2.2 Toxicocinética
Embora existam relatos de intoxicações por via dérmica, vaginal,
ocular, injeção intramuscular, subcutânea e endovenosa, as intoxicações
resultantes da ingestão de paraquat, acidentais ou por tentativa de suicídio
são as mais importantes do ponto de vista toxicológico (ONG, 1989;
PEDRAZZINI, 1991; GARNIER et al., 1994; CHANDRASIRI, 1999; XARAU,
2000; HSU et al., 2001; RIVERO-GONZÁLEZ et al., 2001; SOLOUKIDES,
2007).
A absorção do paraquat e diquat não ocorre quando em contato com
a pele íntegra, devido à alta polaridade destes compostos; porém quando
grandes quantidades dos herbicidas entram em contato com a pele
provocam irritações e ulcerações, tornando-se permeável e ocorrendo a
absorção por esta via.
Pela via respiratória o paraquat e diquat não oferecem grandes
riscos, e dificilmente são inalados, pois são compostos praticamente não-
voláteis (pressão de vapor ser praticamente nula). A inalação pode ocorrer,
entretanto, quando gotículas são produzidas pelos aparelhos de
vaporização. Neste caso, as partículas em suspensão formadas durante a
pulverização das culturas são relativamente grandes, ficando retidas nas
vias aéreas superiores e não atingindo os alvéolos (PEDROSA, 1984).
O paraquat quando ingerido (acidental ou intencional) causa lesões
cáusticas em todo trato gastrintestinal, principalmente na boca, esôfago e
garganta. A alta polaridade destes herbicidas caracteriza uma baixa
Generalidades 29
absorção pelo trato gastrintestinal (> 10%), porém pode ser rapidamente
absorvido: seu pico plasmático por ser atingido aproximadamente de 2-4
horas após a ingestão. Em geral, a presença de alimento no estômago pode
reduzir a absorção deste herbicida (BISMUTH et al., 1987; POND, 2001;
GELLER, 2007).
O paraquat se distribui por vários órgãos como pulmões, rins,
fígados, tecidos musculares e praticamente por todo o organismo. O volume
de distribuição é por volta de 1,2 – 1,6 L/kg, não se ligando às proteínas
plasmáticas. A concentração pulmonar pode chegar a ser 20 vezes maior
quando comparada à plasmática. A alta concentração renal reflete o papel
dos rins na eliminação do paraquat: mais de 90% da dose absorvida é
eliminada como composto inalterado por essa via em período de 12 a 24
horas após a exposição. A ½-vida do paraquat está em torno de 5 horas
(BISMUTH et al., 1987; POND, 2001; GELLER, 2007).
Mesmo após os níveis plasmáticos estarem muito baixos, a
concentração de paraquat nos pulmões continua a apresentar níveis
relativamente altos. Esse fenômeno é reflexo da captura do paraquat pelas
células epiteliais alveolares tipo I e tipo II, a chamada via de captação de
poliaminas. A captura é resultado da similaridade estrutural entre o paraquat
e poliaminas biogênicas como a putrescina e a espermidina, essenciais
para o crescimento celular. Essas substâncias são ativamente captadas nos
pulmões por um sistema transportador na membrana que tem
especificidade por compostos com duas aminas quaternárias carregadas
Generalidades 30
positivamente e separadas por uma distância de 0,6 a 0,7 nm, o que não se
aplica ao diquat (Figura 5) (POND, 1998).
Foi observado que, mesmo em pacientes que ingeriram altas doses,
as funções renais e o clearance do paraquat permanecem inalterados
durante horas. Como a deterioração da função renal e a liberação do
paraquat retido nos pulmões e músculos para a corrente sangüínea é lenta,
baixas concentrações de paraquat podem ser detectadas na urina por
vários dias após a exposição (POND, 1998).
Estudos posmortem mostraram que o paraquat se distribui
preferencialmente no rim, pulmão e fígado, sendo também detectável na
tiróide, testículos, humor vítreo e líquido cérebro-espinal, atravessando a
placenta, onde atinge valores mais elevados que no sangue da mãe
(TSATSAKIS, 1996).
2.3 Efeitos tóxicos
Indiferente da via de exposição, os pulmões são os órgãos que
apresentam as mais sérias alterações patológicas causadas pelos efeitos
tóxicos do paraquat. O principal mecanismo de intoxicação do paraquat está
no ciclo de oxido-redução que ocorre no pneumócito, no qual se utiliza
nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADPH) como doador de elétrons para
a formação de paraquat monoradical cátion (PQ+•). A reação espontânea
deste monoradical com o oxigênio molecular retorna a forma original de
duplo-cátion do paraquat (PQ++), que pode ser reduzido novamente. Esse
Generalidades 31
processo, conhecido como ciclo redox, é abastecido pelo suprimento de
elétrons e O2 presente em grandes quantidades nos pulmões. Esta reação e
as reações subseqüentes explicam porque a presença do O2 aumenta a
toxicidade do paraquat. Nesta reação também é produzido o ânion
superóxido (O2-•) que é convertido em peróxido de hidrogênio (H2O2) pela
enzima superóxido dismutase. O ânion superóxido e o H2O2 também
produzem uma série de reações catalisadas por ferro na produção de
radicais hidroxila (OH•). Estas espécies reativas podem reagir com lipídios
poliinsaturados (lipoperoxidação) formando hidroperóxidos lipídios que, por
sua vez, reagem com lipídios insaturados, perpetuando a reação destrutiva
(degradação de membranas celulares) (POND, 1998; ECOBICHON, 2001;
WOOLLEY, 2004).
O diquat produz efeitos tóxicos similares àqueles observados com o
paraquat exceto pela extensão de danos pulmonares e fibrose progressiva.
Este fato pode ser explicado pela falta de afinidade do diquat com os
sistemas de captação de poliaminas das células epiteliais alveolares.
Experimentos realizados em animais utilizando altas doses de diquat
demonstraram que os órgãos alvos são: trato gastrintestinal, fígado e rins. A
necrose tecidual está associada com o mecanismo de ação semelhante ao
do paraquat, onde a peroxidação lipídica é desencadeada (ECOBICHON,
2001; MOFFAT et al., 2004).
A intoxicação aguda por paraquat é caracterizada pela combinação
de sinais e sintomas que incluem dores abdominais e torácicas, secreções
sanguinolentas, dispnéia, anóxia, fibrose progressiva, coma e morte. Apesar
Generalidades 32
das lesões pulmonares serem as mais preocupantes, o paraquat induz
hemorragias e danos a múltiplos órgãos como fígado, rins e coração
(ECONBICHON, 2001; MOFFAT et al., 2001). O paraquat é um dos mais
específicos agentes tóxicos pulmonares conhecidos (CAVALLI, 2002). Dois
tipos de intoxicações fatais são observados: uma intoxicação fulminante que
leva à morte em algumas horas e uma forma menos grave, que pode durar
cerca de algumas semanas, conduzindo progressivamente para fibrose
pulmonar letal (SERRA et al., 2003).
Generalidades 33
Figura 5. Mecanismo de ação tóxica do paraquat. (A) Transporte ativo do paraquat (PQ2+) e putrescina através da membrana alveolar pela via de captação de poliaminas. (B) Redução do NADPH e oxidação do PQ2+ para o monoradical cátion (PQ+•). (C) Formação de espécies reativas de oxigênio, promovendo lipoperoxidação e morte celular e ação de sistemas antioxidantes (superóxido dismutase-SOD e glutationa peroxidase-GPX) (modificado de SMITH, 1987).
NADPH
NADP+
PQ2+
PQ+•
receptor
H3N (CH2)4 NH3
+ +NN CH3CH3
++
............ 0,702 ............ ........ 0,622 ........
Paraquat (PQ2+) Putrescina (A)
EXTRACELULAR
Membrana epitelial
alveolar
INTRACELULAR
NADPH NADP+
O2-•
O2
2 O2-•
+ 2H+ O2 + H2O2
SOD
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ OH• + OH
-
lipoperoxidação
morte celular H2O
GSSG
GSH
GR GPx
(B)
(C)
Generalidades 34
2.4 Suportes ao paciente intoxicado
Qualquer paciente exposto ao paraquat deve ser considerado como
caso de urgência, mesmo se os sinais e sintomas típicos da intoxicação não
forem visíveis. Quando o paciente for diagnosticado, o tratamento deve ser
vigoroso e iniciado rapidamente (POND, 1998). Os principais sinais e
sintomas iniciais incluem dor e queimação na boca, faringe, esôfago, dores
abdominais, irritação gastrintestinal, náuseas, vômitos, diarréia, letargia,
hipóxia, dispnéia, taquicardia, hiperpnéia, ataxia, hiperexitabilidade e
convulsão além de úlcera local e/ou necrose tecidual. Embora rara, a
perfuração do esôfago pode ocorrer (ECOBICHON, 2001; SCHMITT, 2006).
Até o momento, não existe antídoto eficaz que reverta os quadros
clínicos de uma intoxicação por paraquat. Desta forma, o tratamento da
intoxicação aguda baseia-se essencialmente em três pontos: prevenção da
absorção, aumento da velocidade de excreção do paraquat absorvido e
modificações dos efeitos tissulares do paraquat absorvido e não excretado
(POND, 2001; SERRA et al., 2003).
Os pacientes que ingeriram paraquat invariavelmente vomitam
devido ao seu efeito irritante ou às substâncias eméticas que são
acrescentadas em suas formulações comerciais. Entretanto, mesmo que o
paciente tenha vomitado, uma intervenção imediata se faz necessária na
tentativa de minimizar os efeitos do agente tóxico remanescente.
Embora alguns métodos alternativos tenham sido propostos para o
tratamento dessa intoxicação, o método mais indicado sugere lavagem
Generalidades 35
gástrica seguida pela administração de adsorventes minerais como a terra
de Fuller e/ou carvão ativado a fim de evitar ou diminuir a absorção do
paraquat e/ou diquat. Para promover maior grau de remoção do agente
tóxico, purgativos também podem ser administrados. A fração absorvida
pelo trato gastrintestinal pode ser removida por hemodiálise e/ou
hemoperfusão. Para evitar excessivo dano ao pulmão, alguns especialistas
sugerem que o suplemento de O2 deva ser reduzido ao nível suficiente para
manter uma aceitável demanda de 10% de oxigênio, para manter uma
pressão arterial de PO2 de 40 a 50 mmHg. Apesar dos pacientes poderem
sofrer de hipóxia e insuficiência respiratória, uma condição hiperbárica de
O2 é contra indicada, uma vez que esse procedimento pode aumentar os
efeitos tóxicos do paraquat nos alvéolos pulmonares (IPCS, 1995a;
ARIYAMA et al., 2000; BOTELLA DE MAGLIA & BELENGUER TARIN,
2000; ECOBICHON, 2001; CALDAS et al., 2004).
O aumento da eliminação renal ou diurese forçada também tem sido
indicado a fim de aumentar ou acelerar a excreção do paraquat por essa via
de eliminação. Para esse procedimento, utilizam-se soros, medicamentos,
manitol, suplementação de potássio e hemodiálise/hemoperfusão com
carvão ativado (SCHMITT, 2006).
A terapêutica medicamentosa também pode ser utilizada. Frente ao
mecanismo de ação do paraquat, é indicado o uso de beta-bloqueadores,
pois acredita-se que estes fármacos são capazes de bloquear o influxo de
paraquat para os pulmões, diminuindo assim o acúmulo neste órgão
(POND, 1998). Para diminuir ou minimizar o estresse oxidativo causado
Generalidades 36
pelo ciclo redox desencadeado pelo efeito tóxico do paraquat, a terapêutica
com medicamentos anti-oxidantes tem sido indicada. Para essa finalidade,
os mais utilizados são: desferoxamina, N-acetilcisteína, vitamina E, vitamina
C, selênio e anti-oxidante biológico (RIVERO-GONZÁLEZ et al., 2001;
POND, 2001; EDDLESTON, WILKS & BUCKLEY, 2003).
Acredita-se que a fibrose pulmonar possa ser diminuída com a
utilização de corticosteróides, imunossupressores, agentes fibrinolíticos,
radioterapia e colchicina (RIVERO-GONZÁLEZ et al., 2001; POND, 2001).
Devido aos danos causados pelo paraquat nos alvéolos, alguns
autores sugerem o transplante pulmonar como uma alternativa, podendo ser
mono ou bilateral (WALDER, 1997; LICKER, 1998). Existe o caso de um
paciente que foi submetido ao transplante bilateral de pulmão após
intoxicação por paraquat. Após sobrevida de seis meses, o paciente foi a
óbito por problema no miocárdio não descrito como sendo associado à
intoxicação (POND, 2001).
2.5 Métodos de diagnóstico da intoxicação aguda por paraquat e
diquat
As possibilidades de sobrevivência dos pacientes intoxicados com
paraquat estão diretamente relacionadas com o tempo decorrido da
ingestão do composto e ao tratamento adequado. Portanto, a rápida
definição do diagnóstico e a conduta terapêutica são fundamentais. Para
Generalidades 37
isso é necessário que se tenham métodos analíticos adequados e capazes
de mensurar o herbicida em material biológico.
A dose letal média por via oral para paraquat em animais (DL50) é de
22 e 262 mg/kg, dependendo da espécie (ECOBICHON, 2001). Para seres
humanos, embora a dose letal de paraquat esteja estimada por volta de 15
a 20 mL da formulação a 20%, há relatos de casos de mortes ocorridas com
doses tão baixas quanto 1 mL, tornando-se difícil fazer um prognóstico
baseado na dose ingerida (SERRA et al., 2003). Desta forma, a
quantificação do paraquat e/ou diquat em amostras biológicas constitui um
importante dado na avaliação do grau de exposição ao agente tóxico. Para
este fim, testes qualitativos rápidos (triagem) seguidos por testes
confirmatórios em amostras biológicas (sangue ou urina) são recomendados
(Tabela 2) (TAYLOR et al., 2001).
Quando um paciente chega a um hospital com suspeita de
intoxicação por paraquat, após os procedimentos de urgência
desempenhados pelos médicos, a coleta imediata das amostras biológicas
para o método de triagem é de extrema importância. O método de triagem
mais utilizado é o que envolve a reação de redução com ditionito de sódio
em meio alcalino. Nestas condições, o paraquat ou diquat recebem um
elétron e são reduzidos ao seu radical monocátion, gerando assim uma
coloração azul para o paraquat e uma coloração verde para diquat. O
método é bastante utilizado para triagem, porém a grande limitação é o seu
limite de detecção, pois concentrações abaixo de 1,0 mg/L de paraquat e
5,0 mg/L de diquat não são possíveis de serem detectadas. (IKEBUCHI,
Generalidades 38
YUASA & KOTOKU, 1988; IPCS, 1995a; POND, 1998; MOFFAT et al.,
2004).
Tabela 2 – Principais métodos para quantificação e detecção de paraquat e ou diquat.
SPE – Extração em fase sólida; Liq-liq. - Extração líquido líquido; GC-MS – Cromatografia em fase gasosa acoplado a espectrometria de massas; CE – Eletroforese capilar; HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência; HPLC-MS - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado à espectrometria de massas; HPLC-UV - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultra violeta.
Matriz Analito Extração Detecção Limite de quantificação Autor Ano
Plasma Paraquat e diquat Liq-liq GC-MS - DRAFFAN 1977
Urina Paraquat Liq-liq GC, GC-MS 200ng/mL LUKASZEWSKI 1985
Soro Paraquat e diquat SPE CE 0,5 µg/mL TOMITA 1992
Soro Paraquat - HPLC 0,4 µg/mL CROES 1993
Sangue, urina,
fígado, rim e bile
Diquat SPE HPLC - MADHU 1995
Urina Paraquat e diquat SPE CE 15 e 8 ng/mL WU e TSAI 1998
Plasma e urina
Paraquat e diquat Liq-liq CE-UV 13-23 ng/mL VINNER 2000
Plasma, urina e
conteúdo estomacal
Paraquat Liq-liq HPLC-DAD 32 e 63 µg/L ARYS 2000
Plasma e urina Paraquat SPE HPLC-UV 0,1 mg/L TAYLOR 2001
Plasma e soro Paraquat SPE HPLC 0,4 µg/mL PAIXÃO 2002
Amostras biológicas diversas
Paraquat e diquat
SPE HPLC-UV 1; 1; 0,02 e 0,02 ng/mL
FUKE 2002
Sangue e plasma Paraquat Injeção
direta HPLC 0,005 µg/mL BRUNETTO 2003
Urina e sangue
Paraquat e diquat SPE HPLC-
MS 10 e 5 ng/mL LEE 2004
Soro Paraquat e diquat Liq-liq HPLC 0,1 µg/mL ITO 2005
Soro Paraquat e diquat SPE HPLC 0,5 µg/mL HARA 2007
Generalidades 39
A técnica de espectrofotometria também pode ser aplicada na análise
destes herbicidas em material biológico. FUKE et al. (1992) empregaram a
desproteinização do plasma com ácido sulfosalicílico e para redução dos
analitos, o ditionito de sódio. Os dados foram analisados com a aplicação da
segunda derivada, que consiste em um método matemático de
processamento de espectros onde busca eliminar os interferentes e realçar
os espectros.
Para a análise quantitativa destes herbicidas em amostras biológicas,
alguns métodos têm sido propostos na literatura científica. Os métodos que
possibilitam a quantificação do herbicida são: a cromatografia gasosa (GC),
a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a eletroforese capilar
(CE). De fato, a grande maioria dos métodos utilizados para esse fim usa a
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e seus diferentes
tipos de detectores (GILL et al., 1983; CROES, MARTENS & DESMET,
1993; LEE et al., 1998; ARYS et al., 2000; CASTRO et al., 2001; TAYLOR
et al., 2001; PAIXÃO et al., 2002; FUKE et al., 2002; LEE et al., 2004; ITO,
2005).
Para a quantificação de paraquat por HPLC, no preparo das
amostras (plasma, soro e sangue total) utilizaram-se inicialmente as
técnicas de precipitação de proteínas por meio da adição de ácidos, sais e
solventes orgânicos (CROES, MARTENS & DESMET, 1993; ARYS et al.,
2000; PAIXÃO et al., 2002; FUKE et al., 2002; BRUNETTO, 2003).
Com relação à extração dos herbicidas das matrizes biológicas,
algumas técnicas são descritas, sendo na grande maioria empregada a
Generalidades 40
extração em fase sólida com cartuchos C18 (CROES, MARTENS &
DESMET, 1993; FUKE et al., 2002). Embora ARYS (2002) tenha
empregado éter etílico na técnica de extração líquido-líquido, este tipo de
extração não é muito utilizado devido à alta polaridade do paraquat e diquat.
Para a aplicação deste tipo de extração, os analitos devem ser previamente
derivatizados a fim de torná-los menos polares.
O detector de ultravioleta com comprimento de onda entre 258 a 290
nm é mais comumente utilizado nas técnicas onde se empregam HPLC
(PAIXÃO et al., 2002; FUKE et al., 2002; BRUNETTO, 2003). O detector
ultravioleta pode também ser utilizado no método de varredura com o auxílio
do detector de fotodiodo (ITO, 2005). LEE et al., (2004) utilizou
espectrometria de massas acoplado à cromatografia líquida (LC-MS).
A técnica de extração em fase sólida (SPE) de paraquat e diquat
também pode ser empregada em análises para quantificação desses
herbicidas por eletroforese capilar (CE). Para a demonstração da eficiência
da extração em fase sólida, WU & TSAI, (1998) desenvolveram dois
métodos para análise de paraquat e diquat em urina, sendo que em um
método utilizaram a técnica de injeção direta e no segundo empregaram a
SPE. Neste experimento, os limites de detecção obtidos com injeção direta
foram de 0,1 e 0,2 mg/mL (para paraquat e diquat, respectivamente) e com
o método utilizando SPE os limites de detecção foram de 15 e 8 nm/mL
(TOMITA et al.,1992; WU & TSAI, 1998; VINNER et al., 2001).
VINNER et al. (2001) extraíram paraquat e diquat com fenol liquefeito
para posterior quantificação por CE. O detector comumente utilizado na CE
Generalidades 41
é o ultravioleta, porém a espectrometria de massas também tem sido
empregada em conjunto com eletroforese capilar para a determinação
destes herbicidas em amostras biológicas (NÚÑEZ, MOVANO & GALCERA,
2002).
A alta polaridade e a baixa volatilidade dos herbicidas paraquat e
diquat não permitem a análise direta por cromatografia em fase gasosa.
Devido a essa limitação, um método foi proposto utilizando boridreto de
sódio como agente derivatizante para preparar as substâncias e deixá-las
aptas a serem extraídas por meio apolar (éter etílico) e analisadas por
cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas
(DRAFFAN et al., 1977; LUKASZEWSKI, 1985).
Métodos analíticos para quantificação de paraquat/diquat em
amostras biológicas podem fornecer um prognóstico de sobrevida de
indivíduos intoxicados. SCHERRMANN et al. (1987) realizaram um estudo
com 53 casos de intoxicação por este herbicida e verificaram que
concentrações urinárias menores que 1,0 mg/L quando coletada nas
primeiras 24 horas, representavam sobrevivência do paciente. As
concentrações urinárias daqueles que morreram dentro de 24 horas
estavam entre 10 a 10.000 mg/L e as concentrações daqueles que
morreram posteriormente de fibrose pulmonar estavam entre 1 a 1,000
mg/L.
A concentração plasmática do agente tóxico medida em função do
tempo decorrente da exposição aguda também pode ser determinante para
o prognóstico da sobrevivência do intoxicado. O ideal é que essa medidab
Generalidades 42
seja exponencialmente menor a partir das primeiras quatro horas após a
exposição ao agente (SCHMITT et al., 2006). JONES et al. (1999),
analisaram 375 casos de intoxicação por paraquat e com os resultados
obtidos construíram uma equação matemática na qual a probabilidade de
sobrevivência era correlacionada com a concentração plasmática de
paraquat em um determinado tempo após a ingestão do praguicida.
Baseado neste aspecto, HART et al. (1984) construíram nomograma,
(Figura 6) no qual concentrações plasmáticas de paraquat determinadas em
amostras coletadas dentro de um período de até 28 horas após ingestão,
eram correlacionadas com a evolução dos efeitos tóxicos. No nomograma
apresentado é possível observar que a concentração plasmática de 1
µg/mL, após quatro horas de ingestão, representaria 50% de chance de
sobrevivência e que se esta fosse menor que 0,5 µg/mL poderia passar
para até 90% de chance. Desta forma, a determinação da concentração
plasmática do paraquat poderia indicar o prognóstico da sobrevivência do
indivíduo exposto agudamente a este herbicida (SCHMITT et al., 2006).
Generalidades 43
Figura 6. Probabilidade de sobrevivência do indivíduo após a ingestão do paraquat através da correlação da concentração plasmática em µg/mL e o tempo em horas após a ingestão, segundo Hart, 1984. Retirado de SCHMITT et al., (2006).
ObjetivoObjetivoObjetivoObjetivo
Objetivo 45
3. Objetivo e plano de trabalho
O objetivo do trabalho foi o desenvolvimento e a aplicação de
métodos qualitativo (triagem) e quantitativo para detecção e determinação
de paraquat e diquat em amostras de plasma e urina. Amostras de
pacientes com suspeita de intoxicação por estes praguicidas foram
submetidas aos métodos desenvolvidos. Os resultados foram avaliados
quanto a sua aplicabilidade na investigação clínica e os valores de
concentração sangüínea e urinária de paraquat/diquat foram
correlacionados com a evolução da intoxicação. Para obtenção deste
objetivo, o seguinte plano de trabalho foi seguido:
-Desenvolvimento e otimização dos métodos semi-quantitativo enzimático-
espectrofotométrico e confirmatório quantitativo por GC-MS.
-Validação dos métodos, avaliando-se parâmetros como limite de detecção
e quantificação, linearidade, precisão intra e interensaio e recuperação.
-Aplicação dos métodos validados em amostras de plasma e urina
provenientes de pacientes com suspeita de intoxicação por paraquat e/ou
diquat.
-Avaliação dos resultados obtidos, tentando correlacionar as concentrações
do agente tóxico medido nas amostras biológicas e o grau de intoxicação do
paciente.
Material Material Material Material e Me Me Me Métodosétodosétodosétodos
Material e Métodos 47
4. Material e Métodos
4.1 Material
4.1.1 Reagentes e cartuchos de extração
Boridreto de sódio, fosfato de potássio, hidróxido de sódio e carbonato
de sódio anidro foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha). O Cofator β-
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido (NADPH) e enzima
NADPH-P450 redutase humana foram obtidos da Sigma-Aldrich (Milwaukee,
EUA). Para o procedimento de extração em fase sólida (SPE), foram
utilizados cartuchos C18 com (360mg) da Waters (Milford, EUA).
4.1.2 Soluções-padrão
• Padrões de dicloreto de paraquat, dicloreto de diquat e dibrometo de
etilparaquat (padrão interno) foram obtidos da Sigma-Aldrich
(Milwaukee, EUA). A partir dos padrões foram preparadas soluções
de trabalho a 1,0 mg/mL em água destilada.
• Soluções-padrão de trabalho foram preparadas em água, dicloreto de
paraquat, dicloreto de diquat e dibrometo de etilparaquat nas
concentrações de 1,0 mg/L, 100 µg/mL, 10 µg/mL, para cada padrão,
obtidas pela diluição em água das soluções-padrão estoque.
Material e Métodos 48
4.1.3 Equipamentos e Acessórios
- Espectrofotômetro Powerware X340 da BioTek Instruments
(Winooski, EUA).
- Equipamento de cromatografia em fase gasosa modelo 6890
acoplado ao espectrômetro de massa modelo 5972 (GC-MS), ambos da
Hewlett Packard (Little Falls, EUA), equipado com coluna capilar de sílica
fundida HP-5MS (Hewlett Packard) com as seguintes dimensões: 30m x
0,25mm x 0,10µm.
-Espectrômetro de massas tipo ion trap, modelo Esquire HCT (Bruker
Daltonics, Alemanha), acoplado a um cromatógrafo líquido modelo
Prominence (Shimadzu, Japão), composto por três bombas modelo LC-
20AD, injetor automático SIL-20AC, forno para coluna CTO-20AC,
controladora CBM-20A, e detector DAD ( diode array) SPD-M20A. Para o
acoplamento dispõe-se das seguintes fontes de ionização: electrospray,
APCI e nanospray. Para infusão direta possui bomba Cole Parmer ®
(Illinois, EUA).
4.1.4 Amostras
Amostras de plasma heparinizadas e urina foram obtidas de
pacientes com suspeita de intoxicação aguda que foram admitidos nos
Hospital Regional do Vale do Ribeira (Pariquera-Açu-SP) e Hospital de
Clínicas da Universidade de Campinas (HC-Unicamp). As amostras foram
coletadas por enfermeiros e armazenadas em frascos de plástico (pois o
Material e Métodos 49
paraquat se liga ao vidro) e congeladas até o momento da análise. Dados
relativos ao paciente foram coletados como idade, sexo, histórico da
intoxicação (circunstância, quantidade estimada ingerida, evolução da
intoxicação) (POND, 1998). O Projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP (CEP n.
122/2005) – ANEXO A.
4.2 Métodos
4.2.1 Método Enzimático-Espectrofotométrico para detecção de
paraquat e diquat em amostras biológicas
Conforme descrito anteriormente, no suposto mecanismo de ação
tóxica do paraquat (PQ2+), essa substância sofre redução enzimática para o
monoradical cátion (PQ+•) na dependência de NADPH nos pneumócitos. A
reação espontânea deste monoradical com o O2 retorna a forma original
duplo-cátion do paraquat (PQ2+), que pode ser reduzido novamente,
formando o ciclo redox. (ECOBICHON, 2001; WOOLLEY, 2004). Baseado
nesse mecanismo, foi estudada a possibilidade do desenvolvimento de um
método enzimático-espectrofotométrico de triagem mais sensível que o
método colorimétrico convencional com ditionito de sódio (que detecta
somente concentrações acima de 1,0 mg/L) (IPCS, 1995b; MOFFAT et al.,
2004), uma vez que, teoricamente, uma única molécula de paraquat poderia
consumir relativamente grande quantidade de NADPH e O2 (devido ao ciclo
redox), conforme ilustrada na Figura 7.
Material e Métodos 50
Figura 7. Ciclo redox do paraquat.
4.2.1.1 Preparação da amostra
Inicialmente, os principais fatores que poderiam afetar a velocidade
de reação foram verificados: quantidade de NADPH, temperatura e pH. As
melhores condições foram observadas em pH 7,4 e temperatura de 37 °C.
Em seguida, o procedimento adotado foi: em cubetas de quartzo foram
adicionados, 0,5 mL de amostra de urina, 0,5 mL de tampão potássio pH
7,4, 0,64 UI de NADPH P-450 redutase e 0,156 µmol de NADPH preparado
em tampão potássio a 100 mM. Neste método foi monitorada a velocidade
de consumo de NADPH a 340 nm na presença de diferentes concentrações
de paraquat. A temperatura utilizada no aparelho foi de 37º C, o consumo
do NADPH foi monitorado por 20 minutos.
NADPH NADP+
Citocromo P450 redutase
PQ+•••• PQ2+
O2- O2
Material e Métodos 51
4.2.1.2 Oxidação de NADPH
Para verificar a oxidação espontânea do NADPH, foram realizados
alguns testes baseados no procedimento 4.2.1.1. Em cubetas de quartzo
foram adicionados, 875 µL de tampão potássio pH 7,4, a 340 nm, a 37º C
por um período de 20 minutos. As variações foram:
NADPH
Enzima + NADPH
Paraquat + NADPH
Enzima + NADPH + Paraquat.
4.2.1.3 Linearidade
O estudo de linearidade foi realizado pela análise das amostras de
urina submetidas ao método em triplicata nas seguintes concentrações de
paraquat 0,05; 2,0 e 5,0 mg/L. A curva de calibração foi construída e o
coeficiente de correlação foi calculado.
4.2.1.4 Análises de amostras de urina
Amostra de urina de paciente com suspeita de intoxicação foi
submetida ao método enzimático-espectrofotométrico, e o procedimento
adotado foi o seguinte: em cubetas de quartzo foram adicionados, 0,5 mL
de amostra de urina, 0,5 mL de tampão potássio pH 7,4, 0,64 UI de NADPH
P-450 redutase e 0,156 µmol de NADPH preparado em tampão potássio a
Material e Métodos 52
100 mM. Neste método foi monitorada a velocidade de consumo de NADPH
a 340 nm. A temperatura utilizada no aparelho foi de 37º C, o consumo do
NADPH foi monitorado por 20 minutos.
4.2.2 Análise quantitativa confirmatória por cromatografia em
fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS)
Um método foi desenvolvido para determinação do paraquat/diquat
em plasma e urina por cromatografia em fase gasosa acoplada à
espectrometria de massas (GC-MS). O etilparaquat foi utilizado como
padrão interno.
4.2.2.1 Preparação dos padrões reduzidos
Em diferentes tubos plásticos, foram adicionados 50 mg de paraquat,
diquat, etilparaquat, foram também adicionados em todos os tubos 300 mg
de boridreto de sódio e 5 mL de tampão fosfato pH 8,0. Deixou-se reagir por
90 minutos sob agitação mecânica. A reação de redução está ilustrada na
Figura 8. Os produtos de redução dos analitos foram extraídos com 2
porções de 20 mL de éter etílico destilado. Para precipitação dos
compostos, foi utilizado um sistema para borbulhar HCl concentrado e obter
assim a formação dos sais de cloridrato dos respectivos produtos reduzidos.
Fluxo de nitrogênio e bomba de alto vácuo foram utilizados para evaporar o
excesso de éter dos sais obtidos. Após esse processo, os sais foram
submetidos ao processo de cristalização para a purificação.
Material e Métodos 53
Os analitos foram injetados no equipamento de cromatografia líquida
acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) e no GC-MS para
comprovar a estrutura das substâncias formadas e a ausência de
subprodutos. Ao final, soluções-padrão dos analitos reduzidos foram
preparados na concentração de 1,0 mg/mL.
Figura 8. Reação de redução de paraquat, diquat e etilparaquat com boridreto de sódio e produtos formados.
4.2.2.2 Preparação da amostra
Em tubos de plásticos foram adicionados 1,5 mL de tampão pH 8,0,
500µL de plasma ou urina, 20 µL de etilparaquat a 100 µL/mL e 10 mg de
boridreto de sódio (NaBH4). As amostras foram submetidas a banho de
água a 60º C por 10 minutos. Após o resfriamento da solução a temperatura
ambiente, foi iniciado o procedimento de extração em fase sólida (SPE).
paraquat
NaBH4
60 ºC, 10 min.
NaBH4
60 ºC, 10 min.
diquat
+N N+CH3 CH3 N NCH3 CH3
N N+ +
N N
+N N+CH3CH2 CH2CH3 N NCH3CH2 CH2CH3
Etilparaquat
NaBH4
60 ºC, 10 min.
Material e Métodos 54
Para tanto, foram utilizados cartuchos C18 (360 mg) da Waters (Milford,
EUA). Os cartuchos foram condicionados com 2,0 mL de metanol e 2,0 mL
de tampão fosfato pH 8,0. Adicionou-se a amostra a um fluxo de 1,0 mL/min
e lavou-se com 2,0 mL de água deionizada. Para a eluição dos analitos
utilizou-se 2,0 mL de metanol. Após evaporação do extrato, o resíduo foi
ressuspendido com 100 µL de metanol e 2 µL foram injetados no GC-MS
(Figura 9).
Figura 9. Esquema para extração em fase sólida de amostras de paraquat
e diquat.
4.2.2.3 Condições Cromatográficas
As seguintes condições foram padronizadas para análise de paraquat
e diquat extraídos de plasma e urina:
-Injetor: - temperatura: 270°C.
- Modo splitless
2 mL Metanol + 2 mL tampão fosfato pH 8,0
2 mL Amostra + 2 mL de água
DQ
PQ
Interf.
PI
DQ
PQ
PI
2 mL Metanol
Material e Métodos 55
-Coluna: - fluxo de hélio constante: 0,6 mL/minuto;
- temperatura inicial do forno: 80°C por 1 minuto;
- rampa: 10°C por minuto até 200°C
- rampa: 20°C por minuto até 270°C
- temperatura final do forno: 270°C por 4 minutos.
-Interface: - temperatura: 260°C.
-Gás de arraste: Hélio
-Detector: espectrômetro de massas (modo de operação: fragmentação por
impacto de elétrons e monitoramento seletivo de íons-SIM)
Íons selecionados (íons sublinhados utilizados para quantificação):
Paraquat: 134, 148, 192
Diquat: 108, 135, 190
Etil Paraquat: 148, 162, 220
4.2.3 Otimização do método
Antes de se efetuar os ensaios necessários para validação de um
método, alguns testes preliminares foram feitos para verificar a situação
ótima para cada parâmetro que compõe o método. Os parâmetros
analisados trabalhados em triplicata, observando a abundância absoluta
obtida no GC-MS.
Material e Métodos 56
4.2.3.1 Estudo do pH ótimo para reação e extração dos analitos
Os valores de pH testados para derivatização e extração foram: 8,0;
9,0 e 10,0. Padrões de paraquat, diquat e etilparaquat foram adicionados às
amostras na concentração de 5 mg/L, as quais foram submetidas ao
procedimento descrito no item 4.2.2.2. A eficiência da reação também foi
avaliada através da área absoluta formada pelos analitos frente a diferentes
valores de pH. Para cada valor de pH, as análises foram conduzidas em
triplicata.
4.2.3.2 Estudo da influência do tempo de reação no rendimento
da derivatização
Amostras de plasma foram adicionadas 50 mg/L de paraquat e diquat
e foram submetidas ao método descrito em 4.2.2.2, variando-se o tempo de
aquecimento da amostra em banho de água a 60º C, foram utilizados os
seguintes tempos: 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. Para cada tempo, as
análises foram conduzidas em triplicata.
4.2.3.3 Determinação da quantidade necessária de NaBH4
Amostras de plasma foram adicionadas 50 mg/L de paraquat e diquat
e submetidas ao método descrito 4.2.2.2, variando-se a quantidade de
NaBH4, foram utilizados os seguintes massas: 10, 20, 30, 50, 100 e 150 mg.
Para cada concentração as análises foram conduzidas em triplicata.
Material e Métodos 57
4.2.4 Validação do método
A validação do método foi realizada estabelecendo-se os valores de
recuperação, linearidade, precisão intra e interensaio, limite de detecção e
limite de quantificação.
4.2.4.1 Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ)
O LD e o LQ do método foram determinados pelo método empírico
que consiste em analisar uma série de amostras de plasma e urina
contendo quantidades decrescentes dos analitos (ARMBRUSTER,
TILLMAN & HUBBS, 1994). O LD foi considerado a menor concentração
que apresentou um coeficiente de variação que não excedeu 20% e o LQ a
menor concentração que apresentou um coeficiente de variação que não
excedeu 10%. O LD e o LQ deveriam ainda satisfazer um critério de
aceitação de qualificação pré-determinado (tempos de retenção com
variação menor que 1% e razão de íons com variação menor que 20%,
quando comparados com os padrões dos analitos) (PEAT & DAVIS, 1998).
4.2.4.2 Linearidade
Linearidade é a capacidade de um método analítico demonstrar
resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra,
dentro de um intervalo especificado (RIBANI et al., 2004). O estudo de
linearidade foi realizado pela análise das amostras de plasma e urina
Material e Métodos 58
submetidas ao método em triplicata nas seguintes concentrações de
paraquat e diquat: (0,1; 1,0; 5,0; 10; 20 e 50 mg/L). Foi verificada a
possibilidade de existência de heteroscedasticidade e alguns fatores de
peso (1/x; 1/x2; 1/x1/2; 1/y; 1/y2; 1/y1/2) foram avaliados.
4.2.4.3 Precisão intra-ensaio e interensaio
A precisão intra e interensaio foram determinadas indiretamente pelo
cálculo de imprecisão através da determinação do coeficiente de variação
do método (CV). O estudo foi conduzido analisando-se amostras de plasma
e urina em três dias diferentes, contendo as seguintes concentrações de
paraquat e diquat (0,3; 25 e 38 mg/L). As análises foram realizadas em
cinco replicatas para cada concentração.
4.2.4.4 Recuperação
Para o estudo da recuperação do método, dois grupos de amostras
de plasma e urina contendo diferentes concentrações foram analisados. No
primeiro grupo, consistindo de três concentrações das substâncias
pesquisadas (0,3; 25 e 38 mg/L) padrões de paraquat, diquat e etilparaquat
(PI) reduzidos foram adicionados às amostras, as quais foram submetidas à
extração conforme procedimento 4.2.2.2. em cinco replicatas para cada
concentração. No segundo grupo, consistindo também de cinco replicatas
para cada concentração (0,3; 25 e 38 mg/L) padrões de paraquat e diquat
reduzidos foram adicionados somente após a extração. O padrão interno
Material e Métodos 59
etilparaquat reduzido foi adicionado antes da extração. A recuperação
absoluta foi avaliada pela área relativa média obtida no primeiro grupo em
relação à área relativa média obtida no segundo.
4.2.4.5 Aplicação do método em amostras de pacientes com
suspeita de intoxicação
Amostras de plasma e/ou urina de pacientes atendidos no Hospital
Regional do Vale do Ribeira (Pariquera-Açu-SP) e Hospital de Clínicas da
Universidade de Campinas (HC-Unicamp) com suspeita de intoxicação por
paraquat e ou diquat foram submetidas ao método.
Resultados Resultados Resultados Resultados
Resultados 61
5. RESULTADOS
5.1 Resultados obtidos com o método Enzimático-
Espectrofotométrico
Nesta seção são apresentados os resultados do método enzimático-
espectrofotométrico em urina e em seguida os resultados das análises
realizadas com este método em amostras de urina de pacientes com
suspeita de intoxicação aguda por paraquat e/ou diquat.
5.1.1 Resultado do estudo de oxidação de NADPH
Não foi observada oxidação espontânea de NAPDH, isolada ou na
presença de paraquat ou de enzima NADPH redutase. Com a adição dos
três componentes, a reação inicia-se e assim o consumo deste cofator é
monitorado a 340nm (Figura 10).
Resultados 62
Redução NADPH
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
00:00:00 00:07:12 00:14:24 00:21:36
Tempo
Ab
sob
Ân
cia
340
nm
Reduação NADPH na presença de enzima
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
00:00:00 00:07:12 00:14:24 00:21:36
Tempo
Ab
sorb
ânci
a 3
40n
m
Redução de NADPH na presença de paraquat
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
00:00:00 00:07:12 00:14:24 00:21:36
Tempo
Ab
sorb
ânc
ia 3
40
nm
Redução do NADPH na presença de Enzima e NADPH
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
00:00:00 00:07:12 00:14:24 00:21:36
TempoA
bso
rbân
cia
340
nm
(A) (B)
(C) (D)
Figura 10. Verificação da oxidação de NADPH em algumas condições: (A) somente NADPH e tampão; (B) NADPH na presença de paraquat; (C) NADPH na presença de enzima redutase e (D) NADPH na presença de paraquat e enzima.
5.1.2 Resultado da linearidade do método enzimático em
amostras de urina
A Figura 11 ilustra às curvas de decaimento de NADPH com
amostras de urina com diferentes concentrações de paraquat através da
monitorização em espectrofômetro a 340 nm. O método demonstrou ser
linear na faixa de concentração estudada: 0,05 a 5,0 mg/L. O coeficiente de
correlação para o paraquat foi de 0,9991. A Figura 12 ilustra a curva de
calibração obtida, confeccionada a partir da inclinação da reta do consumo
de NADPH, (velocidade de reação, calculada pela razão de variação da
Resultados 63
absorbância pela respectiva variação no tempo) em função da concentração
de paraquat na amostra.
Figura 11. Cinética de consumo de NADPH através da monitorização espectrofotométrica a 340 nm com amostras de urina contendo diferentes concentrações de paraquat. (A) amostra negativa; (B) amostra contendo 0,05 mg/L; (C) amostra contendo 2,0 mg/L e (D) amostra contendo 5,0 mg/L.
Curva de calibração paraquat
y = 0,0077x + 0,0086
R2 = 0,9991
00,0050,01
0,0150,02
0,0250,03
0,0350,04
0,0450,05
0 1 2 3 4 5 6
concentração mg/L
Vel
oci
dad
e d
e re
ação
Figura 12. Curva de calibração do paraquat pelo método enzimático-
espectrofotométrico.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
00:00:00
00:02:53
00:05:46
00:08:38
00:11:31
00:14:24
00:17:17
00:20:10
00:23:02
Time (min)
Ab
sorb
ance
at
340
nm
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,91
00:00:00 00:02:53 00:05:46 00:08:38 00:11:31 00:14:24 00:17:17 00:20:10 00:23:02
Time (min)
Ab
sorb
ance
at
340
nm
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
00:00:00 00:02:53 00:05:46 00:08:38 00:11:31 00:14:24 00:17:17 00:20:10 00:23:02
Time (min)
Ab
sorb
ance
at
340
nm
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
00:00:00
00:02:53
00:05:46
00:08:38
00:11:31
00:14:24
00:17:17
00:20:10
00:23:02
Time (min)
Ab
sorb
ance
at
340
nm
(A) (B)
(C) (D)
Resultados 64
5.1.3 Resultado da análise de amostras de urina de pacientes
com suspeita de intoxicação
A Figura 13 ilustra a curva de consumo de NADPH de uma amostra
de urina de paciente com suspeita de intoxicação por paraquat. A análise
revelou a presença de paraquat na concentração de 4,2 mg/L., após
extrapolação da velocidade de reação obtida na curva de calibração da
Figura 12.
Amotra de paciente
0
0,10,2
0,30,4
0,5
0,60,7
0,80,9
1
00:00:00
00:02:53
00:05:46
00:08:38
00:11:31
00:14:24
00:17:17
00:20:10
00:23:02
Tempo
Ab
sorb
ânci
a 34
0 n
m
Figura 13. Curva de decaimento de NADPH com amostra de urina coletada de paciente com suspeita de intoxicação por paraquat.
5.2 Resultado do método confirmatório em GC-MS
Nessa seção são apresentados, inicialmente, a validação do método
analítico desenvolvido para determinação de paraquat e diquat em plasma e
urina por cromatografia gasosa acoplada ao detector de espectrometria de
massas GC-MS e os cromatogramas característicos da análise desses
Resultados 65
compostos. Em seguida são apresentados os resultados obtidos com as
análises de amostras de pacientes com suspeitas de intoxicação.
5.2.1 Resultado da preparação dos padrões reduzidos
Após purificação dos padrões, foram analisados no LC-MS por
injeção direta (Figura 14) e no GC-MS (Figura 15), o rendimento da reação
foi por volta de 100 % para os três padrões.
Figura 14. Espectros de massa (LC-MS) obtidos através da injeção direta dos padrões reduzidos de (A) diquat, (B) paraquat e (C) etilparaquat.
C
B
A
Resultados 66
5.2.2 Cromatograma característico e espectros de massa do
paraquat e diquat reduzidos
A Figura 15 Ilustra um perfil cromatográfico obtido com a análise de
uma amostra de plasma adicionada com paraquat e diquat submetida ao
método proposto. Na Figura 16 são apresentados os espectros de massa
do paraquat, do diquat e do etilparaquat (padrão interno) após redução com
boridreto de sódio.
Figura 15. Cromatograma (GC-MS) obtido dos padrões reduzidos de (A) diquat, (B) paraquat e (C) etilparaquat.
A
B
C
Resultados 67
Figura 16. Espectros de massa (GC-MS) obtidos dos padrões reduzidos de (A) paraquat, (B) diquat e (C) etilparaquat.
N NCH3CH2 CH2CH3
(B)
(C)
N N
N N CH3 CH 3
N N
(A)
Resultados 68
5.2.3 Resultados do estudo do pH ótimo para extração
Na Figura 17, pode-se observar que a recuperação do paraquat
decresce conforme aumenta o pH, por outro lado observa-se que em pH 10,
o diquat está em torno de 110 % de recuperação, já a recuperação do
paraquat no mesmo valor de pH está em torno de 70 % recuperação. A
melhor recuperação observada foi em pH 8 que teve recuperação em torno
de 91% para o paraquat e diquat.
Figura 17. Porcentagens da recuperação de paraquat e diquat em diferentes valores de pH.
5.2.4 Resultados do estudo da influência do tempo de reação no
rendimento da derivatização
Nesse procedimento analítico, fixando-se a quantidade de boridreto
utilizado (10 mg), o pH adotado foi 8,0 e a temperatura a 60º C em banho de
Resultados 69
água. O tempo escolhido foi o de 10 minutos, pois nos outros tempos
estudados os rendimentos foram menores (Figura 18).
Figura 18. Tempo de reação com boridreto de sódio, em pH 8,0 e a
temperatura a 60º C em banho de água.
5.2.5 Estudo da influência da quantidade necessária de NaBH4
Não foram observadas diferenças entre as áreas produzidas pelos
analitos nas diferentes quantidades utilizadas. Desta forma, a mínima
quantidade testada (10 mg) foi escolhida.
Resultados 70
5.2.6 Resultados da validação do método para determinação de
paraquat e diquat em plasma e urina
5.2.6.1 Limite de detecção e quantificação
Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) dos analitos obtidos
para o método proposto para determinação de paraquat e diquat em
amostras de plasma e urina foram de 0,05 mg/L para LD e para LQ 0,1
mg/L.
5.2.6.2 Linearidade
Para avaliar a homocedasticidade ou heteroscedasticidade dos
desvios da curva de calibração, utilizou-se o teste F. que analisa a variância
entre as médias. Para esse teste foram utilizados a variância dos desvios-
padrão do menor e do maior ponto da curva de calibração. A
homocedasticidade é verificada quando a distribuição dos erros entre as
médias está dentro do fator F. Quando o valor do teste de F estiver acima
do aceitável, é confirmada então a existência de heterocedasticidade do
conjunto. Nesse caso, a regressão linear ponderada é recomendada.
Utiliza-se então esta relação para estimar os desvios-padrão referentes a
cada ponto da curva. Os coeficientes de ponderação são utilizados para a
construção da curva de calibração.
Pela utilização da regressão ponderada atribui-se menor importância
aos pontos que apresentam maior desvio-padrão. Isto resulta no
deslocamento do ponto centróide da curva com estreitamento dos intervalos
Resultados 71
de confiança em baixas concentrações e conseqüente alargamento dos
intervalos de confiança nas concentrações mais elevadas (ALMEIDA,
CASTEL-BRANCO & FALCÃO, 2002).
O método de regressão linear convencional poderia resultar em
grandes erros especialmente em concentrações próximas ao limite de
quantificação. Aplicando-se fatores de peso (1/x; 1/x2; 1/x1/2; 1/y; 1/y2; 1/y1/2),
verificou-se que a soma da porcentagem de erro relativo (% RE) em toda a
faixa de concentração era menor quando aplicado o peso 1/x1/2 para plasma
e 1/y para urina. Os coeficientes de correlação para o paraquat e diquat
foram acima de 0,98. As equações lineares e coeficientes de correlação
obtidos foram: diquat: y = 0,138x−0,040; r2 = 0,981 e paraquat: y = 0,200x +
0,201; r2 = 0,9811 para amostras de plasma e diquat: y = 0,109x + 0,017; r2
= 0,990 e paraquat: y = 0,198x + 0,051; r2 = 0,997 para amostras de urina,
onde y e x representam a relação entre a razão de áreas dos picos
(analito/padrão interno) e as concentrações de calibradores
respectivamente.
5.2.6.3 Precisão intra-ensaio e interensaio
Os resultados de precisão intra-ensaio e interensaio obtidos para a
determinação de paraquat e diquat em amostras de plasma e urina são
apresentados na Tabela 3. Valores de precisão menores que 18% foram
encontrados em todos os casos.
Resultados 72
Tabela 3 - Valores de precisão intra-ensaio e interensaio obtidos com a aplicação do método proposto em amostras de plasma e urina.
Precisão Intra-ensaio (%)
Precisão Interensaio (%)
Amostras Analitos CQ1 CQ2 CQ3 CQ1 CQ2 CQ3
URINA PARAQUAT 9,9 9,2 4,7 14,9 7,3 5,2
DIQUAT 11,6 10,5 13,1 11,7 5,7 8,8
PLASMA
PARAQUAT
9,3 14,1 11,0 6,0 16,8 12,6
DIQUAT 10,1 6,3 8,0 11 7,2 17,2
CQ1 – 0,3 mg/L, CQ2 – 25 mg/L e CQ3 – 38 mg/L
5.2.6.4 Recuperação
Os valores de recuperação obtidos para a determinação de paraquat
e diquat em amostras de plasma e urina são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 - Valores de precisão intra-ensaio e interensaio obtidos com a aplicação do método proposto em amostras de plasma e urina.
Recuperação %
Amostras Analitos CQ1 CQ2 CQ3
URINA PARAQUAT 82,7 85,9 88,4
DIQUAT 83,2 88,4 108,8
PLASMA
PARAQUAT 75,2 87,3 92,0
DIQUAT 87,9 110,4 81,9
CQ1 – 0,3 mg/L, CQ2 – 25 mg/L e CQ3 – 38 mg/L
Resultados 73
Os dados de desenvolvimento e validação do método para
determinação de paraquat e diquat em amostras de plasma e urina foram
publicados no Journal of Chromatography B (Anexo B) (ALMEIDA &
YONAMINE, 2007).
5.3 Resultado das amostras dos pacientes com suspeita de
intoxicação
A Figura 19 mostra o perfil cromatográfico da análise de uma
amostra de urina de um paciente no qual há concentração de 32,4 mg/L
paraquat.
Figura 19. Cromatogramas obtidos com a análise GC-MS de: (A) urina adicionada de paraquat (PQ) e diquat (DQ) na concentração de 0,1 mg/L; (B) Amostra de referência negativa e (C) urina de paciente intoxicado. A análise revelou a presença de paraquat na concentração de 32,4 mg/L.
DQ PQ
EPQ
(A)
EPQ
(B)
(C)
PQ
EPQ
Resultados 74
Os resultados das análises e as informações obtidas através da
aplicação do questionário ou análise do histórico dos pacientes estão
apresentados na TABELA 5.
Tabela 5 - Dados do paciente, histórico e resultados das análises toxicológicas para determinação de paraquat em urina e plasma.
NI – não informada. NC – Não coletada. Neg – Negativo.
Paciente Idade Sexo Quantidade ingerida Ocasião Suporte
após Coleta após Resultado mg/L Conseqüência
urina plasma
A 21 F 100 mL suicídio 18 horas 18 horas 32,4 NC óbito
B 17 F 50 mL suicídio 12 horas 12 horas 89,6 NC alta
C 67 M NI suicídio NI NI 268,6 1,6 óbito
D 33 M 30 mL suicídio 2 horas 14 horas 400,3 0,34 óbito
E 21 M 5-10 mL suicídio 40 min 12 horas 0,66 0,31 alta
F NI M NI NI NI NI NC NEG NI
G 17 M 40 mL suicídio 3 horas 15 horas 5,3 NC alta
H 38 M 50 mL suicídio 5 horas 5 horas Neg NC alta
I 25 M indeterminada suicídio 1 hora NI 1575,2 NC óbito
J 27 M 50 mL suicídio 48 horas 48 horas NC 0,26 óbito
L 23 M 10 mL suicídio 12 horas 12 horas 1,5 NC alta
M 37 M 300 mL suicídio NI NI NC 0,37 óbito
N NI M NI NI NI NI NC 0,22 NI
O 22 F 500 mL suicídio 9 horas 9 horas 33,5 0,61 óbito
DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão
Discussão 77
6. DISCUSSÃO
A utilização de técnicas de triagem ou qualitativas são bastante
empregadas na rotina clínica de urgência toxicológica, devido à praticidade,
rapidez e baixo custo. Um paciente quando encaminhado para um serviço
de urgência ou emergência médica, necessita de um rápido diagnóstico
para a exclusão ou confirmação de uma suspeita clínica. No caso de
pacientes com suspeitas de intoxicações, a análise laboratorial de
emergência (triagem) é de extrema importância e deve ser realizada com
agilidade e em um curto período de pelo menos uma hora (LOUIS, 2001).
Particularmente para identificação do paraquat e diquat em amostras
biológicas, o teste colorimétrico com ditionito de sódio a 1% ainda é muito
utilizado (SCHMITT, 2006). Entretanto, apesar dessa técnica convencional
de triagem ser simples e rápida, ela só é capaz de detectar concentrações
acima de 1,0 mg/L (IPCS, 1995b; MOFFAT et al., 2004). Por outro lado,
mesmo concentrações abaixo de 1,0 mg/L podem representar um nível de
intoxicação importante e também deveriam ser consideradas (IPCS, 1995b;
POND, 1988; SOLOUKIDES et al., 2007).
Outros métodos de triagem utilizando técnicas espectrofotométricas
foram desenvolvidos, contudo, um procedimento de extração em fase sólida
(SPE) é necessário para fornecer limites de detecção mais baixos, o que
tornam os métodos menos práticos (KOIVUNEN et al., 2005; KUO et al.,
2001).
No presente trabalho, um método enzimático-espectrofotométrico,
baseado no próprio mecanismo de ação tóxica foi desenvolvido para rápida
Discussão 78
detecção de paraquat em amostras biológicas. Durante o desenvolvimento
do método, não foi observada oxidação espontânea de NAPDH, isolada ou
na presença de paraquat ou de enzima NADPH redutase. Com a adição dos
três componentes, a reação inicia-se e assim o consumo deste cofator pode
ser monitorado a 340 nm (Figura 10). Quando o NADPH é exposto a
apenas uma substância, sua oxidação não ocorre. Isso evidencia a proposta
do mecanismo de ação do paraquat na produção de espécies reativas de
oxigênio e assim ocasionando morte celular (ECOBICHON, 2001 e BUS,
1976). Este mecanismo de ação no qual o método foi embasado consiste na
transferência de um elétron do NADPH catalisado pela NADPH P-450
redutase para o paraquat dicátion, formando assim o paraquat monoradical
que por sua vez se oxida espontaneamente na presença de oxigênio,
voltando a sua forma inicial. Nessa forma, o paraquat pode se reduzir
novamente através do NADPH e novas espécies reativas de oxigênio são
geradas, formando assim o ciclo redox. Embora esse mecanismo de ação
tóxica seja aplicado apenas para o paraquat, quando o diquat foi submetido
ao método enzimático-espectrofotométrico, a redução do NADPH também
foi constatada. Desta forma, o fato do diquat não desencadear o ciclo redox
in vivo pode ser explicado pelo fato desta substância não se ligar tão
efetivamente ao sistema transportador de poliaminas localizado na
membrana dos alvéolos, como faz o paraquat (POND, 1998; ECOBICHON,
2001; MOFFAT et al., 2004).
A velocidade do consumo de NADPH era proporcional à
concentração de paraquat até 5 mg/L. O método de triagem proposto
Discussão 79
demonstrou ser simples e sensível, sendo possível a detecção de paraquat
em urina em concentrações tão baixas quanto 0,05 mg/L, utilizando
somente 0,5 mL de amostra. Quando o aplicado em amostra de urina de
paciente com suspeita de intoxicação por paraquat, a análise revelou a
presença de paraquat na concentração de 4,2 mg/L. Em conclusão, o
método proposto pode ser uma alternativa de triagem para detectar baixas
concentrações de paraquat em casos de suspeita de intoxicação. A única
limitação do método é o elevado custo, neste momento o valor agregado
para se obter as enzimas específicas para esse tipo de reação é o que
impossibilita a aplicabilidade deste método semi-quantitativo na rotina
laboratorial.
A quantificação e/ou confirmação, para presença ou não de paraquat
e diquat em amostras biológicas também pode ser muito importante na
avaliação do grau de exposição ao agente tóxico. A cromatografia em fase
gasosa com detector de espectrometria de massas (GC-MS) foi a técnica
escolhida para a quantificação e confirmação de paraquat e diquat em
amostras biológicas de plasma e urina de pacientes com suspeita de
intoxicação aguda. Como se tratam de compostos quaternários de amônio
e, portanto com características bastante polares, a identificação por
cromatografia em fase gasosa torna-se impossibilitada sem que os analitos
originais sejam previamente alterados quimicamente para substâncias com
maior volatilidade. Desta forma, avaliou-se a possibilidade da utilização de
NaBH4 como agente redutor para conversão do paraquat, diquat e do
etilparaquat (utilizado como padrão interno nas análises cromatográficas)
nos respectivos compostos reduzidos e mais voláteis. Inicialmente, tentou-
Discussão 80
se reproduzir as condições de reação descritas no trabalho de DRAFFAN et
al. (1977), monitorando os produtos formados através do GC-MS.
Posteriormente, adaptou-se o método utilizando a microextração em fase
sólida (SPME), fazendo a imersão direta da fibra de polidimetilsiloxano
(PDMS) de 100 µm na solução aquosa ou expondo a fibra aos vapores da
amostra (extração por headspace).
Realizou-se o método por imersão direta da fibra, no qual os analitos
reduzidos puderam ser extraídos pela fibra de SPME. Observou-se que o
boridreto de sódio na presença de proteínas do plasma levava à formação
de espuma que era incompatível com o sistema de extração. Ao utilizar-se
da dimeticona como agente antiespumante, não houve mais a formação de
espuma; porém, vários picos interferentes foram detectados no GC-MS,
conforme pode ser visualizado na Figura 20.
Figura 20. Cromatograma obtido utilizando dimeticona como agente antiespumogênico. Picos relativos aos compostos reduzidos de (A) diquat, (B) paraquat e (C) etilparaquat.
A segunda tentativa para aplicação da SPME foi por headspace, pois
é um método rápido e, teoricamente, produziria cromatogramas com
A B
C
Discussão 81
menores quantidades de interferentes. Devido à formação de espuma na
reação de derivatização dos analitos e a impossibilidade da utilização de
dimeticona como agente antiespumante, a desproteinização das amostras
de plasmas foi necessária para eliminar as proteínas e diminuir a formação
de espuma. Ácido tricloroacético foi utilizado com essa finalidade. Embora
tenha parecido promissor à primeira vista, os ensaios posteriores de
validação demonstraram que o método de SPME por headspace não
apresentava bons índices de reprodutibilidade.
Desta forma, optou-se em aplicar a extração em fase sólida no
desenvolvimento do método. Primeiramente cartuchos C18 contendo
200mg de sílica foram avaliados e não foi obtida boa recuperação (inferior a
50%). O mesmo ocorreu quando foram utilizados cartuchos com outro tipo
de fase estacionária como a Bond Elut Certify da Varian (Harbor City, EUA).
Estes contêm grupos benzenossulfônico e C8 como elementos ativos. Com
cartuchos C18 contendo 500mg de fase, verificou-se a obstrução da
passagem de amostra, uma vez que, com o procedimento desenvolvido,
não se precipitou as proteínas. O cartucho de C18 com 360 mg de sílica
(Waters: Milford, EUA) apresentou bons índices de recuperação e foi o
empregado para o desenvolvimento do método.
Após eleger o cartucho de SPE para o procedimento de extração,
testes para definir alguns parâmetros foram realizados para posterior
validação do método analítico. Os parâmetros avaliados foram: temperatura,
tempo de reação dos analitos em banho de água, pH e quantidade de
agente redutor.
Discussão 82
Com o intuito de se obter condições ótimas do meio para a reação
química de redução dos analitos nas amostras, alguns parâmetros foram
avaliados. A temperatura usada para a reação (60º C) é a mesma utilizada
por ARYS et al. (2000). É sabido que o meio alcalino é uma condição
favorável para ocorrer a reação de redução do paraquat e diquat
(DRAFFAN et al., 1977; ARYS et al., 2000). No presente experimento, o
melhor valor de pH encontrado para a reação de redução foi 8,0, também foi
observado que em pH 9,0 e 10,0 a eficiência da reação diminuía
progressivamente. Este fenômeno pode ser associado com a instabilidade
química do paraquat e diquat em alguns valores mais elevados de pH
(IBÁÑEZ, PICÓ & MAÑES, 1998; SERRA et al., 2003). A duração do tempo
de reação em banho a 60º C também tem uma influência considerável no
rendimento da reação. Observou-se que o período de 10 minutos é o
melhor tempo para a incubação. Períodos mais longos (20, 30, 40 e 60
minutos), causam perdas progressivas dos produtos. Nenhuma diferença foi
observada com relação à quantidade do boridreto de sódio empregada. A
quantidade mínima testada (10 mg) foi o bastante para reduzir
eficientemente os analitos na maior concentração utilizada na curva de
calibração (50 mg/L). Observou-se que a taxa de conversão dos analitos foi
de aproximadamente 100%, quando comparado aos padrões reduzidos.
Após definição dos valores de pH, quantidade de agente redutor, e
tempo da reação, a validação do método analítico pôde ser iniciada. Os
parâmetros analisados para a validação do método analítico foram:
recuperação, limite de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão intra-
ensaio e interensaio e linearidade.
Discussão 83
Para o estudo da recuperação foi necessária a síntese dos padrões
reduzidos não disponíveis comercialmente. No estudo de recuperação, foi
avaliada a quantidade de analito que se consegue extrair pelo procedimento
analítico desenvolvido comparando a resposta obtida com soluções-padrão
reduzidas (padrões sintetizados) dos herbicidas. Os resultados de
recuperação utilizando os padrões reduzidos foram adequados.
Portanto, a recuperação sendo satisfatória foi possível atingir bons
valores de LD e LQ no método desenvolvido. Estes valores de LQ e LD são
compatíveis com outros métodos analíticos similares descritos na literatura
científica.
Tanto a precisão interensaio como a intra-ensaio produziram valores
adequados para métodos cromatográficos, obtendo-se valores de
coeficientes de variação menores que 10% para a precisão interensaio e
menores que 20% para a precisão intra-ensaio. A escolha do PI adequado
deve ter contribuído para obtenção desses valores, pois o padrão interno
utilizado é muito parecido quimicamente com os analitos, o que possibilitou
a participação do PI em todas as etapas analíticas do método desenvolvido
como, a reação de redução e a extração.
Para o estudo de linearidade, uma ampla faixa de trabalho foi
avaliada (0,1 a 50 mg/L) com base nas concentrações geralmente
verificadas em casos de intoxicações agudas relatados na literatura.
Trabalhos mencionam desde intoxicações com uma mínima exposição até
casos com ingestão de uma grande quantidade destes herbicidas (ARYS,
2000; SOLOUKIDES, 2007). Entretanto, devido a grande faixa de trabalho
Discussão 84
(mais que duas ordens de magnitude), foi verificado que o fenômeno de
heteroscedasticidade estava presente. Neste caso, os maiores desvios
encontrados em altas concentrações tendem a apresentar maior influência
na linha de regressão do que menores desvios associados a baixas
concentrações. No entanto o método de regressão linear ordinária poderia
resultar em grandes erros nos cálculos das concentrações de paraquat e
diquat, especialmente nas concentrações baixas. Entretanto, utilizando a
regressão linear ponderada onde são atribuídos diferentes coeficientes de
ponderação (1/x; 1/x2; 1/x1/2; 1/y; 1/y2; 1/y1/2), o coeficiente que apresentou
melhor resultado, ou seja, menor valor da soma dos erros foi o 1/x1⁄2 para o
plasma e 1/y para urina.
As condições cromatográficas empregadas foram adequadas,
possibilitando uma boa separação e resolução dos picos de interesse e sem
a presença de interferentes. O tempo empregado para cada análise foi de
20,5 min. Para a detecção dos analitos no espectrômetro de massas,
utilizou-se o monitoramento seletivo de íons (SIM), que é um modo de
operação do MS que possibilita o instrumento monitorar dois, três ou mais
fragmentos específicos de cada uma das substâncias a serem analisadas.
Esse modo possibilita detectar concentrações bem menores de substância
quando comparado com o modo Full Scan. Neste modo, o equipamento
gera um espectro completo, fornecendo melhor informação quando se
deseja identificar a substância.
Discussão 85
O método desenvolvido para determinação de paraquat e diquat em
amostras de urina e plasma por GC-MS demonstrou ser prático e preciso
com a utilização do padrão interno etilparaquat.
O método proposto e validado neste trabalho consiste basicamente
no emprego da técnica de derivatização dos herbicidas (boridreto de sódio),
seguido do procedimento de extração (SPE). Após a extração, as amostras
foram evaporadas (concentradas) em fluxo de nitrogênio, ressuspendidas
(100 µL metanol) e injetadas (2 µL) no GC-MS. O tempo necessário para a
realização do procedimento analítico seja de 60 minutos. Como citado
anteriormente, nos casos de intoxicações por paraquat e diquat, o tempo é
um dos fatores determinante para o prognóstico da sobrevida do paciente e
a determinação destes herbicidas deve ser rápida e eficiente para auxiliar
este prognóstico.
Após o desenvolvimento e validação do método para determinação
de paraquat e diquat em plasma e urina por GC-MS, este foi aplicado em
amostras de pacientes com suspeita de intoxicação aguda. Na Tabela 5
foram apresentados os resultados das análises e alguns dados referentes
aos pacientes atendidos com suspeitas de intoxicação por estes herbicidas.
Analisando os relatos dos pacientes (ou acompanhante), constatou-se que
todos os casos foram por administração oral, a maioria dos casos foi
tentativa de suicídio, exceto dois casos não relatados. O tempo para o
atendimento e a concentração plasmática do agente tóxico são fatores
decisivos para sobrevivência dos pacientes, porém a grande maioria dos
Discussão 86
pacientes procurou ou foi encaminhada tardiamente para os hospitais,
ocasionando um atraso no atendimento.
Dentre os casos, observou-se que um indivíduo que ingeriu 100 mL
da solução de paraquat, com coleta de amostra biológica realizada após 18
horas do incidente, o resultado da análise urinária foi de 32,4 mg/L. Em
outro caso, um paciente que ingeriu 50 mL, com coleta da amostra de urina
após 12 horas, verificou-se a presença de paraquat na concentração de
89,6 mg/L. O paraquat é pouco absorvido pelo trato gastrintestinal e existem
outros fatores que podem influenciar na absorção ou eliminação do
herbicida, por exemplo o conteúdo estomacal e função renal. Os suportes
realizados aos pacientes para a desintoxicação, como administração de
carvão ativado ou substâncias adsorventes, também podem influenciar na
absorção do paraquat e assim na sua concentração plasmática ou urinária.
A porcentagem de sobrevivência do paciente é inversamente
proporcional ao tempo da exposição ao suporte clínico e a concentração
plasmática do herbicida. A paciente O, de 22 anos, depois de ter ingerido
500 mL do composto contendo paraquat e a sua amostra de sangue
coletada após 9 horas da exposição, o resultado da análise indicou 0,61
mg/L. Confrontando o valor plasmático com o nomograma da Figura 5,
verificou-se que a porcentagem de sobrevivência deste paciente seria
entorno de 40 %. Este caso seria classificado como uma intoxicação
fulminante que leva a morte em algumas horas. A intoxicação fulminante é a
mais comum nos casos de suicídio ou tentativa de suicídio, nos quais os
Discussão 87
indivíduos ingerem geralmente grandes quantidades destes herbicidas
(SERRA et al., 2003).
Das amostras de plasma e/ou urina dos 14 pacientes atendidos com
suspeitas de intoxicação nos hospitais anteriormente descritos, 7 pacientes
tiveram amostras de plasma coletadas e dessas 7 amostras de plasma,
apenas 3 continham informações suficientes para determinar o prognóstico
de sobrevida dos pacientes. Confrontando-se os valores encontrados em
plasma (mg/L) com o nomograma (Figura 5), constatou-se que o
prognóstico de sobrevida dos pacientes era de 40 % para o paciente O e de
50 % para os pacientes D e E, sendo que o paciente E sobreviveu.
A grande dificuldade para confrontar esses valores com os valores
propostos no nomograma é a precisão das informações. Na grande maioria
das vezes o indivíduo que fornece as informações é o próprio paciente
quando apto ou o seu acompanhante. Entretanto, estas informações podem
não ser precisas, o que pode ser um fator complicador para estimar a
probabilidade de sobrevivência do intoxicado.
O método desenvolvido permitiu a determinação e confirmação de
paraquat e diquat em amostras de plasma e urina. Como descrito
anteriormente existe a necessidade de uma análise toxicológica de
emergência ser rápida e eficiente. O método desenvolvido demonstrou que
preenche todos os requisitos de uma análise de urgência, podendo assim
ser aplicado na rotina dos Centros de Controle de Intoxicações - CCI como
uma ferramenta para auxiliar os diagnósticos e prognósticos dos casos de
suspeita de intoxicação por paraquat e diquat. O método também pode ser
Discussão 88
empregado nas áreas de ocupacional, toxicologia ambiental e toxicologia
forense.
ConclusãoConclusãoConclusãoConclusão
Conclusão 90
7. CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos, pode-se concluir que:
– O método de triagem apresentou bom limite de detecção, podendo
detectar até 0,05 mg/L de paraquat em amostras de urina
– O método de quantificação e confirmação proposto apresentou limites de
detecção de 0,05 mg/L e limites de quantificação de 0,1 mg/L. Os
resultados obtidos na validação do método mostram que trata-se de um
método rápido, preciso, prático e linear, que pode ser aplicado para a
determinação quantitativa e confirmatória de herbicidas paraquat e
diquat em plasma e urina de pacientes com suspeitas de intoxicação
aguda.
– As amostras analisadas apresentaram um valor alto de concentração,
devido à utilização destes herbicidas como agentes para suicídio ou
homicídio.
ReferêReferêReferêReferênciasnciasnciasncias
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ANEXO A – Comitê de Ética
