DESENVOLVIMENTO DO MODELO 3D DA DERME EQUIVALENTE IN VITRO PARA AVALIAR A ENTREGA DO FOTOSSENSIBILIZADOR

H. L. Ma a, T. F. L. Moraisa, C. Bernalb, V. C. A. Martinsb, A. M. G. Plepisa,b, J. R. Perussia,b aPrograma de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia EESC/FMRP/IQSC,

Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil bInstituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil

Instituto de Química de São Carlos - IQSC-USP; Avenida Trabalhador São-carlense, 400 -

CEP 13566-590; janice@iqsc.usp.br

RESUMO

O sistema tridimensional (3D) de culturas celulares tem sido considerado um

modelo alternativo para completar a lacuna entre os estudos in vitro e in vivo para os

ensaios citotóxicos. Devido à similaridade de cultura celular 3D com a arquitetura

morfológica do tecido que pode fornecer as previsões próximas à resposta in vivo. O

nosso objetivo foi desenvolver uma derme equivalente in vitro utilizando uma esponja

de colágeno com cultura de células para investigar a entrega de Hipericina (HY). A

microscopia eletrônica de varredura mostrou que a esponja de colágeno hidrolisado

possui os poros distribuídos com tamanho de 68,37±13,83 μm. O material não é

citotóxico para as células de fibroblasto Vero. A microscopia confocal exibiu a

fluorescência da HY distribuída na derme e, principalmente, nas fibras de colágeno,

após 2h de aplicação. Concluiu-se que o suporte desenvolvido foi um biomaterial

adequado para o modelo 3D de cultura de células.

Palavras-chave: colágeno, derme equivalente, fotossensibilizador.

INTRODUÇÃO

A cultura celular está cada vez mais difundida, isso deve à versatilidade dessa

metodologia, além de ser baixo custo em comparação com o uso de animais nos

testes, também possibilita o controle dos parâmetros experimentais e proporciona

boa reprodutividade (1). Contudo, atualmente, em boa parte dos testes pré-clínicos

para aprovação das drogas ou produtos cosméticos requer os testes com células e in

vivo (2). Embora os sistemas convencionais da cultura bidimensional têm sido

amplamente aplicados para o melhor entendimento da fisiologia celular e as reações

das células diante do estímulo, entretanto, devido à ausência da matriz extracelular

impossibilita as interações da célula-célula e célula-matriz para desenvolver a

diferenciação, proliferação e função celular (3). Dessa forma, a cultura celular

tridimensional (3D) foi proposta como uma etapa a fim de aproximar às condições in

vivo.

A cultura celular 3D utilizando um suporte ou matriz mimetiza tecido in vivo. Os

materiais destacados para suporte são agarose, colágeno, gelatina, laminina,

vitonectina e polímeros sintetizados (4). Dependendo da natureza do estudo, existem

requisitos na escolha do suporte cujo material deve ser não citotóxico, além disso, é

necessário fornecer a morfologia e comportamento fisiológico apropriados às células

cultivadas. Portanto, as características como a porosidade, fibra, permeabilidade e

estabilidade da matriz 3D são essenciais para criar um microambiente ativado à

proliferação e aderência das células (5).

A sobrevivência prolongada das células nos modelos 3D é a maior vantagem

da engenharia dos tecidos que pode servir como alternativa para o uso dos animais

nos desenvolvimentos das drogas para diversas terapias na medicina 6. Estudo

mostrou que há diferença da cultura celular 3D na predição da eficácia da droga que

induz a hepatoxicidade, uma vez que os hepatócitos humanos e do rato cultivados 3D

foram menos suscetíveis ao metotrexato do que em cultura 2D, isso comprova a

melhor confiabilidade para testes de drogas (7,8).

O colágeno tipo I é comumente usado no sistema da cultura 3D, devido à

facilidade na preparação, baixo custo e não ser citotóxico às células. Além disso, o

tamanho e a densidade dos poros podem ser controlados através da concentração

do colágeno ou adição de compostos cross-linking para alterar as propriedades do

gel (9). A derme é composta predominantemente por uma matriz extracelular de fibras

de colágeno entrelaçadas, na qual os fibroblastos, que é o principal tipo de células da

derme, produz colágeno para manter a estrutura (10). Assim, a cultura 3D dos

fibroblastos, Vero, utilizando uma esponja de colágeno biomimetiza a camada derme

da pele. O objetivo do presente estudo visou à formação do modelo 3D da derme

equivalente in vitro para estudar a entrega do fotossensibilizador no tecido biológico.

MATERIAIS E MÉTODOS

Esponja de colágeno

Utilizou-se uma placa de teflon com 72 poços e colocou-se 0,5 g de gel de 1,1%

de colágeno Tipo I de origem serosa porcina em cada poço. O gel foi congelado

lentamente com nitrogênio líquido, e posteriormente, levado à liofilização por 12h.

Em seguida, as esponjas de colágeno foram colocadas individualmente nos

cassetes histológicos e mergulhadas na solução de bicarbonato de sódio 1 mol L-1

por 36 h visando neutralizar os grupos de carboxiamida do colágeno tipo I. Após

esse período, os cassetes com esponja foram mantidos na água deionizada para

retirar o sal formado depois da neutralização. As esponjas de colágeno foram

removidas do cassete e liofilizadas novamente para a esterilização com o gás óxido

de etileno (C2H4O).

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) utilizada para visualizar as

cavidades formadas na esponja de colágeno foi feita com um equipamento ZEISS

LEO 440 (Cambridge, Inglaterra) com detector OXFORD (modelo 7060), operando

com feixe de elétrons de 15 kV. As amostras foram recobertas com 6 mm de ouro em

um metalizador Coating System BAL-TEC MED 020 (BAL-TEC, Liechtenstein) e

mantidas em dessecador até o momento de análise. Condições de metalização:

pressão na câmara = 2x10-2 mbar; corrente = 60 mA; taxa de deposição 0,60 nm s-1).

As amostras foram colocadas na porta amostra de alumínio para a observação.

Cultura celular

A linhagem celular de células epiteliais fibroblastos de rim de macaco verde

africano VERO (ATCC CCL-81) foi cultivada e aderida ao substrato sólido consistindo

da garrafa de polipropileno com área de 25 cm2 plana em 5 mL de meio de cultura

Dulbecco modificado por Iscove’s com 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos

penicilina 10 000 U.I. mL-1 e estreptomicina 10 mg mL-1. As células foram mantidas

em estufa a 37°C e 5% CO2.

Ensaio de citotoxidade pelo método de difusão em ágar

Um volume de 5 mL da suspensão de células Vero, na concentração de 3,0 x

105 células mL-1, foi semeado em placa de Petri (15x60 mm) e, incubado durante 48h

a 37°C e 5% CO2. Após esse período, o meio de cultura foi sugado e adicionado 5 mL

do meio “overlay” em cada placa de Petri a uma temperatura aproximadamente 44°C.

Este meio é composto por 38 mg mL-1 de Muller Hinton Agar (HIMEDIA) contendo

0,01% de vermelho neutro e, foi previamente preparado e auto clavado.

Os materiais: papel de filtro e látex, foram cortados em fragmento com área

cerca de 0,25 cm2 e colocados no meio da placa de ágar, esses serviram como

controle negativo e positivo, respectivamente, do experimento. Para investigar a

citotoxidade das esponjas de colágeno, esta foi colocada no meio da placa de ágar.

Todas as placas de ágar com matérias de estudo foram incubadas novamente na

estufa de 37°C e 5% CO2 por 24h.

As placas foram avaliadas macroscopicamente quanto a presença de halo e

microscopicamente quanto a integridade celular ao redor da amostra. A característica

de toxicidade foi constatada pela presença de um halo claro ao redor do material

testado. Este halo é observado quando há lise e morte das células, liberando o

corante vermelho neutro incorporando nas células, dando um aspecto transparente

ao local. A citotoxidade foi constatada pela medida do diâmetro deste halo claro

formado medido com uma régua milimétrica.

Formação da derme equivalente in vitro através da cultura celular 3D

Numa placa de petri com meio de cultura, colocaram-se as esponjas para

umedecer por 2h. Em seguida, as esponjas foram transferidas separadamente para

placas de cultura de 24 poços. O meio de cultura em excesso na superfície foi

sugado com agulha cuidadosamente. Adicionou-se 100 μL de suspensão celular

1x106 células mL-1 em cima da esponja umedecida, após isso, a placa foi incubada

por 15 min para acomodação das células. Adicionou-se mais 100 µL de meio de

cultura para manter as células úmidas e as placas foram armazenadas na estufa de

cultura por 30 minutos. Logo após, adicionou-se mais 2 mL de meio e as placas

foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 por 7 dias com a troca do meio no terceiro dia

da incubação. No sétimo dia, formou-se a derme reconstituída. O protocolo da

formação de derme reconstituída foi previamente determinado e testado por Anna

Cecília Bezerra de Oliveira, ex-aluna de mestrado da Profa. Dr. Janice Rodrigues

Perussi.

Ensaio de Permeação de hipericina na derme reconstituída

Empregou-se a derme equivalente in vitro para proceder ao ensaio de

permeação, logo no sétimo dia da cultura tridimensional celular, o meio de cultura foi

sugado com o auxílio de uma agulha e bomba a vácuo, adicionando-se 2 mL do meio

de cultura sem vermelho fenol, depois de 2 h de incubação, retirou-se o meio de

cultura que fica na parte superior da derme e, aplicou 20 μL de Hipericina 10 μg mL-1

em PEG 400 (estéril). Paralelamente, adicionou-se 20 μL de PEG 400 (estéril) na

outra derme formada, a qual serviu como o controle do ensaio.

O resultado da permeação foi avaliado pela microscopia Confocal de

fluorescência Zeiss (modelo LSM 780 invertido) utilizando objetiva Plan-Apochromat

M27 com aumento de 20X e abertura numérica de 0,8. A excitação das amostras foi

realizada por um e dois fótons, (1P) e (2P), respectivamente, utilizando Laser de 800

nm para o colágeno e 594 nm para a Hipericina. A emissão foi coletada nas regiões

espectrais de 400 a 800 nm, com detecção em 2º harmônico em 400 nm para o

colágeno e 604 nm para hipericina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A esponja de colágeno foi obtida através da hidrólise alcalina do tropocolágeno,

durante a reação, os grupos de carboximidas presentes nos resíduos de asparagina

e glutamina são convertidos em carboxilatos cujas cargas negativas são

responsáveis pela alteração da morfologia do colágeno, uma vez que a repulsão

eletrostática dessas cargas promove a porosidade do biomaterial (11).

A Figura 1-A) é a imagem da MEV, a qual mostrou que o biomaterial obtido

apresentou uma distribuição homogênea dos poros, através do programa

computacional, Imagem tool, foi possível medir a distância entre os canais dos poros

foi 68±13,83 μm. Sabe-se que as células mamíferas possuem tamanho em torno de

11-18 μm (12), dessa maneira, a esponja de colágeno apresentou microambientes

adequados para o crescimento celular. Além disso, a Fig. 1-B) foi uma corte

transversal da esponja, na qual mostrou os canais verticais que evidenciou a

interligação entre os poros.

Figura 1. As imagens da microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) da

esponja de colágeno. 1-A) mostra a distribuição dos poros com tamanhos de 68±

13,83 μm. 1-B) é a corte transversal da esponja de colágeno que mostra as

interligações entre os poros. (Autoria própria)

Empregou-se o método de difusão em ágar para avaliar a citotoxidade do

biomaterial, através do contato direto da amostra em análise com a monocamada de

células Vero, os controles: positivo (látex) e negativo (papel de filtro), foram

estabelecidos como os parâmetros de avalição visual.

As Figuras 2 - A) e B) mostram as fotos das placas dos controles, a presença do

halo na placa com látex indica a morte celular ao redor do material. Ao contrário da

placa com papel de filtro, o halo não foi observado. A Figura 2- C. corresponde à foto

da placa com a esponja de colágeno, na qual não foi verificado o halo transparente,

assim, pode-se concluir que a esponja de colágeno não é citotóxica.

Figura 2. Teste de citotoxidade do biomaterial pelo método de difusão em ágar.

2-A) O controle negativo – papel de filtro que é um material não citotóxico; 2-B) O

controle negativo – Látex apresentou o halo ao redor do material citotóxico; 2-C) A

esponja de colágeno não apresentou o halo. (Autoria própria)

A Figura 3. trata-se de uma imagem da permeação de 10 μg mL-1 de hipericina

no veículo PEG 400, mostrando a emissão de fluorescência em 604 nm que foi

representada pela cor vermelha na imagem, dessa forma, pode-se concluir que a

maior parte da hipericina permeada ligou-se às fibras de colágeno, fato que

confirmou que a permeação topical da hipericina em PEG 400 ocorre através da

matriz extracelular (colágeno).

Figura 3. A imagem da microscopia Confocal da derme equivalente in vitro

formada pela cultura célula na esponja de colágeno, após 2h de incubação da

hipericina. Os sinais de fluorescência indicam: vermelho-hipericina e azul-colágeno.

(Autoria própria)

A hipericina é um fotossensibilizador que possui alto rendimento quântico de

formação de espécies reativas de oxigênio através da excitação luminosa para levar

as células tumorais à morte (13). Por outro lado, tanto no experimento que foi realizado

com derme equivalente in vitro quanto na literatura, comprovou-se que a hipericina

exibe a forte interação com o colágeno e pode ser um fotossensibilizador eficiente

para atuar nos tecidos ricos em colágenos como pele e córnea (14). Em destaque, os

canceres de bexiga, ovário, pâncreas, nasofaringe e pele, demostram resultados

positivos tratando com a terapia fotodinâmica empregando a hipericina (15).

O colágeno é a principal proteína constituinte da matriz extracelular em

diversas estruturas dos tecidos, dessa forma a sua manutenção e degradação podem

influenciar diretamente as funções biológicas, bem como o crescimento, proliferação,

diferenciação e migração das células (16). Além disso, os estudos mostram que a

alteração do colágeno interfere em alguns processos de tumorgênese como a

vascularização e metástase (17). À vista disso, o estudo da interação da hipericina

com o colágeno foi essencial a fim de melhorar o entendimento da forma de entrega

dessa molécula orgânica no tecido alvo. Uma vez que a entrega dos

fotossensibilizadores e a eficiência terapêutica dependem intrinsicamente do

microambiente onde localiza o tumor.

CONCLUSÕES

A esponja preparada a partir do gel de colágeno de origem serosa porcina

apresentou as propriedades morfológicas adequadas para cultura celular, além disso,

o material é biocompatível por não ser citotóxico às células fibroblastos Vero. Através

da aplicação da hipericina na derme equivalente in vitro, mostrou-se que a hipericina

se liga intensamente com as fibras de colágeno, este resultado sugeriu que a

hipericina pode ser um potente candidato de fotossensibilizador para aplicar nos

tecidos que constituem majoritariamente pelo colágeno.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer ao Central de Esterilização Comércio e

Indústria Ltda. - ACECIL, Campinas, por oferecer o serviço de esterilização do

material, ao Prof. Dr. Anderson Oliveira da UFABC pela obtenção da hipericina, ao

Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica (CePOF – Fapesp) pelo apoio financeiro

da pesquisa e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) por conceder a bolsa de estudo para Ma Hui Ling.

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DEVELOPMENT OF AN IN VITRO 3D CELL CULTURE MODEL TO

EVALUATE PHOTOSENSITIZER DERMIS DELIVERY

ABSTRACT

The three-dimensional system (3D) cell cultures has been considered an

alternative model to fill the gap between in vitro and in vivo studies to cytotoxic assays.

Due to the similarity of 3D cell culture with the morphological architecture of tissue

that can provide forecasts close to in vivo response. Our aim was to develop in vitro

dermis equivalent by cells culture in collagen sponge to investigate the hypericin

delivery. The scanning electron microscopy showed that the hydrolyzed collagen

sponge has pores distributed with size of 68.37 ± 13.83 micrometers. The material is

not cytotoxic to Vero fibroblast cells. After 2 hours of hypericin (HY) application,

Confocal microscopy showed HY fluorescence distributed in the dermis and

especially in collagen fibers. It was concluded that the scaffold developed was

suitable biomaterial for the 3D cell culture.

Key-words: collagen, equivalent dermis, photosensitizer.