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Desenvolvimento de uma nanoemulsão bioinseticida preparada com extrato de Manilkara subsericea CAIO PINHO FERNANDES Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biotecnologia Vegetal da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial para obtenção do título de doutor em Biotecnologia. Orientadores: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha Profª Drª Deborah Quintanilha Falcão Rio de Janeiro RJ 2014

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Desenvolvimento de uma nanoemulsão bioinseticida preparada

com extrato de Manilkara subsericea

CAIO PINHO FERNANDES

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Biotecnologia Vegetal da

Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como requisito parcial para obtenção do

título de doutor em Biotecnologia.

Orientadores:

Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

Profª Drª Deborah Quintanilha Falcão

Rio de Janeiro – RJ

2014

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Caio Pinho Fernandes

Desenvolvimento de uma nanoemulsão bioinseticida preparada com extrato de Manilkara

subsericea

_________________________________________

Prof. Dr. Leandro Machado Rocha (UFF)

____________________________________________

Profª. Drª. Deborah Quintanilha Falcão (UFF)

____________________________________________

Profª. Drª. Adriana Passos Oliveira (UFRJ)

____________________________________________

Profª. Drª. Alice Sato (UNIRIO)

____________________________________________

Profª. Drª. Carla Holandino Quaresma (UFRJ)

____________________________________________

Prof. Dr. José Carlos Tavares Carvalho (UNIFAP)

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____________________________________________

Prof. Dr. Marcelo Guerra Santos (UERJ)

____________________________________________

Profª. phD Fernanda Reinert Thomé Macrae (UFRJ)

Aprovada em 18 de fevereiro de 2014, Rio de Janeiro

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Dedico este trabalho aos meus

pais, minha irmã e minha esposa,

que são meu alicerce.

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Não há vegetal algum que não

mereça ocupar a atenção de um

verdadeiro sábio; nenhum há, por

mais desprezível que pareça, de

que não se possa esperar alguma

utilidade.

(Frei Veloso)

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AGRADECIMENTOS

À minha esposa Fernanda, que me acompanha em todos os momentos com seu sorriso,

apoio, amizade, paciência, tornando minha vida mais feliz.

Aos meus pais Luiz Carlos Fernandes e Luizaura Pinho Fernandes, pelo apoio irrestrito

e amor incondicional.

À minha irmã Laís Pinho Fernandes, pelo caráter, amizade e exemplo que sempre

demonstrou.

Às minhas vós Aurora e Lacy, minha tia Laurinha e demais familiares, por demonstrar o

significado mais puro de uma família unida, tão presente em minha vida.

Aos meus orientadores Leandro Machado Rocha e Deborah Quintanilha Falcão, pelo

incentivo e ensinamentos que consolidaram a vontade de seguir a carreira acadêmica, além de

serem verdadeiramente amigos.

Aos amigos do Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN-UFF), Jonathas,

Rodrigo, Ricardo (Paulo Betti), Luis Armando (Gaúcho), Rafael, Hildegardo, Iraí, Arthur,

Bruno, Henrique (Iow), Francisco (Kiko), Diogo (Che Guevara), Adriana, Raquel, Bárbara,

Jeane, Amanda, Gisele, pelo apoio, amizade, cafés, lanches, músicas, longos dias/noite de

risadas, além de contribuírem firmemente no meu caminho de aprendizado sobre as plantas.

Ao Prof Marcelo Guerra, pela amizade e grande ajuda durante as coletas na restinga.

Ao Jorge (Mateiro), por nos receber na sua casa (Restinga de Jurubatiba) e

ensinamentos valiosos.

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À Professora Denise Feder e demais professores e alunos do Laboratório de Biologia de

Insetos do GBG/UFF, pelo grande auxílio e ensinamentos.

Aos Professores e funcionários da Faculdade de Farmácia – UFF.

Aos Professores e funcionários do Curso de Farmácia – UNIFAP, em especial ao Prof.

José Carlos Tavares Carvalho, por terem proporcionado um ambiente tão acolhedor.

Aos membros da banca, por aceitarem avaliar esse trabalho e contribuir com seus

conhecimentos e experiência.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal, em especial a Prof.

Fernanda Reinert, por ter depositado tanta confiança em mim e pelos bate-papos sempre

produtivos, e a Regina, pela paciência e carinho com que sempre me ajudou

Ao CNPQ pelo suporte financeiro.

Muito Obrigado

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RESUMO

FERNANDES, Caio Pinho. Desenvolvimento de uma nanoemulsão bioinseticida preparada

com extrato de Manilkara subsericea Rio de Janeiro, 2014. Tese (Doutorado em

Biotecnologia) – Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Vegetal - Centro de Ciências

da Saúde - Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) é uma espécie brasileira endêmica,

amplamente distribuída no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba e popularmente

conhecida nessa localidade como “guracica”. Estudos fitoquímicos com essa espécie

indicaram a predominância de triterpenos pentacíclicos. Além disso, foi verificada a atividade

inseticida modulada por seus extratos, principalmente a fração apolar de frutos. O presente

trabalho descreve o desenvolvimento de uma nanoemulsão inseticida contendo uma fração

solúvel em hexano obtida de frutos de M. subsericea. Também foi realizada a identificação e

elucidação estrutural de metabólitos secundários desta espécie, incluindo a descrição pela

primeira vez dos caproatos de alfa- e beta-amirina, caprilatos de alfa- e beta- amirina, ácido

pomólico, miricetina, quercetina, kaempferol, miricitrina, quercitrina, óxido de linalol, linalol,

terpineol, safranal, beta-ciclocitral, geraniol, entre outros. A nanoemulsão contendo a fração

apolar de frutos de M. subsericea apresentou baixo tamanho médio de partícula (155,2 ± 3,8

nm) e reflexo azulado característico. A nanoemulsão obtida foi capaz de induzir mortalidade

sobre Dysdercus peruvianus, espécie que causa sérios danos no cultivo do algodão. Além

disso, essa formulação apresentou atividade inibitória sobre a acetilcolinesterase de peixe

elétrico e não provocou efeitos letais em camundongos (Mus musculus). Este trabalho

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permitiu a obtenção de uma nanoemulsão inseticida, indicando seu potencial como pesticida

biodegradável e sem efeitos indesejáveis sobre outros organismos.

Palavras-chave: Dysdercus peruvianus, insecticida, óleo essencial, flavovóides, Manilkara

subsericea, nanoemulsão, triterpenos.

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ABSTRACT

FERNANDES, Caio Pinho. Development of a bioinsecticide nanoemulsion prepared with

Manilkara subsericea extract. Rio de Janeiro, 2014. Tese (Doutorado em Biotecnologia) –

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Vegetal - Centro de Ciências da Saúde -

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is a Brazilian endemic species widely

distributed at “Restinga de Jurubatiba National Park”, being popularly known in this locality

as “guracica”. Studies with this species indicated the predominance of pentacyclic triterpenes.

Moreover, it was observed an insecticidal activity modulated by its extracts, mainly apolar

fraction from fruits. The present study describes development of an insecticide nanoemulsion

containing hexane-soluble fraction obtained from fruits of M. subsericea. Identification and

structural elucidation of secondary metabolites from this species was also performed,

includind first reports of alpha- and beta-amyrin caproates, alpha- and beta-amyrin caprylates,

pomolic acid, myricetin, quercetin, kaempferol, myricitrin, quercitrin, linalool oxide, linalool,

terpineol, safranal, beta-cyclocitra, geraniol, among others. Nanoemulsion containing apolar

fraction from M. subsericea fruits presented small mean droplet size (155.2 ± 3.8 nm) and

characteristic bluish reflect. It was observed that this nanoemulsion was able to induce

mortality of Dysdercus peruvianus, a species that causes damages in cotton crops. Moreover,

this formulation did not interfere with acetylcholinesterase from electric eel and did not cause

any lethal effects in mice (Mus musculus). The present study allowed achievement of a

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insecticide nanoemulsion from Manilkara subsericea, indicating its potential as biodegradable

pesticide, without harmful effects over non-target species.

Keywords: Dysdercus peruvianus, insecticide, essential oil, flavonoids, Manilkara

subsericea, nanoemulsion, triterpenes.

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LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1. Estruturas químicas do acetato de beta-amirina (esquerda)

e acetato de alfa-amirina (direita). 24

Figura 2. Espécime em frutificação de Manilkara subserica (Mart.) Dubard encontrado

no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (RJ). 25

Figura 3. Ilustração botânica de Manilkara subsericea (Mart.) Dubard. publicada

na Flora Brasiliensis 26

Figura 4. Macroemulsão (esquerda) e nanoemulsão (direita). 30

Capítulo 2

Figura 1. Esquema ilustrativo do isolamento de miricetina, quercetina,

kaempferol, miricetrina, quercitrina e ácido pomólico da fração solúvel

em acetato de etila, proveniente do extrato etanólico de folhas de

Manilkara subsericea. 42

Figura 2. Representação das reações de hidrólise do substrato enzimático

(acetiltiocolina) pela enzima acetilcolinesterase. 49

Capítulo 3

Figure 1. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard, Sapotaceae,

at Restinga de Jurubatiba National Park (Rio de Janeiro, Brazil). 58

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Figure 2. Fragmentation pattern for Δ12-oleane/Δ12-ursane series.

A: beta-amyrin acetate. B: alpha-amyrin caproate. C: alpha-amyrin caprylate. 63

Figure 3. Chemical structures of the amyrin esters: beta-amyrin acetate (E),

alpha-amyrin acetate (F), beta-amyrin caproate (G), alpha-amyrin caproate (H),

beta-amyrin caprylate (I) and alpha-amyrin caprylate (J ) from the hexanic extract

from fruits of Manilkara subsericea. 66

Figure 4. GC-FID chromatogram of the hexanic extract from fruits of

Manilkara subsericea, Sapotaceae. 67

Figure 5. Vero cell viability in the presence of extracts for 24 h measured

by LDH assay 70

Capítulo 4

Figure 1. Structures of flavonoids and triterpene from leaves

of Manilkara subsericea 84

Figure 2. ESI(-)-FT-ICR mass spectra for (a) FL4 and (b) FL5 samples

and CID experiments for ion of m/z 463 and 447 corresponding to (c) myricitrin

and (d) quercitrin. 88

Figure 3. ESI(-)-FT-ICR mass spectrum of triterpene acids present in the

leaves of M. subsericea 90

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Capítulo 5

Figura 1. Pseudo-ternary phase diagram constructed with water, MOD

and surfactants (sorbitan monoleate/polysorbate 80, HLB =10.75) at different

compositions. Nanoemulsion region is delimited in blue. 110

Figure 2. Nanoemulsions obtained by low energy method. HFNE shown in left side and blank

nanoemulsio shown in right side of the picture. 113

Figure 3. Particle size distribution of (a) negative control (57.0 ± 0.3 nm)

and (b) nanoemulsion with hexane-soluble fraction from fruits of M. subsericea

(155.2 ± 3.8 nm). Polidispersity was 0.270 ± 0.006 for blank nanoemulsion and

0.150 ± 0.050 for nanoemulsion with hexane-soluble fraction from fruits

of M. subsericea. 113

Figure 4. Analysis of mortality after topical treatment of Dysdercus peruvianus

with nanoemulsion containing hexane-soluble fraction from fruits of

Manilkara subsericea (HFNE) (filled column). Negative control group was

topically applied with blank nanoemulsion (crosshatched columns). Untreated group

is represented by open columns. Each group represents mean

of three experiments. 115

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Figure 5. Linear regression between AchE activity (mU) x natural logarithm of

(a) effective concentration of eserine (p<0.05) and (b) effective concentration

of hexane-soluble fraction from fruits of Manilkara subsericea (p>0.05). 117

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LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Capítulo 2

Capítulo 3

Table 1. Means of the inhibition halos (mm + SD) for Staphylococcus aureus

and Escherichia coli tested with extracts (100 mg/mL) from Manilkara subsericea. 68

Capítulo 4

Table 1. Relative abundance of essential oil constituents from leaves

of Manilkara subsericea. 92

Capítulo 5

Table 1. Composition, mean droplet size and polydispersity of each formulation

prepared during construction of pseudo-ternary phase diagram for

delimitation of nanoemulsion region. 108

Table 2. Weight variation in adult female and male Swiss albino mice (Mus musculus)

treated with HFNE (5% of MOD, 5 % of surfactants (HLB of 10.75), 5% of

hexane-soluble fraction from fruits of M. subsericea and 85% of water)

by oral route, corresponding to 3g/kg of extract. Control groups received same

volume of MNE (5% of MOD, 5% of surfactants and 90 % of water) 118

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 19

OBJETIVOS 21

CAPÍTULO 1. Revisão da Literatura 23

Inseticidas de origem natural 23

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 24

Nanoemulsões 28

Referências 32

CAPÍTULO 2. Materiais e Métodos 39

Referências 51

CAPÍTULO 3. Atividades biológicas e ésteres triterpênicos provenientes de

frutos comestíveis de Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) 53

Introdução. 53

Referências 54

Artigo 1. Triterpene esters and biological activities from edible fruits of

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard, Sapotaceae 55

CAPÍTULO 4. Metabólitos especiais de folhas de Manilkara subsericea

(Mart.) Dubard 76

Introdução 76

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Referências 77

Artigo 2. Secondary metabolites from leaves of Manilkara subsericea (Mart.) 78

Dubard

CAPÍTULO 5. Desenvolvimento de uma nanoemulsão inseticida com extrato

de Manilkara subsericea (Sapotaceae) 100

Introdução 100

Referências 101

Artigo 3. Development of an insecticidal nanoemulsion with Manilkara subsericea

(Sapotaceae) extract 102

CONCLUSÕES 132

PERSPECTIVAS FUTURAS 134

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INTRODUÇÃO

Plantas são utilizadas no controle de pragas desde tempos remotos e elas foram a

principal fonte de agentes inseticidas até o desenvolvimento de substâncias sintéticas para

essa finalidade. Os efeitos tóxicos dessas substâncias para o meio ambiente e outros

organismos, além da seleção de insetos mais resistentes frente a inseticidas usuais, fez com

que as plantas ocupassem novamente um papel de destaque na busca por novos agentes

pesticidas. Dentre as diversas espécies investigadas, Manilkara subserica apresentou grande

potencial para o controle de Dysdercus peruvianus, praga do cultivo de algodão. Entretanto,

as frações mais ativas e substâncias avaliadas possuem limitada solubilidade em água, sendo

solúveis apenas em solvente orgânicos tóxicos, como o diclorometano e clorofórmio. A

utilização da nanotecnologia apresenta-se como uma alternativa para o desenvolvimento de

um produto viável, eficaz, seguro e capaz de ser disperso em meio aquoso.

Neste contexto, o presente trabalho teve o intuito de apresentar uma nanoemulsão

inseticida para ser utilizada frente a D. peruvianus. Foi utilizada como matéria prima ativa a

fração apolar oriunda de frutos de Manilkara subsericea.. Adicionalmente, foram realizados

estudos fitoquímicos para aumentar a base de informações relacionadas aos metabólitos

secundários produzidos por essa espécie, endêmica da flora brasileira e praticamente

inexplorada.

O presente trabalho será apresentado sob a forma de cinco capítulos, relacionados

respectivamente a:

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Revisão da literatura, apresentando os principais pontos abordados nos presentes estudos;

Materiais e métodos empregados nos estudos;

Avaliação da atividade biológica e elucidação estrutural de triterpenos presentes em

frutos de Manilkara subsericea;

Identificação de metabólitos secundários de folhas de Manilkara subsericea, como

triterpenos, flavonóides e constituintes de óleo essencial;

Desenvolvimento de uma nanoemulsão bioinseticida contendo fração apolar proveniente

do extrato de frutos de Manilkara subsericea. Adicionalmente foram feitos testes de

toxicidade, verificando o impacto da formulação em outros organismos.

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OBJETIVOS

Objetivo geral

O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma nanoemulsão bioinseticida contendo

fração apolar proveniente do extrato de frutos de Manilkara subsericea, além de identificar

substâncias químicas produzidas por essa espécie vegetal.

Objetivos específicos

Elucidar a estrutura química de flavonóides presentes nas folhas de Manilkara

subsericea;

Elucidar a estrutura química de triterpenos presentes nos frutos e folhas de

Manilkara subsericea;

Elucidar a estrutura química de constituintes do óleo essencial extraído de folhas de

Manilkara subsericea;

Desenvolver nanoemulsão contendo fração apolar proveniente do extrato etanólico

de frutos de Manilkara subsericea;

Caracterizar fisicamente as nanoemulsões obtidas;

Avaliar a atividade inseticida da nanoemulsão contendo fração apolar proveniente

do extrato de frutos de Manilkara subsericea;

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- 22 -

Verificar a influência da nanoemulsão bioinseticida sobre a acetilcolinesterase de

peixe elétrico;

Verificar a toxicidade da nanoemulsão bioinseticida frente a camundongos (Mus

musculus).

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CAPÍTULO 1

Revisão da Literatura

Inseticidas de origem natural

Os insetos se tornam pragas quando eles conflitam com nosso bem-estar ou interferem

nos lucros agrícolas (Gullan & Cranston, 2008). Pesticidas de origem sintética são

comumente utilizados no controle de insetos, entretanto, eles são geralmente nocivos para o

meio ambiente. Neste contexto, há uma crescente preocupação mundial com o uso

indiscriminado dessas substâncias, que está associado à poluição do meio ambiente e

intoxicação de outros organismos (Rao et al., 2003; Varona et al., 2009). Os produtos de

origem natural já foram a principal arma contra pragas agrícolas até aproximadamente 1940,

quando os inseticidas sintéticos assumiram um papel de destaque (Isman et al., 2008).

Entretanto, problemas oriundos do uso indiscriminado desses pesticidas fizeram com que

programas integrados de controle, utilizando produtos de origem natural, voltassem a ser

debatidos (Tunaz, 2004).

Plantas são reconhecidamente capazes de produzir suas próprias substâncias

defensivas, incluindo inseticidas para sua proteção contra o ataque de pragas (Gobbo-Neto &

Lopes, 2007). Esses produtos de origem natural incluem flavonóides, esteróides, alcalóides,

substâncias fenólicas e terpenóides (Viegas Jr, 2003; Castillo-Sánchez et al., 2010). Eles

atuam por uma ampla variedade de mecanismos, incluindo a inibição da acetilcolinesterase

(López & Pascual-Villalobos, 2010) e surgem como fontes potenciais de novos bioinseticidas

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biodegradáveis, sendo uma alternativa para o controle de insetos na agricultura (Rattan,

2010).

Dentre os diversos insetos que causam graves prejuízos econômicos, podemos citar o

percevejo Dysdercus peruvianus (Hemiptera), que causa graves danos no cultivo do algodão

(Milano et al., 1999; Stanisçuaski et al., 2005). Estudos prévios realizados com extratos

provenientes de Manilkara subsericea indicaram a capacidade de indução de efeitos severos

sobre essa espécie, incluindo mortalidade, atraso na muda e metamorphose, além de animais

deformados. Possivelmente essa atividade é modulada, ao menos parcialmente, por triterpenos

pentacíclicos, como os acetatos de beta- e alfa-amirina (Figura 1) (Fernandes et al., 2013a).

O

O

O

O

Figura 1. Estruturas químicas do acetato de beta-amirina (esquerda) e acetato de alfa-amirina

(direita).

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

A família Sapotaceae possui aproximadamente 58 gêneros e 1250 espécies (Bartish et

al., 2011). No Brasil, essa família é representada por 11 gêneros e 231 espécies, incluindo 2

gêneros e 104 espécies endêmicas (Carneiro et al. 2014).

O gênero Manilkara Adans é constituído por 30 espécies distribuídas nos Neotrópicos,

20 espécies encontradas na África e 12 espécies encontradas na Ásia e no Pacífico

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- 25 -

(Pennington, 2006). Devido à circunscrição dos gêneros, algumas espécies anteriormente

descritas como pertencentes aos gêneros Achas L. e Mimusops L. foram incluídas no gênero

Manilkara (Almeida Jr., 2010). O Brasil possui um total de 18 espécies deste gênero, sendo

15 consideradas endêmicas (Almeida Jr. 2014).

Figura 2. Espécime em frutificação de Manilkara subserica (Mart.) Dubard encontrado no

Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (RJ). Fonte: Próprio autor (Caio Pinho Fernandes).

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Figura 2) é uma espécie endêmica da Mata

Atlântica brasileira (Almeida Jr., 2014), comumente conhecida como “maçaranduba”,

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“maçarandubinha” e “guracica” (Lorenzi, 2009; Santos et al., 2009a). Ela é amplamente

distribuída no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba , sendo utilizada nessa localidade

como material para fabricação de mourões e pelos frutos comestíveis (Santos et al., 2009b). A

prancha dessa espécie foi publicada em 15 de janeiro de 1863 no volume VII (Fascículo 32)

da obra Flora Brasiliensis, produzida por Carl Friedrich Philipp von Martius com a

participação de diversos colaboradores, e considerada uma das obras mais importantes

relacionadas à flora brasileira (Figura 3).

Figura 3. Ilustração botânica de Manilkara subsericea (Mart.) Dubard publicada na Flora

Brasiliensis. Disponível em http://florabrasiliensis.cria.org.br/search?taxon_id=5835, acesso

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em janeiro de 2014). A nomenclatura utilizada na prancha segue a classificação da época,

sendo uma das sinonímias atualmente aceitas para a espécie (The Plant List, 2013).

Estudos relacionados a biologia reprodutiva (Gomes et al., 2008), biologia floral

(Gomes et al., 2010) e ecologia (Monteiro et al., 2007; Oliveira et al., 2012) de M. subsericea

têm sido observados, enquanto trabalhos relacionados à atividades biológica de extratos,

frações ou substâncias isoladas de M. subsericea são escassos e possivelmente restritos a

avaliação das atividades antimicrobiana (Fernandes, 2011), inseticida (Fernandes et al.,

2013a) e antiofídica (Oliveira et al., 2014).

Historicamente, a maior parte dos estudos fitoquímicos do gênero Manilkara estão

concentrados na espécie M. zapota (L.) P. Royen (Ma et al., 2003; Ahmed et al., 2001; Fayek

et al., 2013), popularmente conhecida como sapoti. Apesar de observarmos a existência de

poucos trabalhos relacionados a fitoquímica de Manilkara subsericea, é possível verificar a

predominância de triterpenos pentacíclicos, basicamente relacionadas aos esqueletos olean-

12-eno e urs-12-eno, incluindo os acetatos de alfa- e beta-amirina (Fernandes, 2011) (Figura

1). Essas substâncias são encontradas em abundância nos extratos dessa espécie e são

consideravelmente apolares. Devido a esse fato, o desenvolvimento de produtos com essa

matéria-prima torna-se um grande desafio, uma vez que são pouco solúveis em água e

solúveis em solventes orgânicos tóxicos, como clorofórmio e diclorometano. Neste contexto,

a nanotecnologia se configura como uma boa alternativa para resolver tal problema,

aumentando a sua disponibilização em meio aquoso e permitindo a obtenção de produtos

adequados para o uso comercial.

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Nanoemulsões

Nanotecnologia pode ser definida como a ciência e engenharia envolvidos no design,

síntese, caracterização e aplicação de materiais e dispositivos cuja organização funcional se

encontra em escala nanométrica. (Silva, 2004). A origem conceitual dessa importante área

pode ser datada de 1959, quando o físico Richard Feynman ministrou uma célebre palestra em

uma reunião da Sociedade Americana de Física. Entretanto, Noro Taniguchi é reconhecido

como a primeira pessoa a utilizar o termo “nanotecnologia”, no ano de 1974 (Irache et al.,

2011). Desde então, avanços notáveis foram realizados com o auxílio dessa tecnologia,

incluindo o desenvolvimento de uma série de formulações com potencial aplicação na área de

alimentos, cosméticos, medicamentos e pesticidas (Assis et al., 2012; Patel & Velikov, 2011;

Duncan, 2011; Brumfiel, 2006; Irache et al., 2011; Wang et al., 2007). Dentre as diversas

apresentações para esses produtos, podemos citar as ciclodextrinas (Gomes et al., 2014;

Falcão et al., 2011), nanopartículas (Wissing & Muller, 2002; Falcão et al., 2011),

nanosuspensões (Pardeike et al., 2011; Wang et al., 2011), nanodispersões (Leong et al.,

2011; Cheong et al., 2008) e nanoemulsões (Donsi et al., 2012; Fernandes et al., 2013b), entre

outras.

Esses nanoprodutos apresentam uma série de vantagens, como maior estabilidade,

características organolépticas favoráveis, maior poder de penetração por membranas, maior

biodisponibilidade, incremento da solubilidade em água de substâncias pouco solúveis e até

mesmo liberação controlada de substâncias (Irache et al., 2011). Neste contexto, uma das

formulações que vem ganhando mais destaque são as nanoemulsões, um tipo de formulação

do grupo das emulsões, tendo em vista a facilidade de sua obtenção por diferentes métodos e

versatilidade.

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Emulsões são basicamente dispersões constituídas por um líquido disperso sob a

forma de pequenas gotículas em outro líquido, sendo ambos imiscíveis (Brasil, 2010).

Usualmente esses dois líquidos são água e um óleo. Denomina-se o líquido dispersante como

fase externa ou contínua, enquanto o líquido disperso é frequentemente chamado de fase

interna ou descontínua (Aulton, 2005; Ansel et al., 2007). Outras substâncias podem ser

adicionadas, sendo frequentemente necessária a utilização de agentes tensoativos. Eles

permitem a redução da tensão superficial entre a fase oleosa e a fase aquosa, que é

fundamental para a manutenção de pequenos glóbulos, sendo especialmente importante na

estabilidade de nanoemulsões (Surassmo et al., 2010). Além disso, os tensoativos auxiliam na

formação de um filme ao redor da fase dispersa, reduzindo a chance de ocorrência de um

fenômeno de instabilidade chamado de coalescência, que é fusão entre duas gotículas gerando

uma gotícula maior (Ansel et al., 2007).

As emulsões são frequentemente sub-divididas em três grupos, que são as

macroemulsões, microemulsões e nanoemulsões. As macroemulsões são sistemas

termodinamicamente instáveis e contém gotículas da fase dispersa com diâmetro médio que

varia de 0,5 até 100 μm, sendo susceptíveis à força da gravidade. As microemulsões são

termodinamicamente estáveis, possuindo gotículas com diâmetro médio próximo a 10 nm.

Elas são espontaneamente formadas quando as fases aquosa e oleosa são colocadas em

contato com os tensoativos. Entretanto, esse tipo de formulação requer grandes quantidades

de tensoativos, sendo restritas para algumas aplicações. As nanoemulsões, também chamadas

de emulsões ultrafinas ou miniemulsões, possuem gotículas da fase dispersa com tamanho

diminuto (20-500 nm). Elas são transparentes ou translúcidas, frequentemente apresentando

um reflexo azulado (Figura 4) e possuem estabilidade cinética (Forgiarini et al., 2000).

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Apesar das nanoemulsões possuírem tamanho de gotícula diminuto, quando

comparados a macroemulsões, elas frequentemente podem ser obtidas com quantidades

inferiores de tensoativos do que o requerido para as microemulsões. Isso se configura como

uma importante vantagem, visto que a menor concentração de tensoativos reduz custos e

possíveis restrições de uso. Elas são frequentemente caracterizadas como formulações do tipo

óleo em água (O/A), sendo a fase interna (dispersa) oleosa e a fase externa aquosa. Essa

abordagem permite o incremento na solubilidade em água de substâncias lipofílicas e a

diluição das nanoemulsões em água e/ou outras soluções miscíveis neste líquido. Por outro

lado, nanoemulsões do tipo A/O, em que a fase dispersa é aquosa e a fase externa é oleosa

têm sido historicamente menos frequentes (Solans et al., 2005). Essas formulações possuem

uma ampla variedade de aplicações industriais (Izquierdo et al., 2002; Tadros et al., 2004),

como adjuvantes em alimentos, medicamentos e produtos agrícolas, indicando o alto potencial

econômico das nanoemulsões.

Figura 4. Macroemulsão (esquerda) e nanoemulsão (direita). Fonte: Próprio autor (Caio Pinho

Fernandes).

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Sistemas nanoemulsionados contendo substâncias naturais com atividade inseticida

têmchamado atenção nos últimos anos. Além de serem possivelmente biodegradáveis e menos

tóxicos para o meio ambiente (Varona et al., 2009), eles permitem uma maior molhabilidade,

espalhamento e penetração, que são vantagens adicionais para o uso de nanoemulsões como

pesticidas agrícolas (Wang et al., 2007). Tendo em vista que muitos pesticidas de origem

natural são pouco solúveis em água, o desenvolvimento de nanoemulsões inseticidas é uma

alternativa viável para o lançamento de novos produtos. Além disso, a mudança no perfil dos

consumidores tem levado a uma busca por “produtos verdes”, indicando o potencial das

nanoemulsões contendo produtos naturais para agroindústria (Lim et al., 2012).

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CAPÍTULO 2

Materiais e Métodos

Material Vegetal

Frutos e folhas de Manilkara subsericea foram coletados respectivamente em 2009 e

2010 no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. Amostras do material vegetal foram

herborizadas e depositadas no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro (RFFP 13.416 e 15.316).

Solventes

Os solventes utilizados na preparação de reagentes, soluções, extração, partições

apresentaram grau de análise (P.A.) enquanto aqueles utilizados nos métodos cromatográficos

apresentaram grau espectroscópico, sendo obtidos do fabricante VETEC® (RJ, Brasil). Foi

utilizada água destilada para os procedimentos efetuados nestes estudos.

Extratos e partições

Os frutos frescos (1.1 kg) foram triturados em turbilhonador e extraídos pela técnica

de maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após este período o extrato

obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom), obtendo-se 170 g de

extrato. Ele foi ressuspendido em 500 mL de uma solução hidroacoólica 90% (v/v) e

particionado com hexano (2 x 600 mL). A fração orgânica foi evaporada até a secura para

obtenção de uma fração em hexano de coloração amarela (FH 14 g) (Fernandes, 2011).

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Folhas (0,8 kg) foram submetidas a processo de secagem em estufa com ventilação

forçada (QUIMIS), com temperatura de aproximadamente 40°C pelo período de 2 dias,

moídas em moinho de facas e em seguida submetidos à extração por maceração em etanol 96

% (v/v) até completo esgotamento. Após este período, o extrato obtido foi filtrado e

concentrado em evaporador rotatório (Fisatom) até completa remoção do solvente, obtendo-se

o extrato etanólico de folhas (109,5 g). Em seguida, o extrato bruto de folhas foi submetido à

lavagem com hexano (5 x 2000 mL) e diclorometano (5 x 2000 mL), com o intuito de

remover os constituintes menos polares. A fração insolúvel nesses solventes foi lavada com

acetato de etila (5 x 2000 mL). A fração solúvel em acetato de etila foi filtrada e concentrada

em evaporador rotatório, permitindo a obtenção de 17,3 g de fração em acetato de etila de

folhas.

Óleo essencial

Folhas frescas de Manilkara subsericea (340 g) foram fragmentadas utilizando-se um

turbolizador com água destilada. Em seguida, o material vegetal foi adicionado em balão de 5

L, contendo fragmentos de porcelana porosa para regularização da ebulição. O balão foi

colocado em manta de aquecimento e acoplado a um aparato do tipo Clevenger. Foi

adicionada quantidade suficiente de água pelo topo do condensador até que o material vegetal

em suspensão ocupasse volume aproximado de 3 L, seguida da adição de 2 mL de hexano no

condensador. Após o sistema entrar em ebulição, procedeu-se a extração do óleo essencial por

3 horas. Ao término deste período, o hidrolato foi recolhido e a fase hexânica contendo as

substâncias voláteis foi recolhida, filtrada em sulfato de sódio anidro e armazenada em freezer

até a realização da análise química.

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Cromatografia em Camada Fina (CCF)

Para a realização dos ensaios cromatográficos qualitativos, utilizou-se gel de Sílica G

60 de fase normal em cromatofolhas de alumínio ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20 com

0,20 mm de espessura.

Reveladores (Wagner & Bladt, 1996)

Solução de anisaldeído sulfúrico – solução de 0,5 mL de p-anisaldeído, 98% (Aldrich

Chemical Company, Inc, Milwaukee, USA) em 10 mL de ácido acético glacial, seguida da

adição de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado. A placa deve ser

borrifada com a solução e aquecida até aparecimento das manchas cromatográficas.

NP/PEG - – preparar reagente I constituído por solução metanólica de ácido difenil bórico β-

etilamino éster (1 %, v/v) e reagente II, constituído por solução etanólica de polietilenoglicol-

4000 (5%, v/v). Borrifar a placa com aproximadamente 10 mL da solução I e 8 mL da solução

II.

Cromatografia em coluna

O isolamento das substâncias foi feito por cromatografia em coluna utilizando-se

diferentes fases estacionárias e sistemas de eluição (Figura 1). A fração solúvel em acetato de

etila proveniente do extrato bruto de folhas de M. subsericea foi inicialmente fracionada

utilizando-se a resina Amberlite XAD-2 como fase estacionária (Sigma-Aldrich, St Louis).

Foi efetuado um gradiente de eluição com água, misturas de metanol/água (5:95→9:1),

metanol e acetona. Após análise do perfil cromatográfico por cromatografia em camada fina

(CCF), as frações 28-40 foram reunidas. Em seguida foi realizada uma purificação final por

cromatografia em coluna utilizando-se Sephadex LH-20 como fase estacionária e metanol

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como fase móvel, permitindo a obtenção de três agliconas de flavonoides (40.2 mg de

miricetina, 35.7 mg de quercetina e 11.9 mg de kaempferol).

Figura 1. Esquema ilustrativo do isolamento de miricetina, quercetina, kaempferol,

miricetrina, quercitrina e ácido pomólico da fração solúvel em acetato de etila, proveniente do

extrato etanólico de folhas de Manilkara subsericea.

As frações 8-19 foram reunidas com base em seu perfil cromatográfico (CCF) e

submetidas a purificação utilizando-se C-18 (Sigma-Aldrich, St Louis) como fase estacionária

e gradiente de metanol em água (60%→63%, v/v) como fase móvel. Foi feita uma purificação

final utilizando-se Sephadex LH-20 como fase estacionária e metanol como fase móvel,

permitindo a obtenção de dois flavonoides glicosilados (7.4 mg de uma mistura de miricetrina

e quercitrina). As frações 41-52 foram submetidas a purificação utilizando-se silica gel como

fase estacionária e um sistema de eluição isocrático constituído por mistura de hexano :

acetato de etila : metanol (5:5:1), permitindo a obtenção de 9.7 mg do triterpeno ácido

pomólico.

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Elucidação estrutural

Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM)

O cromatograma e espectros de massas do óleo essencial de M. subsericea foram

obtidos em cromatógrafo gasoso acoplado à espectrômetro de massas (GCMS-

QP5000,SHIMADZU) equipado com detector por impacto de elétrons. 1 µL da solução do

óleo essencial diluído em hexano desta solução foi injetada em coluna RTX-5MS (30m x 0,25

mm x 0,25 µm). As condições de análise foram: hélio como gás de arraste; fluxo com taxa de

1mL/min; injeção de split com taxa de 1:40; temperatura do injetor, 260°C, temperatura do

detector, 290 ºC; temperatura inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC, com taxa de variação de

3º/min. As condições da EM foram: voltagem de ionização de 70eV e taxa de varredura 1

scan/s. Os indices de retenção foram calculados em relação a uma mistura de hidrocarbonetos

alifáticos (C7-C40) (Sigma-Aldrich, EUA) analisados sob as mesmas condições (Van den

Dool and Kratz, 1963). A identificação das substâncias foi feita por comparação dos indices

de retenção e padrão de fragmentação com dados da literatura (Adams, 2007). A análise

quantitativa foi realizada através de análise em cromatógrafo gasoso acoplado a detector de

ionização de chama (CG/DIC), sob as mesmas condições da análise por CG/EM).

A análise da fração hexânica proveniente do extrato etanólico de frutos de M.

subsericea foi realizada conforme descrito por Fernandes (2011). A elucidação das estruturas

dos ésteres triterpênicos foi realizada por comparação com dados da biblioteca do aparelho

(NIST) e análise da fragmentação (via Retro-Dials-Alders).

Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de RMN 1H e RMN 13C foram obtidos no equipamento Varian VNMRS

com 500 MHz 1H e 125 MHz para 13C. O solvente deuterado para obtenção dos espectros de

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RMN foram obtidos da Cambridge Isotope Laboratories (USA). Os deslocamentos químicos

(δ) foram expressos em partes por milhão (ppm). A edição dos espectros foi realizada

utilizando-se o programa MestReNova 6.0.2- 5475 (Mestrelab Research S.L., 2009).

Nanoemulsões

Método de emulsificação

As nanoemulsões foram preparadas utilizando-se o método de inversão de fases

(Aulton, 2005). A fase oleosa e os tensoativos foram adicionados em um béquer e aquecidos a

75 ± 5 ºC, enquanto a fase aquosa constituída de água destilada foi colocada em outro

recipiente e aquecida sob essa mesma temperatura. Quando ambas as fases atingiram a

temperatura desejada, a fase aquosa foi sobre a fase oleosa sob agitação constante (400 rpm)

pelo período de 10 minutos. Em seguida o sistema foi resfriado com agitação constante (400

rpm) por mais 5 minutos. As nanoemulsões contendo fração em hexano obtida do extrato

etanólico de frutos de M. subsericea ou eserina tiveram esses constituintes adicionados ao

bequer contendo fase oleosa, sendo sua quantidade descontada da massa total de água

(Fernandes et al., 2013a).

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Caracterização das nanoemulsões

As nanoemulsões foram caracterizadas imediatamente e após 1, 15 e 30 dias. Elas

foram armazenadas em tubos de vidro com tampa e armazenadas sob temperatura ambiente

(25±2 ºC). Adicionalmente foram colocados tubos em estufa (40±5 ºC) para verificação da

estabilidade acelerada. Foram avaliadas características macroscópicas como cor, aspect

visual, separação de fases, cremagem e sedimentação (Fernandes et al., 2013a).

O tamanho das gotículas da fase dispersa e polidispersão foram determinados por

espectroscopia de correlação de fótons, utilizando aparelho ZetaPlus (Brookhaven Inst. Corp.,

USA). Cada emulsão foi diluída utilizando água ultra pura Mili-Q (1:25). Cada análise foi

feita em triplica, sendo os resultados expressos em função da média e desvio padrão.

Desenvolvimento das formulações

Determinação do valor de Equilibrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL) requerido da fase oleosa

Foram preparadas diversas emulsões contendo diferentes proporções de tensoativos na

faixa de EHL entre 4,3 (EHL do monooleato de sorbitano) e 15 (EHL do polissorbato 80). O

EHL resultante de cada mistura de tensoativos foi determinado com base na fórmula a seguir:

Onde:

EHLm é o valor de EHL resultante da mistura de dois tensoativos

EHLA é o valor de EHL do tensoativo mais hidrofóbico

EHLB é o valor de EHL do tensoativo mais hidrofílico

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A% é o percentual do tensoativo mais hidrofóbico

B% é o percentual do tensoativo mais hidrofílico

A% + B% = 100

As emulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases (Aulton, 2005),

contendo 5% de fase oleosa (miristato de octildodecila, MOD®), 5% de tensoativos

(monooleato de sorbitano e polisorbato 80) e 90 % de fase aquosa (água destilada) (Fernandes

et al., 2013a). Com base na estabilidade das emulsões iniciais obtidas (separação de fases e

cremagem), foram preparadas novas emulsões com valor de EHL próximos aquela que

apresentou maior estabilidade, sendo avaliadas macroscopicamente e microscopicamente. O

valor de EHL requerido para o MOD® foi definido como sendo o EHL do tensoativo ou

mistura de tensoativos capaz de formar a emulsão mais estável (Salager, 2000), verificada

através dos ensaios de estabilidade e tamanho de partícula.

Diagrama ternário

Este método se baseia na utilização de um triângulo equilátero, em que cada um dos

vértices corresponde a 100% da composição de cada constituituinte da formulação. A razão

tensoativo/co-tensoativo correspondente ao EHL requerido do óleo empregado. Diversas

emulsões serão preparadas variando-se a proporção entre os constituintes (água,

tensoativo/co-tensoativo/óleo). A análise do tamanho médio das gotículas das emulsões

geradas será realizada com o intuito de se traçar a região de nanoemulsão (Fernandez et al.,

2004).

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Avaliação da atividade inseticida

Colônias

As colônias de Dysdercus peruvianus (Hemiptera) foram mantidas em cubas de vidro

fosco (de aproximadamente 19 cm de profundidade por 17 cm de diâmetro) em uma

temperatura média entre 20-25 ºC, umidade relativa de 70-75% e ciclos de 16h (dia) e 8h

(noite). A abertura da cuba deve estar tampada com um pano (filó) para entrada de ar. Os

insetos tinham livre acesso a água e foram alimentados com sementes de algodão (Fernandes

et al., 2013b). Dentro das cubas, foram utilizados dois pedaços de papel filtro: um cortado em

circulo para ser depositado no fundo e outro retangular e sanfonado, depositado verticalmente,

para aumentar a área de movimentação dos insetos. Um bebedouro ficava pendurado por um

arame preso no topo da cuba, a fim de evitar vazamento no fundo da mesma. Placas de petri

eram colocadas no fundo, contendo gazes ou algodão, para que os insetos realizassem as

posturas.

Os testes foram realizados através de tratamento tópico de ninfas no quarto estágio. Os

animais foram separados em grupos de 30 indivíduos e foi realizada aplicação de uma

nanoemulsão contendo fração hexânica proveniente do extrato etanólico de frutos de M.

subsericea (50 μg de extrato / inseto). O controle negativo foi realizado aplicando-se a

nanoemulsão correspondente, sem adição de fração hexânica no dorso dos insetos, submetidos

às mesmas condições do grupo experimental. O grupo não tratado recebeu comida e água,

sem aplicação tópica de nenhuma substâncias. Em seguida foram colocadas em frascos

pequenos de aproximadamente 7 cm de profundidade por 5 cm de diâmetro e iniciou-se a

contagem diária, acompanhando o desenvolvimento dos insetos até atingirem o estágio adulto

(Mello et al., 2007; 2008; Fernandes et al., 2013b)

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A significância dos resultados foi analisada utilizando-se programa ANOVA e teste de

Tukey utilizando-se o programa Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 (Windows 98).

As diferenças entre os grupos tratados, controle e não tratados foram considerados

estatisticamente sem significância para p>0,05. Todos os experimentos foram feitos em

triplicata.

Atividade inibitória sobre a acetilcolinesterase

Para verificar a atividade inibitória sobrea enzima acetilcolinesterase, foi realizado o

ensaio espectrofotométrico baseado no método colorimétrico de Ellman (1961) com algumas

modificações (Rhee et al., 2001), utilizando-se leitor de microplacas de 96 poços. O ensaio

colorimétrico ocorre segundo a reação enzimática de hidrólise do iodeto de acetiltiocolina

(ATCI) catalisada pela enzima AChE, na qual o produto de hidrólise, a tiocolina, reage com o

agente colorimétrico, ácido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB), promovendo a formação

de uma substância de coloração amarela, o ácido tionitrobenzóico (TNB) (figura 2).

O volume total em cada poço foi de 200 μL, sendo constituídos por 65 μL de tampão

fosfato salino (PBS), 60 μL de ácido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB (1,5 mM), 25 μL

de acetilcolinesterase de peixe elétrico (550 mU/mL) e 25 μL de nanoemulsão. Por fim,

adicionou-se 25 μL de iodeto de acetiltiocolina. Diferentes concentrações das amostras foram

obtidas através de diluições sucessivas em PBS. A hidrólise espontânea do substrato

enzimático (iodeto de acetiltiocolina) foi verificada na ausência de enzima, sendo seu volume

substituído por PBS. As leituras foram feitas no comprimento de onda de 412 nm. Os

resultatos são expressos em função da atividade enzimática remanescente, calculada em

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- 49 -

relação ao controle negativo. A análise estatística foi feita através coeficiente de correlação de

Pearson, com 95 % de intervalo de confiança, utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.04.

SN

O

O

O

SN

HO

+_+_

+ + 2H+AChE

2

tiocolina acetato

Reação 1

acetiltiocolina

SS

O

OH OH

O

NO2

O2N

OH

O

NO2

(CH3)3NCH

2SS S

O

OH

O2N

(CH3)3NCH

2S+ + +

DTNB amarelo

+

tiocolina

_

Reação 2

Figura 2. Representação da reação de hidrólise do substrato enzimático (acetiltiocolina) pela

enzima acetilcolinesterase. A formação de ácido tionitro benzoico (TNB) indica atividade

enzimática e pode ser observada pela formação de coloração amarela.

Toxicidade aguda

Animais

O estudo envolvendo animais foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Amapá sob o número de registro (CEP – UNIFAP – 005AP/2013).

Foram utilizados machos e fêmeas de camundongos suíços albinos (Mus musculus), com 12

semanas de idade, provenientes do Laboratório Central do Estado do Amapá – Macapá

(LACEN/AP). Cada grupo experimental foi constituído de 5 animais. Eles foram mantidos em

caixas sob condições controladas (25°C ± 2°C e períodos de claro/escuro de 12 horas cada).

Os animais tiveram livre acesso a água e comida, exceto nas 24 horas anteriores ao

experimento, quando foram mantidos em jejum.

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Protocolo experimental

Os estudos de toxicidade aguda foram realizados utilizando-se camundongos de ambos

os sexos, conforme descrito por Pina et al. (2012), com algumas modificações. Os grupos

tratados receberam uma única dose de nanoemulsão contendo fração hexânica proveniente do

extrato etanólico de frutos de M. subsericea por gavagem, correspondendo a uma dose de

3g/kg de extrato. O controle negativo foi realizado administrado-se mesma quantidade da

nanoemulsão correspondente, sem adição de fração hexânica, em camundongos submetidos às

mesmas condições do grupo experimental.

As observações foram realizadas 30, 60, 120, 240, 360 e 720 minutos após o

tratamento e diariamente por 14 dias. Foram observadas possíveis alterações

comportamentais, como agitação, convulsão, frêmito vocal, irritação, movimentos

estereotipados, resposta ao toque, salivação, tremores, distensão corporal, ptose, sono,

defecação, diarreia, piloereção). O peso, consumo de alimento e água, sinais de intoxicação e

mortalidade foram verificados diariamente. Ao final dos 14 dias de tratamento, os animais

foram sacrificados por deslocamento cervical e foi realizada autópsia para retirada dos órgãos

(coração, pulmões, fígado, rim e baço), para posterior pesagem e observação de possíveis

alterações macroscópicas. A análise estatística foi efetuada através do Test t de Student (95%

de interval de confiança), utilizando o programa GraphPad Prism 5.04. Diferenças foram

consideradas significante para p<0.05.

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CAPÍTULO 3

Atividades biológicas e ésteres triterpênicos provenientes de frutos comestíveis de

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae)

Introdução

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard é uma espécie da família Sapotaceae com ampla

distribuição no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. Seus frutos são utilizados como

alimento pela população desta localidade, onde é popularmente conhecida como guracica

(Santos et al., 2009). Trata-se de uma espécie endêmica do Brasil e poucas informações estão

disponíveis em relação à constituição química de M. subsericea.

Estudos anteriores realizados no Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais da

Universidade Federal Fluminense (LTPN-UFF) indicaram a presença de triterpenos

pentacíclicos, como os acetatos de alfa- e beta-amirina e os ácidos ursólico e oleanólico nesta

espécie. Adicionalmente, seus extratos foram capazes de inibir o crescimento de uma

linhagem de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), incluindo uma fração hexânica de frutos

(Fernandes, 2011).

Neste contexto, o presente capítulo tem como objetivo apresentar a elucidação

estrutural de quatro triterpenos pentacíclicos oriundos de frutos, que não haviam sido

descritos anteriormente para essa espécie.

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Referências

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Artigo 1

Triterpene esters and biological activities from edible fruits of Manilkara subsericea

(Mart.) Dubard, Sapotaceae

Artigo publicado no periódico “BioMed Research International”

Volume 2013, Article ID 280810, 7 pages

http://dx.doi.org/10.1155/2013/280810

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Triterpene esters and biological activities from edible fruits of Manilkara subsericea

(Mart.) Dubard, Sapotaceae

Caio P. Fernandesa,e, Arthur L. Corrêaa, Jonathas F.R. Loboa, Otávio P. Caramela, Fernanda B.

de Almeidaa, Elaine S. Castrob, Kauê F.C.S. Souzab , Patrícia Burthb, Lidia M.F. Amorimb,

Marcelo G. Santosc, José Luiz P. Ferreirad, Deborah Q. Falcãoe, José C. T. Carvalhof &

Leandro Rochaa,e*

aLaboratório de Tecnologia de Produtos Naturais, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal Fluminense, Rua Doutor Mário Viana 523, Santa Rosa, CEP 24241-000, Niterói, RJ,

Brazil

bDepartamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal

Fluminense, Outeiro São João Batista s/no, Centro CEP 24020-141, Niterói, RJ, Brazil

cDepartamento de Ciências, Faculdade de Formação de Professores, Universidade do Estado

do Rio de Janeiro, Dr. Francisco Portela 1470, CEP 24435-000, São Gonçalo, RJ, Brazil

dLaboratório de Farmacognosia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense,

Rua Doutor Mário Viana 523, Santa Rosa, CEP 24241-000, Niterói, RJ, Brazil

eDepartamento de Tecnologia Farmacêutica, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal

Fluminense, Rua Doutor Mário Viana 523, Santa Rosa, CEP 24241-000, Niterói, RJ, Brazil

fLaboratório de Pesquisa em Fármacos, Colegiado de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Federal do Amapá, Campus Universitário - Marco Zero do Equador, Rod. Juscelino

Kubitschek de Oliveira, KM-02 - Bairro Zerão, CEP 68902-280 Macapá, AP, Brazil

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*Corresponding author: Tel: 55 21 2629 9578 / E-mail address: [email protected]

Abstract

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is popularly known in Brazil as

“guracica”. Studies with Manilkara spp indicated the presence of triterpenes, saponins and

flavonoids. Several activities have been attributed to Manilkara spp, such as antimicrobial,

antiparasitic and antitumoral, which indicates the great biological potential of this genus. In

all, 87.19% of the hexanic extract from fruits relative composition were evaluated, in which

72.81 % were beta- and alpha- amyrin esters, suggesting that they may be chemical markers

for M. subsericea. Hexadecanoic acid, hexadecanoic acid ethyl ester, (E)-9-octadecenoic acid

ethyl ester and octadecanoic acid ethyl ester were also identified. Ethanolic crude extracts

from leaves, stems and hexanic extract from fruits exhibited antimicrobial activity against

Staphylococcus aureus ATCC25923. These extracts had high IC50 values against Vero cells,

demonstrating weak cytotoxicity. This is the first time, to our knowledge, that beta- and alpha-

amyrin caproates and caprylates are described for Manilkara subsericea.

1. Introduction

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is popularly known in Brazil as

“guracica”, “maçaranduba-pequena”, “maçaranduba-vermelha “maçarandubinha” or “paraju”

(Figure 1). This species is widely spread on the sandbanks of eastern Brazil, from the states of

Espírito Santo to Santa Catarina. M. subsericea has edible fruits, being consumed in natura,

and local population also use its woods for construction [1, 2]. Studies with species from the

genus Manilkara indicated the presence of triterpenes [3], saponins [4] and flavonoids [5].

Several activities have been attributed to Manilkara spp, such as antimicrobial [6, 7],

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antiparasitic [8, 9] and antitumoral [10], which indicates the great biological potential of the

genus.

Figure 1: Manilkara subsericea (Mart.) Dubard, Sapotaceae, at Restinga de Jurubatiba

National Park (Rio de Janeiro, Brazil).

On the present study, we evaluated the antibacterial and cytotoxity activity of extracts

from Manilkara subsericea. We also made the phytochemical characterization of the hexanic

extract from edible fruits of M. subsericea.

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2. Materials and Methods

2.1. Plant material

Aerial parts with fruits of Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) were

collected at Restinga de Jurubatiba National Park (Rio de Janeiro, Brazil) in January 2009 and

were identified by the botanist Dr. Marcelo Guerra Santos. A voucher specimen of M.

subsericea was deposited at the herbarium of the Faculdade de Formação de Professores

(Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brazil) under the register number RFFP 13.416.

2.2. Preparation of extracts

Extracts were obtained from fruits, leaves and stems. The M. subsericea freshly fruits

(1.14 kg) were crushed and macerated with ethanol (EtOH) 96 % (v/v) at room temperature

until exhaustion. This ethanolic extract was concentrated in vacuum using a rotary evaporator

to obtain ethanolic crude extract from fruits (170g). This extract was dissolved into 500 mL

EtOH/H2O 90% (v/v) mixture and partitioned with hexane (2 x 600 mL) to obtain, after

evaporation of the hexanic portion, 14.0g of hexanic extract from fruits (FH). The

hydroalcoholic portion from this partition was evaporated in vacuum and ressuspended in 500

mL distilled water. This aqueous suspension was successively partitioned with ethyl acetate

(2 x 600 mL) and butanol (2 x 600 mL), furnishing, after evaporation, 4.5g of ethyl acetate

extract (FEA) and 6.8g of butanol extract (FB) from fruits. Leaves (1.93 kg) and stems (0.96

kg) were individually dried at 40ºC for two days, triturated and macerated with ethanol

(EtOH) 96 % (v/v) at room temperature until exhaustion. Each ethanolic extract was

concentrated in vacuum using a rotary evaporator to obtain 530g of ethanolic crude extract

from leaves (LET) and 169.3 g of ethanolic crude extract from stems (SET).

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2.3. Analysis of FH by Gas-Chromatography-Mass Spectrometry

The hexanic extract from fruits (FH) was analyzed by a GCMS-QP5000

(SHIMADZU) gas chromatograph equipped with a mass spectrometer using electron

ionization, according to these experimental conditions: injector temperature, 270°C; detector

temperature, 290°C; carrier gas, Helium; flow rate 1 mL/min and split injection with split

ratio 1:50. The oven temperature was programmed from 60°C (isothermal for 3 min), with an

increase of 10 °C/min to 290 °C, ending with a 59 min isothermal at 290 °C. One microliter

of the sample, dissolved in CHCl3 (1:100 mg/μL), was injected into a ZB-5MS column (i.d. =

0.25 mm, length 30 m, film thickness = 0.25 mm). Mass spectrometry (MS) conditions were

ionization voltage, 70 eV and scan rate, 1 scan/s. The identification was performed by

comparison of the MS fragmentation pattern of the substances of FH with NIST mass spectra

libraries. Quantitative analysis of the chemical constituents was performed by flame

ionization gas chromatography (GC/FID), under same conditions of GC/MS analysis and

percentages obtained by FID peak-area normalization method.

2.4. Antimicrobial activity

2.4.1. Microbial strain

Staphylococcus aureus ATCC25923 and Escherichia coli ATCC36298 obtained from

the culture collections of the Laboratório de Controle Microbiológico, Faculdade de Farmácia,

Universidade Federal Fluminense, were used for the antibacterial activity experiments.

Overnight cultures were prepared by inoculating approximately 2 mL Tryptic soy broth (TSB;

Difco) with 2-3 colonies of each organism. Bacterial strains were cultured overnight at 37ºC.

Inocula were prepared by diluting overnight cultures in saline to approximately 108 CFU/mL.

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2.4.2. Diffusion disk assay

Qualitative antimicrobial tests were carried out by disk diffusion method [11]. Briefly,

a suspension of microorganism (108 UFC/mL) was spread on the solid media plates of

Muller-Hinton agar (Difco). Disks (6 mm in diameter) were impregnated, until saturation,

with the ethanolic crude extracts from leaves and stems, hexanic, ethyl acetate and butanol

extracts from fruits. Then, disks were placed on the inoculated agar. Vancomycin (30 μg) and

ampicillin (30 μg) were used as positive reference standards of the test. Disks impregnated

with solvents used for solubilization of extracts were used as negative control. The inoculated

plates were incubated at 37ºC for 24 h. Antimicrobial activity was evaluated by measuring the

zone of inhibition against the test organisms. Each experiment made in triplicate.

2.4.3. Minimum inhibitory concentration (MIC)

A micro-dilution technique using 96 well micro-plates, as described by Eloff [12] was

used to obtain MIC values of extracts against S. aureus. The method comprised of filling all

the wells of a 96 well micro-plate with 100µl of Muller-Hinton broth (Vetec). Triplicates

(100µl) of the samples (ethanolic crude extracts from leaves and stems, hexanic, ethyl acetate

and butanol extracts from fruits) at starting concentrations of 2 mg/ml in DMSO were

introduced into the first well. Serial doubling dilutions were then performed, rejecting 100 µl

from each well and adding a mixture of test micro-organism (100 µl) having an inoculum size

of approximately 1×106 CFU/ml. The final concentrations per well were 500, 250, 125, 64 e

32 µg/mL. The micro plates were sealed and incubated at 37ºC for 24h. After incubation, 50µl

of a 2.5% solution of the biological indicator TTC (Triphenyl Tetrazolium Chloride) solution

was added, and the plate were incubated again for 2h to visualize growth inhibition. The

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lowest concentration of the sample that inhibited the bacterial growth (colourless) after

incubation was taken as the MIC. Vancomycin and DMSO were used as positive and negative

control, respectively.

2.5. Cytotoxic assay

2.5.1. Mammalian Vero cell line culture condition

Vero cell line (ATCC CCL-81) was cultured at 37 °C, 5% CO2 in DMEM medium (GIBCO)

supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (GIBCO) and 0.1 mg/mL

streptomycin (GIBCO), and 100 U/mL penicillin (GIBCO).

2.5.2. Cell viability by LDH assay

To evaluate the toxicity of extracts, Vero cell line was incubated with samples

(ethanolic crude extracts from leaves and stems, hexanic, ethyl acetate and butanol extracts

from fruits) for 24 hours and cell viability measured using LDH assay (Doles). In brief, 5 X

104 cells/well were seeded in a 96-well microplate and incubated for 24 hours to attach. In the

following day, cells were washed with PBS and fresh media DMEM without serum were

replaced containing the plant extract at different concentrations (500 - 31.25 μg/mL). Plates

were incubated for further 24 hours and LDH activity measured by colorimetric assay using

spectrophotometer (micronal-B582) at 510 nm. As control for maximum LDH release, cells

were treated with 0.1% triton-X100 in DMEM medium for 10 min before running the assay.

To determine the normal LDH release, cells were cultured in serum-free medium in presence

of DMSO. Cell viability was determined using absorbance of treated cells at DMSO as a

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reference for 100% viability (Absorbance of extract treated cells × 100/ Absorbance of

DMSO treated cells).

Figure 2: Fragmentation pattern for Δ12-oleane/Δ12-ursane series. A: beta-amyrin acetate. B:

alpha-amyrin caproate. C: alpha-amyrin caprylate.

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2.6. Statistical analysis

For antibacterial assay, statistical analysis was performed by ANOVA (One-way

Anova) with 95% confidence interval, using the GraphPad Prism 5.0 software package.

Differences were considered significant when P-values were ≤ 0.05. Vero cell viability (%)

was determined by averaging three repeated experiments and IC50, representing the

concentration at which cell viability was reduced by 50%, was calculated by linear regression

using the GraphPad Prism 5.0 software package.

3. Results and Discussion

Analysis of the chromatogram obtained from the hexanic extract from fruits of M.

subsericea indicated the elution of 20 compounds. Substances with retention time (min) of

16.84, 16.99, 18.71 and 18.94 corresponded, respectively, to hexadecanoic acid (A) (5.41%),

hexadecanoic acid ethyl ester (B) (3.57%), (E)-9-octadecenoic acid ethyl ester (C) (3.95%)

and octadecanoic acid ethyl ester (D) (1.45%). These compounds were identified by

comparison of their MS fragmentation pattern with NIST mass spectra.

On another study, we described the obtainment and identification of a mixture

containing beta-amyrin acetate and alpha-amyrin acetate from edible fruits of this species

[13]. Thus, comparison of the previously fragmentation pattern obtained for these substances

confirmed the major substances, with retention time (min) of 34.63 and 36.15, as beta-amyrin

acetate (E) (10.27%) and alpha-amyrin acetate (F) (42.34%), respectively. The substances

with retention time (min) of 53.31/56.55 and 71.70/76.99 also showed a typical fragmentation

pattern for pairs of triterpenes from the Δ12-oleane/Δ12-ursane series. The characteristic

peaks at m/z 218 (base peak), 203 and 189 due to Retro-Dials–Alder fragmentation [14] were

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observed for these substances. Beta-amyrin type triterpenes presented peak at m/z 203 higher

than peak at m/z 189, while alpha-amyrin type triterpenes showed an equal abundance (Figure

2). According to Oyo-Ita et al. [15], the amyrin caproates have molecular ion peak (M+) at m/z

524, followed by loss of CH3 or the acid moiety to m/z 509 and 408, respectively. Thus, the

substances with retention time (min) of 53.31 and 56.55 could be identified as beta-amyrin

caproate (G) (5.46%) and alpha-amyrin caproate (H) (7.26%). The mass fragment at m/z 408,

due to the loss of 144 (caprylic acid) mass unit from the molecular ion peak (M+) at m/z 552

was in accordance with literature data [16, 17] and suggested substances with retention time

(min) of 71.70 and 76.99 as beta-amyrin caprylate (I) (2.44%) and alpha-amyrin caprylate (J)

(5.04%), respectively.

It is interesting for the chemotaxonomic consideration that several studies carried out

for Manilkara species, such as Mimusops littoralis Kurz [=Manilkara littoralis (Kurz)

Dubard] [18], Mimusops manilkara G.Don [=Manilkara kauki (L.) Dubard] (Misra & Mitra,

1969) and Mimusops hexandra Roxb [=Manilkara hexandra (Roxb.) Dubard] [19] indicated

the presence of triterpene esters. Thus, the chemical substances identified on the hexanic

extract from fruits of M. subsericea (Figure 3) are in accordance with the chemical markers of

the genus Manilkara.

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R1

R3

R2

E R1=CH3 , R2=H , R3= AcO

F R1=H , R2=CH3 , R3= AcO

G R1=CH3 , R2=H , R3= CH3(CH2)4COO

H R1=H , R2=CH3 , R3= CH3(CH2)4COO

I R1=CH3 , R2=H , R3= CH3(CH2)6COO

J R1=H , R2=CH3 , R3= CH3(CH2)6COO

Figure 3: Chemical structures of the amyrin esters: beta-amyrin acetate (E), alpha-amyrin

acetate (F), beta-amyrin caproate (G), alpha-amyrin caproate (H), beta-amyrin caprylate (I)

and alpha-amyrin caprylate (J ) from the hexanic extract from fruits of Manilkara subsericea.

The identified substances corresponded to 87.19% of the total relative composition of

the hexanic extract from fruits of M. subsericea. The individual amounts of each substance are

illustrated in Figure 4. Furthermore, to our knowledge, this is the first time that the beta- and

alpha- amyrin caproates and caprylates are described for the Manilkara subsericea species.

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Figure 4: GC-FID chromatogram of the hexanic extract from fruits of Manilkara subsericea,

Sapotaceae. A: hexadecanoic acid (5.41%), B: hexadecanoic acid ethyl ester (3.57%), C: (E)-

9-octadecenoic acid ethyl ester (3.95%), D: octadecanoic acid ethyl ester (1.45%), E: beta-

amyrin acetate (10.27%), F: alpha-amyrin acetate (42.34%). For analysis conditions see

Materials and Methods, Section 2.3.

Antibacterial assay was performed against Staphylococcus aureus ATCC25923 and

Escherichia coli ATCC36298. There were significant differences (P < 0.05) in the

antibacterial activity of ethanolic crude extract from leaves (7 ± 0.28 mm), ethanolic crude

extract from stems (8 ± 0 mm) and hexanic extract from fruits (6 ± 0 mm), which were

considered active against S. aureus. (Table 1). Ethyl acetate and butanol extracts from fruits

did not inhibit the S. aureus growth. All extracts were considered inactive against E. coli.

(Table1).

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Table 1: Means of the inhibition halos (mm + SD) for Staphylococcus aureus and

Escherichia coli tested with extracts (100 mg/mL) from Manilkara subsericea. LET:

ethanolic crude extract from leaves, SET: ethanolic crude extract from stems, FH: hexanic

extract from fruits, FEA: ethyl acetate extract from fruits, FB: butanol extract from fruits.

Vanc: Vancomycin (30 µg), Ampicillin: (30 µg).

Inhibition halo (mm) + SD

Staphylococcus aureus Escherichia coli

LET 7 + 0.28 b 0 b

SET 8 + 0 c 0 b

FH 6 + 0 d 0 b

FEA 0 e 0 b

FB 0 e 0 b

Vanc 18 + 0.28a Not tested

Amp Not tested 32 + 7 a

Means in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05)

The extracts that exhibited antimicrobial activity during the disk diffusion method

were evaluated for their Minimum inhibitory concentration (MIC). All extracts tested

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inhibited the bacterial growth of the S. aureus strain with MIC of 250 µg/mL. Terpenoids are

active against bacteria but the mechanism of action of terpenes is not fully understood,

although it is speculates to involve membrane disruption by lipophilic compounds [20]. The

isomeric mixture of beta-amyrin and alpha-amyrin is known by its antimicrobial activity [21]

and 72.81% of the relative amount of the hexanic extract from fruits is constituted by esters of

these substances. Beta- and alpha- amyrin acetates are also known by their anti-inflammatory

activity and also inhibitory effects on Epstein-Barr virus early antigen (EBV-EA) in Raji cells

[22]. Furthermore, according to Hichri et al [23], the triterpene beta-amyrin acetate was able

to inhibit the bacterial growth of the Staphylococcus aureus ATCC25923 reference strain at

90 µg/mL. Thus, our results suggest that the antibacterial activity found in the hexanic extract

from fruits may be modulated by the beta- and alpha- amyrin esters identified.

All tested extracts demonstrated weak cytotoxic effects on the mammalian Vero cells.

The Cell viability on treatment with hexanic and ethyl acetate extracts from fruits was 69.66%

and 56.07% in concentration of 250 µg/mL, respectively (Figure 5). Ethanolic crude extract

from leaves (1658 μg/mL; 1164-2525) had highest IC50 value, followed by ethanolic crude

extract from stems (1112 μg/mL; 757-2525), butanol extract from fruits (683.4 μg/mL; 451-

2200), hexanic extract from fruits (482.6 μg/mL; 385-677) and ethyl acetate extract from

fruits (307.6 μg/mL; 276-346).

The triterpene beta-amyrin acetate was reported to have cytotoxicity against A2780

ovarian cancer cell line with IC50 of 12.1 μg/ml [24]. This compound was not considered

active against A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498 and HCT15 cancer cell lines [25].

Moreover, some beta- and alpha- amyrin esters were able to induce cell apoptosis in HL-60

leukemia cells [26].

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Figure 5 – Vero cell viability in the presence of extracts for 24 h measured by LDH assay.

LET: ethanolic crude extract from leaves, SET: ethanolic crude extract from stems, FEA:

ethyl acetate extract from fruits, FB: butanol extract from fruits, FH: hexanic extract from

fruits.

4. Conclusions

Although Manilkara subsericea fruits are used as food, to our knowledge, only one

article regarding to its phytochemicals and biological activities was published [13]. The

present study describes the identification of a high percentage of substances from the hexanic

extract from edible fruits of Manilkara subsericea, in which beta- and alpha- amyrin

caproates and caprylates are reported for the first time for this species. Our results suggest that

this hexane extract from fruits and ethanolic crude extract from leaves and stems presented

antimicrobial activity against S. aureus ATCC25923. In addition, these extracts had low

cytotoxicity on Vero cells, in the same concentration which inhibited S. aureus growth.

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Several biological studies are carried out for mixtures of beta- and alpha- amyrin type

triterpenes [21, 27, 28], since their separation by conventional chromatographic methods is

quite difficult [29].

Acknowledgments

The authors thank CNPq (Proc. 564745/2010-3), CAPES, FAPERJ and Rede Bionorte 156

(Rede Biodiversidade e Biotecnologia da Amazonia Legal) for their financial support.

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amirina por cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova, 34, 704-706.

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CAPÍTULO 4

Metabólitos secundários de folhas de Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

Introdução

O gênero Manilkara Adans encontra-se distribuído nos Neotrópicos, sendo 18

espécies (15 endêmicas) encontradas no Brasil (Almeida Jr., 2013). Devido a circunscrição

dos gêneros, algumas espécies anteriormente descritas como pertencentes aos gêneros Achas

L. e Mimusops L. foram incluídas no gênero Manilkara (Almeida Jr., 2010).

A maioria dos estudos fitoquímicos com espécies do gênero Manilkara têm sido

realizados com M. zapota (L.) P. Royen (Ma et al., 2003; Ahmed et al., 2001; Fayek et al.,

2013), espécie popularmente conhecida como sapoti. Entretanto, dados relacinados a

constituição da maioria das espécies desse gênero ainda são escassos, incluindo M.

subsericea. Estudos prévios com essa espécie indicam umas predominância de triterpenos

pentacíclicos com esqueletos do tipo olean-12-eno e ursan-12-eno (Fernandes et al., 2011;

2013).

Neste contexto, o presente capítulo tem o objetivo de identificar estruturalmente

substâncias não descritas previamente em Manilkara subsericea, incluindo um triterpeno

pentacíclico, cinco flavonoides e constituintes de óleo essencial.

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Brasil. PhD Thesis, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Pernambuco, Brasil.

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Fernandes C.P., Corrêa A.L., Cruz R.A.S., Botas G.S., Silva-Filho M.V., Santos M.G., de

Brito M.A., Rocha L. (2011). Anticholinesterasic activity of Manilkara subsericea (Mart.)

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Fernandes C.P., Corrêa A.L., Lobo J.F.R., Caramel O.P., de Almeida F.B., Castro E.S., Souza

K.F.C.S., Burth P., Amorim L.M.F., Santos M.G., Ferreira J.L.P., Falcão D.Q., Carvalho

J.C.T., Rocha L. (2013). Triterpene esters and biological activities from edible fruits of

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard, Sapotaceae. Bio.Med. Research International. Article

ID 280810, 7 p.

Ma J., Luo X.D., Protiva P., Yang H., Ma C., Basile M.J., Weinstein I.B., Kennelly E.J.

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Artigo 2

Secondary metabolites from leaves of Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

Artigo submetido ao periódico “Brazilian Journal of Pharmacognosy”

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Secondary metabolites from leaves of Manilkara subsericea (Mart.) Dubard

Caio P. Fernandes1,2*, Fernanda B. de Almeida2, Wanderson Romao3,4, Gabriela

Vanini3, Helber B. Costa3, Hildegardo S. França4, Marcelo G. Santos5, José C. T.

Carvalho6, Deborah Q. Falcão7, Leandro Rocha1,8

1Programa de Pós – Graduação em Biotecnologia Vegetal – Centro de Ciências da Saúde-

Bloco K , 2º andar – sala 032 – Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ – Av.

Brigadeiro Trompowski s/n – CEP: 21941-590 - Ilha do Fundão – RJ – Brazil

2Laboratório de Nanobiotecnologia Fitofarmacêutica – Colegiado de Farmácia –

Universidade Federal do Amapá – Campus Universitário Marco Zero do Equador – Rodovia

Juscelino Kubitschek de Oliveira – KM – 02 Bairro Zerão – CEP: 68902-280 – Macapá – AP

– Brazil

3Laboratório de Petroleômica e Forense- Departamento de Química- Universidade Federal

do Espírito Santo- CEP: 29075-910, Vitória – ES - Brasil.

4Instituto Federal de Educação - Ciência e Tecnologia do Espírito Santo - CEP: 29106-010 -

Vila Velha – ES - Brazil

5Faculdade de Formação de Professores – UERJ- Rua: Dr. Francisco Portela, 1470 –

Patronato – CEP: 24435-005 – São Gonçalo – Rio de Janeiro – Brazil

6Laboratório de Pesquisa em Fármacos, Colegiado de Farmácia, Universidade Federal do

Amapá, Campus Universitário Marco Zero do Equador, Rod. Juscelino Kubitschek de

Oliveira, KM-02 - Bairro Zerão, CEP 68902-280 Macapá, AP, Brazil

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7Laboratório de Tecnologia Farmacêutica – Departamento e Tecnologia Farmacêutica –

Faculdade de Farmácia – Universidade Federal Fluminense – UFF Rua: Mario Viana, 523 –

CEP: 24241-000 – Santa Rosa – Niterói – RJ – Brazil

8Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais – LTPN – Departamento e Tecnologia

Farmacêutica – Faculdade de Farmácia – Universidade Federal Fluminense – UFF Rua:

Mario Viana, 523 – CEP: 24241-000 – Santa Rosa – Niterói – RJ – Brazil

* Corresponding author

Caio Pinho Fernandes

Universidade Federal do Amapá, Campus Universitário Marco Zero do Equador

Rodovia Juscelino Kubitschek de Oliveira – KM – 02 Bairro Zerão – CEP: 68902-280 –

Macapá – AP – Brazil

Tel: +55 (96) 4009 2924 / E-mail address: [email protected]

Abstract

Manilkara subsericea is a species widely spread in the sandbanks of Restinga de Jurubatiba

National Park (Rio de Janeiro, Brazil). To our knowledge, the present study reports the first

phytochemical information about leaves from M. subsericea, being 39 substances found for

the first time on this species, including a polyhydroxy triterpene acid (pomolic acid) and some

flavonoids, such as quercitrin, myricitrin, and their aglycons, quercetin and myricetin.

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Keywords

Essential oil, Flavonoids, Manilkara subsericea, Pomolic Acid, Sapotaceae

1. Introduction

Sapotaceae is a family containing 58 genus and approximately 1250 species with

morphological variation, ranging from shrubs to medium and giant trees (Bartish et al., 2011).

Brazil comprises 11 genera and 231 species, including 1 endemic genus and 104 endemic

species (Carneiro et al. 2013). This family has the following synapomorphies, well-

developed, elongate laticifers with white latex; 2-branched hairs, brownish, T-shaped; berry

fruits, seeds usually with a hard shiny testa and large hilum (Judd et al, 2009).The genus

Manilkara Adans. is constituted by 30 species in the Neotropics, been approximately 20

species found in Africa and 12 species found in Asia and Pacific (Pennington, 2006). Brazil

has 18 species, being 15 endemic to this country (Almeida Jr., 2013). The genus Manilkara is

characterized by calyx of 2 whorls of 3 sepals, presence of staminodes and hilum shape seed

(Almeida Jr., 2010; Pennington, 1990, 2006). Due to this genus circumscription, some species

of the genera Achras L. and Mimusops L. were included in Manilkara (Almeida Jr., 2010).

Manilkara subsericea (Mart.) Dubard is an endemic species from Brazilian Atlantic

Rain Forest (Almeida Jr., 2013), commonly known as “maçaranduba”, “maçarandubinha” and

“guracica”. It is widely distributed at Restinga de Jurubatiba National Park (Rio de Janeiro

state, Brazil), being used in this locality as food and timber (Santos et al., 2009). This species

develop a main role in the ecology of Restinga de Jurubatiba, especially regarding insect-plant

interactions, being an important host plant for some Lepidoptera species (Monteiro et al.,

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2007) and for porcupine (Chaetomys subspinosus) feeding (Oliveira et al., 2012). The aim of

the present study was to perform phytochemical characterization with chemotaxonomic

significance of leaves from Manilkara subsericea.

2. Material and Methods

2.1. Plant material

Leaves of Manilkara subsericea were collected at Restinga de Jurubatiba National

Park, Rio de Janeiro State, Brazil (22°14’46’’S - 41°34’56’’W), October 2010 by Dr. Caio

Pinho Fernandes. Identification was performed by the botanist Dr. Marcelo Guerra Santos and

voucher specimen of M. subsericea were deposited at the herbarium of the Faculdade de

Formação de Professores (Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brazil) under the

register number RFFP 15316. Nomenclatural update was realized in Lista de Espécies da

Flora do Brasil (http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/listaBrasil/PrincipalUC/PrincipalUC.do)

and The Plant List: a Working List of All Plant Species (http://www.theplantlist.org/).

2.2. Preparation of extracts

Leaves (0.84 kg) were dried at 40 ºC for 2 days and then crushed and macerated in

ethanol (EtOH) 96% (v/v) at room temperature until exhaustion. After filtration, the ethanolic

extract was concentrated under vacuum using a rotary evaporator in order to obtain 109.5 g of

the ethanolic crude extract from leaves. This dried extract was sequentially washed with n-

hexane (5 x 2000 mL) and dichloromethane (5 x 2000) in order to remove less polar

constituents from the extract. The insoluble fraction was washed with ethyl acetate (5 x 2000

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mL). The ethyl acetate-soluble fraction was filtered and concentrated under vacuum using a

rotary evaporator, affording 17.3 g of the ethyl acetate fraction from leaves.

2.3. Isolation of substances

The ethyl acetate-soluble fraction from leaves was fractionated through column

chromatography using Amberlite XAD-2 resin (Sigma-Aldrich, St Louis). Elution was

performed with water, methanol/water mixtures (5:95→9:1), methanol and acetone. Fractions

28-40 were pooled together according to the TLC profile and purified on Sephadex LH-20

using and methanol as mobile phase, affording1 (40.2 mg), 2 (35.7 mg) and 3 (11.9 mg).

Fractions 8-19 were pooled together according to the TLC profile and chromatographed in C-

18 reversed phase silica gel (Sigma-Aldrich, St Louis) using gradient of mobile phase

constituted by methanol solutions (v/v) in water (60%→63%). Final purification on Sephadex

LH-20 using methanol as mobile phase afforded a fraction (7.4 mg) containing 4 and 5.

Fractions 41-52 was submitted to silica gel chromatography column using an isocratic system

of mobile phase (n-hexane : ethyl acetate : methanol, 5:5:1), affording a fraction (9.7 mg)

constituted by 6.

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O

OH O

OH

R4

R2

R3

R1

1 Myricetin R1 = R2 = R3 = R4 = OH

2 Quercetin R1 = R2 = R4 = OH, R3 = H

3 Kaempferol R1 = R3 = H, R2 = R4 = OH

4 Myricitrin R1 = R2 = R3 = OH, R4 = ORha

5 Quercitrin R1 = R2 = OH, R3 = H, R4 = ORha

OH

COOH

OH

6 Pomolic acid

Figure 1. Structures of flavonoids and triterpene from leaves of Manilkara subsericea.

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2.4. Essential oil extraction

Fresh leaves (340 g) from Manilkara subsericea were ground with distilled water

using an automatic blender (Ética Equipamentos Científicos S.A, Brazil). Hydrodistillation

method was employed for three hours using Clevenger apparatus and plant material was

placed in a 5L flask. At the end of extraction, essential oil was collected, dried over anhydrous

sodium sulphate and stored at 4 °C for further analyses.

2.5. Chemical analysis

1H and 13C NMR spectra of 1, 2, 3 and 6 were recorded at 500 and 125 MHz,

respectively, on a Varian VNMRS 500MHz spectrometer. Deuterated methanol was used for

solubilization of flavonoids, while deuterated dimethyl sulfoxide was used for solubilization

of triterpene fraction. Solvents were obtained from Cambridge Isotope Laboratories (USA)

and TMS peak was used as an internal standard.

Substances 4, 5 and 6 were analyzed by negative-ion electrospray ionization Fourier

transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, ESI(−)-FT-ICR MS (Colati et al.,

2013; Dalmaschio et al., 2014; Freitas et al., 2013). Briefly, each sample was diluted to 1.0

mg mL−1 in acetonitrile (containing 0.1% w/v of NH4OH). The resulting solution was directly

infused at a flow rate of 5 μl min−1 into the ESI source. The mass spectrometer (ESI(−)) over a

mass range of m/z 200–2000. The ESI source conditions were as follows: nebulizer gas

pressure of 0.5–1.0 bar, capillary voltage of 2.5–3.5 kV, and transfer capillary temperature of

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250 ºC. All mass spectra were externally calibrated using a NaTFA (m/z from 200 to 1200). A

resolving power (m/Δm50% ≈ 530,000, in which Δm50% is the full peak width at half-maximum

peak height) of m/z 400 and a mass accuracy (mass error) of < 1 ppm provided unambiguous

molecular formula assignments for singly charged molecular ions. Mass spectra were

acquired and processed using the software package Compass Data Analysis (Bruker

Daltonics, Bremen, Germany). ESI(-)-MS/MS experiments were collected after 4–40 eV

collision-induced dissociations (CID) with argon. Selection was performed by quadrupole,

using a unitary m/z window, and collisions were performed in the rf-only hexapole collision

cell, followed by mass analysis of product ions by the ultra-high resolution ICR analyzer.

Structures of flavonoids and triterpene identified are presented in Figure 1.

Essential oil was analyzed by a GCMS-QP2010 (SHIMADZU) gas chromatograph

equipped with a mass spectrometer using electron ionization. The gas chromatographic (GC)

conditions were as follows: Essential oil: injector temperature, 260 °C; detector temperature,

290 °C; carrier gas (Helium), flow rate 1 mL/min and split injection with split ratio 1:40.

Oven temperature was initially 60 °C and then raised to 290 °C at a rate of 3 °C/min. The

sample was diluted with n-hexane (1:100, v/v) and injected at RTX-5 column (i.d. = 0.25 mm,

length 30 m, film thickness = 0.25 µm). The mass spectrometry (MS) conditions were

voltage, 70 eV and scan rate; 1 scan/s. The retention indices (RI) were calculated by

interpolation of retention times of the substances to the retention times of a mixture of

aliphatic hydrocarbons (C7-C40) (Sigma) analyzed in the same conditions (Van den Dool and

Kratz, 1963). The identification of substances was performed by comparison of their retention

indices and mass spectra with those reported in literature (Adams, 2007). MS fragmentation

pattern of compounds was also checked with NIST mass spectra libraries. Quantitative

analysis of the chemical constituents was performed by flame ionization gas chromatography

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(CG/FID), under same conditions of GC/MS analysis and percentages obtained by FID peak

area normalization method.

3. Results and Discussion

1H NMR spectrum of 1 (CD3OD, 500 MHz) showed two doublets at δH 6.18 (J = 1.45

Hz) and δH 6.38 (J = 1.45 Hz), attributable respectively to the protons H-8 and H-6, and a

two-proton singlet observed at δH 7.34, corresponding to the B-ring aromatic protons H-2´

and H-6´ of a flavonol. Signals observed in the 1H and 13C NMR spectrum are in accordance

with literature data for myricetin (Ceruks et al., 2007). Substances 2 and 3 had their 1H and

13C NMR spectra compared with literature data (Koolen et al., 2012; Olennikov et al., 2012)

and therefore were respectively identified as quercetin and kaempferol.

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Figure 2. ESI(-)-FT-ICR mass spectra for (a) FL4 and (b) FL5 samples and CID experiments

for ion of m/z 463 and 447 corresponding to (c) myricitrin and (d) quercitrin.

The remaining flavonoids, 4 and 5, were analyzed by ESI(−)-FT-ICR MS, Figure 2a-

d. For FL4, Figure 2a, ESI(-)-FT-ICR mass spectrum, detected the presence of the O-

glycoside flavonol myricitrin (M = C21H20O12), ions of m/z 463.0882 ([M – H]-), 499.0651

([M + Cl]-) and 927.1844 ([2M – H]-) as deprotonated molecule, chlorine adduct and dimer,

respectively. A DBE (double bound equivalents) of 12 found for ions [M – H]- and [M + Cl]-

agrees with the chemical structure of myricitrin, that presents two aromatic rings (DBE = 8),

one rhamnose (DBE = 1) and a ring containing one double bond, and a ketone group (DBE =

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3). To confirm myricitrin detection, ESI(-)-MS/MS was performed for the ion of m/z 463,

Figure 2c. The CID of [M - H]- of m/z 463 agrees well with its structure and connectivity,

producing fragments with m/z 316, corresponding to neutral loss of C6H11O4. For FL5, Figure

2b, ESI(-)-FT-ICR mass spectrum identified, simultaneously, ion [M – H]- of m/z 463.0882,

and ions [N – H]- and [N + Cl]- of m/z 447.0933 and 483.0703, respectively, where N =

C21H20O11, corresponding to the O-glycoside flavonol quercitrin. CID experiment of ion of

m/z 447, Figure 2d, produces fragments of m/z 301 and 284 corresponding to neutral losses

of C6H10O4 and one rhamnose molecule.

Some flavonoids isolated and identified on the present study have also been found on

this genus. Quercetin was identified on Mimusops manilkara G.Don (Manilkara kauki (L.)

Dubard) and Mimusops littoralis Kurz (Manilkara littoralis (Kurz) Dubard) (Jahan et al,

1996; Misra and Mitra, 1969), while myricetin was identified on Achras zapota L. (Manilkara

zapota (L.) P.Royen) (Subramanian and Nair, 1972). The glycosylated flavonoids quercitrin

and myricitrin were isolated from M. zapota (Ma et al., 2003).

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Figure 3. ESI(-)-FT-ICR mass spectrum of triterpene acids present in the leaves M.

subsericea

Chromatographic fractionation of the ethyl acetate extract from leaves (EAL) also

afforded a white powder. These substances comprise one of the largest classes of special

metabolites and usually are obtained as mixtures (Olea and Roque, 1990). ESI(-)FT-ICR mass

spectrum of the fraction containing substance 6 revealed the presence of precursor ions

[C30H48O4 – H]-, [C30H48O5 – H]- and [C30H48O6 – H]- of m/z 471, 487 and 503, being

attributed to dihydroxy, trihydroxy and tetrahydroxy triterpene acids (Figure 3), probably

derivatives from ursolic and oleanolic acids (DNP version 19.1, 2010). 13C NMR spectra of

this fraction showed typical set of signals for triterpene mixtures. It was observed a typical

signal at δc 181.0, due to the C-28 carboxyl group of triterpene acid. The presence of C-12/C-

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13 olefinic carbons at δc 128.4/140.3, as well as the signals of carbons bonded to hydroxyl

groups at δc 79.8 (C-3) and 73.1 (C-19) suggested that pomolic acid (6) may be the main

constituent of this fraction. Assignments for pomolic acid are in accordance with literature

data and allowed establishment of relative configuration (Mahato and Kundu, 1994). To our

knowledge, this is the first time that this substance is reported as constituent of M. subsericea.

Several triterpenes, such as beta-amyrin acetate, alpha-amyrin acetate, beta-amyrin

caproate, alpha-amyrin caproate, beta-amyrin caprylate, alpha-amyrin caprylate, oleanolic

acid and ursolic acid have been previously isolated from M. subsericea (Fernandes et al. 2011,

2013). Pomolic acid, is structurally related to ursolic acid and was already found in the family

Sapotaceae (Lee et al., 2005). Alpha-amyrin caprylate, alpha-amyrin acetate and β-amyrin-3-

(3'-dimethyl) butyrate were isolated from Manilkara zapota (L.) P.Royen (Ahmed et al.,

2001; Fayek et al., 2013). Alpha-amyrin acetate, beta-amyrin acetate and ursolic acid were

isolated from Mimusops manilkara (Manilkara kauki (L.) Dubard) (Misra et al., 1969).

Alpha- and beta-amyrin and beta-amyrin caproate were isolated from Mimusops littoralis

Kurz (Manilkara littoralis (Kurz) Dubard) (Jahan et al., 1996). Alpha-amyrin acetate and

alpha-amyrin cinnamate were isolated from Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. (Rhourri-

frih et al., 2012). It is interesting from a chemosystematic overview that substances described

above for Manilkara species are derived from olean-12-ene and urs-12-ene pentaciclic

triterpene type. This data suggests a possible chemotaxonomic significance of pentacyclic

triterpenes, especially from these specific skeletons on the genus.

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Table 1. Relative abundance of essential oil constituents from leaves of Manilkara

subsericea.

Substance RI

Relative

abundance (%)

Substance RI

Relative

abundance (%)

3-hexen-1-ol 850 0.2 Trans-2-decenal 1262 0.2

Hexanol 862 0.2 Beta-damascenone 1388 0.2

2-heptanone 889 0.1 Beta-damascone 1418 0.3

Heptanal 902 0.2 Beta-caryophyllene 1423 0.5

Heptanol 966 0.3 Farnesene 1510 0.3

Octanal 1003 0.2

Caryophyllene

oxide

1588 0.7

(3E)-3-hexenyl

acetate

1006 0.6 Hexadecanoic Acid 1969 8.6

Beta-ocimene 1047 7.3 Eicosene 1994 0.2

Octanol 1069 1.3 Heneicosane 2100 0.3

Linalool oxide 1089 0.5 Phytol 2116 15.6

2-nonanone 1092 0.2 Docosene 2194 0.4

Linalool 1100 27.6 Tricosane 2300 0.6

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Terpineol 1193 0.9 Pentacosane 2500 0.4

Methyl salicilate 1197 1.9 Heptacosane 2700 0.9

Safranal 1202 0.3 Squalene 2832 2.6

Beta-cyclocitral 1223 0.3 Nonacosane 2900 8.9

Geraniol 1256 0.3 Untriacontane 3100 3.4

Total Identified 86.5

RI: Retention Indices calculated by interpolation of retention times of the substances to the

retention times of a mixture of aliphatic hydrocarbons

Gas chromatographic (GC) conditions: injector temperature, 260 °C; detector temperature,

290 °C; carrier gas, Helium; flow rate, 1 mL/min; split ratio, 1:40. Initial temperature, 60 °C;

final temperature, 290 °C; rate of 3 °C/min. RTX-5 column (i.d. = 0.25 mm, length 30 m, film

thickness = 0.25 µm). Mass spectrometry (MS) conditions: voltage, 70 eV; scan rate; 1 scan/s.

Essential oil obtained from fresh leaves of Manilkara subsericea was analysed by GC-

MS in order to determine its chemical composition. In all, 34 substances were identified,

mainly comprising monoterpenes, sesquiterpenes and long chain hydrocarbons, corresponding

to 86.5 % of total relative composition of the oil (Table 1). The monoterpene linalool was the

major substance found, corresponding to 27.6% of the total relative composition of the

essential oil. The relative amount of each substance found is presented in table 1. Some

terpenoids with more isoprene units than monoterpenes and sesquiterpenes were also found

on this essential oil. It was observed an ion peak (M+) at m/z 296 and characteristic fragments

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- 94 -

at m/z 278, due to loss of 18 units of mass (M+ - H2O), m/z 123 and 71 (base peak). This data

is in accordance with literature data for phytol (Siqueira et al., 2003).This substance has wide

distribution among plants, since this substance forms the lipophilic side chain of the

chlorophylls (Dewick, 2009). It was also observed a substance with main fragments at m/z

341, 95, 81 and 69 (base peak), which is in accordance with literature that for squalene

(Bhatia et al., 2013). Detection of this substance may be relevant from a biosynthetic

perception for M. subsericea, since this acyclic substance with 30 atoms of carbon is an

important precursor of triterpenes (Dewick, 2009; Xu et al., 2004).

4. Conclusions

Despite the ecological significance, great abundance, use as food and literature data

concerning its biological activities, Manilkara subsericea remains almost chemically

unexplored. As part of our ongoing studies, the present study allowed the identification of

substances from leaves of this species for the fisrt time, being all substances found identified

for the first time on M. subsericea, with the exception of hexadecanoic acid. Moreover,

flavonoids and a polyhydroxy triterpene acid are reported, contributing for phytochemical

characterization of an almost unexplored species of the Brazilian flora.

Acknowledgment

Authors thank CNPq (nº 306676/2010-9) and FAPERJ for their financial support.

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CAPÍTULO 5

Desenvolvimento de nanoemulsão inseticida contendo extrato de Manilkara subsericea

(Sapotaceae)

Introdução

O uso indiscriminado de pesticidas de origem sintética em lavouras têm sido alvo de

debates, principalmente devido a possibilidade de seleção de populações de insetos com

resistência aos inseticidas e efeitos tóxicos sobre organismos não alvos. Neste contexto, o uso

de substâncias de origem natural têm ganhado força para geração de produtos específicos,

menos tóxicos, menos poluentes e ecologicamente corretos (Rao et al., 2003).

As plantas produzem substâncias de defesa em resposta ao ambiente em que se situam,

incluindo agentes com atividade inseticida, com o intuito de repelir e/ou eliminar herbívoros.

Diversas classes de metabólitos especiais, como alcalóides, substâncias fenólicas e

terpenóides foram descritas como inseticidas (Rattan, 2010). Os triterpenos estão entre os

grupos mais ativos (Viegas Jr, 2003), entretanto, a baixa solubilidade em água e consequente

necessidade de uso de solventes orgânicos potencialmente tóxicos se configura como um

desafio tecnológico para obtenção de produtos viáveis.

A espécie Manilkara subsericea (Mart.) Dubard foi capaz de induzir mortalidade em

Dysdercus peruvianus (Hemiptera), uma praga agrícola que causa graves danos no cultivo do

algodão. Além disso, foi observado que a atividade inseticida da fração hexânica de frutos é,

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ao menos parcialmente, modulada por triterpenos pentacíclios com baixa solubilidade em

água, como os acetatos de alfa- e beta-amirina (Fernandes et al., 2013).

Neste contexto, a utilização de nanoemulsões se configura como uma alternativa

viável para aumentar a disponibilização de substâncias apolares. O tamanho diminuto das

partículas dispersas aumentam a estabilidade da formulação, além de torná-la mais atraente

visualmente e potencialmente aumentar a biodisponibilidade dos ativos. O presente capítulo

tem por objetivo descrever o desenvolvimento de uma nanoemulsão inseticida contendo a

fração em hexano obtida dos frutos de Manilkara subsericea.

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- 102 -

Artigo 3.

Development of an insecticidal nanoemulsion with Manilkara subsericea (Sapotaceae)

extract

Artigo publicado no periódico “Journal of Nanobiotechnology”

Volume 2014 12:22

doi:10.1186/1477-3155-12-22

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- 103 -

Development of an insecticidal nanoemulsion with Manilkara subsericea (Sapotaceae)

extract

Caio Pinho Fernandes1,2, Fernanda Borges de Almeida1 Amanda Nunes Silveira3, Marcelo

Salabert Gonzalez4, Cicero Brasileiro Mello4, Denise Feder4, Raul Apolinário4, Marcelo

Guerra Santos5, José Carlos Tavares Carvalho6, Luis Armando Cândido Tietbohl7,

Leandro Rocha7 & Deborah Quintanilha Falcão3

* Correspondence

Caio Pinho Fernandes

Universidade Federal do Amapá, Campus Universitário Marco Zero do Equador

Rodovia Juscelino Kubitschek de Oliveira – KM – 02 – Jardim Marco Zero – CEP: 68902-

280 – Macapá – AP – Brazil

Tel: +55 (96) 4009 2924 / E-mail address: [email protected]

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Abstract

Background: Plants have been recognized as a good source of insecticidal agents, since

they are able to produce their own defensives to insect attack. Moreover, there is a

growing concern worldwide to develop pesticides with low impact to environment

and non-target organisms. Hexane-soluble fraction from ethanolic crude extract

from fruits of Manilkara subsericea and its triterpenes were considered active

against a cotton pest (Dysdercus peruvianus). Several natural products with

insecticidal activity have poor water solubility, including triterpenes, and

nanotechnology has emerged as a good alternative to solve this main problem. On

this context, the aim of the present study was to develop an insecticidal

nanoemulsion containing apolar fraction from fruits of Manilkara subsericea.

Results: It was obtained a formulation constituted by 5% of oil (octyldodecyl

myristate), 5% of surfactants (sorbitan monooleate/polysorbate 80), 5% of apolar

fraction from M. subsericea and 85% of water. Analysis of mean droplet diameter

(155.2 ± 3.8 nm) confirmed this formulation as a nanoemulsion. It was able to

induce mortality in D. peruvianus. It was observed no effect against

acetylcholinesterase or mortality in mice induced by the formulation, suggesting the

safety of this nanoemulsion for non-target organisms. Conclusions: The present

study suggests that the obtained O/A nanoemulsion may be useful to enhance water

solubility of poor water soluble natural products with insecticidal activity, including

the hexane-soluble fraction from ethanolic crude extract from fruits of Manilkara

subsericea.

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Keywords: Dysdercus peruvianus, Manilkara subsericea, Nanoemulsions

Background

Chemical pesticides have been used to control pest insects, however, they are usually

toxic to environment. There is a growing concern worldwide regarding indiscriminate use of

these substances, which are associated to environmental pollution and toxicity risk to non-

targeted organisms [1]. Plant species are well recognized by their ability to produce defensive

substances, in order to protect themselves from insect attack [2]. These natural products

appear as potential sources of new biodegradable insecticides with wide range of mechanisms

of action, being an important alternative for insect pest management in agriculture [3]. One of

the most promising and recognized group of substances with insecticidal activity are the

triterpenes [4].

Manilkara subscericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is an endemic species of

Brazilian Atlantic Forest [5] and widely distributed at Restinga de Jurubatiba National Park

(Rio de Janeiro State, Brazil) [6]. Several non-polar pentacyclic triterpenes have been

described as major constituents of M. subsericea, mainly alpha- and beta-amyrin esters [7,8].

Hexane-soluble fraction from ethanolic crude extract from fruits of M. subsericea and its

major substances (alpha- and beta-amyrin acetate) was able to induce mortality, delayed

development and inhibition of moulting in Dysdercus peruvianus [9], a hemiptera species

which causes serious loss of cotton crops [10]. This apolar fraction and its triterpenes have

poor water solubility and are soluble in toxic organic solvents, such as chloroform and

dichloromethane, being this intrinsic characteristic a technological challenge if development if

a viable product is desired.

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Nanotechnology has emerged as a promising area for development of products in a

wide range of applications, including pesticide agents. Considering that many of the

insecticides known today are organic compounds with poor water solubility, development of

nanoproducts appear to solve this main problem, enhancing water solubility, bioavailability

and resulting in stable formulations without utilization of organic toxic solvents [11].

Nanoemulsions are one of the most important formulations to enhance solubility and

dissolution properties of poorly water soluble substances [12]. They are also referred as

miniemulsions or ultrafine emulsions and have small droplet size (20-200 nm). They are

transparent or translucent, often presenting a bluish reflect and have high kinetic stability [13].

Low energy methods have been used to achieve nanoemulsions, including reverse-phase

composition (RPC) and temperature of inversion phase (TIF) [14]. Formulation screening

stage is crucial if development of a stable nanoformulation is desired, especially if a low

energy method is employed, being determination of required HLB value of an oil [15] and

construction of pseudo-ternary phase diagrams [16] very useful, especially to achieve

nanoemulsions.

On this context, the aim of the present study was to develop an insecticidal

nanoemulsion containing apolar fraction from fruits of Manilkara subsericea and verify its

effects against Dysdercus peruvianus and non-target organisms.

Results and Discussion

Preliminary solubility studies were performed regarding choice of oil phase and

surfactants. Octyldodecyl myristate (MOD®) was the best oil, being able to solubilize equal

amount (1:1, w/w) of hexane-soluble fraction from fruits of M. subsericea (HF). It is

frequently necessary to use blends, such as a pair of hydrophilic and lipophilic non-ionic

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surfactants, to achieve droplets with small diameter [17]. Sorbitan oleate and polysorbate 80

were considered the best pair (Data not shown). These surfactants have been used in low

energy methods, being able to produce nanoemulsions with smaller mean droplet size, when

compared to other surfactants. This could be explained by the ability of this couple to induce

formation of a looser film, which is associated to generation of nanoemulsions [12]. Addition

of water to a surfactant in oil solution was employed in the present study, since it provided

better results, when compared to addition of oil to an aqueous surfactant solution (Data not

shown). This could be attributed to phase transitions and changes in the curvature of the

surfactant from W/O to O/W during emulsification process [18].

In order to predict the best ratio of surfactants to be used, several emulsions were

prepared varying the relative amounts of sorbitan oleate and polysorbate 80. Most of them

presented instable behavior, including critical macroscopical changes, such as creaming and

phase separation. Surfactants can be classified according to their Hydrophile-Lipophile

Balance (HLB), a semi-empirical scale [19] and several HLB values can be obtained using

different amounts of each component of a couple of surfactants [20]. Emulsions with HLB

values of 10 (sorbitan oleate/polysorbate ratio, 1.0/1.1) and 11 (sorbitan oleate/polysorbate

ratio, 1.0/1.7) were considered more stable. A second set of emulsions within this HLB range

was prepared and the obtained formulations presented translucent aspect and bluish reflect,

which is characteristic for nanoemulsions [13]. Mean droplet size analysis indicated that

nanoemulsion with HLB value of 10.75 (sorbitan oleate/polysorbate ratio, 1.0/1.5) presented

the smallest mean diameter (50.6 ± 0.4 nm) and low polydispersity (0.164 ± 0.021). Stable

formulations with low mean droplet size can be obtained when HLB value of the surfactant

couple coincides with required HLB value of the oil [12,20]. Thus, required HLB of oil can be

determined by calculating the HLB value of emulsifier or emulsifier mixture which was able

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to induce formation of the most stable formulation, among a set of emulsions prepared with

different blends of a couple of emulsifiers in a wide range of HLB value [21]. Our results

indicate that 10.75 should be the required HLB value of MOD® used in the present study.

Table 1. Composition, mean droplet size and polydispersity of each formulation prepared

during construction of pseudo-ternary phase diagram for delimitation of nanoemulsion region.

% of Oil

% of

Surfactants

% of Water

Mean Diameter

(nm)

Polydispersity

1a 5 5 90 50.6 ± 0.4 0.164 ± 0.021

2 2.5 5 92.5 234.2 ± 12.5 0.025 ± 0.012

3 2.5 7.5 90 421.5 ± 50.4 0.005 ± 0.000

4a 5 7.5 87.5 196.4 ± 12.5 0.178 ± 0.044

5a 7.5 5 87.5 145.7 ± 8.6 0.132 ± 0.038

6 7.5 2.5 90 256.9 ± 8.6 0.016 ± 0.011

7a 5 2.5 92.5 151.7 ± 6.0 0.155 ± 0.018

8a 10 5 85 139.4 ± 9.6 0.078 ± 0.049

9a 10 7.5 82.5 133.5 ± 0.5 0.247 ± 0.011

10a 7.5 7.5 85 139.5 ± 4.7 0.073 ± 0.039

11a 10 10 80 86.8 ± 0.9 0.294 ± 0.006

12a 7.5 10 82.5 48.7 ± 0.2 0.313 ± 0.002

13 5 10 85 234.4 ± 2.3 0.270 ± 0.016

14 5 12.5 82.5 298.5 ± 31.8 0.005 ± 0.000

15a 7.5 12.5 80 85.4 ± 1.2 0.350 ± 0.005

16a 10 12.5 77.5 51.7 ± 0.2 0.331 ± 0.005

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17a 7.5 15 77.5 162.4 ± 1.3 0.335 ± 0.011

18a 7.5 17.5 75 159.2 ± 2.3 0.334 ± 0.007

19a 10 15 75 68.7 ± 0.8 0.360 ± 0.004

20a 10 17.5 72.5 87.9 ± 1.5 0.365 ± 0.003

21a 12.5 15 72.5 170.6 ± 6.2 0.144 ± 0.027

22a 12.5 12.5 75 66.6 ± 1.1 0.304 ± 0.005

23a 12.5 10 77.5 120.1 ± 1.0 0.225 ± 0.003

24a 15.0 12.5 72.5 95.3 ± 0.6 0.255 ± 0.006

25a 15 15 70 45.9 ± 0.4 0.271 ± 0.005

26a 12.5 7.5 80 75.4 ± 2.3 0.340 ± 0.005

27a 17.5 15.0 67.5 161.6 ± 1.9 0.266 ± 0.007

28a 12.5 17.5 70 97.2 ± 1.0 0.256 ± 0.002

Oil – MOD®

Surfactants – sorbitan monooleate/polysorbate 80 at HLB of 10.75

a Formulations in the nanoemulsion region

It is observed that not every combination of components produces nanoemulsions over

the whole range of possible compositions [22]. Thus, a total of 28 emulsions were prepared

using different percentages of water, MOD® and surfactants (sorbitan monoleate/polysorbate

80, HLB 10.75) and mean droplet size of each formulation was analyzed. Mean droplet size

ranged from 45.9 ± 0.4 nm (oil 15%, surfactants 15%, water 70%) to 421.5 ± 50.4 nm (oil

2.5%, surfactants 7.5%, water 90%) (Table 1). Composition of each emulsion obtained can be

expressed as a pseudo-ternary phase diagram, which is represented by equilateral triangle in

which four or more constituents are investigated [22] and is very useful to determine relation

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between phase behavior of a mixture and its composition [23]. In all, 23 emulsion presented

mean droplet size bellow 200 nm, ranging 45.9 ± 0.4 nm to 196.4 ± 12.5 and were used to

delineate the nanoemulsion region (Figure 1). Small mean droplet sizes, such as 48.7 ± 0.2 nm

(7.5% of oil, 10% of surfactants, 82.5% of water), 51.7 ± 0.2 nm (10% of oil, 12.5% of

surfactants, 77.5% of water) and 45.9 ± 0.4 nm (15% of oil, 15% of surfactants, 70% of

water) were obtained (Table 1). This data may be important for further studies or development

of nanoformulations using MOD®, sorbitan oleate, polysorbate 80 and water.

Figure 1. Pseudo-ternary phase diagram constructed with water, MOD® and surfactants

(sorbitan monoleate/polysorbate 80, HLB =10.75) at different compositions. Nanoemulsion

region is delimited in blue.

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Special attention was given to formulation comprised by 5% of MOD, 5% of

surfactants and 90 % of water, which also presented stable behavior, small mean droplet size

(50.6 ± 0.4 nm) and low polidispersity (0.164 ± 0.021). Low surfactant percentage could be

considered an advantage, since further preparation of this formulation would reduce toxicity

and costs with raw materials, when compared to other nanoemulsions with higher

concentrations of surfactants. Thus, this formulation was chosen to prepare a nanoemulsion

with hexane-soluble fraction from fruits of Manilkara subsericea dispersed through internal

phase (HFNE).

Concentration of extract corresponded to equal percentage of MOD®, based on its

intrinsic solubility. This amount was discounted from water percentage, being HFNE

constituted by 5% of MOD, 5 % of surfactants, 5 % of hexane-soluble fraction from fruits of

M. subsericea and 85% of water. A blank nanoemulsion without hexane-soluble fraction of

M. subsericea extract (HF) was prepared for negative control. Both nanoemulsions presented

a characteristic bluish reflect, associated to Tyndall effect [13] (Figure 2). It was observed an

increase in the nanoemulsion mean droplet size when HF was dispersed through oil phase

(Figure 3). This fact could be explained due to deposition of substances, which may reduce

the flexibility of the surfactant film and result in more compact films instead of looser films

and smaller mean droplets [12]. Previous gas chromatography analysis of HF indicated a high

relative percentage of pentacyclic triterpenes, including beta-amyrin acetate (10.27%), alpha-

amyrin acetate (42.34%), beta-amyrin caproate (5.46%), alpha-amyrin caproate (7.26%), beta-

amyrin caprylate (2.44%) and alpha-amyrin caprylate (5.04%) [8]. These substances may be

contributing to the result described above.

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HFNE and blank nanoemulsion presented zeta potential values of – 47.4 ± 3.2 and –

59.6 ± 4.1, respectively. Zeta potential is a special parameter that should be analyzed, in order

to determine stability of nanoemulsions and is associated to surface potential of the droplets

[24]. Maximum stability is observed when zeta potential value is above ± 30 mV [25]. The

high stability of formulations with great zeta potential values is associated to repulsive forces

that exceed attracting Van der Waals forces, resulting in dispersed particles and a

deflocculated system [23]. Macroscopical analysis of the nanoemulsion with HF and blank

nanoemulsion indicated that these formulations maintained their original fine appearance and

bluish reflection. It was observed no phase separation, creaming and sedimentation under

room temperature (25±2 ºC) and accelerated stability evaluation. Long term physical stability

of a nanoemulsion related to its small droplets, making this type of formulation being also

referred as “approaching thermodynamic stability” [26,13].

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Figure 2. Nanoemulsions obtained by low energy method. HFNE shown in left side and

blank nanoemulsion shown in right side of the picture.

Figure 3. Particle size distribution of (a) negative control (57.0 ± 0.3 nm) and (b)

nanoemulsion with hexane-soluble fraction from fruits of M. subsericea (155.2 ± 3.8 nm).

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Polidispersity was 0.270 ± 0.006 for blank nanoemulsion and 0.150 ± 0.050 for nanoemulsion

with hexane-soluble fraction from fruits of M. subsericea.

Insecticidal assay was performed in order to verify if HFNE is able to induce mortality

in D. peruvianus. During the whole experimental period, it was observed that HFNE (treated

group) did not interfere in body weight, when compared to untreated group, indicating the

absence of antifeedant effect. This effect was also not detected in negative control group. It

was not observed overaged, extranumerary nymphs or insects with body deformations. Figure

4 indicates that mortality in the untreated group ranged from 3.3 ± 1.15 %, between 5° and

14° days of observation, to 10 ± 1.53 %, between 15° and 30° of observation. Negative

control group (treated with blank nanoemulsion) presented higher levels of mortality

throughout the experimental period, reaching (6.6± 1.15%) (p< 0.001) after 4 days, 13.3±

2.52% (p< 0.001) after 14 days and 21.10± 3.06% (p< 0.001) after 30 days of treatment.

Treatment of insects with HFNE exhibited significantly higher levels of mortality. It was

observed that mortality began on the first day after treatment (12.23 ± 0.58 %) (p< 0.001),

reached 22.23± 1.73% (p< 0.001) after 14 days and 44.43± 6.66% (p< 0.0001) after the end of

the experiment. Significant differences between the group of insects treated with hexanic

nanoemulsion containing extract of M. subsericea and the control group were detected in

almost all days of observation until the end of the experiment (ANOVA, p<0.005). However,

it is worth to note that there was no statistical difference between HFNE-treated and blank

nanoemulsion-treated insects among days 21-23 after treatment. Perhaps, differences in the

speed of absorption between HFNE and blank nanoemulsion by insect metabolic systems may

explain this not expectable result. Physiological mechanisms of metabolization of these

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compounds by invertebrates remains unknown [9] and is now under investigation by our

research group.

Changes in the time period in which occur the processes of molt and metamorphosis

were observed in group treated with HFNE and negative group (Data not shown). Moreover,

an associated high mortality rate were displayed continuously and gradually increasing

throughout insects lifecycle regardless whether the insects were in the nymphal or adult stage.

This observation point out to a physiological connection between the neuroendocrine control

of the insect development and the reduced longevity obtained after treatments. These results

suggest that HFNE may able to release insecticidal components from HF, while formulation

used as blank nanoemulsion may be used to disperse other insecticidal agents.

Figure 4. Analysis of mortality after topical treatment of Dysdercus peruvianus with

nanoemulsion containing hexane-soluble fraction from fruits of Manilkara subsericea

(HFNE) (filled column). Negative control group was topically applied with blank

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nanoemulsion (crosshatched columns). Untreated group is represented by open columns. Each

group represents mean of three experiments.

In order to evaluate if the formulation interfere with acetylcholinesterase, HFNE was

tested using a colorimetric assay. Positive control was performed by preparing a

nanoemulsion with eserine, a recognized lipophilic anticholinesterase agent dispersed through

oil phase (MOD®). Mean droplet analysis confirmed this formulation, constituted by 5% of

MOD®, 5% of surfactants (HLB of 10.75), 0.05% of eserine and 89.95% of water, as a

nanoemulsion (67.3 ± 0.3 nm). IC50 of this substance could not be determined, since lowest

eserine concentration (0.6 ppm) was able to inhibit 90% of enzyme activity (Figure 5).

Results suggest that eserine may be able to displace from disperse phase of the nanoemulsion

to the aqueous external phase and induced a dose-dependent inhibition of

acetylcholinesterase, since it should be in external phase to bind to the enzyme. Pesticides are

used as an important tool to protect crops worldwide, however, residues of these substances

can be found in many environments, including rivers, estuaries and oceans [27,28]. Most

insecticides provide harmful impacts on non-target species, especially aquatic organisms,

such as fishes. These animals are especially susceptive to acetylcholinesterase inhibitors,

probably due to lacking of detoxification systems and sharing same neurological and

respiratory mechanisms [27,29]. Acetylcholinesterase inhibitory assay indicated that no

significant inhibition of acetylcholinesterase modulated by HFNE (Figure 5). Considering that

acetylcholinesterase used in this assay is from fish origin, our results suggest that HFNE may

not induce harmful effects over aquatic non-target animals, indicating the potential of this

nanoemulsion as an insecticidal agent. Nanoemulsion without M. subsericea extract also did

not interfere with the enzyme (Data not shown).

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Acute toxicity evaluation was performed in order to verify effects of HFNE in mice. It

was not observed any behavioral change during all tested period and mortality in all groups.

Analysis of body weight also indicated absence of significant difference between HFNE and

negative control group (Table 2). It was also not observed significant difference in food and

water consumption, macroscopical aspects and weight of organs between groups treated with

HFNE and negative control group (Data not shown). Treatment with HFNE was performed at

a single high dose corresponding to 3g/kg of extract per animal. Since no death or toxic

signals were observed, LD50 could not be estimated and HFNE, suggesting that HFNE may

be considered non-toxic [30].

Figure 5. Linear regression between AchE activity (mU) x natural logarithm of (a) effective

concentration of eserine (p<0.05) and (b) effective concentration of hexane-soluble fraction

from fruits of Manilkara subsericea (p>0.05).

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Table 2. Weight variation in adult female and male Swiss albino mice (Mus musculus) treated

with HFNE (5% of MOD®, 5 % of surfactants (HLB of 10.75), 5% of hexane-soluble fraction

from fruits of M. subsericea and 85% of water) by oral route, corresponding to 3g/kg of

extract. Control groups received same volume of blank nanoemulsion (5% of MOD, 5% of

surfactants and 90 % of water)

Body weight (Male) Body weight (Female)

Initial (g) Final (g) Initial (g) Final (g)

HFNE 49.06 ± 0.43 50.39 ± 1.37 52.72 ± 1.62 50.64 ± 0.63

Control 50.65 ± 1.50 52.05 ± 2.71 50.64 ± 0.63 51.76 ± 1.59

p>0.05

Conclusions

Previous study performed by our research group indicated that hexane-soluble fraction

from ethanolic crude extract from fruits of Manilkara subsericea presented insecticidal

activity against Dysdercus peruvianus. This activity may be partially attributed to beta-and

alpha amyrin acetates, which may be used as chemical markers for quality control of products

with M. subsericea extracts. However, these substances, as well as the active fraction are

poorly water soluble. As part of our ongoing studies with this species, we decided to develop

an insecticidal nanoemulsion. This formulation was able to induce mortality in insects and our

results suggest that it may be safe for non-target organisms and environment. The present

study suggests the obtained O/A nanoemulsion may be useful to enhance water solubility of

poor water soluble natural products with insecticidal activity, including the hexane-soluble

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fraction from ethanolic crude extract from fruits of Manilkara subsericea. The absence of

organic toxic solvents and stability makes this nanoemulsion a potential insecticidal product.

Materials and Methods

Chemicals

Sorbitan oleate (HLB: 4.3) and Polysorbate 80 (HLB: 15) were purchased from La

Belle Ativos Ltda (Paraná, Brazil). Octyldodecyl myristate (MOD®) was purchase from

Brasquim Ltda (São Paulo, Brazil). Acetylthiocholine iodide (ATCI), 5,5-dithiobis-2-

nitrobenzoic acid (DTNB), physostigmine (eserine) and acetylcholinesterase from electric eel

(type VI-S, C3389-2UK, lyophilized powder) were purchased from Sigma (Sigma-Aldrich

Corporation, St Louis, MO). Hexane-soluble fraction from fruits of M. subsericea was

previously obtained [9] and stored at 4 °C for further utilization.

Emulsification method

Emulsions were prepared by temperature of inversion phase method [31]. The required

amounts of both emulsifiers were dissolved in the oil phase and heated at 75 ± 5 º C, while the

aqueous phase was separately heated at same temperature. When both phases reached the

same temperature, aqueous phase was gently added and mixed with the oil phase, using a

mechanic agitator model Fisatom 713D at 400 rpm for 10 min and additional 5 min of

agitation under cooling. Aditional constituents was weight an placed together with oil and

surfactants mixture, being its mass discounted from water mass.

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Required HLB Determination

Each emulsion was prepared at a final mass of 25 g, containing 90 % (w/w) of distilled

water, 5% (w/w) of MOD® and 5% of a mixture of emulsifiers [32]. Series of emulsions were

prepared using sorbitan oleate (HLB = 4.3) and polysorbate 80 (HLB = 15), allowing a wide

range of HLB values from 4.3 (5% w/w of sorbitan oleate) to 15 (5% w/w of polysorbate 80)

by blending together the emulsifiers in different ratios.

Pseudo-Ternary Phase Diagram

Nanoemulsion region was determined using pseudo-ternary phase diagram. Each

corner corresponded to 100% of water, surfactants and MOD®. Surfactants blend was kept

constant and corresponded to ratio which results on required HLB value of oil phase.

Composition (w/w) which allowed required HLB value determination was used as starting

point (90 % of distilled water, 5% of oil and 5% of surfactants blend) and mean droplet size of

each prepared composition was performed in order to determine nanoemulsion region.

Macroscopical Analysis

Stability of all emulsions was evaluated immediately and after 1, 15 and 30 days of

manipulation by macroscopic analysis, such as color, visual aspect, phase separation,

creaming and sedimentation. During this period all emulsions were maintained under room

temperature (25±2 ºC) in screw-capped glass test tubes [32]. Acelerated stability evaluation

was performed keeping emulsion under controlled temperature (40 ± 5 ºC)

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Droplet size and zeta potential analysis

The droplet size, polydispersity and zeta potential were determined by photon

correlation spectroscopy using a ZetaPlus (Brookhaven Inst. Corp., USA). Each emulsion was

diluted using ultra-pure Milli-Q water (1:25). Measurements were performed in quintuplicate

and average droplet size was expressed as the mean diameter.

Insect Bioassay

Dysdercus peruvianus were obtained from the colony maintained in the Laboratory of

Insect Biology of the Universidade Federal Fluminense (GBG-UFF), being kept at 24-25 0C,

relative humidity of 70-75% and a 16:8 h light:dark cycle [9].

Fourth-instar insects were randomly chosen and separated in two treated groups, being

one group topically applied with a nanoemulsion containing hexane-soluble fraction from

fruits of M. subsericea (HFNE) (5% of MOD®, 5 % of surfactants (HLB of 10.75), 5% of HF

and 85% of water), corresponding to 50 μg of extract per insect, while negative control group

was treated with blank nanoemulsion (5% of MOD®, 5% of surfactants and 90 % of water).

Untreated insects received no treatment, being only fed. Biological evaluation was performed

in order to determine mortality levels during the entire time required for development from

the fourth instar to the adult stage [9,33,34]. All experiments were repeated at least three

times with samples from 30 insects (n = 30 in each triplicate). Significance of the results was

analysed using ANOVA and Tukey’s test21 according to Stats Direct Statistical Software,

v.2.2.7 for Windows 98. Differences between treated group and control.

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Anticholinesterase assay

Anticholinesterase activity was performed according to method described by Ellman et

al. (1961) [35] with some modifications [36], using a 96-well microplate. A total volume of

200 μL of test media was composed by 65 μL of Phosphate buffered saline (PBS), 60 μL of

5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 1,5 mM, 25 μL of electric eel

acetylcholinesterase (Sigma) (AchE) 550 mU/mL, 25 μL of nanoemulsion and 25 μL of

acetylthiocholine iodide (ASCh). Different concentrations of HF and eserine (positive control)

were obtained by dilution of each nanoemulsion with PBS. Negative control was performed

using a blank nanoemulsion, without inhibitor or extract. The spontaneous hydrolysis of

substrate was calculated replacing the enzyme solution by PBS. Absorbance was measured at

412 nm. The statistical analysis of the anticholinesterase assay was performed on GraphPad

Prism 5.04 program using Pearson´s correlation coefficient with 95% confidence interval.

Acute toxicity

Animals

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal do

Amapá (CEP – UNIFAP – 005AP/2013). All procedures were performed according to the

International Committee for animal care in accordance with established national regulations

for animal experimentation. The experiments were performed using adult female and male

Swiss albino mice (Mus musculus), 12 weeks age, provided by the Central Laboratory of the

State of Amapá – Macapá (LACEN/AP). Each experimental group was composed of 5

animals. They were kept in polyethylene cages on a temperature-controlled rack (25°C ± 2°C)

under a 12-hour light-dark cycle. They had free access to food and water, except for the 24

hours before the experiments, when they had access only to water.

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Experimental protocol

Acute toxicity studies were performed using both sexes of mice according to Pina et

al. (2012) [30], with some modifications. Treated groups received a single dose of HFNE (5%

of MOD®, 5 % of surfactants (HLB of 10.75), 5% of hexane-soluble fraction from fruits of M.

subsericea and 85% of water) by oral route, corresponding to 3g/kg of extract. Negative

control groups received a blank nanoemulsion (5% of MOD®, 5% of surfactants and 90 % of

water).

Observations were performed at 30, 60, 120, 240, 360 and 720 min after the oral

treatment and daily for fourteen days. Behavioral changes (agitation, convulsions, vocal

fremitus, irritation, stereotyped movements, touch response, salivation, tremors, writhing,

body distension, ptose, sleepiness, defecation, diarrhea, piloerection), weight, food and water

intake, clinical signs of toxicity and mortality were recorded daily. At the end of fourteen

days, they were sacrificed by cervical dislocation and taken to autopsy for macroscopic

observation of the organs (heart, lung, liver, kidney and spleen). Statistical analysis was

performed by Student t test with 95% confidence intererval, using GraphPad Prism 5.04.

Differences between organs, body weight and food and water intake were considered

significant when p<0.05.

Competing interests

All authors declare no conflict of interests.

Authors’ contributions

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- 124 -

CPF contributed in collecting plant sample, running the laboratory work, analysis of the data

and drafted the paper. FBA and ANS contributed in preparation of extracts, HLB

determination and nanoemulsions preparation. MSG, CBM and DF contributed in insect

bioassay. MGS contributed in plant identification and herbarium confection. LACT

contributed in AChE bioassay. JCTC contributed to critical reading of the manuscript and

acute toxicity assay. LR and DQF designed the study, supervised the laboratory work and

contributed to critical reading of the manuscript. All the authors have read the final

manuscript and approved the submission.

Authors’ information

Caio Pinho Fernandes is a professor at Universidade Federal do Amapá and has been

working with natural products, including phytochemistry, nanotechnology and biological

activities of these compounds.

Fernanda Borges de Almeida is an undergraduate student at Universidade Federal do

Amapá and participated in this project as part of her scientific initiaion program.

Amanda Nunes Silveira is an undergraduate student at Universidade Federal Fluminense and

participated in this Project as part of her scientific initiaion program.

Marcelo Salabert Gonzalez is professor at Universidade Federal Fluminense and has been

working with complementary strategies to control insects with secondary metabolites from

plant species.

Cicero Brasileiro Mello is professor at Universidade Federal Fluminense and has been

working with complementary strategies to control insects with secondary metabolites from

plant species.

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- 125 -

Denise Feder is professor at Universidade Federal Fluminense and has been working with

complementary strategies to control insects with secondary metabolites from plant species.

Raul Apolinário is undergraduate student at Universidade Federal Fluminense and

participated in this project as part of her scientific initiation program and did al experiments

with insects.

Marcelo Guerra Santos is professor at Universidade Estadual do Rio de Janeiro. He is a

botanist and has been working with species from sandbanks of Parque Nacional da Restinga

de Jurubatiba (RJ) Brazil.

José Carlos Tavares Carvalho is professor and President of the Universidade Federal do

Amapá (Brazil) and has been working with natural products pharmacology.

Luis Armando Cândido Tietbohl is a Master´s student at Universidade Federal Fluminense

and has been working with acetylcholinesterase inhibition.

Leandro Rocha is professor at Universidade Federal Fluminense and has been working with

natural products and its biological activities.

Deborah Quintanilha Falcão is professor at Universidade Federal Fluminense and has been

working with nanotechnology of natural products.

Acknowledgement

Authors would like to thank CNPQ (nº 306676/2010-9) and FAPERJ for the finantial support

and “Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas” for the use of Zeta Potential Analyzer.

Author Details

1Programa de Pós – Graduação em Biotecnologia Vegetal – Centro de Ciências da Saúde-

Bloco K , 2º andar – sala 032 – Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ – Av.

Brigadeiro Trompowski s/n – CEP: 21941-590 - Ilha do Fundão – RJ – Brazil

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2Laboratório de Farmacotécnica - Colegiado de Ciências Farmacêuticas – Universidade

Federal do Amapá –– Rodovia Juscelino Kubitschek – KM – 02-Jardim Marco Zero –

CEP: 68903-419 – Macapá – AP – Brazil

3Laboratório de Tecnologia Farmacêutica I - Faculdade de Farmácia – Universidade

Federal Fluminense - Rua: Mario Viana, 523 – CEP: 24241-000 – Santa Rosa – Niterói –

RJ – Brazil

4Laboratório de Biologia de Insetos – LABI, Departamento de Biologia Geral (GBG),

Universidade Federal Fluminense, Morro do Valonguinho S/No, CEP 24001-970, Niterói,

RJ, Brazil

5Faculdade de Formação de Professores – UERJ- Rua: Dr. Francisco Portela, 1470 –

Patronato – CEP: 24435-005 – São Gonçalo – Rio de Janeiro - Brazil

6Laboratório de Pesquisa em Fármacos – Colegiado de Ciências Farmacêuticas –

Universidade Federal do Amapá – Rodovia Juscelino Kubitschek – KM – 02 – Jardim

Marco Zero – CEP: 68903-419 – Macapá – AP – Brazil

7Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais – LTPN – Departamento e Tecnologia

Farmacêutica – Faculdade de Farmácia – Universidade Federal Fluminense – UFF Rua:

Mario Viana, 523 – CEP: 24241-000 – Santa Rosa – Niterói – RJ – Brazil

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CONCLUSÕES

O presente trabalho permitiu concluir que:

As rotas biosintéticas na espécie Manilkara subsericea favorecem a formação de

triterpenos pentacíclicos do tipo olean-12-eno e ursan-12-eno, permitindo sugerir estas classe

como marcadores químicos;

A presença de esqualeno, um precursor acíclico de triterpenos no óleo essencial obtido

reforça a importância da rota de formação de triterpenos nessa espécie;

Os flavonóides obtidos pertencem a classe dos flavonóis, o que está de acordo com

dados da literatura sobre o gênero;

O valor requerido do equilíbrio hidrófilo-lipófilo do miristato de octildodecila é 10,75.

Este dado é importante para obtenção de nanoemulsões contendo este óleo, permitindo a

redução de etapas no desenvolvimento de futuros produtos com essa matéria prima;

A nanoemulsão contendo fração apolar de frutos de Manilkara subsericea é capaz de

induzir mortalidade em Dysdercus peruvianus;

A nanoemulsão contendo fração apolar de frutos de Manilkara subsericea não é capaz

de inibir a acetilcolinesterase de peixe elétrico, sendo que a atividade sobre essa enzima é

umas das principais causas de efeitos tóxicos sobre organismos aquáticos. Portanto, é possível

que esse produto seja seguro para peixes;

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A nanoemulsão contendo fração apolar de frutos de Manilkara subsericea não exerceu

efeito letal sobre camundongos, sugerindo uma possível segurança para mamíferos;

Nanoemulsões contendo produtos de origem natural são uma alternativa viável e

promissora no desenvolvimento de produtos inseticidas.

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PERSPECTIVAS FUTURAS

O presente trabalho abre uma série de perspectivas, que irão contribuir para bases científicas

sólidas, dentre elas, podemos citar:

Agregar valor econômico a plantas das restingas, que são espécies fascinantes capazes

de produzir substâncias que podem servir de protótipo ou matéria-prima para diversos

produtos, como inseticidas;

Criação de cultivares de Manilkara subsericea para aumentar a biomassa e atender as

possíveis demandas futuras;

Modificações genéticas em Manilkara subsericea para favorecer as rotas biosintéticas

produtoras de determinadas substâncias (p.ex. triterpenos), aumentando o rendimento em

termos de substâncias ativas;

Preparação de novas nanoemulsões contendo substâncias inseticidas a partir da

formulação desenvolvida nesse trabalho.