desenvolvimento de oleos alimentares funcionais da ciencia a aplicacao
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DESENVOLVIMENTO DE ÓLEOS ALIMENTARES FUNCIONAIS
da Ciência à Aplicação
Ana A
lexandra Figueiredo Matias
Ana Alexandra Figueiredo Matias
2008
ISBN: 978-989-20-1283-4
Oeiras _ Julho 2008
Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Engenharia Química pelo Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de Lisboa. Com suporte financeiro da Fundação para a Ciência e Tecnologia e Sovena Consumer Goods SA, através da Bolsa Doutoramento Empresa nº SFRH/BDE/15535/2005.
DESENVOLVIMENTO DE ÓLEOS ALIMENTARES FUNCIONAIS, da Ciência à Aplicação
Ana Alexandra Figueiredo Matias
Oeiras, 2008
Dissertação apresentada para obtenção do grau de doutor
em Engenharia Química pelo Instituto de Tecnologia Química e
Biológica da Universidade Nova de Lisboa
Com suporte financeiro da Fundação para a Ciência e Tecnologia e Sovena – Comércio e
Indústria de Óleos Alimentares S.A. através da Bolsa Doutoramento Empresa nº
SFRH/BDE/15535/2005
Em memória dos meus avós maternos, Laura e Domingos, por
tudo o que foram.
Para o Lucas, a minha experiência mais bem acabada.
i
É difícil em página e meia conseguir expressar os meus sinceros
agradecimentos a todas as pessoas que durante estes últimos anos me
ajudaram a tornar esta tese uma realidade.
Após três anos de dificuldades ultrapassadas, dúvidas existenciais,
discussões cientificas e “dramas” laboratoriais do dia a dia, mais um circulo
se fecha e se completa, com a sensação de que muito fica por dizer e fazer.
Em primeiro lugar um agradecimento muito especial às pessoas com quem
iniciei a minha viagem pela ciência, ao Professor Nunes da Ponte e muito em
particular à Doutora Catarina Duarte, que mais que orientadora desta tese, foi
e será uma amiga com uma solução para todas as situações.
Agradecimentos
Agradecimentos
ii
Teria sido impossível apresentar todo o trabalho aqui descrito, sem a ajuda
fundamental de todos os meus colegas de laboratório, que estiveram sempre
disponíveis em todas as situações, não chegando um simples obrigado: à
Raquel Sousa pela enorme paciência para me ouvir e boa disposição, à
Teresa Serra por toda a ciência partilhada e principalmente pela ajuda
imprescindível nos inúmeros ensaios de bioactividade, à Raquel Frade pelas
discussões científicas, à Mariana Costa pela contagiante energia positiva, ao
Pedro Poejo a preciosa ajuda nos ensaios finais de actividade antioxidante, à
Rita Duarte a força para continuar.
Um muito obrigado a todos os colegas do ITQB com quem tive o prazer de
trabalhar, em especial à Isabel Marcelino, uma óptima professora e para além
disso uma óptima amiga, à Doutora Paula Alves por ter acreditado que eu
alguma vez conseguiria trabalhar com células animais, à Marlene Carmo pela
paciência e ajuda com o FACS. Em particular, à Doutora Rosário Bronze e
Rodrigo Feliciano pelo suporte em toda a parte analítica e ajuda em horas de
stress.
Na Faculdade de Ciências e Tecnologia, não posso deixar de agradecer ao
Doutor Rui Duarte, pela companhia e ajuda nos vários dias de ensaios de
EPR, e à Doutora Teresa Casimiro pelo incentivo e amizade ao longo destes
anos.
A toda a equipa da Sovena, Consumer Goods, SA um obrigado, pelo apoio e
disponibilidade que sempre demonstraram, nomeadamente à Eng. Ana
Saraiva. Na realização dos estudo do Capíulo 3.3, foi imprescindível a
colaboração e ajuda das Engenheiras, Tânia Diogo e Ana Salvador,
aproveitando a oportunidade para expressar a ambas, o meu sincero
agradecimento.
Em particular, um agradecimento especial ao meu orientador, Eng. Maia
Miranda, excelente comunicador e professor, por ter acreditado neste
projecto.
Agradecimentos
iii
Sem nunca me poder esquecer, um MUITO obrigada à Ana Nunes, por todo
o caminho percorrido em conjunto e acima de tudo pela amizade nunca
questionável.
Um simples obrigada nunca vai chegar pelas longas sessões de paciência,
carinho, incentivo e principalmente pela ajuda imensurável: mãe, pai e
mano…um longo e enorme beijo de gratidão.
Nuno, por preencheres a minha vida, e por seres em parte responsável pela
minha experiência mais bem acabada, muito, muito OBRIGADO!
v
PARTE I: DESENVOLVIMENTO DE ÓLEOS ALIMENTARES SAUDÁVEIS ATRAVÉS DE INCORPORAÇÃO DE BIOPRO-DUTOS A crescente preocupação da população por uma alimentação saudável
provocou, no final do século XX, uma mudança drástica na indústria de óleos
alimentares. Os óleos vegetais, considerados no passado como elementos
menos nutritivos da alimentação, e, em parte, sinónimo de obesidade,
passaram na actualidade a ser revistos como componentes saudáveis de
uma dieta equilibrada, iniciando-se uma procura, por parte da indústria
alimentar, por óleos de maior qualidade nutritiva e mais saudáveis, isto é,
óleos que respeitem todas as caracteristicas organolépticas e em simultâneo
promovam um benefício específico na saúde do consumidor – óleos
funcionais.
As oleoginosas, por si só, apresentam na sua composição compostos, tais
como tocoferóis, fitosteróis e ácidos gordos essenciais, para os quais já foi
provada a sua bioactividade. Muitos destes micronutrientes são totalmente ou
parcialmente removidos no processo de refinação dos óleos alimentares,
diminuindo drasticamente a sua qualidade nutritiva, tornando possível para a
Sumário
Sumário
vi
a indústria, a funcionalização dos óleos através do aumento dos níveis
desses compostos bioactivos. O aumento dos níveis de micronutrientes pode
ser efectuado através de variação dos parâmetros do processo de refinação,
recorrendo à fortificação directa dos óleos com quantidades adicionais de
ingredientes activos (Bioprodutos) ou mesmo através da combinação de
diversas razões de óleos alimentares com diferentes composições em lipídos
e micronutrientes.
O objectivo da primeira parte desta tese foi avaliar a viabilidade de formular
óleos alimentares saudáveis com determinada funcionalidade associada. O
estudo e desenvolvimento envolveram a funcionalização de óleos alimentares
recorrendo à fortificação directa com vários bioprodutos de origem vegetal,
misturas de óleos com composições distintas e a combinação dos dois
métodos em simultâneo. No método de fortificação directa seleccionou-se o
óleo de girassol como modelo de estudo, dado ser o óleo mais consumido na
Europa Ocidental. Na combinação de diferentes óleos alimentares foram
avaliadas misturas de óleos girassol, milho e girassol rico em ácido oleico
(girassol alto oleico). Os bioprodutos seleccionados para este estudo foram
extractos naturais ricos em polifenóis, misturas naturais de tocoferóis e
fitosteróis e ácido ascórbico.
Avaliou-se em particular, na fortificação directa, a viabilidade de formulação
de um óleo funcional através da incorporação de extractos naturais obtidos a
partir de resíduos de azeitona. A incorporação de extractos bioactivos de
azeitona foi avaliada através de três métodos distintos: i) emulsionantes
água/óleo recorrendo a agitação, ii) solubilização directa dos extractos e iii)
encapsulação dos extractos em partículas lipídicas formuladas na presença
de dióxido de carbono supercrítico (125 bar e 50 ºC). Os extractos
seleccionados para os estudos de formulação foram obtidos por um processo
integrado de tecnologias limpas, desenvolvido no âmbito de um projecto
anterior e adquiridos no mercado.
Os extractos naturais utilizados foram caracterizados em termos de
compostos bioactivos e as suas propriedades antioxidantes avaliadas por
métodos in vitro.
Sumário
vii
Os extractos foram produzidos a partir de resíduos/sub-produtos resultantes
do processo de produção de azeite. A composição química dos resíduos/sub-
produtos (matérias-primas) é dependente de inúmeros factores, tais como,
grau de maturação da azeitona, tipo de cultivo da azeitona, composição do
solo onde se encontra a oliveira e clima a que a oliveira esteve sujeita. A
variabilidade da composição da matéria-prima é um factor determinante da
qualidade (composição química e bioactividade) final dos extractos naturais,
sendo, por isso, a standardização dos mesmos, um processo necessário,
mas complexo. É por isso importante tentar garantir que a composição
química dos resíduos/sub-produtos (matérias-primas) seja pouco variável.
Nesse sentido, realizaram-se dois estudos preliminares de tratamentos
prévios aplicados às matérias-primas, com dióxido de carbono (CO2)
pressurizado e água quente, avaliando-se a influência de parâmetros como o
tempo de exposição ao CO2 ou à água quente e temperatura do ensaio.
Os extractos bioactivos seleccionados foram estudados em termos de
bioactividade in vitro, avaliando-se a citotoxicidade a eles associada e as
potenciais propriedades anti-proliferativas em células de adenocarcinoma do
cólon (Caco-2 e HT29) e de adenocarcinoma gástrico (MKN45). Foi
posteriormente avaliada a actividade dos extractos sobre diferentes fases do
ciclo celular, por citometria de fluxo.
A potencial utilização dos extractos naturais como conservantes naturais, na
indústria alimentar contra doenças do foro gastro-intestinal, foi avaliada
determinando a actividade anti-microbiana dos mesmos contra cinco estirpes
diferentes de microrganismos, Escherichia coli, Salmonella poona, Bacillus
cereus, Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans.
Os óleos alimentares, funcionalizados através da incorporação de
bioprodutos (concentrados bioactivos) adquiridos no mercado contendo
fitosteróis, tocoferóis e ácido ascórbico, foram avaliados em termos de
estabilidade oxidativa recorrendo a testes de estabilidade acelerados e a
testes de estabilidade em tempo real. O tempo de indução da oxidação,
utilizando o teste de Rancimat, o índice de peróxidos, o conteúdo em ácidos
gordos livres (acidez), o teor em compostos polares totais e o índice de p-
anisidina foram determinados para cada caso.
Sumário
viii
PARTE 2 - VARIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO QUÍMI-CAS DE ÓLEOS EM CONDIÇÕES ASSOCIADAS AO PRO-CESSO DE FRITURA DOMÉSTICA. QUANTIDADE DE GORDURA ABSORVIDA PELO ALIMENTO. A fritura por imersão (deep fat frying) é um processo ancestral que tem
crescido exponencialmente nos últimos 50 anos. Este processo de cozinhar
consiste na imersão dos alimentos em óleos vegetais que são aquecidos a
temperaturas acima do ponto de ebulição da água. Os óleos vegetais são
constituídos, na sua maioria, por triacilgliceróis, que durante o processo de
fritura sofrem irreversíveis transformações, originando a sua degradação.
Este processo deve-se, não só à utilização de temperaturas superiores a
100 ºC, como ao contacto com oxigénio que desencadeia inúmeras reacções
de oxidação. Apesar do acto de fritar ser bastante antigo, os parâmetros que
afectam todo o processo, bem como todos os mecanismos que ocorrem
durante a fritura, estão ainda longe de estar devidamente identificados pela
comunidade científica. O objectivo da segunda parte desta tese foi contribuir
para o estado do conhecimento actual, correlacionando parâmetros físico-
químicos com a absorção de gordura no alimento, em ambiente de fritura
doméstica e, dessa forma, estudar a formulação de um óleo mais eficaz, mais
resistente à oxidação e por isso, mais saudável. Numa primeira abordagem,
durante 4,5 h de aquecimento a 180 ºC, determinaram-se as variações de
viscosidade, índice de peróxidos, índice p-anisidina, ácidos gordos livres
(acidez), teor em compostos polares totais e composição lipídica de
diferentes óleos. Numa fase seguinte, realizaram-se ensaios de fritura com
batata, mantendo os mesmos parâmetros de operação, 4,5 h a 180 ºC.
Durante as quatro horas e meia de ensaio foram efectuados cinco lotes
sucessivos de 100 g de batatas fritas, em intervalos de 1 h. O teor de óleo
incorporado nas batatas foi posteriormente determinado por extracção em
soxhlet. Os óleos seleccionados para o estudo, tendo como finalidade a
avaliação da influência da composição lipídica nos parâmetros determinados,
foram óleo de colza, óleo de soja, óleo de girassol e girassol alto oleico. A
influência de adição de antioxidantes ao óleo foi também avaliada,
Sumário
ix
escolhendo, como modelo de estudo, o óleo de girassol. Como antioxidantes,
foram seleccionados partículas lipídicas ricas em ácido ascórbico
(desenvolvidas no âmbito da primeira parte da tese), extracto natural de
azeitona (comercial), extracto de rosmaninho (comercial) e galato de propilo.
A viabilidade de produção dos óleos formulados e as suas potencialidades de
utilização em fritura doméstica foram discutidas.
xi
AAPH AR BH BS CAET
2’ ,2’- azobis (2-amidinopropano) dihidroclorato
Águas Ruças
Bagaço Húmido
Bagaço Seco
Capacidade Antioxidante Equivalente de Trolox
DCF-DA Diclorofluoresceína - diacetato
DP DMPS
Desvio Padrão
Dimetilpolisiloxano
EAG Equivalentes de ácido gálico
EBH Extracto Bioactivo obtido a partir do bagaço húmido
EBS EC50
Extracto Bioactivo obtido a partir do bagaço seco Concentração de extracto necessária para atingir 50% de redução na viabilidade celular
EPR (REP) Ressonância Electro Paramagnética
FACS Fluorescence-activated cell sorting
Abreviaturas
Abreviaturas
xii
FBS Fetal Bovine Serum (Soro de bovino fetal)
FFA Free Fatty Acids (ácidos gordos livres)
GRAS GMS
Generally Regarded as Safe
Glicerilmonoestereato
HORAC Hydroxyl Radical Averting Capacity
HPLC-DAD
High-performance liquid chromatography with diode array
detector
HT Hidroxitirosol
IpA Índice de p-Anisidina
IP kp
Índice de Peróxidos
Coeficiente partição água/azeite
LDL MP
Lipoproteína de Baixa Densidade
Matérias Primas
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
MUFA(S)
OL
Ácidos Gordos monoinsaturados (Monounsaturated Fatty
Acids)
Oleuropeína
ORAC P
Oxygen Radical Absorbance Capacity
Pressão
PL PGPR
Partículas Lipídicas
Poliglicerilpoliricenoloato
PUFA(S) Pv
Ácidos Gordos Polinsaturados (Polyunsaturated Fatty
Acids)
Pressão de Vapor
RFC Reagente Folin - Ciocalteu
ROS Espécies Reactivas de Oxigénio
RSEV Extracto bioactivo obtido após 1ª etapa do processo
integrado a partir de Bagaço Seco 1O2 Singleto oxigénio
Abreviaturas
xiii
OH• Radical hidróxilo
•O2- LDL
Radical superóxido
Lipoproteína de Baixa Densidade
LO• Radical alcóxilo
LOO• Radical peróxilo
SFA Ácidos Gordos Saturados (Saturated Fatty Acids)
SOD Superóxido dismutase
TPM
μ
Compostos Polares Totais
Viscosidade
xv
O trabalho apresentado nesta tese, realizado em ambiente empresarial
(Sovena, Consumer Goods SA) e académico (Instituto de Tecnologia
Química e Biológica), corresponde a um período de três anos durante o qual
ocorreu, em simultâneo, um contrato de I&DT estabelecido entre a referida
empresa e o Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica.
A tese encontra-se dividida em duas partes distintas:
Parte I, que aborda a funcionalização de óleos alimentares recorrendo à
incorporação de ingredientes naturais bioactivos (bioprodutos) tendo como
perspectiva uma melhor qualidade nutritiva e organoléptica do óleo como
produto final.
Nesta parte, é avaliada a viabilidade de adição de três ingredientes naturais
provenientes de resíduos de azeitona, a óleo de girassol. São apresentados
resultados referentes à caracterização dos ingredientes ricos em polifenóis
característicos da azeitona, que, devido às características a eles associados,
podem não só conferir uma maior estabilidade oxidativa aos óleos
Estrutura e Enquadramento da Tese
Estrutura
xvi
alimentares, como atribuir-lhes características específicas de funcionalidade
associadas a potenciais benefícios na saúde e bem-estar.
A influência da adição dos bioprodutos (extractos bioactivos de azeitona e
concentrados de antioxidantes comerciais) na estabilidade oxidativa dos
óleos alimentares em condições normais de armazenamento e em ambiente
de fritura doméstica, é estudada.
Parte II, avalia-se o comportamento e estabilidade à oxidação térmica de
diferentes óleos alimentares em condições de fritura doméstica. O
conhecimento de alterações de determinados parâmetros que caracterizam a
degradação lipídica é fundamental para desenvolver um óleo mais saudável e
específico para fritura.
Na figura seguinte apresenta-se, de forma esquemática, a estrutura da tese.
Capítulo 1
Introdução
Capítulo 2
Óleo Funcionalizado com Extracto
Bioactivo de Azeitonas
Capítulo 3
Óleos Funcionais (Incorporação de
Ingredientes Activos)
Capítulo 4
Conclusões
•Formulação de Óleo Funcional•Extractos Bioactivos de Azeitona•Avaliação das MP•Caracterização e capacidade antioxidante•Bioactividade
•Avaliação do impacto dasformulações na estabilidadeoxidativa – case studies-
•Óleo rico em n-3 PUFA•Óleo aditivado com DMPS
Desenvolvi-mento de
Óleos Funcionais
I
Estrutura
xvii
Capítulo 1
Introdução
Capítulo 2
Variação das propriedades FQ em condições de Fritura
por imersão
Capítulo 3
Absorção de Gordura em batatas fritas
durante fritura por imersão
Capítulo 4
Conclusões•Correlação com estabilidade oxidativa
•Correlação com a variação das propriedades FQ
Estudo do processo
Fritura por Imersão
IIPr
oprie
dade
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eos a
limen
tare
sCo
ndiçõ
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Dom
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a
Índice
Parte I – Desenvolvimento de óleos alimentares saudáveisatravés de incorporação de Bioprodutos
Índice 19
Capitulo 1 – Introdução 23
Capitulo 2 – Óleo Funcionalizado com extracto Bioactivo de azeitona 37
Capitulo 3 – Óleos Funcionais – Propostas de soluções 131
Capitulo 4 – Conclusões Finais 163
Parte II – Estudo da variação das propriedades Fisico Químicas deóleos com temperaturas associadas ao processo de fritura.Correlação com a quantidade de gordura absorvida pelo alimento.
Índice 167
Capitulo 1 – Introdução 169
Capitulo 2 - Variação das propriedades Fisico Químicas de Óleos com temperaturas associadas ao processo de Fritura 177
Capitulo 3 - Correlação das propriedades Fisico Químicas de um Óleo com a quantidade de gordura absorvida pelo alimento, durante o processo de fritura 193 Capitulo 4 - Conclusões Finais 205
Anexos
Índice 209
Anexo A 211 Anexo B 219 Anexo C 227 Anexo D 231 Anexo E 239 Anexo F 243 Anexo G 245 Anexo H 249 Anexo I 257 Anexo J 263 Anexo K 265 Anexo L 271
Curriculum vitae 275
DESENVOLVIMENTO DE ÓLEOS ALIMENTARES SAUDÁVEIS
ATRAVÉS DE INCORPORAÇÃO DE BIOPRODUTOS
Capitulo 1 – Introdução
Capitulo 2 – Óleo Funcionalizado com extracto Bioactivo de azeitona
Capitulo 3 – Óleos Funcionais – Propostas de soluções
Capitulo 4 – Conclusões Finais
23
37
131
163
- 23 -
The market for naturally-derived ingredients grew strongly in recent years, due to consumer awareness of the importance of nutrition and healthy eating. Euromonitor report, 2005 1.1 A indústria dos Óleos Alimentares
Com um consumo médio diário de 10 g de óleo per capita, os óleos
alimentares são uma fonte válida de energia, vitaminas e ácidos gordos
essenciais para uma dieta saudável e equilibrada, tendo sido estabelecido,
pela Organização Mundial de Saúde, que 30 % do consumo de calorias
deveria ter origem em gorduras vegetais.(1)
Nas últimas duas décadas, o aumento de casos de obesidade na Europa
Ocidental induziu os consumidores a reduzir a ingestão da maior parte da
gordura “visível” que fazia parte das suas dietas diárias, os óleos alimentares.
Esta preocupação provocou um decréscimo, em 2002, de cerca de 5 % no
consumo de óleo alimentar per capita na Europa Ocidental. (2)
Este movimento tornou-se responsável pela necessidade crescente da
indústria alimentar defender uma posição no mercado, apostando em
sectores emergentes como a área de bem-estar e saúde, formulando
1 - Introdução
Capitulo 1
- 24 -
gorduras vegetais mais ricas do ponto de vista nutritivo, com benefícios de
bem-estar associados. (1,2)
Surge, neste contexto, o interesse crescente da indústria em comercializar
Óleos Funcionais, óleos vegetais alimentares desenvolvidos com o objectivo
específico de actuar no bem-estar dos consumidores, criando-se uma nova
área de negócio, a dos Oleocêuticos. Os novos óleos têm, como alvo,
consumidores mais conscienciosos e preocupados com a sua qualidade de
vida que optam por passar de uma nutrição por necessidade, para uma
nutrição mais eficiente, onde associam à saúde o carácter nutritivo,
organoléptico e social do alimento.
Por curiosidade, só entre 1998 e 2002, o volume global de vendas, no sector
das gorduras vegetais funcionais, cresceu mais de 100%, atingindo um
aumento no valor total de vendas de, aproximadamente, 300%, sendo ainda
um sector que permanece praticamente limitado ao Mercado Europeu,
correspondendo a cerca de 60 % do total de vendas mundiais. (2,3)
Capítulo 1
- 25 -
1.2 Óleos Vegetais Alimentares
Os óleos vegetais são constituídos por cerca de 95 % de triacilgliceróis,
resultantes da esterificação de três ácidos gordos a uma molécula de
glicerol.(4) Por sua vez, os ácidos gordos são constituídos por uma cadeia
hidrocarbonada, que pode ser saturada, monoinsaturada (Monounsaturated
Fatty Acids – MUFA - com uma ligação dupla) ou polinsaturada
(Polyunsaturated Fatty Acids – PUFA - com duas ou mais ligações duplas).
Os óleos vegetais são uma das principais fontes de ácidos gordos
polinsaturados (PUFAs) na dieta diária. Estes importantes ácidos gordos são
compostos de elevado valor nutritivo sendo frequentemente associados a
importantes actividades fisiológicas. (4-6) No entanto, são também estes
ácidos gordos essenciais os principais responsáveis pela instabilidade dos
óleos vegetais quando na presença de compostos indutores da degradação,
como o oxigénio. (7-10) A exposição destas gorduras vegetais ao ar, calor, luz,
metais e humidade, favorece reactividade dos seus compostos lipídicos, (7,11,12) iniciando uma das maiores causas de degradação dos óleos
alimentares, a Oxidação Lipídica. (10,13)
A deterioração lipídica, causada pelo processo de oxidação, é uma das
maiores preocupações económicas da indústria, dado que afecta as
qualidades sensoriais e nutritivas dos óleos alimentares, (9,13,14) sendo
relevante a formação, durante este processo de degradação, de compostos
potencialmente tóxicos para consumo humano. (12)
O processo da oxidação lipídica compreende uma sequência complexa de
interacções químicas entre os grupos acilo dos ácidos gordos insaturados
com espécies reactivas de oxigénio (ROS) (Figura 1.1), (9,12,13)dependendo os
seus mecanismos da natureza de ROS presentes e da composição física e
química do meio onde se encontram. (10,15,16)
Durante o processo de decomposição dos ácidos gordos no mecanismo de
oxidação lipídica formam-se pequenas moléculas voláteis responsáveis por
maus aromas (off-aromas) associados ao conhecido ranço. Estes produtos
da oxidação são obtidos a partir de hidroperóxidos lipídicos (produtos de
Capitulo 1
- 26 -
oxidação primários), cuja decomposição resulta da quebra das cadeias dos
ácidos gordos, produzindo os compostos voláteis de baixo peso molecular
(produtos de oxidação secundários). (9,12,13,16)
Figura 1.1 Representação esquemática do processo de oxidação lipídica. Modificado de Decker
et al, 2002). (16)
Existem também diversos sistemas pro-oxidantes nas gorduras vegetais, isto
é, factores responsáveis pela iniciação, indução ou aceleração da oxidação
lipídica, (12,17) tais como exposição a temperaturas elevadas, exposição à luz,
ou a existência na composição do óleo alimentar de metais de transição. (9,13)
Muitos dos produtos de oxidação secundários, produzidos a partir da
decomposição dos hidroperóxidos, são bastante reactivos, sendo capazes de
desencadear processos de oxidação in vivo, contribuindo para os
mecanismos de carcinogenesis e aterosclerose. (14)
Tendo em conta estes factos, assegurar a produção de óleos alimentares
com uma elevada estabilidade oxidativa é de extrema importância para a
Ácidos Gordos Insaturados/Triglicéridos
AutooxidaçãoFotooxidação
Radicais Livres
(L• + O2 LOO•)
(LOO• + LH LOOH + L•)
O2 IniciaIniciaççãoão
Hidroperóxidos(LOOH)
1O2
PropagaPropagaççãoão
TerminaTerminaççãoão(LO• + OH•)
Reacções cisão β
Produtos de oxidação Quebra da Cadeia HC
Cetonas, aldeídos, álcoois voláteis
Ácidos Gordos Livres
Produtos da Polimerização
Dimeros e polimerosNão ligados por oxigénio
Ácidos gordos ciclicos
Produtos secundários
Ácidos hidroxiloÁcidos cetónicos
Ácidos Gordos Insaturados/Triglicéridos
AutooxidaçãoFotooxidação
Radicais Livres
(L• + O2 LOO•)
(LOO• + LH LOOH + L•)
O2 IniciaIniciaççãoão
Hidroperóxidos(LOOH)
1O2
PropagaPropagaççãoão
TerminaTerminaççãoão(LO• + OH•)
Reacções cisão β
Produtos de oxidação Quebra da Cadeia HC
Cetonas, aldeídos, álcoois voláteis
Ácidos Gordos Livres
Produtos da Polimerização
Dimeros e polimerosNão ligados por oxigénio
Ácidos gordos ciclicos
Produtos secundários
Ácidos hidroxiloÁcidos cetónicos
Capítulo 1
- 27 -
saúde e bem-estar dos consumidores, representando um factor relevante do
ponto de vista competitivo/económico.
Desta forma, a avaliação do estado da oxidação dos óleos alimentares é
importante a nível industrial, existindo descritos dezenas de métodos
distintos. (18-20) Porém, cada método fornece informação sobre um estado
particular do processo oxidativo e varia em função das condições aplicadas e
dos substratos lipídicos estudados. (9)
Podem ser considerados dois tipos de testes para determinação da
estabilidade oxidativa: testes de estabilidade em tempo real, através dos
quais se determina as condições de um óleo no seu estado normal de
armazenamento, e testes de estabilidade acelerados, onde a promoção do
envelhecimento possibilita a avaliação da resistência de um óleo à
oxidação.(9,12)
Através de testes de estabilidade em tempo real é possível quantificar os
produtos primários e secundários do processo de oxidação lipídica, obtendo-
se, assim, uma avaliação do estado global da oxidação. Os produtos
primários (hidroperóxidos e peróxidos) representam o estado de degradação
organoléptica, sendo determinados através do ensaio de índice de peróxidos.
A formação de aldeídos (produtos secundários) relaciona-se com o estado de
deterioração efectivo do óleo vegetal e a sua quantificação pode ser
efectuada através do teste de índice de p-anisidina. (12,13,21,22) Estes dois
parâmetros correlacionam-se através do valor total de oxidação – Totox. (9,23)
De entre os vários métodos de estabilidade acelerada existentes para avaliar
a estabilidade oxidativa de um óleo, o mais utilizado é o teste de Rancimat,
devido, sobretudo, ao fácil manuseamento do seu equipamento e à sua
elevada reprodutibilidade. (24,25)
O teste de Rancimat é baseado na determinação do tempo necessário
(Tempo de indução) para o óleo alimentar entrar na fase exponencial do
processo de oxidação. Esse tempo é determinado medindo a condutividade
Capitulo 1
- 28 -
de água desionizada, na qual vai borbulhando ar que passa pela amostra de
óleo aquecido a uma temperatura específica, arrastando consigo os
compostos voláteis resultantes do processo de oxidação. (25,26)
Capítulo 1
- 29 -
1.3 Antioxidantes Os antioxidantes, de acordo com os seus mecanismos de acção, podem ser
classificados em antioxidantes primários ou secundários. Existem, no
entanto, algumas substâncias particulares, cuja actividade antioxidante pode
seguir vários mecanismos de actuação, sendo referidas como antioxidantes
de múltipla função. (13)
Os antioxidantes primários são compostos que têm a capacidade de resgatar
diversas espécies de radicais livres por doação de um protão H+, formando
espécies de radicais mais estáveis, não reactivos. No sistema de oxidação
lipídica, actuam a nível das reacções radicalares, interferindo nas fases de
iniciação e propagação, inactivando os radicais livres antes de estes reagirem
com os ácidos gordos. Entre os principais antioxidantes, dadores de protão
H+, estão os compostos fenólicos de um ou vários anéis aromáticos contendo
substituições monohidroxilo ou polihidroxilo. (10,16)
Por sua vez, os antioxidantes secundários são substâncias que conseguem
retardar o processo de oxidação, através de outros mecanismos que não os
que convertem radicais livres em espécies mais estáveis e não reactivas.
Substâncias quelantes de metais de transição (compostos catalisadores da
oxidação lipídica) são importantes antioxidantes secundários, dado que
conseguem inactivar a ligação destes metais a pontos específicos de
reacção, evitando a sua acção. Em muitas situações, estas substâncias
quelantes não são efectivas quando actuam sozinhas, tendo a capacidade
de, quando agem em conjunto com compostos sequestradores de radicais
livres, potenciar a acção destes. (10,16) Neste grupo de antioxidantes
secundários, encontram-se também as substâncias sequestradoras directas
de oxigénio, um importante substrato para ocorrer a oxidação lipídica. O
ácido ascórbico é um exemplo deste importante tipo de antioxidantes. (13)
Capitulo 1
- 30 -
Antioxidantes e óleos alimentares Os óleos vegetais, embora contendo na sua composição antioxidantes, tais
como tocoferóis, tocotrienóis, carotenoides, esteróis e compostos fenólicos,
estes não são, no entanto, totalmente eficazes na protecção dos óleos ao
processo de oxidação. (12,16,27-29) Neste sentido, a incorporação intencional de
antioxidantes nos óleos, é considerada como um dos métodos mais efectivos
para incrementar a estabilidade oxidativa dos mesmos. (10,12,14,30)
Antioxidantes in vivo Evidências experimentais têm demonstrado a existência de seis grandes
espécies reactivas de oxigénio (ROS) que podem causar danos oxidativos no
organismo de diferentes seres vivos.
Estas espécies são o anião superóxido (O2•-), peróxido de hidrogénio (H2O2),
radical peroxilo (ROO•), radical hidroxilo (HO•), oxigénio singleto (1O2) e
radical peroxinitrilo (ONOO-).(31)
De forma a combater os ataques destes radicais, os organismos vivos
contêm nos seus sistemas celulares antioxidantes enzimáticos que os
transformam em especies inócuas e não reactivas. Exemplo desta protecção
é a conversão do anião superóxido (O2•-) em oxigénio e hidrogénio pela
enzima superoxidismutase (SOD) e da conversão de peróxido de hidrogénio
em água e oxigénio pela enzima catalase. No entanto, não é conhecido
nenhuma actividade enzimática responsável pelo resgate dos radicais
(ROO•), (HO•) (1O2) e (ONOO-), sendo esta protecção imputada às
variedades de antioxidantes não enzimáticos que têm a capacidade de
resgatar estas espécies reactivas impedindo-as de continuar o seu
caminho.(31) Existe uma grande diversidade de antioxidantes não enzimáticos
presentes na dieta diária de um ser humano, tais como vitaminas, polifenóis,
carotenóides, terpenóides, compostos Maillard e sais minerais, sendo deste
grupo de compostos, os polifenóis, os qualitativamente mais relevantes,
recomendando-se uma ingestão diária de 1 g/dia. (32-34)
Capítulo 1
- 31 -
Antioxidantes Naturais
Muitos dos antioxidantes não enzimáticos presentes na nossa dieta diária são
fitoquímicos, metabolitos secundários de origem vegetal onde se incluem os
já referidos carotenóides, fitosteróis e polifenóis, aos quais têm sido
associados a prevenção de doenças crónicas relacionadas com a idade, tais
como doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, diabetes tipo
II e diversos tipos de cancro directamente relacionados com os hábitos
alimentares. (35-40) Comparativamente a fármacos específicos, os fitoquímicos
são biologicamente menos activos, mas uma vez que a sua ingestão regular
pode atingir quantidades significativas, os seus efeitos fisiológicos terão um
efeito de longo termo, tornando estes compostos em importantes
quimiopreventivos. (41)
Análises de mercado, realizadas para diversas indústrias da área alimentar,
têm revelado o grande interesse dos consumidores por produtos alimentares
promotores da saúde e bem-estar que contenham, na sua composição,
compostos bioactivos de origem vegetal. (41) Nesse sentido, a indústria tem
recorrido cada vez mais a estes fitoquímicos como importantes ingredientes
activos (Bioprodutos) na formulação de novos produtos que estão associados
à promoção de um benefício específico de saúde e bem-estar – os alimentos
funcionais. (42-44)
Diversos estudos que abordam a adição de ingredientes activos,
nomeadamente extractos de origem vegetal, a óleos alimentares, têm sido
realizados com o objectivo de aumento da estabilidade oxidativa dos óleos
finais. (13,23,28,29,45,46) As matrizes mais referidas como fontes destes
ingredientes activos são ervas, chás, cereais, cacau, frutas e vegetais, sendo
os extractos mais exaustivamente estudados para este fim, o de
rosmaninho,(45) o de oregãos,(14,47) e mais recentemente, extractos ricos em
biofenóis característicos da azeitona. (7,48) Particularmente, tem merecido
especial atenção, por parte da comunidade científica, a actividade
antioxidante de polifenóis em óleos, efectuando-se estudos de incorporação
Capitulo 1
- 32 -
de compostos fenólicos, na sua forma pura, a diversos óleos
alimentares.(29,49)
Um óleo alimentar, enriquecido em compostos activos antioxidantes, pode
conduzir à formulação de um óleo de estabilidade oxidativa melhorada e de
qualidade sensorial e nutritiva mais elevada, contribuindo para um bem-estar
específico do consumidor.
Capítulo 1
- 33 -
1.4 Alimentos Funcionais
Tal como referido anteriormente, tem-se assistido, nos últimos anos, a um
forte aumento nas vendas de alimentos associados ao conceito de natural,
enriquecidos com ingredientes activos (bioprodutos) – os Alimentos
funcionais. (50)
Consideram-se alimentos funcionais, alimentos que quando consumidos
regularmente, para além das suas propriedades nutritivas, favorecem
determinados benefícios específicos para a saúde e bem-estar do
consumidor. (41,51)
Os novos regulamentos da Comissão Europeia e do Parlamento Europeu de
20 de Dezembro de 2006, sobre Reivindicações de Nutrição e saúde, indicam
em particular a necessidade de suporte científico para as alegações de
alimentos com benefícios específicos para a saúde. As alegações
concretizadas terão de se relacionar com um evidente melhoramento do
estado da saúde ou redução de risco de doença, tendo que ser
cientificamente comprovadas. (41)
Estes novos factos no mercado dos alimentos funcionais tornam agora
imprescindível a estreita ligação das indústrias com unidades de I&D, de
forma a tornar possível o lançamento de novos produtos-chave na procura de
uma maior competitividade.
Capitulo 1
- 34 -
1.5 Referências (1) Pitts, M., Dorling, D. and Pattie, C., Oil for Food: The Global Story of Edible Lipids, Journal of World-Systems Research,, 2007, XIII, 12-32. (2) Benkouider, C., Can Functional Products Revive a Mature Oils and Fats Market?, Euromonitor, 2003. (3) Global Industry Analysts, I., Vegetable Oils: A Global Strategic Business Report, Global Industry Analysts, Inc., 2007. (4) Dubois, V., Breton, S., Linder, M., Fanni, J. and Parmentier, M., Fatty Acid Profiles of 80 Vegetable Oils with Regard to Their Nutritional Potential, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2007, 109, 710–732. (5) Bassuk, S.S. and Manson, J.E., Lifestyle and Risk of Cardiovascular Disease and Type 2 Diabetes in Women: A Review of the Epidemiologic Evidence 10.1177/1559827608314095, American Journal of Lifestyle Medicine, 2008, 2, 191-213. (6) Leonard, E.C., Dietary Fatty Acids: Effect of the N-6/N-3 Balance on Human Nutrition and Disease., Lipid Technol., 1999, 11, 110-114. (7) Salta, F.N., Mylona, A., Chiou, A., Boskou, G. and Andrikopoulos, N.K., Oxidative Stability of Edible Vegetable Oils Enriched in Polyphenols with Olive Leaf Extract, Food Science and Technology International, 2007, 13, 413-421. (8) Choe, E. and Min, D.B., Chemistry of Deep-Fat Frying Oils Doi:10.1111/J.1750-3841.2007.00352.X, Journal of Food Science, 2007, 72, R77-R86. (9) Silva, F.A.M., Borges, M.F.M. and Ferreira, M.A., Métodos Para Avaliação Do Grau De Oxidação Lipidica E Da Capacidade Antioxidante, Quimica Nova, 1999, 22, 94-103. (10) Choe, E. and Min, D.B., Mechanisms and Factors for Edible Oil Oxidation Doi:10.1111/J.1541-4337.2006.00009.X, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2006, 5, 169-186. (11) Isabei, P. and Mariano, M., Study of the Thermal Stability of Edible Vegetable Oils in Different Environments., Afinidad, 2001, 58, 190–196. (12) Frankel, E.N., 1998, The Oily Press. (13) Chaiyasit, W., Elias, R.J., McClements, D.J. and . Decker, E.A., Role of Physical Structures in Bulk Oils on Lipid Oxidation., Critical Reviews infood science and Nutrition, 2007, 47, 299-317. (14) Yanishlieva, N.V. and Marinova, E.M., Stabilisation of Edible Oils with Natural Antioxidants, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2001, 103, 752–767. (15) McClements, D.J. and Decker, E.A., Lipid Oxidation in Oil-in-Water Emulsions: Impact of Molecular Environment on Chemical Reactions in Heterogeneous Food Systems., J. Food Sci., 2000, 65, 1270-1282. (16) Decker, E.A. in: Lipid Chemistry,(2002) Vol. (Akoh, C.C. and Min, D.B., Eds.) Marcel Dekker, Inc., New York, NY. (17) Gomes, T., Delcuratolo, D. and Paradiso, V.M., Pro-Oxidant Action of Polar Triglyceride Oligopolymers in Edible Vegetable Oils, European Food Research and Technology, 2008, 226, 1409-1414. (18) Ramadan, M., Amer, M. and Sulieman, A.E.-R.M., Correlation between Physicochemical Analysis and Radical-Scavenging Activity of Vegetable Oil Blends as Affected by Frying of French Fries, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2006, 108, 670–678. (19) Pereira, A.F.C., Pontes, M.J.C., Neto, F.F.G., Santos, S.R.B., Galvão, R.K.H. and Araújo, M.C.U., Nir Spectrometric Determination of Quality Parameters in Vegetable Oils Using Ipls and Variable Selection, Food Research International, 2008, 41, 341-348. (20) Osawa, C.C., Goncalves, L.A.G. and Ragazzi, S., The Use of Fast Methodologies (Kits) in Evaluating Deep-Frying Oils, Journal of the American Oil Chemists Society, 2007, 84, 893-897. (21) Tompkins, C. and Perkins, E., The Evaluation of Frying Oils with the P-Anisidine Value., J Am Oil Chem Soc, 1999, 76, 945–947. (22) Gertz, C., Chemical and Physical Parameters as Quality Indicators of Used Frying Fats, Eur J Lipid Sci Technol, 2000, 102, 566–572. (23) Gertz, C., Klostermann, S. and Kochhar, S.P., Testing and Comparing Oxidative Stability of Vegetable Oils and Fats at Frying Temperature, European Journal of Lipid Science and Technology, 2000, 102, 543-551.
Capítulo 1
- 35 -
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Capitulo 1
- 36 -
(48) Fki, I., Allouche, N. and Sayadi, S., The Use of Polyphenolic Extract, Purified Hydroxytyrosol and 3,4-Dihydroxyphenyl Acetic Acid from Olive Mill Wastewater for the Satbilization of Refined Oil: A Potential Alternative to Synthetic Antioxidants., Food Chemistry, 2005, 93, 197-204. (49) Artajo, L.S., Romero, M.P., Morello, J.R. and Motilva, M.J., Enrichment of Refined Olive Oil with Phenolic Compounds: Evaluation of Their Antioxidant Activity and Their Effect on the Bitter Index, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54, 6079-6088. (50) Euromonitor, The Market for the Growth of Natural Ingredients, Euromonitor International, 2005. (51) Shahidi, F., Functional Foods: Their Role in Health Promotion and Disease Prevention Doi:10.1111/J.1365-2621.2004.Tb10727.X, Journal of Food Science, 2004, 69, R146-R149.
- 37 -
The €819.9m European fruit and vegetables extracts and powders market is on course to grow 4.5 per cent, reaching €1128m by 2009. In Frost & Sullivan report O azeite é a principal gordura consumida em países de dieta normalmente
reconhecida como dieta mediterrânica. A dieta mediterrânica identifica-se por
ser rica em frutas, vegetais, peixe e, em particular, associada a um consumo
regular de azeite. (1-3) Esta gordura “rica”, é, por si só, considerada como um
alimento funcional, já que a sua composição reúne um elevado teor de
gordura insaturada (MUFAS), nomeadamente ácido oleico, e compostos de
menor peso molecular com propriedades biológicas já reconhecidas. (4) O
conteúdo nesses compostos de menor peso molecular, com natural
actividade antioxidante, varia consoante o tipo de cultivar da azeitona, o clima
a que esteve sujeita a oliveira, o grau de maturação da azeitona na altura da
colheita e o processo de extracção/produção de azeite. (5,6) Os compostos
menores dividem-se em duas fracções distintas, fracção insaponificável e
fracção saponificável ou solúvel que permanece na matriz lipídica. Da fracção
saponificável fazem parte os compostos fenólicos, responsáveis por conferir
2 – Óleo Funcionalizado com extracto Bioactivo de Azeitona
Capitulo 2
- 38 -
características específicas ao azeite, tais como, sabor, aroma e protecção à
oxidação. (7) Os compostos fenólicos hidrofílicos, com coeficientes de
partição (azeite/água) muito baixos, são, por sua vez, constituintes da fracção
insaponificável, existindo em concentrações muito reduzidas na matriz
lipídica. (4,8) Grande parte destes compostos fenólicos permanecem nos
diferentes tipos de resíduos/sub-produtos resultantes do processo de
extracção, passando apenas cerca de 2 % dos mesmos para o azeite, (8) e
maioritariamente pertencentes ao grupo dos secoiridoides, como a
oleuropeína, demetiloleuropeína, ligstrósido, e os seus derivados hidroliticos, oleuropeína aglícona, oleoside-11-metil ester, ácido elenóico, e
maioritariamente fenóis simples, tais como o hidroxitirosol e tirosol. (9,10) A oleuropeína e o hidroxitirosol (produto da degradação da oleuropeína), dois
dos principais compostos fenólicos existentes apenas na Olea europaea L.
(azeitona) e seus derivados, têm sido, na literatura mais recente,
correlacionados com importantes propriedades fisiológicas devido à sua
elevada capacidade antioxidante. (4,11,12) O hidroxitirosol é frequentemente
indicado como sendo o responsável pela forte estabilidade oxidativa do
azeite. (13,14) Devido à sua composição específica em compostos fenólicos e lípidos, onde
predominam os ácidos gordos monoinsaturados, o azeite é a gordura vegetal
mais estável e resistente à oxidação lipídica, (15,16) sendo os seus biofenóis
reconhecidos como potenciais alvos para formulação de novos ingredientes,
quer para a indústria alimentar, quer para a indústria farmacêutica. (17,18) Entre os anos de 2002 e 2004, parte da equipa do laboratório de
acolhimento, onde o trabalho apresentado nesta tese foi realizado, liderou um
projecto Europeu, “Antioxidantes Naturais”, financiado pelo programa Prime.
No âmbito deste projecto Europeu, cujo objectivo foi avaliar a viabilidade de
obtenção de concentrados de compostos antioxidantes isolados a partir de
resíduos vegetais da indústria agro-alimentar, desenvolveu-se um processo
integrado de tecnologias limpas para obtenção de um concentrado em
biofenóis a partir dos subprodutos da extracção de azeite, patenteado
durante o ano de 2005 (Julho 2005) (Anexo A). (19) O projecto estabeleceu
como parceiros das entidades de I&D indústrias potencialmente interessadas
Capítulo 2
- 39 -
nos resultados finais atingidos, onde a Sovena foi uma das indústrias
demonstradoras. Na sequência do trabalho desenvolvido durante o tempo do
projecto, delineou-se o plano da tese apresentada.
Os extractos naturais obtidos através do processo integrado de tecnologias
limpas, para além de serem concentrados naturais de biofenóis, ricos em
hidroxitirosol (HT), são isentos de qualquer tipo de resíduo de solventes
orgânicos, sendo esse facto uma mais valia para a sua utilização na indústria
alimentar. Assim sendo, a incorporação destes extractos naturais como
bioprodutos (ingredientes activos) viabiliza a formulação de um óleo mais
estável à oxidação lipídica e com propriedades biológicas específicas, sendo
a caracterização exaustiva das propriedades antioxidantes e de potenciais
actividades biológicas dos concentrados activos aspectos fundamentais para
a concretização da formulação de óleos alimentares funcionalizados
(oleocêuticos).
Capitulo 2
- 40 -
2.1 Formulação de Óleo Funcional
A análide da viabilidade de formulação de óleos funcionais, através da
incorporação de extractos ricos em compostos fenólicos característicos da
azeitona, dividiu-se em duas etapas distintas.
A primeira etapa consistiu em avaliar a possibilidade de adição destes
concentrados naturais a óleos alimentares recorrendo a diferentes métodos
para a sua realização. A segunda etapa envolveu a caracterização e
avaliação das propriedades antioxidantes e potenciais actividades biológicas
dos extractos naturais adicionados aos óleos alimentares. Esta segunda
etapa é sempre importante na formulação de produtos funcionais pois, ao
definir-se que tipo de propriedades se atribui aos extractos naturais como
ingredientes activos (bioprodutos), é possível delinear que alegações e
propriedades se podem estender para o produto final. Esta etapa é descrita
no sub-capítulo 2.2.
Os extractos naturais ricos em polifenóis, característicos da azeitona,
seleccionados para o estudo eram (devido ao seu processo de produção)
hidrossolúveis. Foram avaliadas três formas distintas de incorporar os
extractos em óleos alimentares. Como modelo de estudo, para a adição dos
extractos, utilizou-se óleo de girassol, dado este ser o óleo mais consumido
em Portugal e na Europa Ocidental.
2.1.1 Incorporação de Extracto Bioactivo
A incorporação dos extractos hidrossolúveis em óleo de girassol formou
emulsões de água em óleo (A/O) estáveis e não homogéneas. Foi por isso
necessário desenvolver uma metodologia que viabilizasse a adição dos
ingredientes formulados ao óleo de girassol, cumprindo sempre a legislação
Nacional e Europeia relativamente a quais os aditivos alimentares e
respectivas quantidades permitidas no âmbito da directiva - Directiva 95/2/EC.
A incorporação dos extractos naturais em óleo de girassol recorreu a três
métodos distintos:
Capítulo 2
- 41 -
• Incorporação recorrendo à utilização de emulsionantes;
• Incorporação por solubilização directa (SD) - sem emulsionantes;
• Incorporação por encapsulação em micropartículas lipídicas (PL).
Incorporação por Emulsionantes
De conhecimento já adquirido em trabalhos anteriores, foram propostos, pelo
grupo de trabalho, dois emulsionantes, apresentados na Tabela 2.1.
Tabela 2.1 Emulsionantes utilizados nos ensaios de incorporação dos extractos por
métodos convencionais
Nome / Aditivo Composição Características Limites
PGPR / E476 Poliglicerol
poliricinoleato
Emulsionante
Utilizado na indústria
alimentar para reduzir
viscosidades
0,4 % (m/m)
GMS / E471 gliceril
monoestereato
2 % (m/m)
Sendo necessário optimizar as condições operatórias de incorporação,
nomeadamente velocidade de agitação, tempo de agitação e temperatura,
optou-se por se realizarem os primeiros ensaios com concentrados
comerciais ricos em hidroxitirosol (HT). Foi assim assegurada a
disponibilidade de produto para a realização do estudo (à data do trabalho
realizado não era possível produzir os extractos a uma escala que não a
laboratorial), havendo a oportunidade para a comparação dos extractos
naturais estudados no âmbito deste trabalho, com os já existentes no
mercado. Os produtos comerciais seleccionados foram: o Hidrox® 9 %, da
Creagri, USA, que se apresenta na forma de um sólido caramelizado
castanho, e o Oleaselect®, da Indena, Itália, que se apresenta em forma de
pó solto castanho com intenso odor a azeitona. No Anexo B, encontra-se
uma tabela com características dos produtos comerciais existentes à data da
realização do trabalho. A escolha destes concentrados teve por base:
i) Hidrox® 9%, na sua composição rica em HT e a composição mais
semelhante aos extractos bioactivos selccionados, nomeadamente
Capitulo 2
- 42 -
um dos extractos seleccionados o EBH (Extracto Bioactivo obtido a
partir de bagaço húmido de azeitona – consultar sub-capítulo 2.2;
ii) Oleaselect® como termo de comparação, devido a ser um
concentrado muito mais complexo, apresentando, na sua
composição, grande concentração de polifenóis de maior peso
molecular, principalmente verbascoside.
Os ensaios foram realizados tendo em conta as seguintes considerações:
Tabela 2.2 Considerações técnicas para incorporação dos extractos naturais
Parâmetros Considerações Observações
Tempo de agitação < possível
Minimização possível de tempo de
incorporação de forma a reduzir
tempo de produção
Exposição ao ar < possível
Minimização possível de
exposição ao ar de forma a não
induzir oxidação lipídica
Rotação
Viável para ser
possível reproduzir
em fábrica
-
Temperatura < possível
Minimização possível do uso de
temperatura de forma a não
induzir oxidação lipídica e
minimizar recursos energéticos.
%(v/v) de extracto
(solução) a incorporar ≤ 0,6 % -
[HT] no produto final 0,007 g/L Quantidade média de HT existente
no azeite.
Tomando em consideração resultados obtidos anteriormente em outros
trabalhos fora do âmbito da Tese, fixou-se uma única formulação para a
combinação dos dois emulsionantes.
Considerando a quantidade de HT presente no óleo final de 0,007 g/L
(concentração média de HT nos azeites portugueses), foi necessário utilizar,
para a incorporação, extractos com a mais elevada concentração possível em
HT, minimizando assim a quantidade de água a incorporar.
Os métodos utilizados foram:
Capítulo 2
- 43 -
I) Introdução, em simultâneo, de 0,6 (% v/v) de extracto natural
concentrado e dos emulsionantes: 0,1 (% m/m) E471 e 0,2 (%
m/m) E476 e agitação por Homogeneizador Turrax (IKA, Ale-
manha) a 3000 rpm, durante 5 min (método ilustrado na Figura
2.1);
II) Preparação prévia de uma emulsão (óleo + Extracto concentrado
+ emulsionantes + ácido cítrico) com elvada concentração em HT
(> 2 g/L). Adição de 0.5 (% v/v) da emulsão ao óleo e agitação
por Homogeneizador Turrax (IKA, Alemanha) a 3000 rpm,
durante 5 min.
Figura 2.1 Exemplo de aplicação do homogeneizador Turrax, (IKA, Alemanha) na estabilização
da emulsão A/O formada pela incorporação dos extractos no óleo de girassol.
A velocidade de rotação e tempo de homogeneização foram escolhidos com
base em estudos preliminares, tendo em conta alteração de temperatura
conferida ao óleo de girassol e consequentes alterações de propriedades.
A Tabela 2.3 reúne a informação relativa aos ensaios efectuados.
Capitulo 2
- 44 -
Tabela 2.3 Resumo dos ensaios realizados com emulsionantes para incorporação dos extractos
naturais.
Todos os óleos finais foram avaliados de forma sensorial em termos de cor,
brilho e cheiro (Figura 2.3), utilizando, como controlo, o óleo normal sem
aditivos.
Determinou-se, para todos os óleos formulados, o índice de teor de Sabão
(segundo a norma NP 1644), de forma a seleccionar quais as formulações
realizadas com emulsionantes adicionados em excesso. Os resultados
obtidos são expressos em % (m/m) de sabão presente no óleo.
Para cada amostra, recorrendo a um teste de estabilidade acelerado, o teste
de Rancimat, determinou-se o Tempo de Indução – TI – necessário para se
atingir um “ponto crítico” do processo de oxidação radicalar, i.e. o tempo em
que se inicia a fase de propagação da oxidação no óleo. (20) O método
encontra-se descrito, mais sucintamente, no Anexo C.
A avaliação do “sucesso” da adição dos extractos activos aos óleos foi
também determinada pela quantificação de polifenóis totais incorporados
através do método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, descrito no Anexo D. A
quantificação dos compostos fenólicos envolve a extracção da fracção polar
dos óleos vegetais, sendo essa a fracção analisada. O método de extracção
dos compostos polares está mais sucintamente detalhado no Anexo B. Os
resultados obtidos são expressos em mg de Equivalentes de Ácido Gálico/L
Bioproduto (extracto activo)
Técnica % (v/v)
Concentrado/ óleo
% (m/m) E471
% (m/m) E476
%(m/m) Ácido Cítrico
C HT (g/L)
Hidrox 9% I 0,6 0,1 0,2 - 0,0035
Hidrox 9% II 0,5 0,0025 0,004 0,001 0,0035
Oleaselect I 1 0,2 0,2 - 0,008
Oleaselect II 0,5 0,0025 0,004 0,001 0,008
EBH I 0,6 0,1 0,2 - 0,008
EBH* II 0,5 0,0025 0,004 0,001 0,008
Capítulo 2
- 45 -
(mg EAG/L). A identificação dos polifenóis e quantificação de HT incorporado,
expresso em g/L, foi efectuado por HPLC-DAD a 280 nm (descrição do
método no Anexo D). Os resultados encontram-se reunidos na Figura 2.4.
Incorporação por Solubilização Directa (SD) Foi estudada a viabilidade de solubilização directa do HT no óleo alimentar,
não recorrendo à utilização de emulsionantes. Apesar do HT apresentar um
coeficiente de partição (kp) água/óleo bastante reduzido, (21) este vai
aumentando de forma linear com a temperatura e tempo de residência na
matriz lipídica, pelo que este processo poderia apresentar vantagens
competitivas relativamente ao processo recorrendo a emulsionantes. Os
custos de matérias-primas seriam reduzidos, eliminando qualquer problema
de sobredosagem dos aditivos utilizados.
Tendo como objectivo avaliar a viabilidade deste método, determinaram-se
as curvas de solubilidade em termos de percentagem de HT incorporado,
para o composto comercial Hidrox® 9 %, e para um dos extractos bioactivos
naturais seleccionado para a realização deste trabalho, o EBH (descrição de
método de obtenção e propriedades no sub-capítulo 2.2). Os ensaios
consistiram em adicionar 2 g de extracto sólido a 100 mL de óleo, agitando o
sistema a 450 rpm, durante 5 h, num reactor com agitação por pás, ao abrigo
da luz e fechado. Ao longo do tempo, foram-se retirando 2 mL ± 0,05 mL de
óleo solubilizado e adicionando óleo fresco. Como modelo de estudo, utilizou-
se o óleo de girassol.
Nos ensaios com preparação prévia de um premix (pré-tratamento da
amostra), foram adicionadas 2 g de extracto a 5 mL de óleo e a mistura
agitada a 800 rpm durante 5 min, a 50 ºC.
As amostras recolhidas ao longo do tempo foram analisadas por HPLC-DAD
a 280 nm e a concentração de HT determinada. Antes da injecção da
amostra no HPLC, procedeu-se à extracção da fracção polar recorrendo ao
método descrito no Anexo B.
As condições das experiências realizadas encontram-se descritas na Tabela
2.4.
Capitulo 2
- 46 -
Tabela 2.4 Condições dos ensaios de determinação de curvas de solubilidade
Temperatura (ºC) Bioproduto (Extracto
Activo) Tempo
25 Hidrox® 9% 5
50 Hidrox® 9% 5
25
Hidrox® 9%
Com Pré-tratamento do
extracto a 50ºC durante 5min
(Premix)
5
25
EBH
Com Pré-tratamento do
extracto a 50ºC durante 5min
(Premix)
5
As curvas de solubilidade estão representadas na Figura 2.5 e Figura 2.6. Os
resultados são expressos em termos de % HT solubilizada relativamente à
massa inicial existente no extracto (% [mHT solubilizada/mHT inicial x100]). Os
resultados apresentados são a média de (n=2) experiências independentes,
sendo o erro determinado sempre inferior a 6 %.
Incorporação por Encapsulação dos Extractos em Partículas Lipídicas
(PL)
Tendo como objectivo, na incorporação dos bioprodutos, a minimização de
tempos de agitação, temperatura, exposição ao ar, dificuldade de
manuseamento e emulsionantes utilizados, optou-se por tentar formular um
sistema estável, com afinidade para o óleo, surgindo assim a encapsulação
dos extractos aquosos em partículas de base lipídica. A encapsulação é
favorável perante duas situações distintas:
i) facilitar a incorporação, protegendo o sistema aquoso com ácidos
gordos também característicos da matriz óleo:
ii) proteger o extracto de possível degradação/oxidação que pode
ocorrer no óleo durante armazenamento. (22,23)
Existem várias técnicas possíveis de produzir partículas lipídicas, tais como
pulverização (spray-drying), spray-chilling (métodos mais convencionais) ou
Capítulo 2
- 47 -
recorrendo a tecnologia supercrítica através de PGSS (Particles from Gas
Saturated Solutions) ou SAS (Supercritical Anti-Solvent). Neste caso, tendo
em conta as características dos extractos (apresentadas no sub-capítulo 2.2),
as partículas lipídicas foram processadas utilizando tecnologia supercrítica,
em particular, o método PGSS. Este método consiste na dissolução do CO2,
no seu estado supercrítico (Anexo E), a determinadas condições (P, T) na
matriz lipídica fundida, seguida de despressurização rápida da mistura
saturada resultante por um dispersor (nozzle). A despressurização rápida
causa uma queda de temperatura (efeito Joule-Thomson) que conduz à
evaporação completa do gás e consequente solidificação dos compostos,
formando as microparticulas secas, posteriormente recolhidas num colector. (24)
No presente trabalho, os extractos aquosos foram introduzidos em
simultâneo com o sistema lipídico seleccionado, num reactor com agitação de
500 cm3 de volume e o CO2 pressurizado, para o interior do reactor, através
de uma bomba de pistão de alta pressão, como representado na Figura 2.2.
Após um determinado tempo de agitação para o sistema se encontrar em
equilíbrio, a mistura foi despressurizada através do dispersor e as partículas
secas recolhidas.
Figura 2.2 Instalação de PGSS. A- Reactor com agitação de alta pressão; B- Colector de
partículas; P- Indicador de pressão; TIC – Controlador de temperatura.
As condições operatórias de pressão e temperatura (P,T) foram 120 bar
(12 MPa) e 50 ºC (325 K) respectivamente. O sistema lipídico transportador
foi seleccionado tendo em conta testes preliminares realizados de dissolução
directa do mesmo no óleo de girassol, sendo a mistura de Precirol® ato 5 e
Capitulo 2
- 48 -
GMS Lumulse K – E471 (50:50 m/m) o sistema final eleito. Ambos os
compostos são produtos lipídicos, constituídos maioritariamente por ácidos
gordos glicerados, sendo ambos biocompatíveis. Na Tabela 2.5, apresentam-
se as características destes dois compostos lipídicos.
Tabela 2.5 Características dos compostos lipídicos.
Nome / Aditivo Precirol® ato 5 GMS LumulseTM K /
E471
Composição
Mono-, di- e triacilgliceróis de
ácidos gordos saturados C16
e C18.
gliceril monoestereato
Fornecedor Gattefossé Lambert Technologies
Balanço hidrofilico - Lipofílico (HLB)
2 4
Ponto Fusão (ºC) 53-57 62
Valor de Iodeto (g I2/100g)
< 3.0 2.0
Acidez (mg KOH/g) < 6.0 < 3.0
Valor de Saponificação (mg KOH/g)
165-195 165-176
As partículas obtidas foram de seguida testadas quanto à incorporação no
óleo de girassol. Amostras de 140 mg foram adicionadas 140 g de óleo
(concentração de 1000 mg/kg) e a mistura agitada manualmente, durante
2 min, até ocorrer homogeneização.
Determinou-se a curva de solubilidade das partículas elaboradas, nas
mesmas condições dos ensaios de solubilização directa acima descritos.
As amostras recolhidas ao longo do tempo foram analisadas por HPLC-DAD
a 280 nm e a concentração de HT determinada. Antes da injecção da
amostra no HPLC, procedeu-se à extracção da fracção polar do óleo,
recorrendo ao método descrito no Anexo B.
Os resultados (Figura 2.7) são expressos em % de HT (% [mHT solubilizada/mHT
inicial x100]) incorporado no óleo de girassol, de forma a comparar com as
curvas de solubilidade dos extractos anteriormente obtidas.
Capítulo 2
- 49 -
Resultados & Discussão
Os resultados obtidos nos ensaios de incorporação dos extractos através dos
métodos acima descritos encontram-se representados em seguida.
Figura 2.3 Análise Sensorial relativa aos óleos incorporados através de métodos convencionais
recorrendo a emulsionantes.
Onde,
0
1
2
3cor
brilho
cheiro
estabilidade emulsão
Hidrox 9% - Mét. IHidro 9% - Mét. II
0
1
2
3cor
brilho
cheiro
estabilidade emulsão
Oleaselect - Mét. IOleaselect - Mét. II
0
1
2
3cor
brilho
cheiro
estabilidade emulsão
EBH - Mét. IEBH - Mét. II
_ª_ª
1 alteração drástica2 alteração atenuada3 sem alteração
1 0 < EE < 22 2 < EE < 43 4 < EE < 6
meses
Cor, Brilho e Cheiro
Estabilidade
Capitulo 2
- 50 -
Figura 2.4 Resumo dos resultados obtidos para os óleos incorporados por emulsionantes.
O erro associado ao método de quantificação de sabão é 4% e ao Rancimat 2%.
00,020,040,060,08
0,10,120,140,160,18
(% m
/m) S
abão
no
Óle
o
Óleo G irassol C
ontrol
H idrox 9% M
étI
H idrox 9% M
ét.I
Oleaselect Mét I
Oleaselect Mét. I
EBH Mét. I
EBH Mét. II
0123456789
10
Pol
ifeno
is T
otai
s (x
10-3
) (m
gEA
G/L
)
Óleo G irassol C
ontrol
H idrox 9% M
étI
H idrox 9% M
ét.I
Oleaselect Mét I
Oleaselect Mét. I
EBH Mét. I
EBH Mét. II
0
1
2
3
4
TI (h
)
Óleo Girassol Controlo
Hidrox 9% Mét. II EBH Mét. II
QuantificaQuantificaçção de ão de HidroxitirosolHidroxitirosolPolifenoisPolifenois Totais Totais ––MMéétodo todo FolinFolin‐‐CiocalteuCiocalteu
AvaliaAvaliaçção do Tempo de Induão do Tempo de InduççãoãoMMéétodo todo RancimatRancimat
QuantificaQuantificaçção de Sabão Totalão de Sabão TotalMMéétodo de NP 1644todo de NP 1644
0
1
2
3
4
5
6
7
HT
Inco
rpor
ado
(x 1
0-3) (g
/L)
Óleo G irassol C
ontrol
H idrox 9% M
étI
H idrox 9% M
ét.I
Oleaselect Mét I
Oleaselect Mét. I
EBH Mét. I
EBH Mét. II
Capítulo 2
- 51 -
Figura 2.5 Curvas de Solubilidade determinadas no âmbito dos ensaios de Solubilização directa
dos extractos. Para o extracto bioactivo EBH só foi realizado o ensaio a condições idênticas ao
melhor resultado do Hidrox 9 %.
Figura 2.6 Comparação das Curvas de Solubilidade obtidas nos ensaios de Solubilização
Directa dos extractos com a Curva de solubilidade obtida para as partículas lipídicas (PL) ricas
em EBH. O eixo das ordenadas da curva de solubilidade das PL encontra-se representado à
direita.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 100 200 300 400tempo (min)
% (m
HTs
olub
ilizad
a/m
HT
inic
ial x
100)
Hidrox 9% Hidrox 9% 50ºCHidrox 9% Premix@50ºC EBH Premix@50ºC
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 50 100 150 200 250 300 350 400
tempo (min)
% (m
HTs
olub
iliza
da/m
HT
inic
ial x
100)
Ens
aios
Sol
ubili
zaçã
o D
irect
a
0
10
20
30
40
50
60
% (m
HTs
olub
iliza
da/m
HT
inic
ial x
100)
Inco
rpor
ação
Par
ticul
as L
ipid
icas
Hidrox 9% Hidrox 9% 50ºCHidrox 9% Premix@50ºC EBH Premix@50ºCPL EBH
Capitulo 2
- 52 -
Figura 2.7 Comparação dos resultados obtidos para os melhores resultados de incorporação
directa e adição das partículas lipídicas (PL), quanto a quantidade (g/L) de HT incorporado,
polifenóis totais (mgEAG/L) e tempo de indução da oxidação (TI) – Rancimat.
0
20
40
60
80
100
HT
Inco
rpor
ado
(x 1
0-3) (g
/L)
Óleo Girassol Controlo Hidrox 9%Premix@50ºC
EBH PL
0
2
4
6
8
10
12
Pol
ifeno
is T
otai
s (x
10-2
) (mgE
AG/L
)
Óleo Girassol Controlo Hidrox 9% Premix@50ºC EBH PL
0
1
2
3
4
TI (h
)
Óleo Girassol Controlo
Hidrox 9%Premix@50ºC
EBH Premix@50ºC
EBH PL
PolifenoisPolifenois Totais Totais ––MMéétodo todo FolinFolin‐‐CiocalteuCiocalteu
QuantificaQuantificaçção de ão de HidroxitirosolHidroxitirosol
AvaliaAvaliaçção do Tempo de Induão do Tempo de InduççãoãoMMéétodo todo RancimatRancimat
Capítulo 2
- 53 -
Incorporação por Emulsionantes
Na incorporação directa dos extractos por acção de emulsionantes, verificou-
se, através de análise sensorial (Figura 2.3), que os óleos aos quais se
adicionou Oleaselect ficaram baços e com cor e cheiro bastante alterados.
Esta alteração mais evidente relacionou-se com o facto de se ter incorporado
1 % (v/v) e não os 0,6 % (v/v) de extracto aquoso. Esta variação nos
parâmetros foi necessária para se adicionar a quantidade pretendida de HT,
dado que a concentração da solução é sempre inferior à dos outros extractos
avaliados. A preparação prévia de uma primeira emulsão (Método II) é eficaz
na redução da quantidade de emulsionantes a adicionar, não ultrapassando
por isso o teor de sabão permitido por lei. No entanto, no caso do Oleaselect,
a emulsão era muito instável, observando-se separação dos seus
constituintes após incorporação no óleo.
Não existem diferenças significativas a nível da análise sensorial entre o
extracto comercial Hidrox 9 % e EBH, incorporados através dos dois métodos
descritos. Em termos de incorporação de HT, os valores mais elevados
obtidos foram para o EBH, verificando-se consequentemente um incremento
no tempo de indução da oxidação, determinada pelo método de Rancimat.
Dos dois métodos testados, o método II foi o que se evidenciou em termos de
redução de emulsionantes, tempo de agitação e incorporação de composto
activo conseguida. Contudo, as emulsões conseguidas tiveram um tempo de
vida inferior a um ano, verificando-se a precipitação dos extractos
incorporados no fundo do recipiente com o óleo, afectando significativamente
o tempo de vida do produto final. Esta técnica apresenta também a
desvantagem de se recorrer a velocidades de agitação elevadas, que
sobreaquecem a mistura óleo+extracto, podendo influenciar na qualidade do
produto final.
Capitulo 2
- 54 -
Solubilização Directa (SD)
A solubilização directa dos extractos (Figura 2.5 e 2.6) apresenta a vantagem
de não se recorrer ao uso dos emulsionantes, cuja utilização é desvantajosa
do ponto de vista económico e legal (limites permitidos por lei). Os resultados
mais favoráveis foram conseguidos para os ensaios cujo extracto recebeu um
pré-tratamento, formulando-se um premix que se adiciona posteriormente ao
óleo original. No entanto, este preparado é aquecido a 50 ºC, podendo
provocar alguma degradação/oxidação, quer do extracto, quer do óleo
utilizado, e este efeito ser sentido mais tardiamente na estabilidade e tempo
de vida de prateleira do produto final formulado.
No caso do premix do Hidrox 9 %, conseguiu-se atingir o valor imposto como
mínimo para a concentração de HT no óleo, logo ao final de 50 min de
contacto óleo/extracto. Este valor não chega a ser atingido no caso do ensaio
realizado com EBH.
O resultado obtido com o Hidrox 9 % no método de Rancimat, um incremento
de 1,28 relativamente ao tempo de indução do controlo (óleo de girassol),
demonstra aumento de estabilidade à oxidação, correlacionando-se com o
carácter antioxidante do extracto. No entanto, o óleo obtido por solubilização
directa do EBH, com um teor em HT três vezes mais reduzido do que o
atingido com o Hidrox 9 %, apresenta também um incremento no rancimat de
1,06. Este resultado leva a concluir que ou os compostos constituintes do
EBH que conseguem solubilizar no óleo exercem sinergias positivas entre si,
favorecendo a actividade antioxidante perante a oxidação lipídica, ou os
constituintes do extracto Hidrox 9 % não favorecem a actividade antioxidante
deste extracto. Este facto poderá estar relacionado com a presença de
metais, como o ferro, que aceleram a oxidação lipídica, actuando como pro-
oxidantes. (25)
Encapsulação em Partículas Lipídicas (PL)
Analisando os dados obtidos para a curva de solubilização destas partículas
no óleo, observa-se que a % de HT liberto é muito superior à conseguida no
Capítulo 2
- 55 -
caso da solubilização directa com Hidrox 9 % (melhor caso), tornando este
método bastante atractivo do ponto de vista de rentabilidade do extracto
utilizado. A afinidade dos compostos lipídicos seleccionados para com o óleo
alimentar tornam estas PL fáceis de incorporar, misturando-se com simples
agitação manual ou recorrendo a agitação mecânica de velocidade mais
reduzida. Os testes de sabão, devido às quantidades reduzidas adicionadas,
não revelaram alterações em relação ao controlo (0 % de sabão
incorporado).
Uma outra vantagem associada à utilização destas PL (comparativamente ao
método por emulsionantes) é o facto de no sistema incorporado o teor de
água ser significativamente reduzido. A presença de uma fase aquosa num
sistema lipídico diminui a actividade dos antioxidantes, devido às pontes de
hidrogénio estabelecidas com a água, tornando-os menos efectivos na
capacidade de doar um hidrogénio e resgatarem os radicais lipídicos. (26)
O incremento obtido no tempo de indução da oxidação (1,29) através do
método de Rancimat demonstra que apesar do processamento recorrendo a
alta pressão e temperatura o extracto EBH continua a apresentar capacidade
antioxidante. Tendo em conta que no óleo obtido por incorporação com
partículas a quantidade total de HT solubilizada no óleo é menor do que a
solubilizada através do método por solubilização directa do Hidrox 9 %, os
resultados idênticos de Rancimat levam a duas hipóteses distintas:
i) os constituintes do extracto comercial reduzem a capacidade
antioxidante do HT;
ii) os constituintes lipídicos das partículas, ao serem parte deles Mono-,
di- e triacilgliceróis de ácidos gordos saturados C16 e C18,
potenciam a estabilidade oxidativa.
Capitulo 2
- 56 -
2.2 Extractos Bioactivos a partir de Resíduos de Azeitona Após se averiguar a possibilidade de incorporação dos extractos naturais em
óleo de girassol (Capitulo anterior), foi necessário efectuar a caracterização
de propriedades antioxidantes e biológicas dos extractos, no sentido de
avaliar e prever qual o impacto da incorporação dos mesmos nos óleos
alimentares.
Estes resíduos/sub-produtos são ricos em biofenóis que não passam para a
fracção lipídica (azeite), sendo possível, recorrendo a diferentes tecnologias,
isolá-los e concentrá-los de forma a desenvolver produtos de elevado valor
acrescentado.
Tendo em conta toda a envolvência actual, o consumo mundial de azeite,
desde 1990 até à data, duplicou, verificando-se dessa forma um aumento
proporcional na sua produção.
Hoje em dia, Portugal encontra-se na 8ª posição do ranking da produção
mundial a par com a Argélia e Jordânia, enquanto a Espanha detém um terço
(34%) de toda a produção mundial, ocupando, dessa forma, a 1º posição do
ranking. Ao aumentar a produção de azeite, aumenta a quantidade de
resíduos/sub-produtos gerados, sendo imprescindível haver uma politica
rígida de controlo e incentivos ao tratamento e reutilização dos mesmos.
2.2.1 Matérias Primas (MP) Hoje em dia, existem diferentes tecnologias disponíveis para a extracção /
produção de azeite, tecnologias essas que influenciam a composição química
e a qualidade em termos de sabor e aroma do produto final. É possível
classificar estas diferentes tecnologias em:
i) sistema de extracção tradicional;
ii) sistemas de extracção contínua. (27) Nos sistemas de extracção tradicional, a extracção é efecuada por pressão,
isto é, através de um processo de filtração a qual separa o mosto oleoso
(mistura de azeite e águas ruças) da parte sólida, o bagaço. (27)
Capítulo 2
- 57 -
Devido aos elevados custos em mão-de-obra e à descontinuidade do
processo, a indústria investiu em novas tecnologias, tendo sido desen-
volvidos sistemas de extracção contínua, de duas e de três fases. Em ambos
os sistemas, a separação do azeite da pasta de azeitona é efectuada por
centrifugação. No sistema de três fases, é adicionada água à pasta de
azeitona antes desta ser introduzida na centrífuga horizontal, distinguindo-se,
no final três fases, uma sólida (bagaço), formada a partir do material residual
da azeitona, e duas líquidas, azeite e águas ruças (água adicionada e água
do fruto). No sistema de duas fases, a centrífuga horizontal não necessita da
adição de muita água à pasta de azeitona, resultando, dessa forma, a
formação de apenas duas fases, o azeite e uma mistura de bagaço e águas
ruças. O bagaço obtido neste processo detém um elevado teor de humidade,
entre aproximadamente 65-75 %, designado por bagaço de duas fases.(27,28) As unidades de operação destes dois sistemas de extracção contínua, pode
ser consultado no esquema resumo apresentado na Figura 2.8.
Figura 2.8 Esquema ilustrativo do método de extracção de azeite descontínuo (à esquerda) e
método de extracção de azeite contínuo (à direita). Fonte: Alburquerque, J.A., etal., 2004. (29)
Capitulo 2
- 58 -
Na Península Ibérica, nos últimos anos, assistiu-se a um aumento relevante
da utilização de sistemas de extracção em contínuo de duas fases, em
detrimento do sistema tradicional de prensas e do sistema contínuo de três
fases. Sendo o sistema de duas fases considerado como ecológico devido à
redução em 75 % de resíduos e menor consumo de água, (27) foi alvo de
incentivos e subsidios disponibilizados no âmbito de programas europeus
para o sector olivícola, permitindo aos industriais realizar investimentos
adequados para melhorar os seus processos tecnológicos e responder aos requisitos impostos pela legislação ambiental. (28) Esta evolução em Portugal
está reportada na Figura 2.9.
Figura 2.9 Valores Percentuais de processos de extracção de azeite utilizados em Portugal nas
colheitas correspondentes aos anos de 1998/1999 e de 2004/2005. SC3F – Sistema Contínuo de
3 Fases; SC2F – Sistema Contínuo de 2 Fases; SDP- Sistema Descontínuo de Prensas.
Fonte: INRA, 2007. (30)
O bagaço, resultante quer do processo de três fases, quer do processo de
duas fases, é normalmente reutilizado para extracção de óleo, produzindo-se
o chamado óleo de bagaço de azeitona. No entanto, devido ao elevado grau
de humidade, o bagaço de duas fases necessita de ser submetido a uma secagem através de secadores especiais ou de duas passagens nos
secadores tradicionais, para que o óleo final obtido seja de boa qualidade. (28) A valorização conseguida para estes bagaços de duas fases não chega a compensar os custos adicionais com este passo de secagem, pelo que se
0102030405060708090
100%
SC3F SC2F SDP
1998/19992004/2005
Capítulo 2
- 59 -
têm tentado encontrar alternativas para a sua reutilização e valorização. Após
a extracção de óleo do bagaço, resulta, como sub-produto deste processo, o
bagaço de azeitona extractado. Este sub-produto é frequentemente utilizado
como combustível devido ao seu elevado poder calorífico. (30) No entanto, a
Comissão Europeia tem sugerido a produção de concentrados de compostos
bioactivos a partir dos resíduos da extracção de azeite como alternativa
viável de valorização destes problemáticos sub-produtos. (31)
2.2.2 Processamento das MP para Obtenção de Extractos É para o composto alvo, presente nos concentrados bioactivos obtidos
através do referido processo, que se reivindicam muitas das propriedades
biológicas reclamadas para o azeite: o hidroxitirosol - 4-(2-Hidroxietil)-1,2-
benzenodiol (HT). As suas propriedades benéficas associam-se à sua
elevada capacidade antioxidante, determinada perante o radical peroxilo
(ROO•) (21200 ET/ga), cerca de duas vezes mais do que o determinado para
o chá verde. Na selecção das matérias-primas a utilizar no processo de
extracção, as águas ruças (AR) mostraram-se inicialmente bastante
promissoras, revelando concentrações elevadas de hidroxitirosol (Anexo A),
tendo sido os primeiros ensaios de produção do(s) extracto(s) bioactivo(s)
realizados com esta matriz. No entanto, tendo em conta toda a evolução do
sector olivícola referido no ponto 2.1.1 (tendência para processo de extracção
ser contínuo de duas fases), eliminaram-se, à partida, a utilização deste
resíduo, assim como o bagaço resultante do processo em contínuo de três
fases, para desenvolvimento destes concentrados naturais.
Assim, seleccionou-se como matéria-prima, o bagaço de duas fases húmido
(doravante designado por bagaço húmido - BH) e o bagaço após processo de
secagem (doravante designado por bagaço seco - BS).
O bagaço húmido apresenta na sua composição toda a fracção mineral e
orgânica do material vegetal do fruto. Na fracção orgânica é possível
identificar proteínas, açúcares, ácidos orgânicos, celulose, hemiceluloses,
pectinas, taninos e polifenóis. (29,32) Normalmente, como já referido
a Valor determinado no âmbito do trabalho apresentado nesta dissertação.
Capitulo 2
- 60 -
anteriormente, a concentração em fenóis simples, como o hidroxitirosol, varia
consoante o tipo de cultivar da azeitona, o ano de apanha da azeitona e o
seu grau de maturação, sendo possível encontrar bagaços com
aproximadamente 1 g/L em HT. (27,33)
O bagaço seco, como já referido anteriormente, passa por uma etapa
adicional, a secagem. Durante esta, a composição do bagaço húmido é
bastante alterada, os compostos fenólicos mais complexos sofrem hidrólise a
temperaturas elevadas, originando, dessa forma, monómeros fenólicos, tal
como o hidroxitirosol. Durante o processamento, ocorre também a
despolimerização dos polissacarídeos (principalmente hemiceluloses) e a
quebra das ligações de linhanos e hidratos de carbono, provocando, desse
modo, um aumento da solubilidade parcial de alguns compostos na água. (32)
Prepararam-se extractos aquosos das matrizes seleccionadas para efectuar
a caracterização dos compostos fenólicos, antes do seu processamento para
obtenção dos extractos naturais. A escolha das condições de operação das
extracções aquosas foi realizada anteriormente no âmbito do projecto
“Antioxidantes Naturais”. As condições óptimas seleccionadas foram razão 4
(m/m) matriz/solvente, agitação em reactor batch a 900 rpm durante 1 h e
separação dos sólidos efectuada por centrifugação (30 min a 9000 rpm, à
temperatura ambiente) e tiveram em conta as concentrações finais dos
compostos alvo (como por exemplo, hidroxitirosol, tirosol e ácido cafeíco),
água e energia dispendida. Esta mesma etapa de extracção aquosa, utilizada
para caracterização das matrizes seleccionadas, é o primeiro passo aplicado
no processo integrado de tecnologias limpas patenteado, utilizado para
obtenção dos extractos estudados neste capítulo.
Os compostos alvo são hidrofílicos e de baixo peso molecular, pelo que ao
seleccionar-se a água como solvente, efectuou-se uma primeira refi-
nação/separação dos compostos polifenólicos presentes no extracto final.
Este extracto final apresenta, na sua composição, monómeros fenólicos, não
existindo compostos fenólicos com dois ou mais aneis benzénicos, tais como
as quercetinas. Na Figura 2.10, destaca-se a estrutura molecular de alguns
dos compostos presentes nos extractos aquosos obtidos a partir do bagaço
húmido e a partir do bagaço seco.
Capítulo 2
- 61 -
Os compostos fenólicos foram identificados por HPLC acoplado a detector de
diodos (34)b com base nos seus tempos de retenção e espectros de absorção
a 280 nm. A comparação dos perfis cromatográficos obtidos para os
extractos aquosos elaborados a partir de bagaço húmido recolhido em
diferentes épocas de colheita é também apresentado na Figura 2.10. No
Anexo F, pode-se consultar a sobreposição do perfil cromatográfico dos
compostos puros utilizados como padrão, com o perfil cromatográfico de um
dos extractos seleccionados, assim como a comparação entre dois extractos
obtidos a partir de bagaço húmido.
Figura 2.10 Perfis cromatográficos determinados por HPLC-DAD a 280 nm dos extractos
aquosos obtidos a partir dos diferentes bagaços e identificação dos compostos fenólicos
indicados. A) Comparação dos extractos aquosos do BH e BS com as águas ruças (AR)
provenientes do processo descontinuo de extracção. B) Comparação dos extractos obtidos a
partir de bagaços húmidos de diferentes lagares: M1 (Moura0405); M2 (Moura0607); B1
(Brinches0506).
b A descrição detalhada do método de cromatografia encontra‐se no Anexo D.
1 Oleuropeina
3 Tirosol
2 Hidroxitirosol
4 Ácido Cafeico
5 Ácido p‐coumárico
AA
BB
23
4
15
1
5
4
2
3
BSBH
AR
M1
B1M2
1 Oleuropeina
3 Tirosol
2 Hidroxitirosol
4 Ácido Cafeico
5 Ácido p‐coumárico
AA
BB
23
4
15
1
5
4
2
3
1 Oleuropeina
3 Tirosol
2 Hidroxitirosol
4 Ácido Cafeico
5 Ácido p‐coumárico
AA
BB
23
4
15
1
5
4
2
3
BSBH
AR
M1
B1M2
Capitulo 2
- 62 -
Nos extractos obtidos, identificou-se a presença de compostos com dois
grupos hidroxilo localizados na posição orto do anel de benzeno (tal como no
hidroxitirosol e no ácido cafeíco), grupo que confere a estes compostos
fenólicos elevada actividade antioxidante. Foram também identificados
compostos só com um grupo hidroxilo, como o tirosol e ácido p-coumárico,
que apresentam valores inferiores de capacidade antioxidante.(35) O
isolamento dos compostos não foi o principal objectivo do processo de
extracção aplicado, devido ao efeito sinérgico positivo que estas moléculas
evidenciam potenciando as suas propriedades antioxidativas e biológicas. A
aplicação do processo integrado de tecnologias limpas a este tipo de
matrizes possibilitou a produção de extractos concentrados em compostos
fenólicos com menor peso molecular (fenóis simples e ácidos
hidrocinâmicos), de estrutura molecular similar à do hidroxitirosol e em
oligoelementos (ex. Mg, K, Ca).
Têm sido realizados vários estudos à escala laboratorial, no sentido de
desenvolver novos métodos de extracção de biofenóis a partir ou de folhas
de oliveira ou de bagaços de azeitona, nomeadamente hidroxitirosol. Muitos
desses métodos recorreram ao uso de solventes orgânicos, tais como
misturas metanol/água, acetato de etilo, propanol, acetona ou aceto-
nitrilo.(31,36) O crescente interesse nestes biofenóis está relacionado com as
suas possíveis aplicações no desenvolvimento de produtos para consumo
humano, (37) tais como alimentos funcionais e nutracêuticos, tornando-se
imperativo desenvolver métodos que recorram à utilização de solventes
menos tóxicos e considerados seguros para consumo humano (GRAS).
Como alternativa de processamento do bagaço húmido, tratamentos
hidrotérmicos, a partir deste resíduo,(38) foram também estudados para isolar
compostos de elevado valor acrescentado e, mais recentemente, foi também
proposta a extracção com líquidos (aquosos ou orgânicos) super-aquecidos a
alta pressão, mas sem atingir o ponto crítico do solvente. (37) Por sua vez, os processos de filtração com membranas, e a sua integração
com outros processos, como a centrifugação, têm vindo a ser aplicados por
Capítulo 2
- 63 -
vários grupos de investigação no tratamento de águas residuais provenientes
do processo de produção de azeite, para remoção de grande parte dos
sólidos e compostos orgânicos existentes. (39,40) O processo patenteado, utilizado para a obtenção dos extractos ricos em
biofenóis de seguida caracterizados, consiste na integração de uma etapa de
extracção com solventes biocompatíveis (água), seguida de fraccionamento
recorrendo à utilização de tecnologia de membranas. (19) Em anexo (Anexo
A), encontra-se mais sucintamente descrita a metodologia e tecnologia
patenteada, bem como outras combinações de processos aqui não
referenciadas. Na Figura 2.11 apresenta-se o esquema ilustrativo da
combinação de processos que pode ser usada na produção dos extractos
naturais.
Figura 2.11 Esquema Ilustrativo de sequência do processo desenvolvido para obtenção do
concentrado bioactivo.
De forma sucinta, o processo consiste num primeiro passo de extracção, com
água ou solventes biocompatíveis, das lamas e resíduos do processo de
produção de azeite (A e B), sendo que ao extracto resultante poder-se-ão
adicionar as águas ruças do processo de produção de azeite (C). A mistura
resultante é de seguida centrifugada (D) para remover os sólidos em
suspensão.
O passo de separação por membranas é constituído por nanofiltração (E),
onde se separam os compostos alvo dos restantes compostos, e osmose
inversa (F), onde se concentram estes mesmos compostos na corrente do
retido. Do passo de separação por membranas resulta uma corrente rica em
hidroxitirosol (G) e água que poderá ser reutilizada no processo (H).
Tendo em conta a matriz de origem e o processo de obtenção aplicado,
seleccionaram-se três extractos naturais distintos: um extracto obtido
Capitulo 2
- 64 -
imediatamente após a etapa D (centrifugação) e dois extractos obtidos após
todo o processo em cima descrito, obtidos na corrente G, da Figura 2.11. A
matriz utilizada para a produção do extracto obtido após centrifugação
(RSEV) foi o bagaço seco. Este extracto, RSEV, não foi processado através
da separação por membranas, sendo por isso mais rico em compostos de
maior peso molecular. Os dois extractos obtidos através do processo
integrado diferem na matriz de origem, sendo o EBH o extracto obtido a partir
do bagaço húmido e o EBS obtido a partir do bagaço seco.
Os perfis cromatográficos, apresentados na Figura 2.12, identificados por
HPLC-DAD a 280 nm, correspondem aos três extractos bioactivos
seleccionados.
Em todos os extractos o composto fenólico em maior concentração é o
hidroxitirosol (HT). No entanto, o EBH apresenta na sua composição ácido
cafeíco e ácido p-coumárico, dois importantes ácidos cinâmicos, enquanto
que no EBS estes compostos se encontram presentes em quantidades
inferiores, existindo na sua composição compostos com um maior tempo de
retenção (mais polares e de maior peso molecular). Não foi possível
identificar este composto por método de injecção de padrão.
Capítulo 2
- 65 -
Figura 2.12 Cromatogramas determinados por HPLC-DAD a 280 nm dos Extractos Bioactivos
finais obtidos a partir dos diferentes bagaços e identificação de compostos fenólicos alvo. A
comparação entre eles é apenas qualitativa devido aos diferentes teores de compostos fenólicos
e ao desfazamento temporal entre produção dos mesmos, as diluições efectuadas foram
diferentes.
A razão entre os ácidos cinâmicos, presentes no EBH, entre HT/ácidos
cinâmicos e HT/tirosol, manteve-se sempre constante para os bagaços
húmidos recolhidos a partir de
i) diferentes lagares no mesmo ano de colheita;
ii) mesmos lagares, anos distintos de colheita (Figura 2.13).
Os valores são apresentados em (valor médio da razão entre compostos
fenólicos) ± Desvio Padrão (DP).
1 Hidroxitirosol
3 Ácido Cafeico
4 Ácido p‐coumárico
2 Tirosol
EBHEBH
EBSEBS
RSEVRSEV
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
Capitulo 2
- 66 -
Figura 2.13 Variação das proporções dos compostos fenólicos existentes nos Extractos EBH
obtidos a partir de diferentes bagaços Húmidos. Mesmo ano de colheita e lagares de origem
diferentes (Brinches 04 e Moura 04); Anos de colheita diferentes e mesmo lagar de origem
(Brinches 04 e Brinches 05).
A- Proporções entre restantes compostos (Tir-tirosol; AC-ácido cafeico; p-coum-ácido p-
coumárico)
B - Proporções Hidroxitirosol e restantes compostos (Tir-tirosol; AC-ácido cafeico; p-coum-ácido
p-coumárico)
O extracto aquoso do bagaço húmido, obtido após a 1ª etapa do processo
(extracção aquosa seguida de centrifugação), a partir do qual se obtém o
EBH, é menos complexo do que as águas ruças, fazendo parte da sua
composição apenas compostos fenólicos e oligoelementos com afinidade
para a água. A vantagem da utilização deste extracto, como alimentação de
um processo de separação por membranas, em detrimento da utilização das
águas ruças, é a eliminação de alguns compostos fenólicos de maior peso
molecular e consequente concentração de compostos fenóis simples.
No EBS, as razões entre ácidos cinâmicos, HT/ácidos cinâmicos e HT/tirosol
são diferentes das calculadas para o EBH. Foi também identificado neste
extracto, ácido protocatechuico, composto fenólico com elevada capacidade
antioxidante associada.
Na composição do RSEV identificaram-se HT, tirosol, ácidos cinâmicos e
ácido protocatechuico, mas em menor concentração do que no EBS,
existindo também, em concentrações mais reduzidas, uma gama de
BEH (Brinches 04) BEH (Moura 04) BEH (Brinches 05)
Raz
ões
Com
post
os F
enól
icos
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0Tir/AC Tir/p-coum AC/p-coum
A
BEH (Brinches 04) BEH (Moura 04) BEH (Brinches 05)
Raz
ões
Com
post
os F
enól
icos
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18HT/Tir HT/AC HT/p-coum
B
BEH (Brinches 04) BEH (Moura 04) BEH (Brinches 05)
Raz
ões
Com
post
os F
enól
icos
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0Tir/AC Tir/p-coum AC/p-coum
A
BEH (Brinches 04) BEH (Moura 04) BEH (Brinches 05)
Raz
ões
Com
post
os F
enól
icos
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18HT/Tir HT/AC HT/p-coum
B
Capítulo 2
- 67 -
compostos de estrutura molecular mais complexa (detectada entre os 40 e 60
min de tempo de retenção por HPLC-DAD a 280 nm), na qual se incluem os
derivados secoiridoides do HT e tirosol. Tendo em conta a composição de
RSEV e EBS, é possível concluir que o primeiro é um extracto menos
“refinado”. Mesmo assim, o EBS é um extracto aquoso bastante menos
complexo do que as águas ruças ou do que o extracto aquoso obtido nas
mesmas condições a partir do bagaço húmido (ver Figura 2.10). O processo
de separação por membranas também garante a remoção de pesticidas, tais
como, PCB’s e PHA’s, que possam existir nos extractos aquosos.
Os extractos EBH, EBS e RSEV, seleccionados para o estudo de formulação
de um óleo alimentar funcional, foram caracterizados em termos de
compostos fenólicos, capacidade antioxidante in vitro e potencial actividade
biológica. Na secção 2.2.3 apresentam-se todos os métodos utilizados na
caracterização dos extractos e no sub-capítulo 2.3 são apresentados os
ensaios de bioactividade realizados com os extractos em estudo.
2.2.3 Caracterização dos Extractos Bioactivos
Na sequência de formular o melhor óleo funcional, os extractos EBH, EBS e
RSEV foram caracterizados em termos de conteúdo total de polifenóis,
identificação e quantificação dos compostos de maior relevância
(hidroxitirosol, tirosol), conteúdo total de proteína e avaliação da capacidade
antioxidante.
A tabela seguinte (Tabela 2.6) sumariza os métodos utilizados na
determinação de cada parâmetro químico para os vários extractos em
estudo.
Capitulo 2
- 68 -
Tabela 2.6. Métodos e unidades utilizadas para caracterização dos extractos desenvolvidos.
Método Unidades
Actividade Antioxidante
Radical Hidroxilo EPR
HORAC*
% inibição
(CAAC)
Radical Peroxilo ORAC
oxLDL
(CAET)
% Inibição
Polifenóis Totais Folin-Ciocalteau mgEAG/L
Identificação e quantificação de compostos
HPLC-DAD-ED mAU
Proteína Total Bradford mgBSA/L
* HORAC apenas efectuado para dois extractos, EBS e RSEV.
No Anexo D, encontram-se mais sucintamente descritos os métodos
utilizados na caracterização química dos extractos bioactivos.
Determinação de Polifenóis Totais
A quantidade total de compostos fenólicos foi determinada utilizando uma
versão modificada do método colorimétrico de Folin-Ciocalteu (RFC), descrita
por Singleton et al. (41) Este método baseia-se na capacidade dos compostos
fenólicos presentes na amostra reduzirem o reagente de Folin-Ciocalteu em
condições básicas, durante 30 min a 40 ºC. Durante o tempo da reacção,
ocorre a dissociação de protões dos compostos fenólicos que levam à
formação do anião fenolato, o qual é capaz de reduzir os compostos
presentes no reagente de RFC, alterando a cor dos mesmos para azul (42). A
absorvância das soluções é de seguida medida a 765 nm num
espectrofotómetro Thermo Spectronic, Genesys 10uv.O ácido gálico é
utilizado como padrão, sendo os resultados obtidos expressos em miligramas
de equivalentes de ácido gálico (EAG) por mL de extracto analisado.
Os resultados de conteúdo total em compostos fenólicos, para os três
extractos estudados, apresentam-se graficamente na Figura 2.18 e em tabela
no Anexo D (Tabela D1). Os valores apresentados são a média de (n≥6)
ensaios independentes ± DP.
Capítulo 2
- 69 -
Actividade Antioxidante Como referido anteriormente (Capítulo 1), a capacidade antioxidante dos
extractos naturais depende das sinergias existentes entre os diferentes
compostos presentes na complexa mistura. É assim perceptivel que podem
existir diferentes mecanismos de actuação sobre os radicais livres, num
mesmo extracto,(43) tornando-se, desta forma, fundamental a combinação de
mais do que dois métodos de determinação da capacidade antioxidante in
vitro. A combinação de mais do que um método é, assim, fundamental para
conseguir reunir dados suficientes, importantes para definir a capacidade
antioxidante total de uma amostra.(44) A avaliação da capacidade antioxidante
dos extractos bioactivos desenvolvidos recaiu na avaliação de:
a) Capacidade de resgate do radical livre ROO•
b) Capacidade de inibição de produção do radical HO•
A capacidade de resgate do radical ROO• foi determinada pelo método de
ORAC (Oxygen Radical Absorbance) e pelo ensaio de Inibição de
Autooxidação Lipidica Induzida (LDL). Em ambos os ensaios mede-se a
capacidade que determinados compostos presentes na amostra, têm em
doar um átomo de hidrogénio à espécie reactiva. Estes métodos inserem-se
no grupo de ensaios já anteriormente referidos (Capitulo 1), HAT (Hydrogen
Atom Transfer), como sendo os mais relevantes na avaliação da influência
dos antioxidantes na quebra das reacções radicalares, que ocorrem in vivo. (45)
A capacidade dos mesmos extractos em inibir a produção e/ou resgatar o
radical HO• foi quantificada através do método de HORAC (Hydroxyl Radical
Averting Capacity) e Ressonância Electro Paramagnética (EPR).
a) Capacidade de resgate do radical livre ROO•
Capitulo 2
- 70 -
O radical ROO• é um radical chave, participante no mecanismo de oxidação
lipídica, quer de alimentos, quer em sistemas biológicos, não sendo
conhecidos mecanismos intrínsecos de defesa para combater o seu ataque.
É por isso importante, o estudo de agentes externos que possam inibir a sua
acção, dado que participa em diversas patogenesis. Devido à sua
importância e ao facto de que recorrendo a qualquer composto azo se
consegue gerar o radical, é na actualidade a espécie reactiva mais utilizada
nos diversos ensaios implementados para quantificação de capacidade
antioxidante. (45)
Método ORAC(46)
O método de ORAC (Oxygen Radical Absorbance) mede a capacidade
antioxidante de resgate do radical peroxilo produzido pelo 2,2-azobis(2-
amidinopropano) dihidroclorado (AAPH) a 37 ºC. Recorrendo a um fluorófero
que oxida na presença do AAPH, acompanhando a cinética da reacção,
mede-se a redução na fluorescência da solução e monitoriza-se a
capacidade protectora dos antioxidantes testados.
Na Figura 2.14, encontram-se esquematizados as reacções que ocorrem
durante o ensaio de ORAC.
Figura 2.14 Esquema de reacções elementares ocorridas no ensaio de ORAC. O AAPH, por
termodegradação, produz os radicais peroxilo que reagem com a Fluoresceína (FLH). Na
presença de um antioxidante, AH, este resgata o radical, dando origem a compostos não
reactivos, ROOH e ROOA.
Recorrendo a uma modificação deste método, (47,48) (descrito mais
sucintamente no Anexo D), avaliou-se a capacidade de certos compostos
presentes nos extractos bioactivos resgatarem o radical peroxilo e
consequentemente inibirem a oxidação da fluoresceína (fluorófero utilizado).
Os valores de actividade antioxidante são calculados a partir da perda de
ROO• + FLH
ROOH + FL•
AAPHAH
ROO• + AH ROOH + A•
A• + ROO• ROOAROO• + FLH
ROOH + FL•
AAPHAH
ROO• + AH ROOH + A•
A• + ROO• ROOA
Capítulo 2
- 71 -
fluorescência da fluoresceína ao longo de 30 min relativamente a um
antioxidante padrão - Trolox (análogo hidrofílico da vitamina E). O resultado
final é expresso em termos de actividade antioxidante equivalente ao Trolox
(CAET- Capacidade Antioxidante em Equivalentes de Trolox) - micromolar
CAET (μM CAET).
Os valores determinados para os extractos bioactivos e para uma solução
standard de HT (650 μM) apresentam-se na Figura 2.18 e em anexo na
Tabela D1.
Inibição de Autooxidação Lipídica Induzida (LDL) Os compostos fenólicos de origem vegetal, com elevada actividade
antioxidante, têm sido relacionados com a capacidade de proteger a oxidação
da Lipoproteína de baixa densidade (LDL). Os efeitos da forma oxidada da
LDL estão relacionados com a maioria das alterações observadas no
mecanismo de desenvolvimento da aterosclerose. Devido a esta correlação,
a comunidade científica tem atribuido a estes compostos fenólicos a
propriedade de prevenirem doenças cardiovasculares.
A avaliação da capacidade dos extractos bioactivos na protecção da
oxidação da LDL in vitro foi efectuada através da monitorização da formação
de dienos conjugados ao longo de oito horas a 37 ºC por espectrofotometria
UV a 234 nm. (49) O controlo do ensaio é determinado a partir da incubação
da lipoproteína com um agente oxidante (AAPH - gerador de radicais
peroxilo) e os ensaios com os antioxidantes determinado a partir da
incubação da lipoproteína com um agente oxidante (AAPH) e 10 μL de
amostra. Dado que nestes ensaios a inclinação da curva da fase de latência
e andamento da oxidação depende da concentração de antioxidante em
contacto com a lipoproteína, (45) todos os ensaios com os extractos bioactivos
foram realizados tendo a mesma concentração final em HT em contacto com
a LDL (0,4μM) nas quatro situações: EBS, RSEV, EBH e HT. A capacidade
de cada extracto (composto) em inibir a oxidação da LDL é determinada pelo
prolongamento da fase de latência relativamente ao controlo (LDL+AAPH). A
Capitulo 2
- 72 -
fase de latência é o tempo durante o qual o antioxidante pode exercer efeito
antes de se iniciar a oxidação.(44)
Na Figura 2.15, apresenta-se um exemplo da cinética da oxidação da
lipoproteína quando na presença ou não dos extractos ou hidroxitirosol.
Figura 2.15 Perfil da cinética de oxidação da LDL: na presença de i) AAPH (controlo), ii) EBH e
iii) Hidroxitirosol (HT). A capacidade de protecção da oxidação reflecte-se pelo aumento do
tempo da fase de latência. A- Exemplo da cinética obtida nos ensaios realizados com os
extractos e hidroxitirosol com concentração 0,4 μM em HT. As setas indicam o final da fase de
latência e início da oxidação da LDL. B – Influência da concentração de HT na capacidade de
protecção contra a oxidação da LDL – Dependência da dose. Nas concentrações mais elevadas
não se verifica início da oxidação durante as 8 h de ensaio.
Os resultados finais apresentam-se na Figura 2.18 e estão expressos em
percentagem (%) de inibição da oxidação da lipoproteína. Este método
encontra-se descrito de forma mais detalhada no Anexo D.
b) Capacidade de inibição de produção do radical HO•
O radical hidroxilo, tal como o peroxilo, fazem parte de um conjunto de
principais radicais livres desencadeadores de stress oxidativo celular. O
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH, 2.4uM HTEBH, 0.12uM HTEBH, 0.8uM HTHT, 3.5uMControlo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
A
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH, 2.4uM HTEBH, 0.12uM HTEBH, 0.8uM HTHT, 3.5uMControlo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
A
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH, 2.4uM HTEBH, 0.12uM HTEBH, 0.8uM HTHT, 3.5uMControlo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH, 2.4uM HTEBH, 0.12uM HTEBH, 0.8uM HTHT, 3.5uMControlo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
A
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH, 2.4uM HTEBH, 0.12uM HTEBH, 0.8uM HTHT, 3.5uMControlo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH, 2.4uM HTEBH, 0.12uM HTEBH, 0.8uM HTHT, 3.5uMControlo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
t (min)
Abs
(234
nm
)
EBH
Controlo
Hidroxitirosol
A
B
Capítulo 2
- 73 -
stress oxidativo produzido por radicais livres está associado a múltiplas
doenças, tais como doenças cardiovasculares, vários tipos de cancro,
doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer e Parkinsson e
envelhecimento celular. (4) Tal como para o radical peroxilo, não se conhece
a existência de antioxidantes enzimáticos (ex. Superoxide Dismutase -SOD)
que inibam a acção destes nefastos radicais. Biologicamente, sabe-se que os
compostos metais-quelantes desactivam metais de transição participantes na
reacção com o peróxido de hidrogénio, não havendo assim formação de
espécies reactivas de oxigénio (ROS), tal como o HO•.(50) Uma das condições
para se gerar radicais hidroxilo é a presença em simultâneo de iões metálicos
oxidantes e peróxido de hidrogénio (reacção de Fenton). (45) O reagente de
Fenton (mistura de H2O2 e sais ferrosos) é um oxidante efectivo para muitos
dos substratos orgânicos, sendo os mecanismos exactos envolvidos na
reacção de Fenton (ou “tipo-Fenton”) extremamente complexos. Como tal,
não existem respostas para a total inibição ou produção deste tipo radicais
HO•.(51) De facto, medir quantitativamente a capacidade de resgate desta
espécie reactiva é uma tarefa árdua devido à dificuldade de controlar a sua
geração/produção.
No trabalho apresentado, a capacidade de resgate/inibição de geração dos
radicais HO• foi quantificada recorrendo a duas técnicas distintas, mas que se
complementam.
Método por EPR - Electron Spin Ressonance Spectroscopy.
A inibição da produção deste radical relaciona-se com a capacidade dos
antioxidantes em quelar iões metálicos intervenientes na geração do radical
em questão. No entanto, os antioxidantes podem também ter capacidade de
doar o seu átomo de hidrogénio, resgatando o radical, não se sabendo bem
qual a actuação exacta devido à complexidade das reacções integrantes da
reacção de Fenton (ou “Tipo Fenton”). Uma outra situação, é o facto de não
se ter a certeza do sucesso de produção dos radicais pretendidos, já que HO
é uma espécie intermédia das reacções e bastante instável. A ressonância
electro paramagnética (EPR) é uma técnica é bastante útil para detectar
Capitulo 2
- 74 -
espécies reactivas de oxigenio em vários sistemas, providenciando uma
quantificação directa. (52)
O método EPR detecta a presença de electrões desenparelhados, (42) pelo
que, dessa forma, é possível comprovar a formação dos radicais,
acompanhando o espectro de um radical mais estável, formado entre um
composto paramagnético (spin trap) e o radical hidroxilo. (53)
O ensaio consiste, assim, na geração do referido radical através da reacção
de Fenton:
Fe2++H2O2 Fe3++OH-+HO (eq 2.1)
Posteriormente, adicionam-se os extractos/compostos a analisar (método
descrito no Anexo D) e, através de espectroscopia de ressonância
electroparamagnética, adquire-se o espectro dos radicais gerados.
Na Figura 2.9, apresenta-se o exemplo do espectro associado ao radical HO•,
sem adição de nenhum agente inibidor.
Figura 2.9. Espectro do radical hidroxilo detectado por EPR.
A capacidade antioxidante é avaliada pelo decréscimo/anulação do espectro
do radical. Na Figura 2.18, estão representados os valores obtidos para os 3
extractos bioactivos e para o HT (solução standard 650 μM), expressos em
termos de percentagem da capacidade de resgate/inibição do radical
hidroxilo. Na Tabela D1 (Anexo D), estão os valores apresentados em tabela.
Capítulo 2
- 75 -
HORAC (50)
O método de HORAC (Hydroxyl Radical Averting Capacity) quantifica a
capacidade dos extractos bioactivos em quelar iões metálicos reactivos,
catalisadores de reacções de oxidação. De forma indirecta, relacionando a
actividade como agentes quelantes, com a não geração de radicais hidroxilo,
é possível determinar a capacidade dos extractos em inibir a formação desta
espécie reactiva.
Neste método, inicia-se uma reacção “Tipo Fenton” entre um metal (Co(II)) e
peróxido de hidrogénio que, ao formarem espécies intermédias reactivas,
oxidam o fluorófero com o qual entram em contacto (consultar Anexo D).
Neste trabalho, o fluorófero escolhido para optimização do método foi a
fluoresceína, que na sua forma oxidada se torna incolor. Tal como no método
de ORAC, é possível acompanhar a cinética da reacção medindo a redução
da fluorescência da solução e, dessa forma, quantificar a capacidade
protectora dos antioxidantes testados.
Na Figura 2.17, encontram-se esquematizadas as reacções que podem
ocorrer durante o ensaio de HORAC.
Figura 2.17 Esquema da reacção do peróxido de
hidrogénio (H2O2) em presença de iões metálicos (M).
A reacção gera o radical hidroxil HO . Este radical é
bastante reactivo e ao reagir com espécies
antioxidantes (R-H) capta um hidrogénio originando
uma espécie com um electrão desemparelhado (R ).
Por sua vez esta espécie reage com o O2 molecular
formando o radical peroxilo ROO . Fonte: Ou et al,
2002. (50)
Seleccionou-se, após optimização do método, o ácido cafeíco como
composto fenólico padrão, pelo que, em cada ensaio, é necessário efectuar
uma recta de calibração com soluções padrão de ácido cafeíco. Os
resultados finais de HORAC são calculados através da regressão linear entre
os valores de concentração de ácido cafeíco e a área da curva de
decaímento da fluoresceína, sendo expressos em equivalentes de Ácido
Cafeíco (Capacidade Antioxidante Equivalentes ácido cafeico – μM CAAC).
Capitulo 2
- 76 -
Na Figura 2.18, só se apresentam valores de HORAC para o RSEV e EBS,
pois o método foi implementado numa última fase do trabalho, não sendo
possível obter matéria-prima (bagaço húmido) para processar e produzir
EBH. Os resultados apresentados são a média de três ensaios
independentes (n=3) ± DP.
Método de Identificação e Quantificação Analítica
O perfil cromatográfico dos compostos fenólicos, dos extractos bioactivos
desenvolvidos e dos extractos realizados para estudo das matérias-primas,
foram obtidos por HPLC acoplado a um detector de díodos (Surveyor,
Thermo Finnigan, San Jose, C.A., USA). O método utilizado foi desenvolvido
de acordo com trabalhos prévios realizados no laboratório. (34,54) Em
situações específicas foi acoplado, em série, ao HPLC-DAD, um detector
electroquímico (ED) para confirmação da presença de HT.
Os compostos fenólicos mais relevantes, e seleccionados como compostos
alvo, foram quantificados recorrendo a um software de aquisição e tratamento
de dados: Chromquest (versão 4.0 – ThermoFinnigan, Surveyor, San Jose,
C.A. USA).
O erro calculado para o método desenvolvido foi de 5%.
As concentrações de hidroxitirosol e de tirosol, expressas em ppm (mg/L),
dos extractos bioactivos, EBS, RSEV e EBH apresentam-se na Figura 2.18 e
em anexo (Anexo D), na Tabela D1.
Método de Quantificação de Proteína
A quantificação de proteína foi realizada através do método de Bradford, (55)
método colorimétrico baseado no pressuposto de que o máximo de absorção
do Brilliant Blue G-250, quando ligado a proteínas em solução ácida, passa
de 465 para 565 nm. A forma aniónica do composto colorado é estabilizada
por interacções hidrofóbicas e iónicas, sendo possível observar a mudança
de côr da solução.
A albumina foi a proteína seleccionada para a elaboração da recta de
calibração, sendo os resultados finais expressos em mgalbumina/L (mgBSA)/L.
Capítulo 2
- 77 -
Resultados & Discussão
Os resultados obtidos apresentam-se graficamente em seguida, na Figura
2.18.
Figura 2.18 Caracterização Química dos Extractos Bioactivos. Os valores apresentados são a
média n>3 ensaios e o desvio padrão é representado pelas barras de erro.
QuantificaQuantificaçção de ão de HidroxitirosolHidroxitirosolPolifenoisPolifenois Totais Totais ––MMéétodo todo FolinFolin‐‐CiocalteauCiocalteau
QuantificaQuantificaçção de ão de TirosolTirosolQuantificaQuantificaçção de Proteão de Proteíína Totalna TotalMMéétodo de todo de BradfordBradford
0100200300400500600700
EBS RSEV EBH
mg
BSA
/L
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
EBS RSEV EBH
(x10
3)m
gEA
G/L
0%
20%
40%
60%
80%
100%
EBS RSEV EBH
% H
T no
tota
l de
polif
enoi
s do
s E
xtra
ctos
[HT] mgEAG/L
0%
20%
40%
60%
80%
100%
EBS RSEV EBH
% T
ir no
tota
l de
polif
enoi
s do
s E
xtra
ctos
[Tir] mgEAG/L
QuantificaQuantificaçção de ão de HidroxitirosolHidroxitirosolPolifenoisPolifenois Totais Totais ––MMéétodo todo FolinFolin‐‐CiocalteauCiocalteau
QuantificaQuantificaçção de ão de TirosolTirosolQuantificaQuantificaçção de Proteão de Proteíína Totalna TotalMMéétodo de todo de BradfordBradford
0100200300400500600700
EBS RSEV EBH
mg
BSA
/L
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
EBS RSEV EBH
(x10
3)m
gEA
G/L
0%
20%
40%
60%
80%
100%
EBS RSEV EBH
% H
T no
tota
l de
polif
enoi
s do
s E
xtra
ctos
[HT] mgEAG/L
0%
20%
40%
60%
80%
100%
EBS RSEV EBH
% T
ir no
tota
l de
polif
enoi
s do
s E
xtra
ctos
[Tir] mgEAG/L
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante –– Radical Radical PeroxiloPeroxiloMMéétodo ORACtodo ORAC
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante –– Radical HidroxiloRadical HidroxiloMMéétodo EPRtodo EPR
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante –– Radical HidroxiloRadical HidroxiloMMéétodo HORACtodo HORAC
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante InibiInibiçção da Oxidaão da Oxidaçção da LDLão da LDL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EBS RSEV EBH HT 650uM0
20
40
60
80
100
EBS RSEV EBH HT 650uM
% C
apac
idad
e R
esga
te d
o R
adic
al O
H.
0
2
4
6
EBS RSEV EBH HT 650uM
(x10
4 ) mM
CA
ET
0
1
2
EBS RSEV
(x10
4 ) mM
CA
AC
01020304050607080
EBS RSEV EBH HT% A
umen
to T
empo
Lat
ênci
a da
LDL
na O
xida
ção
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante –– Radical Radical PeroxiloPeroxiloMMéétodo ORACtodo ORAC
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante –– Radical HidroxiloRadical HidroxiloMMéétodo EPRtodo EPR
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante –– Radical HidroxiloRadical HidroxiloMMéétodo HORACtodo HORAC
Actividade Antioxidante Actividade Antioxidante InibiInibiçção da Oxidaão da Oxidaçção da LDLão da LDL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EBS RSEV EBH HT 650uM0
20
40
60
80
100
EBS RSEV EBH HT 650uM
% C
apac
idad
e R
esga
te d
o R
adic
al O
H.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EBS RSEV EBH HT 650uM0
20
40
60
80
100
EBS RSEV EBH HT 650uM
% C
apac
idad
e R
esga
te d
o R
adic
al O
H.
0
2
4
6
EBS RSEV EBH HT 650uM
(x10
4 ) mM
CA
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0
1
2
EBS RSEV
(x10
4 ) mM
CA
AC
01020304050607080
EBS RSEV EBH HT% A
umen
to T
empo
Lat
ênci
a da
LDL
na O
xida
ção
Capitulo 2
- 78 -
Inibição do radical hidroxilo, HO
De acordo com os resultados apresentados, a quantificação da
inibição/resgate do radical hidroxilo pelo método de EPR não é
correlacionável com os valores determinados pelo método de HORAC. Pelo
determinado por este último método, o RSEV apresenta maior valor de
capacidade antioxidante (expressa em equivalentes de ácido cafeíco) do que
o extracto bioactivo EBS. No entanto, pelo método de EPR é o RSEV que
apresenta a menor capacidade de inibição do radical hidroxilo. Estes
resultados podem estar relacionados com o facto de o RSEV ser o único
extracto testado que na sua composição apresenta compostos fenólicos de
maior peso molecular, nomeadamente flavonóides, flavonas e fenóis
glucosidados. Estes compostos, devido à sua estrutura molecular,
apresentam valores de HORAC mais elevados, enquanto os ácidos fenólicos,
constituintes maioritários de EBS e EBH, são o grupo de compostos fenólicos
com valores de HORAC mais reduzidos. (50) Uma das hipóteses apresentada
na literatura, para este facto, relaciona-se com a coordenação dos grupos HO
dos compostos fenólicos, que, ao bloquearem os pontos reaccionais do
peróxido de hidrogénio, agem como quelantes metálicos, (50) tendo já sido
demonstradas as capacidades quelantes de vários compostos fenólicos,
nomeadamente HT e seus derivados, quando na presença de determinados
iões metálicos.(56) O facto do EBS apresentar um valor mais elevado de EPR
e mais baixo de HORAC, relaciona-se com o que se está a monitorizar no
ensaio de EPR, isto é, neste método monitoriza-se a diminuição dos radicais
HO gerados, enquanto no HORAC, em primeiro lugar, mede-se a
capacidade de quelar e inactivar os iões metálicos que desencadeiam a
reacção de decréscimo da fluoresceína, podendo não estar a ser quantificado
o resgate do radical (ver Figura 2.17). No ensaio de EPR, verifica-se que o
composto puro, numa concentração inferior à dos extractos testados (650 μM
– 100mg/L HT), apresenta somente metade do valor da capacidade de
inibição do radical HO , evidenciando sinergias negativas nos extractos
bioactivos. Estas sinergias negativas podem estar relacionadas com a
existência de iões metálicos nos extractos, que catalisam a geração de
Capítulo 2
- 79 -
radicais hidroxilo, em simultâneo à inibição imposta pelos compostos
fenólicos. No EPR, para o RSEV e EBS, a resposta é dependente da dose de
HT, não se verificando esta dependência para o EBH. Pode-se assim prever
que os extractos resultantes do bagaço seco serão mais concentrados em
iões metálicos agindo como catalisadores do radical HO .
Inibição do radical peroxilo, ROO
A inibição da oxidação da LDL com HT puro, como reportado na literatura, (57)
é dependente da dose testada. Nos ensaios com os extractos naturais,
verificou-se também a dependência da dose em função da concentração de
HT (Figura 2.9). Ao comparar-se a capacidade de inibição dos extractos
bioactivos com HT puro, verifica-se que este último apresenta uma melhor
resposta (68,7 % de aumento da fase de latência) do que EBS, EBH e RSEV.
Dos extractos bioactivos testados, o EBH foi o que apresentou melhor
capacidade de inibição da LDL, com um valor de 66,7 % de aumento da fase
de latência, resultado semelhante ao valor obtido para o HT em igual
concentração. Este resultado indica que neste processo de oxidação lipídica,
induzida pela presença de radicais peroxilo, a capacidade de resgate do
mesmo realciona-se com o HT presente no extracto, não se verificando um
aumento da actividade devido à junção de sinergias positivas existentes entre
os compostos fenólicos constituintes de EBH. Devido ao processamento
destes extractos, estes são ricos em sais minerais e oligoelementos. Sendo
assim, os extractos podem conter, na sua composição, metais que induzem,
por si só, a autooxidação lipídica, dificultando a acção dos compostos
fenólicos. Este facto ajuda a interpretar os resultados obtidos: EBS e RSEV
têm origem na mesma matéria-prima, que, por se encontrar já seca, é mais
concentrada em compostos minerais e oligoelementos, nomeadamente
metais, do que o bagaço húmido que dá origem a EBH. Como se sabe, EBS
é um concentrado de compostos de baixo peso molecular do RSEV, sendo,
por isso, respectivamente mais concentrado em metais que induzem a
oxidação lipídica. Desta forma, RSEV e EBH são menos concentrados
(EBH<RSEV) nestes compostos indutores da oxidação, pelo que se justifica
a capacidade de inibição da oxidação da LDL ser mais elevada no extracto
Capitulo 2
- 80 -
bioactivo do resíduo húmido, EBH. Devido a estes factos, os resultados
obtidos para a capacidade de inibição de autooxidação induzida da LDL não
se correlacionam com os resultados obtidos no ensaio de ORAC. No ensaio
de ORAC, os resultados apresentam uma tendência de aumento em função
da dose de HT, não sendo esse aumento estatisticamente significativo.
Os resultados reforçam a justificação encontrada para a inibição do radical
hidroxilo: os extractos EBS e RSEV são concentrados em iões metálicos que
interferem nas reacções de oxidação potenciando sinergias negativas.
Deve ainda referir-se que os ensaios realizados para avaliação da
capacidade antioxidante dos extractos se baseiam em reacções químicas
que tentam representar e prever comportamentos in vivo. Apesar de alguns
destes ensaios serem bastante relevantes a nível biológico, é importante
complementar os resultados com ensaios a nível celular (sub-capítulo 2.3).
2.2.4 Breve Estudo de Tratamentos Alternativos às MP
As matéria-primas (bagaços de azeitona), utilizadas para obtenção dos
extractos bioactivos estudados, são produtos irregulares em termos de
composição fenólica, variando de ano para ano e de lagar para lagar. Essa
irregularidade deve-se a inúmeros factores não controláveis, tais como
condições climatéricas, composição mineral do solo, estado de maturação e
tipo de cultivar da azeitona, levando a uma não uniformização da composição
dos concentrados bioactivos obtidos no final do processo de extracção.
Uma das formas para tentar ultrapassar este problema é recorrer ao controlo
de armazenamento/processamento das matérias-primas (MP) antes do
processo de produção dos extractos.
A acidificação das matrizes é um dos processos mais aplicados no
armazenamento destas matérias-primas tendo como objectivo favorecer
reacções de hidrólise entre os compostos fenólicos, aumentando, dessa
forma, a concentração em hidroxitirosol. Trabalhos realizados fora do âmbito
Capítulo 2
- 81 -
da tese, onde se acidificou bagaço húmido antes deste ser processado,
levaram a concluir que este passo diminui a bioactividade final do extracto
obtido. Para além disso, a adição de um ácido não se enquadra na definição
de “natural” e de processo sem adição de químicos, que se atribui a estes
extractos.
No sentido de encontrar alternativas de controlo da MP, de forma a
uniformizar a sua composição fenólica e por sua vez a dos extractos naturais
obtidos, realizaram-se dois estudos preliminares de tratamentos aplicados a
estas matrizes (bagaços).
Os métodos estudados são considerados alternativas de processamento aos
métodos mais convencionais, com interesse em explorar, para avaliar a sua
viabilidade como tratamentos rápidos das matrizes antes do início do
processo de produção dos extractos.
Dois tipos de processo foram explorados:
i) acondicionamento das matrizes, por um período máximo de sete
dias, em atmosfera de CO2 pressurizado a 100 bar;
ii) tratamentos hidrotérmicos a 50 ºC, 100 ºC e 150 ºC por um período
máximo de 15 min.
2.2.4.1 Tratamento da MP com CO2
O CO2 existe abundantemente na natureza, apresentando um valor limite à
temperatura ambiente de exposição à inalação de 5000 ppm. Estudos
demonstraram que é possível um trabalhador estar repetidamente exposto a
esta concentração sem sofrer efeitos adversos. Para além disso, não sendo
inflamável e sendo bastante menos tóxico que solventes orgânicos como a
acetona, a sua manipulação é considerada segura. Devido ao seu baixo valor
de toxicidade e à elevada pressão de vapor que este composto apresenta,
nenhum resíduo tóxico ficará presente no substrato onde pode actuar. Este
facto torna-o indicado para trabalhar em alimentos ou em algo que seja para
consumo humano.
Capitulo 2
- 82 -
A pressões moderadas (≤ 100bar), o CO2 dissolve rapidamente na água,
formando H2CO3. Esta reacção conduz a reduções drásticas de pH do meio,
podendo condicionar o ambiente e o substrato em contacto com este
composto.
O ensaio de armazenamento foi realizado à temperatura ambiente.
O esquema da instalação de alta pressão, onde se realizaram os ensaios,
apresenta-se de seguida na Figura 2.19:
Figura 2.19 Esquema da instalação de alta pressão utilizada nos ensaios de tratamento prévio
da MP com CO2. 1) banho de água, 2) célula de alta pressão, 3) vaso de recolha para
despressurização.
O dióxido de carbono é liquifeito, por redução da temperatura à saida da
garrafa, e pressurizado lentamente por uma bomba de líquidos até à pressão
de 10 MPa. O CO2 pressurizado lentamente vai-se difundindo na matriz que
se encontra no interior da célula de aço inoxidável (2). A instalação
permanece à temperatura ambiente durante um, dois, três ou sete dias. Os
ensaios foram realizados para bagaço húmido e para bagaço seco.
No interior da célula de aço, colocou-se para cada ensaio, 4 g de bagaço
seco e 7 g de bagaço húmido. A diferença de peso deve-se ao facto de o
bagaço húmido apresentar um teor em água de 65 %. A célula de aço
utilizada tem um volume interno de 15 mL.
Após cada ensaio, o reactor foi despressurizado e a extracção aquosa do
bagaço submetido ao armazenamento efectuada. As condições operatórias
da extracção aquosa foram as mesmas do processo já descrito: Razão 4
(m/m) matriz/solvente, agitação a 900 rpm durante 1 h e separação dos
P
2
13
P
2
13
Capítulo 2
- 83 -
sólidos efectuada por centrifugação (30 min a 9000 rpm). Os extractos
aquosos obtidos foram de seguida caracterizados em termos de teor de
polifenóis totais (mgEAG/gmatriz), capacidade antioxidante perante o radical
peroxilo (ORAC – μmol/gmatriz CAET) e o seu perfil polifenólico determinado
por HPLC-DAD (Anexo E), tendo sido o hidroxitirosol e o tirosol quantificados
(ppm).
As amostras da depressurização de CO2 em etanol foram analisadas por
HPLC-DAD (Anexo E), confirmando-se que nenhum composto fenólico foi
arrastado pelo gás.
Os resultados determinados são apresentados graficamente nas figuras 2.20
e 2.21. Os resultados de polifenóis totais e capacidade antioxidante são a
média de (n=3) ensaios independentes e expresso em mgEAG/gmatriz ± DP
(desvio padrão) e μmol/gmatriz CAET ± DP, respectivamente.
Capitulo 2
- 84 -
Figura 2.20 Valores obtidos para o tratamento do bagaço húmido com CO2. A-
Comparação da evolução da concentração em hidroxitirosol e tirosol (mg/gmatriz ) com a
variação da quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) ao longo dos sete dias de
tratamento. B- Comparação da variação da quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) com
a capacidade antioxidante (μmol/gmatriz CAET) dos extractos obtidos a partir dos bagaços
tratados, ao longo dos sete dias de tratamento.
Figura 2.21 Valores obtidos para o tratamento do bagaço seco com CO2. A- Comparação
da evolução da concentração em hidroxitirosol e tirosol (mg/gmatriz ) com a variação da
quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) ao longo dos sete dias de tratamento. B-
Comparação da variação da quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) com a capacidade
antioxidante (μmol/gmatriz CAET) dos extractos obtidos a partir dos bagaços tratados, ao longo
dos sete dias de tratamento.
0
1
2
3
4
5
6
7
BH 1dia BH 2dia BH 3dia BH 7dia
mgE
AG
/gm
atriz
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
μmol
CA
ET/
gmat
riz
mgEAG/gumol CAET/g
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
BH 1dia BH 2dia BH 3dia BH 7dia
mg/
gmat
riz
0
1
2
3
4
5
6
7HT (mg/g)Tir (mg/g)mgEAG/g
A B
A B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
BS 1dia BS 2dia BS 3dia
mg/
gmat
riz
0
2
4
6
8
10
12
14HT (mg/g)Tir (mg/g)mgEAG/g
0
2
4
6
8
10
12
14
BS 1dia BS 2dia BS 3dia
mgE
AG
/gm
atriz
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
μmol
CA
ET/
gmat
riz
mgEAG/gumol CAET/g
Capítulo 2
- 85 -
Discussão
O tratamento de CO2 aplicado a ambos os resíduos provocou um aumento na
concentração de tirosol com respectivo aumento da quantidade total de
polifenóis e da capacidade antioxidante. No entanto, em relação à
concentração de hidroxitirosol, este aumento só foi notório no bagaço seco,
onde a sua concentração inicial era já no início mais elevada. No bagaço
húmido, onde não se detectava HT acima de 0,2 ppm, não se verificou
nenhum aumento deste composto durante os dias de ensaios testados,
verificando-se aumento da concentração de tirosol ao longo dos dias de
tratamento. Esse aumento pode ter resultado, tal como já foi referido
anteriormente, de reacções de hidrólise de compostos fenólicos mais
complexos. Por outro lado, o não aumento de HT pode-se relacionar com o
facto dos seus principais precursores (tal como a oleuropeína) se
encontrarem também em concentrações bastante reduzidas, existindo, no
entanto, maior concentração de compostos precursores de tirosol (como por
exemplo o Ligstrósido). A concentração reduzida de derivados da
oleuropeína nas matérias-primas relaciona-se com o tipo de cultivar da
azeitona e com o seu grau de maturação, sendo, dessa forma, variável de
ano para ano. (59)
No bagaço seco, como já referido, o tratamento provocou aumento da
concentração de HT e de tirosol, aumento que acompanhou a tendência de
aumento dos polifenóis totais e da actividade antioxidante. Neste resíduo, o
teor de água era bastante mais reduzido que no bagaço húmido, não sendo
tão favorável a ocorrência de possíveis reacções de hidrólise. Foi, no entanto,
notório que a solubilização dos dois principais compostos, HT e tirosol,
aumentou com a permanência em atmosfera de CO2.
Comparando o comportamento dos dois bagaços, foi evidente que, ao final
de três dias, o tratamento foi muito mais significativo para o bagaço húmido
do que para o bagaço seco, verificando-se um incremento de 408 % na sua
actividade antioxidante e de 562,5 % na concentração de tirosol. Por sua vez,
no bagaço seco, esses aumentos foram só de 22 % e de 35,8 %
Capitulo 2
- 86 -
respectivamente. A variação destes parâmetros no tratamento de três dias e
de sete dias no bagaço húmido não foi significativa.
A taxa de conversão, por influência do CO2, foi determinada através da (eq.
2.2):
%conversão=(Vi-Vf)/Vi)x100 (eq 2.2)
Onde,
Vi – valor no inico do tratamento
Vf – valor no final do tratamento
Estes resultados levam a prever que um tratamento a médio-curto prazo em
atmosfera de CO2 é benéfico, aumentando a solubilização dos compostos
alvo na extracção aquosa consequente.
2.2.4.2 Tratamento da MP com Água Quente
A fim de explorar a possibilidade de aumentar as quantidades de HT e
compostos fenólicos existentes nos resíduos durante o processamento,
submeteram-se os dois tipos de bagaço a um processo de extracção com
líquidos aquecidos, no qual tendo em conta o processo de obtenção dos
extractos, se seleccionou a água como solvente. Em processos de extracção
com líquidos aquecidos (solventes orgânicos ou aquosos), as matrizes são
submetidas a temperaturas e/ou pressões elevadas e diferenciam-se hoje em
dia três modelos distintos: modelo estático (com um volume fixo de solvente),
dinâmico (onde o solvente passa em contínuo pela matriz) e o semi-estático
(combinação dos dois modos). (60) Estes processos aplicados a diferentes
tipos de matrizes têm demonstrado vantagens em termos de aumento da
selectividade da extracção de determinados compostos. Na literatura
encontram-se na actualidade trabalhos de extracção com líquidos aquecidos
em modo semi-estático para a matriz bagaço húmido de azeitona. (37)
O modelo escolhido para realizar o trabalho deste sub-capítulo foi o estático,
utilizando como solvente água. A selecção deste modelo teve como base de
pressuposto a utilização desta técnica como um tratamento prévio da matriz
Capítulo 2
- 87 -
antes desta ser processada pelo método integrado de tecnologias,
anteriormente descrito (Anexo A). Os ensaios foram realizados utilizando um
reactor fechado e submetendo-o a temperaturas de 50 ºC, 100 ºC e 150 ºC.
As pressões de vapor dentro do reactor variaram no intervalo de 0,1 a 3,87
bar – consultar Anexo G.
As variações térmicas do solvente dentro do reactor são um parâmetro
importante pois neste caso ao aumentar-se a temperatura da água, a sua
constante dieléctrica baixa, aumentando o valor do seu produto iónico, e as
suas características como solvente ou como catalisador alteram-se podendo
ocorrer promoção de reacções de hidrólise de biomateriais. (61)
O objectivo deste estudo consistiu, assim, em estudar o i) aumento da
solubilização de compostos fenólicos na água (conseguindo-se, dessa forma,
um extracto mais rico nesses compostos) e ii) aumento da concentração
existente de HT, promovendo a hidrólise de compostos mais complexos
(olígomeros) que podem dar origem a este antioxidante, tais como
oleuropeína, demetiloleuropeína, verbascósido, e hidroxitirosol
glucosilado.(59)
Os ensaios foram conduzidos por modificação de um método já descrito, (61)
utilizando um reactor de aço inoxidável (resistente a alta temperatura e
pressão) com um volume de 15 ml, no qual se colocaram 3 g de matriz
(bagaço seco ou húmido) e 12 mL de água destilada. Após fechar e isolar
bem o reactor, este era colocado num forno termostatizado à temperatura
requerida (T ± 1 ºC). Os ensaios foram realizados a 50 ºC, 100 ºC e 150 ºC
durante 5 min, 10 min e 15 min. Depois de atingidas as condições de ensaio
pretendidas, o reactor era imediatamente removido e arrefecido num banho
de gelo até à temperatura ambiente. O esquema da instalação utilizada na
realização destes ensaios apresenta-se em baixo, na Figura 2.22.
Figura 2.22 Esquema da instalação de alta pressão utilizada na realização dos ensaios
com água quente. 1- Forno termostatizado; 2- reactor de aço; 3- vaso de recolha.
TIC
P
21
3
TIC
P
21
3
Capitulo 2
- 88 -
Uma das desvantagens deste método, quando utilizado isolado como
processo de extracção, é a partição dos compostos entre a matriz e o
solvente, (37) isto é, este processo pode favorecer a libertação de compostos
fenólicos simples (menor peso molecular) durante o tempo de ensaio, mas ao
diminuir-se drasticamente a temperatura estes podem precipitar,
incorporando-se de novo na matriz. No entanto, o objectivo final deste estudo
foi estudar a viabilidade de combinar este processo com o processo já
implementado para obtenção dos extractos bioactivos, fazendo dele uma
etapa de tratamento prévio da matriz. Por conseguinte, após o tratamento
com água quente, a matriz foi processada como descrito anteriormente:
depois de baixar a temperatura até à temperatura ambiente por arrefecimento
rápido, o sobrenadante e a matriz foram removidos do reactor e procedeu-se
à sua centrifugação (nas mesmas condições já descritas). Os extractos finais
obtidos foram analisados quanto à concentração de HT e tirosol, quantidade
total de polifenóis e capacidade antioxidante (ensaio de ORAC), e os
resultados expressos em (mg/g ± DP), (mgEAG/g ± DP), (μmol/g CAET ± DP)
respectivamente. Os resultados apresentam-se nas Figuras 2.23 e 2.24 para
os tratamentos realizados com bagaço húmido e Figuras 2.25 e 2.26 para os
realizados com bagaço seco. No Anexo G é possível consultar os resultados
apresentados em tabela.
Capítulo 2
- 89 -
Figura 2.23 Influência dos tratamentos com a água quente no BH (bagaço húmido) A -Variação
da quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) e capacidade antioxidante determinada por
ORAC (μmol/gmatriz CAET) nos extractos após diferentes tempos de tratamento, para 50 ºC e
100 ºC; B- Variação da concentração em HT e Tirosol (mg/gmatriz), nos extractos após diferentes
tempos de tratamento, para 50 ºC e 100 ºC.
Figura 2.24 Influência da temperatura no ensaio de 15 min de tratamento no BH. Variação da
concentração de HT e Tirosol (mg/gmatriz), quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) e
capacidade antioxidante determinada por ORAC (μmol/gmatriz CAET) nos extractos.
50ºC; 46,88
150ºC; 88,97
100ºC; 85,15
umol/g CAET
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
50 100 150
ºC
mg/
g
Tir 15' HT 15'
A
B
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
0 5 10 15
μmol
/g C
AE
T
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
mgE
AG
/g
umol/g CAET 50ºC umol/g CAET 100ºCmgEAG/g 50ºC mgEAG/g 100ºC
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 5 10 15min
mg/
g
Tir 50ºC Tir 100ºC HT 50ºC HT 100ºC
Capitulo 2
- 90 -
Figura 2.25 Influência dos tratamentos com a água quente no Bagaço seco (BS) A -Variação da
quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) e capacidade antioxidante determinada por ORAC
(μmol/gmatriz CAET) nos extractos após diferentes tempos de tratamento, para 50 ºC e 100 ºC; B-
Variação da concentração em HT e Tirosol (mg/gmatriz), nos extractos após diferentes tempos de
tratamento, para 50 ºC e 100 ºC.
Figura 2.26 Influência da temperatura após 15 min de tratamento ao BS. Variação da
concentração de HT e Tirosol (mg/gmatriz), quantidade total de polifenóis (mgEAG/gmatriz) e
capacidade antioxidante determinada por ORAC (μmol/gmatriz CAET) nos extractos.
A
B
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 5 10 15min
mg/
g
Tir 50ºC Tir 100ºC HT 50ºC HT 100ºC
100,00
150,00
200,00
250,00
0 5 10 15
mm
ol/g
CAE
T
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
mgE
AG/g
umol/g CAET 50ºCumol/g CAET 100ºCmgEAG/g 50ºCmgEAG/g 100ºC
228,8
235,2umol/g CAET
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
50 100
ºC
mg/
g
Tir 15' HT 15'
Capítulo 2
- 91 -
Discussão
Efeito tempo de exposição à temperatura
Analisando o conjunto de resultados obtidos, é possível concluir que os
tratamentos aplicados, tanto ao bagaço húmido, como ao bagaço seco, foram
promissores do ponto de vista de tratamento da matriz, principalmente
quando realizados para o bagaço húmido durante cinco minutos, e para o
bagaço seco, durante quinze minutos.
Nos ensaios realizados a 50 ºC, em ambos os bagaços, nos tratamentos de
cinco minutos observou-se sempre um aumento significativo de concentração
de HT, Tir (mg/g) correlacionável com a quantidade total de polifenóis e
capacidade antioxidante. Este aumento foi sobretudo significativo para o
bagaço húmido, uma vez que anteriormente não era detectável HT. A
hipótese apresentada para este facto é que, ao aumentar a temperatura da
água e a pressão de vapor, se iniciam reacções de quebra de ligações em
compostos fenólicos de maior peso molecular (principalmente os precursores
secoiridoides do HT), formando-se compostos fenólicos mais simples. Por
outro lado, o aumento da temperatura melhora as características da água
como solvente e como catalisador, aumentando a solubilização de
compostos. As reacções de hidrólise de oleuropeína, ligstrósido e
glucosidados do HT são as que ocorrem normalmente, resultando num
aumento de HT, (7) podendo ser esta a causa de uma maior percentagem de
conversão no tratamento do bagaço húmido. A 50 ºC e a 100 ºC, no bagaço
húmido, o aumento do tempo de ensaio, até quinze minutos, conduziu a uma
diminuição da concentração dos analitos alvo (HT e tirosol) e da capacidade
antioxidante. Este resultado indica que determinados compostos
antioxidantes solubilizados na água, quando sujeitos por um determinado
período de tempo a temperaturas mais elevadas se degradam
(termodegradação) e/ou oxidam (oxidação).
Nos tratamentos com o bagaço seco (50 ºC durante 10 min), esta redução
não foi significativa para o tirosol, verificando-se uma descida ligeira na
concentração de HT. Esta descida pressupõe que um maior teor de água
(bagaço húmido) pode potenciar, não só uma maior taxa de conversão, como
Capitulo 2
- 92 -
uma maior redução nas concentrações dos analitos por degradação. A
hipótese de degradação é reforçada com a leitura dos perfis cromatográficos
dos extractos aquosos finais (Anexo E), onde se observa que ao
desaparecerem os picos correspondentes aos analitos estudados não se
verifica o aparecimento de nenhum outro pico a outro tempo de retenção. Tal
facto, reflecte-se também na quantidade total de polifenóis e na capacidade
de resgate dos radicais peroxilo a eles associada, dado que ambos diminuem
com um maior tempo de exposição à temperatura.
Comparando os valores obtidos para 50 ºC e 100 ºC aos 5 min, verifica-se
que o aumento da temperatura favorece a solubilização de compostos
fenólicos na água, o que leva a concluir que o tempo de exposição a
temperatura elevada é determinante na degradação ocorrida.
Em ambas as matrizes, quando estas são expostas durante 15 min a 100 ºC,
verificou-se o fenómeno inverso: tanto no bagaço seco, como no húmido,
após 15 min de exposição a 100 ºC aumentou a concentração em HT e
tirosol na água e aumentou, ainda, a quantidade de polifenóis e a capacidade
antioxidante. Consequentemente, podem formular-se duas hipóteses: podem
ocorrer reacções de quebra de ligações de moléculas que são precursoras
destes compostos, que necessitam de mais tempo expostas a uma
temperatura mais elevada para ocorrerem, ou haver necessidade de mais
tempo de contacto entre o solvente (água) e a matriz de forma à solubilização
dos compostos ser efectiva (aumento da transferência de massa). Nos
resultados do bagaço húmido e seco, aos 10 min a 100 ºC, verificou-se uma
redução da concentração de HT na água e da respectiva capacidade
antioxidante, evidenciando-se a degradação deste composto quando
submetido a temperaturas mais elevadas. Contudo, a quantidade de
polifenóis não reduz significativamente, levando a concluir que com o
aumento do tempo de exposição à temperatura se forma (por quebra de
moléculas de maior peso molecular) ou solubiliza mais HT na solução
aquosa.
O tratamento mais favorável, para o bagaço húmido, é o que reúne um menor
tempo de exposição e temperatura, sendo 15 min de tempo de tratamento a
100 ºC o mais indicado para o bagaço seco, quer do ponto de vista de
Capítulo 2
- 93 -
concentração de HT e tirosol, como das propriedades antioxidantes do
extracto final obtido.
Efeito aumento da temperatura
De forma a melhor interpretar o efeito do aumento de temperatura, na Figura
2.24 e 2.26, reuniram-se, para o bagaço húmido e seco respectivamente, os
resultados obtidos para 15 min de tempo de tratamento (tempo ao qual se
verificou um aumento das concentrações dos compostos alvo).
Na Figura 2.24, para os resultados do bagaço húmido quando se passa de
50 ºC para 100 ºC, é evidente o efeito da temperatura nas características da
água, tanto como solvente como catalizadora de reacções. No entanto, o
aumento de 100 ºC para 150 ºC já não se mostrou tão efectivo, evidenciando
que durante este tempo de tratamento a variação pouco acentuada das
propriedades da água, como a densidade (ver Anexo G), não influêncía a
solubilização dos compostos.
Nos tratamentos efectuados, durante 15 minutos, para o bagaço seco, não se
verificou a influência do aumento de temperatura.
Capitulo 2
- 94 -
2.3 Ensaios de Bioactividade dos Extractos
A formação e acção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e de outros
radicais livres, como espécies de nitrogénio, contribuem para o processo de
envelhecimento per si e para o desenvolvimento de muitas doenças
associadas ao envelhecimento celular, tais como, doenças degenerativas
(Alzheimer e Parkinson), doenças cardiovasculares, diabetes e tipos de
cancro intimamente relacionados com danos oxidativos. O stress oxidativo é
resultado de um desequilíbrio entre a produção de espécies reactivas e a
defesa antioxidante existente a nível celular, dando origem aos designados
“danos oxidativos”. (42) Este desequilíbrio pode ter origem numa deficiência
nos mecanismos de defesa celulares ou no aumento dos níveis das espécies
reactivas, induzidos por diversos mecanismos de doença. Existem, a nível
endógeno, enzimas que actuam como antioxidantes, inibindo o aumento de
certas espécies de radicais. No entanto, para alguns radicais livres bastante
reactivos, tais como o radical peroxilo e o hidroxilo, não existem mecanismos
endógenos capazes de diminuir eficientemente a sua actuação.
Assim, após caracterização dos extractos seleccionados (sub-capitulo 2.2),
onde, através de ensaios químicos, se determinaram as suas capacidades
antioxidantes in vitro perante diferentes radicais indutores de stress oxidativo,
acresce a necessidade de avaliar o comportamento e actuação dos mesmos
perante sistemas biológicos. Os estudos da potencial actividade biológica dos
extractos foram realizados in vitro, recorrendo a modelos biológicos
compostos ou por linhas celulares humanas ou por microorganismos.
2.3.1 Ensaios in vitro em Linhas celulares Humanas
O objectivo dos ensaios in vitro em linhas celulares humanas consistiu em
a) Avaliar a possível toxicidade associada aos extractos naturais;
Capítulo 2
- 95 -
b) Estudar a potencial capacidade preventiva dos extractos sobre dois
sistemas celulares de cancro: cancro do cólon recto e cancro do estômago;
c) Determinar a capacidade antioxidante dos extractos a nível celular,
tentando estabelecer a correlação com b).
Avaliação da Citotoxicidade
A composição química dos extractos naturais seleccionados para estudo
inclui, como já referido, maioritariamente fenólicos simples (hidroxitirosol e
tirosol), que, segundo a literatura, passam a digestão a nível do estômago,
sendo só absorvidos mais tarde, a nível do intestino. (62-64) Estudos
comprovam a biodisponibilidades deste tipo de compostos que, devido aos
seus baixos pesos moleculares, transpõem facilmente a barreira intestinal. (11,63) Assim, tendo em conta estudos de biodisponibilidade associados aos
compostos fenólicos e modelos de linhas celulares utilizados para avaliação
de toxicidade de determinados compostos moleculares, seleccionou-se a
linha celular Caco-2 para avaliar a citotoxicidade associada aos extractos
naturais.
O modelo celular de avaliação da citotoxicidade Caco-2 é bastante utilizado
pois, quando as células atingem o seu estado de confluência, a monocamada
existente mimetiza o epitélio intestinal. (65)
A avaliação da toxicidade é um passo muito importante nos ensaios in vitro
de base celular. É com este ensaio que se definem concentrações a avaliar
noutros estudos, onde se avaliam potencias actividades biológicas.
A determinação da toxicidade celular foi realizada pelo método colorimétrico
de MTT (3-(4,5-dimetriltiazolil-2)-2,5-difeniltetrzolium bromide) optimizado e já
descrito. (66)
O método baseia-se na redução do MTT por uma enzima produzida na
mitocôndria de células metabolicamente activas (dehidrogenase), formando-
se cristais de formazan de cor púrpura.
Capitulo 2
- 96 -
As células Caco-2 (adenocarcinoma do cólon) foram adquiridas à DSMZ
(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) e cultivadas
aderentes em frascos de 175 cm2 em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado
com 10 % de soro bovino (FBS) e 2 mM L-glutamina (Gibco) a 37 ºC, numa
atmosfera controlada com 5 % CO2. O meio foi mudado de dois em dois dias
até à subconfluência das células de aproximadamente 75%, sendo, de
seguida, removidas dos frascos utilizando tripsina para diminuir a sua
aderência. Após se observarem as células destacadas da superfície,
adicionou-se meio suplementado com soro, de forma a inibir a acção
continuada da tripsina.
As células Caco-2 foram em seguida inoculadas em placas de 96-poços
(1x104 células/poço) para crescerem até atingirem o seu estado confluente
(3-4 dias), mudando-se novamente o meio de dois em dois dias. Quando
atingido o seu estado de confluência, removeu-se o meio de cada poço e
adicionou-se meio fresco (0,5%FBS) + extractos em diferentes concen-
trações (contendo nas suas composições de 0 a 800 μM de HT), sendo
depois incubadas, durante 4h. No final das 4h de incubação, removeu-se o
meio + extracto e adicionou-se novamente meio fresco (0,5 %FBS) com o
reagente MTT (0,5 g/L). As células foram deixadas a incubar por mais 4
horas. O meio foi removido e os cristais de formazan formados dissolvidos
em DMSO (150 μL/poço) conferindo a cor púrpura à solução. A solução foi
quantificada através da medição da absorvância a 540 nm num
espectrofotómetro de placas. A absorvância é tanto maior, quanto maior o
número de células viáveis capazes de reduzir o composto MTT.
Os resultados são expressos em percentagem (%) de células viáveis,
normalizadas relativamente ao controlo (células em meio sem extractos). Os
valores apresentados são a média de (n≥3) ± DP. As (n≥3) experiências
foram independentes, e em cada experiência realizaram-se triplicados. Os
resultados estão apresentados na Figura 2.29.
Capítulo 2
- 97 -
Capacidade Antioxidante Intracelular
As ROS são produzidas essencialmente a nível celular, surgindo durante o
próprio metabolismo da célula (respiração aeróbia). Também a exposição a
determinados agentes agressores externos, como é o caso da poluição
ambiental, o fumo do tabaco, toxinas, radiações, etc, pode conduzir à
acumulação de radicais livres no organismo. (4) As principais ROS, que
geralmente reagem com as macromoleculas biológicas (proteínas, lípidos e
DNA), são: anião superóxido (O2 -), peróxido de hidrogénio (H2O2) radical
hidroxilo (OH ), radical peroxilo (ROO ) e singleto de oxigénio (1O2). É de
referir que, por si só, o organismo apresenta um sistema de defesa
antioxidante que permite eliminar as ROS, como é o caso das enzimas
antioxidantes SOD e Catalase que convertem, respectivamente, os radicais
O2 - e H2O2, em espécies não reactivas. (44) No entanto, este sistema não é
100 % eficiente. O consumo de antioxidantes naturais, provenientes de uma
dieta rica em frutos e legumes, tem sido relacionado com a prevenção de
doenças relacionadas com o stress oxidativo celular. As vitaminas C e E, os
polifenóis, os flavonóides e os carotenóides são os principais compostos
bioactivos presentes nestas matrizes. A sua acção sobre a diminuição do
stress oxidativo é realizada através de uma série de mecanismos,
nomeadamente o resgate das ROS, complexação de iões metálicos, e
modelação de uma resposta celular. (44)
Torna-se então fundamental, avaliar a capacidade antioxidante dos extractos
a nível celular. Apesar dos testes químicos in vitro serem indicadores da
capacidade antioxidante, quando estes se realizam, o composto antioxidante
está sempre em excesso comparativamente às espécies reactivas de
radicais. Contudo, a nível celular não é o que se passa. O antioxidante
encontra-se sempre em muito menor quantidade que os radicais que tenta
inibir. Este é um facto relevante, que pode influênciar a resposta dos
extractos perante situações de stress oxidativo, dado que os sistemas
biológicos são bastante mais complexos do que as simples reacções
quimicas testadas, podendo os compostos bioactivos actuar por diferentes
mecanismos. (67)(68)
Capitulo 2
- 98 -
A linha celular escolhida como modelo para implementar este ensaio foi a
linha de adenocarcinoma do cólon, Caco-2 e o método adaptado e
optimizado para esta linha celular. (69,70)
O princípio do método baseia-se em pré-incubar as células com diferentes
diluições dos extractos EBS e RSEV, em simultâneo com diacetato de
diclorofluoresceína (DCF-DA). A DCF-DA permeia a membrana celular e no
interior das células permanece (por acção de esterases) na sua forma mais
polar (DCF). Os antioxidantes adicionados podem permanecer ligados à
membrana celular ou, por difusão membranar, passar para o interior da
célula. As células são, de seguida, tratadas com um dos dois indutores de
stress possíveis: o peróxido de tert-butil hidróxido (t-BHP) ou o peróxido de
hidrogénio (H2O2), que se decompõe em espécies reactivas, como os radicais
ROO e OH respectivamente, e se difundem para o meio intracelular. Estas
espécies reactivas podem então ser resgatadas ainda no exterior da célula
pelos compostos antioxidantes ligados às membranas celulares, ou no seu
interior antes que estas espécies oxidem a DCF (composto fluorescente na
sua forma oxidada). A capacidade antioxidante quantifica-se pela redução da
fluorescência relativa ao controlo (células apenas tratadas com DCF-DA e t-
BHP). Na Figura 2.27, apresenta-se um esquema resumido do mecanismo
intracelular descrito. O método encontra-se mais sucintamente detalhado no
Anexo H.
Figura 2.27 Princípio do método proposto para a quantificação da capacidade antioxidante intracelular. (70)
Membrana Celular
DCF-DA
DCF
esterasescelulares
DA
DCF
t-BHP H2O2
ROS
AOx
t-BHP H2O2
ROS
ROS
ROSAOx
AOx
Membrana Celular
DCF-DA
DCF
esterasescelulares
DA
DCF
t-BHP H2O2
ROS
AOx
t-BHP H2O2
ROS
ROS
ROSAOx
AOx
Capítulo 2
- 99 -
Avaliou-se a capacidade antioxidante dos extractos EBS e RSEV numa gama
de concentrações de 0 a 650 μM de HT presente.
Os resultados são expressos em termos de percentagem (%) de inibição de
ROS relativamente ao controlo (células sem tratamento e sujeitas a stress
oxidativo- t-BHP), calculada através da (eq. F2, apresentada no Anexo H):
Os valores apresentados são a média de (n≥3) ± DP. As (n≥3) experiências
foram independentes, e em cada experiência realizaram-se triplicados. Os
resultados estão apresentados na Figura 2.30.
Avaliação na Proliferação Celular
Ao longo desta última década, tem-se relacionado o facto de, nos países de
dieta mediterrânica, a incidência de certos tipos de cancro ser
significativamente mais baixa do que nos países do norte da Europa,
associando-se esta redução ao consumo regular de azeite. (71) Um dos tipos
de cancro mais estudados tem sido o cancro do carcinoma do cólon pois é o
3º tipo de cancro mais mortífero no mundo, sendo um dos mais resistentes
aos agentes quimioterapeuticos utilizados. (72) Estudos efectuados
demonstraram que o consumo regular desta gordura correlaciona com a
indução de níveis significantes de apoptose em diversas células
cancerígenas, nomeadamente em células do intestino grosso. Estas
propriedades são atribuídas à presença de compostos fenólicos no azeite,
nomeadamente ao hidroxitirosol(73), para o qual se atribuem diversas
propriedades biológicas. (12,74-77) De facto, vários estudos sugerem a
capacidade do HT em prevenir diversos tipos de cancro, nomeadamente o
cancro do cólon-recto, (71,78-80) devido à sua capacidade de prevenção da
actividade mutagénica induzida pelo stress oxidativo.
Contudo, o cancro é uma doença extremamente complexa, onde se podem
encontrar diferenças genéticas, não só entre os diversos tipos de cancro,
mas mesmo em células do mesmo tipo de tumor de diferentes indivíduos, ou
no mesmo tumor em diferentes células. Por isso, a terapia através de uma
única molécula para um único alvo, não é eficiente nem suficiente. (81) A
Capitulo 2
- 100 -
combinação de diferentes moléculas (antioxidantes ou não) com diferentes
nutrientes e oligoelementos pode ser a chave para uma prevenção mais
direccionada deste tipo de doenças, fazendo, em casos de doença declarada,
parte de uma terapia integrada.
Neste sentido, no âmbito deste trabalho, os extractos bioactivos ricos em HT
foram testados, a fim de se avaliar a potencial capacidade anti-proliferativa
dos mesmos, em células cancerígenas.
Seleccionaram-se duas linhas celulares distintas como modelos deste
estudo: uma linha celular representante de uma das etapas da
carcinogenesis do cancro do cólon-recto – HT29 – e uma linha celular
representante de uma das etapas da carcinogenesis do cancro do estômago
– MKN45. A linha celular MKN45 foi escolhida para comparação de actuação
dos extractos, tendo em conta que estes, embora contendo na sua
composição compostos fenólicos que são mais metabolizados e absorvidos a
nível do intestino, no processo de ingestão permanecem em contacto com as
células gástricas por um determinado período de tempo. (64) Estas linhas
celulares foram gentilmente cedidas pelo IPATIMUP.
Ambas as linhas celulares seleccionadas são bastante utilizadas como
modelos celulares no estudo da proliferação (80,82,83) e as duas apresentam
uma mutação a nível da p53 (67,81), sendo por isso, consideradas
extremamente resistentes.
O estudo da capacidade anti-proliferativa foi realizado através do método
colorimétrico de MTT, (66) quantificando a viabilidade celular após incubação
das células cancerígenas com várias diluições dos extractos naturais.
O método apresenta algumas alterações em relação ao método utilizado para
avaliar a toxicidade celular, dado que os extractos são adicionados às células
24h após a sua inoculação em placas, de forma a estes actuarem no final
fase de latência (lag phase), no início da fase exponencial do crescimento
celular. No Anexo H encontram-se as curvas de crescimento determinadas
para as células HT29 e MKN45 com diferentes inóculos.
Assim, células HT29 e MKN45 são inoculadas em placas de 96-poços. Após
24 horas (início da fase de crescimento), o meio é removido e as células são
incubadas com as várias diluições dos extractos EBS, RSEV, EBH e de HT
Capítulo 2
- 101 -
puro, variando em termos de concentração de HT de (0 a 800 μM),
preparadas em RPMI-1640 0,5 % FBS. Após 4 e 24 horas, o meio é
substituído por meio fresco com o reagente MTT (0,5 g/L) e as células
deixadas a incubar por mais 4 horas. O meio é removido e os cristais de
formazan formados são dissolvidos em DMSO (150μL/poço). A solução é
quantificada através da medição da absorvância a 540 nm num
espectrofotómetro. A absorvância é tanto maior, quanto maior o número de
células viáveis capazes de reduzir o composto MTT.
Quando possível, determinou-se o EC50 para os extractos/compostos
testados. O EC50 representa a concentração para a qual os
extractos/compostos induzem 50% da viabilidade celular. (66)
Os resultados são expressos em percentagem (%) de células viáveis,
normalizadas relativamente ao controlo (células em meio sem extractos). Os
valores apresentados são a média de (n≥3) ± DP. As (n≥3) experiências
foram independentes, e em cada experiência realizaram-se triplicados. Os
resultados estão apresentados nas Figuras 2.31 e 2.32.
Distribuição do Ciclo celular
Os mecanismos celulares pelos quais os compostos fenólicos, como o HT,
tirosol e ácidos cinâmicos, podem actuar, evidenciando as suas capacidades
anti – proliferativas, estão ainda por determinar, (71) sabendo-se, no entanto,
que este tipo de compostos (polifenóis) apresentam uma importante
participação na regulação dos checkpoints do ciclo celular de determinadas
células cancerígenas. (81) A interrupção da regulação normal do ciclo celular
deste tipo de células, quer na fase de progressão, quer na fase de divisão, é
um evento importante no desenvolvimento do cancro.
O ciclo celular é uma sequência de eventos nos quais se incluem a
duplicação do conteúdo celular e subsequente divisão, sendo dividido em
quatro fases distintas (ver Figura 2.28)
Capitulo 2
- 102 -
Figura 2.28 Representação das quatro etapas que constituem o ciclo celular de uma célula
eucariótica normal. Fase G1 – Crescimento Celular; Fase S – Síntese de ADN; Fase G2/M - G2
a célula prepara-se para a divisão, M-os cromossomas separam-se e a célula divide-se.
A progressão do ciclo celular, de uma fase para a outra, é regulada através
de activação ou inactivação sequencial de determinados “pontos de controlo
– Checkpoints” que monitorizam o estado da célula e o ambiente que as
rodeia. Desta forma, a célula só avança para uma outra fase, quando a
verificação de determinado ponto de controlo lhe assegura que a fase
anterior já terminou. Se tal não acontece, o ciclo não prossegue e as células
ficam estagnadas numa dada fase do processo – Bloqueio do Ciclo Celular.
Existem três pontos de controlo (Checkpoints) pelos quais pode ocorrer o
bloqueio do ciclo celular:
• Checkpoint Fase G1 e G1/S
• Checkpoint Fase S
• Checkpoint Fase G2/M
Tendo em conta a importância da regulação do ciclo celular na progressão da
proliferação das células cancerígenas, o objectivo do trabalho aqui
apresentado foi avaliar se os extractos já estudados quanto à sua capacidade
anti-proliferativa estavam a provocar alguma alteração no ciclo celular das
mesmas. Essa avaliação pode conduzir a uma melhor percepcção das
possíveis vias de actuação dos extractos, importante para determinação das
suas capacidades preventivas.
Neste estudo, só se avaliou a linha celular do cancro do cólon-recto, HT29.
GG00 GG11
SS
GG22/M/M
GG00 GG11
SS
GG22/M/M
Capítulo 2
- 103 -
O método utilizado é uma modificação de um método já descrito. 2x106
células HT29 são inoculadas em frascos de 25cm2 e 24 horas depois (início
da fase de crescimento), o meio é removido e as mesmas de novo incubadas
com os extractos EBS e RSEV (35 μM em HT) e o HT puro (100 μM), em
RPMI-1640 0,5 % FBS. Após 4, 24 e 48 horas remove-se o meio, tripsinizam-
se as células e contam-se, utilizando para tal um hemacitómetro e reagente
azul tripano (que cora as células não viáveis). Centrifugam-se 1x106 células a
200 g durante 10 min. Remove-se o sobrenadante e adiciona-se 1 mL de
PBS frio e centrifuga-se de novo a 200 g durante 10 min. Remove-se de novo
o sobrenadante, ressuspende-se as células em 1 mL de solução de “FACS”
(consultar Anexo H) e deixa-se a incubar ao abrigo da luz, à temperatura
ambiente, durante 2 horas. Guardam-se as amostras durante a noite, a 4 ºC.
A distribuição dos ciclos celulares das células HT29 após incubação com os
extractos bioactivos foi analisada através de citometria de fluxo, utilizando um
citometro de fluxo CyFlow Space (Partec Instruments, Alemanha) com
aquisição dos dados através do canal FL2, apresentados sob a forma de
FSC/SSC e FL2-A/FL2-W e comprimento de onda de emissão (λemi=498 nm).
O número de eventos adquiridos por amostra foi sempre de 30000, excluindo
debris e dubletos, com um caudal de injecção de 200 eventos/seg.
As percentagens das células nas diferentes fases do ciclo celular foram
determinadas recorrendo ao software da Partec – FloMax DPAC , utilizando o
Cell Cycle Plataform e o modelo matemático Single Cell Cycle Fit (quando
possível ajustar).
Os resultados são expressos em percentagem (%) de número de células em
cada fase. Os valores apresentados são a média de (n=3) ± DP. As (n=3)
experiências foram independentes, e em cada experiência realizaram-se
duplicados. Os resultados estão apresentados nas Figuras 2.33 e 2.34, na
secção Resultados & Discussão.
Resultados & Discussão
Os resultados obtidos, referentes aos ensaios de bioactividade dos extractos
desenvolvidos em modelos celulares, apresentam-se de seguida:
Capitulo 2
- 104 -
Figura 2.29 Efeito dos extractos EBS, EBH, RSEV e do composto puro HT na viabilidade celular
das células Caco-2. Os extractos/composto foram incubados durante 4h com células Caco-2
após as quais se quantificou a % de células viáveis através do ensaio de MTT.
Figura 2.30 Capacidade Antioxidante Intracelular dos extractos EBS e RSEV pré-incubados
durante 2h com DCF-DA em células Caco-2 antes da adição do indutor de stress: A) t-BHP; B) H2O2.
HT24h
0
20
40
60
80
100
120
140
25 50 100 150 325 487 650
μM HT
(FEx
trac
to/F
c )x1
00 (%
)
EBS/H2O2
RSEV/H2O2
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
25 50 100 150 325 487 650
μM HT
(FE
xtra
cto /F
c )x1
00 (%
)
EBS/t-BHP
RSEV/t-BHP
A
B
0
20
40
60
80
100
120
10 100 1000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
RSEV
EBS
EBH
0
20
40
60
80
100
120
10 100 1000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
HT
EBS
Extracto / Composto EC50 (μM)
EBS NARSEV NAEBH NAHT NA
Caco-2 - 4h
Capítulo 2
- 105 -
Figura 2.31 Efeitos dos extractos testados na proliferação celular das células HT29
subconfluentes. As células foram expostas a diferentes concentrações de extractos e de HT
durante 4 e 24h. NA – Não Atingido. Eixo das abcissas em escala logarítmica.
0
20
40
60
80
100
120
140
10 100 1000 10000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBS
HT
0
20
40
60
80
100
120
140
10 1000 (μM HT)
% C
élul
as V
iáve
isEBH
EBS
RSEV
NAHT
350EBH
380RSEV
NAEBS
EC50 (μM)
Extracto / Composto
HT29 - 4h
NAHT
350EBH
380RSEV
NAEBS
EC50 (μM)
Extracto / Composto
HT29 - 4h
0
20
40
60
80
100
120
140
10 100 1000(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSRSEVHT
NAHT
490RSEV
NAEBS
EC50(μM)
Extracto/ Composto
HT29 - 24h
NAHT
490RSEV
NAEBS
EC50(μM)
Extracto/ Composto
HT29 - 24h
Capitulo 2
- 106 -
Figura 2.32 Efeitos dos extractos testados na proliferação celular das células MKN45
subconfluentes. As células foram expostas a diferentes concentrações de extractos e de HT
durante 4 e 24h. NA – Não Atingido. Eixo das abcissas em escala logarítmica.
0
20
40
60
80
100
120
10 100 1000 10000(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSRSEVEBH
0
20
40
60
80
100
120
10 100 1000 10000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSHT
0
20
40
60
80
100
120
140
10 100 1000 10000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSRSEVHT
Extracto / Composto EC50 (μM)
EBS 370RSEV 100EBH 190HT 195
MKN45 - 4h
Extracto / Composto EC50 (μM)
EBS 200RSEV 85
HT 210
MKN45 - 24h
0
20
40
60
80
100
120
10 100 1000 10000(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSRSEVEBH
0
20
40
60
80
100
120
10 100 1000 10000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSHT
0
20
40
60
80
100
120
140
10 100 1000 10000
(μM HT)
% C
élul
as V
iáve
is
EBSRSEVHT
Extracto / Composto EC50 (μM)
EBS 370RSEV 100EBH 190HT 195
MKN45 - 4h
Extracto / Composto EC50 (μM)
EBS 200RSEV 85
HT 210
MKN45 - 24h
Capítulo 2
- 107 -
Figura 2.33 Efeitos dos extractos testados na distribuição das fases do ciclo celular. Células
HT29 subconfluentes foram expostas a EBS (35 μM HT), RSEV (35 μM HT) durante 4 h, 24 h e
48 h e a uma solução 100 μM HT durante 4 h e 24 h. As células tripsinizadas foram tratadas com
uma solução com Iodeto de Propideo e RNase e analisadas por citometria de fluxo. No Anexo H
é possível consultar as distribuições obtidas no programa de análise de distribuição do ciclo
celular do FloMax DPAC.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo EBS 4h EBS 24h EBS 48h
Dis
trib
uiçã
o C
iclo
Cel
ular
(%)
G1 S G2M
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo RSEV 4h RSEV 24h RSEV 48h
Dis
trib
uiçã
o C
iclo
Cel
ular
(%)
G1 S G2M
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo HT 4h HT 24hDis
trib
uiçã
o C
iclo
Cel
ular
(%)
G1 S G2M
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo EBS 4h EBS 24h EBS 48h
Dis
trib
uiçã
o C
iclo
Cel
ular
(%)
G1 S G2M
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo RSEV 4h RSEV 24h RSEV 48h
Dis
trib
uiçã
o C
iclo
Cel
ular
(%)
G1 S G2M
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo HT 4h HT 24hDis
trib
uiçã
o C
iclo
Cel
ular
(%)
G1 S G2M
Capitulo 2
- 108 -
Figura 2.34 Efeito da dependência da dose de Extracto EBS na distribuição das fases do ciclo
celular. Células HT29 subconfluentes foram expostas a EBS (35 μM HT) e a EBS (70 μM HT)
durante 24 h. As células tripsinizadas foram tratadas com uma solução com Iodeto de Propideo e
RNase e analisadas por citometria de fluxo.
Avaliação da Citotoxicidade
A exposição de células Caco-2 a diferentes concentrações de extractos EBS,
EBH, RSEV e de hidroxitirosol puro durante 4 h (Figura 2.29), revelou não
ocorrer redução significativa da viabilidade celular, não podendo ser
associada toxicidade às soluções testadas. Em nenhum dos casos avaliado
foi possível determinar o EC50, embora o RSEV tenha sido o extracto natural
que mais afectou a percentagem de células metabolicamente activas,
reduzindo para uma concentração de 500 μM em HT, aproximadamente
25 % do número de células viáveis.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Controlo EBS 35uM EBS 70uM
Dis
tribu
ição
Cic
lo C
elul
ar (%
)
G1 S G2M
Capítulo 2
- 109 -
Capacidade Antioxidante Intracelular
Os resultados obtidos para a capacidade antioxidante intracelular dos
extractos (Figura 2.30) testados revelam capacidade de protecção à actuação
das ROS produzidas após exposição das células Caco-2 aos dois indutores
de stress. Essa capacidade de protecção revelou-se mais significativa
quando as células são tratadas com t-BHP, atingindo-se com o extracto
RSEV uma inibição de 48 % e com o EBS 36 %. Nas células tratadas com
peróxido de hidrogénio a resposta foi menos acentuada (redução máxima de
22% para o RSEV), não havendo diferenças estatisticamente significativas
entre os dois extractos avaliados. Em ambos os ensaios, observou-se que a
resposta é dependente da dose testada, sendo essa relação inversa,
obtendo-se valores de maior inibição das espécies reactivas geradas para
exposição a concentrações menores de extracto (concentrações
apresentadas em termos de concentração de HT presente no extracto). Nas
concentrações mais elevadas (≥ 325 μM) observou-se um aumento das ROS
intracelulares. Este aumento é mais evidente no RSEV, que revelou no
ensaio de citotoxicidade, para as suas concentrações mais elevadas, reduzir
cerca de 20 % a viabilidade celular. Tais factos podem estar correlacionados,
indicando uma possível actividade pro-oxidante a partir de determinadas
concentrações.
De acordo com os ensaios químicos de capacidade antioxidante, RSEV
revelou melhor actividade na inibição da oxidação da lipoproteína de baixa
densidade LDL (Figura 2.18) do que EBS, indicando uma maior capacidade
protectora à oxidação lipídica quando na presença de radicais ROO•. Os
resultados obtidos estão em concordância, dado que no sistema celular é
também RSEV, que, para uma baixa gama de concentrações, demonstrou
melhor actividade antioxidante. Na literatura, foi demonstrado que o HT actua
na protecção das células Caco-2 ao stress oxidativo induzido pelo peróxido
de hidrogénio. (84) O estudo revelou que 250 μM de HT inibe a redução da
viabilidade celular provocada pelo stress oxidativo. A melhor actividade do
RSEV pode-se relacionar com sinergias existentes entres os diferentes
Capitulo 2
- 110 -
compostos fenólicos, tais como os derivados secoiridoides, existentes em
baixas concentrações, incrementando a bioactividade associada ao HT.
Avaliação na Proliferação Celular
Avaliou-se a capacidade dos extractos naturais em inibir a proliferação de
células de adenocarcinoma do cólon (HT29) e de carcinoma do estômago
(MKN45), numa gama de concentrações de 0 a 1000 μM em HT, durante 4 h
e 24 h.
Numa primeira abordagem, seleccionou-se, como tempo de ensaio, 4 h, de
forma a simular o contacto dos compostos durante o seu tempo de
metabolização e biotransformação, ao longo do tracto intestinal. Essa
avaliação pretendeu ter em conta a ingestão diária, mas não contínua, deste
tipo de extractos, como acontece, por exemplo, na ingestão de um alimento
funcional. Posteriormente, adicionou-se ao estudo o tempo de 24 h que
simula uma ingestão contínua dos extractos, como pode acontecer no caso
de ingestão de um nutracêutico com uma actuação específica.
Dos resultados obtidos para as duas linhas celulares, observou-se uma maior
resistência à actuação deste tipo de compostos nas células HT29, sendo por
isso um desafio encontrar agentes preventivos eficazes para este tipo de
carcinoma. A maior resistência das HT29 a determinados compostos
fenólicos e fármacos já foi anteriormente reportado. (85)
Efeito da concentração
Durante as 4 h de contacto, de ambas as linhas celulares com os extractos
EBS, EBH, RSEV e o composto HT, a redução na viabilidade celular
mostrou-se dependente da dose (Figura 2.31). Contudo, para as
concentrações testadas nas HT29 só foi possível determinar o EC50 para o
EBH e RSEV, sendo os valores obtidos bastante semelhantes entre si,
demonstrando um comportamento idêntico nos dois extractos. Em ambos, a
Capítulo 2
- 111 -
partir da concentração de 300 μM em HT assistiu-se a uma descida
acentuada da viabilidade das células HT29. Segundo os dados obtidos nos
ensaios químicos de capacidade antioxidante, e tendo em conta a
concentração de HT presente no EBH, este apresenta uma maior eficácia
como composto antioxidante. No entanto, esse facto não influênciou o
comportamento na inibição da proliferação celular deste tipo de linha celular,
não se verificando uma correlação directa entre estas duas propriedades. O
mesmo já tinha sido reportado por outros autores, referindo que nem sempre
os melhores antioxidantes apresentam a melhor capacidade de inibição na
proliferação de células cancerígenas. (86) De novo se reforça a existência de
sinergia entre os constituintes do extracto menos processado RSEV. A
presença de uma gama de compostos de maior peso molecular (derivados
secoiridoides do HT) em baixas concentrações parece ser de importância
determinante na sua bioactividade.
A capacidade de inibição da proliferação do extracto EBS nesta linha celular
revelou-se menor do que a capacidade demonstrada para o HT isolado, que,
logo a partir das concentrações mais baixas, reduziu 20 % a viabilidade
celular.
Nas células MKN45 (Figura 2.32) os EC50 foram todos atingidos ao final de
4 h de exposição aos extractos/composto, sendo novamente o menor valor
atribuído ao RSEV (100 μM). A partir desta concentração, em todos os
extractos avaliados, o número de células metabolicamente activas diminuiu
significativamente.
Efeito do tempo de exposição
Nos ensaios de 24 h, realizados com HT29, a avaliação da gama de
concentrações até 100 μM revelou que os comportamentos dos extractos
demosntram uma tendência para a resposta ser inversa à dose administrada
(Figura 2.31). No entanto, a partir desta concentração assiste-se a um
aumento na proliferação seguido de uma descida acentuada a partir de
250 μM. O aumento expressivo da proliferação está associado a uma
Capitulo 2
- 112 -
resposta mitogénica induzida por toxicidade associada a determinados
compostos. (66) O aumento do tempo de exposição desta linha celular ao
RSEV diminuiu o valor de EC50 em mais de 100 μM. Nas MKN45, verificou-se
redução de 50 % a viabilidade celular para os mesmos valores de
concentração de extractos/composto. No entanto, a descida mais significativa
observou-se para o EBS (que nas células HT29 nunca chegou a atingir EC50),
embora a melhor capacidade de inibição tenha sido determinada para RSEV.
O HT isolado não apresentou uma redução estatisticamente significativa com
o tempo de exposição, no entanto, outros autores verificaram que só ao final
de 72 h de exposição das células HT29 ao HT puro e com 750 μM deste
composto é que se atinge o EC50. (85)
Mais tempo de exposição apresenta-se importante do ponto de vista de
influência dos compostos fenólicos e outros constituintes dos extractos em
determinados caminhos e mecanismos relacionados com a proliferação de
células cancerígenas.
Distribuição do Ciclo Celular
Após a avaliação dos resultados obtidos na inibição da proliferação celular, e
tendo em conta diversos trabalhos reportados que atribuem ao HT
capacidade de interferir em passos da carcinogenesis através da alteração
no ciclo celular das células cancerígenas, (71,85) optou-se por se avaliar qual a
influência dos extractos no ciclo celular das células HT29.
Devido às respostas obtidas na avaliação da capacidade antioxidante
intracelular e na inibição da proliferação de células HT29 (em que se verificou
uma dependência inversa com a dose), as concentrações escolhidas para
realizar estes ensaios foram de 35 μM em HT para o extracto RSEV e EBS e
de 100 μM para o HT puro.
Capítulo 2
- 113 -
Efeito do Tempo de Exposição
Estudou-se o efeito na distribuição do ciclo celular após 4 h, 24 h e 48 h de
exposição ao EBS, RSEV e HT (dados não adquiridos para as 48 h).
Tanto para o EBS, como para o RSEV, observou-se, ao longo do tempo, um
aumento significativo da fase G0/G1, com consequente decréscimo da fase S
e G2/M. Estes resultados indicam um bloqueio do ciclo celular na fase
G0/G1.
Após 4 h de ensaio, o efeito verificado para a actuação do extracto EBS e HT
(aumento da fase G1) é diferente do observado para o RSEV. Ao final deste
tempo de ensaio, a actuação do RSEV foi acompanhada de um aumento da
fase S em vez de aumento na fase G1, indicando que este extracto induziu
as células a entrar nesta fase de replicação. Este facto foi já referido para o
Resveratrol, que posteriormente inibe a progressão das células na fase S,
inibindo a síntese do ADN. (81)
Observando o efeito deste extracto ao final das 24 h, verificou-se uma
diminuição acentuada das fases S e G2/M e consequente aumento das
células presentes na fase G1. Por sua vez, a actuação do extracto EBS e HT
durante esse tempo reflecte-se novamente num aumento da fase G1, embora
as percentagens de células presentes nesta fase tenha sido inferior à atingida
pelo contacto com o RSEV.
Observando o gráfico que se encontra no Anexo H, e que apresenta a
contagem efectuada das células ao longo do tempo de ensaio, constata-se
que o RSEV tal como o HT, ao final das 4 h de ensaio reduziu, de forma mais
significativa, o número de células vivas.
Ao final das 48 h de ensaio, o bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1
provocado pelo RSEV e EBS é ainda mais notório, existindo maior
percentagem de células estagnadas nesta fase – dependência do tempo de
exposição. Contudo, ao avaliar o número de células, observou-se que a
diminuição não foi tão acentuada como o ocorrido para as 4 h, sugerindo uma
recuperação da actividade normal das células ao longo do tempo. Esse facto
pode estar relacionado com o consumo de algum dos compostos
Capitulo 2
- 114 -
constituintes dos extractos, diminuindo o bloqueio de algum mecanismo
relacionado com a alteração da distribuição do ciclo celular.
Dependência da concentração
De forma a avaliar a influência da concentração testada, realizou-se um
ensaio com EBS com 70 μM de HT durante 24 h (Figura 2.34). Os resultados
obtidos demonstraram uma tendência para a actividade exercida ser
dependente da dose, dado que o aumento da percentagem de células
estagnadas na fase G1 aumentou quando tratadas com EBS 70 μM. Em
simultâneo, a fase S decresceu mais rapidamente quando as células
estiveram em contacto com a concentração mais elevada, evidenciando o
efeito verificado para a concentração 35 μM ao fim de 48 h (redução total da
fase S).
Influência da composição dos extractos
A diferença observada para o ensaio de 4 h, entre o RSEV e o EBS, pode
estar relacionado com a diferença de composição dos extractos bioactivos.
Como já referido anteriormente, ao longo deste capítulo, na composição do
RSEV existiam compostos de maior peso molecular, existentes também eles,
mas em concentrações mais reduzidas, no azeite. Extractos polifenólicos de
azeite demonstraram actuar na distribuição do ciclo celular, mas, ao contrário
do observado com o hidroxitirosol, o ciclo é bloqueado na fase G2/M. (71)
Assim, e tal como com o sucedido com o resveratrol, pode existir algum
composto que ao actuar sob outros caminhos e metabolismos do ciclo
celular, diferentes dos mecanismos de acção do hidroxitirosol, modifique a
resposta celular.
Capítulo 2
- 115 -
Mecanismo
O bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1 pelo hidroxitirosol puro já foi
demonstrado em trabalhos publicados anteriormente. (71,78) Tendo em conta
que o HT é o composto em maior concentração nos dois extractos testados.,
os resultados obtidos neste trabalho são concordantes com os da literatura.
O bloqueio da distribuição celular na fase G0/G1 é normalmente regulado
pelo checkpoint G1/S quando são detectados danos no ADN, sendo, por isso,
considerado como crucial para o processo de carcinogenesis.
Quando as células se encontram no seu estado normal, este bloqueio do
ciclo na fase G1 efectua-se através da proteína p53. A proteína p53 é
específica do ciclo celular, tornando-se activa em determinadas situações,
actuando assim em alvos transcripticionais que vão inibir as cicloquinases
dependentes (CDK), bloqueando o ciclo na fase G0/G1. No entanto, nas
células testadas, as HT29, apresentam uma mutação a nível desta proteína,
não sendo através deste caminho que a retenção na fase G0/G1 pode
ocorrer. (87) Um outro mecanismo de actuação pode ser sugerido através do
bloqueio de mensageiros que não as CDK’s dependentes do metabolismo da
p53. Existem espécies reactivas de oxigénio (ROS), essenciais no processo
de carcinogenesis, que actuam como segundos mensageiros na transdução
do sinal mitótico de certas citoquinas e factores de crescimento. (88,89) É aqui
que os antioxidantes podem actuar, ao resgatarem essas ROS, sendo este
um dos possíveis mecanismos de actuação sugerido para os resultados
obtidos tanto do EBS como do RSEV.
2.3.2 Ensaios em Microorganismos(90)
Doenças do foro gastro-intestinal, devido à ingestão de alimentos
contaminados com bactérias patogénicas, são hoje em dia um problema de
saúde pública.
Em todo o mundo tem-se verificado um esforço conjunto para minimizar o
uso de conservantes químicos na indústria alimentar, devido à preocupação
Capitulo 2
- 116 -
crescente dos consumidores em seleccionar o que é “natural” procurando
cada vez mais produtos considerados saudáveis. Consequentemente,
assiste-se a um aumento por parte da comunidade científica em tentar
desenvolver e encontrar extractos naturais com actividade antimicrobiana, de
forma a poderem ser utilizados como bioconservantes.
A actividade antimicrobiana de vários extractos de plantas e produtos
naturais tem sido, ao longo desta última década, alvo de estudo, (91,92)
nomeadamente a avaliação da actividade antibacteriana contra Bacills
megaterium, de extractos obtidos a partir de resíduos da extracção de
azeite.(93)
O trabalho apresentado neste sub-capítulo, reúne a avaliação da
potencialidade como agente bioconservante contra espécies patogénicas
características de contaminações alimentares, de um dos extractos naturais
obtido pelo processo integrado de tecnologias limpas anteriormente descrito,
o EBH.
Avaliaram-se cinco diferentes estirpes de microorganismos (Escherichia coli,
Salmonella poona, Bacillus cereus, Saccharomyces cerevisiae e Candida
albicans). Como comparação da actividade antimicrobiana, testaram-se, em
simultâneo, dois compostos fenólicos puros: hidroxitirosol e a oleuropeína.
Das espécies de microorganismos escolhidas, os B.cereus são as bactérias
Gram-positivas mais comumente associadas a dois tipos de doença do foro
gástrico: a diarreia e a síndrome emética.
As bactérias Gram-negativas estão representadas pela E.coli e S.poona.
A E.coli encontra-se normalmente na flora intestinal humana, no entanto,
existe uma espécie patogénica (enterohaemorrhagic) responsável por grande
parte das intoxicações alimentares. (92) A sua infecção pode provocar diarreia
intensa, podendo ser fatal. Por sua vez, a Salmonella é reportada como
sendo a responsável por grande parte das gastroenterites comuns e doenças
similares, por todo o mundo.
Por outro lado, a contaminação dos alimentos por leveduras como a
S.cerevisiae e C.albicans são bastante comuns, sendo agentes causadores
de micoses oportunistas e infecções na mucosa oral, respectivamente. (92)
Capítulo 2
- 117 -
Escolheu-se o hidroxitirosol como composto fenólico padrão devido ao
elevado teor deste composto presente no extracto estudado, EBH. Como
composto de referência seleccionou-se a oleuropeína, dado que a sua
actividade antimicrobiana contra diversos agentes patogénicos tinha sido já
reportada na literatura.
Espécies de Microorganismos Todas as estirpes de bactérias avaliadas (Escherichia coli C7085L,
Salmonella poona C6009L e Bacillus cereus C1220) e as leveduras
(Saccharomyces cerevisiae C8201L e Candida albicans C1503L), foram
recuperadas a partir de culti-loops comerciais da Oxoid (Hampshire,
Inglaterra).
Meios de Cultura e Inóculos As culturas de bactérias foram mantidas em dois tipos de meio, meio Mueller-
Hinton (MH) (Biokar Diagnostic, França) e meio Nutritivo (CN). O meio
Nutritivo foi preparado com Bacto Tryptone (BD, Sparks,USA), extracto de
carne seca (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e cloreto de sódio (Panreac,
Química SA, Barcelona, Espanha). As leveduras cresceram em meio de
dextrose de batata (PDB) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e em sumo
de maçã comercial.
Cada estirpe de microorganismo foi ressuspendida em 5 mL de meio, as
bactérias Gram(-) foram de seguida incubadas durante a noite a 37 ºC, os
B.cereus a 30 ºC e as leveduras a 25 ºC.
O crescimento e desenvolvimento das culturas foram controlados pela
medida da turbidez a 620 nm, a fim de se obter um inóculo de 108cfu/ml.
Ensaio Antimicrobiano
Utilizou-se uma adaptação ao método fotométrico em placas(94) para realizar
os ensaios de actividade antimicrobiana do extracto e compostos padrão.
Utilizaram-se placas de 96 poços, onde, em cada poço, se adicionou meio de
Capitulo 2
- 118 -
crescimento (10 e103cfu/ml) e 100 μL de várias concentrações de extracto ou
compostos puros. Nos poços de controlo, colocou-se 100 μL de meio de
crescimento em vez de extracto ou compostos puros. O ensaio foi realizado,
para as bactérias, em meio MH e CN e, para as leveduras, em PDB e em
sumo de maçã comercial. As placas foram de seguida incubadas a condições
específicas para cada microorganismo (37 ºC para as bactérias Gram(-),
30 ºC para B.cereus e 25 ºC para as leveduras). A diferentes tempos de
incubação (18, 24, 48 e 72h), as placas foram agitadas e a absorvância
medida a 620 nm. Os resultados apresentados são a média correspondente a
(n=3) experiências sendo o erro associado <5 %.
Os resultados estão representados abaixo, nas Figuras 2.35 e 2.36.
Figura 2.35 Actividade antibacteriana do extracto bioactivo EBH e dos compostos padrão
hidroxitirosol (HT) e oleuropeina (OL) no crescimento às 18 h das bactérias E. coli, B. cereus e S.
poona em meio Muller Hinton (MH) e meio nutritivo (CN). Os resultados são a diferença entre a
absorvância medida às 18 h e às 0 h.
0
0,5
1
1,5
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
E.coli
B. cereus
0
0,5
1
1,5
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
10 cfu/ml CN 10 cfu/ml MH 10 3̂ cfu/ml CN 10 3̂ cfu/ml M
S. poona
EBHEBH((mgmgHTHT/L)/L)
HTHT(mg/L)(mg/L)
OLOL(mg/L)(mg/L)
0
0,5
1
1,5
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
E.coli
B. cereus
0
0,5
1
1,5
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
10 cfu/ml CN 10 cfu/ml MH 10 3̂ cfu/ml CN 10 3̂ cfu/ml M
S. poona
EBHEBH((mgmgHTHT/L)/L)
HTHT(mg/L)(mg/L)
OLOL(mg/L)(mg/L)
0
0,5
1
1,5
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
E.coli
B. cereus
0
0,5
1
1,5
Abs
(620
nm)
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
10 cfu/ml CN 10 cfu/ml MH 10 3̂ cfu/ml CN 10 3̂ cfu/ml M
S. poona
EBHEBH((mgmgHTHT/L)/L)
HTHT(mg/L)(mg/L)
OLOL(mg/L)(mg/L)
Capítulo 2
- 119 -
Figura 2.36 Actividade anti-leveduras do extracto bioactivo EBH e dos compostos padrão
hidroxitirosol (HT) e oleuropeina (OL) no crescimento às 18h da C. albicans e da S. cerevisiae
em meio de dextrose de batata (PDB) e em sumo de maçã comercial. O inoculo de levedura
utilizado foi de 106cfu/ml. Os resultados são a diferença entre a absorvância medida às 18 h e às
0 h.
Actividade Antibacteriana
Como referido anteriormente, em ordem a verificar se o meio de cultura é um
factor importante para a actividade antimicrobiana do extracto natural e
compostos padrão, realizou-se o ensaio de crescimento bacteriano em dois
tipos diferentes de meio: o meio MH e o CN. Os resultados apresentam-se na
Figura 2.35.
0
0,5
1
1,5
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
Sumo MaçaPDB
0
0,5
1
1,5
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
Sumo MaçaPDB
Candida albicans
S. cerevisae
Abs
18h-
Abs
0h(6
20nm
)Ab
s 18h
-Abs
0h(6
20nm
)
((mgmgHTHT/L)/L)EBHEBH
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
((mgmgHTHT/L)/L)EBHEBH
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
0
0,5
1
1,5
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
Sumo MaçaPDB
0
0,5
1
1,5
Controlo 25 50 75 25 50 75 250 500 700
Sumo MaçaPDB
Candida albicans
S. cerevisae
Abs
18h-
Abs
0h(6
20nm
)Ab
s 18h
-Abs
0h(6
20nm
)
((mgmgHTHT/L)/L)EBHEBH
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
((mgmgHTHT/L)/L)EBHEBH
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
(mg/L)(mg/L)HTHT
(mg/L)(mg/L)OLOL
Capitulo 2
- 120 -
Considerando os resultados obtidos para o controlo (crescimento de
bactérias só em meio MH e CN sem adição de extracto e de HT e OL), a
dependência da composição do meio de cultura no crescimento bacteriano é
evidente. Todas as estirpes de bactérias estudadas mostraram um
crescimento mais rápido no meio mais nutritivo, o MH. No entanto, o
comportamento antimicrobiano do EBH e do HT no crescimento das estirpes
Gram (-) não é alterado. Tanto para a E. Coli, como para a S. Poona, o EBH
e o HT não apresentam, em nenhuma situação, nenhum tipo de efeito sobre
o seu crescimento, enquanto para a OL, a inibição verificada para o
crescimento bacteriano no meio MH é também verificada no meio CN.
Quando se analisam os resultados para os B. cereus, a composição do meio
de crescimento influência claramente a resposta antimicrobiana das soluções
testadas. No meio mais nutritivo, a actividade antimicrobiana é nula para o
EBH, HT e OL.
Analisando só os resultados obtidos para o crescimento bacteriano no meio
menos nutritivo (CN), verificou-se que o extracto natural EBS, o HT e a OL
apresentaram uma actividade antimicrobiana mais baixa perante as bactérias
Gram(-), E. coli e S. poona do que as bactérias Gram(+) B.cereus (Figura
2.35), sugerindo que as bactérias Gram(-) são mais resistentes aos
polifenóis, como o HT e a OL. Esta observação já tinha sido reportada para a
actividade antimicrobiana das águas ruças provenientes de um processo
descontínuo de extracção de azeite.(95) Este facto pode estar relacionado
com as diferenças existentes na parede celular das bactérias, dado que as
bactérias Gram(+) possuem uma parede celular com uma estrutura menos
complexa, tornando-a, por isso, mais permeável aos compostos
antimicrobianos.
Verifica-se uma melhor capacidade de inibição do crescimento das bactérias
Gram(+) por parte da OL, composto que não faz parte da composição do
EBH, sendo a actuação do extracto muito semelhante à do HT nas mesmas
concentrações.
Contudo, no caso do B. cereus, o extracto para a concentração testada mais
reduzida provoca inibição total do crescimento, enquanto o mesmo não se
verifica para o composto puro testado na mesma concentração. Este
Capítulo 2
- 121 -
resultado indica a presença de outros compostos no extracto que actuam em
sinergia, melhorando a actividade do extracto.
Efeito do EBH, HT e OL no crescimento das leveduras
A actividade antimicrobiana contra duas estirpes de leveduras, S.cerevisiae e
C.albicans, foi também testada. Neste ensaio, as duas leveduras cresceram
separadamente, durante 18 h em meio PDB com várias concentrações
adicionadas individualmente de EBH, HT e OL. O crescimento das leveduras
somente em meio de cultura foi utilizado como controlo. Os resultados
(Figura 2.36) revelam que o extracto EBH é o mais activo na inibição do
crescimento destas estirpes. O EBH exibe dependência da dose na inibição
do crescimento das leveduras, sendo esta praticamente total para as duas
concentrações mais elevadas testadas. O HT, nas mesmas concentrações,
não apresenta o mesmo efeito, reforçando a hipótese de sinergias positivas
resultantes da combinação de diferentes compostos fenólicos no extracto
natural. A OL não apresenta inibição no crescimento das duas estirpes
estudadas.
Tendo em conta os dados apresentados e considerando que as leveduras
são os principais responsáveis pelas contaminações de sumo de fruta,
efectuou-se o mesmo ensaio utilizando como meio de crescimento sumo
comercial de maçã.
Os resultados obtidos no controlo experimental levam a concluir que o
crescimento das leveduras é mais lento no sumo de maçã do que no meio de
cultura anteriormente testado. Este facto relaciona-se com a diferença de
composição e do pH do meio, pois o pH do meio PDB é igual a sete e o do
sumo é igual a quatro.
Não obstante, a actividade do EBH continuou a ser dependente da
concentração testada, sendo contudo mais efectiva do que no meio PDB.
No geral, o EBH apresenta evidente actividade antimicrobiana dependente da
dose, sendo esta, no entanto, mais especifica para bactérias Gram(-) e para
Capitulo 2
- 122 -
leveduras. A acção do composto puro HT apresenta a mesma especificidade
do EBH, sendo a sua acção menos efectiva do que a do extracto natural.
Este facto sugere-nos duas situações (já referidas anteriormente noutros
ensaios realizados):
i) Sinergia positiva resultante dos compostos constituintes do EBH,
resultando num reforço da resposta;
ii) Presença de outros compostos no extracto com actividade antimicrobiana.
Dos resultados apresentados anteriormente, conclui-se que o EBH tem
potencial para ser desenvolvido como conservante natural para a indústria
alimentar.
Capítulo 2
- 123 -
2.4 Conclusões
A utilização de concentrados naturais como ingredientes activos
(Bioprodutos) fundamentais na formulação de alimentos funcionais e/ou
nutracêuticos é, hoje em dia, uma área de investigação em evidente
crescimento. (96) Associada à preocupação, cada vez mais evidente dos
consumidores, por alimentos mais saudáveis e essencialmente baixos em
teor de gorduras, a indústria alimentar tem reunido esforços no sentido de
procurar encontrar formulações de óleos de maior valor nutricional, com
benefícios específicos no bem-estar e saúde de quem os consome .
A adição de extractos ricos em compostos específicos do azeite a um óleo
alimentar é interessante, quer do ponto de vista de aumento de estabilidade
do produto, quer do ponto de vista de potenciais alegações de saúde
associadas. Os extractos seleccionados para o estudo eram aquosos,
necessitando de adjuvantes que facilitassem a sua incorporação numa matriz
lipídica. Neste sentido, realizaram-se estudos de incorporação através de três
métodos distintos, evidenciando-se de entre os três métodos estudados, o
método por encapsulação dos extractos em sistemas de base lipídica,
recorrendo a tecnologia supercrítica.
A viabilidade de formulação de óleos funcionalizados com extractos ricos em
compostos da azeitona depende principalmente de três factores essenciais:
i) da forma de incorporação dos mesmos nos óleos vegetais;
ii) das propriedades e características dos extractos selecionados;
iii) da existência de extractos em quantidades necessárias a preços
acessiveis.
A avaliação exaustiva das propriedades antioxidantes e actividades
biológicas dos extractos seleccionados para a formulação de óleos funcionais
foi essencial para decidir as quantidades necessárias de concentrados
activos a utilizar na incorporação, bem como quais as características que se
poderiam atribuir ao novo óleo funcional.
Capitulo 2
- 124 -
A integração de tecnologias limpas, para processamento de resíduos
resultantes da extracção de azeite, têm como resultado a obtenção de
extractos com composições singulares aos quais se podem atribuir potenciais
actividades biológicas.
Através dos ensaios realizados, foi possível concluir que isolar determinados
compostos fenólicos a partir de uma matriz vegetal, isolando-os do seu meio,
diminuiu as suas características comos antioxidantes, diminuindo também as
resultantes propriedades biológicas. Exemplo disso, e tendo em conta a
concentração em HT, composto alvo nos estudos realizados, foi o facto de os
resultados de capacidade antioxidante e actividade biológica não serem mais
favoráveis para o extracto mais rico em HT, cuja composição em termos de
polifenóis, era a menos complexa.
A complexidade da matriz nem sempre é uma vantagem, pois a presença de
determinados polifenóis polimerizados, de maior peso molecular e de outros
compostos não fenólicos (como por exemplo metais), pode impedir
compostos mais simples como o HT de agir, inibindo a sua acção.
É, por isso, uma tarefa difícil balançar a presença de compostos constituintes
da matriz vegetal que possam exercer, entre si, sinergias que potenciam as
propriedades antioxidantes e biológicas dos extractos. Na tentativa de
seleccionar quais os compostos fenólicos em maior concentração nos
extractos finais, foram realizados estudos de pré-tratamento das matérias
primas utilizadas. Verificou-se o aumento dos compostos alvo nos dois tipos
de tratamento efectuados, sendo ambos mais efectivos quando aplicados à
matriz húmida resultante do processo em descontínuo da extracção de
azeite. Deste estudo, evidenciou-se principalmente a potencialidade de
manter a materia-prima em atmosfera de CO2 pressurizado, onde se
associou, a uma maior estabilidade da matriz, a possibilidade de conversão
de polifenóis de maior peso molecular em HT. A estabilidade da matriz é
melhorada por se encontrar num ambiente não favorável à oxidação e à
presença de microorganismos aeróbios, sendo este passo fundamental para
se manter as características dos extractos bioactivos finais.
Da avaliação das características e propriedades antioxidantes dos extractos
seleccionados, todos eles apresentaram capacidade antioxidante perante
diferentes espécies de radicais livres. Contudo, a especificidade da
Capítulo 2
- 125 -
capacidade antioxidante variou consoante a composição singular de cada
extracto, obtendo-se, por isso, respostas distintas nos estudos de actividade
biológica efectuados. Os extractos avaliados apresentaram capacidade de
inibição da proliferação de duas linhas distintas de células cancerígenas,
evidenciando a sua acção no ciclo de vida celular, influênciando, assim, o
processo de carcinogenesis.
Na globalidade, pode-se concluir que os extractos obtidos a partir deste tipo
de matrizes e ricos em HT apresentam capacidades antioxidantes relevantes,
com potencialidade de prevenção de doenças relacionadas com o stress
oxidativo induzido pela exposição celular aos radicais livres, como diversos
tipos de cancro, aterosclerose e doenças cardiovasculares.
Hoje em dia, é crescente a procura por este tipo de extractos bioactivos
derivados da azeitona, para formulação de alimentos funcionais, existindo,
para tal procura, poucos fornecedores e produtores mundiais. Este facto,
associado ao carácter natural e às tecnologias específicas necessárias para
os processar, tornam a cotação comercial destes produtos bastante elevada,
sendo, por isso, pouco acessíveis a determinadas áreas da indústria
alimentar, devido ao incremento não comportável no custo de produção do
novo alimento funcional.
Capitulo 2
- 126 -
2.5 Referências (1) Francesco Visioli, A.P., Claudio Gall,, Antioxidant and Other Biological Activities of Phenols from Olives and Olive Oil, Medicinal Research Reviews, 2002, 22, 65-75. (2) Francesco Visioli, C.G., Giovanni Galli, Donatella Caruso,, Biological Activities and Metabolic Fate of Olive Oil Phenols, European Journal of Lipid Science and Technology, 2002, 104, 677-684. (3) Owen, R.W., Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Würtele, G., Spiegelhalder, B. and Bartsch, H., Olive-Oil Consumption and Health: The Possible Role of Antioxidants, The Lancet Oncology, 2000, 1, 107-112. (4) Montserrat Fitó, R.d.l.T., María-Isabel Covas,, Olive Oil and Oxidative Stress, Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51, 1215-1224. (5) E. Gimeno, A.I.C., R. M. Lamuela-Raventós, M. C. de la and Torre, M.C.L.-S., The Effect of Harvest and Extraction Methods on the Antioxidant Content (Phenolics, Atocopherol, and B-Carotene) in Virgin Olive Oil., Food Chem., 2002, 78, 207-211. (6) Gomez-Rico, A., Salvador, M.D., La Greca, M. and Fregapane, G., Phenolic and Volatile Compounds of Extra Virgin Olive Oil (Olea Europaea L. Cv. Cornicabra) with Regard to Fruit Ripening and Irrigation Management, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54, 7130-7136. (7) Morello, J.-R., Vuorela, S., Romero, M.-P., Motilva, M.-J. and Heinonen, M., Antioxidant Activity of Olive Pulp and Olive Oil Phenolic Compounds of the Arbequina Cultivar, J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 2002-2008. (8) Rodis, P.S., Karathanos, V.T. and Mantzavinou, A., Partitioning of Olive Oil Antioxidants between Oil and Water Phases, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 596-601. (9) Mulinacci, N., Romani, A., Galardi, C., Pinelli, P., Giaccherini, C. and Vincieri, F.F., Polyphenolic Content in Olive Oil Waste Waters and Related Olive Samples, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 3509-3514. (10) Susana M Cardoso, Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, José A Lopes-da-Silva, Catherine MGC Renard and Manuel A Coimbra, Characterisation of Phenolic Extracts from Olive Pulp and Olive Pomace by Electrospray Mass Spectrometry, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85, 21-32. (11) Manna, C., Della Ragione, F., Cucciolla, V., Borriello, A., D'Angelo, S., Galletti, P. and Zappia, V., Biological Effects of Hydroxytyrosol, a Polyphenol from Olive Oil Endowed with Antioxidant Activity, Adv Exp Med Biol, 1999, 472, 115-30. (12) D'Angelo, S. et al., Hydroxytyrosol, a Natural Antioxidant from Olive Oil, Prevents Protein Damage Induced by Long-Wave Ultraviolet Radiation in Melanoma Cells, Free Radic Biol Med, 2005, 38, 908-19. (13) Aparicio, R., Roda, L., Albi, M.A. and Gutierrez, F., Effect of Various Compounds on Virgin Olive Oil Stability Measured by Rancimat, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 4150-4155. (14) Bendini, A., Cerretani, L., Carrasco-Pancorbo, A., Gomez-Caravaca, A.M., Segura-Carretero, A., Fernandez-Gutierrez, A. and Lercker, G., Phenolic Molecules in Virgin Olive Oils: A Survey of Their Sensory Properties, Health Effects, Antioxidant Activity and Analytical Methods. An Overview of the Last Decade, Molecules, 2007, 12, 1679-1719. (15) Hrncirik, K. and Fritsche, S., Relation between the Endogenous Antioxidant System and the Quality of Extra Virgin Olive Oil under Accelerated Storage Conditions, J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 2103-2110. (16) Carrasco-Pancorbo, A., Cerretani, L., Bendini, A., Segura-Carretero, A., Lercker, G. and Fernandez-Gutierrez, A., Evaluation of the Influence of Thermal Oxidation on the Phenolic Composition and on the Antioxidant Activity of Extra-Virgin Olive Oils, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55, 4771-4780. (17) Schieber, A., Stintzing, F.C. and Carle, R., By-Products of Plant Food Processing as a Source of Functional Compounds -- Recent Developments, Trends in Food Science & Technology, 2001, 12, 401-413. (18) Obied, H.K., Allen, M.S., Bedgood, D.R., Prenzler, P.D., Robards, K. and Stockmann, R., Bioactivity and Analysis of Biophenols Recovered from Olive Mill Waste, J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 823-837.
Capítulo 2
- 127 -
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Capitulo 2
- 128 -
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Capítulo 2
- 129 -
(63) Manna, C., Galletti, P., Maisto, G., Cucciolla, V., D'Angelo, S. and Zappia, V., Transport Mechanism and Metabolism of Olive Oil Hydroxytyrosol in Caco-2 Cells, FEBS Lett, 2000, 470, 341-4. (64) Corona, G., Tzounis, X., Dessi, M.A., Deiana, M., Debnam, E.S., Visioli, F. and Spencer, J.P.E., The Fate of Olive Oil Polyphenols in the Gastrointestinal Tract: Implications of Gastric and Colonic Microflora-Dependent Biotransformation, Free Radical Research, 2006, 40, 647-658. (65) Pinto, M., Robine-Leon, S. and Appay, M.D., Enterocyte-Like Differentiation and Polarization of the Human Colon Carcinoma Cell Line Caco-2 in Culture, Biol. Cell., 1983, 47, 323–330. (66) Frade, R.F.M., Matias, A., Branco, L.C., Afonso, C.A.M. and Duarte, C.M.M., Effect of Ionic Liquids on Human Colon Carcinoma Ht-29 and Caco-2 Cell Lines, Green Chem., 2007, 9, 873 - 877. (67) Liu, R.H. and Finley, J., Potential Cell Culture Models for Antioxidant Research, J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 4311-4314. (68) Liu, R.H., Potential Synergy of Phytochemicals in Cancer Prevention: Mechanism of Action, J. Nutr., 2004, 134, 3479S-3485. (69) YOKOMIZO, A. and MORIWAKI, M., Effects of Uptake of Flavonoids on Oxidative Stress Induced by Hydrogen Peroxide in Human Intestinal Caco-2 Cells, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2006, 70, 1317-1324. (70) Wolfe, K.L. and Liu, R.H., Cellular Antioxidant Activity (Caa) Assay for Assessing Antioxidants, Foods, and Dietary Supplements, J Agric Food Chem, 2007, 55, 8896-907. (71) Corona, G., Deiana, M., Incani, A., Vauzour, D., Dessi, M.A. and Spencer, J.P.E., Inhibition of P38/Creb Phosphorylation and Cox-2 Expression by Olive Oil Polyphenols Underlies Their Anti-Proliferative Effects, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 362, 606-611. (72) Hwang JH, JY, K., MR, C. and HR., P., Effect of Methanolic Extract from Silkworm Droppings on Proliferation and Caspase Activity in Ht-29 Human Colon Cancer Cells., J Med Food., 2007, 10, 467-72. (73) Owen, R.W., Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Spiegelhalder, B. and Bartsch, H., The Antioxidant/Anticancer Potential of Phenolic Compounds Isolated from Olive Oil, Eur J Cancer, 2000, 36, 1235-47. (74) de la Puerta, R., Martinez-Dominguez, E. and Ruiz-Gutierrez, V., Effect of Minor Components of Virgin Olive Oil on Topical Antiinflammatory Assays, Z Naturforsch [C], 2000, 55, 814-9. (75) Covas, M.I. et al., Postprandial Ldl Phenolic Content and Ldl Oxidation Are Modulated by Olive Oil Phenolic Compounds in Humans, Free Radical Biology and Medicine, 2006, 40, 608-616. (76) Goya, L., Mateos, R. and Bravo, L., Effect of the Olive Oil Phenol Hydroxytyrosol on Human Hepatoma Hepg2 Cells - Protection against Oxidative Stress Induced by Tert- Butylhydroperoxide, European Journal of Nutrition, 2007, 46, 70-78. (77) Visioli, F. and Galli, C., Biological Properties of Olive Oil Phytochemicals, Crit Rev Food Sci Nutr, 2002, 42, 209-21. (78) Fabiani, R., Rosignoli, P., De Bartolomeo, A., Fuccelli, R. and Morozzi, G., Inhibition of Cell Cycle Progression by Hydroxytyrosol Is Associated with Upregulation of Cyclin-Dependent Protein Kinase Inhibitors P21(Waf1/Cip1) and P27(Kip1) and with Induction of Differentiation in Hl60 Cells, Journal of Nutrition, 2008, 138, 42-48. (79) Yumi Z.H-Y. Hashim, I.R.R., Hugh McGlynn, Maurizio Servili, Roberto Selvaggini, Agnese Taticchi, Sonia Esposto, GianFrancesco Montedoro, Leena Kaisalo, Kristiina Wähälä, Chris I.R. Gill,, Inhibitory Effects of Olive Oil Phenolics on Invasion in Human Colon Adenocarcinoma Cells <I>in Vitro</I>, International Journal of Cancer, 2008, 122, 495-500. (80) Chris I.R. Gill, A.B., Emily McDermott, Mark McCann, Maurizio Servili, Roberto Selvaggini, Agnese Taticchi, Sonia Esposto, GianFrancesco Montedoro, Hugh McGlynn, Ian Rowland,, Potential Anti-Cancer Effects of Virgin Olive Oil Phenolson Colorectal Carcinogenesis Models <I>in Vitro</I>, International Journal of Cancer, 2005, 117, 1-7. (81) Meeran, S. and Katiyar, S., Cell Cycle Control as a Basis for Cancer Chemoprevention through Dietary Agents., Front Biosci., 2008, 1, 2191-202. (82) ENDO, K., KOHNOE, S., TSUJITA, E., WATANABE, A., NAKASHIMA, H., BABA, H. and MAEHARA, Y., Modulation of Anti-Apoptosis by Endogenous Iap Expression in Mkn45 Human Gastric Cancer Cells, Anticancer research, 2005, 25, 2713-2717. (83) Ran, Z.H., Xu, Q., Tong, J.L. and Xiao, S.D., Apoptotic Effect of Epigallocatechin-3-Gallate on the Human Gastric Cancer Cell Line Mkn45 Via Activation of the Mitochondrial Pathway, World J Gastroenterol, 2007, 13, 4255-4259.
Capitulo 2
- 130 -
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- 131 -
Once maligned, fats and oils are now viewed as healthful dietary components. In Nutraingredients.com
Neste capítulo são abordados trabalhos de I&D que tiveram como principal
objectivo avaliar diferentes alternativas de funcionalização de óleos
alimentares. Os dois sub-capítulos, que compõe este capítulo 3, reportam
objectivos distintos de funcionalização de óleos alimentares, sendo ambos,
resultado da ambição constante da indústria parceira e financiadora deste
projecto, na melhoria contínua do produto final, desde a linha de produção ao
seu processo de utilização pelos consumidores.
3.1 Introdução Os óleos alimentares contêm naturalmente na sua composição antioxidantes,
como por exemplo os tocoferóis, cuja função é prevenir a oxidação dos
ácidos gordos instaurados. (1) No entanto, ao longo da vida do produto ou
durante o seu aquecimento (temperaturas de fritura), os compostos
3 – Óleos Funcionais – Propostas de soluções
Capítulo 3
- 132 -
antioxidantes degradam-se deixando de actuar na protecção à oxidação
lipídica.(2)
A fritura por imersão é um processo extremamente complexo cujo
desempenho determina o produto final: cor dos alimentos, aspecto, sabor e
textura. A estabilidade do produto final depende assim da resistência do óleo
vegetal à oxidação, durante o processo de fritura. (3)
Existem várias formas de aumentar naturalmente a estabilidade oxidativa dos
óleos de fritura, nomeadamente formular misturas de óleos ricos em ácidos
gordos monoinsaturados (MUFAs) e polinsaturados (PUFAs) com óleos com
elevado teor de ácidos gordos saturados. (3) No entanto, as gorduras
saturadas, apesar de estáveis à oxidação têm um forte impacto na saúde,
estando o seu consumo regular associado a doenças tais como doenças
cardiovasculares e diabetes tipo II, forçando a indústria a procurar
alternativas. (4,5)
Hoje em dia, a formulação de uma boa gordura vegetal tem por objectivo
combinar um perfil lipídico mais saudável com uma estabilidade oxidativa
mais elevada, com a preocupação de colocar no mercado óleos mais
estáveis que mantenham as suas propriedades e características nutritivas
durante o seu tempo de vida em prateleira e processos de utilização. (6) Este
facto, torna emergente a procura de soluções para a instabilidade dos óleos
alimentares.
Em resposta a este desafio, os extractos de origem vegetal com propriedades
antioxidantes, são cada vez mais um recurso utilizado para o aumento da
estabilidade de óleos alimentares polinsaturados. As matérias-primas mais
procuradas para o desenvolvimento destes extractos de origem vegetal são
em muitos casos as que dão origem às próprias gorduras vegetais
insaturadas, mas conhecidas como sendo extremamente resistentes à
oxidação lipídica: o azeite, o óleo de sésamo e o óleo de arroz. (3,6-8)
Capítulo 3
- 133 -
3.2 Funcionalização de Óleo de Girassol através da adição de Partículas Bioactivas Partículas Bioactivas e Bioprodutos
O objectivo deste estudo foi avaliar a potencialidade da incorporação, em
óleos alimentares, de diferentes ingredientes activos (bioprodutos comerciais
e não comerciais) encapsulados em partículas lipídicas (PL) formuladas
recorrendo a tecnologia supercrítica descrita no capítulo anterior, Capítulo 2.
No trabalho anterior, concluiu-se que a composição saturada dos adjuvantes
lipídicos utilizados na formulação da partículas (PL) potenciava o aumento da
estabilidade do óleo à oxidação.
Nesse sentido, seleccionou-se concentrados activos e compostos
antioxidantes com diferentes características, para utilizar na formulação das
PL, tendo como objectivo final avaliar a influência de cada sistema na:
• Resistência dos óleos formulados à oxidação lipídica, durante trinta
dias (simulando o tempo de armazenagem em casa dos
consumidores);
• Performance e estabilidade dos óleos formulados durante simulação
de processo de fritura doméstico.
A variação da temperatura é um factor condicionante na estabilidade dos
óleos alimentares, variando o tipo de reacções e interacções ocorridas num
processo de aquecimento de 20 ºC a 200 ºC. (9) Na Tabela 3.1, estão
sumarizadas as reacções e interacções que podem ocorrer num óleo
alimentar a determinados intervalos de temperatura, e quais os possíveis
inibidores efectivos para cada etapa.
Capítulo 3
- 134 -
Tabela 3.1 Reacções e Interacções ocorridas num óleo alimentar com a temperatura. (9)
Intervalo de
Tempera-turas
Reacção Iniciada
por Inibida
por
20-100ºC
Hidrólise Mecanismo:
Hidrólise
H2O
(dos
alimentos)
Adição de sivos moleculares,
Filtração
(remoção da H2O)
20-140ºC
Autooxidação Mecanismo:
Radicalar
O2,
Iões
Metálicos.
Compostos Fenólicos
Antioxidantes (AOX),
BHA, BHT, Galatos
α-Tocoferol
Anti-espuma
Anti-aglomerantes
120-200ºC
Polimerização Mecanismo:
Eliminação
Desidratação
Substituição
Nucleofílica
H+,
Vapor
água.
Sinergias entre AOX
Palmitato de ascorbilo (E304)
γ-Tocoferóis
Ácido Citrico
Ingredientes Naturais
Fitosteróis
Orizanol
Sesamolina
Esqualeno
Extracto Rosmaninho
Tendo em conta as possíveis reacções ocorridas com a variação da
temperatura, seleccionou-se os ingredientes activos (bioprodutos) para que a
as reacções fossem inibidas por algum dos compostos escolhidos. Os
bioprodutos seleccionados para realizar o estudo foram os seguintes:
• Fitosteróis vegetais, FV (concentrado comercial de diversos esteróis);
• Tocoferóis vegetais, Toc (concentrado comercial de α, β, γ -
tocoferol),
• Ácido Ascórbico (E300, Sigma, Espanha),
• Dimetil-polisiloxano, DMPS - E900 (Anti-espuma),
• Dióxido silicone (Aerosil 200, Degussa) (Anti-aglomerante)
• EBH, extracto bioactivo estudado no Capítulo 2, (rico em polifenóis,
nomeadamente hidroxitirosol).
Capítulo 3
- 135 -
Tabela 3.2 Via de actuação dos bioprodutos e compostos seleccionados.
Intervalo de
Temperaturas Reacção
Iniciada por
Inibida por
20-140ºC Autooxidação
O2,
Iões
Metálicos
.
EBH
Toc
DMPS
Aerosil 200
120-200ºC
Polimerização
Mecanismo:
Eliminação
Desidratação
Substituição
Nucleofílica
H+,
Vapor
água.
Sinergias entre AOX
Àcido Ascórbico (E300)
Toc
Ingredientes Naturais
FV (Fitosteróis)
Aerosil 200
O ácido ascórbico foi seleccionado, pois apesar de ser um composto
hidrofílico este foi adicionado ao óleo vegetal encapsulado nas PL, não tendo
sido assim necessário recorrer ao palmitato de ascorbilo. O palmitato de
ascorbilo (Ácido 6-palmitil-L-ascórbico, E304) é um éster do ácido ascórbico,
utilizado recorrentemente na indústria alimentar, muito utilizado para
formulações à base de gorduras vegetais. No entanto, a incorporação do
palmitato de ascorbilo a óleos vegetais, necessita de agitação vigorosa a
temperatura sempre superior a 60 ºC, não sendo imediata a sua
solubilização. A encapsulação de ácido ascórbico nas PL elimina os
problemas de solubilização verificados para o palmitato de ascorbilo,
protegendo em simultâneo o ácido ascórbico à oxidação e aumentando a sua
estabilidade.
Formulação das Partículas Bioactivas
O processo de produção das PL foi idêntico ao já descrito no Capítulo 2.
Utilizaram-se os mesmos adjuvantes lipídicos, o Precirol ato 5 e o Lumulse
GMS K na proporção mássica (50:50). As condições operatórias de pressão
e temperatura (P,T) foram 120 bar (12 MPa) e 50 ºC (325 K)
respectivamente.
Capítulo 3
- 136 -
As percentagens utilizadas de princípios activos variaram para cada estudo
realizado e encontram-se registadas, mais à frente, nas Tabelas 3.3 e 3.4.
Incorporação no Óleo Alimentar
A incorporação das diferentes PL + Bioproduto nos óleos alimentares
consistiu em adicionar 140 mg de cada sistema produzido, a 140 g de óleo
alimentar, perfazendo uma concentração de partículas de 1000 mg/kg de
óleo. A solubilização das partículas no óleo foi conseguida por agitação
manual, ocorrendo homogeneização total minutos depois.
As características sensoriais (cor, brilho e cheiro) não foram
significativamente alteradas.
3.2.1 Impacto Estabilidade Oxidativa – Tempo de vida do
Produto
Este estudo dividiu-se em duas partes distintas:
A) Influência e estudo de sinergias existentes após incorporação das PL
em óleo de Girassol
O principal objectivo deste trabalho consistiu em avaliar o impacto da adição
de ácido ascórbico na estabilidade oxidativa de óleo de girassol. Estudou-se
a importância do aumento da dose bem como possíveis sinergias existentes
com determinados micronutrientes (também constituintes do óleo de girassol)
importantes como inibidores de determinadas reacções de degradação,
nomeadamente, tocoferóis e fitosteróis. A influência da adição de um anti-
aglomerante foi também avaliada. Comparou-se a capacidade antioxidante
do ácido ascórbico com a do extracto rico em polifenóis da azeitona, quando
incorporados na mesma percentagem em relação aos adjuvantes.
Capítulo 3
- 137 -
B) Influência da adição de polifenóis característicos da azeitona na
estabilidade oxidativa de óleos alimentares.
O objectivo foi avaliar a influência dos biofenóis presentes nos extractos ricos
em HT, na inibição da degradação de óleo de girassol, comparando a
actuação do extracto bioactivo encapsulado nas PL com a actuação do
mesmo quando solubilizado directamente no óleo vegetal. A influência da
composição lipídica e de micronutrientes do óleo foi também avaliada.
Parte I
As composições das PL formuladas no âmbito deste estudo estão
sumarizadas na Tabela 3.3.
Tabela 3.3 Composições das Partículas Lipídicas testadas (%m/m Lípido). Controlo: só
adjuvantes lipídicos (PL).
PL Ácido Ascórbico Fitosteróis Tocoferóis
EBH Extracto Bioactivo
AEROSIL 200 (hidrofílico)
PLA 17 - - - -
PLB 17 - 2 - -
PLC 17 5 - - -
PLD 33 - - - -
PLE 17 5 - - 6
PLF - - - 15 -
As escolha das quantidades de cada composto ou bioproduto utilizadas na
produção das PL, teve por base limites permitidos por lei, a nível de
alegações de rotulagem (as dose diária recomendadas - DDR), e a nível de
aditivos alimentares para se cumprir sempre a legislação nacional e Europeia
(Directiva 95/2/EC). Foi tido em consideração, o impacto no preço no produto
final da adição das PL aos óleos alimentares.
Após incorporação das PL no óleo de girassol, cada amostra foi desarejada
utilizando azoto, colocada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, durante
30 dias.
Capítulo 3
- 138 -
Nestas condições, a oxidação lipídica é na sua maioria um mecanismo de
autooxidação, envolvendo a formação de espécies de radicais livres,
altamente instáveis, que iniciam reacções em cadeia radicalares. Os produtos
dessas reacções radicalares, são produtos da oxidação, importantes de
serem monitorizados no estudo da interferência de antioxidantes na inibição
do processo de degradação lipídica e consequente impacto no seu tempo de
vida.
Ao final de 20 e 30 dias, avaliou-se o grau da degradação dos óleos
preparados com as PL, através de testes de estabilidade em tempo real (10)
nos quais se quantificam os produtos da oxidação resultantes das várias
etapas das reacções radicalares – propagação (peróxidos) e terminação
(ácidos gordos livres, aldeídos e álcoois voláteis). (9)
A quantificação do índice de peróxidos (IP) foi determinada por titulação
iodométrica segundo a norma NP 3960 – Quantificação de Índice de
Peróxidos em gorduras vegetais (Anexo B), sendo os resultados expressos
em mEq O2/kgóleo ± DP. A acidez, quantificada através de titulação dos ácidos
gordos livres com uma solução etanólica de hidróxido de potássio e os
resultados expressos em % Ácido Oleico ± DP (%FFA), foi realizada de
acordo com a norma da AOCS Ca 5-a 40 (Anexo B). Ambos os ensaios
foram realizados em duplicado.
A produção de aldeídos e álcoois voláteis, responsáveis pelo característico
odor a ranço, foram indirectamente monitorizados através de um teste de
estabilidade acelerado, avaliando o tempo necessário (Tempo de Indução -
TI) para se atingir um “ponto crítico” do processo de oxidação radicalar, i.e. o
tempo em a fase de propagação da oxidação é iniciada. (10) O teste utilizado
para esta medição, foi o teste Rancimat descrito mais sucintamente no
Anexo B. (11-13) Os ensaios, realizados em triplicado, fazem passar uma
corrente de ar (20 mL/min) aquecido a 120 ºC por 3 g de amostra de cada
óleo, num Rancimat Methrom (modelo 679). Os resultados são expressos em
TI(h) ± DP e em Factor F (aumento em relação ao controlo). O óleo de
girassol, sem adição de nenhum ingrediente, foi utilizado como controlo
global. Como controlo para quantificação do incremento provocado pelas
partículas adicionadas, utilizou-se óleo de girassol com incorporação da
Capítulo 3
- 139 -
mesma concentração de partículas produzidas só com adjuvantes. Os
controlos foram preparados no mesmo dia das restantes amostras.
Os resultados obtidos estão representados graficamente na Figura 3.1.
Parte II
As composições estudadas neste trabalho estão sumarizadas na Tabela 3.4.
Tabela 3.4 Composições das diferentes formulações de óleos avaliadas.
As formulações que envolveram misturas de óleos (Girassol:milho) e
(girassol:girassol alto oleico), foram preparadas antes da adição do
compostos bioactivos. Dado o óleo de milho ser extremamente rico em
tocoferóis e o girassol alto oleico um óleo cujo teor em ácido oleico é
bastante superior ao comum óleo de girassol (~ 75 % vs 30 %), foi possível
através da adição de pequenas percentagens destes óleos ao óleo normal de
girassol avaliar quais as sinergias e a influência que estes diferentes
componentes têm na estabilidade à oxidação das formulações A, C e D.
Após preparação das amostras estas foram desarejadas com uma corrente
de azoto e colocadas à temperatura ambiente ao abrigo da luz, durante 30
dias.
Devido às actividades biofuncionais reconhecidas para os polifenóis
característicos da azeitona, a formulação de um óleo rico nestes compostos
tem potencialidade para se enquadrar simultaneamente numa vertente de
Formulação
ABCD
12ppm HT (PLF) + 0,5% Fitosterois48ppm HT (SD) + 0,5% Fitosterois
12ppm HT (PLF)48ppm HT (SD)
Composição
Óleo Formulação
A
BCDAC
DAC
DGira
ssol
:G
. Alto
O
leic
o
(80:
20)
Gira
ssol
Gira
ssol
:M
ilho
(8
0:20
)
Capítulo 3
- 140 -
produto mais estável e saúde. È possível assim, reclamar maior valor
nutricional para o produto final, como consequência da melhor qualidade do
óleo por diminuição da degradação lipídica e pela adição de compostos
bioactivos. Note-se porém que é necessário validar a bioactividade destes
compostos no novo meio onde se encontram – o óleo.
Avaliou-se, ao final de 30 dias, os segundos produtos da oxidação lipídica,
representativos do estado de deterioração lipídica, os ácidos gordos livres,
aldeídos e álcoois voláteis, através do teste de Rancimat (10). A quantificação
de ácidos gordos livres, expressos em % Ácido Oleico ± DP (%FFA),
representados na Figura 3.2, foram realizados em duplicado, e determinados
como referido para os ensaios da Parte I. O Tempo de Indução foi
determinado pelo teste de Rancimat, utilizando as mesmas condições de
ensaio descritas na Parte I. Os resultados, apresentados na Figura 3.3 são
expressos em em TI(h) ± DP e em Factor F (TIamostra/TI0). O óleo de girassol
sem nenhum ingrediente adicionado e aberto em simultâneo foi utilizado
como controlo.
Resultados & Discussão
Parte I
Avaliou-se a influência do ácido ascórbico encapsulado nas partículas
lipídicas (PLA), na resistência do óleo ao processo de autooxidação, bem
como possíveis efeitos sinérgicos deste composto com um concentrado de
tocoferóis natural (PLB), concentrado de fitosteróis vegetais natural (PLC) e
com um anti-aglomerante sintético (PLE). Comparou-se a actuação do ácido
ascórbico com a do extracto bioactivo EBH (PLF), quando encapsulado nas
PL em percentagens mássicas equivalentes (relativamente à massa de
lípido).
Os resultados obtidos para os vários parâmetros que definem o grau de
degradação estão representados na figura seguinte (Figura 3.1).
Capítulo 3
- 141 -
Figura 3.1 Resultados obtidos nos diferentes testes de estabilidade oxidativa para os vários
óleos formulados com partículas bioactivas: A- Ácidos Gordos Livres (%FFA); B- Valores de
Peróxidos (IP); C- Teste de Rancimat e valores de Factor F.
Observando os resultados obtidos, verifica-se que a formulação de PL só
com ácido ascórbico apresenta uma tendência, apesar de ligeira, na
protecção do óleo de girassol à autooxidação. No entanto, esta variação
parece não estar associada à quantidade presente de ácido ascórbico no
óleo, já que as mesmas variações se verificaram para a formulação que
contém as PL sem nenhum componente bioactivo. Analisando os resultados
referentes à formulação PLD (PL com o dobro da concentração em ácido
ascórbico) verifica-se que esta quantidade de composto já interfere no
processo de oxidação, diminuindo quer os primeiros produtos da fase de
propagação (peróxidos) como os da fase de terminação (ácidos gordos livres,
aldeídos e álcoois voláteis).
A formulação PLC demonstrou um efeito sinérgico positivo entre o ácido
ascórbico, fitosteróis e lípidos dos adjuvantes das partículas. Este efeito
0 1 2 3 4 5
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
TI (h)
1,15
1,121,24
1,15
1,07
1,07
0,99F
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
% Ácido Oleico
30 dias
20 dias
0 dias
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
Peróxidos (mEqO2/kg)
A B
C
0 1 2 3 4 5
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
TI (h)
1,15
1,121,24
1,15
1,07
1,07
0,99F
0 1 2 3 4 5
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
TI (h)
1,15
1,121,24
1,15
1,07
1,07
0,99F
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
% Ácido Oleico
30 dias
20 dias
0 dias
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Girassol
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
PL Controlo
Peróxidos (mEqO2/kg)
A B
C
Capítulo 3
- 142 -
inibidor é mais acentuado nos segundos produtos da oxidação (gráfico A e
C), revelando que são mais eficazes na retardação da etapa de terminação
das reacções radicalares da oxidação lipídica. Quando a esta combinação de
componentes se adiciona um anti-aglomerante, o tempo de indução aumenta,
sendo o maior valor de factor F (TIamostra/TI0) atingido durante estes ensaios.
Este efeito é curioso, dado que se tem conhecimento de que este tipo de
compostos actua a nível da inibição da polimerização de triacilgliceróis que
ocorre principalmente durante um processo de temperatura elevado. (3,14)
O melhor resultado, foi obtido para a formulação de PL contendo o extracto
bioactivo EBH, que paralelamente ao que se verificou para a formulação mais
rica em ácido ascórbico, actuou nas duas fases distintas das reacções
radicalares da oxidação.
Parte II
Tendo em conta os resultados obtidos na Parte I, para formulações não
contendo ácido ascórbico, surgiu como objectivo da Parte II avaliar a
interacção das formulações contendo polifenóis da azeitona com, fitosteróis
em óleo de girassol, mistura girassol:milho e mistura girassol:girassol alto
oleico (80:20 %v/v).
Os resultados obtidos para o teste de quantificação de acidez e Rancimat,
após 30 dias de armazenamento, apresentam-se na Figura 3.2.
Capítulo 3
- 143 -
Figura 3.2 Resultados obtidos no 1) Teste de determinação da acidez (ácidos gordos livres), 2)
Teste de Rancimat, para as várias formulações analisadas.
A- Influência da adição ao óleo de girassol de duas concentrações distintas de HT e interferência
da adição de 0,5%Fitosteróis (óleo C e D);
B- Comparações de valores de 1) acidez (% Ácido Oleico), 2) TI (h), para os três controlos;
C- Influência da adição a uma mistura (80:20 v/v) girassol:milho de duas concentrações distintas
de HT e influência da adição de 0,5 %Fitosteróis (óleo D);
D- Influência da adição a uma mistura (80:20 v/v) girassol:girassol alto oleico de duas
concentrações distintas de HT e influência da adição de 0,5 %Fitosteróis (óleo D).
(Quadro 2 - barra a pontilhado 12ppm HT PL; barra a preto 48 ppm HT Solubilização Directa)
3 3,5 4 4,5 5
Gira
ssol
AB
CD
TI (h)
0 1 2 3 4 5 6Gira
ssol
:Milh
o(8
0:20
)A
CD
TI (h)
0 1 2 3 4 5 6 7
Gira
ssol
:G
. Alto
Ole
ico
(80:
20)
AC
D
TI (h)
A
DC
B
0 1 2 3 4 5 6
Gira
ssol
Gira
ssol
:
Milh
o(8
0:20
)
Gira
ssol
:
G. A
ltoO
leic
o(8
0:20
)
TI (h)
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Gira
ssol
Gira
ssol
: M
ilho
(80:
20)
Gira
ssol
: G
. Alto
Ole
ico
(80:
20)
% Ácido Oleico
30 dias0 dias
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
Gira
ssol
:M
ilho
(80:
20)
AC
D
% Ácido Oleico
30 dias0 dias
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
Gira
ssol
:G
. Alto
Ole
ico
(80:
20)
AC
D
% Ácido Oleico
30 dias0 dias
A
C D
B
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
Gira
ssol
AB
CD
% Ácido Oleico
30 dias0 dias
1
2
Capítulo 3
- 144 -
A dependência da dose de HT (extracto bioactivo solubilizado), no caso do
óleo de girassol, foi notória no teste de Rancimat e na quantidade de ácidos
gordos livres formados, após 30 dias. O mesmo efeito foi verificado, com
diferenças menos significativas, para a mistura girassol:alto oleico. A
capacidade de inibir reacções iniciadas pelas espécies de radicais livres,
resultantes do processo de autooxidação do óleo, foi tanto maior quanto
maior a concentração de HT solubilizado. No entanto, a resposta observada
não foi linear com a concentração de HT sendo dependente da composição
do óleo analisado. Na composição da formulação B existia o triplo da
quantidade de HT e no ensaio de Rancimat observou-se que a resposta de
inibição da oxidação no óleo de girassol não foi, por sua vez, três vezes
maior. Esse comportamento foi ainda mais evidente, quando se aumentou a
quantidade de ácido oleico – gráfico D do quadro II da Figura 3.2 – onde a
análise dos resultados obtidos sugere sinergias menos positivas entre a
fracção lípidica dos óleos e o HT. Esta resposta não foi de todo concordante
com o esperado, dado que, no caso do azeite (gordura vegetal rica em ácido
oleico), a sua elevada estabilidade oxidativa é atribuída à presença de HT.
Na mistura girassol:milho, a presença de HT não apresentou qualquer efeito
na oxidação lipídica, demonstrando mais uma vez a forte influência da
composição do substrato (óleo). (15) Neste caso, a inibição da acção do HT,
como antioxidante, pode ser relacionada com a concentração elevada em
tocoferóis característica do óleo de milho. Este efeito sinérgico negativo,
entre HT e tocoferóis em concentrações elevadas, foi anteriormente
reportado na literatura. (15,16) A adição de 20% de óleo de milho, com elevado
teor de polinsaturados, a óleo de girassol, aumenta o grau de insaturação
lipídica, sendo necessário aumentar a concentração em componentes
bioactivos para garantir estabilização da matriz. (15) Verificou-se mais uma
vez que a adição de fitosteróis a óleo de girassol potencia o aumento da
estabilidade oxidativa, reduzindo os segundos produtos da oxidação. A
sinergia positiva dos fitosteróis em óleo de girassol, foi mais evidente para
concentrações mais reduzidas de HT.
Capítulo 3
- 145 -
3.2.2 Impacto na Fritura Doméstica
Existe cada vez mais a preocupação de colocar no mercado, óleos mais
estáveis que possam manter as suas propriedades e características
nutritivas, durante o tempo de vida em prateleira e durante o seu
processamento pelo consumidor.
Na sequência do trabalho desenvolvido na Parte I da secção 3.2.1, realizou-
se um breve estudo para avaliar o impacto das formulações com PL na
performance de diferentes óleos após processo de simulação de fritura
(T>170 ºC). (9)
As partículas lipídicas formuladas na secção 3.2.1 (Parte I), cujas
composições se encontram na Tabela 3.3, foram incorporadas pelo método já
em cima descrito, em óleo de girassol e mistura de óleos girassol:milho
(80:20 v/v). Posteriormente, os óleos formulados foram submetidos a um
processo de simulação de fritura em laboratório, método modificado de Gertz
et al, 2000. Durante o processo de simulação monitorizou-se a formação de
compostos polares totais (%TPM), avaliando-se sensorialmente a
performance dos óleos a nível de salpicos de óleo, cheiro liberto, espuma
formada e alteração de cor (resultados não divulgados). No final da
simulação de fritura, a acidez dos óleos resultantes (segundo método descrito
no Anexo B) foi medida, sendo os resultados obtidos expressos em % Ácido
Oleico (Figura 3.3).
Os compostos polares totais são produtos finais da oxidação que decorre a
temperaturas mais elevadas, e englobam mono e di-acilgliceróis, ácidos
gordos livres, dimeros e polímeros de ácidos gordos, dimeros e polímeros de
triacilgliceróis. (1) A determinação do teor de compostos polares totais é
considerado uma medida representativa das alterações ocorridas no óleo
durante o processo de fritura. (17,18)
Utilizou-se um método colorimétrico rápido - Oleotest® (Anexo B) - que
subdívide os resultados em termos de quantidade percentual de TPM em
cinco categorias de 5 a 24 % (valor limite legal).
Capítulo 3
- 146 -
Os resultados são expressos em % de compostos polares totais e
apresentados na forma de intervalo (Figura 3.3). Os testes foram realizados
em triplicado.
O processo de simulação de fritura consiste em adicionar a 20 g de óleo 1g
de silica gel (MNkieselgel 60, Machenery-Nagel) pré-tratada com 10 % de
água e aquecida durante 1 h. A mistura óleo e silica é colocada durante 1 min
num banho de ultrasons para homogeneizar e de seguida é aquecida a
180 ºC durante 4 h. No Anexo I, Figura I1, encontra-se uma foto da instalação
preparada para os ensaios.
A adição de dimetilpolisiloxano (E900, DMPS), a duas formulações em óleo
de girassol e à mistura girassol/milho, foi também avaliada. Às formulações
PLC e PLF (melhores resultados obtidos na estabilidade oxidativa) adicionou-
se 10 ppm de DMPS, quantidade máxima permitida ao abrigo da directiva
98/72/EC.
O DMPS forma uma camada protectora na interface óleo/ar diminuindo a
evaporação de água observando-se redução de salpicos e de formação de
espuma. (19)
Capítulo 3
- 147 -
Resultados & Discussão
Figura 3.3 Resultados obtidos durante e após simulação do processo de fritura para as
formulações Girassol e Partículas Lipídicas (PL) e mistura Girassol/Milho (80:20, v/v%) e PL. A-
Ácidos Gordos Livres após processo fritura (% Ácido Oleico); B- Efeito da adição de DMPS
(E900) em simultâneo com as PLC, PLE e PLF na quantidade de ácidos gordos livres; C-
Resultados obtidos, em intervalos de valores percentuais, para os compostos polares totais no
final dos processos de simulação de fritura.
Os ensaios realizados de simulação de processo de fritura demonstraram ser
uma forma rápida e económica de prever o que se poderá passar num
processo de fritura por imersão. Apesar do erro associado foi possível, de
forma expedita, eliminar formulações à partida não rentáveis ou cuja
performance associada se encontrava muito abaixo dos parâmetros de
qualidade.
Dos resultados obtidos com as formulações estudadas com partículas
lipídicas, observou-se, no caso de óleo de girassol, redução de ácidos gordos
livres produzidos durante o tempo de ensaio. No caso da mistura
girassol/milho, este comportamento não foi tão evidente, sendo neste caso o
óleo de milho, bastante rico em micronutrientes, responsável pela maior
estabilidade atingida. Em ambas as situações os melhores resultados (por
ordem decrescente), foram conseguidos para as formulações contendo as
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18
Controlo +E900
PLC + E900
PLE + E900
PLF +E900
% Ácido Oleico (FFA)
Gir/MilhoGirassol
Girassol; Girassol/MilhoPLA;PLB;PLD
PLA G/M; PLB G/M; PLC G/M;PLD G/M:
PLC G/M E900
13-16%
PLC, PLE, PLFPLE E900; PLF E900PLE G/M; PLF G/M
PLE E900 G/M; PLF E900 G/M
6-12%
FormulaçõesTPM (%)
Girassol; Girassol/MilhoPLA;PLB;PLD
PLA G/M; PLB G/M; PLC G/M;PLD G/M:
PLC G/M E900
13-16%
PLC, PLE, PLFPLE E900; PLF E900PLE G/M; PLF G/M
PLE E900 G/M; PLF E900 G/M
6-12%
FormulaçõesTPM (%)
A B
C
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16
Controlo
PLA
PLB
PLC
PLD
PLE
PLF
% Ácido Oleico (FFA)
Gir/ MilhoGirassol
Capítulo 3
- 148 -
partículas PLF, PLE e PLC, evidenciando o já anteriormente verificado para o
estudo de estabilidade oxidativa à temperatura ambiente. As partículas PLE e
PLC contêm fitosteróis, que a temperaturas elevadas actuam como
antioxidantes protegendo o óleo do processo de polimerização, reduzindo o
teor de ácidos gordos livres e de compostos polares totais. (3) A formulação
PLF demonstrou ser eficaz na protecção dos óleos à oxidação a
temperaturas mais elevadas. Este facto pode ser explicado pela resistência à
temperatura, quando em ambiente lipofílico, do composto dominante no
extracto bioactivo, o hidroxitirosol. Este composto, ao actuar no mecanismo
radicalar do processo de autooxidação que se desencadeia durante o
processo de aquecimento, reduz a quantidade de ácidos gordos livres
formados.
A adição de dimetilpolisiloxano (DMPS) às formulações testadas não
demonstrou qualquer efeito sobre a estabilidade do óleo em termos de teor
de ácidos gordos livres ou compostos polares totais, evidenciando alguma
tendência para o aumento destes parãmetros em vez de diminuição. Este
comportamento era esperado, dado que o DMPS forma uma camada na
interface óleo/ar, que evita a libertação de vapor, favorecendo a performance
do óleo quanto a redução de salpicos e formação de espuma, e
desfavorecendo a libertação de oxigénio. A presença de oxigénio inibe, em
parte, a actuação dos fitosteróis como antioxidantes favorecendo a formação
de um radical peroxilo instável e sem qualquer actividade.(3,14)
Capítulo 3
- 149 -
3.3 Estabilização de duas formulações de Óleos alimentares com diferentes ingredientes naturais
O trabalho apresentado nesta secção foi desenvolvido tendo em vista
potenciais alternativas para formulações de óleos já comercializados.
Desta forma, não serão reveladas as composições dos óleos em questão,
nem referidos nomes de marcas.
3.3.1 Óleo Alimentar rico em Omega-3
Existem muitos óleos vegetais naturalmente ricos em ácidos gordos n-3
vegetal, ácido α-linolénico (C18:3n-3), tais como o óleo de soja, óleo de
canola, óleo de linhaça e óleo de noz. Os ácidos gordos n-3 de cadeia longa
polinsaturados (PUFAS) estão relacionados com inúmeros efeitos benéficos
na prevenção de doenças tais como a artrite, doenças auto-imunes, diabetes
tipo II e hipertensão. Estes efeitos benéficos estão associados ao efeito que
os n-3 PUFA exercem sobre a membrana celular, aumentando a presença
dos metabolitos de cadeia longa, ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido
docosahexaenoico (DHA). (20) Este ácido n-3 PUFA é considerado um
complemento ao ácido linoleico (C18:2n-6), o ácido gordo mais ambundante
na dieta. (21)
Apesar de todos os efeitos benéficos associados a estes ácidos n-3 PUFA, o
seu grau de insaturação favorece a peroxidação lipídica sendo por isso difícil
a sua estabilização. Como consequência desta instabilidade, os produtos
ricos neste composto apresentam alterações sensoriais e de qualidade
nutritiva problemáticas.
Torna-se assim imperativo encontrar soluções que promovam a estabilização
destes ácidos n-3, tais como alteração da composição lipídica e de
micronutrientes do óleo, alternativas de processamento e de embalamento.
Capítulo 3
- 150 -
Os antioxidantes são muitas vezes pouco efectivos nestas formulações ricas
em ácidos gordos polinsaturados dado que a composição da fracção
insaponificável é já normalmente concentrada em fitosteróis, polifenóis e
tocoferóis.
Diferentes bioprodutos foram testados, de forma a avaliar a sua inflência na
estabilização da oxidação lipídica do óleo alimentar rico em n-3 PUFA.
Concentrados Bioactivos
Foram testados dois concentrados comerciais de origem natural e diferentes
formulações preparadas com PL (partículas lipídicas).
Os concentrados comerciais utilizados foram:
• Tocoferóis vegetais, Toc (concentrado comercial de α, β, γ -
tocoferol),
• Ácido Ascórbico e concentrados de Tocoferóis, NCT (concentrado
comercial lipofílico)
Avaliou-se a capacidade de cada concentrado em retardar a oxidação lipídica
do óleo rico em n-3, preparando diferentes formulações com várias
concentrações.
As concentrações estudadas encontram-se resumidas na Tabela 3.5.
Tabela 3.5 Concentrações (ppm) de NCT e Toc adicionadas ao óleo (%m/m).
NCT (ppm)
Tocoferóis (Toc) (ppm)
1500 30
750 7
500 3,5
250 1,4
100 -
Capítulo 3
- 151 -
Formulação das Partículas Bioactivas
O processo de produção das PL foi idêntico ao já descrito no Capítulo 2,
tendo sido utilizados os mesmos adjuvantes lipídicos, Precirol ato 5 e
Lumulse GMS K na proporção mássica (50:50) e o concentrado comercial de
tocoferóis. As condições operatórias de pressão e temperatura (P,T) foram
120 bar (12 MPa) e 50 ºC (325 K) respectivamente.
As concentrações de tocoferóis encapsuladas na matriz lipídica, foram as
seguintes (Tabela 3.6):
Tabela 3.6 Composições das Partículas Lipídicas com Toc (%m/m Lípido).
Adição ao óleo rico em n-3 PUFA
Os concentrados naturais NCT e Toc são preparados comerciais com
especificação para óleos alimentares. A sua adição envolveu a pesagem
rigorosa das quantidades a adicionar e agitação reduzida, ao abrigo da luz e
ar, durante alguns minutos.
A incorporação das PL realizou-se como anteriormente descrito.
Após adição dos compostos bioactivos ao óleo, as amostras foram
armazenadas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após 25 dias,
efectuaram-se medidas da acidez (% Ácido Oleico), índice de peróxidos
(mEqO2/kg) e índice de anisidina (testes de estabilidade em tempo real,
descritos no Anexo B) de forma a determinar o estado de oxidação lipídica
dos óleos formulados. Foi também determinado o valor Totox (Valor Total de
Oxidação) para cada óleo formulado.
PL Tocoferóis (Toc)
PL30 11
PL7 2
PL3,5 1
PL1,4 0,5
Capítulo 3
- 152 -
O valor de Totox, quantifica o estado de degradação do óleo, correlacionando
os resultados de índice de peróxidos (IP) com os de índice de p-anisidina
(IpA), através da seguinte equação (Eq. 3.1):
Totox = 2x(IP) + (IpA) (Eq. 3.1)
O IpA quantifica os aldeídos com duas duplas ligações conjugadas,
resultantes da degradação do ácido linoleico, representando desta forma um
estado efectivo de degradação das gorduras vegetais (Anexo B). (10) O valor
de IpA deverá ser inferior a 10 para se considerar que o óleo se encontra não
degradado. (10) Efectuou-se para todas as formulações o teste de Rancimat.
Resultados & Discussão
Os resultados sumarizados graficamente, encontram-se na Figura 3.4 e em
tabela no Anexo I.
Figura 3.4 Variação dos vários indicadores da degradação lipídica dos óleos formulados em
função das concentrações testadas de compostos bioactivos, NCT, Toc e PL com Toc, após 25
dias de abertura. A- Teste de Rancimat (h); B- ácidos gordos livres (%Ácido Oleico); C- Valor de
Totox.
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
0 500 1000 1500 2000
ppm
TI (h
)
0 10 20 30 40PL & Toc
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0 500 1000 1500 2000 (ppm)
% Á
cido
Ole
ico
0 10 20 30 40PL & Toc (ppm)
3,000
8,000
13,000
18,000
23,000
28,000
0 500 1000 1500 2000
ppm
Toto
x
0 10 20 30 40PL & Toc
NCT Toc PL Toc
C
A B
Capítulo 3
- 153 -
O valor de Totox determinado para o óleo rico em n-3 PUFA sem qualquer
adição de ingrediente ou bioproduto, após 25 dias de abertura, foi de 24,15
(Tabela I4 do Anexo I).
A adição das três formulações distintas, NCT, Toc e PL ricas em Toc a este
óleo, reduziram o valor de Totox, sendo este comportamento dependente da
concentração. A dependência com a dose adicionada foi mais evidente para
a formulação com a concentração mais elevada de NCT, para a qual o valor
de totox determinado foi 10,5.
Nas formulações com Toc e PL com Toc encapsulado, verificou-se
dependência da dose até aos 7 ppm adicionados, observando-se para a
concentração mais elevada um novo aumento do estado da degradação do
óleo. Como já referido anteriormente, os tocoferóis (nomeadamente o α-
tocoferol que existe em maior abundância, neste concentrado) são
antioxidantes que cedem um protão aos radicais livres ROO•, resultando num
radical α-tocoferoxilo que não possui qualquer tipo de actividade antioxidante,
reduzindo assim pouco a pouco a protecção imposta por estes compostos.
Se em simultâneo, existirem outros compostos antioxidantes, que consigam
regenerar este radical α-tocoferoxilo, a capacidade antioxidante do α-
tocoferol vai-se mantendo. (15) Se os tocoferóis se encontrarem em
concentrações muito elevadas, os restantes micronutrientes constituintes do
substrato passam a não ser capazes de estabilizar estes compostos,
deixando de exercer a sua função como antioxidantes, potenciando por sua
vez, a oxidação lipídica. No concentrado NCT, com 6,5 % de tocoferóis não
se verifica este efeito. O conteúdo em ácido ascórbico neste concentrado
confere aos tocoferóis a estabilidade adicional necessária para que a sua
acção como antioxidantes permaneça inalterada.
O comportamento verificado anteriormente com os valores de Totox obtidos
(que correlaciona indice de peróxidos e anisidina) em função das
concentrações testadas foi validado com os resultados de tempo de indução
determinados no teste de Rancimat e de ácidos gordos livres.
As variações de ácidos gordos livres foram pouco perceptíveis estando de
acordo com a variação pouco significativa da amostra controlo. No teste de
Rancimat, a dependência da dose adicionada só se verificou para a
formulação com NCT, não existindo nenhum tipo de variação significativa
Capítulo 3
- 154 -
para as restantes formulações. Os valores de factor F (TIamostra/TI0) obtidos
para as duas concentrações mais elevadas de NCT foram bastante
satisfatórios, sendo representativos de uma melhoria significativa da
estabilidade do produto. Estes resultados, associados ao decréscimo
acentuado verificado no valor de Totox, fazem desta formulação (NCT) uma
mais valia para incorporação em óleo rico em n-3 PUFA, de elevado carácter
nutritivo mas instável à oxidação.
3.3.2 Óleo com DMPS – especial fritura
A qualidade dos óleos durante o processo de fritura depende da qualidade do
óleo quando se inicia o processo de aquecimento, pelo que é necessário
garantir a estabilidade do produto até chegar às cozinhas dos consumidores.
A estabilidade dos óleos vegetais à temperatura de fritura é dependente de
muitos outros constituintes da sua composição, que não só os ácidos gordos,
verificando-se mesmo uma co-dependência com o conteúdo da fracção
insaponificável (fitosteróis, tocoferóis, polifenóis etc.) em termos de presença
ou não de efeitos sinérgicos. (9,22) A existência de compostos quelantes ou
sequestradores, a existência de metais que actuam como pro-oxidantes,
exposição à luz e condições de fabrico, são também factores de extrema
importância e que condicionam o processo de fritura. (3)
No trabalho aqui apresentado, dois concentrados comerciais de origem
natural, foram testados na capacidade de inibir a degradação de um óleo
alimentar durante o seu armazenamento, tendo como objectivo garantir que
durante o processo de fritura o consumidor utilize um produto com
parâmetros de qualidade mais elevada.
O óleo alimentar em causa, é um óleo aditivado com DMPS, um conhecido
anti-espuma da indústria alimentar. A temperaturas elevadas, devido ao
processo oxidativo de polimerização dos ácidos gordos e triacilgliceróis,
ocorre a formação de espuma. A utilização de silicones, como agentes anti-
espuma, é já bem conhecida e explicada devido à natureza química do
polímero em causa.(23)
Capítulo 3
- 155 -
De acordo com estudos já realizados, o DMPS é pouco solúvel (1 mg/kg) no
óleo vegetal, acumulando-se na sua superfície sob a forma de uma
monocamada fina, evitando o contacto directo óleo/ar. (19)
Os concentrados comerciais utilizados foram os seguintes:
• Tocoferóis vegetais, Toc (concentrado comercial de α, β, γ -
tocoferol),
• Ácido Ascórbico e Tocoferóis, NCT (concentrado comercial lipofílico),
• Ácido Ascórbico, NC (concentrado comercial lipofílico).
Avaliou-se a capacidade de cada concentrado em retardar a oxidação lipídica
de óleo alimentar aditivado com DMPS durante o seu tempo de
armazenamento, preparando diferentes formulações com várias
concentrações.
As concentrações estudadas encontram-se resumidas na Tabela 3.7.
Tabela 3.7 Concentrações dos concentrados bioactivos estudados.
Adição ao óleo alimentar
Os concentrados naturais NCT, NC e Toc tal como já referido, são
preparados comerciais com especificação para óleos alimentares. A sua
adição envolveu a pesagem rigorosa das quantidades a adicionar e agitação
reduzida ao abrigo da luz e do ar durante alguns minutos.
Após adição dos compostos bioactivos ao óleo alimentar (todos realizadas
após abertura das embalagens de óleo na mesma altura), armazenaram-se à
temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após 5 e 10 dias, efectuaram-se
NCT
(ppm)
Tocoferóis (Toc) (ppm)
NC +
Toc (250ppm)
1500 250 1500
750 125 750
500 50 500
100 30 100
Capítulo 3
- 156 -
testes de estabilidade em tempo real; acidez (% Ácido Oleico), índice de
peróxidos (mEqO2/kg) e indice de anisidina (mg/L) de forma a determinar o
estado de oxidação lipídica dos óleos formulados em função das
concentrações testadas (descrição dos métodos no Anexo B). Determinou-se
o valor Totox (Valor Total de Oxidação) para cada óleo formulado ao final dos
10 dias.
Resultados & Discussão
O resumo dos resultados encontra-se em seguida na Figura 3.5 (e em tabela
no Anexo I).
Figura 3.5 Variação dos vários indicadores da degradação lipídica dos óleos em função das
concentrações testadas de compostos bioactivos, NCT, Toc e NC+Toc, após 10 dias de
abertura. A- Teste de Rancimat (h); B- ácidos gordos livres (% Ácido Oleico); C- Valor de Totox.
O óleo original, após dez dias de abertura, apresentou um valor de
degradação total de 10,6, encontrando-se no limite de valor para o qual se
considera que o óleo se encontra em bom estado de conservação lipídica. (10)
Observou-se uma dependência da dose para a formulação NCT, sendo para
22,5
33,5
44,5
55,5
66,5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600(ppm)
TI (h
)
0 50 100 150 200 250 300
Toc (ppm)
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0 500 1000 1500(ppm)
% Á
cido
Ole
ico
0 50 100 150 200 250 300
Toc (ppm)A
C
B
0,0002,0004,0006,0008,000
10,00012,00014,000
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600(ppm)
Toto
x
0 50 100 150 200 250 300
Toc (ppm)
NCT NC+Toc Toc
Capítulo 3
- 157 -
este concentrado bioactivo, que se obteve o valor mais reduzido de
degradação total do óleo: 6,3 para uma concentração de 750 ppm.
As formulações que envolveram a utilização do concentrado de tocoferóis
vegetais, não apresentaram, para as concentrações estudadas, variações
significativas no valor de Totox (gráfico C, da Figura 3.5), com excepção do
verificado para a concentração mais reduzida de Toc. A adição de 30 ppm do
concentrado de tocoferóis manteve o valor de acidez do óleo original, e
reduziu, comparativamente com o controlo, os valores de índice de peróxidos
e de p-anisidina. No entanto, com o aumento de concentração de Toc não se
observou variação nestes parâmetros. Dos ensaios realizados para a
formulação NC + Toc, destacaram-se os resultados obtidos no teste de
Rancimat, onde a variação do tempo de indução em função da concentração
apresentou um aumento dependente da dose, não se verificando o mesmo
para os valores de acidez e de Totox. Estes resultados indicam que o efeito
positivo obtido no ensaio de rancimat pode ser atribuido à presença de ácido
ascórbico e não somente à presença de tocoferóis. Para a mesma
concentração de tocoferóis (250 ppm) a formulação com Toc, atingiu um
tempo de indução, no ensaio de rancimat, de 4,55 h enquanto que nas
formulações de NC+Toc o tempo de indução foi sempre superior (sinergia
positiva entre ácido ascórbico e tocoferóis). A sinergia positiva (ácido
ascórbico-tocoferóis) evidenciada por este efeito pode ser potenciada pela
presença de temperatura dado que estes resultados só foram obtidos no
teste de rancimat, onde o óleo é submetido a uma temperatura de 120 ºC. O
efeito de temperatura pode-se relacionar com o facto de o ácido ascórbico
actuar como antioxidante nas reacções de polimerização que se
desencadeiam a partir de 120 ºC, reduzindo o estado de oxidação do óleo e
prolongando a resistência do mesmo.(9) NC e Toc apresentam assim uma
sinergia positiva, mas comparativamente com a formulação NCT esse efeito
não é verificado. Os resultados obtidos para o estado de oxidação dos óleos
quando se utilizou a formulação 1500 ppm NC+Toc (na qual são 1500 ppm
de ácido ascórbico), e 1500 ppm de NCT (onde só 40 % são ácido ascórbico)
revelam que a formulação NCT é mais efectiva na prevenção da degradação
lipídica.
Capítulo 3
- 158 -
Tendo em conta todos os resultados obtidos neste breve estudo, a
incorporação de NCT em concentrações de 750 a 1500 ppm, é indicada para
manter a estabilidade lipídica do produto óleo vegetal + DMPS. Um próximo
passo seria avaliar o comportamento desta formulação em temperaturas de
fritura, para estudar a acção do DMPS durante esse processo e avaliar a sua
influência na formulação NCT. Uma combinação com fitosteróis (que como se
observou em resultados anteriores, têm uma boa performance a
temperaturas mais elevadas) seria interessante para analisar sinergias com
ácido ascórbico na inibição do processo de polimerização. Estudos idênticos
ao realizado deveriam ser efectuados com concentrações abaixo de 30 ppm
de tocoferóis, para avaliar o comportamento verificado para esta
concentração.
Capítulo 3
- 159 -
3.4 Conclusões
A oxidação dos lípidos constituintes dos óleos alimentares, é um processo de
degradação (processo de rancidificação) que afecta a qualidade dos óleos
em termos nutricionais e organolépticos, sendo uma das suas maiores
causas de desvalorização perante os consumidores.
A estabilização dos óleos alimentares quer à temperatura ambiente, quer a
temperaturas de fritura, é um dos maiores desafios para a indústria alimentar
tornando-se imperativo o seu estudo.
A adição aos óleos alimentares de determinados concentrados bioactivos
(bioprodutos) com propriedades antioxidantes, é hoje em dia um dos métodos
mais efectivos para se retardar a degradação lipídica. (24-26) No entanto, como
o observado pelos resultados obtidos, a eficiência dos concentrados
bioactivos no aumento de estabilidade dos óleos vegetais, não depende só
da sua composição e da sua capacidade antioxidante. Inúmeros factores, tais
como a concentração em que são adicionados, exposição à luz, temperatura,
composição lipídica e de micronutrientes do óleo, condicionam a actividade
destes compostos, tornando complexa a selecção da formulação adequada.
Das formulações testadas durante os trabalhos apresentados neste capítulo,
evidenciaram-se as que contêm as partículas lipídicas (PL) como
transportadores eficientes dos concentrados bioactivos, que devido ao seu
teor de saturação potenciam a estabilidade oxidativa dos óleos, agindo em
sinergia com os compostos nelas encapsulados. Formulações de óleos
contendo PL com fitosteróis (PLE e PLC), mostraram-se eficientes quando
submetidas a um processo de simulação de fritura em ambiente doméstico,
observando-se que às temperaturas elevadas atingidas durante o processo
de fritura, actuam como antioxidantes protegendo o óleo do processo de
polimerização, reduzindo em parte os ácidos gordos livres e
consequentemente os compostos polares totais. (3)
Os fitosteróis demonstraram ser compostos efectivos também a temperaturas
moderadas, realçando-se a sua boa performance em conjunto com um anti-
aglomerante (silicone) na redução do teor total de compostos polares após
4 h de simulação de fritura, actuando possivelmente na redução da
Capítulo 3
- 160 -
polimerização lipídica. O extracto bioactivo, EBH, caracterizado e estudado
no Capítulo 2, demonstrou mais uma vez a sua capacidade antioxidante ao
inibir de forma eficiente a oxidação lipídica à temperatura ambiente. Esta
capacidade de actuar a nível do mecanismo de oxidação radicalar é
associada a todos os compostos polifenólicos testados em óleos alimentares.
A temperaturas elevadas os compostos fenólicos, normalmente termolábeis,
degradam-se deixando de ser efectivos, não sendo a eles associada a
capacidade de inibição do mecanismo de polimerização.
Nos resultados obtidos, EBH demonstrou capacidade de protecção da
degradação lipídica após 4 h a 180 ºC, verificando-se redução dos
compostos polares totais e acidos gordos livres no óleo final. Estes
resultados mostraram-se bastante promissores, sendo interessante no futuro
avaliar qual o possível mecanismo de actuação dos compostos presentes no
extracto a temperaturas elevadas.
Os concentrados comerciais, ricos em ácido ascórbico e tocoferóis naturais
(NCT), mostraram ser efectivos no aumento da estabilidade oxidativa de duas
formulações de óleos alimentares já comercializadas, sendo o efeito
dependente da concentração utilizada. O óleo rico em n-3 PUFA passou, por
acção de 1500 ppm de NCT, de um valor total de degradação de 24 para 10,
valor referência para o qual se considera um óleo em bom estado de
conservação lipídica, revelando-se por isso uma boa hipótese para conferir a
este óleo de carácter nutritivo superior, a estabilidade oxidativa necessária
para aumentar a sua qualidade final.
A adição a óleos alimentares de concentrados bioactivos demonstrou ser
uma hipótese viável ao aumento da qualidade lipídica do óleo, evitando o
indesejável processo de rancidificação que tem como resultados, odores e
sabores indesejáveis ao consumidor. Estes concentrados apresentam ainda
a vantagem de poderem conferir ao óleo final um carácter funcional. Sendo
as gorduras vegetais, em muitos casos o veiculo ideal para ingestão de
alguns micronutrientes aumentando as suas biodisponibilidades, os óleos
funcionais (Oleocêuticos) são uma importante área de mercado actuando
directamente no bem estar dos consumidores.
Òleos mais saudáveis para um futuro melhor.
Capítulo 3
- 161 -
3.5 Referências
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Capítulo 3
- 162 -
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- 163 -
Continuing resistance to food chemicals and awareness of health and nutrition will give rise to greater demand from consumers for natural ingredients
n Nutraingredients.com, 2007 O objectivo da primeira parte da tese foi identificar potenciais soluções para o
desenvolvimento de novos óleos alimentares funcionais, isto é, óleos mais
saudáveis a nível nutricional, aos quais se poderão associar propriedades
benéficas para a saúde do consumidor.
No trabalho até aqui descrito, o estudo do desenvolvimento de potenciais
formulações de óleos funcionais, foi maioritariamente realizado por via de
adição directa de componentes activos a diferentes óleos alimentares,
combinando, em alguns casos, com misturas de diferentes óleos vegetais
para incremento de determinado (s) ingrediente (s) específico (s).
Foi estudada a viabilidade de incorporar em óleo de girassol, extractos
bioactivos de origem natural, obtidos particularmente a partir de resíduos da
extracção de azeite. Os extractos naturais, desenvolvidos por um processo
patenteado na sequência de um projecto anterior a este trabalho, provêm de
4 – Conclusões Finais
Capitulo 4
- 164 -
resíduos da azeitona após a extracção de azeite e são concentrados ricos
num dos principais compostos fenólicos antioxidante, o hidroxitirosol.
As partículas formuladas por encapsulação do extracto em micropartículas
formuladas com adjuvantes lipídicos, produzidas através de tecnologia
supercrítica, demostraram ser facilmente incorporadas em óleo de girassol,
ocorrendo a sua solubilização de modo rápido, sem recorrer a agitação
mecânica com rotações elevadas e sem utilização de temperatura.
A caracterização e a avaliação in vitro da capacidade antioxidante dos
extractos bioactivos seleccionados para este estudo (EBH, RSEV e EBS)
perante diferentes espécies de radicais livres, evidenciou a importância da
selecção da matéria-prima para a obtenção dos extractos (bagaços) sendo
um factor determinante para a sua composição, propriedades químicas e
biológicas. Os três extractos avaliados revelaram valores elevados de
capacidade antioxidante perante os diferentes tipos de radicais livres,
variando essa capacidade de actuação consoante a composição da matriz de
partida e do processo aplicado na obtenção de cada extracto. Ensaios
preliminares de pré-tratamentos (acondicionamento em atmosfera de CO2
pressurizado e tratamentos hidrotérmicos) das matérias-primas utilizadas na
produção dos extractos naturais demonstraram a viabilidade de aumentar as
concentrações existentes de compostos fenólicos com elevada capacidade
antioxidante tais como o tirosol e o hidroxitirosol. Os melhores resultados,
quer no acondicionamento em CO2 pressurizado quer nos tratamentos
hidrotérmicos, foram obtidos para o bagaço húmido a 50ºC, onde se verificou
o aparecimento de hidroxitirosol não identificado anteriormente no extracto.
Os ensaios realizados a nível celular para identificação de capacidade
antioxidante intracelular e capacidade anti-proliferativa dos extractos EBH,
EBS e RSEV foram efectuados com linhas celulares humanas de
adenocarcinoma do cólon (Caco-2 e HT-29) e de carcinoma gástrico
(MKN45). Dois dos extractos testados, EBH e RSEV apresentaram
capacidade antioxidante relevante perante diferentes indutores de stress, em
particular quando testados em concentrações reduzidas. A capacidade
destes extractos em resgatar ou quelar espécies reactivas de radicais
evidenciou estar relacionada com as propriedades anti-proliferativas nas
Capítulo 4
- 165 -
linhas cancerígenas testadas, sendo tanto mais efectivos quanto maior a
actividade como antioxidantes. Por sua vez, a presença dos extractos RSEV
e EBS provocou alterações no ciclo celular das células HT-29, ocorrendo
retenção das células vivas na fase de divisão G0/G1. Este bloqueio relaciona-
se com a participação como segundos intermediários de espécies de radicais
livres nos mecanismos de regulação do ciclo celular na passagem da fase G0
para a fase S.
O extracto EBH demonstrou, nos ensaios de actividade anti-microbiana
realizados sobre microorganismos potenciadores de contaminações
alimentares (B. cereus, E. coli, S. poona, S.cerevisiae e C.albicans),
capacidade de total inibição do crescimento de leveduras e de redução da
proliferação de bactérias gram (+).
As incorporações de ácido ascórbico encapsulado em Partículas Lipídicas e
de extracto rico em hidroxitirosol (EBH) demonstraram ser efectivas na
inibição do processo de autooxidação de óleo de girassol à temperatura
ambiente, actuando como antioxidantes tanto a nível dos primeiros produtos
como dos segundos produtos da oxidação lipídica, num efeito dependente da
dose. No caso da adição de extracto rico em HT às misturas de óleos
vegetais, observou-se sinergias negativas quando a mistura final apresentava
maior teor em ácido oleico. No estudo do impacto dos óleos alimentares,
formulados com diferentes ingredientes activos encapsulados em PL, na
fritura por imersão, ensaio em laboratório, os fitosteróis e o extracto EBH em
óleo de girassol e nas misturas de óleos vegetais foram os mais efectivos,
prevenindo a oxidação térmica e melhorando a performance em fritura. A
adição de dimetilpolisiloxano (DMPS) às formulações testadas não revelou
qualquer efeito sobre a estabilidade oxidativa do óleo em termos de acidez ou
compostos polares totais, parecendo haver tendência para aumento destes
parâmetros em vez de diminuição. O impacto da adição deste aditivo deverá
ser avaliado em fritura descontínua na presença de alimento.
No caso de estudo, óleo rico em n-3 PUFA, o bioproduto, mistura de
tocoferóis com ácido ascórbico (NCT) foi o mais efectivo na manutenção da
Capitulo 4
- 166 -
conservação lipídica dos óleos testados, apresentando um efeito dependente
da dose, reduzindo para as concentrações mais elevadas testadas, o índice
de Totox de 24 para 10.
O óleo aditivado com DMPS - especial fritura, segundo caso de estudo
apresentado, o bioproduto, mistura de tocoferóis, à temperatura ambiente,
quando presente em concentrações mais reduzidas, demonstrou capacidade
de actuar nas reacções radicalares do processo de oxidação. Efeitos
sinérgicos negativos foram verificados entre tocoferóis e ácido ascórbico
quando a concentração de Toc atingiu os 250 ppm, verificando-se actividade
pró-oxidante.
Neste caso de estudo, os melhores resultados obtidos foram para o
concentrado NCT, onde as concentrações mais elevadas deste bioproduto
conseguiram retardar a oxidação lipídica do produto comercial.
Combinando as diversas competências em determinadas áreas cientificas
com o conhecimento da indústria nos seus produtos, é possivel desenvolver
óleos funcionais de elevada qualidade, com potencial impacto na dieta diária
do consumidor.
ESTUDO DA VARIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FISICO QUÍMICAS
DE ÓLEOS COM TEMPERATURAS ASSOCIADAS AO
PROCESSO DE FRITURA.
CORRELAÇÃO COM A QUANTIDADE DE GORDURA ABSORVIDA
PELO ALIMENTO.
Capitulo 1 – Introdução
Capitulo 2 - Variação das propriedades Fisico Químicas de Óleos com temperaturas asso-ciadas ao processo de Fritura
Capitulo 3 - Correlação das propriedades Fisico Químicas de um Óleo com a quanti-dade de gordura absorvida pelo alimento, durante o processo de fritura
Capitulo 4 - Conclusões Finais
169
177
193
205
- 169 -
Deep-fat frying is the most common unit operation in food preparation, as evidenced by the
worldwide annual production of more than 20 millions tons of frying oil.
Gertz et al, 2004
1.1 Processo de Fritura A fritura por imersão (deep fat frying) é um dos métodos mais antigos e
populares para se confeccionar alimentos.(1,2) Os alimentos fritos têm uma
cor, sabor e textura agradável sendo dessa forma muito apetecíveis para o
consumidor, (3) tornando a fritura por imersão num mercado de biliões. (1,4)
Este método de preparação de alimentos consiste em submergi-los em óleo
cuja temperatura se encontra acima dos 130 ºC, ocorrendo durante a imersão
importantes transferências de calor e de massa (consultar Figura J1, no
Anexo J). (5,6) Devido à acção de diversos agentes tais como: vapor de água,
ingredientes e contaminantes provenientes dos alimentos, oxigénio que se
difunde pela superfície do óleo provocando oxidação, temperatura elevada
que promove alterações térmicas, os óleos alimentares durante o processo
de fritura sofrem alterações na sua estrutura química e física. (7,8)
1 – Introdução
Capitulo 1
- 170 -
Quando o alimento é imerso no óleo quente e se inicia o processo de fritura,
a água nele contida vai saindo gradualmente e evaporando provocando o
aparecimento de pequenas bolhas. A água, como nucleófilo, ataca a ligação
éster dos triacilgliceróis produzindo mono- e diacilgliceróis, glicerol e ácidos
gordos livres. (1,9)
A temperaturas até 130ºC, o oxigénio em contacto com o óleo reage
rapidamente com os triacilgliceróis produzindo-se hidroperóxidos através do
mecanismo predominante de deterioração, o mecanismo radicalar de auto-
oxidação. Acima dos 130ºC, temperaturas normalmente utilizadas no
processo de fritura, a presença mais limitada de oxigénio faz com que os
hidroperóxidos sejam rapidamente decompostos, antes de originarem mais
radicais livres que propagariam as reacções radicalares. O mecanismo
químico da oxidação térmica segue o mesmo princípio do mecanismo da
autooxidação, sendo no entanto bastante mais rápido. (1) Os hidroperóxidos
são assim produtos muito instáveis durante a fritura, sendo decompostos, por
homólise da ligação peroxídica, em radicais alcoxilo e hidroxilo. (1,10) A
existência de água nos óleos influência assim a presença de voláteis,
potenciando a diminuição destes compostos por volatilização no vapor. (10)
Os voláteis que permanecem no óleo, decompõem-se ou reagem com
constituintes dos alimentos seguindo reacções de oxidação, dimerização e
polimerização. (11)
O processo de fritura, devido às suas elevadas temperaturas, acelera a
geração de dímeros, polímeros e compostos cíclicos através de reacções de
polimerização dos triacilgliceróis. (1,12) A formação destes compostos,
considerados como os principais produtos de decomposição do óleo durante
a termo-oxidação, origina o aparecimento de espuma e aumenta a
viscosidade e formação de acrilamida. (4,13)
Os produtos resultantes da degradação do óleo durante a fritura por imersão
são os responsáveis pela alteração organoléptica e nutricional dos alimentos
fritos. Os voláteis nos óleos de fritura são os factores mais condicionantes do
sabor conferido aos alimentos, sendo os polímeros os responsáveis pela
alteração de cor e textura do alimento. (1)
Capítulo 1
- 171 -
1.2 Parâmetros Físico-Químicos
No sentido de desenvolver métodos expeditos e pouco dispendiosos para
controlo da deterioração e qualidade de óleos alimentares durante o processo
de fritura por imersão tem-se observado, nos últimos anos, um esforço da
comunidade científica, para identificar os compostos formados durante este
processo e os respectivos mecanismos de degradação. (8,12,14)
Os hidroperóxidos, compostos formados durante a oxidação lipídica e
quantificados pela medição de Índice de Peróxidos, são espécies
intermediárias de transição que a temperaturas elevadas se decompõem em
compostos carbonílicos, tornando este parâmetro pouco fiável para a
monitorização da qualidade do óleo durante o processo de fritura por
imersão.(14,15) Por sua vez, os compostos carbonílicos formados pela
degradação dos hidroperóxidos, na presença de p-anisidina e meio ácido são
detectados por absorvância, sendo assim possível utilizar esta medição como
um parâmetro de controlo da qualidade do óleo durante o processo de fritura.
O índice de anisidina aumenta ao longo do tempo de
aquecimento/fritura.(16,17)
Durante o processo de fritura de óleos alimentares, o conteúdo em ácidos
gordos livres (FFA) vai aumentando também ao longo do tempo, sendo as
reacções de hidrólise e de oxidação dos triacilgliceróis os responsáveis por
este aumento. No entanto, a ocorrência de volatilização destes compostos no
vapor de água dos alimentos durante o processo de fritura, torna a sua
quantificação pouco fidedigna para acompanhamento da degradação dos
óleos a altas temperaturas. (15) Apesar da existência de ácidos gordos livres
nos óleos de fritura potenciar o mecanismo de oxidação térmica, é o grau de
insaturação dos ácidos gordos (mais que o seu tamanho de cadeia) o que
mais contribui para esse fenómeno. (1)
Capitulo 1
- 172 -
A viscosidade define a fluidez de um líquido a determinada temperatura e à
pressão atmosférica. (12) A viscosidade dos óleos alimentares aumenta com o
comprimento das cadeias dos ácidos gordos que compõem os triacilgliceróis,
mas diminui com o grau de insaturação dos mesmos, sendo por isso um
parâmetro que depende das forças intermoleculares e de interacções
estruturais. (18) Os ácidos gordos polinsaturados (PUFAS) com duas ou mais
ligações duplas, apresentam preferencialmente uma conformação cis, que
evita a aglomeração e as interacções dos triacilgliceróis, reduzindo por isso a
viscosidade dos óleos ricos nestes compostos. (1,13,19)
Em óleos não degradados, o aumento de temperatura provoca uma
diminuição da viscosidade devido a maior movimento das moléculas e
diminuição das forças intermoleculares. (18,19) No entanto, com a progressiva
degradação dos óleos durante o processo de fritura, a viscosidade vai
aumentando como consequência da polimerização dos triacilgliceróis. As
moléculas maiores de triacilgliceróis têm maior capacidade de estabelecer
interacções estruturais, aumentando assim a viscosidade do óleo. (8,18-20) A
monitorização das variações da viscosidade destas gorduras durante o
processo de fritura pode ser considerada uma medida eficiente para controlo
da qualidade dos mesmos. (1,8,15).
Ao longo do deste complexo processo, a estrutura dos óleos vai-se alterando,
e o grau de insaturação do óleo original tende a decrescer ao longo do
tempo, em parte devido à formação de pequenas quantidades de misturas
complexas de ácidos gordos monocíclicos. (1,19)
No decorrer do processo de fritura, acima de 130ºC, tanto os ácidos gordos
livres como os compostos polimerizados que se formam se correlacionam
com o conteúdo total de compostos polares (TPM). O conteúdo em TPM é
considerado como o critério mais objectivo e válido para a avaliação da
degradação do óleo durante a fritura por imersão. (15) A quebra dos
triacilgliceróis durante o tempo de fritura, e a consequente formação de
peróxidos e ácidos gordos livres, provocam o aumento da polaridade das
moléculas presentes no óleo, induzindo o aumento de compostos polares
totais ao longo do tempo de fritura. (15)
Capítulo 1
- 173 -
É possível sucintamente resumir que durante o processo de fritura por
imersão se observa a diminuição do grau de insaturação dos óleos com
consequente formação de espuma, alteração da cor, aumento de
viscosidade, conteúdo em ácidos gordos livres, compostos polimerizados e
materiais polares. Na figura 1.1, apresenta-se a evolução dos compostos
resultantes da termo-oxidação de um óleo ao longo do tempo de fritura.
Figura 1.1 Variações químicas e físicas nos óleos durante processo de fritura por imersão.
Evolução ao longo do tempo. Adaptado de Choe et al, 2007. (1)
A monitorização do processo de degradação dos óleos durante o processo
de fritura, realiza-se por métodos físicos e químicos que se complementam. (8,14) Os métodos físicos incluem principalmente medição de viscosidade, cor,
índice de refracção, espectroscopia por IV e medição da constante
dieléctrica. Os ensaios químicos incluem a determinação de ácidos gordos
livres (acidez do óleo), índice de anisidina, valor de saponificação,
determinação de polímeros e de compostos polares totais. (12)
Peróxidos
Polímeros
TPM
FFA
Espuma
Cor & Viscosidade
Voláteis
Tempo
Uni
dade
med
ida
Peróxidos
Polímeros
TPM
FFA
Espuma
Cor & Viscosidade
Voláteis
Tempo
Uni
dade
med
ida
Capitulo 1
- 174 -
1.3 Absorção de gordura pelo alimento
Nos últimos anos tem-se assistido a uma evidente preocupação dos
consumidores, principalmente da Europa ocidental, em diminuir o consumo
de alimentos ricos em gorduras. Este fenómeno surgiu após os inúmeros
alertas de especialistas em nutrição e saúde, que correlacionam o consumo
de gordura com maior incidência de doenças cardiovasculares e
determinados tipos de cancro. (21,22) Neste sentido, a indústria alimentar tem
procurado soluções que minimizem a quantidade de gordura absorvida pelos
alimentos, contribuindo dessa forma para a redução das gorduras ingeridas
pelos consumidores.
Contudo, a obtenção de alimentos com menos gordura incorporada após
fritura, torna necessário entender os mecanismos envolvidos durante esse
processo, para assim ser possível diminuir a gordura acumulada. Um dos
principais mecanismos a estudar é de como se realiza a migração do óleo
para o interior da estrutura do alimento.
A fritura por imersão é uma operação complexa que envolve altas
temperaturas causando mudanças significativas a nível estrutural, do óleo e
do alimento. (23-25) Este último, durante o processo de fritura, encontra-se
sujeito a simultâneas transferências de calor e massa em direcções opostas
(sai água do alimento e entra óleo) e sofre mudanças microestruturais na sua
superfície e no seu interior (consultar figura J1, em anexo). (5,6,23) Ainda não
se encontra totalmente esclarecido de quando e como o óleo penetra na
estrutura do alimento. No entanto, inúmeros estudos realizados na última
década têm demonstrado que quase todo o óleo fica localizado na superfície
do alimento, sendo durante o processo de arrefecimento que a maior
quantidade é absorvida. (21,26-29)
Capítulo 1
- 175 -
1.4 Referências (1) Choe, E. and Min, D.B., Chemistry of Deep-Fat Frying Oils Doi:10.1111/J.1750-3841.2007.00352.X, Journal of Food Science, 2007, 72, R77-R86. (2) Choe, E. and Min, D.B., Mechanisms and Factors for Edible Oil Oxidation Doi:10.1111/J.1541-4337.2006.00009.X, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2006, 5, 169-186. (3) Boskou, G., Salta, F., Chiou, A., Troullidou, E. and Andrikopoulos, N., Content of Trans, Trans-2,4-Decadienal in Deep-Fried and Pan-Fried Potatoes., Eur J Lipid Sci Technol, 2006, 108, 109–15. (4) Pedreschi, F., Moyano, P., Kaack, K. and Granby, K., Color Changes and Acrylamide Formation in Fried Potato Slices., Food Res Intl, 2005, 38, 1–9. (5) Achir, N., Kara, W., Chipeaux, C., Trezzani, I. and Cuvelier, M.E., Effect of Energy Transfer Conditions on the Chemical Degradation of Frying Oil, Eur J Lipid Sci Technol, 2006, 108, 999-1006. (6) Dobarganes, C., Márquez-Ruiz, G. and Velasco, J., Interactions between Fat and Food During Deep-Frying, Eur J Lipid Sci Technol, 2000, 102, 521-528. (7) Osawa, C.C., Gonçalves, L.A.G. and Ragazzi, S., The Use of Fast Methodologies (Kits) in Evaluating Deep-Frying Oils, J Am Oil Chem Soc, 2007, 84, 893–897. (8) Dobarganes, M. and Marquez-Ruiz, G., Regulation of Used Frying Fats and Validity of Quick Tests for Discarding the Fats., Grasas y Aceites, 1998, 48. (9) Chung, J., Lee, J. and Choe, E., Oxidative Stability of Soybean and Sesame Oil Mixture During Frying of Flour Dough, J Food Sci, 2004, 69. (10) May, W., Peterson, R. and Chang, S., Chemical Reactions Involved in the Deep-Fat Frying of Foods: Ix. Identification of the Volatile Decomposition Products of Triolein, J AmOil Chem Soc, 1983, 60, 990–995. (11) Paul, S. and Mittal, G., Regulating the Use of Degraded Oil/Fat in Deep-Fat/Oil Food Frying, Crit Rev Food Sci Nutr, 1997, 37, 635–662. (12) Gertz, C., Chemical and Physical Parameters as Quality Indicators of Used Frying Fats, Eur J Lipid Sci Technol, 2000, 102, 566–572. (13) Gertz, C., Determination of Polymerized Triglycerides Content in Deep-Frying Fats and Oils, European Journal of Lipid Science and Technology, 2001, 103, 114-116. (14) Osawa, C.C., Goncalves, L.A.G. and Ragazzi, S., The Use of Fast Methodologies (Kits) in Evaluating Deep-Frying Oils, Journal of the American Oil Chemists Society, 2007, 84, 893-897. (15) Ramadan, M., Amer, M. and Sulieman, A.E.-R.M., Correlation between Physicochemical Analysis and Radical-Scavenging Activity of Vegetable Oil Blends as Affected by Frying of French Fries, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2006, 108, 670–678. (16) Houhoula, D., Oreopoulou, V. and Tzia, C., A Kinetic Study of Oil Deterioration During Frying and a Comparison with Heating., J Am Oil Chem Soc, 2002, 79, 133–137. (17) Tompkins, C. and Perkins, E., The Evaluation of Frying Oils with the P-Anisidine Value., J Am Oil Chem Soc, 1999, 76, 945–947. (18) Santos, J.C.O., Santos, I.M.G. and Souza, A.G., Effect of Heating and Cooling on Rheological Parameters of Edible Vegetable Oils, Journal of Food Engineering, 2005, 67, 401–405. (19) Valdés, A.F. and Garcia, A.B., A Study of the Evolution of the Physicochemical and Structural Characteristics of Olive and Sunflower Oils after Heating at Frying Temperatures, Food Chemistry, 2006, 98, 214-219. (20) Abramovic, H. and Klofutar, C., The Temperature Dependence of Dynamic Viscosity for Some Vegetable Oils, Acta Chim Slov., 1998, 45, 69-77. (21) Bouchon, P. and Pyle, D.L., Studying Oil Absorption in Restructured Potato Chips Doi:10.1111/J.1365-2621.2004.Tb13363.X, Journal of Food Science, 2004, 69, FEP115-FEP122. (22) Bassuk, S.S. and Manson, J.E., Lifestyle and Risk of Cardiovascular Disease and Type 2 Diabetes in Women: A Review of the Epidemiologic Evidence 10.1177/1559827608314095, American Journal of Lifestyle Medicine, 2008, 2, 191-213.
Capitulo 1
- 176 -
(23) Dana, D. and Saguy, I.S., Review: Mechanism of Oil Uptake During Deep-Fat Frying and the Surfactant Effect-Theory and Myth, Advances in Colloid and Interface Science, 2006, 128-130, 267-272. (24) Gertz, C., Klostermann, S. and Kochhar, S.P., Testing and Comparing Oxidative Stability of Vegetable Oils and Fats at Frying Temperature, European Journal of Lipid Science and Technology, 2000, 102, 543-551. (25) Kochhar, S.P. and Gertz, C., New Theoretical and Practical Aspects of the Frying Process, European Journal of Lipid Science and Technology, 2004, 106, 722-727. (26) Bouchon, P., Aguilera, J.M. and Pyle, D.L., Structure Oil-Absorption Relationships During Deep-Fat Frying Doi:10.1111/J.1365-2621.2003.Tb05793.X, Journal of Food Science, 2003, 68, 2711-2716. (27) Aguilera, J.M. and Gloria-Hernandez, H., Oil Absorption During Frying of Frozen Parfried Potatoes Doi:10.1111/J.1365-2621.2000.Tb16031.X, Journal of Food Science, 2000, 65, 476-479. (28) Pedreschi, F., Cocio, C., Moyano, P. and Troncoso, E., Oil Distribution in Potato Slices During Frying, Journal of Food Engineering, 2008, 87, 200-212. (29) Pedreschi, F. and Moyano, P., Oil Uptake and Texture Development in Fried Potato Slices, Journal of Food Engineering, 2005, 70, 557-563.
- 177 -
Frying is believed to have originated in ancient Egypt around 2500BC Tannahill et al, 1995 2.1 Introdução
O objectivo deste capítulo foi avaliar e acompanhar a degradação térmica
ocorrida durante o processo de fritura doméstica de vários óleos alimentares.
O conhecimento de alterações de determinados parâmetros que caracterizam
a degradação lipídica durante este complexo fenómeno, é fundamental para
desenvolver um óleo mais saudável e específico para fritura.
Os diferentes óleos alimentares estudados foram submetidos a um processo
de aquecimento contínuo durante 4,5 h a 180 ºC, durante o qual se
recolheram amostras para posterior análise e monitorização da viscosidade,
índice de anisidina, compostos polares totais, ácidos gordos livres (acidez), e
composição em ácidos gordos. De forma a avaliar a influência no processo
de fritura, da adição ao óleo de girassol de compostos activos antioxidantes,
seis diferentes formulações foram estudadas.
2 – Variação das propriedades Físico Químicas de Óleos com temperaturas associadas ao processo de Fritura
Capitulo 2
- 178 -
2.2 Materiais e Métodos
Materiais
Avaliou-se a influência da composição química dos óleos no comportamento
e estabilidade térmica dos mesmos durante o processo de fritura comparando
diferentes: óleo de Girassol, Soja, Colza e Girassol Alto Oleico (Gir AO).
Todos os óleos alimentares foram fornecidos pela Sovena, Consumer Goods,
SA.
A influência, na estabilidade oxidativa e comportamento durante o processo
de fritura, da adição de compostos activos (bioprodutos) ao óleo de girassol
foi também avaliada. Na Tabela 2.1 encontram-se listados os bioprodutos
testados e as respectivas concentrações utilizadas.
Tabela 2.1 Concentrados activos antioxidantes e respectivas concentrações (%m/m)
adicionados ao óleo de girassol.
Concentrados Antioxidantes /Bioprodutos
Concentração(% m/m)
Denominação
HT - Extracto comercial Lipofílico
de azeitona, rico em hidroxitirosol. 0,02 10HT
HT - Extracto comercial Lipofílico
de azeitona, rico em hidroxitirosol 0,03 15HT
IN – Extracto de Rosmaninho 0,05 0,05IN
IN – Extracto de Rosmaninho 0,1 0,1IN
Partículas Lipídicas com Ácido
Ascórbico 0,1 PLAA
Galato Propilo 0,008 GP80
As concentrações testadas dos bioprodutos em cima listados, foram
seleccionadas tendo em conta trabalhos anteriormente realizados, as
propriedades descritas para os diferentes produtos e respectivos modos de
utilização referidos pelos fornecedores.
As partículas lipídicas (PL) ricas em ácido ascórbico (30 % m/m em relação à
massa de lípido) foram formuladas de acordo com o método já descrito no
Capítulo 2 - Parte 1.
Capítulo 2
- 179 -
Métodos
Formulação das Particulas Bioactivas
As PL foram formuladas de acordo com o método descrito no Capítulo 2 -
Parte 1. Os adjuvantes lipídicos utilizados foram os anteriormente
mencionados, o Precirol ato 5 e o Lumulse GMS K, na proporção mássica
(50:50). As condições operatórias de pressão e temperatura (P,T) foram 120
bar (12 MPa) e 50 ºC (325 K) respectivamente.
Adição dos Concentrados Antioxidantes
1000 mg de partículas lipídicas com ácido ascórbico (PLAA) foram
adicionadas a cada kg de óleo de girassol, sendo a solubilização total
conseguida por agitação manual.
Os concentrados antioxidantes HT e IN e o galato de propilo (E310), são
preparados comerciais com especificação para óleos alimentares. A adição
do concentrado de rosmaninho envolveu a pesagem rigorosa das
quantidades a adicionar e agitação reduzida ao abrigo da luz e ar durante
alguns minutos. A adição do concentrado HT e do galato de propilo exigiu
agitação recorrendo ao homogeneizador Turrax e aquecimento a 60 ºC
durante 5 min.
As características sensoriais (cor, brilho e cheiro) não foram
significativamente alteradas.
Aquecimento Contínuo
Os ensaios de aquecimento dos óleos em contínuo foram realizados
utilizando duas fritadeiras eléctricas domésticas (Ufesa, Espanha) com 2 L de
capacidade, equipadas com um cesto de aço inoxidável.
Capitulo 2
- 180 -
Em cada fritadeira, colocou-se 2 L de óleo e aqueceu-se durante 20 minutos
até termostatização do óleo a 180 ºC ± 3 ºC.
Trinta minutos depois de se atingir a termostatização, efectuou-se a primeira
recolha de óleo. Outras quatro recolhas foram realizadas durante o restante
tempo de ensaio, intervaladas entre si em 1 h. Em cada recolha, após 1
minuto de homogeneização por agitação, recolheu-se 200 mL do óleo, sendo
a amostra recolhida colocada em recipientes fechados e opacos, e
guardados ao abrigo da luz até realização das análises. As amostras para
análise de índice de peróxidos e teste de rancimat foram guardadas a 4 ºC.
As fritadeiras permaneceram abertas durante todo o ensaio.
Óleos originais, referente ao tempo zero, foram guardados nas mesmas
condições sem serem abertos, para posteriores análises.
Análises dos parâmetros físico-químicos
A progressão da deterioração dos óleos ao longo das quatro horas e meia de
aquecimento foi acompanhada pela monitorização de diferentes parâmetros:
índice de p-anisidina, ácidos gordos livres e compostos polares totais. A
composição dos óleos em ácidos gordos foi determinada para as amostras
originais e para as amostras referentes às últimas recolhas (final do tempo de
aquecimento).
A determinação do conteúdo em compostos polares totais (TPM) dos óleos
foi realizada por medição da constante dieléctrica, imediatamente antes de se
proceder a cada recolha.
O método oficial, descrito para quantificação dos compostos polares totais, é
cromatografia em colunas de sílica. No entanto, este método é extremamente
moroso e dispendioso, pelo que nos últimos anos têm surgido referências a
métodos mais expeditos e com igual rigor e precisão para determinar o teor
destes compostos nos óleos alimentares. (1,2) A constante dieléctrica dos
diferentes óleos varia com o aumento do teor de compostos polares. Durante
os ensaios descritos, utilizou-se para quantificar o teor em TPM o Testo 265
(Alemanha), aparelho que mede a constante dieléctrica através de um sensor
Capítulo 2
- 181 -
capacitivo formado por um condutor de ouro e um substrato cerâmico. O
sensor é mergulhado in situ no óleo em estudo, quantifica a constante
dieléctrica e calcula o valor de compostos polares totais. Este valor é
expresso em percentagem (% TPM), visualiza-se num LED do aparelho.
Realizou-se sempre quatro medições distintas para determinar o erro
associado à medição deste parâmetro. Os resultados apresentam-se
graficamente na Figura 2.1, e encontram-se expressos em % TPM ± DP. Por
lei, o valor máximo de compostos polares totais permitidos num óleo
alimentar é 25%.
O índice de p-anisidina, que acompanha a formação de segundos produtos
da oxidação térmica (compostos voláteis, aldeídos e cetonas) foi determinado
para todas as amostras em duplicado. (3) O erro médio determinado para este
ensaio foi 7,1 %. As amostras cujo erro foi superior a 8 % foram novamente
analisadas. Os resultados obtidos ao longo do tempo de aquecimento,
apresentam-se graficamente na Figura 2.2, expressos em g/mL. O método de
análise encontra-se sucintamente descrito no Anexo B.
A quantificação de ácidos gordos livres foi efectuada segundo o método
oficial, que se encontra descrito no Anexo B. A determinação deste
parâmetro foi realizada para todas as recolhas ao longo do tempo do ensaio.
Os resultados, expressos em % ácido Oleico, encontram-se representados
na Figura 2.3. O erro médio associado a este ensaio foi 6 %.
O índice de peróxidos através do qual se monitoriza os primeiros produtos da
oxidação lipídica foi calculado para as várias recolhas de óleo efectuadas. O
tempo de indução determinado pelo método de Rancimat foi determinado
para as últimas recolhas de óleos correspondentes ao final do tempo de
ensaio. Dado que estes parâmetros não são específicos para a avaliação da
degradação de óleos durante o processo de fritura (Capítulo 1 – Parte II) os
resultados apresentam-se em anexo (Anexo K). Ambos os métodos foram
descritos anteriormente (Capítulo 3, Parte 1) e encontram-se mais detalhados
no Anexo B.
Capitulo 2
- 182 -
A variação da composição lipídica dos óleos ao longo do tempo de
aquecimento foi efectuada quantificando os ácidos gordos presentes nos
óleos originais e nos óleos recolhidos ao fim do tempo de ensaio (270 min). A
quantificação dos ácidos gordos foi efectuada por cromatografia gasosa
(GC), estereficando os ácidos gordos nos seus ésteres de metilo (FAME). (4)
Na Tabela 2.2, apresenta-se os resultados determinados, expressos em
percentagem mássica (% m/m).
Mediu-se a viscosidade das várias amostras de óleos recolhidas ao longo dos
270 minutos de ensaio de forma a avaliar a sua degradação estrutural. As
medidas de viscosimetria dinâmica, foram efectuadas usando um
viscosímetro para baixas viscosidades (modelo LVTD-II-Brookfield,
Middleboro, USA), e utilizando o spindle 31 adaptado a um colector de
amostras de volume reduzido, permitindo a utilização de 17 mL de amostra
de óleo por análise. As medições foram realizadas à temperatura ambiente (±
23 ºC) e num intervalo de velocidades de rotação de 1,5 a 6 rpm. Em cada
medição, a viscosidade foi determinada a 1,5 rpm, 3 rpm e 6 rpm. Os ensaios
foram realizados em duplicado, sendo os resultados finais expressos em cP ±
DP. As viscosidades referentes aos óleos originais e aos óleos recolhidos no
último tempo de ensaio (5ª Recolha, 5R) apresentam-se na Tabela 2.2 e em
gráfico na Figura 2.4. No Anexo K é possível consultar a correlação obtida
para a variação da viscosidade em função do grau de insaturação dos óleos
estudados.
Capítulo 2
- 183 -
2.3 Resultados & Discussão Os resultados obtidos, referentes aos vários parâmetros representativos da
degradação térmica ao longo do tempo de ensaio para os óleos estudados,
são de seguida apresentados.
Na Tabela 2.2, encontram-se resumidos os resultados obtidos por
cromatografia gasosa para a composição em ácidos gordos dos óleos
originais e para os óleos aquecidos em contínuo durante 270 min. Na tabela
estão representadas as percentagens mássicas globais de ácidos gordos
polinsaturados (PUFAS), monoinsturados (MUFAS) e saturados (SFA), as
percentagens mássicas dos ácidos gordos polinsaturados existentes na
conformação Trans e a razão SFA/PUFAS que representa o grau de
insaturação de cada amostra.
Tabela 2.2 Variações na composição lipídica (% m/m) verificadas ao final de 270 min de
aquecimento contínuo a 180 ºC em ambiente de fritura doméstica.
cP
t (min) Amostra PUFAS MUFAS SFA Transoleicos Translinolénicos + Translinoleicos SFA/PUFAS Viscosidade
Soja 59,68 24,74 15,58 0,02 0,80 0,26 60,80Colza 27,67 64,54 7,79 0,08 1,19 0,28 73,50
Girassol 60,15 28,78 11,07 0,02 0,15 0,18 64,00Gir PLAA 60,03 28,73 11,24 0,02 0,16 0,19 59,13Gir 10HT 60,06 28,70 11,24 0,03 0,16 0,19 59,47Gir 15HT 60,15 28,66 11,19 0,01 0,17 0,19 61,73Gir GP80 60,04 28,78 11,18 0,03 0,16 0,19 65,03Gir 0,05IN 59,82 28,82 11,36 0,02 0,16 0,19 59,60Gir 0,1IN 59,75 28,91 11,34 0,02 0,17 0,19 59,70Gir AO 11,61 79,39 9,00 0,04 0,07 0,78 77,33Soja 5R 57,44 25,86 16,70 0,10 0,81 0,29 70,50Colza 5R 26,67 65,04 8,29 0,12 1,09 0,31 67,70
Girassol 5R 58,24 29,58 12,18 0,05 0,19 0,21 69,37Gir PLAA 5R 58,05 29,92 12,03 0,09 0,21 0,21 70,57Gir 10HT 5R 58,11 29,99 11,90 0,11 0,21 0,20 76,60
Gir 15HT 5R 58,22 29,94 11,84 0,10 0,20 0,20 78,33
Gir GP80 5R 57,59 30,51 11,90 0,08 0,17 0,21 75,57Gir 0,05IN 5R 58,34 29,80 11,86 0,08 0,19 0,20 69,23Gir 0,1IN 5R 58,23 29,88 11,89 0,09 0,20 0,20 69,80Gir AO 5R 11,87 78,97 9,16 0,17 0,07 0,77 84,27
o m
in27
0 m
in
%
Capitulo 2
- 184 -
O teor em compostos polares totais (TPM) foi determinado para cada
amostra de óleo recolhida ao longo do ensaio recorrendo ao sensor
dieléctrico, Testo 265.
Os valores de % TPM obtidos para os óleos de Girassol, Soja, Colza e Alto
Oleico ao longo do tempo de aquecimento, encontram-se representados na
Figura 2.1.
Figura 2.1 Variação da percentagem mássica de compostos polares totais durante os 270
min de aquecimento contínuo a 180 ºC.
A variação dos TPM para os óleos de girassol enriquecidos com os diferentes
concentrados de antioxidantes apresenta-se graficamente no Anexo K, não
se tendo verificado variações significativas.
Os valores obtidos para os índicies de anisidina (IpA) referentes aos vários
tempos de recolha dos diferentes óleos estudados estão representados na
figura seguinte, Figura 2.2.
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 150 200 250 300
t (min)
% T
PM
Girassol Colza Girassol Alto Oleico Soja
Capítulo 2
- 185 -
Figura 2.2 Variação dos valores obtidos para o índice de anisidina ao longo dos 270min de
ensaio para os diferentes óleos avaliados. O IpA é expresso em g/mL.
As funções ajustadas aos valores experimentais são polinomiais de grau 3
relacionando-se com o espectável para andamento de funções ajustadas a
variação de compostos voláteis e aumento de ácidos gordos livres. As
regressões aplicadas aos dados experimentais apresentam coeficientes de
correlação maiores que 0,998.
Na Figura 2.3, encontra-se representado graficamente a variação dos valores
de acidez para as várias amostras de óleo de Girassol, Colza, Soja e Girassol
Alto Oleico, em função do tempo. A variação, ao final de 270 min de ensaio, é
ainda pouco acentuada.
As variações dos valores de acidez, obtidos para os óleos de girassol
enriquecidos com concentrados antioxidantes, apresentam-se no Anexo K
(Figura K3).
0
50
100
150
200
0 50 100 150 200 250 300
IpA
GirassolColzaSojaGirassol AO
0
50
100
150
200
0 50 100 150 200 250 300
IpA
Gir+10HTGir+15HTGirassol
0
50
100
150
200
0 50 100 150 200 250 300
t (min)
IpA
Gir+0,1INGir+0,05INGirassol
0
50
100
150
200
0 50 100 150 200 250 300
t (min)Ip
A
Gir+GP80Gir+PLAAGirassol
Capitulo 2
- 186 -
Figura 2.3 Variação da quantidade de ácidos gordos livres em função do tempo de aquecimento
dos óleos. A quantidade de ácidos gordos livres é expressa em %Ácido Oleico±DP.
Os valores obtidos para as viscosidades dos óleos ao final da primeira (1R -
30 min) e da quinta recolha (5R – 270 min) apresentam-se de seguida na
Figura 2.4.
Figura 2.4 Valores obtidos para as viscosidades dinâmicas dos óleos após 30 e 270 min de
aquecimento contínuo a 180ºC. As viscosidades foram medidas à temperatura ambiente.
Observando os resultados obtidos para a composição lipídica dos óleos
estudados, (Tabela 2.2 e Tabela J1 do Anexo J) no inicio (0 min) e no fim
(270 min) do processo de aquecimento em contínuo a 180 ºC, é possível
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 50 100 150 200 250 300t (min)
%FF
A
Girassol SojaColza Girassol AO
0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00
SojaColz
a
Girass
ol
Girass
ol AO
Girass
ol PLA
A
Girass
ol 10
HT
Girass
ol 15
HT
Girass
ol GP80
Girass
ol 0,0
5IN
Girass
ol 0,1
IN
μ, c
P
Originais 30 min 270 min
Capítulo 2
- 187 -
distinguir pequenas variações nas quantidades de ácidos gordos
polinsaturados (PUFAS) e saturados (SFA). Resultados idênticos foram já
anteriormente reportados, concluindo-se que durante o processo de
aquecimento a 180 ºC (temperatura comum de fritura) ocorre uma diminuição
dos ácidos gordos polinsaturados em detrimento do aumento dos ácidos
gordos saturados. No trabalho apresentado, as modificações observadas
foram mais significativas para os óleos de soja e colza, para os quais se
observou um ligeiro aumento do ácido palmítico (C16:0), do ácido esteárico
(C18:0) e do ácido Oleico (C18:1), verificando-se em simultâneo um ligeiro
decréscimo do ácido linoleico (C18:2) e linolénico (C18:3). O tratamento
térmico induziu a modificação dos ácidos gordos com duas ou mais ligações
duplas evidenciando dessa forma a instabilidade de óleos ricos em n-3
PUFAS, como é o caso do óleo de colza. (1, 5, 6,7).
Não se verificou em nenhum dos óleos avaliados formação significativa de
isómeros trans do ácido linolénico e linoleico, durante o tempo de ensaio.
Estes resultados sugerem que o óleo de soja e o óleo de colza são os mais
susceptíveis à oxidação térmica verificada durante o processo de fritura.
Ao longo do tempo, para as várias recolhas de óleos, os compostos polares
totais (TPM) foram aumentando, revelando um aumento da degradação
lipídica das gorduras vegetais com a exposição a temperatura elevada. O
valor dos compostos polares totais aumenta devido ao aumento de ácidos
gordos livres, dímeros e polímeros de triacilgliceróis ao longo do tempo de
aquecimento (Figura 2.1 e Figura K2).
O aumento de TPM mais acentuado foi observado para o óleo de soja e em
seguida para o óleo de girassol. Quanto mais elevado o grau de insaturação
de um óleo maior a sua instabilidade e menor a sua resistência à oxidação
térmica. Como já referido, este comportamento deve-se aos PUFAS serem
ácidos gordos mais reactivos devido às posições das suas ligações duplas, (1,6,8) sendo por isso mais susceptíveis à oxidação térmica. Como resultado, o
óleo de girassol alto oleico, óleo com um valor baixo de polinsaturados e
elevado teor de monoinsaturados, foi o que apresentou valores mais
reduzidos para os TPM formados ao longo do tempo, sendo por isso maior a
Capitulo 2
- 188 -
sua resistência à oxidação imposta pela temperatura. Por sua vez, para o
óleo de colza, que embora rico em ácido linolénico apresenta um teor
reduzido de PUFAS, também se observou uma menor variação dos TPM
formados ao longo do tempo de ensaio. Apesar do elevado teor em ácido
linolénico, o óleo de colza é bastante rico em MUFAS (valor duas vezes
superior a um óleo de girassol ou de soja).
Para os óleos de girassol ricos em antioxidantes, não se observou diferenças
significativas na evolução dos TPM, não diferindo dos valores obtidos para o
aquecimento de óleo de girassol (Figura J2, Anexo J).
Como esperado, para todos os óleos avaliados, os ácidos gordos livres (FFA)
e o índice de anisidina (quantificação de segundos produtos da oxidação)
aumentaram ao longo do tempo de aquecimento. (3)
Os valores de anisidina expressam a formação de produtos resultantes da
decomposição dos hidroperóxidos que ocorre durante o processo de
oxidação térmica. Ao longo do tempo de ensaio, o aumento destes produtos
da oxidação foi notório, sendo o valor mais elevado determinado para o óleo
de soja, e em seguida para o óleo de girassol (Figura 2.2). Como já
mencionado, essa diferença é resultado da composição lipídica dos óleos,
onde o teor mais elevado de ácidos gordos polinsaturados do óleo de soja e
do óleo de girassol, comparativamente ao óleo de colza e de girassol alto
oleico (Tabela 2.2), os torna óleos mais instáveis durante a oxidação térmica.
Este facto é mais evidente no óleo de soja, onde a oxidação das ligações
duplas do ácido gordo em maior concentração, o ácido linolénico, origina
ácidos gordos de menor peso molecular.
No caso de aquecimento contínuo de óleo e ausência de alimento, os FFA
formam-se por oxidação das ligações duplas dos ácidos gordos
polinsaturados (PUFAS), dando origem a grupos carbonilo que se convertem
em ácidos gordos de baixo peso molecular. (1,6,9) No entanto, devido ao
pouco tempo de aquecimento do ensaio realizado, os aumentos observados
são pouco acentuados, sendo as diferenças pouco significativas entre os
óleos de colza, girassol, girassol alto oleico e soja (Figura 2.3). Como se
Capítulo 2
- 189 -
pode observar na Figura 1.1 da Introdução, o aumento dos ácidos gordos
livres apresenta numa primeira fase do aquecimento um aumento menos
acentuado, tornando-se, só com o decorrer da exposição à temperatura,
exponencial. A observação desse aumento significativo e exponencial num
processo de fritura contínuo é muitas vezes verificada ao final de mais de um
dia de fritura consecutiva. Analisando os resultados da acidez determinados
para os óleos enriquecidos com os concentrados antioxidantes (Figura J3 do
Anexo J), verifica-se que para todos eles os valores obtidos foram muito
semelhantes, não sendo possível observar variação em relação ao óleo de
girassol. Este resultado, reflecte mais uma vez a diminuída acção dos
compostos antioxidantes testados durante a operação de fritura. (6,10-12) O
aumento da acidez das amostras analisadas acompanhou o aumento de
compostos polares totais determinados.
É possível correlacionar os valores de viscosidade determinados para as
diferentes amostras de óleos com os seus teores em PUFAS (Figura J1,
Anexo J). Em geral, para todos os óleos, durante a primeira hora de ensaio,
observou-se uma redução do valor de viscosidade. Em óleos não
degradados, a redução da viscosidade é o comportamento normal. (1,13-15) O
aumento da viscosidade só se observa para óleos com degradação lipídica
evidente, e que neste caso só foi observada após duas horas de ensaio,
excepto para o óleo de colza. O óleo de colza, ao final dos 270 min ainda não
atingiu o valor da sua viscosidade original. A adição de antioxidantes não
demonstrou nenhuma variação na viscosidade do óleo de girassol, sugerindo
que estes antioxidantes nas concentrações testadas não têm acção efectiva
na inibição das reacções de polimerização e oxidação ocorridas durante o
tratamento térmico.
Os óleos cujo perfil lipídico é mais rico em compostos monoinsaturados, óleo
girassol alto oleico e óleo de colza, são os que apresentam uma maior
resistência à oxidação térmica que ocorre no processo de fritura, sendo
considerados por isso, óleos mais saudáveis para consumo humano. No
entanto, o óleo de colza contém uma maior quantidade inicial de isómeros
Capitulo 2
- 190 -
Trans dos ácidos linoleico e linolénico, a que estão associados a efeitos
negativos no perfil da lipoproteinas. (16-18)
Capítulo 2
- 191 -
2.4 Referências
(1) Ramadan, M., Amer, M. and Sulieman, A.E.-R.M., Correlation between Physicochemical Analysis and Radical-Scavenging Activity of Vegetable Oil Blends as Affected by Frying of French Fries, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2006, 108, 670–678. (2) Gertz, C., Chemical and Physical Parameters as Quality Indicators of Used Frying Fats, Eur J Lipid Sci Technol, 2000, 102, 566–572. (3) Tompkins, C. and Perkins, E., The Evaluation of Frying Oils with the P-Anisidine Value., J Am Oil Chem Soc, 1999, 76, 945–947. (4) Kowalski, R., Gc Analysis of Changes in the Fatty Acid Composition of Sunflower and Olive Oils Heated with Quercetin, Caffeic Acid, Protocatechuic Acid, and Butylated Hydroxyanisole, Acta Chromatographica, 2007, 18, 15-23. (5) Dubois, V., Breton, S., Linder, M., Fanni, J. and Parmentier, M., Fatty Acid Profiles of 80 Vegetable Oils with Regard to Their Nutritional Potential, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2007, 109, 710–732. (6) Choe, E. and Min, D.B., Chemistry of Deep-Fat Frying Oils Doi:10.1111/J.1750-3841.2007.00352.X, Journal of Food Science, 2007, 72, R77-R86. (7) Gertz, C. and Kochhar, S.P., A New Method to Determine Oxidative Stability of Vegetable Fats and Oils at Simulated Frying Temperature, Ocl-Oleagineux Corps Gras Lipides, 2001, 8, 82-88. (8) Choe, E. and Min, D.B., Mechanisms and Factors for Edible Oil Oxidation Doi:10.1111/J.1541-4337.2006.00009.X, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2006, 5, 169-186. (9) Chung, J., Lee, J. and Choe, E., Oxidative Stability of Soybean and Sesame Oil Mixture During Frying of Flour Dough, J Food Sci, 2004, 69. (10) Gertz, C., Klostermann, S. and Kochhar, S.P., Testing and Comparing Oxidative Stability of Vegetable Oils and Fats at Frying Temperature, European Journal of Lipid Science and Technology, 2000, 102, 543-551. (11) Kochhar, S.P., Stabilisation of Frying Oils with Natural Antioxidative Components, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2000, 102, 552–559. (12) Yanishlieva, N.V. and Marinova, E.M., Stabilisation of Edible Oils with Natural Antioxidants, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2001, 103, 752–767. (13) Santos, J.C.O., Santos, I.M.G. and Souza, A.G., Effect of Heating and Cooling on Rheological Parameters of Edible Vegetable Oils, Journal of Food Engineering, 2005, 67, 401–405. (14) Pedreschi, F. and Moyano, P., Oil Uptake and Texture Development in Fried Potato Slices, Journal of Food Engineering, 2005, 70, 557-563. (15) Valdés, A. and Garcia, A., A Study of the Evolution of the Physicochemical and Structural Characteristics of Olive and Sunflower Oils after Heating at Frying Temperatures, Food Chemistry, 2005, 98, 2006. (16) Okuyama, H., Fujii, Y. and Ikemoto, A., N-6/N-3 Ratio of Dietary Fatty Acids Rather Than Hypercholesterolemia as the Major Risk Factor for Atherosclerosis and Coronary Heart Disease., J. Health Sci., 2000, 46, 157-177. (17) Merchant, A.T. et al., Interrelation of Saturated Fat, Trans Fat, Alcohol Intake, and Subclinical Atherosclerosis, Am J Clin Nutr, 2008, 87, 168-174. (18) Leonard, E.C., Dietary Fatty Acids: Effect of the N-6/N-3 Balance on Human Nutrition and Disease., Lipid Technol., 1999, 11, 110-114.
- 193 -
The global potato chips market generated total revenues of 16.4 billion dollars in 2005. This accounted for 35.5% of the total savory snacks market in that year (46.1 billion dollars). Euromonitor, 2007 3.1 Introdução
O objectivo deste capítulo foi i) estudar a variação da quantidade de óleo
absorvida pelo alimento, ao longo de 4,5 h de frituras sucessivas a 180 ºC em
ambiente de fritura doméstico, ii) tentar estabelecer correlação e relação
entre a quantidade de gordura incorporada no alimento e as variações dos
parâmetros físico-químicos determinados no processo de aquecimento
contínuo sem alimento, realizado em condições operatórias idênticas
(apresentado no capítulo anterior - Capítulo 2).
Escolheu-se como modelo de estudo de incorporação de gordura a batata,
devido a ser o alimento que é mais consumido frito em todo o mundo.
É necessário o conhecimento e esclarecimento de quais os parâmetros que
influenciam a incorporação de gordura durante o complexo processo de
3 – Correlação das propriedades Físico Químicas de um Óleo com quantidade de gordura absorvida pelo alimento durante o processo de Fritura
Capitulo 3
- 194 -
fritura, de forma a ser possível produzir óleos ou processos que diminuam a
gordura consumida.
Ao longo do tempo de ensaio, para além da quantificação da gordura
incorporada na batata, determinou-se o teor de compostos polares totais ao
longo das diferentes recolhas. 3.2 Materiais e Métodos A influência da composição dos diferentes óleos no teor de gordura absorvida
na batata foi avaliada comparando os resultados obtidos para fritura com óleo
de Girassol, Soja, Colza e Girassol Alto Oleico, todos eles fornecidos pela
Sovena, Consumer Goods, SA.
O estudo da interferência da presença de compostos antioxidantes na
composição do óleo utilizado em fritura foi realizado tendo como modelo o
óleo de girassol. Ao óleo de girassol adicionou-se os concentrados activos
antioxidantes (bioprodutos) estudados no processo de aquecimento contínuo,
apresentado no capítulo anterior.
Métodos
Formulação das Particulas Bioactivas
O processo de produção das PL foi o descrito no capitulo 2 - Parte 1.
Utilizaram-se os adjuvantes lipídicos, o Precirol ato 5 e o Lumulse GMS K na
proporção mássica (50:50). As condições operatórias de pressão e
temperatura (P,T) foram 120 bar (12MPa) e 50 ºC (325 K) respectivamente.
Adição dos Concentrados Antioxidantes
A incorporação das PLAA no óleo alimentar consistiu em adicionar 1000 mg
de partículas formuladas a cada kg de óleo. A solubilização das partículas no
óleo foi conseguida por agitação manual.
Capítulo 3
- 195 -
Os concentrados antioxidantes HT e IN e o galato de propilo (E310), são
preparados comerciais com especificação para óleos alimentares. A adição
do concentrado de rosmaninho envolveu a pesagem rigorosa das
quantidades a adicionar e agitação reduzida ao abrigo da luz e ar durante
alguns minutos. A adição do concentrado HT e do galato de propilo
necessitou de agitação recorrendo ao homogeneizador Turrax e aquecimento
a 60 ºC durante 5 min.
As características sensoriais (cor, brilho e cheiro) não foram
significativamente alteradas.
Fritura
Os ensaios de fritura em contínuo foram realizados durante 270 min,
utilizando duas fritadeiras eléctricas domésticas (Ufesa, Espanha) com 2 L de
capacidade, equipadas com um cesto de aço inoxidável para imersão dos
alimentos.
Em cada fritadeira, colocou-se 2 L de óleo e iniciou-se o aquecimento.
Esperou-se 20 minutos até os óleos termostatizarem a 180 ºC ± 3 ºC.
As batatas foram previamente descascadas e cortadas em palitos com uma
dimensão média de (lxcxh de 1,3x8,2x0,8). Em cada lote de fritura colocou-se
100 g ± 1 g de batatas no cesto de aço inoxidável.
A primeira fritura realizou-se trinta minutos depois de termostatização a
180 ºC, sendo as outras quatro frituras seguintes realizadas com intervalos
de 1 h. Em cada fritura registou-se o tempo de imersão das batatas e foram
retiradas após comparação visual de cor. A cor dourada, necessária para a
remoção das batatas, foi coincidente com o tempo de fritura (Tf) em todos os
óleos (Tf1R: 3 min; Tf2R:4 min; Tf3R: 4 min; Tf4R: 5 min; Tf5R: 5 min). Antes
de cada fritura mediu-se a quantidade de compostos polares totais utilizando
o sensor Testo 265. Após cada Tf as batatas foram removidas e
permaneceram no cesto de aço inoxidável a arrefecer durante 10 min, sendo
de seguida guardadas em frascos opacos para posterior análise de absorção
de gordura. As fritadeiras permaneceram abertas durante todo o ensaio.
Extracção de Gordura
Capitulo 3
- 196 -
O teor de óleo incorporado em cada recolha de batatas foi determinado por
método de extracção em Soxhlet com n-hexano, durante 2 h, sendo
posteriormente cada amostra obtida, evaporada à secura por destilação a
pressão reduzida. A determinação do teor de óleo é efectuada por diferença
de peso em relação ao balão de evaporação vazio. No Anexo L, encontra-se
o método descrito mais sucintamente.
O erro médio associado a este ensaio foi de 6,7 %.
Capítulo 3
- 197 -
3.3 Resultados & Discussão Apresenta-se na figura seguinte, Figura 3.1, os resultados determinados para
o teor de gordura incorporada nas batatas ao longo do tempo de ensaio e
para os diferentes tipos de óleo.
Figura 3.1 Variação do teor de gordura absorvida na batata em função do tempo de fritura.
O andamento da absorção de gordura em função do tempo de fritura é o
característico de uma função polinomial de grau 3 em que no inicio do
processo se verifica um rápido aumento da quantidade de gordura
incorporada no alimento seguido de um gradiente de diminuição gradual. Os
coeficientes de correlação determinados foram todos superiores a 0,99.
Antes de cada lote de fritura, efectuou-se a medição do teor de compostos
polares totais (TPM) através do aparelho Testo 265, que mede a constante
dieléctrica através de um sensor capacitivo formado por um condutor de ouro
e um substrato cerâmico. O sensor é mergulhado in situ no óleo,
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 150 200 250 300
t (min)
% G
ordu
ra
GirassolColzaSojaGirassol AO
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 150 200 250 300t (min)
% G
ordu
ra
Gir+10HTGir+15HTGirassol
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 150 200 250 300
t (min)%
Gor
dura
Gir+0,1INGir+0,05INGirassol
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 150 200 250 300t (min)
% G
ordu
raGir+GP80Gir+PLAAGirassol
Capitulo 3
- 198 -
quantificando a constante dieléctrica e calculando o valor de compostos
polares totais, expressos em percentagem (%TPM) e visualizados num LED
do aparelho. Realizaram-se sempre quatro medições distintas deste
parâmetro.
Os resultados, representados graficamente na Figura 3.2, são expressos em
%TPM ± DP.
Figura 3.2 Variação dos compostos polares totais ao longo dos 270 min de ensaio. Medição
efectuada imediatamente antes de cada fritura.
A fritura por imersão é um processo extremamente complexo que decorre a
elevadas temperaturas, envolvendo variações estruturais dos alimentos
associadas a transferência de massa e de calor (Figura J1, Anexo J) entre o
óleo e o respectivo alimento. (1-3)
A quantidade de gordura incorporada e absorvida pelo alimento depende de
inúmeros factores tais como o processo de fritura, as características do
próprio alimento e a qualidade do óleo utilizado, não existindo no entanto
correlações directas com parâmetros físico-químicos característicos das
gorduras utilizadas. (1, 2, 4)
R2 = 0,9822
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50 60 70
% PUFAS
% T
PM
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 150 200 250 300t (min)
% T
PM
Girassol FB Colza FB Girassol Alto Oleico FB Soja FB
PUFAS
Capítulo 3
- 199 -
Observou-se para todos os óleos testados, que ao longo do processo de
fritura, o teor de gordura incorporada nas batatas vai aumentando. É possível
relacionar este facto com a degradação termo-oxidativa dos óleos
determinada na primeira fase do estudo, no ensaio de aquecimento contínuo
realizado nas mesmas condições operatórias do ensaio de fritura com batata.
Durante a degradação oxidativa aumenta a quantidade de compostos polares
(principalmente dímeros e polímeros de triacilgliceróis) presentes nos óleos
alimentares, contribuindo para o aumento da viscosidade dos mesmos
(Figura 3.2). Um aumento de viscosidade do óleo pode estar relacionado com
o maior teor de gordura retida no alimento ao longo do tempo.
Dessa forma, seria de esperar que os óleos mais resistentes à oxidação
térmica e mais estáveis durante os ensaios de aquecimento contínuo fossem
os que provocassem menor incorporação de gordura no alimento. Contudo
isso não se verificou. O óleo de colza, um dos mais estáveis à oxidação
térmica devido ao seu teor de monoinsaturados, foi o que revelou uma maior
absorção de gordura nas batatas durante a última fritura. Por sua vez, o óleo
de soja, característico pela sua instabilidade a alta temperatura demonstrou
ser o que, a seguir ao óleo de colza, promovia mais retenção de gordura na
batata. Neste caso, não é a viscosidade o parâmetro que está a determinar a
absorção do óleo na estrutura do alimento testado, dado que a viscosidade
do óleo de colza na última recolha do ensaio de aquecimento é da mesma
ordem de grandeza que a do óleo de soja (Figura 2.4 – Capítulo 2),
evidenciando dessa forma, que um factor determinante para o processo de
fritura é a estrutura do próprio alimento e as transferências de massa e calor
que ocorrem durante a imersão no óleo.
Por outro lado, tanto o óleo de colza, como o óleo de soja são ricos em ácido
linolénico, sendo por isso mais susceptíveis de ocorrer a formação de
polímeros durante o processo de fritura. (5) A polimerização está associada a
uma redução de transferência de energia entre óleo/alimento, sendo um dos
factores que pode justificar a maior retenção de gordura dentro da
microestrutura da batata. (5)
Capitulo 3
- 200 -
Existem diferenças entre o ensaio realizado com as batatas e o ensaio de
aquecimento do óleo em contínuo, principalmente a nível do teor de água
presente no óleo. Os alimentos, durante o processo de fritura, libertam água
que abandona o óleo sob a forma de vapor. A água desencadeia reacções de
hidrólise, responsáveis pela quebra de ligações nos triacilgliceróis,
aumentando assim o conteúdo em ácidos gordos de menor peso molecular,
por sua vez responsáveis por originar reacções de oxidação. As reacções de
hidrólise ocorrem preferencialmente em óleos com teor de insaturação mais
elevado dado que estes ácidos gordos são mais solúveis em água.
Desta forma, a acidez dos óleos é influenciada pelas reacções de hidrólise
que podem ocorrer durante a fritura da batata, pelo que a quantidade real de
ácidos gordos livres (FFA) presente nos óleos após as frituras é de certeza
mais elevada do que a quantidade determinada no ensaio de aquecimento
contínuo sem alimento.
No entanto, se houvesse um aumento nos FFA muito significativo em relação
à medida efectuada no ensaio de aquecimento, esse deveria ser reflectido na
quantidade total de compostos polares medida antes de cada lote de fritura.
Observando os valores obtidos para a % de TPM (Figura 3.2), verifica-se que
os valores são semelhantes aos obtidos no ensaio de aquecimento contínuo
apresentado no capítulo anterior (Capitulo 2 – Figura 2.1), não sendo
evidente o aumento drástico de FFA.
Nos ensaios realizados com óleo de girassol, aos quais se adicionou
concentrados activos de antioxidantes, o teor de gordura absorvida foi
também aumentando ao longo do tempo de fritura. Em geral não se observou
em relação ao óleo de girassol original, variações significativas no teor de
gordura extraído das batatas para as diferentes recolhas, excepto no caso do
óleo ao qual se adicionou as partículas lipídicas com ácido ascórbico (PLAA).
Nos ensaios realizados com este óleo, verificou-se tendência para um menor
teor de gordura retido nas batatas após as cinco recolhas efectuadas (Figura
3.1). Tendo em conta que o ácido ascórbico é um forte quelante, com acção
antioxidante, que actua como inibidor das reacções de polimerização que se
desencadeiam a partir de 120 ºC a ligeira diminuição de quantidade de
Capítulo 3
- 201 -
gordura absorvida pelas batatas pode ser resultado destas suas
propriedades. (6)
Reportado na literatura, existem fundamentalmente três mecanismos
propostos para explicar o complexo processo de absorção de gordura no
alimento durante a fritura por imersão: 1) substituição da água removida do
alimento por óleo; 2) efeito de arrefecimento e 3) presença de agentes
tensioactivos na superfície do alimento. (2)
De seguida, serão rapidamente abordados os três mecanismos acima
mencionados.
1) Substituição da água removida
Considerando a fritura um processo de secagem, o óleo substitui a água
quando esta se liberta rapidamente sob a forma de vapor. A água ao sair de
forma rápida do alimento torna a sua superfície seca ajudando na formação
da crosta de fritura. No interior do alimento, permanece uma certa quantidade
de água que se vaporiza e se torna responsável pela formação de um
gradiente de pressão positivo. Assim, o vapor para sair do alimento passa por
pequenas aberturas e canais (que devido a pressão exercida na crosta se
são originados) fazendo com que o óleo consiga penetrar no interior do
alimento à medida que a água sai. (2) Este mecanismo é proposto como
possível explicação para a relação encontrada entre a perda de água e
absorção de gordura no alimento. (7,8)
No entanto, este mecanismo só consegue explicar parte do processo de
absorção dado que foi demonstrado por muitos autores que grande parte do
óleo absorvido no alimento acontece durante o seu processo de
arrefecimento. (4,7,9) Experiências realizadas com um capilar cheio de água
demonstram o possível mecanismo que ocorre na etapa de arrefecimento. Ao
observarmos um capilar cheio de água introduzido em óleo quente é possível
ver a água a evaporar. Contudo, só é possível ver o óleo a entrar,
preenchendo o espaço vazio no capilar criado pela água evaporada, quando
este é removido do óleo. No instante da remoção, a descida de temperatura
Capitulo 3
- 202 -
provoca a condensação de água descendo a pressão interna promovendo a
entrada de óleo para o interior do capilar.
Este fenómeno indica que a formação de canais no alimento não é o factor
determinante da absorção de gordura. (2)
1) Efeito do Arrefecimento
O efeito do arrefecimento é explicado em parte pela teoria demonstrada pela
experiência do capilar. A descida da pressão interna devido à condensação
do vapor de água faz com que o óleo seja “sugado” por um “efeito de vácuo”
aderindo à superfície do alimento. Este mecanismo explica a absorção de
óleo como um fenómeno de superfície existindo um equilíbrio entre a adesão
e a drenagem de óleo. (10) Sendo a superfície do alimento um factor
determinante, a incorporação e distribuição do óleo relaciona-se com a
microestrutura da crosta formada durante a fritura.(1,2,4,11) Por outro lado, a
viscosidade do óleo é também fundamental no mecanismo de absorção do
óleo no alimento. O aumento da viscosidade, em parte motivada pela
polimerização dos triacilgliceróis, leva ao aumento da retenção do óleo na
microestrutura da crosta do alimento (Figura J2, Anexo J), devido à
dificuldade de drenagem do óleo. (2,5,12, 11, 13)
3) Agentes tensioactivos na superfície do alimento
O processo de termo-oxidação promove o aparecimento de inúmeros
compostos resultantes da degradação dos triacilgliceróis, alterando
drasticamente a estrutura do óleo. (14) A água que evapora dos alimentos
desencadeia reacções de hidrólise responsáveis pela quebra de ligações
entre os ácidos gordos e a molécula de glicerol formando-se mono- e
diglicéridos que vão promovendo a formação de espuma. (2,5,15) Por sua vez,
a presença de espuma e glicerol aceleram as reacções de hidrólise
formando-se ainda mais compostos menores resultantes da degradação dos
ácidos gordos. A presença destes produtos de degradação reduz a tensão
interfacial entre o óleo e a superfície do alimento, agindo como agentes
Capítulo 3
- 203 -
tensioactivos, que favorecem o contacto entre estes dois elementos
aumentando significativamente a retenção de gordura.
As várias teorias existentes para explicar este complexo processo
comprovam que a operação de fritura depende das características do produto
a fritar e da qualidade do óleo utilizado.
A temperaturas elevadas, devido a um menor tempo de operação, a
absorção de gordura é normalmente mais reduzida e a crosta formada no
alimento age como barreira física à penetração do óleo. Contudo os estudos
são controversos, existindo resultados de maior absorção de gordura em
ensaios realizados a temperaturas de fritura mais elevadas, provando-se que
o processo de fritura é também um factor determinante.
Foi também demonstrado que uma pré-secagem do alimento reduz o teor de
gordura incorporada, tanto em batatas normais como em batatas tratadas em
água salgada. (11) As batatas tratadas em água salgada demonstraram
absorver mais quantidade de gordura, provavelmente devido à superfície se
encontrar mais molhada. (9,10,16,17)
Possíveis explicações para estes factos relacionam-se com mudanças
estruturais, redução do teor de humidade do alimento e menor superfície de
contacto. (18)
Capitulo 3
- 204 -
3.4 Referências (1) OUCHON, P.B., AGUILERA, J.M. and PYLE, D.L., Structure Oil-Absorption Relationships During Deep-Fat Frying Doi:10.1111/J.1365-2621.2003.Tb05793.X, Journal of Food Science, 2003, 68, 2711-2716. (2) Dana, D. and Saguy, I.S., Review: Mechanism of Oil Uptake During Deep-Fat Frying and the Surfactant Effect-Theory and Myth, Advances in Colloid and Interface Science, 2006, 128-130, 267-272. (3) Gertz, C., Klostermann, S. and Kochhar, S.P., Deep Frying: The Role of Water from Food Being Fried and Acrylamide Formation, Ocl-Oleagineux Corps Gras Lipides, 2003, 10, 297-303. (4) OUCHON, P.B. and PYLE, D.L., Studying Oil Absorption in Restructured Potato Chips Doi:10.1111/J.1365-2621.2004.Tb13363.X, Journal of Food Science, 2004, 69, FEP115-FEP122. (5) Choe, E. and Min, D.B., Chemistry of Deep-Fat Frying Oils Doi:10.1111/J.1750-3841.2007.00352.X, Journal of Food Science, 2007, 72, R77-R86. (6) Gertz, C., Klostermann, S. and Kochhar, S.P., Testing and Comparing Oxidative Stability of Vegetable Oils and Fats at Frying Temperature, European Journal of Lipid Science and Technology, 2000, 102, 543-551. (7) GAMBLE, M.H. and RICE, P., Effect of Pre-Fry Drying of Oil Uptake and Distribution in Potato Crisp Manufacture Doi:10.1111/J.1365-2621.1987.Tb00519.X, International Journal of Food Science & Technology, 1987, 22, 535-548. (8) RICE, P. and GAMBLE, M.H., Technical Note: Modelling Moisture Loss During Potato Slice Frying Doi:10.1111/J.1365-2621.1989.Tb00632.X, International Journal of Food Science & Technology, 1989, 24, 183-187. (9) Pedreschi, F. and Moyano, P., Oil Uptake and Texture Development in Fried Potato Slices, Journal of Food Engineering, 2005, 70, 557-563. (10) Pedreschi, F., Cocio, C., Moyano, P. and Troncoso, E., Oil Distribution in Potato Slices During Frying, Journal of Food Engineering, 2008, 87, 200-212. (11) Aguilera, J.M. and Gloria-Hernandez, H., Oil Absorption During Frying of Frozen Parfried Potatoes Doi:10.1111/J.1365-2621.2000.Tb16031.X, Journal of Food Science, 2000, 65, 476-479. (12) Gertz, C., Determination of Polymerized Triglycerides Content in Deep-Frying Fats and Oils, European Journal of Lipid Science and Technology, 2001, 103, 114-116. (13) Santos, J.C.O., Santos, I.M.G. and Souza, A.G., Effect of Heating and Cooling on Rheological Parameters of Edible Vegetable Oils, Journal of Food Engineering, 2005, 67, 401–405. (14) Chung, J., Lee, J. and Choe, E., Oxidative Stability of Soybean and Sesame Oil Mixture During Frying of Flour Dough, J Food Sci, 2004, 69. (15) Ramadan, M., Amer, M. and Sulieman, A.E.-R.M., Correlation between Physicochemical Analysis and Radical-Scavenging Activity of Vegetable Oil Blends as Affected by Frying of French Fries, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2006, 108, 670–678. (16) Pedreschi, F. and Aguilera, J.M., Some Changes in Potato Chips During Frying Observed by Confocal Laser Scanning Microscopy (Clsm) 10.1177/1082013202008004931, Food Science and Technology International, 2002, 8, 197-201. (17) Durán, M., Pedreschi, F., Moyano, P. and Troncoso, E., Oil Partition in Pre-Treated Potato Slices During Frying and Cooling, Journal of Food Engineering, 2007, 81, 257-265. (18) Troncoso, E. and Pedreschi, F., Modeling of Textural Changes During Drying of Potato Slices, Journal of Food Engineering, 2007, 82, 577-584.
- 205 -
A fritura por imersão (deep fat frying) é um dos métodos mais antigos e
populares para se preparar os alimentos, tanto devido à sua rapidez e
eficiência como às características organolépticas conferidas aos preparados
finais. (1,2)
A tendência de mercado para uma alimentação mais saudável e a evidente
preocupação dos consumidores, em diminuir o consumo de alimentos ricos
em gorduras, tem reunido cientistas e indústrias em todo mundo no sentido
de se procurar explanar quais os mecanismos que determinam a
incorporação e distribuição de gordura no alimento. Encontrar soluções para
produção de alimentos fritos com menor teor de gordura e formulações ideais
para óleos especiais de fritura, é uma forte motivação para a investigação
deste complexo processo que é a fritura por imersão.
Os ensaios realizados na ausência de alimento, demonstraram que ao longo
do tempo de aquecimento todos os óleos sofrem um processo de termo-
oxidação, durante o qual vai ocorrendo a sua degradação.
4 – Conclusões Finais
Capitulo 4
- 206 -
Os óleos com menor teor de PUFAS, o óleo de colza e óleo girassol alto
oleico, revelaram ser os óleos mais estáveis ao processo de degradação
durante o aquecimento. A adição de concentrados activos antioxidantes ao
óleo de girassol não demonstrou ser efectiva para a retardação do processo
de termo-oxidação.
Os PUFAS, devido à posição das suas ligações duplas são extremamente
reactivos sendo por isso instáveis ao processo de termo-oxidação.
O óleo de colza, embora rico em monoinsaturados e com baixo teor em
polinsaturados, é uma boa fonte de ácido linolénico (n-3 PUFA). Apesar da
sua concentração neste ácido gordo mais instável, a existência de maior
quantidade de monoinsaturados confere-lhe mais estabilidade.
Por outro lado, verificou-se que a viscosidade dos óleos aumenta ao longo do
tempo de ensaio, evidenciando a degradação que estes vão sofrendo ao
longo do processo. Os valores de viscosidades obtidos para os diferentes
óleos após as 4,5h de ensaio não apresentam variações significativas entre
si. Sabe-se que o aumento da viscosidade dos óleos se relaciona em parte
com as reacções de polimerização dos triacilgliceróis, podendo dessa forma
influênciar a absorção de gordura no alimento devido à dificuldade de
drenagem do óleo durante o processo de arrefecimento.
No ensaio de frituras sucessivas de batatas, realizado nas mesmas
condições do ensaio de aquecimento contínuo, observou-se que o teor de
gordura absorvido pelas batatas aumentou com o tempo de fritura para todos
os óleos testados. Contudo, observou-se que tanto o óleo de colza como o
óleo de soja são os promoveram a maior retenção de óleo no interior do
alimento testado. Tal facto pode ser relacionado com o maior conteúdo,
destes dois óleos, em ácido linolénico. O n-3 PUFA, devido à posição das
suas ligações duplas é muito instável, associando-se a um aumento de
dímeros e polímeros de triacilgliceróis, responsáveis pela redução da
transferência de energia entre óleo/alimento. Este pode ser um dos factores
Capítulo 4
- 207 -
que pode justificar a maior retenção de gordura dentro da microestrutura da
batata. (1)
O processo de absorção de gordura pelos alimentos ainda não se encontra
totalmente esclarecido. Três mecanismos são hoje em dia propostos, para
descrever quais os factores que influenciam a absorção de gordura. Da
análise dos mesmos, evidencia-se o mecanismo que descreve o efeito de
arrefecimento como o passo determinante na incorporação e distribuição do
óleo na estrutura do alimento, relacionando-se dessa forma com a
microestrutura da crosta formada durante a fritura.(3-6)
As várias teorias existentes para explicar este complexo processo
comprovam que a operação de fritura depende das características do produto
a fritar e da qualidade do óleo utilizado.
Capitulo 4
- 208 -
4.1 Referências
(1) Choe, E. and Min, D.B., Chemistry of Deep-Fat Frying Oils Doi:10.1111/J.1750-3841.2007.00352.X, Journal of Food Science, 2007, 72, R77-R86. (2) Choe, E. and Min, D.B., Mechanisms and Factors for Edible Oil Oxidation Doi:10.1111/J.1541-4337.2006.00009.X, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2006, 5, 169-186. (3) OUCHON, P.B., AGUILERA, J.M. and PYLE, D.L., Structure Oil-Absorption Relationships During Deep-Fat Frying Doi:10.1111/J.1365-2621.2003.Tb05793.X, Journal of Food Science, 2003, 68, 2711-2716. (4) Dana, D. and Saguy, I.S., Review: Mechanism of Oil Uptake During Deep-Fat Frying and the Surfactant Effect-Theory and Myth, Advances in Colloid and Interface Science, 2006, 128-130, 267-272. (5) OUCHON, P.B. and PYLE, D.L., Studying Oil Absorption in Restructured Potato Chips Doi:10.1111/J.1365-2621.2004.Tb13363.X, Journal of Food Science, 2004, 69, FEP115-FEP122. (6) Aguilera, J.M. and Gloria-Hernandez, H., Oil Absorption During Frying of Frozen Parfried Potatoes Doi:10.1111/J.1365-2621.2000.Tb16031.X, Journal of Food Science, 2000, 65, 476-479.
ANEXOS
Anexo A 211
Anexo B 219
Anexo C 227
Anexo D 231
Anexo E 239
Anexo F 243
Anexo G 245
Anexo H 249
Anexo I 257
Anexo J 263
Anexo K 265
Anexo L 271
- 211 -
EP1910257 - Método para obtenção de um concentrado
natural rico em Hidroxitirosol a partir de resíduos da
produção de azeite, utilizando tecnologias limpas. M. DE MAGALHAES NUNES DA PONTE, JOSÉ LUIS CARDADOR DOS SANTOS, ANA
ALEXANDRA FIGUEIREDO MATIAS, ANA VITAL MORGADO MARQUES NUNES, CATARINA
MARIA MARTINS DUARTE, JOÃO PAULO SEREJO GOULÃO CRESPO.
A principal vantagem e novidade da invenção consiste na utilização integrada
de tecnologias limpas para recuperar selectivamente um ou mais dos solutos
com potencial bioactivo presentes nos resíduos dos processos de produção
do azeite.
Consideram-se resíduos da produção de azeite: i) as águas vegetativas e o
resíduo sólido provenientes de lagares que utilizam o processo de três fases
ii) o resíduo semi-sólido proveniente de lagares que utilizam o processo de
duas fases iii) caroços de azeitona e folhas de oliveira.
A Figura A1 mostra um diagrama de uma unidade que inclui a integração dos
seguintes processos: extracção com solventes biocompatíveis,
Anexo A
Anexos
- 212 -
fraccionamento com fluidos supercríticos e/ou utilização de tecnologia de
membranas. Para que o processo seja eficaz e a recuperação do(s) soluto(s)
desejado(s) ocorra com rendimentos elevados e de forma selectiva, é
necessário definir o conjunto: combinação de solventes biocompatíveis mais
adequada na extracção/ membranas de nanofiltração e osmose inversa a
utilizar/ condições óptimas de operação das instalações de membranas e de
extracção supercrítica. Só com esta abordagem integrada é possível realizar
o processo de concentração do(s) soluto(s) desejado(s) com a selectividade
desejada, de forma quantitativa, e com bons desempenhos de permeação /
extracção.
Um solvente encontra-se no estado supercrítico quando está acima da sua
temperatura e pressão crítica. Acima deste ponto, o equilíbrio líquido-vapor
deixa de existir, surgindo uma única fase, fluida e densa. As propriedades
destes fluidos assumem valores que se aproximam dos valores dos líquidos
no que se refere à densidade, e dos valores dos gases no que se refere à
viscosidade e difusividade. Para além disso, a possibilidade de alterar o
poder solvente com pequenas alterações de temperatura e pressão, tornam a
utilização deste tipo de fluidos muito interessante no que respeita à sua
capacidade de fraccionamento de extractos.
A extracção de líquidos com fluidos supercríticos é efectuada numa coluna de
separação que permite o contacto entre o fluido supercrítico e a matriz
líquida. A mistura líquida é continuamente alimentada no topo da coluna por
meio de uma bomba de líquidos, e o fluido supercrítico alimentado na base
da coluna por meio de um compressor. O fluido supercrítico e os compostos
nele dissolvidos que deixam a coluna pelo topo, são separados num ciclone
por expansão até aproximadamente 50 bar, e seguidamente o fluido
supercrítico é reciclado de novo para a coluna. A pressão dentro da coluna é
controlada através de uma válvula pneumática localizada antes do ciclone de
separação. Utilizando esta tecnologia, é possível processar directamente as
águas ruças ou uma solução obtida através de uma pré-extracção a partir de
resíduos da produção de azeite. Esta extracção preliminar deve ser
efectuada utilizando solventes biocompatíveis, tais como água, etanol ou
misturas água/etanol.
De acordo com invenção, o passo de extracção supercrítica é efectuado num
Anexos
- 213 -
intervalo de temperaturas entre os 30 ºC e 200 ºC e a pressões entre 6 MPa
e 40 MPa.
Qualquer fluido ou mistura de fluidos no estado supercrítico ou no estado
líquido sub-crítico pode ser utilizado na execução desta invenção.
Preferencialmente, o fluido comprimido, ou a mistura destes fluidos, deve ser
muito volátil, ou estar num estado gasoso às condições atmosféricas, de
forma a facilitar a sua remoção por expansão e/ou evaporação, após o
processo de extracção ter lugar. Por motivos de segurança, o fluido
comprimido, ou a mistura destes fluidos, deve ainda ser não-tóxico e não-
inflamável e deve poder ser reciclável para uso futuro.
A nanofiltração e a osmose inversa são processos de separação por
membranas em fase líquida, em que a força motriz é definida pela diferença
de pressão transmembranar entre o compartimento da alimentação e o do
permeado. Se as membranas de nanofiltração e osmose inversa forem
correctamente seleccionadas em termos das suas propriedades químicas e
estrutura, é possível criar condições que permitam o transporte do(s)
soluto(s) desejado(s) de forma selectiva e com elevado fluxo de permeação.
Uma instalação típica de nanofiltração ou de osmose inversa é constituída
por um vaso de alimentação, no qual se encontra a solução contendo o(s)
soluto(s) que se pretende(m) recuperar. O conteúdo deste vaso é alimentado
com uma bomba centrífuga ou de deslocamento positivo através de tubagem
adequada ao módulo de nanofiltração ou osmose inversa, o qual é
constituído por um compartimento de alimentação, pela membrana
seleccionada através da qual o(s) soluto(s) desejado(s) permeiam, e pelo
compartimento de permeado. O permeado pode ser encaminhado destas
unidades de forma contínua ou de forma descontínua, por abertura de
válvulas ou por acção de bombas. A corrente de alimentação após contactar
com a membrana pode ou não ser reintroduzida através de linhas de
recirculação no vaso de alimentação.
A corrente de alimentação consiste numa solução aquosa ou hidroalcoólica
proveniente do processamento de resíduos do processo de produção de
azeite.
Os solutos que se pretendem recuperar compreendem compostos com
potencial bioactivo.
Anexos
- 214 -
A corrente de alimentação deverá estar preferencialmente a uma temperatura
inferior a 150 ºC, no caso de se usarem membranas poliméricas sensíveis a
temperaturas elevadas, mas poderá ser processada a temperaturas
superiores no caso de se utilizarem membranas termicamente estáveis a
temperaturas elevadas.
As membranas de nanofiltração e osmose inversa a utilizar deverão constituir
uma barreira selectiva, de forma a evitar a permeação de qualquer
constituinte da alimentação que não seja desejado, e deverão permitir a
permeação selectiva dos diferentes solutos com potencial bioactivo presentes
na alimentação inicial. As suas características devem permitir que os solutos
que se pretendem recuperar tenham um fluxo de permeação elevado e que
os solutos que não se pretendam recuperar tenham um fluxo de permeação
baixo.
As membranas a utilizar poderão ser constituídas por diferentes tipos de
materiais, podendo ser de natureza polimérica ou inorgânica. Podem
igualmente incluir simultaneamente materiais poliméricos e materiais
inorgânicos. Em relação à sua estrutura, podem ser homogéneas ou
assimétricas, e podem igualmente ser compósitas, apresentando nesse caso
diferentes camadas constituídas por diferentes materiais e/ou com estruturas
morfológicas diferentes. Cada uma destas camadas pode ter uma espessura
própria e diferente das outras camadas integrantes da membrana.
As membranas podem ter geometria plana ou tubular e podem estar
inseridas em diferentes tipos de módulos, nomeadamente, módulos planos,
módulos espirais, módulos de membranas tubulares, módulos de fibras
capilares e módulos de fibras ocas.
A corrente de alimentação a processar pode ser alimentada aos módulos de
membrana de forma contínua, semi-contínua, ou descontínua. O módulo de
membranas pode estar submerso no tanque de alimentação, ou tanque
reaccional, ou pode ser externo a este. Podem ser utilizados um ou mais
módulos dispostos em série ou em paralelo. As membranas usadas em cada
módulo podem ser iguais ou diferentes na sua natureza e a configuração do
diferentes módulos pode ser idêntica ou diferente.
Em termos da sua natureza química, as membranas podem apresentar um
carácter denominado hidrofóbico quando são permeáveis a espécies
Anexos
- 215 -
químicas com carácter hidrofóbico, ou seja, espécies químicas que em
solução aquosa apresentam um coeficiente de actividade a diluição infinita
superior a 1. As membranas a utilizar podem igualmente apresentar um
carácter denominado hidrofílico, quando são mais permeáveis a água do que
a compostos orgânicos.
O valor da pressão no compartimento da alimentação que garante o
transporte do(s) soluto(s) desejado(s) através das membranas de
nanofiltração e osmose inversa, pode ser ajustado de forma a garantir uma
força motriz adequada para obtenção do(s) fluxo(s) desejado(s) do(s)
soluto(s) que se pretende(m) recuperar. Este valor de pressão absoluta deve
preferencialmente situar-se entre os 5 e os 20 bar, para o caso da
nanofiltração, e entre os 50 e 80 bar, para o caso da osmose inversa.
O concentrado rico em hidroxitirosol (G e L) a que se refere esta invenção,
apresenta uma fracção em massa neste composto que pode variar de pelo
menos 15% até 98%, preferencialmente e pode também conter outros
compostos bioactivos que em conjunto com o hidroxitirosol apresentem
efeitos sinérgicos, aumentando a actividade biológica do extracto.
O concentrado obtido pelos métodos ou combinação de métodos descritos
anteriormente, pode ser utilizado numa variedade de aplicações. De entre
essas aplicações podem-se referir: a) terapêutica/quimiopreventivo com
aplicação na indústria farmacêutica e cosmética, devido às suas
propriedades antioxidantes; b) Anti-microbiano (anti-bacteriano e anti-fúngico)
com aplicações na indústria alimentar para aumento do tempo de vida do
produto, na agricultura como controlo de pragas e como terapêutico no
combate a infecções.
O concentrado obtido pode ser utilizado na forma de líquido, de sólido e de
emulsão. Quando se refere líquido, fala-se de uma solução aquosa, esta
pode ou não ser liofilizada ou atomizada, dando origem a um sólido. Podem
ser elaboradas formulações específicas com excipientes bio-aceitáveis e
matrizes lipídicas, a fim de proteger a bioactividade associada ao composto
mais activo, o hidroxitirosol.
Alternativamente, o concentrado pode ser utilizado sob a forma de emulsão
tornando a sua aplicação na indústria alimentar mais facilitada. Podem ser
obtidas formulações distintas com emulsionantes e surfactantes. Os
Anexos
- 216 -
emulsionantes podem ser ésteres de poliglicerol de ácidos gordos, ésteres de
glicerois de ácidos gordos, lecitina ou combinações destes. As formulações
podem ter uma fracção em volume de hidroxitirosol de 5 a 60%, mas
preferencialmente entre 30 a 55 %. Às formulações pode-se ou não adicionar
ácido cítrico para estabilizar a emulsão.
Figura A1 Diagrama representativo da integração de processos descrita na invenção. extracção
com água ou solventes biocompatíveis das lamas e resíduos do processo de produção de azeite
(A). Possivel adição de águas ruças do processo de produção de azeite (C) ao processo.
Centrifugação (D) da mistura resultante. O passo de separação por membranas é constituído
pela nanofiltração (E) e osmose inversa (F). Corrente rica em hidroxitirosol (G), e água (H) que
poderá ser reutilizada no processo. Coluna de extracção supercrítica (I) e osmose inversa (J). 2ª
Corrente rica em hidroxitirosol (L), e água (M), que poderá ser também reutilizada no processo.
Na figura A2, apresenta-se o perfil cromatográfico de uma possível
alimentação e consequente extracto final obtido por etapas do processo
integrado em cima descrito.
Figura A2 Perfil cromatográfico após análise por HPLC-DAD de Águas Ruças provenientes de
processo descontínuo de prensas (Vermelho) e de extracto bioactivo obtido após processo
integrado descrito (Azul).
Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
1400Detector 1-280nmOUT1004OUT1004006.dat
Detector 1-280nmOUT1004out1004007.dat
Hidroxitirosol
Anexos
- 217 -
A nível de processo industrial existem já algumas patentes com processos
relevantes para a recuperação dos compostos fenólicos a partir dos
resíduos/subprodutos da extracção de azeite, mas sendo poucos os
processos que recorrem só à utilização de tecnologias ou solventes
considerados limpos. Existe uma patente que descreve um método para a
recuperação de compostos antioxidantes a partir de derivados da azeitona
recorrendo a uma coluna de adsorção, por forma a reter os compostos com
interesse e eluição da coluna com um solvente orgânico. (1) Por sua vez, em Espanha foi desenvolvido um método para obter
hidroxitirosol através de um tratamento cromatográfico, e eluição com
metanol ou com misturas água/etanol. (2) Nos EUA desenvolveram um
método para obtenção de uma composição rica em hidroxitirosol a partir de
águas ruças, que consiste na extracção contínua desta matriz com um fluido
supercrítico através de um módulo de leito poroso de polipropileno (método
patenteado - Porocrit). (3)
Referências (1) JOHN;, C. and B, R.A., US 6,361,803, Antioxidant Compositions Extracted from a Wastewater from Olive Oil Production, 2002. (2) JUAN;, F.-B.G., HEREDIA;, M.A., RODRIGUEZ;, G.G., RODRIGUEZ;, A.R., JIMENEZ;, A.A. and GUILLEN, B.R., US2004102657, Method for Obtaining Purified Hydroxytyrosol from Products and by-Products Derived from the Olive Tree, 2004. (3) ROBERTO, C., WO0218310, Method of Obtaining a Hydroxytyrosol-Rich Composition from Vegetation Water, 2002.
- 219 -
Protocolos de Análise relativos a Óleos Alimentares
Teste de Rancimat
O método de rancimat baseia-se na determinação automática do tempo
necessário (Tempo de Indução - TI) para se atingir a fase exponencial da
oxidação (ponto de mudança na velocidade de reacção), isto é, entrada na
etapa de propagação no mecanismo radicalar de oxidação lipidica. O TI é
determinado pelo aumento da conductividade de água desionizada, na qual
ao longo do tempo de ensaio, vai mergulhando ar quente que transporta
compostos voláteis. Os compostos voláteis transportados pelo ar, resultam
da sua passagem por um recipiente com 3 ± 0,1g de óleo alimentar aquecido
a uma temperatura entre os 110 e 130 ºC. (1)
O ponto máximo de mudança da velocidade da reacção de oxidação é
determinado matematicamente como o máximo da segunda derivada da
conductividade em função do tempo. Nos softwares dos aparelhos de
rancimat este ponto máximo de mudança é calculado através da variação do
declive da função recorrendo a um algoritmo (Figura B1). (2)
Anexo B
Anexos
- 220 -
Nestes ensaios, utilizou-se um aparelho Rancimat 679 (Metrohm, Suiça),
capaz de operar num intervalo de temperaturas de 50-220 ºC. O material de
vidro, antes de cada ensaio, foi sempre rigorosamente lavado de forma a
evitar qualquer tipo de contaminação que pudesse catalisar a peroxidação.
O material é fervido numa solução de isopropanol:água (90:10) com cerca de
1% de hidróxido de potássio, durante 1h, sendo de seguida lavado em água a
90 ºC e passado por água destilada e colocado na estufa até completa
secagem. Os electrodos são também lavados numa solução com detergente
e de seguida passados por abundante água destilada.
Figura B1 Exemplo da aquisição de dados efectuada pelo aparelho Rancimat e respectivas
curvas de conductividade em função do tempo.
O aparelho Rancimat 679 é diversas vezes validado com diferentes tipos de
óleos, sendo o erro associado a este método inferior a 3%.
Protocolo Determinação de Índice de Peróxidos (3) (máx. 2 mEqO2/kg)
Reagentes
• Solução de Ácido Acético/Iso octano 3:2
Anexos
- 221 -
• Solução de Iodeto de Potássio saturada e preparada diariamente,
isenta de iodo e iodatos
• Solução de tiossulfato de sódio 0,01 mol/L
• Solução de amido 5 g/L (0,5%)
Juntar 1 g de amido num pouco de água destilada fria. Juntar esta
mistura a 200 mL de água fervente. Como conservante juntar 250 mg
de ácido salicilico e ferver durante 3 min. Retirar do calor e arrefecer
rapidamente. Guardar a 4 ºC.
Tomas de Ensaio
Como o índice de peróxido previsto é no máximo 2 mEqO2/kg a toma de
ensaio são 5 ± 0,1 g
Procedimento
Passar o balão cónico por uma corrente de azoto.
Pesar a toma directamente no balão cónico.
Adicionar 50 mL da solução ácido acético/iso octano e fechar.
Agitar o frasco até a mistura estar dissolvida.
Juntar com pipeta volumétrica 0,5 mL de solução saturada de Iodeto de
Potássio e fechar de novo o frasco.
A solução fica 1 min no escuro a reagir.
Juntar 30 mL de água destilada.
2 ou 3 gotas de amido a 0,5% - assim que se adiciona o amido a solução fica
turva e cinzenta.
Titular a solução com tiossulfato de sódio, adicionando gradualmente e com
agitação constante
Anexos
- 222 -
Cálculos
O índice de peróxido, P, expresso em mmolO2/kgóleo é calculado pela seguinte
equação (Eq B1):
P = ( )
mcVV
⋅⋅−
21000 0 (Eq. B1)
V = Volume consumido na titulação de tiossulfato de sódio expresso em mL
V0 = Volume consumido na titulação de tiossulfato de sódio no ensaio em
branco expresso em mL
C = concentração de tiossulfato de sódio em mol/L
M = massa em g da toma do ensaio
Protocolo Determinação de Acidez (máx. 0,2% Ácido Oleico) Reagentes
• Éter Etílico/Etanol 95% (v/v)
A solução tem de ser neutralizada com KOH em presença de 0,3mL de
solução de fenolftaleína.
• Solução etanólica de KOH – 0,1 M – guardada em frasco âmbar
• Solução de fenolftaleína 1% (10 g/L em Etanol)
Tomas de Ensaio
Como o índice de acidez previsto é no máximo 0,2 % ácido oleico, a toma de
ensaio são 20 ± 0,1 g.
Anexos
- 223 -
Procedimento
Dissolve-se a toma de ensaio em 100 mL de solução Éter/Etanol previamente
neutralizada,
Titula-se com agitação, com a solução de KOH até à viragem do indicador
(coloração carmim da fenolftaleína persistente pelo menos por 10 s)
Cálculos
A acidez expressa em % em massa de ácido oleico determina-se através da
equação (Eq.B2):
% acidez = ( )
mMcV
⋅××
10 (Eq B2)
V = Volume consumido na titulação de KOH expresso em mL
C = concentração de KOH expresso em mol/L
M = massa molar (g/mol) do ácido adoptado como referência (ácido oleico)
M = massa em g da toma do ensaio
Protocolo Determinação de Índice de p-Anisidina(4)
Reagentes
• Sulfato de Sódio anidro
• 2,2,4-Trimetilpentano (iso-octano)
• p-anisidina
(armazenar a p-anisidina num frasco escuro entre 0 e 4 ºC no escuro)
• Ácido acético glacial
Anexos
- 224 -
Procedimento
Solução de Ensaio
A dimensão da toma de ensaio depende da sua qualidade e das
características do espectrofotómetro usado, devendo-se encontrar no
intervalo de 0,4 a 4 g. As tomas realizadas no âmbito destes ensaios foram
de 0,5 ± 0,01 g, pesadas directamente para um balão volumétrico de 25 mL e
dissolvidas em 15 mL de iso-octano (solução 1).
Solução de Ensaio antes da Reacção
Transferir 5 mL da solução de ensaio (1) para um tubo de ensaio. Adicionar
1 mL de ácido acético glacial e agitar bem.
Solução de Ensaio após Reacção
Transferir 5 mL da solução de ensaio (1) para um tubo de ensaio. Adicionar
1 mL de da solução de p-anisidina e agitar bem.
Ensaio em branco: 5 mL de iso-octano e 1 mL de p-anisidina agitar bem.
Conservar os tubos no escuro à temperatura ambiente durante 8 min.
Medição Espectrofotométrica
Calibrar o espectrofotómetro com iso-octano.
Determinar a absorvância da Solução de Ensaio após Reacção, da Solução
de Ensaio antes da Reacção e do branco respectivamente contra iso-octano.
As absorvâncias devem-se encontrar numa gama de 0,2 a 0,8, senão repetir
a determinação com uma quantidade menor de toma.
Cálculos
O índice de anisidina (IpA), expresso em g/mL determina-se através da
equação (Eq.B3):
Anexos
- 225 -
IpA = ( )[ ]0212,1100 AAAm
VQ−−⋅⋅
⋅⋅ (Eq B3)
V = Volume no qual se dissolveu a amostra em análise, expresso em mL,
Q = teor da amostra da solução baseado nas unidades em que se expressa o
índice de anisidina, em g/mL (Q=0,01g/mL),
A0 = absorvância da Solução de Ensaio antes da Reacção
A1 = absorvância da Solução de Ensaio após Reacção
A2 = absorvância do ensaio em branco
m = massa em g da toma do ensaio,
Determinação de Compostos Polares – OLEOTEST ©
O Oleo Test é um método fiável, rápido e barato de controlar a qualidade dos
óleos alimentares. Este teste, permite em escassos minutos e de uma forma
extremamente simples, avaliar os óleos alimentares, em termos da presença
e concentração de compostos polares (extremamente nocivos para a saúde
humana).
A fiabilidade do Oleo Test é comprovada continuamente através de
laboratórios independentes e que os testes também têm sido utilizados de
forma regular por entidades oficiais (como a Inspecção Geral de Actividades
Económicas) em acções de fiscalização, até porque mantêm-se inalterados
após utilização, o que permite a sua utilização como prova legal. Os testes
Oleo Test são um importante complemento nos sistemas de auto-controlo
das empresas do ramo alimentar (obrigatórios por lei, segundo a
Portaria n.º 1135/95 de 15 de Setembro).
Especificações: Ponto de Fusão 60 ºC Cor Compostos Polares até 5 % Azul Cor Compostos Polares de 6 a 12 % Azul Esverdeado Cor Compostos Polares de 13 a 16 % Verde Escuro Cor Compostos Polares de 17 a 23 % Verde Garrafa Cor Compostos Polares superiores a 24 % Verde Pardo
Anexos
- 226 -
Referências
(1) Farhoosh, R., The Effect of Operational Parameters of the Rancimat Method on the Determination of the Oxidative Stability Measures and Shelf-Life Prediction of Soybean Oil, Journal of the American Oil Chemists Society, 2007, 84, 205-209. (2) AOCS, Sampling and Analysis of Commercial Fats and Oils - Oil Stability Index, Cd 12b-92, (1993). (3) NP, Óleos E Gorduras De Origem Animal E Vegetal. Determinação Do Índice De Peróxido, ISO 3960:1998, (2004). (4) NP, Óleos E Gorduras Animais E Vegetais. Determinação Do Índice De Anisidina., EN ISO 6885, (2002).
- 227 -
Formulação do óleo funcional
1. Extractos Comerciais
Na Tabela I1 encontra-se resumido as características dos extractos
comerciais ricos em HT testados no estudo de formulação do óleo funcional –
Etapa de incorporação.
Tabela C1 Características dos extractos comerciais avaliados Nota: Preço (€/kg) reportam-se a 2005.
2
2
4
3
1
% Hidroxitirosol
(folheto)
2501.2393035Prolivols(Seppic)
2.20
2.89
1.65
1
% Real Hidroxitirosol*
37
8
8
2
% Real Polifenóis
34000
1400
1520
430
Valor Actividade
Antioxidante (mmole TE/g)
350Oleaselect(Indena)
520Hidrox 9%
340Hidrox 6%
160Hidrox 2%
Preço (€/kg)
Produto (Extracto)
2
2
4
3
1
% Hidroxitirosol
(folheto)
2501.2393035Prolivols(Seppic)
2.20
2.89
1.65
1
% Real Hidroxitirosol*
37
8
8
2
% Real Polifenóis
34000
1400
1520
430
Valor Actividade
Antioxidante (mmole TE/g)
350Oleaselect(Indena)
520Hidrox 9%
340Hidrox 6%
160Hidrox 2%
Preço (€/kg)
Produto (Extracto)
Anexo C
Anexos
- 228 -
2. Extracção de Compostos polares dos Óleos Reagentes
- MeOH
- H2O
Método
1. Pesar 2 g de amostra (óleo ou azeite) e colocar dentro de um tubo de 15
ml
2. Efectuar uma extracção com 3 mL de MeOH
3. Agitar no vortex durante 5 min
4. Centrifugação a 5000 rpm durante 30 min
5. Repetir passos 2, 3, e 4
6. Reunião das fases metanólicas: evaporar MeOH até à secura, com
rotavapor
7. Efectuar a retoma com 2 mL de mix MeOH: água (80:20 v/v)
3. Resultados Figura C1 Exemplo de Perfil Cromatográfico obtido por HPLC-DAD a 280nm dos óleos
incorporados com EBH. A) Hidrox 9% na concentração de 0.0035 g/L incorporado directamente
sem preparação prévia de emulsão, B) Hidrox 9% na concentração de 0.003 g/L incorporado
com preparação prévia de uma emulsão concentrada em hidroxitirosol.
Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mA
U
0
50
100
150
200
mAU
0
50
100
150
200Detector 1-280nmmar1405mar1405012.dat
Detector 1-280nmMAR0705MAR0705002.dat
Detector 1-280nmmar1405mar1405013.dat
AB
Anexos
- 229 -
Figura C2 Adição das particulas lipídicas ao óleo de girassol (à esquerda). Várias etapas da
incorporação das PL no óleo (à direita)
- 231 -
Descrição de Métodos Analíticos 1. Método de Folin Ciocalteu- Polifenóis Totais
A quantificação química do total de compostos fenólicos é determinada pelo
método de Folin-Ciocalteu. (1) Este método baseia-se na capacidade dos
compostos fenólicos presentes na amostra reduzirem o reagente de Folin
Ciocalteu em condições básicas.
Assim, 40 μL de amostra (diluída em 1,36 mL de água destilada) é oxidada
com 200 μL do reagente de Folin Ciocalteu, e a reacção é neutralizada com
uma solução saturada de carbonato de cálcio.
A solução é aquecida a 40 ºC durante 30 min e no final deste tempo de
espera mede-se a absorvância da solução resultante a 765 nm, num
espectrofotómetro Thermo Spectronic, Genesys 10uv.
Os resultados finais são expressos em equivalentes em ácido gálico (EAG)/L
extracto. O ácido gálico foi o composto escolhido para a obtenção da recta de
calibração. A recta de calibração é efectuada em cada dia de ensaio.
Anexo D
Anexos
- 232 -
O reagente de Folin foi adquirido à Panreac (Espanha).
2. Método de ORAC – Resgate do Radical ROO
O método baseia-se na capacidade de determinados compostos presentes
nas matrizes em estudo, inibirem a oxidação da fluoresceína (disodium
fluorescein) induzida por radicais peroxilo (ROO ) gerados pelo AAPH (2’,2’-
Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride). (2)
O ensaio consiste na adição de 300 μL de amostra a uma solução de
fluoresceína (1800 μL, 4x10-6 mM) pré-incubada a 37 ºC. Após adição de
AAPH (41.4 g/L, 300 μL) a fluorescência da mistura reactiva é medida a cada
1 min, ao longo de 30 min à temperatura de 37 ºC (λem=515nm,
λex=493 nm). Todas as soluções são preparadas em PBS (75 mM, pH 7.4).
As soluções padrão para a realização de uma curva de calibração são
realizadas com Trolox (0, 1, 5, 12.5, 25 μM). Os resultados finais de ORAC
são calculados através da regressão linear entre os valores de concentração
de Trolox e a área da curva de decaimento da fluoresceína sendo expressos
em equivalentes de Trolox (Capacidade Antioxidante Equivalentes Trolox –
μM CAET).
3. Inibição de Autooxidação Lipidica Induzida (LDL)
A capacidade de inibição da autooxidação induzida da Lipoproteina de baixa
densidade (LDL) é realizada por espectrofotometria através de adaptação do
método de formação de dienos conjugados descrito por Esterbauer et al.(3)
A LDL é adquirida à Calbiochem, sendo isolada de plasma humano. Antes de
se iniciar o ensaio, procede-se à diálise da LDL em colunas PD-10 Dessalting
para remoção do agente quelante. A quantidade de proteína é depois
quantificada recorrendo ao reagente de Bradford (ver 7. Ensaio de
quantificação de proteína).
Anexos
- 233 -
O método consiste na incubação de 0.1 mg/L de proteína com a amostra e
com o agente indutor AAPH (500 μM) a 37 ºC. A absorvância da mistura final
é lida a 234 nm (comprimento de onda a que absorvem os produtos da
oxidação da LDL- dienos conjudados), de 5 em 5 min ao longo de 10horas.
A capacidade de inibição da oxidação da LDL é determinada pelo
prolongamento da fase de latência relativamente ao controlo (LDL+AAPH) e
é expressa em percentagem (%) de inibição, calculada a partir da seguinte
equação (Eq. D1):
% In = [(tc-tam)/tc]x100 (Eq. D1)
Onde,
tc- tempo de latência do controlo
tam-tempo de latência com amostra
Note-se que uma das desvantagens deste método é o facto da mistura
testada durante o ensaio ser bastante complexa (LDL+Extractos), pelo que a
forma da fase de latência pode variar de ensaio para ensaio. (4)
4. Método de EPR – Inibição do Radical HO (5)
O método baseia-se na capacidade de determinados compostos presentes
nas matrizes em estudo, inibirem a produção de radicais hidroxilo (HO )
gerados pela reacção de Fenton (Eq. D2) por acção quelante dos metais
envolvidos e/ou resgatarem os radicais HO após estes estarem formados (eq
D3):
Fe2++H2O2 Fe3++OH-+OH (Eq.D2)
OH + RH R + H2O (Eq. D3)
Após a adição de um composto exógeno (DMPO) a esta reacção, este
“prende” os radicais OH , formando-se uma espécie radical mais estável e
detectada por EPR (Electron Spin Ressonance Spectroscopy). A intensidade
Anexos
- 234 -
do sinal obtido (espectro) está relacionada com a quantidade de radicais HO
gerados.
O ensaio consiste na adição das seguintes soluções: 100 μL de H2O2
(10 mM), 100 μL de DMPO (48 mM) e 100 μL de FeSO4 (2 mM). De seguida
adiciona-se 100μL de amostra a analisar ou água (controlo). A amostra é
colocada de imediato na célula plana do aparelho de EPR (Bruker EMX6/1,
1998) e 3 min depois adquire-se o espectro.
A capacidade de inibição da geração/ resgate dos radicais por parte dos
compostos presentes na amostra é avaliada pelo decréscimo/anulação do
espectro do radical. Os valores são expressos em termos de percentagem de
inibição.
5. Método de HORAC – Inibição do Radical HO (6)
O método baseia-se na capacidade de determinados compostos presentes
nas matrizes em estudo, inibirem a oxidação da fluoresceína (FL - disodium
fluorescein) induzida por iões metálicos gerados por uma reacção-tipo Fenton
iniciada por Co(II) (Eq. D4). Esta reacção origina a formação de radicais
hidroxilo, que não são produzidos se o ião metalico não reagir com o
peróxido de hidrogénio. Em primeiro lugar é quantificada a capacidade dos
compostos como quelantes metálicos.
FL + Co(II) + H2O2 FL oxidada + OH (Eq.D4)
Numa placa de 96 poços, adiciona-se 10 μL de amostra (ou PBS) a uma
solução de fluoresceína (180 μL, 4x10-6 mM) pré-incubada a 37 ºC durante
10 min. Após incubação, adicionar 5 μL de H2O2 a cada um dos poços.
Mesmo antes da leitura, e em simultâneo, adiciona-se 5 μL de CoF2 a cada
um dos poços (injector). A fluorescência da mistura reactiva é medida a cada
Anexos
- 235 -
1 min, ao longo de 30 min à temperatura de 37 ºC (λem=515 nm,
λex=493 nm). Todas as soluções são preparadas em PBS (75 mM, pH 7.4).
As soluções padrão para a realização de uma curva de calibração são
realizadas com Ácido Cafeico (0, 1, 5, 12.5, 25 μM). Os resultados finais de
HORAC são calculados através da regressão linear entre os valores de
concentração de Ácido Cafeico e a área da curva de decaímento da
fluoresceína sendo expressos em equivalentes de Ácido Cafeico
(Capacidade Antioxidante Equivalentes Ácido Cafeico – μM CAAC).
6. Método de Identificação e Quantificação de Compostos
fenólicos
Os compostos fenólicos foram identificados por HPLC acoplado a um
detector de díodos (Surveyor, Thermo Finnigan, San Jose, C.A., USA). As
separações foram efectuadas a 35 ºC com uma coluna LiChrospher (5 m, d.i.
250 mm×4 mm) RP-18 da Merck com uma pré-coluna com o mesmo
enchimento. O injector de amostras foi mantido a 12 ºC e utilizou-se um loop
de injecção com um volume de 20 μL para efectuar a injecção das amostras.
A fase móvel consiste numa mistura de gradiente do eluente A (ácido
fosfórico 0.1%) com o eluente B (ácido fosfórico–acetonitrilo–água 1:400:595,
v/v/v), com um caudal de 700 μL min-1. O programa do gradiente foi
desenvolvido de acordo com trabalhos prévios realizados no laboratório.(7,8)
O software Chromquest (versão 4.0 – ThermoFinnigan, Surveyor, San Jose,
C.A. USA) foi utilizado na aquisição e tratamento de dados.
Os compostos fenólicos puros utilizados nas misturas padrão (tirosol, ácido
cafeico, ácido p-coumarico, ácido gálico) foram adquiridos na Sigma Aldrich
(Ibérica) e o hidroxitirosol e oleuropeina foram adquiridos à Extrasynthèse
(França).
O Ácido Orto-fosfórico 85%- e Acetonitrilo, solventes utilizados para a
realização de HPLC, foram adquiridos à Panreac (Espanha) e à LabScan
(Irlanda) respectivamente. Na fase móvel foi sempre utilizada água Milli-Q
(Millipore, USA).
Anexos
- 236 -
Foi sempre utilizada uma recta de calibração para a quantificação de
hidroxitirosol, compreendida num intervalo de concentrações de
0,0125 mg/mL a 0,25 mg/mL. O coeficiente de correlação obtido foi de 0,998.
7. Método de Quantificação de Proteína
O método de quantificação de proteina através do método de Bradford(9) é
um método colorimétrico que se baseia no pressuposto de que o máximo de
absorção do Brilliant Blue G-250 quando se liga a proteínas em solução ácida
passa de 465 para 565nm.
A forma aniónica do composto colorado é estabilizada por interacções
hidrofóbicas e iónicas sendo possível observar a mudança de cor da solução.
Adiciona-se 1500 μL de reagente de Bradford (Sigma) a 100 μL de amostra
(ou solução padrão no caso da preparação da recta de calibração com
Albumina - BSA).
Deixa-se a incubar à temperatura ambiente durante 15 min e de seguida lê-
se a absorvância a 565 nm num espectrofotómetro Thermo Spectronic,
Genesys 10uv.
Os resultados finais são expressos em mg de albumina/L (mgBSA)/L. A
albumina é a proteína escolhida para a obtenção da recta de calibração. A
recta de calibração é efectuada em cada dia de ensaio.
Anexos
- 237 -
8. Resumo de Resultados Tabela D1 Caracterização Química dos Extractos Bioactivos - Resumo dos resultados obtidos.
ORAC (x 104 uM CAET)
DP (x104)HORAC (x104 uM CAAC)
DP (x104) EPR DP LDL DP
EBS 5,10 0,79 1,18 0,08 40,99 1,71 50,02 1,20RSEV 4,65 0,58 1,44 0,03 18,62 4,41 56,30 2,20EBH 4,07 0,29 - - 45,80 3,10 58,65 4,08
HT 650uM 0,21 0,00 - - 21,00 1,41 65,38 2,10
Folin (x103
mgEAG/L)DP(x103) HT
(ppm)DP Tir
(ppm)DP Proteina
(mg BSA/L)DP
EBS 1,49 0,01 1,18 0,06 0,51 0,07 0,00 0,00RSEV 1,58 0,01 0,60 0,06 0,22 0,06 620,67 6,97EBH 1,01 0,01 0,35 0,04 0,07 0,05 0,00 0,00
HT 650uM - - - - - - - -
% Inibição
(n≥3), valores apresentados = média dos valores determinados em ensaios independentes. Referências
(1) Singleton, V.L. and Rossi, J.A., Colorimetry of total phenolics with phosphor-molybdicphosphotungstic acid reagents, Am. J. Enol. Vitic., 1965, 16, 144-158. (2) Ou, B., Hampsch-Woodill, M. and Prior, R.L., Development and Validation of an Improved Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay Using Fluorescein as the Fluorescent Probe, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 4619-4626. (3) Esterbauer H, Striegl G, Publ H and M., R., Continuos monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein., Free Radic Res Commun, 1989, 67. (4) Prior, R.L., Wu, X. and Schaich, K., Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements, J Agric Food Chem, 2005, 53, 4290-302. (5) Leonard, S.S., Xia, C., Jiang, B.H., Stinefelt, B., Klandorf, H., Harris, G.K. and Shi, X., Resveratrol scavenges reactive oxygen species and effects radical-induced cellular responses., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 309, 1017-1026. (6) Ou, B., Hampsch-Woodill, M., Flanagan, J., Deemer, E.K., Prior, R.L. and Huang, D., Novel Fluorometric Assay for Hydroxyl Radical Prevention Capacity Using Fluorescein as the Probe, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 2772-2777. (7) M.N. Bravo, S. Silva, A.V. Coelho, L. Vilas Boas and Bronze, M.R., Analysis of phenolic compounds in Muscatel wines produced in Portugal, Analytica Chimica Acta, 2006, 563, 84-92. (8) Silva, S., Matias, A.A. and Nunes, A., Identificação de glicósidos de flavonóis em subprodutos da vinificação por HPLC com diferentes detectores e hifenado com espectrometria de massa., Ciência Téc. Vitiv., 2005, 20, 17-33. (9) Bradford, M., A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-254.
- 239 -
Anexo E
Perfis cromatográficos dos ensaios de “Tratamento da MP
com CO2 “ e “Tratamento da MP com água quente” Figura E1 Perfis Cromatográficos obtidos por HPLC-DAD a 280 nm, dos extractos aquosos do
bagaço seco após tratamentos com água quente. Comparação do perfil cromatográfico nº 1 com
nº4 (50 ºC, 15’ vs 5’) e comparação do perfil cromatográfico nº 2 com nº3 (100 ºC, 5’ vs 15’).
O aumento da temperatura e de tempo de exposição favorece o aumento da concentração de
HT (pico com maior área).
Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mAU
0
100
200
300
400
500 Detector 1-280nmAmostra 1 AMFev2208128.dat
Detector 1-280nmAmostra 2 AMfev2208129.dat
Detector 1-280nmAmostra 3 AMfev2208130.dat
Detector 1-280nmAmostra 4 AMfev2208131.dat
Detector 1-280nmAmostra 5 AMfev2208132.dat
Detector 1-280nmAmostra 6 AMfev2208133.dat
Anexo E
Anexos
- 240 -
Minutes13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350Detector 1-280nmAmostra 1 AMFev2208128.dat
Detector 1-280nmAmostra 2 AMfev2208129.dat
Detector 1-280nmAmostra 3 AMfev2208130.dat
Detector 1-280nmAmostra 4 AMfev2208131.dat
Detector 1-280nmAmostra 5 AMfev2208132.dat
Detector 1-280nmAmostra 6 AMfev2208133.dat
Figura E2 Ampliação dos perfis cromatográficos, no tempo de retenção do HT e tirosol, obtidos
para os extractos aquosos obtidos após submeter bagaço seco a tratamentos com água quente.
Comparação perfil cromatográfico nº 1 com nº4 (50 ºC, 15’ vs 5’) e comparação perfil
cromatográfico nº 2 com nº3 (100 ºC, 5’ vs 15’). Observa-se o aparecimento de um pico ao lado
do pico de retenção do HT, que corresponde ao ácido protocatechuico.
Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mAU
0
100
200
300
400
500 Detector 1-280nmAmostra 7 AMFev2208134.dat
Detector 1-280nmAmostra 8 AMfev2208135.dat
Detector 1-280nmAmostra 9 AMfev2208136.dat
Detector 1-280nmAmostra 10 AMfev2208137.dat
Detector 1-280nmAmostra 11 AMfev2208138.dat
Detector 1-280nmAmostra 12 AMfev2208139.dat
Figura E3 Perfis Cromatográficos obtidos por HPLC-DAD a 280 nm, dos extractos aquosos do
bagaço seco e húmido, após tratamentos com CO2 pressurizado. Comparação do perfil
cromatográfico nº 11 com nº12 (bagaço seco: 1 dia vs 2 dias, respectivamente) e comparação do
perfil cromatográfico nº 9 com nº8 e nº7 (bagaço húmido: 1 dia vs 2 dias vs 3 dias,
respectivamente).
Anexos
- 241 -
Minutes13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350Detector 1-280nmAmostra 7 AMFev2208134.dat
Detector 1-280nmAmostra 8 AMfev2208135.dat
Detector 1-280nmAmostra 9 AMfev2208136.dat
Detector 1-280nmAmostra 10 AMfev2208137.dat
Detector 1-280nmAmostra 11 AMfev2208138.dat
Detector 1-280nmAmostra 12 AMfev2208139.dat
Figura E4 Ampliação dos perfis cromatográficos, no tempo de retenção do HT e tirosol, obtidos
por HPLC-DAD a 280 nm, dos extractos aquosos do bagaço seco e húmido, após tratamentos
com CO2 pressurizado. Comparação do perfil cromatográfico nº 11 com nº12 (bagaço seco: 1 dia
vs 2 dias, respectivamente) e comparação do perfil cromatográfico nº 9 com nº8 e nº7 (bagaço
húmido: 1 dia vs 2 dias vs 3 dias, respectivamente). Observa-se o aparecimento de um pico ao
lado do pico de retenção do HT, que corresponde ao ácido protocatechuico.
Figura E5 Perfis Cromatográficos obtidos por HPLC-DAD a 280 nm, das amostras recolhidas
durante a despressurização do CO2. O CO2 foi despressurizado para uma trap de vidro contendo
etanol. Os perfis cromatográficos comprovam a ausência de compostos fenólicos no CO2.
- 243 -
Perfis Cromatográficos de Extractos Estudados - comparações Figura F1 Perfis Cromatográficos obtidos por HPLC-DAD a 280 nm, para o extracto aquoso de
bagaço húmido obtido após primeira etapa do processo integrado (Vermelho) e para o Extracto
Bioactivo Húmido (EBH) (Azul) obtido no final do processo descrito.
Minutes
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mAU
0
500
1000
1500
2000
mAU
0
500
1000
1500
2000Detector 1-280nmmarço3105março3105003.dat
Detector 1-280nmmar1405mar1405004.dat
Anexo F
Anexos
- 244 -
Figura F2 Perfil Cromatográfico obtido por HPLC-DAD a 280 nm, para o Extracto Bioactivo
Húmido (EBH) e sobreposição de mistura de padrões (vermelho).
- 245 -
Tratamentos da MP com CO2
Os resultados apresentados graficamente no Capitulo 2, encomtram-se
sumarizados na tabela seguinte, Tabela G1.
Tabela G1 – Resultados obtidos para os bagaços húmido e seco após tratamento com CO2
Residuo C Tyr mg/g Tot
C HT mg/g Tot
mgGAE/g média DP
ORAC (umol/g CAET)
DP
BH 1dia 0,091 <0,2 1,885 0,040 24,037 1,097BH 2dia 0,549 <0,2 5,552 0,215 108,421 1,280BH 3dia 0,571 <0,2 5,600 0,152 116,914 1,442BH 7dia 0,606 <0,2 6,000 0,144 122,326 3,691BS 1dia 0,524 1,464 5,455 0,536 149,004 5,143BS 2dia 0,600 1,692 8,602 0,564 160,109 3,564BS 3dia 0,712 1,936 11,738 0,541 182,272 3,694
(n=3), valores apresentados = média dos valores determinados em ensaios
independentes; ( )1
2
−−
= ∑n
xxDP
Anexo G
Anexos
- 246 -
Tratamentos com água subcrítica Os resultados apresentados graficamente no Capitulo 2 encontram-se
sumarizados nas tabelas seguintes, Tabela G2 e Tabela G3.
Tabela G2 – Resultados obtidos para o bagaço húmido após tratamentos com H2O Sub-crítica
T (ºC) t (min) C HT (ppm) Liq DP HT C Tyr
(ppm) Liq DP Tir uM CAET (ORAC)
DP ORAC
mgEAG/L
(Folin)DP Folin
20 0 0,2 0,0 8,0 0,3 2103 98 165 3,4950 5 11,5 0,4 75,0 3,4 17744,0 495 677,8 1,3350 10 3,3 0,2 53,0 3,2 13131,5 12 591,9 2,2250 15 0,0 0,0 17,3 1,2 5859,5 642 259,7 0,22100 5 0,0 0,0 8,0 0,2 14520,2 204 682,7 1,51100 10 0,0 0,0 4,2 0,1 14498,0 641 831,8 2,62100 15 4,5 0,1 26,0 0,5 10644,0 92 794,7 4,26150 15 5,1 0,2 25,7 1,8 11121,5 1470 462,1 0,22
T (ºC) t (min) C HT (mg/g) DP HT C Tyr (mg/g) DP Tir
umol/g CAET
(ORAC)
DP ORAC
mgEAG/g
(Folin)DP Folin
20 0 0,00 0,00 0,11 0,00 27,9 1,30 2,19 0,04650 5 0,15 0,01 1,00 0,04 235,7 6,58 9,00 0,01850 10 0,04 0,00 0,70 0,04 174,5 0,16 7,86 0,02950 15 0,00 0,00 0,23 0,02 77,8 8,53 3,45 0,003100 5 0,00 0,00 0,11 0,00 192,9 2,71 9,07 0,020100 10 0,00 0,00 0,06 0,00 192,6 8,52 11,05 0,035100 15 0,06 0,00 0,35 0,01 141,4 1,22 10,56 0,057150 15 0,07 0,00 0,34 0,02 147,8 19,52 6,14 0,003
Tabela G3 – Resultados obtidos para o bagaço seco após tratamentos com H2O Sub-Crítica
(n=3), valores apresentados = média dos valores determinados em ensaios
independentes; ( )1
2
−−
= ∑n
xxDP
T (ºC) t (min) C HT (ppm) Tot DP HT C Tir
(ppm) Tot DP Tir uM CAET (ORAC) DP ORAC mgEAG/L
(Folin) DP Folin
0 366,0 22,0 131,0 5,2 37251,1 1285,8 1363,8 134,05 516,0 20,6 191,0 4,8 48777,0 509,0 1862,9 36,310 408,9 20,4 185,0 9,3 36625,0 547,3 1569,8 46,815 610,0 18,3 230,0 13,8 57208,0 364,0 2166,0 143,10 366,0 22,0 131,0 5,2 37251,1 1285,8 1363,8 134,05 643,0 25,7 237,0 8,3 50135,0 297,0 2215,8 42,610 559,0 28,0 232,6 4,7 38671,0 591,0 2026,3 16,815 646,0 19,4 247,0 17,3 58790,0 791,0 2394,0 36,3
T (ºC) t (min) C HT (mg/g) DP HT C Tyr
(mg/g) DP Tirumol/g CAET
(ORAC)DP ORAC mgEAG/g
(FOLIN) DP Folin
0 1,46 0,09 0,52 0,02 149,00 5,14 5,46 0,545 2,06 0,08 0,76 0,02 195,11 2,04 7,45 0,1510 1,64 0,08 0,74 0,04 146,50 2,19 6,28 0,1915 2,44 0,07 0,92 0,06 228,83 1,46 8,66 0,570 1,46 0,09 0,52 0,02 149,00 5,14 5,46 0,545 2,57 0,10 0,95 0,03 200,54 1,19 8,86 0,1710 2,24 0,11 0,93 0,02 154,68 2,36 8,11 0,0715 2,58 0,08 0,99 0,07 235,16 3,16 9,58 0,15
50ºC
100ºC
50ºC
100ºC
Anexos
- 247 -
Estimativa da Pressão
T(K) Ln P Pv (mmHg) Pv (atm) Pensaio matriz xH2O323,15 4,53 92,47 0,12 0,10 BH 0,82373,15 6,63 759,94 1,00 0,82 BS 0,80423,15 8,18 3572,26 4,70 3,87
A pressão de equilíbrio, svp , , pode ser lida nas tabelas de equilíbrio de
água líquida + vapor (1) tendo a temperatura como dado de entrada. Ou
também pode ser calculada com a correlação de Antoine(2) apresentada
em baixo na Eq (G1):
CTBAp sv +
−=, ln Eq (G1)
onde:
=] [ , hgmmp sv pressão de vapor de saturação à temperatura ][KT 18,3036A = 3816,44B =
46,13C −= Esta correlação é válida no intervalo:
] [ 1500 , hgmmp sv ≤ [K] 441T[K] 284 ≤≤ Note-se que se aquecermos um líquido é aumentada a energia cinética
média de suas moléculas. As moléculas cuja energia cinética é mais elevada
e que estão próxima da superfície do líquido escaparão e darão lugar a fase
de vapor. Se o líquido está contido num recipiente fechado, algumas
moléculas do vapor seguirão o caminho inverso chocando com a superfície
do líquido e incorporando-se então na fase líquida. É estabelecido um
equilíbrio dinâmico, quando o número de moléculas que escapam do líquido
seja igual (em valor médio) ao número de moléculas que é incorporado no
mesmo. Pode-se dizer então, que se tem um vapor saturado a uma dada
temperatura T e a pressão parcial que exercem as moléculas de vapor a esta
Anexos
- 248 -
temperatura se denomina pressão de vapor Pv. A pressão de vapor de uma
substância depende somente da temperatura e não do volume; isto é, um
recipiente que contém líquido e vapor em equilíbrio a uma temperatura fixa, a
pressão é independente das quantidades relativas de líquido e de vapor
presentes.
Figura G1 Diagrama da variação da densidade da água com o aumento de temperatura e pressão. Referências (1) Moran, M.J. and Shapiro, H.N. (1993) (John Wiley & Sons, I., Ed.). (2) Reid, P. and Sherwood (1977) (Co., M.-H.B., Ed.).
- 249 -
Ensaios com Linhas Celulares – Protocolos & Resultados 1. Actividade Antioxidante Celular Em placas de 96 poços, inoculam-se 1x104 células/poço em meio RPMI 1640
(Gibco) suplementado com 10 % de soro bovino (FBS) e 2 mM L-glutamina
(Gibco) e incubam-se a 37 ºC, numa atmosfera controlada com 5 % CO2.
Quando atingem a confluência, várias diluições de extractos são efectuadas
numa solução salina (HBSS) e incubados com as células por um período de
2 horas.
Após tratamento com as várias diluições dos extractos bioactivos, as células
são tratadas com diacetato de diclorofluoresceína (DCF DA) em HBSS
(0,1 mM). Após 30 minutos de tratamento com DCF DA, as células são
lavadas com HBSS e estimuladas com o indutor de stress - 2 mM peróxido
de tert-butil hidróxido (t-BHP). Depois de um período de 2 horas, o meio é
removido, as células são lavadas e novo HBSS é adicionado a cada poço
(100 μL). A quantificação de espécies reactivas de oxigénio é obtida através
da medição da fluorescência (λem=538 nm, λex=490 nm) ao tempo zero (F0) e
Anexo H
Anexos
- 250 -
após 120 minutos de indução de stress oxidativo (F120min) e calculada de
acordo com a seguinte equação (eq. H1):
0
0120
FFF
Frel−
= (Eq. H1)
Os resultados são expressos em termos de percentagem (%) de inibição de
ROS relativamente ao controlo (células sem tratamento e sujeitas a stress
oxidativo- t-BHP), calculado através da (Eq. H2):
1001% ×⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−=
controlorel
amostrarel
FF
ROSdeInibição (Eq. H2)
2. Distribuição do Ciclo Celular
Preparação do Reagente de FACS
O reagente preparado é uma modificação do reagente de Vindelov e tem a
seguinte composição:
10 mM NaCl (Panreac)
50 mg/L IP (sigma)
1% Triton X-100 (sigma)
100 μg/mL de Ribonuclease A (sigma)
H2O Milli-Q
Anexos
- 251 -
Resultados obtidos por FACS
Figura H1 - Efeitos do extracto EBS (35 μM HT) na distribuição das fases do ciclo celular.
Células HT29 subconfluentes foram expostas a EBS durante 4, 24 e 48 h. As células
EBS 4h
EBS 24h
EBS 48h
EBS 4h
EBS 24h
EBS 48h
Controlo
Anexos
- 252 -
tripsinizadas foram tratadas com uma solução com Iodeto de Propideo e RNase e analisadas por
citometria de fluxo.
Figura H2 - Efeitos do extracto HT 100 μM na distribuição das fases do ciclo celular. Células
HT29 subconfluentes foram expostas a HT durante 4 e 24 h. As células tripsinizadas foram
tratadas com uma solução com Iodeto de Propideo e RNase e analisadas por citometria de fluxo.
HT 24h
HT 4h
HT 24h
HT 4h
Controlo
Anexos
- 253 -
Figura H3 - Efeitos do extracto RSEV (35 μM) na distribuição das fases do ciclo celular. Células
HT29 subconfluentes foram expostas a RSEV durante 4, 24 e 48 h. As células tripsinizadas
foram tratadas com uma solução com Iodeto de Propideo e RNase e analisadas por citometria
de fluxo.
RSEV 24h
RSEV 4h
RSEV 48h
RSEV 24h
RSEV 4h
RSEV 48h
Controlo
Anexos
- 254 -
Figura H4 - Efeitos do extracto EBS (35 µM), RSEV (35 μM) e 100 μM HT na viabilidade celular
das células HT29. As células foram contadas antes de se adicionar o reagente de “FACS”
recorrendo a um hemacitómetro e ao reagente azul tripano.
3. Curvas de crescimento celular Células HT29 – células de adenocarcinoma do colon
Figura H5 – Curva de crescimento para as células HT29 - .INÓCULO: 1x103 célula/poço
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 28 48 72t (hpi)
Núm
ero
Cél
ulas
(x10
6 )
Control EBS 35uM HT 100uM RSEV EBS 70uM
Curva Crescimento - HT29
0,E+00
1,E+05
2,E+05
3,E+05
4,E+05
5,E+05
0 50 100 150 200 250 300 350 400
t (h)
celu
las/
poço
Anexos
- 255 -
Figura H6 – Curva de crescimento para as células HT29 - .INÓCULO: 1x104 célula/poço
Células MKN45 – células de carcinoma do estómago
Figura H7 – Curva de crescimento para as células MKN45 - .INÓCULO: 1x104 célula/poço
Curva Crescimento - HT29
0,E+00
1,E+05
2,E+05
3,E+05
4,E+05
5,E+05
6,E+05
0 50 100 150 200 250 300 350 400tempo (h)
célu
las/
poço
Curva de Crescimento - MKN45
1,E+04
6,E+04
1,E+05
2,E+05
2,E+05
3,E+05
3,E+05
4,E+05
4,E+05
0 50 100 150 200 250 300 350 400t (h)
célu
las/
poço
- 257 -
Resultados Obtidos Capítulo 3 – Óleos Funcionais FUNCIONALIZAÇÃO DE ÓLEO DE GIRASSOL ATRAVÉS DA ADIÇÃO DE PARTÍCULAS BIOACTIVAS Parte I Tabela I1
<3%
Rancimat STDEV Factor F Acidez Inicial STDEV Acidez após 20 dias STDEV
Girassol 4,1 0,082 0,03 0,0009 0,05 0,0015PLA 4,38 0,0876 1,07 0,03 0,0009 0,04 0,0012PLB 4,4 0,088 1,07 0,03 0,0009 0,04 0,0012PLC 4,73 0,0946 1,15 0,03 0,0009 0,03 0,0009PLD 4,58 0,0916 1,12 0,03 0,0009 0,03 0,0009PLE 5,1 0,102 1,24 0,03 0,0009 0,03 0,0009PLF 4,7 0,094 1,15 0,03 0,0009 0,03 0,0009
PL Controlo 4,34 0,0868 0,99 0,03 0,0009 0,04 0,0012<6%
Acidez após 30 dias STDEV Peroxidos STDEV Peroxidos
após 30 dias STDEV
Girassol 0,08 0,0024 1,2 0,072 3,8 0,228PLA 0,07 0,0021 1,1 0,066 3,4 0,204PLB 0,07 0,0021 1,23 0,0738 3,3 0,198PLC 0,03 0,0009 1,18 0,0708 3,15 0,189PLD 0,05 0,0015 1,3 0,078 3,1 0,186PLE 0,03 0,0009 1,23 0,0738 2,9 0,174PLF 0,03 0,0009 1,1 0,066 2,68 0,1608
PL Controlo 0,06 0,0018 1,2 0,072 3,6 0,216
Anexo I
Anexos
- 258 -
Parte II Tabela I2
Protocolo Simulação de Fritura em laboratório
O processo de simulação de fritura consiste em adicionar a 20 g de óleo 1g
de silica gel (MNkieselgel 60, Machenery-Nagel) pré-tratada com 10 % de
água e aquecida durante 1 h. A mistura óleo e silica é colocada durante 1 min
num banho de ultrasons para homogeneizar e de seguida é aquecida a
180 ºC durante 4 h.
Figura I1 Processo de simulação de fritura em
laboratório. Cada forma contém uma formulação
distinta de óleo. O banho é aquecido e
termostatizado a 180 ºC ± 1 ºC através de um
controlador de temperatura.
Formulações C HT ppm Rancimat Acidez 0 dias Acidez após 30 dias
Girassol 0 4,265 0,03 0,08A 12 4,45 0,03 0,04B 48 4,7 0,03 0,03C 12 4,65 0,03 0,03D 48 4,75 0,03 0,03
Girassol: Milho (80:20) 0 5,42 0,04 0,07
Girassol: G. Alto Oleico (80:20)
0 5,07 0,03 0,04G/milho A 12 5,52 0,03 0,06G/oleico A 12 5,42 0,03 0,04G/oleico C 12 5,4 0,03 0,04G/milho C 12 5,5 0,03 0,04G/oleico D 48 6,17 0,03 0,03G/milho D 48 5,53 0,03 0,04
Anexos
- 259 -
Tabela I3
Amostra FFA (%ácido Oleico)
Controlo 0,14PLA 0,09PLB 0,09PLC 0,07PLD 0,08PLE 0,07PLF 0,06
Controlo +E900 0,15PLC + E900 0,16PLE + E900 0,08PLF +E900 0,07
Controlo 0,09PLA 0,08PLB 0,06PLC 0,08PLD 0,10PLE 0,06PLF 0,06
Controlo +E900 0,10PLC + E900 0,09PLE + E900 0,07PLF +E900 0,07
Girassol
Milho
Anexos
- 260 -
ESTABILIZAÇÃO DE DUAS FORMULAÇÕES DE ÓLEO ALIMENTAR COM
DIFERENTES INGREDIENTES NATURAIS Óleo Alimentar rico em Omega-3
Tabela I4
Lote Acidez Peroxido TotoxControlo Dia 0 60131 0,04 1,1 14,1
Concentrações p-anisidina Totox
Formulações ppm % Ác. Oleico STDEV mEqO2/kg STDEV
Controlo 0 0,038 0,0060 6,127 0,000 11,9 24,1541500 0,035 0,0007 3,228 0,097 4,14 10,595750 0,042 0,0008 3,269 0,098 5,77 12,309500 0,032 0,0006 3,831 0,115 7,30 13,431250 0,033 0,0007 3,454 0,104 5,60 14,212100 0,034 0,0007 4,296 0,129 6,31 14,90230 0,031 0,0006 4,412 0,132 9,73 18,5517 0,035 0,0007 4,383 0,131 4,70 13,462
3,5 0,030 0,0006 3,821 0,115 5,67 13,3111,4 0,034 0,0007 3,693 0,111 8,22 15,60830 0,036 0,0007 4,196 0,126 8,55 16,9427 0,033 0,0006 3,492 0,105 8,7 14,613
3,5 0,036 0,0007 4,077 0,122 7,41 15,5631,4 0,032 0,0007 4,151 0,125 7,63 17,002
Concentrações Factor FFormulações ppm TI (h) STDEV
Controlo 0 3,87 0,0771500 5,15 0,085 1,331750 5,08 0,085 1,311500 4,49 0,156 1,159250 4,02 0,007 1,039100 3,93 0,071 1,01430 3,805 0,035 0,9837 3,775 0,106 0,975
3,5 3,885 0,021 1,0041,4 3,93 0,000 1,01630 3,95 0,035 1,0197 0,255 0,000
3,5 3,93 0,000 1,0161,4 3,89 0,057 1,005
NCT
NCT
Covi-Ox 70
Rancimat
Covi-Ox 70
PL com Covi-Ox 70
PL com Covi-Ox 70
Acidez PeróxidosDia 25 Dia 25 Dia 25
Anexos
- 261 -
Óleo com DMPS Tabela I5
Lote Acidez Peroxido TotoxControlo Dia 0 60159 0,03 2,01 10,46
Concentrações p-anisidina Totox
Formulações ppm % Ác. Oleico STDEV mgEqO2/kg STDEV mgEqO2/kg STDEV
Controlo 0 0,034 0,0007 2,707 0,081 2,752 0,083 5,051 10,556100 0,055 0,0011 1,953 0,059 2,616 0,078 7,395 12,626500 0,018 0,0004 2,540 0,076 3,149 0,094 6,227 12,525750 0,032 0,0006 2,739 0,082 2,739 0,082 0,790 6,268
1500 0,034 0,0007 2,469 0,074 2,469 0,074 3,340 8,27730 0,029 0,0006 2,576 0,077 2,268 0,068 2,691 7,22750 0,031 0,0006 3,053 0,092 3,363 0,101 3,509 10,236125 0,033 0,0007 2,759 0,083 2,777 0,083 4,249 9,803250 0,038 0,0008 3,015 0,090 3,239 0,097 3,591 10,068100 0,032 0,0006 1,931 0,058 3,909 0,117 2,781 10,599500 0,039 0,0008 2,969 0,089 2,128 0,064 7,283 11,539750 0,041 0,0008 2,480 0,074 2,741 0,082 6,854 12,336
1500 0,045 0,0009 1,916 0,057 2,558 0,077 6,483 11,599
Concentrações Factor FFormulações ppm TI (h) STDEV
Controlo 0 4,485 0,120100 4,49 0,156 1,001500 5,355 0,106 1,194750 5,375 0,106 1,198
1500 5,86 0,127 1,30730 4,2 0,042 0,93650 4,235 0,000 0,944125 4,23 0,120 0,943250 4,55 0,212 1,014100 4,745 0,042 1,058500 5,45 0,007 1,215750 5,775 0,170 1,288
1500 5,9 0,106 1,315
Dia 10
NCT
Covi-Ox 70
Covi-Ox 70 + NC
Rancimat
PeróxidosDia 5 Dia 10Dia 5
Peróxidos
Covi-Ox 70 + NC
Covi-Ox 70
NCT
Acidez
- 263 -
Esquemas Ilustrativos do Capítulo 1 – Parte II Figura J1 Esquema ilustrativo dos fenómenos de transferência que decorrem entre o alimento e
o óleo durante o processo de fritura por imersão. Esquema retirado da apresentação New
Theoretical and Practical Aspects about Frying Process, Gertz et al, 2004. (1)
Anexo J
Anexos
- 264 -
Figura J1 Esquema ilustrativo das diferentes localizações do óleo na microestrutura do alimento
após processo de fritura. Adaptado de Bouchon et al, 2003. (2)
Referências (1) Gertz, C., Optimising the Baking and Frying Process Using Oil-Improving Agents, European Journal of Lipid Science and Technology, 2004, 106, 736-745. (2) OUCHON, P.B., AGUILERA, J.M. and PYLE, D.L., Structure Oil-Absorption Relationships During Deep-Fat Frying Doi:10.1111/J.1365-2621.2003.Tb05793.X, Journal of Food Science, 2003, 68, 2711-2716.
- 265 -
Resultados obtidos no Capítulo 2 – Parte 2 - VARIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FISICO QUÍMICAS
Variação e correlação da Viscosidade em função do grau de saturação para cada óleo testado
Figura K1 A - Correlação obtida entre as viscosidades determinadas para os óleos originais e a
percentagem mássica de ácidos gordos polinsaturados presentes nos diferentes tipos de óleos.
B – Correlação da variação da viscosidade das amostras de óleos após 270 min de aquecimento
com a diminuição do grau de insaturação.
A
B
R2 = 0,9638
0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00
1 11 21 31 41 51 61 71
% PUFAS
μ, c
P
R2 = 0,9674
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
SFA/PUFA
μ, c
P
Anexo K
Anexos
- 266 -
Variação da composição em ácidos gordos com o aquecimento contínuo.
Tabela K1 – Composições em ácidos Gordos dos óleos estudados antes e após (5R) o
aquecimento continuo a 180 ºC durante 270 min.
Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo %C14:0 0,07 C14:0 0,08 C14:0 0.07 C14:0 0.09C15:0 0,02 C15:0 0,02 C15:0 0.02 C15:0 0.02C16:0 10,6 C16:0 11,47 C16:0 6.18 C16:0 7,21C16:1 0,11 C16:1 0,11 C16:1 0,12 C16:1 0,14C17:0 0,09 C17:0 0,1 C17:0 0.04 C17:0 0.04C17:1 0,04 C17:1 0,04 C17:1 0,03 C17:1 0,03C18:0 3,95 C18:0 4,16 C18:0 3.73 C18:0 3,69C18:1 24,39 C18:1 25,51 C18:1 28,49 C18:1 29,41C18:2 53,53 C18:2 52,02 C18:2 60,01 C18:2 58,02C18:3 6,15 C18:3 5,42 C18:3 0,14 C18:3 0,22C20:0 0,35 C20:0 0,35 C20:0 0.24 C20:0 0,23C20:1 0,20 C20:1 0,2 C20:1 0,14 C20:1 0.14C22:0 0,39 C22:0 0,39 C22:0 0.61 C22:0 0,51C22:1 --- C22:1 --- C22:1 --- C22:1 ---C24:0 0,12 C24:0 0,12 C24:0 0.19 C24:0 0,24
isómeros transoleicos 0,02
isómeros transoleicos 0,1
isómeros transoleicos 0,02
isómeros transoleicos 0,05
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,8
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,81
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,15
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,19
59,68 57,44 60,15 58,24
Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo %C14:0 0.07 C14:0 0.08 C14:0 0.07 C14:0 0.08C15:0 0.03 C15:0 0.03 C15:0 0.02 C15:0 0.02C16:0 5.14 C16:0 5,36 C16:0 6.38 C16:0 6.90C16:1 0,28 C16:1 0,31 C16:1 0,13 C16:1 0,13C17:0 0.05 C17:0 0.05 C17:0 0.04 C17:0 0.04C17:1 0,07 C17:1 0,06 C17:1 0,03 C17:1 0,03C18:0 1.69 C18:0 1,74 C18:0 3.74 C18:0 3,92C18:1 62,98 C18:1 63,37 C18:1 28,42 C18:1 29,62C18:2 19,86 C18:2 19,42 C18:2 59,89 C18:2 57,89C18:3 7,81 C18:3 7,25 C18:3 0,14 C18:3 0,16C20:0 0.47 C20:0 0,59 C20:0 0.24 C20:0 0,25C20:1 1,21 C20:1 1,3 C20:1 0,15 C20:1 0,14C22:0 0.25 C22:0 0,3 C22:0 0.57 C22:0 0,61C22:1 --- C22:1 --- C22:1 --- C22:1 ---C24:0 0.09 C24:0 0,13 C24:0 0.19 C24:0 0,21
isómeros transoleicos
0,08
isómeros transoleicos
0,12
isómeros transoleicos
0,02
isómeros transoleicos
0,09
isómeros translinoleicos
+translinolénicos1,19
isómeros translinoleicos
+translinolénicos1,09
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,16
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,21
Girassol 5R
Girassol PLAA 5RColza 5R
Soja 5RSoja original
Colza original
Girassol original
Girassol PLAA Original
Anexos
- 267 -
(Cont.) Tabela K1 – Composições em ácidos Gordos dos óleos estudados antes e após (5R) o
aquecimento continuo a 180 ºC durante 270 min.
Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo %C14:0 0.06 C14:0 0,05 C14:0 0.07 C14:0 0.07C15:0 0.02 C15:0 0.02 C15:0 0.02 C15:0 0.02C16:0 4,94 C16:0 4,93 C16:0 6.21 C16:0 6.90C16:1 0,21 C16:1 0,2 C16:1 0,12 C16:1 0,13C17:0 0.03 C17:0 0.03 C17:0 0.04 C17:0 0.04C17:1 0,04 C17:1 0,04 C17:1 0,03 C17:1 0,03C18:0 2,82 C18:0 2,93 C18:0 3.70 C18:0 3,89C18:1 78,91 C18:1 78,51 C18:1 28,36 C18:1 29,65C18:2 11,55 C18:2 11,83 C18:2 60,15 C18:2 58,11C18:3 0,06 C18:3 0,04 C18:3 0.14 C18:3 0,11C20:0 0,24 C20:0 0,25 C20:0 0.24 C20:0 0,23C20:1 0,23 C20:1 0,22 C20:1 0,15 C20:1 0,13C22:0 0,64 C22:0 0,69 C22:0 0.59 C22:0 0,52C22:1 --- C22:1 --- C22:1 --- C22:1 ---C24:0 0,24 C24:0 0,27 C24:0 0,2 C24:0 0,16
isómeros transoleicos 0,04
isómeros transoleicos 0,17
isómeros transoleicos 0,01
isómeros transoleicos 0,1
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,07
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,07
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,17
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,2
Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo %C14:0 0.07 C14:0 0.07 C14:0 0.07 C14:0 0.08C15:0 0,02 C15:0 0,02 C15:0 0.02 C15:0 0.02C16:0 6,37 C16:0 6,66 C16:0 6.46 C16:0 6,85C16:1 0,13 C16:1 0,12 C16:1 0,13 C16:1 0,13C17:0 0,04 C17:0 0,04 C17:0 0.04 C17:0 0.04C17:1 0,03 C17:1 0,03 C17:1 0,03 C17:1 0,03C18:0 3,7 C18:0 3,96 C18:0 3.70 C18:0 3,88C18:1 28,47 C18:1 30,21 C18:1 28,61 C18:1 29,59C18:2 59,91 C18:2 57,47 C18:2 59,62 C18:2 58,11C18:3 0,13 C18:3 0,12 C18:3 0,13 C18:3 0,12C20:0 0,23 C20:0 0,26 C20:0 0.24 C20:0 0.24C20:1 0,15 C20:1 0,15 C20:1 0,14 C20:1 0,13C22:0 0,57 C22:0 0,66 C22:0 0.61 C22:0 0,58C22:1 --- C22:1 --- C22:1 --- C22:1 ---C24:0 0,19 C24:0 0,23 C24:0 0,21 C24:0 0,2
isómeros transoleicos 0,03
isómeros transoleicos 0,08
isómeros transoleicos 0,02
isómeros transoleicos 0,09
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,16
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,17
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,17
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,2
Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo % Ácido Gordo %C14:0 0.07 C14:0 0.07 C14:0 0.07 C14:0 0.07C15:0 0.02 C15:0 0.02 C15:0 0.02 C15:0 0.02C16:0 6,56 C16:0 6,72 C16:0 6,44 C16:0 6,7C16:1 0,12 C16:1 0,14 C16:1 0,06 C16:1 0,13C17:0 0.04 C17:0 0.04 C17:0 0.04 C17:0 0.04C17:1 0,03 C17:1 0,03 C17:1 0,03 C17:1 0,03C18:0 3,69 C18:0 3,92 C18:0 3,68 C18:0 3,98C18:1 28,54 C18:1 29,5 C18:1 28,47 C18:1 29,69C18:2 59,69 C18:2 58,24 C18:2 59,93 C18:2 57,98C18:3 0,13 C18:3 0,1 C18:3 0,13 C18:3 0,13C20:0 0,23 C20:0 0.24 C20:0 0,24 C20:0 0,26C20:1 0,13 C20:1 0,13 C20:1 0,14 C20:1 0,14C22:0 0,56 C22:0 0,62 C22:0 0,57 C22:0 0,63C22:1 --- C22:1 --- C22:1 --- C22:1 ---C24:0 0,19 C24:0 0,21 C24:0 0,19 C24:0 0,2
isómeros transoleicos 0,02
isómeros transoleicos 0,08
isómeros transoleicos 0,03
isómeros transoleicos 0,11
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,16
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,19
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,16
isómeros translinoleicos
+translinolénicos0,21
Girassol 0,05IN 5R
Girassol AO 5R
Girassol10HT 5R
Girassol GP80 original
Girassol 0,05IN original Girassol 10HT original
Girassol 0,1IN 5RGirassol GP80 5R
Girassol15HT Original Girassol15HT 5RGirassol AO original
Girassol 0,1IN Original
Anexos
- 268 -
Variação dos Compostos Polares Totais em função do tempo de aquecimento Figura K2 Variação dos compostos polares totais, ao longo tempo de aquecimento em contínuo
a 180 ºC, para os diferentes óleos de girassol enriquecidos em concentrados antioxidantes.
Variação da acidez em função do tempo de aquecimento, dos óleos de girassol enriquecidos em concentrados activos antioxidantes Figura K3 Variação do teor em ácidos gordos livres em função do tempo de aquecimento para
os diferentes óleos de girassol enriquecidos em concentrados antioxidantes. A acidez é expressa
em % ácido oleico.
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00t (min)
% T
PM
Girassol + PLAA Girassol +0,05IN Girassol+0,1IN
Girassol+10AQ Girassol+15AQ Girassol+GP80
Girassol
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 50 100 150 200 250 300
t (min)
%FF
A
Girassol Girassol 15HTGirassol 10HT Girassol 0,1INGirassol 0,05IN Girassol PLAAGirassol GP80
Anexos
- 269 -
Medidas de Rancimat
Figura K4 Valores de tempo de indução determinados pelo teste de Rancimat para os óleos
originais (0 min) e após ensaio de aquecimento contínuo (270 min). Factor F = (TIamostra/TI0).
O método de rancimat falha na análise do estado de degradação de um óleo
durante processo de fritura, uma vez que os compostos de baixo peso
molecular se vão volatilizando durante o processo de fritura.
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
Girass
olColz
aSoja
Girass
ol AO
Gir+PLA
A
Gir+GP80
Gir+10
AQ
Gir+15
AQ
Gir+0,0
5IN
Gir+0,1
IN
Originais270min
óleo TI STDEV FGirassol 4,79 0,049 -
Colza 8,69 0,092 -Soja 6,82 0,141 -
Girassol AO 16,65 1,061 -Gir+PLAA 4,58 0,070 0,96Gir+GP80 4,88 0,071 1,02Gir+10AQ 5,15 0,240 1,08Gir+15AQ 5,56 0,014 1,16Gir+0,05IN 5,21 0,057 1,09Gir+0,1IN 5,48 0,177 1,14Girassol 2,88 0,396 -
Colza 5,73 0,219 -Soja 3,25 0,438 -
Girassol AO 1,45 0,100 -Gir+PLAA 1,67 0,021 0,58Gir+GP80 1,33 0,085 0,46Gir+10AQ 1,37 0,420 0,48Gir+15AQ 1,57 0,350 0,55Gir+0,05IN 1,43 0,320 0,50Gir+0,1IN 1,48 0,210 0,51
o m
in27
0 m
in
Anexos
- 270 -
Medidas de Índice de Peróxidos
Figura K5 Variação do teor em peróxidos determinados para as diferentes recolhas de óleos
alimentares. O índice de peróxidos é expresso em mEqO2/kg de óleo.
Figura K6 Variação do teor em peróxidos determinados para as diferentes recolhas de óleos de
girassol enriquecidos em concentrados antioxidantes. O índice de peróxidos é expresso em
mEqO2/kg de óleo.
Girassol
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
mEq
O2 /k
g
Colza
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
mEq
O2 /k
g
Girassol AO
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mEq
O2 /k
g
Soja
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mE
qO2/
kg
Girassol
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
mEq
O2 /k
g
Colza
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
mEq
O2 /k
g
Girassol AO
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mEq
O2 /k
g
Soja
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mE
qO2/
kg
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mEq
O2 /k
g
Girassol 10HTGirassol 15HTGirassol
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mE
qO2 /
kg
0,1%IN0,05%INGirassol
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
0 2 4 6 8Recolhas
mE
qO2 /
kg
GP80PLAAGirassol
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mEq
O2 /k
g
Girassol 10HTGirassol 15HTGirassol
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
0 2 4 6 8
Recolhas
mE
qO2 /
kg
0,1%IN0,05%INGirassol
0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
0 2 4 6 8Recolhas
mE
qO2 /
kg
GP80PLAAGirassol
- 271 -
Determinação da Gordura Absorvida no Alimento durante processo Fritura
Figura L1 Instalação de extracção por soxhlet utilizada na determinação do teor de gordura nas
batatas (esquerda), recipiente com batata frita guardada antes de preparação para extracção
com n-hexano.
Anexo L
Anexos
- 272 -
Método de determinação do teor de Gordura
O método de determinação do teor de gordura aqui descrito é uma
modificação de um protocolo realizado nos laboratórios da Sovena e do
método da AOCS Ba 3-38.
Material
Balança analítica sensível a 0,001g
Soxhlet de 125 mL
Manta de aquecimento
Condensador de bolas
Balão de fundo redondo de 250 mL
Reguladores de ebulição
Suportes, pinças e nozes
Cartuchos de extracção 26/32
Estufa Eléctrica regulada para 60 ºC
Almofariz de vidro
Reagentes
n-hexano
Procedimento
Pesar balão de fundo redondo com uma precisão de 0,001g;
Pesar entre 4 e 7g de batata;
Esmagar a batata pesada com almofariz e colocar dentro de um cartucho de
extracção previamente seco na estufa e pesado com precisão de 0,001g;
Pesar o cartucho com a batata moída e anotar o peso com uma precisão de
0,001g;
Colocar os cartuchos de extracção no soxhlet já preparado;
Deixar o processo de extracção correr durante 2 h.
Evaporar o solvente;
Anexos
- 273 -
Pesar com uma precisão de 0,001g.
Cálculo do teor de gordura
A determinação da % de teor de gordura é efectuada através da seguinte
expressão (Eq. L1):
100%0
×=MMGordura (Eq. L1)
Sendo,
M = massa de óleo pesada no balão expressa em gramas
M0= peso das batatas colocadas no cartucho de extracção
- 275 -
Nome: Ana Alexandra Figueiredo Matias Local e Data de Nascimento: Lisboa - 09/07/1977
Habilitações Académicas Faculdade de Ciências e Tecnologia (Universidade Nova de Lisboa)
Licenciatura em Engenharia Química 1995-2002
Actividades Anteriores e Situação Actual em Termos Científicos/Profissionais
2005-2008 – Doutoramento – Empresa (BDE), Instituto Tecnologia
Química e Biológica (Laboratório de Nutracêuticos e Libertação
Controlada) e Sovena, Produtos Alimentares SA
Curriculum Vitae
CV
- 276 -
2002 - 2005 - Instituto Biologia Experimental e Tecnológica – IBET –
Labora-tório de Nutracêuticos e Libertação Controlada - Oeiras
TÉCNICA DE INVESTIGAÇÃO - Técnica de investigação científica,
inserida no projecto “Antioxidantes Naturais” financiado pelo
projecto Europeu Prime. O projecto exigia uma estreita
colaboração entre a instituição académica e a indústria.
Linguas
Inglês – Bom (falado, escrito e leitura) (Frequência do curso
avançado de inglês no Wall Street Institute)
Espanhol – Bom (Falado e Leitura)
Médio (Escrito)
Francês – Bom (Leitura)
Médio (Falado e escrito)
Projectos Paralelos
“Olidrox – Antioxidante Natural” – projecto finalista da iniciativa Cohitec
“Turning Technology into Business” 2005. Durante o ano 2006 elaboração
de um Businnes Plan para apresentação a investidores. Desde Fevereiro
2007 encontra-se em fase de angariação de investidor.
CV
- 277 -
Lista de Publicações
Artigos em Revistas Internacionais com Arbitragem Científica
• Ana Teresa Serra, Ana A. Matias, Ana V.M. Nunes, M.C. Leitão,
Dulce Brito, R. Bronze, Sandra Silva, António Pires, M.T. Crespo, M.V.
San Romão, C.M. Duarte, In vitro evaluation of olive- and grape-based
natural extracts as potential preservatives for food, Innovative Food
Science & Emerging Technologies, 9 (3), 2008, 311-319;
• Raquel F. M. Frade, Ana Matias, Luis C. Branco, Carlos A. M. Afonso,
Catarina M. M. Duarte “Effect of ionic liquids on human colon carcinoma
HT-29 and CaCo-2 cell lines”, Green Chem., 2007, 9, 873–877;
• Sandra Silva, Ana A. Matias, Ana V. M. Nunes, Catarina M. M. Duarte,
Ana V. Coelho, M. Rosário Bronze, “Indentification of flavonol glycosides in
winemaking by-products by HPLC with different detectors and hyphenated
with mass spectrometry”, Ciência Téc. Vitiv., 20(1), 17-33, 2005;
• Ana A. Matias, Ana V. M. Nunes, Teresa Casimiro, Catarina M. M.
Duarte, Solubility of coenzyme Q10 in supercritical carbon dioxide,
J.Supercritical Fluids, 2004, 28, 201-206.
Patentes
• M. Nunes da Ponte, Catarina M. M. Duarte, Ana A. Matias, Ana V. M.
Nunes, J. P. Goulão Crespo, J. Santos, Svetlozar Velizarov Patente
103326, INPI, Portugal, 2005;
• M. Nunes da Ponte, Catarina M. M. Duarte, Ana A. Matias, Ana V. M.
Nunes, J. P. Goulão Crespo, J. Santos, METHOD OF OBTAINING A
NATURAL HYDROXYTYROSOL-RICH CONCENTRATE FROM OLIVE
CV
- 278 -
TREE RESIDUES AND SUBPRODUCTS USING CLEAN
TECHNOLOGIES, WO 2007/013032 A2, 2007.
Comunicações em Congressos Científicos
• Serra, A.T., Matias, A. A., Frade, R.F.M.; Bronze, M.R.; Carvalho, A.;
Alves, P.M. e Duarte, C.M.M., Functional Apples?, Functional Foods
Conference, Eulaff Meeting, Maio 2008, Porto, Portugal;
• Matias, A.A.; Serra, A.T.; Frade, R.F.M.; Bronze, M.R.; Alves,P.M. and
Duarte, C.M.M, Valorization of Portuguese agro-food residues – Potential
functional food with activity towards Colon Cancer, Functional Foods
Conference, Eulaff Meeting, Maio 2008, Porto, Portugal;
• C.M.M. Duarte, M. Faustino, A.T. Serra, A.A. Matias, M.R. Bronze, A.R.
Sampaio de Sousa, Processing cherry waste with supercritical fluids to
develop a new promising Nutraceutical, 11th European Meeting on
Supercritical Fluids, Maio 2008, Barcelona;
• A.T.Serra, Ana A. Matias, Raquel F.M. Frade, M. Rosário Bronze, Rui O,
Duarte, Catarina M.M. Duarte, Evaluation of Antioxidant Capacity using
complementary technologies, 4th International Conference on Polyphenols
Applications & Symposium on Functional Drinks and Smart Water, 14-16
Novembro 2007, Malta;
• Ana A. Matias, Ana V. Nunes, J. L. Santos, J.P.Crespo, Catarina M.M.
Duarte, M. Nunes da ponte, A Natural bioactive olive by-products extract,
5th EuroFed Lipid Congress, Setembro 2007, Gotemburgo – Suécia;
• A.R. Sampaio de Sousa, Rodrigo Silva, A.T.Serra, A.V.M.Nunes,
A.Matias, Ana Luísa Simplício, Herminio C. de Sousa, Catarina M.M.
CV
- 279 -
Duarte, Preparation of lipid based delivery systems using supercritical fluid
technology, Pre-sattelite meeting of the 3rd Pharmaceutical Sciences
World Congress (PSWC 2007), Abril 2007 – Amesterdão – Holanda
(comunicação oral);
• A.R. Sampaio de Sousa, Rodrigo Silva, A.T.Serra, A.V.M.Nunes, A. A. Matias, Ana Luísa Simplício, Herminio C. de Sousa, Catarina M.M.
Duarte, Bio-avalability enhancement of chalcone using supercritical CO2,
1st – Iberoamerican Conference on Supercritical Fluids, Abril 2007 –
Iguaçu – Brasil;
• Ana A. Matias, A.R.Sampaio de Sousa, Catarina M.M. Duarte, Improving
oxidative stability of deep-frying sun flower oil by incorporation of bioactive
microparticles, 4th EuroFed Lipid Congress, Outubro 2006, Madrid –
Espanha;
• Ana Teresa Serra, Ana Matias, António Pires, Rosário Bronze, Paula
Alves, Catarina Duarte, DEVELOPMENT OF NUTRACEUTICALS FROM
GRAPES AND CHERRIES WASTES, 3rd International Conference on
Applications in Nutrition and Health e 1st International Symposium on
Antioxidants and Polyphenols: Valorization from Fuits & Vegetable
Wastes, Malta, Outubro 2006;
• Ana Teresa Serra, Ana Matias, António Pires, Rosário Bronze, Catarina
Duarte, DESENVOLVIMENTO DE NUTRACÊUTICOS A PARTIR DE
EXTRACTOS NATURAIS DE CEREJA E UVA, I Encontro de
Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia, Sesimbra, Portugal, Junho 2006;
• Ana Teresa Serra, Ana Matias, Carlos Tiago Cravo, António Pires,
Rosário Bronze, Catarina Duarte, Caracterização de Extractos Bioactivos
de Cereja e Uva, I Encontro de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia,
Sesimbra, Portugal, Junho 2006;
CV
- 280 -
• R. Sampaio de Sousa, Ana A. Matias, Hermínio C. de Sousa, Catarina
M.M. Duarte, Incorporation of hydrophilic compounds in solid lipid particles
using supercritical fluid technology, Particles 2006 – Medical/Biomedical
Diagnostic, Pharmaceutical, and Drug Delivery Applications of Particle
Technology, Orlando – E.U.A. Maio 2006;
• R. Sampaio de Sousa, Ana A. Matias, Catarina M.M. Duarte,
Development of lipid particles using supercritical carbon dioxide, 10th
European Meeting on Supercritical Fluids, Colmar – França, Dezembro
2005 (comunicação oral);
• Ana M. Matias, Ana V. Nunes, Catarina M.M. Duarte, New Nutraceuticals:
New challenges New opportunities, Rothamsted Biomarket 2005,
Rothamsted , Reino Unido, Novembro 2005 (comunicação oral);
• A.A. Matias, A.T. Serra, M. R. Bronze, M.T. Crespo,V. San Romão, C. M.
Duarte, Antimicrobial Activity of two natural extracts recovered from
Industrial Food Residues, INTRADFOOD2005 – Innovations in Traditional
Foods, Valência, Espanha, Outubro de 2005;
• Ana M. Matias, Ana V. M. Nunes, José Santos , Rosário M. Bronze, João
G. Crespo, Catarina M. M. Duarte, Manuel Nunes da Ponte, “Isolation of
natural bioproducts with application on the chemoprevention using clean
technologies”, Conference on Knowledge-based Materials and
Technologies for Sustainable Chemistry, Tallinn, Estonia, 1-5th June 2005;
• Ana V. M. Nunes, Ana M. Matias, Catarina M. M. Duarte, Rosário M.
Bronze, Manuel Nunes da Ponte, “The role of supercritical fluid technology
in the recovery of the main bioactive compounds responsible for
Mediterranean
• diet health benefits” International Symposium on Supercritical Fluids, May
1 - 4, 2005, Rosen Centre Hotel, Orlando, Florida USA;
CV
- 281 -
• Ana V.M. Nunes, Ana M. Matias, Catarina M.M. Duarte, Manuel
Nunes da Ponte, Nutraceutical extraction from plants: supercritical
carbon dioxide fractionation combined with other separation
processes, Seminar in Supercritical clean technologies for food
industries and waste management, Cadiz, Espanha Julho 2004.
(comunicação oral);
• Ana M. Nunes, Ana A. Matias, A. R. Sampaio de Sousa, Rosário Bronze,
Manuel Nunes da Ponte, Catarina M.M. Duarte, Supercritical Fluid
Extraction of Natural Antioxidants from olive by-products by using
Supercritical Mixtures of CO2 and Ethanol, V Brazilian Meeting on
Supercritical Fluids, Florianópolis – Brasil, Abril 2004;
• M.M. Duarte, A.A. Matias, Ana M. Nunes, A. R. Sampaio de Sousa, R.
Ruivo, M.R. Bronze, M. Nunes da Ponte, “ Development of a clean
process for recovery of natural phenolic compounds from wine
byproducts”, V Brazilian Meeting on Supercritical Fluids, Florianópolis –
Brasil, Abril 2004;
• A.M Nunes; A.F.Matias,; M. Nunes da Ponte, M.R. Bronze; C.M.M.
Duarte, Polyphenolic content and antioxidant properties of olive by-product
extracts, 1st International Conference on Polyphenols and Health, Vichy –
France, Novembro 2003;
• A.Raquel S. de Sousa, Ana M. Nunes, Ana F. Matias, M. Nunes da
Ponte, Catarina M.M. Duarte, Solubility in supercritical carbon dioxide of
two antioxidant compounds contained in olive by-products, 6º Encontro
Nacional de Química-Física, CP18, ,Lisboa, Portugal, Setembro 2003;
• Ana A. Matias, Ana V. M. Nunes, Teresa Casimiro, Manuel Nunes da
Ponte, Catarina M.M. Duarte, Supercritical Fluid Technology for
processing CoQ10, a powerful antioxidant, Conferência de Homenagem
ao Profº Jorge Calado, Instituto Superior Técnico, Lisboa, Portugal,
CV
- 282 -
Janeiro 2003;
• C.M.M.Duarte, A.A.Matias, A.V.M.Nunes, M.R.Bronze, H.I. Motta Veiga,
M.Nunes da Ponte, “Separation of antioxidant components from white
grape skin and seeds using compressed carbon dioxide.”, 6th International
Symposium on Supercritical Fluids, Versailles, França, Abril 2003;
• A.V.M.Nunes, A.A.Matias, T.Casimiro, A.Aguiar-Ricardo, M.Nunes da
Ponte, C.M.M.Duarte, “Processing of Coenzyme Q10 using Supercritical
Carbon Dioxide”, 5th International Symposium on Supercritical Fluids,
Bordeaux, França, Abril 2002;
• A.Matias, A.Nunes, T.Casimiro, A.Aguiar-Ricardo, M.Nunes da Ponte,
C.Duarte, Processing of Coenzyme Q10 using Supercritical Carbon
Dioxide, 8th International Chemical Engineering Conference –
CHEMPOR’2001, Aveiro, Portugal, Setembro 2001. (comunicação
oral).
DESENVOLVIMENTO DE ÓLEOS ALIMENTARES FUNCIONAIS
da Ciência à Aplicação
Ana A
lexandra Figueiredo Matias
Ana Alexandra Figueiredo Matias
2008
ISBN: 978-989-20-1283-4
Oeiras _ Julho 2008
Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Engenharia Química pelo Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de Lisboa. Com suporte financeiro da Fundação para a Ciência e Tecnologia e Sovena Consumer Goods SA, através da Bolsa Doutoramento Empresa nº SFRH/BDE/15535/2005.