UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES FÁBIO DOS SANTOS MOURA

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO MOLECULAR PARA QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS EM PRODUTOS

INDUSTRIALIZADOS

Mogi das Cruzes, SP 2010

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES FÁBIO DOS SANTOS MOURA

DESENVOLVIMENTO DE METODO MOLECULAR PARA QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS EM PRODUTOS

INDUSTRIALIZADOS Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação da Universidade de Mogi das Cruzes para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Área de Concentração: Biotecnologia Aplicada a Recursos Naturais e Agronegócios.

Orientador: Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo

Mogi das Cruzes, SP 2010

Um dia você aprende que maturidade tem mais a ver com os tipos

de experiência que se teve e o que você aprendeu com elas, do que com quantos

aniversários você já celebrou.

William Shakespeare

DEDICATÓRIA

- À minha mãe D. Thereza que me ensinou que ser simples é ser verdadeiro.

- Ao meu pai Sr. António que mesmo não vivendo juntos me ensinou que para conquistar é

preciso lutar.

- Aos meus irmãos Sandra, Márcio e Flávio.

- À minha esposa Tatiana C. Moura, por todo incentivo, ajuda, e muita paciência.

- E a minha razão de todos meus esforços a minha filha Lívia Carvalho Moura, por me fazer

um homem mais feliz.

AGRADECIMENTOS

Especialmente:

- À orientação, incentivo, dedicação, confiança e paciência do Prof. Dr. Welington Luiz de

Araújo na elaboração do projeto, além de dar sempre seu apoio e sua amizade.

- À Universidade de Mogi das Cruzes, por intermédio do Núcleo Integrado em Biotecnologia,

pela oportunidade da realização do curso e dos experimentos.

- À equipe do departamento de Microbiologia do Laboratório da Universidade de Mogi das

Cruzes – NIB (Núcleo Integrado em Biotecnologia): Aline Aparecida C. Neves, Almir J.

Ferreira, Ana Marie Carolina Bertini, Bianca Suprizi, Emy Tiyo Mano, Fernanda Alves

Caraviere, Fernanda Storte, Felipe Rezende, Juliana Viana da Silva, Marília Bixilia, Maristela

Ciraulo que foram todos muitos receptivos e que contribuíram de alguma forma para

realização deste trabalho.

- Ao Almir J. Ferreira pela ajuda nos experimentos microbiológicos e moleculares.

- À Manuella Nóbrega Dourado, pela ajuda nos experimentos moleculares.

- Amigos e familiares pela paciência, compreensão, ajuda e apoio valiosos durante este

período de aperfeiçoamento pessoal e profissional;

Obrigado a todos.

RESUMO

Os microrganismos representam uma das mais diversas formas de vida da terra e podem consistir em mais de um milhão de espécies, as quais são contaminantes encontrados no solo ou água ou ar. O ar do ambiente é fonte importante de propagação de microrganismos, e neste aspecto, a matéria particulada (poeira), taxa de ventilação, natureza e grau da atividade exercida pelas pessoas que ocupam um espaço físico são alguns agentes determinantes do grau de contaminação dos produtos. Assim, o controle microbiológico torna–se muito importante para a qualidade final dos produtos industrializados. De acordo com as Boas Práticas de Fabricação, os produtos industrializados devem possuir qualidade, segurança e eficácia, compatível com especificações determinadas por códigos oficiais, visando assegurar seu uso. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método alternativo mais específico e sensível para avaliar a carga microbiana. Para, isso foram utilizados métodos microbiológicos e PCR quantitativo (qPCR), visando estabelecer um protocolo para posterior utilização da técnica na quantificação. Para o desenvolvimento, como modelo foram utilizadas as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus, para realização de uma curva padrão e contaminação das amostras: Água Industrial/Potável, Produto Farmacêutico e um Produto Alimentício. Dessa forma foi possível estabelecer o efeito do produto avaliado sobre a especificidade e sensibilidade do método. Os resultados mostraram que em comparação aos métodos analisados o método molecular apresentou os seguintes resultados: Para os produtos contaminados com o microrganismo S. aureus obtivemos uma recuperação na média das três contaminações de 95,8% para o produto Água industrial/Potável, 91,0% para o produto farmacêutico e 102,2% do produto alimentício. Já para os produtos contaminados com E. coli obtivemos um recuperação 106,8% para Água, 91,1% para o produto farmacêutico e 96,3% para o produto alimentício. Assim sendo, os resultados demonstraram ser possível quantificar DNA bacteriano em amostras de produtos industrializado por meio da técnica de qPCR utilizando uma suspensão com concentração conhecida em UFC padronizada com curva de calibração, seguida de avaliação da carga bacteriana nos produtos industrializados por comparação com a curva de calibração. O que viabiliza a técnica proposta como alternativa para analise microbiológicas em produtos industrializados. Palavras-chave: Carga microbiana, PCR, contaminação, quantificação, rRNA 16S.

ABSTRACT

Microorganisms represent the most diverse life forms and may consist of more than one million species, which some are contaminants found in soil, water or air. The air is the most important source of microorganisms spread, and in this aspect, the particulate matter (dust), ventilation rate, nature and degree of activity performed by persons who occupy a space some agents are determinants degree of contamination of products. It is considered that microbiological contamination of indoor environments has as source the external environment and those generated in their own environment. Thus, microbiological control becomes very important for the final quality of manufactured products. In accordance with Good Manufacturing Practices, industrial goods must have quality, safety and efficiency, compatible with specifications determined by official codes, to ensure its use. Thus, the objective was to develop an alternative method most specific and sensitive to assess the microbial load. For, this we used microbiological methods and quantitative PCR (qPCR), to establish a protocol for further use of the technique in the quantification. For development, were used as model bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus, to perform a standard curve and sample contamination: Industrial Water/Drinking, Pharmaceutical Product and Food Product. Thus it was possible to establish the effect of the product evaluated on the specificity and sensitivity of the method. The results showed that a total of ten samples analyzed by the traditional method was within the limits specified, and three of ten samples were contaminated with three different concentrations, 0.3 x 102, 102 and 1 x 3 x 102 UFC.mL-1 for the product Pharmaceutical and Food and 0.6 x 102, 102 and 2 x 6 x 102 UFC.mL-1 product for Industrial Water / Drinking. According to the specifications Pharmacopeial the maximum microbial count for the food and pharmaceutical products is 1 x 102 UFC.mL-1 and for Drinking Water the maximum 5 x 102 UFC.mL-1. Compared with the molecular methods analyzed showed the following results: For products contaminated with the microorganism S. aureus obtained a recovery of the average of three contamination of 95.8% for industrial products Water / Drinking, 91.0% for the pharmaceutical and 102.2% of the food product. As for the products contaminated with E. coli obtained a recovery to 106.8% Water 91.1% for the pharmaceutical and 96.3% for the food product. Therefore, the results proved possible to quantify bacterial DNA in samples of industrial products by means of qPCR technique using a suspension of known concentration in CFU with standard calibration curve, followed by assessment of bacterial load in manufactured products compared with the curve calibration. What enables the proposed technique as an alternative to microbiological analysis on industrial products.

Keywords: microbial load, PCR, contamination, quantification, rRNA 16S.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Crescimento da bactéria Staphylococcus aureus na concentração 6 x 102 UFC.mL-1 (A) e crescimento de E. coli na concentração 6 x 102 UFC.mL-1(B). As placas foram analisadas após 48 h de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar) . . . . . . . . .36 Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S na suspensão utilizada como curva de calibração contendo a bactéria E. coli. Marcador peso molecular (1 kb) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S na suspensão utilizada como curva de calibração contendo as bactérias E. coli, S. aureus, λ lambda e marcador peso molecular (1 kb). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Figura 4: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S da bactéria S. aureus e controles. Marcador peso molecular (1 kb). . . . . . . . . . . . . 38 Figura 5: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada, Água Industrial/Potável. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 6 x 102 (A), 2 x 102 (B) e 0,6 x 102 (C) UFC.mL-1 de E. coli. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar) . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Figura 6: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada, Água Industrial/Potável. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 6 x 102 (A), 2 x 102 (B) e 0,6 x 102 (C) UFC.mL-1 de S. aureus. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Figura 7: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto alimentício. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de E. coli. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Figura 8: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto alimentício. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de S. aureus. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptc Soy Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Figura 9: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto farmacêutico. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de E. coli. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 Figura 10: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto farmacêutico. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de S. aureus. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Figura 11: Controle negativo realizado nas amostras antes da contaminação; Água Industrial/potável (A), produto alimentício (B) e produto farmacêutico(C). As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar). . . . . 43 Figura 12: Crescimento bacteriano proveniente da suspensão padronizada como curva de calibração utilizada como controle positivo. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 5 x 102 UFC.mL-1 de S. aureus (A) e com 5 x 102 UFC.mL-1 de E. coli (B). As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio de cultura TSA (Triptic Soy Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Figura 13: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S nas amostras industrializadas que foram contaminadas com E. coli e volumes de amplificação variados. Marcador peso molecular (1 kb). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 Figura 14: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S nas amostras industrializadas que foram contaminadas com S. aureus e volumes de amplificação variados. Marcador peso molecular (1 kb). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Figura 15: Curva de calibração de S. aureus, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado para quantificar a carga microbiana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 Figura 16: Curva de calibração de E. coli, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado para quantificar a carga microbiana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Isolado do microrganismo S. aureus, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado como curva padrão para quantificar a carga microbiana. . . . . . . . . . . . .48 Tabela 2: Amostras industrializadas contaminadas com o microrganismo S. aureus, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 Tabela 3: Isolado do microrganismo E. coli, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado como curva padrão para quantificar a carga microbiana. . . . . . . . . . . . .49 Tabela 4: Amostras industrializadas contaminadas com o microrganismo E. coli, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50

SUMÁRIO

1 Introdução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.1 Aspectos Gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2 Métodos tradicionais de contagem bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3 Detecção por método molecular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13

14

18

1.4 Limitações e problemas no uso da PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.5 PCR quantitativo (qPCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.6 RNA ribossômico 16S). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1 Objetivo Geral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Objetivos Específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

29

29

29

3 Método. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.1 Quantificação de microrganismos para obtenção de uma curva de calibração e

contaminação das amostras industrializadas com concentração conhecida. . . . . . . . . .

3.2 Contagem de microrganismos de acordo a farmacopéia Americana e Brasileira

3.3 Extração de DNA genômico total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.4 PCR convencional amplificação e sequenciamento do 16S rRNA. . . . . . . . . . . . .

3.5 Análise por PCR quantitativo (PCR em tempo real). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

30

20

31

33

33

34

4 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4.1 Desenvolvimento da curva de calibração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4.2 PCR realizado para avaliação do limite de detecção nas suspensões utilizadas

como curva de calibração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

4.3 Contaminações das amostras com concentração conhecida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.4 Avaliação do processo de extração do DNA bacteriano de produtos

industrializados contaminados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.5 Avaliação dos resultados do PCR em tempo real. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

5 Discussão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

6 Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

7 Referências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos Gerais

A segurança dos produtos industrializados tem se tornado um item de preocupação tanto

para os consumidores quanto para os órgãos governamentais responsáveis pela saúde publica.

Como consequência, tem aumentando a cobrança sobre as indústrias para manutenção do

padrão de qualidade microbiológica dos produtos industrializados (BARRICHELLO e

ALLIL, 1997).

Para garantir o cumprimento das especificações pré-estabelecidas, ao longo de todo o

fluxo ou processo de produção, é requisito fundamental a boas práticas de manipulação ou

fabricação. Os processos de produção são realizados de acordo as BPM e BPF nacionais e

internacionais que demonstram um melhora significativa para as questões ligadas ao controle

microbiológico, ao treinamento continuado envolvendo todo o pessoal de produção e controle,

com os conceitos básicos de higiene e limpeza e com os estudos de validação dos processos,

sistemas e métodos analíticos. Os limites de aceitação para produtos estão descritos nas

farmacopéias aceitas no país, os quais preconizam ausência de microrganismos patogênicos

em um grama ou mililitro no produto terminado. A Farmacopéia Americana no capítulo 1111

apresenta os principais microrganismos indesejados por forma farmacêutica e via de

administração de produtos não estéreis. Escherichia coli, o Staphylococcus aureus, a

Pseudomonas aeruginosa e espécies de Salmonela, considerados indicadores de

contaminação por microrganismos patogênicos ao homem. Pode ser incluido ainda nesta lista

fungos do gênero Aspergillus (US Pharmacopéia, 2005). Estes microrganismos são da mesma

forma, citados nos outros compêndios oficiais aceitos no Brasil. A obtenção de produtos que

cumpram com as especificações e limites definidos é o objetivo que deve ser alcançado.

Os microrganismos aeróbios mesófilos são todos aqueles capazes de crescerem em

temperatura de 35 – 37ºC em condições de aerobiose. Esses microrganismos indicam a

qualidade sanitária com que os produtos industrializados foram obtidos ou processados.

Um número elevado destes microrganismos indica que o produto está com a sua

qualidade comprometida, mesmo que patógenos estejam ausentes. Portanto, uma alta

contagem destes microrganismos pode significar que houve condições para o crescimento de

14

patógenos (FRANCO e LANDGRAF, 1996) indicando que a qualidade do produto pode estar

comprometida. As análises microbiológicas tradicionais utilizadas no controle de qualidade

dos produtos industrializados foram desenvolvidas a partir do final do século XIX e vêm

sendo utilizadas desde então. São realizadas por semeadura convencional sobre meio de

cultura e a caracterização por meio de kits bioquímicos (VASAVADA et al., 1993).

Em termos laboratoriais, a execução desta técnica é bem simples, consistindo no

plaqueamento de alíquotas da amostra, homogeneizada e diluída, em meio de cultura padrão.

As placas são então, incubadas em condições de tempo e temperaturas adequados, para que

haja o desenvolvimento das colônias que serão enumeradas com o auxílio de contadores

automáticos. Trata-se, no entanto, de um processo bastante susceptível a erros, levando-se em

consideração que: os microrganismos estão arranjados em pares, tétrades, cadeias e cachos

(VASAVADA et al., 1993). Conseqüentemente os números de colônias que aparecem na

placa não correspondem ao número de células individuais presentes; quando muitas diluições

precisam ser plaqueadas podem ocorrer erros; algumas partículas de alimentos podem ser

confundidas com colônias, levando a um falso resultado positivo; o modo de leitura e a

interpretação dos resultados, são muito subjetivos e podem variar de acordo com o analista;

algumas colônias denominadas invasoras se espalham pela placa dificultando a contagem e a

expressão do resultado final. Outras limitações do método estariam relacionadas à fisiologia

das diferentes espécies microbianas nos alimentos, que podem ter seu crescimento limitado

quando são usadas condições padronizadas de temperatura, requerimento de nutrientes e

potencial redox. Visando minimizar estes problemas, surgiram os métodos alternativos que

apresentam a conveniência de produzirem resultados mais rápidos, sensíveis e específicos, se

comparados às técnicas convencionais. Tais métodos também podem oferecer economia de

espaço e materiais, aumentando a produtividade laboratorial. Numerosos métodos alternativos

de contagem em placas estão disponíveis visando melhorar a eficiência desta determinação

(VASAVADA et al., 1993).

1.2 Métodos tradicionais de contagem bacteriana

A Contagem Padrão em Placa ou contagem de aeróbios mesófilos em produtos

industrializados reflete com a qualidade da matéria-prima, bem como as condições de

15

processamento, manuseio e estocagem, permitindo estimar o tempo de prateleira do produto

em questão. Esta análise permite à indústria estabelecer também a quantidade de conservantes

(biocidas) que deve ser adicionada ao produto para que a sua qualidade seja mantida por um

período de tempo maior (VASAVADA et al., 1993).

O crescimento bacteriano pode ser calculado por diferentes técnicas, tais como

Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta das células em um

microscópio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados

cerca de 10 µL da suspensão, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras de contagem. A

contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade

de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes

vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas

células, ou pela formação de agregados celulares (VASAVADA et al., 1993).

Em preparações não coradas, deve-se utilizar microscópio de contraste de fase, o qual

deve ser empregado apenas quando as células não estão muito diluídas (<106 células/mL)

(VASAVADA et al., 1993).

Contagem de viáveis: Procedimento também conhecido como contagem em placa, que

estima o número de células viáveis (isto é, capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta

metodologia envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de

crescimento, as quais são inoculadas em meio sólido ou meio liquefeito. Após incubação,

geralmente por 24 à 48hs, o número de colônias é contado. Como uma colônia normalmente é

originada a partir de uma única célula, o total de colônias que se desenvolvem no meio

corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada. Esta técnica deve

sempre realizada empregando-se várias diluições (102 a 104 células) das amostras. A

contagem de viáveis pode ser feita pela semeadura em superfície ou em profundidade ("pour

plate"), também podem ser usadas membranas filtrantes, onde os líquidos são filtrados e as

membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura. Geralmente o volume a ser

inoculado não deve ultrapassar 1 mL, para evitar a confluência das colônias. Se a técnica de

semeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 mL de células. Esta

técnica é precisa quando o número de colônias (ou placas de lise, no caso de partículas virais)

contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as condições culturais e ambientais estão adequadas

para os microrganismos analisados (US Pharmacopéia, 2005).

Este tipo de contagem está sujeito a erros (formação de duas células próximas,

originando uma colônia) que pode ser minimizado pela realização de duplicatas para cada

16

diluição; o produto a ser analisado pode dificultar a contagem de colônias também

minimizado por diluições; há muitas variações de resultados de analista para analista,

necessidade de diversos meios de cultura; as condições de incubação podem interferir no

crescimento bacteriano; e um tempo maior para avaliação dos resultados, atrasando a

liberação dos produtos. Mesmo com todas essas variáveis esta metodologia é amplamente

utilizada, exibindo sensibilidade para detectar baixos números de células e permitindo

também a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos,

não seletivos e diferenciados (meios que além de favorecerem o desenvolvimento de um tipo

ou grupo de organismo, também permite sua distinção, a partir de alguma característica

fenotípica) (US Pharmacopéia, 2005).

Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso

úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário

determinar o número preciso de microrganismos presentes. A determinação do peso seco é

muito utilizada para a quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e

transferido para um frasco e submetido à secagem. Realizam-se então sucessivas pesagens,

até o momento onde não se observa mais variações. Este procedimento pode também ser

realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então o secando (100 -

150°C/16 horas) e depois o pesando, porem esta metodologia não diferencia células viáveis de

células não viáveis ( US Pharmacopeia, 2005).

Turbidimetria: quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660 nm, uma vez

que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere

com os resultados. Nestes comprimentos de onda, a absorção de luz por componentes

celulares corados é desprezível, mas se necessário, outros comprimentos de onda podem ser

usados. Tal metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise

turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução, não destruindo a amostra.

Entretanto, não permite a determinação de células viáveis (US Pharmacopeia, 2005).

Número Mais Provável (NMP): Amplamente utilizado em laboratórios de

microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificação de microrganismos em água, leite

e outros produtos. Esta metodologia é basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes

totais e coliformes fecais. O grupo dos coliformes totais é o principal indicador utilizado para

avaliar a qualidade microbiológica da água e alimentos. Fazem parte deste grupo,

predominantemente, bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter,

17

Citrobacter e Klebsiella, que têm capacidade de fermentar lactose produzindo ácido e gás

quando incubadas a 35 – 37ºC (FRANCO e LANDGRAF, 1996).

As bactérias pertencentes ao grupo dos coliformes fecais correspondem aos coliformes

totais que continuam fermentando a lactose e com produção de gás quando incubados a 44 –

45,5ºC. Nessas condições, cerca de 90% das culturas de E. coli são positivas, enquanto poucas

cepas de Enterobacter e Klebsiella mantêm estas características. E. coli é o único

microrganismo deste grupo que tem como habitat natural o trato intestinal de humano e sua

presença indica contaminação fecal de produtos. Os demais microrganismos do grupo

coliformes podem estar também em outros ambientes, como vegetais e solo. E sua ocorrência

pode indicar a presença de outros organismos, tais como protozoários e vírus (FRANCO e

LANDGRAF, 1996).

Esta técnica foi desenvolvida após análises estatísticas complexas. A determinação do

NMP é realizada inoculando-se 3 séries de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 mL da água ou do produto

homogeneizado em solução salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos

de Durham invertidos em seu interior. Estes são incubados por 48 hs/37°C sendo então

analisados quanto ao crescimento e à presença de gás no interior dos tubos de Durham. Tal

resultado é considerado positivo para a presença de coliformes totais. Amostras dos tubos

positivos são então repicadas para caldos seletivos para coliforme fecais, também contendo

tubos de Durham, os quais são incubados por mais 24 ou 48 hs a 42°C. Se todos os tubos de

Durham for positivo faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior

identificação bioquímica. De acordo com o número de tubos que apresentam gás determina-se

o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este é um teste apenas

presuntivo para a presença de coliformes (US Pharmacopéia, 2005).

As técnicas microbiológicas tradicionais utilizam meios de cultura de enriquecimento

para amostras contendo baixo número de células, meios seletivos e não seletivos,

complementados por testes bioquímicos. Segundo Farber et al. (2001) os testes bioquímicos

utilizados para identificação e tipagem bacteriana podem apresentar variabilidade devido a

fatores ambientais sobre a expressão gênica, apresentando outras desvantagens, como o baixo

poder discriminatório em microrganismos com pouca variabilidade genética e o risco de

interpretações errôneas, quando se utiliza um número limitado de testes. Estes métodos

tradicionais de detecção de microrganismos, embora confiáveis, requerem vários dias ou

mesmo semanas para que os resultados sejam obtidos (MARIN et al., 2006). Os mesmos

autores ressaltam que as propriedades fenotípicas pelas quais as bactérias são identificadas

18

podem não ser expressas, e os resultados podem ser suscetíveis a variação de interpretação,

além da possibilidade de existência de células viáveis, porém não-cultiváveis. Além disso, os

métodos tradicionais apresentam desvantagens na quantificação dos microrganismos, devido a

não homogeneização das colônias em meio de cultura, o que leva a sobreposição das células;

Estes métodos são mais trabalhosos, visto que utilizam uma grande quantidade de vidrarias e

equipamentos, aumentando a necessidade de espaço para o cultivo em estufas de incubação

(JAY e HALL, 1992) caso queira aumentar a confiabilidade das análises.

Outros problemas podem ocorrer durante o manuseio e o preparo da análise, como por

exemplo, a não higienização correta dos analistas e a desinfecção completa dos materiais,

visto que se deve considerar também a possibilidade de falha na técnica, como a alta

temperatura do Agar fundido utilizado no método tradicional de semeadura por profundidade

(pour plate) e maior risco de contaminação cruzada por apresentar várias etapas no preparo

das amostras a serem analisadas. Outros erros podem ocorrer tais; algumas partículas de

alimentos e/ou produtos podem ser confundido com colônias, levando a um falso resultado

positivo; o modo de leitura e a interpretação dos resultados são muito subjetivos e podem

variar de acordo com o analista; algumas colônias denominadas invasoras se espalham pela

placa dificultando a contagem e a expressão do resultado final (CHAIN e FUNG, 1991).

1.3 Detecção molecular de microrganismos

Nas últimas décadas, verificou-se um aumento significativo no desenvolvimento de

técnicas moleculares para a detecção, identificação e quantificação de bactérias patogênicas.

Avanços nos estudos e biologia molecular propiciaram o desenvolvimento e emprego de

vários métodos moleculares (DESTRO et al., 1995), dentre estes métodos, destacam-se os que

se fundamentam na amplificação de sequências do DNA pela reação em cadeia da DNA

polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR), a qual é extremamente sensível, podendo

detectar uma única molécula de DNA em uma amostra (ALBERTS et al., 1997).

Apesar dos princípios da técnica de PCR terem sido conceitualmente descritos já em

1971 (KLEPPE et al., 1971), os primeiros dados experimentais só foram publicados em

meados dos anos 80 (SAIKI et al., 1985). No início, a abordagem existente era lenta, cara e

imprecisa. A técnica empregava banhos com temperaturas ajustadas e a enzima utilizada na

19

reação era o fragmento obtido a partir da clivagem da DNA polimerase l e Escherichia coli (o

fragmento Klenow), que não apresenta atividade exonucleásica 5’→3’. O uso do fragmento

Klenow (enzima termo sensível) apresentava inúmeras limitações e exigia que a cada ciclo de

desnaturação da dupla fita do DNA alvo, fosse adicionada mais uma alíquota de enzima

(GELFAND, 1989 e SAMBROOK et al., 1989). Essa manipulação para a adição da enzima

proporcionava um trabalho árduo, aumentando o risco de contaminação. Além disso, devido a

sensibilidade térmica da enzima, a técnica apresentava a desvantagem do surgimento de

bandas inespecíficas (MULLIS e FALOONA, 1987). A utilização do fragmento Klenow

permitia que uma molécula específica fosse reproduzida 200.000 vezes, mas apenas um

pequeno percentual deste produto corresponde à sequências alvo (SCHARF et al., 1986),

fazendo-se necessário o uso de sondas específicas em ensaios de hibridação para visualização

do produto específico amplificado (SAIKI et al., 1985 e SAIKI et al., 1986).

No ano de 1988, Saiki e colaboradores descreveram o uso da DNA polimerase extraída

da bactéria termofílica Thermus aquaticus na PCR. O uso da DNA polimerase termoestável

simplificou de forma extrema o procedimento e permitiu que a reação fosse processada em

temperaturas mais altas, já que a temperatura ótima de reação da enzima passou de 37ºC para

72ºC. Com isso, melhorou significativamente a especificidade e aumentou o percentual de

produto amplificado. A utilização da enzima termoestável permitiu a automação do processo,

pois tornou desnecessária a adição de mais enzimas durante o final de cada ciclo, diminuindo

muito a possibilidade de contaminação por ácidos nucléicos exógenos ou amplificação de

outra amostra. Com isso, ao invés de banhos passou-se a utilizar termocicladores automáticos

programáveis (ERLICH, 1991 e INNIS et al., 1988).

A reação da PCR baseia-se em ciclos que se repetem na forma de três etapas:

desnaturação, anelamento e extensão, que ocorrem em um mesmo tubo e em diferentes

temperaturas de incubação, na presença de reagentes termos-estáveis, e sequências específicas

de DNA a serem amplificadas. Os reagentes são: (1) dois pequenos iniciadores (primers),

sintetizados para serem complementares às sequências conhecidas do DNA alvo, (2) grande

quantidade dos quatro desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e

(3) a enzima termoestável Taq DNA-polimerase, isolada da bactéria termofílica Thermus

aquaticus e tampão (EISENSTEIN, 1990).

A fita dupla do DNA alvo é desnaturada por meio da elevação da temperatura para

92/95°C, para quebrar as ligações de hidrogênio que mantêm as fitas unidas. Esta etapa expõe

a fita de DNA, denominada “template” ou molde, à qual se anelará outra fita de DNA que

20

contenha sequência complementar a ela (iniciador). Esta técnica não exige que o DNA esteja

puro, podendo ser detectado em misturas de DNAs ou deste com outras substâncias

(EISENTEIN, 1990; SCHEINERT et al., 2005). Na etapa de anelamento, a temperatura é

rapidamente reduzida para 35/60°C, dependendo essencialmente do tamanho e sequência dos

iniciadores utilizados, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada iniciador com as

sequências complementares que flanqueiam a região alvo.

Os dois iniciadores não podem anelar-se um ao outro e seus sítios de anelamento devem

ser suficientemente distantes um do outro, para permitir a síntese subsequente de novo

produto (EISENSTEIN, 1990). Em seguida, a temperatura é elevada à 72°C para que a

enzima DNA polimerase realize a extensão no sentido 5’- 3’ (TAYLOR, 1993) a uma

velocidade de cerca de 24 nucleotídeos por segundo (SCHEINERT et al., 2005). Este ciclo é

repetido por algumas dezenas de vezes. À medida que os ciclos vão se repetindo, os

iniciadores são consumidos e os números de novas fitas de DNA aumentam (EISENSTEIN,

1990). Esta escala de amplificação permite, portanto, iniciar com quantidades mínimas de

DNA (da ordem de alguns picogramas ou nanogramas) e terminar a reação com grandes

quantidades de DNA especificamente amplificado, resultando em moléculas de DNA com

sequência homóloga ao DNA que serviu de origem (TAYLOR, 1993).

Em relação ao custo, o método molecular é duas a três vezes mais caro do que o método

convencional. Deve-se, no entanto, levar em consideração a relação custo/benefício, visto que

este método molecular permite o processamento de um grande número de amostras em um

período curto de tempo, e tendo em vista a sua especificidade pode ser feito especificamente

para as bactérias ou para grupos específicos.

1.4 Limitações e problemas comuns no uso da PCR

A reação de PCR é caracterizada pela amplificação de sequências específicas do DNA.

Assim, para que a reação ocorra existe a necessidade que as regiões alvo sejam parcial ou

totalmente sequenciadas, para que os iniciadores possam ser sintetizados de modo a flanqueá-

las. Isto limita bastante a expansão da metodologia para estudo de organismos com um

pequeno número de sequências disponíveis. Outro fator importante é o ajuste cuidadoso das

condições ideais de concentração dos componentes da reação, já que não existe um protocolo

21

padrão que possa ser usado, sem ajuste, para todas as amplificações. O número de ciclos, a

concentração de MgCl2, enzimas, quantidade de DNA molde, a temperatura de anelamento e

a concentração dos iniciadores, devem ser cuidadosamente ajustados para cada tipo de reação.

Outro fator fundamental no preparo das reações está relacionado à origem/procedência do

DNA. Deve-se considerar a introdução ou a presença de inibidores da DNA polimerase,

durante o processo de extração do DNA. Entre os inibidores naturais estão substâncias como o

grupo heme da hemoglobina, entre outros inibidores que geralmente são introduzidos no

processo de coleta ou extração do material biológico: fenol e clorofórmio (inibidores da ação

enzimática); proteinase-K (degrada a DNA polimerase); EDTA; heparina (quelantes dos íons

MgCl2) (SAMBROOK et al., 1989).

Um dos problemas da PCR é devido à sua altíssima sensibilidade, que permite a

produção de milhões de cópias de DNA a partir de uma única molécula alvo. Esta alta

sensibilidade torna efetivo o problema de contaminação de reações e a literatura demonstra

grande preocupação com o fato (SARKAR e SOMMER, 1990; ERLICH et al., 1991). Para

minimizar os resultados falsos positivos, procedimentos de operação padrão já foram

descritos, incluindo isolar fisicamente as salas para preparação de reagentes da PCR, das salas

de preparação dos alvos de PCR e seus produtos, usar soluções autoclavadas, preparar e

aliquotar reagentes, usar luvas descartáveis, evitar aerossóis, uso de pipetas descartáveis para

o preparo da reação as quais jamais devem ser utilizadas com material já amplificado,

adicionando o DNA por último, e escolher cuidadosamente controles positivos e negativos

(KWOK e HIGUCHI, 1989).

A melhor abordagem para confrontar resultados dúbios é repetir o experimento

cuidadosamente tendo particular atenção para detalhes e controles. Enquanto controles

negativos podem descartar contaminação de reagentes, o mesmo não acontece com

contaminação esporádica, que pode não ser notada (SAMBROOK et al., 1989). Há três fontes

importantes de DNA contaminante: contaminação do ambiente; contaminação cruzada entre

materiais de múltiplas fontes; e o plasmídio contaminante de um clone recombinante que

contenha a sequência alvo. Das três, a contaminação do ambiente é considerada a principal

fonte de contaminação, por causa da relativa abundância de sequência alvo amplificada. Além

disto, a luz ultravioleta pode reduzir o risco de contaminação de superfícies de trabalho e

reagentes. Já a contaminação cruzada entre amostras é mais difícil de ser diagnosticada. Desta

forma, os resultados suspeitos devem ser repetidos com extração de DNA e PCRs

independentes para as amostras em questão. Contaminação por plasmídios, por outro lado,

22

pode ser identificada por análise da sequência e comparação com todas as sequências de

plasmídio do laboratório (METZKER e CASKEY, 2001). Outro fator importante é a

sequência e o comprimento dos iniciadores para uma amplificação bem sucedida. Os

iniciadores geralmente são sintetizados na faixa de 18-30 bases, que são utilizados na

amplificação de DNA de baixa complexidade. Estes oligonucleotídeos são pequenos demais

para formar híbridos estáveis na temperatura de polimerização (SAMBROOK et al., 1989). Uma alta concentração de iniciadores aumenta a probabilidade de anelamento, gerando

produtos não específicos e dímeros. A falta deste componente interfere na amplificação. Desta

forma, a concentração dos iniciadores deve estar usualmente em torno de 0,1-1,0 pmol.µL-1 de

reação (SCHEINERT et al., 2005).

A especificidade da amplificação depende principalmente das condições empregadas na

etapa de anelamento, como esta etapa envolve hibridação de oligonucleotídeos, a otimização

desta temperatura representa um fator essencial para o sucesso do processo. Baixas

temperaturas de anelamento aumentam a probabilidade de ocorrência de hibridizações

inespecíficas, resultando na amplificação de diferentes regiões do DNA. Por outro lado,

embora temperaturas muito altas propiciem um grande aumento na especificidade, ocorre um

sensível decréscimo do rendimento, a temperatura ótima de anelamento localiza-se em um

ponto intermediário (RYCHLIK et al., 1990). A temperatura de anelamento é crítica para

amplificação de fragmentos longos de DNA ou ainda, quando o DNA genômico é utilizado

como substrato da reação. Uma hot start PCR aumenta ainda mais a especificidade

prevenindo a formação de produtos não específicos nos ciclos iniciais.

A clonagem de segmentos inteiros de produtos de PCR é problemática, pois as

mutações induzidas pela PCR podem causar substituições de nucleotídeos em relação à

sequência original. Assim, esforços significativos vêm sendo empregados no sequenciamento

completo de múltiplos clones de PCR para identificar clones livres de mutações ou clones que

possuam mutações que não alterem a sequência da proteína codificada. Para a maioria das

aplicações, as condições padrão de PCR podem seguramente amplificar alvos acima de 3-4kb

de uma variedade de materiais. A amplificação de alvos maiores que 5kb, entretanto, é

descrita na literatura usando condições convencionais de PCR, mas geralmente rendem

quantidades menores de produto de PCR. O limite do tamanho da PCR pode ser atribuído a

problemas de má incorporação de nucleotídeos que ocorrem 1 a cada 4000-5000 pb e que

finalmente reduz a eficiência da amplificação de regiões alvo longas. Para a produção de

amplicons longos, pode-se usar combinadamente DNA polimerases termoestáveis, uma delas

23

contendo a atividade 3´exonuclease (BARNES, 1994 e CHENG et al., 1994). Um dos fatores

que determina a confiabilidade da PCR é a eficiência de amplificação, que pode ser

influenciada por inúmeros fatores: concentração de DNApolimerase, dNTPs e do cofator

Mg+2, estrutura secundária e conteúdo G/C do alvo, a sequência e composição dos iniciadores

e presença de inibidores da DNA polimerase.

Nos primeiros ciclos os amplicons têm tamanhos variados e a produção é linear. Em

seguida, o produto aumenta de forma exponencial. Durante os ciclos que se seguem, a

velocidade da reação diminui (KOHLER et al, 1995). Outro fator crucial é o tempo de meia

vida da Taq DNA polimerase que é de 30min a 95ºC, em parte, o que desaconselharia para

alguns a utilização de mais do que 30 ciclos de amplificação com a temperatura de

desnaturação a 95ºC, entretanto, é possível reduzir a temperatura de ação da desnaturação

após os 10 primeiros ciclos de amplificação, porque o comprimento do DNA alvo diminui,

então para moldes de 300 pb ou de menos e que apresente 50% de G/C, a temperatura de

desnaturação pode ser reduzida até 88ºC (YAP e McGEE, 1991). Nestas condições, não

haverá muita diminuição na atividade da enzima mesmo com mais de 40 ciclos de PCR.

Num cenário menos favorável, ocorrendo a mutação e propagação de uma única

molécula alvo durante o primeiro ciclo da PCR, existiria depois disso uma freqüência de 25%

no produto final da PCR. Desde que centenas de cópias de alvos são rotineiramente usadas

como DNA origem na PCR e a maioria das más incorporações terminam a síntese de DNA, a

freqüência de erro observada é significantemente menor que 25%. A enzima Phi29 que faz

parte de um kit comercial (genomicPhi®, Amersham Biosciences) é capaz de usar primers

hexâmeros e suporta a síntese por deslocamento de fita. A atividade de correção de erros da

exonuclease 3’ - 5’ resulta em DNA amplificado com maior fidelidade quando comparada a

Taq DNA polimerase. Essa polimerase é altamente processiva e por isso é utilizada quando o

material genético presente em amostras clínicas não está disponível em quantidade e/ou

qualidade suficiente, impedindo a amplificação pela PCR usando Taq polimerase (AZEVEDO

et al., 2004).

24

1.5 PCR quantitativo (qPCR)

O PCR quantitativo (qPCR) foi desenvolvido com a finalidade de estimar o número de

cópias de um gene de interesse ( DOLKEN et al., 1998; HIGUCHI et al., 1993). O qPCR é

uma variação da técnica do PCR convencional que visa quantificar uma amostra de DNA ou

RNA usando sequência de primer específico, determinando assim o número de cópias de uma

determinada sequência. Se uma quantidade elevada de DNA ou RNA está presente na amostra

é detectado nos ciclos iniciais, mas se a quantidade for pequena só é detectado em ciclos mais

tardios (HEID et al., 1996).

A PCR quantitativa (qPCR) vem sendo utilizada para detecção e diagnóstico de

deleções genéticas, para estudo de expressão gênica e para estimação da carga viral de HIV-1.

E podendo ser usada para quantificar a expressão de RNAs mensageiros em baixos níveis ou

fragmentos de DNA, permitindo a detecção e quantificação direta dos produtos da PCR

durante a fase exponencial da reação, e assim combina amplificação e detecção em um só

passo (GIULIETTI et al., 2001). O princípio da técnica baseia-se na atividade exonuclease

5’→3’da enzima Taq DNA polimerase e na construção de sondas de oligonucletídeos

marcadas duplamente. Estas sondas são baseadas no princípio FRET “Transferência de

Energia de Ressonância da Fluorescência” e emitem sinal de fluorescência somente quando

clivadas. Em PCR em tempo real utilizando-se sondas Taq Man, a sonda específica para o

gene de interesse é marcada duplamente com um corante repórter em uma extremidade (5’) e

uma substância que absorve a luz (Supressor) na outra (3’). Na forma livre, a transferência de

energia fluorescente ocorre de forma que a emissão pelo repórter é absorvida pelo

“Supressor”. Quando ocorre a degradação da sonda pela enzima Taq DNA polimerase,

durante a PCR, os fluoroforo repórter e o silenciador são separados e a emissão de

fluorescência do repórter não será mais absorvida pelo “quencher”, resultando em um

aumento de emissão de fluorescência pelo repórter que será detectada e quantificada. O

aumento na emissão de fluorescência pode ser monitorado por um detector em tempo real,

durante a reação de PCR, e é uma consequência direta da amplificação da sequência de DNA

de interesse (GIULIETTI et al., 2001).

25

Enquanto a quantificação de DNA por multiplex PCR foi previamente descrita

(METZKER ET et al., 1995), a quantificação de RNA vem sendo intensamente pesquisada.

Para várias aplicações, estimar a quantidade relativa de produtos de PCR é suficiente para

descrever a presença do agente etiológico. A quantificação absoluta de moléculas de RNA,

entretanto, tem sido mais difícil do que para DNA por causa da dificuldade de gerar controles

precisos.

Padrões internos derivados de RNA sintético ou cDNA vem sendo desenhados para

conter a mesma seqüência de primers que o alvo, mas gerando um produto de PCR de

tamanho diferente que pode ser facilmente separado por eletroforese. Os cDNAs não são

apenas co-amplificados com as seqüências alvo, mas também servem para quantificar a

variabilidade da eficiência da síntese de cDNA. Mais ainda, qPCR é tipicamente realizada na

fase log ou exponencial do processo de amplificação para obter resultados quantitativos

precisos, a quantidade absoluta de mRNA pode ser quantificada por diluições seriadas da

mistura alvo/controle interno e por extrapolações da curva padrão (METZKER e CASKEY,

2005). A variabilidade da quantidade de alvos iniciais e a presença de vários inibidores

podem, entretanto, afetar adversamente a cinética e eficiência da PCR. A qPCR em tempo real

(HEID et al., 1996) usando uma 5´-nuclease fluorôgenica ou ensaio “Taq Man” vem sendo

desenvolvida para medir precisamente as quantidades iniciais de seqüências alvo.

Diferentemente da eletroforese em gel de agarose, a qPCR em tempo real tem a vantagem

única de começar em um sistema de tubo fechado, o qual pode significativamente reduzir

contaminação ambiental. Usando esta técnica, pode-se facilmente monitorar e quantificar

precisamente o acúmulo de produtos de PCR durante a fase log da amplificação (HOLLAND

et al., 1991).

A evolução na área molecular modificou e aperfeiçoou alguns tipos de diagnóstico de

uma forma geral, e ainda está sendo fonte de grandes estudos. Foi, porém, na última década,

que as técnicas de clonagem, de produção in vitro de DNA a reação em cadeia da polimerase

(PCR) e de seqüenciamento de material genético ficaram mais acessíveis e eficientes. Além

de rápida, a técnica de PCR apresenta vantagem de usar quantidades muito pequenas de DNA.

Teoricamente, a técnica pode ser eficaz até se realizada a partir de uma molécula de DNA

proveniente de uma única célula, o que traz grandes vantagens no diagnóstico de várias

doenças. A sensibilidade da PCR tem sido estudada também na pesquisa de doença neoplásica

residual mínima, com uma média de detecção de uma célula clonal em 2x105 células,

superando, assim, outras técnicas utilizadas antes do advento da PCR (STETLER-

26

STEVENSON et al., 1988). A PCR também possibilita a amplificação de regiões do genoma,

a partir de quantidades pequenas de DNA, o qual pode até estar degradado (SAIKI et al.,

1988). Em vista disso, esta técnica torna-se uma metodologia de escolha para a utilização em

tecido fixado em formalina e em blocos de parafina (SEPP et al., 1994), além de outros

materiais de arquivo e de fontes escassas de DNA, ampliando, assim, as possibilidades de

utilização da técnica.

Consequentemente, com os avanços no emprego e na realização da técnica de

polimerização em cadeia, os métodos de extração de DNA também passaram por um processo

de aprimoramento, melhorias e adequações, de forma a serem empregados nos mais diferentes

tipos de fontes de DNA potenciais, ampliando o campo de utilização da PCR. Esses avanços

técnicos têm contribuído para o desenvolvimento de grande número de formas efetivas de

prospecção e descobertas de mutações pontuais, antes desconhecidas. A PCR é uma técnica

da biologia molecular que tem um grande potencial para a análise genética de tecidos. Isso

inclui diagnóstico pré-natal rápido de doenças hereditárias (SAIKI et al., 1988), detecção de

doença residual (LEE et al., 1987), detecção de clonalidade em lesões linfoproliferativas (MC

CARTHY et al., 1990), identificação de mutações pontuais em protooncogenes celulares

(HALASSOS et al., 1989), diagnóstico de infecções virais (LAURE et al., 1988) detecção de

DNA de plasmódio (SCHINDLER et al., 2001) e de Shistosoma mansoni (ABATH et al.,

2002), e muitos outros patógenos infecciosos como: Helicobacter pilory (LAGE et al.,1995);

Herpes simplex (CHESKY et al., 1998 & EISENSTEIN,1990); Mycobacterium tuberculosis

(.TAN et al, 1999); Vírus da Hepatite B –HBV (URDEA,1993 & EISENSTEIN, 1990); Vírus

da Hepatite C – HCV (TOYODA et al, 1996); Toxoplasma gondii (EISENSTEIN, 1990);

Yersinia pestis (LEAL e ALMEIDA, 1999); Entamoeba histolytica (PINHEIRO et al, 2004);

Streptococus sp. (CHESKY et al., 1998).

O aprimoramento da técnica de PCR permitiu, além da detecção do ácido nucléico, a

sua quantificação como, por exemplo, a carga viral dos agentes etiológicos das hepatites B e

C e do HIV. A quantificação desses vírus é um parâmetro preditivo e de resposta terapêutica

(LAU et al., 1993). Dessa forma, vale salientar que esta técnica pode ser utilizada para o

monitoramento de agentes contaminantes em uma série de produtos industrializados,

permitindo a obtenção de resultados rápidos e precisos, e tendo em vista que na indústria o

aumento de eficiência e a redução de tempo podem resultar em diminuição de custos, o

desenvolvimento de protocolos baseados na qPCR podem contribuir para um crescimento

mais sustentável deste segmento da economia.

27

1.6 RNA ribossômico 16S

Os rRNAs distintos se combinam com as proteínas ribossomais para formar os

ribossomos, estas organelas auxiliam diretamente na síntese de proteínas. Os ribossomos são

compostos por duas subunidades principais, cada uma possuindo pelo menos um tipo distinto

de rRNA combinado a proteínas ribossomais. A menor subunidade ribossomal contém um

único tipo de rRNA e 20 proteínas em procariontes ou 30 proteínas em eucariotos. Em

procariotos a grande subunidade ribossomal contém dois rRNAs e cerca de 30 proteínas,

enquanto que em eucariotos possuem três rRNAs combinados a cerca de 40 proteínas

ribossomais, ocorrendo um único exemplar de proteína presente em cada ribossomo. Devido à

necessidade de ribossomos para produção de proteínas nos seres vivos, considera-se que a

síntese de rRNA é necessária à vida, pois é universalmente utilizada pelos seres vivos

(HILLIS e DIXON, 1991). Procariotos podem ter uma ou várias cópias dos genes de rRNAs,

com os mesmos podendo se organizar em um único operon, mas também podem estar

dispersos pelo genoma (BROSIUS et al., 1981 e MORGAN, 1982). Os rRNAs são

normalmente classificados de acordo com sua taxa de sedimentação, a unidade S (Svedburg).

Estas subunidades variam de tamanho que vão desde 5S em procariotos até 28S em genomas

nucleares de eucariotos (GUTELL et al., de 1993). Os rRNAs de bactérias são classificados

como 5S, 16S e 23S, sendo o 16S constitutivo da subunidade menor e alvo de estudos mais

intensos. Amplamente utilizado para amplificação por PCR e sequenciamento a fim de

identificação de microrganismos (SILVA et al., 2006). Além disso, os genes 16S e 18S rRNA

(nuclear em eucariotos) tem sido estudados devido à sua lenta evolução, dessa forma,

compreende-se o porque da sua utilização em estudos que abordam antigos eventos

evolutivos. Por meio disso, registra-se uma extensa diversidade filogenética entre os

procariontes, sendo possível o reconhecimento de linhagens distintas como bactérias e

arqueobactérias (WOESE, 1987 e GOUY e LI, 1989). Além da elucidação de grandes grupos,

o gene 16S também pode ser aplicado em estudos sobre as relações dentro dos grupos. Assim,

o estudo do DNA ribossômico (rDNA) tem proporcionado uma grande riqueza de

informações sobre relações filogenéticas entre espécies estreitamente relacionadas e

populações (HILLIS e DIXON, 1991). Sua utilização na taxonomia pode ser ilustrada na

caracterização de linhagens de Bacillus, onde a realização de 50 testes pode caracterizar

apenas de 1 a 3% do potencial genético (CLAUS e FRITZE, 1989), não expressando toda a

28

informação taxonômica necessária para a caracterização. Dessa forma, a utilização do rRNA

16S é uma importante ferramenta na caracterização e detecção de microrganismos.

29

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Descrever um método alternativo para quantificação de bactérias em produtos

industrializadas, utilizando a técnica de PCR em tempo real (qPCR) e comparar com à

metodologia tradicional.

2.2 Objetivos Específicos

• Obtenção de uma suspensão de bactérias cultiváveis com concentração conhecida para

utilização como curva de calibração e contaminação das amostras industrializadas;

• Fracionar a suspensão bacteriana para formação da curva de calibração e avaliação do

limite de detecção (PCR convencional) em UFC.mL-1, utilizando DNA purificado.

• Extrações de DNA genômico total da curva calibração e das amostras industrializadas

contaminadas por S. aureus e E. coli;

• Quantificação molecular da suspensão padronizada como curva calibração e das

amostras industrializadas contaminadas, através da técnica de PCR em tempo real;

• Comparações das metodologias para quantificação baseada em cultivo (UFC.mL-1) e

PCR em tempo real (DNA).

30

3 MÉTODO

3.1 Quantificação de microrganismos para obtenção de uma curva

calibração e contaminação das amostras industrializadas com concentração

conhecida.

Para a realização do teste foram preparadas cultura recente dos microrganismos S.

aureus e E. coli, em 5 ml TSB, 28ºC por 48 horas. Posteriormente foram realizadas diluições

seriadas, 5mL → 1 / 10mL(mãe) → 1mL / 10mL (102) → 1mL / 10mL (104) → 1mL / 10mL

(106) → 1mL / 10mL (108). Após realizadas as diluições, cada tubo foi agitado

individualmente e 1 mL da suspensão foi transferido para cada uma de duas placas de petri

esterilizadas. Em seguida, foram distribuídos cerca de 15-20 mL do meio TSA (Trip Soy

Agar), observando a temperatura do meio de cultura para que esteja aproximadamente 45ºC.

O meio de cultura juntamente com a suspensão bacteriana foi adicionado nas placas de

petri e incubado a 28oC por 2-3 dias. Após o período de incubação, foi realizada a contagem

do número de UFC’s pelo método tradicional de contagem bacteriana de todas as diluições

realizadas, com o auxílio do contador de colônias. As suspensões de escolha para utilização

como curva de calibração e contaminação das amostras foram a diluição 1 x 10 -4 contendo

uma concentração de 1 x 104 UFC.mL-1. As demais diluições foram descartadas por

apresentar uma alta contagem de UFC’s ou estarem muitas diluídas. Seguida da escolha das

suspensões foi realizado o fracionamento das suspensões tanto da S. aureus como da E. coli

partindo de 6 x 102 UFC.mL -1; 5 x 102 UFC.mL-1;4 x 102 UFC.mL-1; 3 x 102 UFC.mL-1; 2 x

102 UFC.mL-1; 1 x 102 UFC.mL-1; 0,6x 102 UFC.mL-1; 0,3 x 102 UFC.mL-1; 0,15 x 102

UFC.mL-1; 0,05 x 102 UFC.mL-1; 0,01 x 102 UFC.mL-1, seguida da extração do DNA total de todas as

amostras fracionadas, onde foi possível avaliar o limite de detecção da PCR convencional. Em

relação às amostras industrializadas a serem analisadas foi realizado um controle negativo

pelo método tradicional para verificar a possível existência de contaminante nos produtos,

alterando o resultado na etapa de quantificação molecular. Após o período 48 horas de

incubação, verificou-se que não havia crescimento bacteriano, sendo utilizado como

31

parâmetro no controle negativo, mesmo sabendo da possibilidade da existência de bactérias

não cultiváveis.

Os produtos industrializados que foram contaminados e serviram como parâmetros para

o desenvolvimento do método molecular são: Água industrial/Potável lote: 156768 Fab.

08/2009 Val. 02/2013, produto alimentício (Leite Nan A.R.) lote: 9168046041

Val.01/09/2010 e produto Farmacêutico (Snif) lote: 149688 A Fab. 03/2009 Val. 03/2011. A

Água industrial/Potável na embalagem de 10 mL foi contaminada com 6 mL da suspensão

padronizada com 10 x 102 UFC.mL-1 ficando com uma concentração 6 x 102 UFC.mL-1, a

outra contaminação utilizada foi 0,33 mL ficando 2 x 102 UFC.mL-1 e 100µL ficando 0,6 x

102 UFC.mL-1 dos microrganismos E. coli e S. aureus. O produto farmacêutico (Snif na

embalagem de 10 mL), e o produto alimentício (Leite Nam A. R. 1g.10mL-1), foi

contaminado com 3 mL da suspensão padronizada com 10 x 102 UFC.mL-1 ficando com uma

concentração 3 x 102 UFC.mL-1, a outra contaminação que utilizada foi de 0,33 mL ficando

com uma concentração de 1 x 102 UFC.mL-1e 100 µL ficando 0,3 x 102 UFC.mL-1 dos

microrganismos E. coli e S. aureus.

3.2 Contagem de microrganismos de acordo a Farmacopéia

Americana e Brasileira.

As especificações de qualidade dos produtos, desde os insumos utilizados na

fabricação de todas as formas farmacêuticas até a embalagem final, são de competência legal

e, exclusiva, das farmacopéias. Essas especificações garantem a qualidade do produto, bem

como estabelecem os requisitos máximo da quantidade de bactérias presentes nos produtos

produzidos ou usadas em nosso país, servindo, ainda, como parâmetro para as ações da

Vigilância Sanitária. De acordo com códigos oficiais a analise de contagem bacteriana em

produtos industrializados são:

Para o produto Água Potável/Industrial; foi coletado 1 mL da amostra, o qual foi

transferido para cada uma das duas placas de petri esterilizadas. Foram adicionados 15-20 mL

de meio de cultura Plate-Count-Agar (PCA) liquefeito às placas. Certificando-se de que a

32

temperatura do meio de cultura estivesse entre 45 – 50ºC, homogeneizando e sendo incubadas

por um período de 48 horas em estufa de 30 – 35ºC.

Após o período de incubação as UFC’s foram contadas com auxílio de contador de

colônias e os resultados foram registrando.

Especificações segundo farmacopéia: Limite de alerta: 2,5 x 102 UFC.mL-1 Limite

máximo: 5 x 102 UFC.mL-1

Para a realização dos demais produtos farmacêuticos e alimentício, foi pesado 10 g (se a

amostra for sólida usar balança analítica) ou 10 mL (no caso de amostras líquidas usar pipetas

esterilizadas) foram coletados no Fluxo laminar ou Bico de Bunsen, e transferido com

espátula esterilizadas para frasco previamente identificado contendo 90 mL do diluente

adequado tampão pH 7,2, homogeneizando delicadamente por aproximadamente um minuto.

Após foi pipetado nas placas de petri esterilizadas alíquotas de 1,0 ou 0,1mL da diluição, em

seguida foram adicionados 15-20 mL do meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar)

esterilizados, previamente fundido e resfriado a temperatura de aproximadamente 45ºC foram

adicionados as placas, seguida da homogeneização com movimentos suaves em forma de “8”.

Após a solidificação do ágar, as amostras foram incubadas a 30-35ºC por 48 horas e a leitura

das placas foram realizadas no contador de colônias para posterior cálculo da densidade

populacional.

Especificações segundo farmacopéia: Limite de alerta: 0,1 x 102 UFC.mL-1 Limite

máximo: 1 x 102 UFC.mL-1

Posteriormente estas amostras foram contaminadas com as suspensões com

concentração conhecida contendo as bactérias S. aureus e E. coli. Após ter verificado a

presença de contaminantes nas amostras por meio da metodologia tradicional, foram

realizadas a extração do DNA total e seguida da amplificação pela técnica de PCR

convencional. Para verificar se os componentes de suas formulações poderiam alterar o

processo extração do DNA. Sendo descartada esta hipótese devido à confirmação da presença

de DNA contaminante visualizada através do gel de agarose 1% (figuras 13 e14).

33

3.3 Extração de DNA genômico total

A extração do DNA genômico total foi realizada pelo método de “bead beater”, onde

primeiramente foi centrifugado 1 mL do produto por 5 minutos a 14.000 g, em seguida

descartou-se o sobrenadante e foi adicionado 500 µL de solução Tampão de Extração (Tris

1M e pH 8.0; EDTA, 0,5M; NaCl 5M e H2O ultra pura). O conteúdo foi agitado em vortex e

centrifugado por 5 minutos a 14.000 g. Após o descarte do sobrenadante, novamente foi

adicionado 500 µL de TE juntamente com 30µL de SDS 10% (dodecil sulfato de sódio). A

solução foi incubada em termobloco por 10 minutos a 70°C. Logo após, foram adicionadas 2

pás de pó de sílica (Glass Beads 0,1mm) e os microtubos foram agitados por 1 minuto no

bead-beater. Em seguida, foram adicionados 500 µL de fenol saturado e misturados por

inversão e centrifugado por 10 minutos. Depois, o sobrenadante foi transferido para tubos

limpos, onde foi acrescentado 1 volume de fenol-clorofórmio, agitou-se novamente por

inversão e centrifugando-se por 5 minutos a 14.000 g. O sobrenadante foi novamente

transferido para outros tubos contendo 0,1 volume de NaCl 5M e 0,6 volume de isopropanol

absoluto e centrifugados por 10 minutos a 14.000 g. O sobrenadante foi descartado e 300 µL

de etanol 70% foram adicionados, em seguida centrifugou-se por 3 minutos a 9.700 g,

descartando o sobrenadante. Após a evaporação total do álcool, foram adicionados 30µL de

H2O ultra pura, finalizando o procedimento.

As amostras de DNA extraído foram analisadas através de eletroforese em gel de

agarose a 1%, em tampão TAE (Tris-acetato 40mM; EDTA 2mM), coradas com brometo de

etídio, com a finalidade de verificar a e a qualidade da amostra.

Devido baixas concentrações de colônias bacterianas não se observou a formação de

precipitados nos tubos durante a etapa de extração, gerando dúvida quanto à presença de

DNA, mas esta hipótese foi refutada, pois mesmo em concentrações menores de células

bacterianas a técnica de PCR foi sensível o suficiente para a detecção de DNA bacteriano.

3.4 PCR convencional amplificação e sequenciamento do 16S rRNA

34

A técnica de PCR foi utilizada para amplificação do 16S do rRNA. Para realização da

técnica foram utilizados os primers R1387 (5´-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3´) e

968F (5´-AAATTTTTGGG -3´), os quais são específicos para o domínio Bactéria. A PCR foi

realizada em um volume final de 50 µL contendo tampão da enzima 1 X, 5 mM de MgCl2,

0,25 mM de cada dNTPs, 0,1 µM de cada primer, 0,1U/µL de Taq DNA Polimerase. A reação

da amplificação foi realizada em termociclador, programado para realizar uma desnaturação

inicial a 94°C por 4 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a

62,5°C por 1 minuto e extensão de primers 72°C por 1 minuto, seguida de extensão final a

72°C por 10 minutos. Após a amplificação, 5µL da reação de PCR foram avaliados por

eletroforese em gel de agarose (1%).

3.5 Análise por PCR quantitativo (PCR em tempo real)

A reação de amplificação por qPCR foi conduzida em termociclador iQTM5 (Bio-Rad),

utilizando os primers R1387 (5´-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3´) e 968F (5´-

AAATTTTTGGG -3´), os quais são específicos para o domínio Bactéria. O termociclador foi

programado para uma desnaturação inicial em 5 minutos a 94°C, seguida de 40 ciclos de 15

segundos a 94°C e 1 minuto a 62°C. Na reação de qPCR a especificidade dos primers foi

avaliada por meio de uma curva de desnaturação com o gradiente de 60 a 96°C variando 1°C

a cada 30 segundos. Cada reação de amplificação foi realizada em um volume final de 25 µL,

contendo 2 µL de DNA (100 ng), 10 µM de cada primer e 12,5 µL da solução do kit

PlatinumÒ SYBRÒ Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). A eficiência da reação foi

calculada utilizando o programa LinRegPCR (RAMAKERS et al., 2003).

A quantificação da expressão gênica por meio de qPCR foi baseada na expressão de

um gene alvo em relação a um gene de referência (gene com expressão reconhecidamente

constitutiva) pelo modelo matemático de Pfaffl que calcula a razão da expressão relativa de

um gene alvo baseado na eficiência da reação de qPCR (E) e no ponto em que a fluorescência

ultrapassa satisfatoriamente a fluorescência de background (Ct) de uma amostra desconhecida

vs. um controle, e é expresso em relação a um gene referência, de acordo com a seguinte

equação (PFAFFL, 2001).

35

4 RESULTADOS

4.1 Desenvolvimento da curva de calibração

O experimento realizado teve como principal finalidade melhorar a qualidade das

analises. Foi utilizado método tradicional de contagem bacteriana para verificar as

contaminações nas suspensões selecionadas e posteriormente utilizadas como curva de

calibração, seguida de uma quantificação pelo método proposto. Para melhor expressar os

resultados encontrados foi realizado um controle semeando a suspensão utilizada como curva

de calibração em duplicatas (Figuras 1) dos microrganismos S. aureus e E. coli na

concentração de interesse.

As suspensões que foram selecionadas apresentavam uma concentração de 10 x 102

UFC.mL-1 dos microrganismos S. aureus e E. coli, podendo ainda existir a presença de

bactérias não cultiváveis alterando o resultado final, e através destas padronizações seguiu-se

os fracionamentos 6 x 102 UFC.mL-1; 5 x 102 UFC.mL-1;4 x 102 UFC.mL-1; 3 x 102 UFC.mL-

1; 2 x 102 UFC.mL-1; 1 x 102 UFC.mL-1; 0,6x 102 UFC.mL-1; 0,3 x 102 UFC.mL-1; 0,15 x 102

UFC.mL-1; 0,5 x 101 UFC.mL-1; 0,1 x 101 UFC.mL-1. Seguida da extração do DNA total pelo

método de bead-beater e amplificação pela PCR convencional. Foram utilizados dois

volumes diferentes (2 µL e 6 µL) para garantir a amplificação. Onde foi possível verificar

através do gel de agarose 1% o limite de detecção das diluições seriadas em UFC.mL-1(

figuras 2, 3 e 4). Após ter observado a eficiência da técnica de PCR convencional em detectar

baixas concentrações 0,1 x 101 UFC.mL-1 E. coli e 0, 5 x 101 UFC.mL-1 para S. aureus e

garantir a presença de DNA nas amostras fracionadas algumas foram selecionadas e

(Ealvo) ∆CPalvo (controle -amostra)

(Eref.) ∆CPref. (controle - amostra)

Razão (RER)

36

analisadas em PCR em tempo real e através dos resultados obtidos foi possível realizar uma

curva de calibração sendo utilizada como parâmetro para a quantificação da contaminação

dos produtos industrializados.

A B

Figura 1: Crescimento da bactéria S. aureus na concentração 6 x 102 UFC.mL-1 (A) e crescimento de E.coli na concentração 6 x 102 UFC.mL-1(B). As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio cultura TSA (Trip Soy Agar).

4.2 PCR realizado para avaliação do limite de detecção nas suspensões

utilizadas como curva calibração

O processo de extração e avaliação do limite de detecção foi possível através da técnica

de PCR convencional seguida de observação das bandas em gel de agarose 1%. O volume

utilizado no termociclador para amplificação e detecção de banda variou de 2 µL para 6 µL

conforme demonstrado na eletroforese de gel de agarose 1% figuras 2, 3 e 4. Na avaliação da

sensibilidade da técnica de PCR em detectar o limite mínimo de DNA em relação à

quantidade de colônias presente em cada diluição, foi observado que o DNA extraído da

suspensão que teoricamente apresentava 0,1 x 101 UFC.mL-1 do microrganismo E. coli,

resultou em aparecimento de banda sendo verificado nos pontos 23 e 24 da (figura 3) apesar

de ser a mesma amostra, mas sendo amplificado com um volume diferente foi verificado que

o volume de 2 µL apresentou uma qualidade melhor amplificação. Fato este que não foi

repetido para a bactéria S. aureus, que apresentou uma qualidade inferior na sua amplificação,

37

só sendo possível detectar o aparecimento de banda na extração da suspensão contendo 0, 5 x

101 UFC.mL-1 de DNA (Figura 4), nos pontos 49 e 50, inversamente aos dados anteriores o

volume que melhor representa a qualidade da amplificada é de 6 µL demonstrando que a

extração do DNA total da suspensão foi inferior em comparação a suspensão da E. coli,. Esse

resultado pode ser devido ao fato que as bactérias Gram-positivas como S. aureus apresentam

uma parede peptidoglicanas muito espessa que podem dificultar a extração de DNA, ou ter

sofrido algum tipo de perda durante o processo, dificultando a formação de banda. Já a

bactéria E. coli por apresentar uma parede mais pobre em peptidoglicanas (Gram Negativa),

pode alterar a qualidade e quantidade do DNA extraído, alterando também a sensibilidade da

análise.

Na avaliação geral da sensibilidade do método empregado para verificar o limite de

detecção, os resultados demonstraram uma boa eficiência tanto no preparo da suspensão

quanto na etapa de extração do DNA total. Embora tenha sido verificada variação na

concentração em UFC.mL-1, o DNA obtido na extração apresentou ótima qualidade, não

sendo constatada degradação do DNA, a qual seria observada pela presença de um arraste no

gel, indicando a presença de fragmentos de DNA de tamanho variado (figura 2, 3 e 4).

Sabendo que a técnica de PCR foi sensível mesmo em concentrações baixas de

UFC.mL-1, podemos passar o estudo para próxima etapa, quantificação do DNA total extraído

da curva calibração e das amostras contaminadas, através da técnica de PCR em tempo real.

Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S na suspensão utilizada como curva de calibração contendo a bactéria E. coli. Marcador peso molecular (1 kb) . M - Marcador 1kb; 02 – 6 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 03 - 6 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 04 - 5 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 05 - 5 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 06 - 4 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 07 - 4 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 08 - 3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 09 - 3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 10 - 2 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA ; 11- 2 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 12 - 1 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 13 - 1 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; 14 – 0,6x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 15 – 0,6 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; 16 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 17 – 0,3x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; 18 – 0,15 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 19 - 0,15 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; 20 - 0,05 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA

38

Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S na suspensão utilizada como curva de calibração contendo as bactérias E. coli, S. aureus, λ lambda e marcador peso molecular (1 kb). M - Marcador 1kb; 22 - 0,05 x 102 UFC.mL-1E. coli 6µL DNA; 23 - 0,01 x 102 UFC.mL-1E. coli 2µL DNA; 24 - 0,01 x 102 UFC.mL-1E. coli 6µL DNA; 25-λ-1µL( 25ng/ml); 26 - λ - 2µL (50ng/mL); 27 - λ - 3µL (75ng/mL); 28 - λ - 4µL (100ng/mL); 29 - λ - 5µL (125ng/mL; 30 - 6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 31 - 6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 32 - 5 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 33 - 5 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 34 - 4 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 35 - 4 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 36 - 3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 37 - 3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 38 - 2 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 39- 2 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 40 - 1 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA

Figura 4: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação do gene 16S da bactéria S. aureus e controles. Marcador peso molecular (1 kb). M - Marcador 1kb; 42 - 1 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL; 43 – 0,6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 44 – 0,6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 45 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 46 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 47 – 0,15 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 48 - 0,15 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 49 - 0,05 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 50 - 0,05 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 51 - 0,01 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 52 - - 0,01 x 102 UFC.mL-1S. aureus 6µL DNA; 53 - Amostra1 teste 2µL DNA; 54 - Amostra1 teste 6µL DNA; 55 - Amostra 2 teste 2µL DNA; 56 - Amostra 2 teste 6µL DNA; 57 - MIX 2µL DNA; 58 - MIX 6µL DNA; 59 - Branco 2µL DNA; 60 - Branco 6µL DNA

39

4.3 Contaminações das amostras com concentração conhecida

Para a contaminação das amostras industrializadas foram utilizadas as mesmas

suspensões obtidas na curva calibração contendo os mesmos microrganismos E. coli e S.

aureus. Após a padronização da suspensão com carga microbiana conhecida, contendo cepas

bacterianas S. aureus e E. coli, os quais são utilizadas como padrão para análises de

contaminantes em produtos industrializados. Sendo incubadas pelo período de 48 horas e

avaliados pelo método tradicional de contagem microbiana. Foi verificada a presença de

contaminantes (UFC.mL-1), mas a técnica deixava algumas duvidas na interpretação dos

resultados, existia a possibilidade das células bacterianas estarem próximas umas das outras,

formando apenas uma UFC.mL-1 e a turvação do meio de cultura que dificultava a contagem

de UFC.mL-1 nas placas. Como já se sabia o grau de contaminação destes produtos foi

possível fazer a quantificação pelo método molecular.

A contaminação da amostra Água Industrial/Potável foi realizado com uma suspensão

contendo 6 x 102, 2 x 102 e 0,6 x 102 UFC.mL-1 das bactérias E. coli e S. aureus (Figuras 5 e

6), as amostras que foram contaminadas com 6 x 102 UFC.mL-1 estava em desacordo com as

especificações farmacopéicas não estando disponível para comercialização.

Os produtos alimentício e farmacêutico foram contaminado com 3 x 102 UFC.mL-1, 1

x 102 UFC.mL-1 e 0,3 x 102 UFC.mL-1, de acordo as especificações vigentes amostras que

foram contaminadas com 3 x 102 UFC.mL-1 estava em desacordo com as especificações

farmacopéicas não estando disponível para comercialização (Figuras 7, 8, 9 e 10). E um

controle negativo das amostras foram realizado (Figura 11), para verificar a carga microbiana

inicial. Onde foi constatado pelo método tradicional de contagem microbiana que não havia

contaminação nos produtos antes da contaminação, mas sabemos que existe a possibilidade da

presença dos microrganismos não cultiváveis.

E um controle positivo também foi aplicado (Figura 12), para verificar a qualidade do

meio cultura utilizado, verificando as possíveis perdas de nutrientes durante a etapa de

preparo (autoclavação), interferindo no crescimento das colônias.

40

A B

C

Figura 5: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada, Água Industrial/Potável. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 6 x 102 (A), 2 x 102 (B) e 0,6 x 102 (C) UFC.mL-1 de E. coli. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar).

A B

C

Figura 6: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada, Água Industrial/Potável. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 6 x 102 (A), 2 x 102 (B) e 0,6 x 102 (C) UFC.mL-1 de S. aureus. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar).

41

A B

C

Figura 7: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto alimentício. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de E. col. . As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar).

A B

C

Figura 8: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto alimentício. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de S. aureus. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar)

A B

42

C

Figura 9: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto farmacêutico. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de E. coli. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar).

A B

C

Figura 10: Crescimento bacteriano proveniente de amostra industrializada de produto farmacêutico. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 3 x 102 (A), 1 x 102 (B) e 0,3 x 102 (C) UFC.mL-1 de S. aureus. As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar)

43

A B C

Figura 11: Controle negativo realizado nas amostras antes da contaminação; Água Industrial/potável (A), produto alimentício (B) e produto farmacêutico(C). As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar). A B

Figura 12: Crescimento bacteriano proveniente da suspensão padronizada como curva de calibração utilizada como controle positivo. As amostras foram contaminadas nas concentrações de 5 x 102 UFC.mL-1 de S. aureus (A) e com 5 x 102 UFC.mL-1 de E. coli (B). As placas foram analisadas após 48horas de crescimento em meio e cultura TSA (Triptic Soy Agar).

44

4.4 Avaliação do processo de extração do DNA bacteriano dos

produtos industrializados contaminados

Nesta etapa foi demonstrada a eficiência do método de extração do DNA das amostras

contaminadas e verificado possíveis interferências dos produtos industrializados durante a

etapa de extração do DNA total pelo método “bead beater”. Como podem ser observados, os

produtos que foram contaminados com três concentrações diferentes e o volume utilizado no

termociclador variando de 2µL e 6µL, o DNA obtido apresentou qualidade razoável, sendo

observado DNA degradado principalmente na figura 13 nos pontos 13 à 18 contaminado com

E. coli e na figura 14 nos pontos 31 a 36 contaminado S. aureus que representa o produto

alimentício Leite Nan A.R. Diferentemente da extração obtida na curva padrão, foi observada

presença de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Os produtos em análise podem ter

sido uma variável importante, bem como, o microrganismo utilizado, visto que variações

foram observadas. Como mostram as figuras 13 e 14 com o DNA obtido, foi possível obter

fragmentos de amplificação do rDNA das bactérias utilizadas nas amostras avaliadas,

mostrando que podem ser detectadas mesmo em concentração pequenas e possivelmente em

outros produtos industrializados.

Figura 13: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação gene 16S nas amostras industrializadas que foram contaminadas com E. coli e volumes de amplificação variados. Marcador peso molecular (1 kb). M - Marcador 1kb; 01 - 6 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 02 - 6 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 03 - 2 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 04 - 2 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 05 – 0,6x 102 UFC.mL-1. coli 2µL DNA; 06 – 0,6 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 07 - 3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 08 - 3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 9 - 1 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 10- 1 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6µL DNA; 11 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2µL DNA; 12 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; 13 - 3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 14 - 3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 15 - 1 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; 16 - 1 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 17 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 2uL DNA; 18 – 0,3 x 102 UFC.mL-1 E. coli 6uL DNA; M - Marcador 1kb.

45

Figura 14: Eletroforese em gel de agarose 1 % mostrando os fragmentos da amplificação gene 16S nas amostras industrializadas que foram contaminadas com S. aureus e volumes de amplificação variados. Marcador peso molecular (1 kb). M - Marcador 1kb; 19 - 6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 20 - 6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 21 - 2 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 22 - 2 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 23 - 0,6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 0,6 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 25 - 3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 26 - 3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 27 - 1 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 28- 1 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6µL DNA; 29 - 0,3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2µL DNA; 30 -0,3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6uL DNA; 31 - 3x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2uL DNA; 32 - 3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2uL DNA; 33 - 1 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6uL DNA; 34 - 1 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2uL DNA; 35 - 0,3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 6uL DNA; 36 - 0,3 x 102 UFC.mL-1 S. aureus 2uL DNA; 37- branco 2uL; 38 - branco 6uL; 39 - Mix 2uL; 40 - Mix 6uL; M - Marcador 1Kb

Sabendo que a técnica de PCR foi sensível em detectar bandas mesmo em

concentrações baixas de UFC.mL-1 e os produtos analisados não interferiram no processo de

extração, foi possível avançar a próxima etapa, a quantificação do DNA total extraído da

curva padrão e das amostras contaminadas utilizando a técnica de PCR em tempo real.

4.5 Avaliação dos resultados do PCR em tempo real

A quantificação microbiana por meio da técnica de PCR em tempo real ou PCR

quantitativo (qPCR) mostrou que a metodologia pode ser aplicada de acordo com os dados

obtidos neste trabalho, porem alguns ajustes de precisão deverão ser melhorados para possível

utilização em escala industrial. Segundo os dados obtidos (Tabela 1), que representa o DNA

extraído da suspensão padronizada como curva padrão, usando o microrganismo S. aureus

nas concentrações 0,3 x 102, 3 x 102, 4 x 102 e 5 x 102 UFC.mL-1. Foi detectado pela técnica

qPCR representado por Ctmédio que correspode a UFC.mL-1. E os dados da (Tabela 2) que

correspondem as amostras industrializadas contaminadas com uma suspensão com

concentração conhecida por UFC.mL-1do microorganismo S. aureus mostrou que:

46

O produto Água Potável (produto industrializado) que foi contaminado com o

microrganismo S. aureus em três concentrações conhecidas 0,6 x 102, 2 x 102 e 6 x 102

UFC.mL-1, sendo que a média da soma das três contaminações representou uma recuperação

de DNA 95,8% (Tabela 2), em relação ao valor teórico da curva de calibração. Sabendo que a

água não interferiu no processo, a contaminação realizada de 0,6 x 102 UFC.mL-1 apresentou

um valor teórico segundo a curva de calibração de 26,06 ciclos, amplificação representada por

Ctmédio mas o valor detectado na amostra representada pela média de duas detecção Ctmédio

foi 22,45 sendo detectado em ciclos anteriores, para a contaminação de 2 x 102 UFC.mL-1 o

valor teórico era de 24,88 ciclos e o valor encontrado foi de 25,32 ciclos acima do teórico e a

contaminação 6 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico era de 23,82 e o encontrado foi de 23,70

ciclos próximo de 100%.

Já a amostra do produto farmacêutico que foi contaminado com o mesmo

microrganismo mas com concentrações diferentes 0,3 x 102, 1 x 102 e 3 x 102 UFC.mL-1, o

resultado da média recuperada foi de 91,0% DNA (tabela 2) em relação ao valor teórico da

curva de calibração. O produto farmacêutico pode apresentar algum tipo de interferência no

processo de extração alterando a qualidade e quantidade de DNA recuperado. Segundo dados

obtidos da contaminação realizada com 0,3 x 102 UFC.mL-1, o valor teórico segundo a curva

de calibração de 26,73 ciclos, representada por Ctmédio mas o valor amplificado e detectado

na amostra através da média foi 23,28 sendo detectado em ciclos anteriores, para a

contaminação de 1 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico era de 25,56 ciclos e o valor encontrado foi

de 23,22 ciclos abaixo do teórico e a contaminação com 3 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico era

de 24,49 ciclos e o encontrado foi de 23,20 próximo do teórico.

E para o produto alimentício foi possível obter uma recuperação de 102,2% DNA

(tabela 2) em relação ao valor teórico da curva de calibração. O produto alimentício também

pode apresentar algum tipo de interferência no processo de extração alterando a qualidade e

quantidade de DNA recuperado. Os dados obtidos da contaminação realizada com 0,3 x 102

UFC.mL-1, o valor teórico segundo a curva de calibração foi de 26,73 ciclos, representada por

Ctmédio mas o valor de ciclos amplificado e detectado na amostra através da média foi 21,33

sendo detectado em ciclos anteriores, para a contaminação de 1 x 102 UFC.mL-1 o valor

teórico era de 25,56 ciclos e o valor encontrado foi de 23,68 ciclos abaixo do teórico e a

contaminação com 3 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico era de 24,49 ciclos e o encontrado foi de

32,82 ciclos muito acima do teórico.

47

Para as amostras contaminadas com uma suspensão com concentração conhecida por

UFC.mL-1do microorganismo E. coli mostrou que:

Segundo dados observados da (tabela 3) que representa a curva de calibração do DNA

extraido da suspensão padronizada nas concentrações 0,15 x 102, 0,6 x 102, 4 x 102, 5 x 102 e

1 x 103 UFC.mL-1 do microrganismos E. coli foram detectados pela técnica PCR em tempo

real através da detecção de ciclos de amplificação representado por Ctmédio que correspode

ao DNA detectado em relação a UFC.mL-1. O produto Água Potável (produto industrializado)

que foi contaminado com o microrganismo E.coli em três concentrações conhecidas 0,6 x 102,

2 x 102 e 6 x 102 UFC.mL-1, sendo que a média da soma das três contaminações representou

uma recuperação de DNA 106,8% em relação ao valor teórico da curva de calibração dados

da (Tabela 4), sabendo que a água (produto industrializado) não interferi no processo de

extração, a contaminação que foi realizada com 0,6 x 102 UFC.mL-1 apresentou um valor

teórico segundo a curva de calibração de 25,29 ciclos, amplificação representada por Ctmédio

mas o valor detectado na amostra representada pela média de duas detecção Ctmédio foi

31,64 sendo detectado em ciclos acima do teórico, para a contaminação com 2 x 102

UFC.mL-1 o valor teórico era de 24,29 ciclos e o valor encontrado foi de 23,80 ciclos

detectado abaixo do teórico e a contaminação 6 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico era de 23,38 e

o encontrado foi de 22,78 ciclos próximo ao teórico.

Já a amostra do produto farmacêutico que foi contaminado com o mesmo

micorganismo mas com concentrações diferentes 0,3 x 102, 1 x 102 e 3 x 102 UFC.mL-1 ,o

resultado da média recuperada foi de 91,1% DNA (tabela 4), podendo o produto ter algum

tipo de interferência no processo de extração alterando a qualidade e quantidade de DNA

recuperado.

Segundo dados obtidos da contaminação realizada com 0,3 x 102 UFC.mL-1, o valor

teórico segundo a curva de calibração é de 25,86 ciclos, representada por Ctmédio mas o valor

amplificado e detectado na amostra a média foi 23,05 sendo detectado em ciclos anteriores,

para a contaminação de 1 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico é de 24,86 ciclos e o valor

encontrado foi de 21,99 ciclos abaixo do teórico e a contaminação com 3 x 102 UFC.mL-1 o

valor teórico é de 23,96 ciclos e o encontrado foi de 23,00 próximo ao teórico.

E o produto alimentício foi possível obeter uma recuperação de 96,3% DNA em

relação ao valor teórico da curva de calibração dados da (Tabela 4). O produto alimentício

tambem pode apresentar algum tipo de interferência no processo de extração alterando a

qualidade e quantidade de DNA recuperado. Os dados obtidos da contaminação realizada com

48

0,3 x 102 UFC.mL-1, o valor teórico segundo a curva de calibração é de 25,86 ciclos,

representada por Ctmédio mas o valor de ciclos amplificado e detectado na amostra a média

foi 23,40 sendo detectado em ciclos anteriores, para a contaminação com 1 x 102 UFC.mL-1 o

valor teórico é de 24,86 ciclos e o valor encontrado foi de 28,92 ciclos acima do teórico e a

contaminação com 3 x 102 UFC.mL-1 o valor teórico era de 23,96 ciclos e o encontrado foi de

19,64 ciclos muito abaixo do teórico.

Demonstrando que a técnica pode ser aplicada, mas tem que ser melhorada e os

principais pontos a serem melhorados são: Os produtos analisados podem conter células

mortas que não foram detectados no controle negativo realizado pelo método tradicional e ou

durante o processo de analise pode ter ocorrido alguma contaminação de DNA nas amostras

somadas com a contaminação já conhecida, para os resultados que foram encontrados em

ciclos detecção abaixo do valor teórico da curva de calibração e um maior cuidado na etapa de

pipetagem evitando perda das amostras que pode varia de analista para analistas para os

resultado que foram encontrados ciclos acima do valor teórico da curva de calibração.

Tabela 1: Isolado do microrganismo S. aureus, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado como curva padrão para quantificar a carga microbiana.

Staphylococcus aureus

Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1

1 30,22 23,24 26,73 30

2 24,7 24,35 24,52 300

3 24,2 24,1 24,15 400

4 24,19 23,85 24,02 500

Figura 15: Curva de calibração de S. aureus, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado para quantificar a carga microbiana.

49

Tabela 2: Amostras industrializadas contaminadas com o microrganismo S. aureus, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real. Amostra de Água Potável Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1 Teórico % Recuperada

5 22,59 22,31 22,45 60 26,05657 86,2 % 6 25,32 25,32 25,32 200 24,88462 101,7 % 7 23,48 23,93 23,705 600 23,81523 99,5 % Amostra de Produto Farmacêutico Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1

8 23,27 23,48 23,375 30 26,73127 87,4 % 9 23,10 23,34 23,22 100 25,55933 90,8 % 10 23,13 23,26 23,195 300 24,48994 94,7 % Amostra de Produto Alimentício Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1

11 21,22 21,44 21,33 30 26,73127 79,8 % 12 22,76 24,61 23,685 100 25,55933 92,7 % 13 31,44 34,2 32,82 300 24,48994 134,0 %

Tabela 3: Isolado do microrganismo E. coli, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado como curva padrão para quantificar a carga microbiana.

Escherichia coli

Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1

1 26,60 25,93 26,26 15

2 24,98 26,20 25,59 60

3 23,56 23,56 23,56 400

4 23,51 23,58 23,54 500

5 22,78 23,18 22,98 1000

Figura 16: Curva de calibração de E. coli, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real utilizado para quantificar a carga microbiana.

50

Tabela 4 : Amostras industrializadas contaminadas com o microrganismo E. coli, dados obtidos através da técnica de PCR em tempo real. Amostra de Água Potável Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1 Teórico % Recuperada

6 25,38 37,89 31,635 60 25,28761 125,1 % 7 23,32 24,28 23,80 200 24,29241 98,0 % 8 22,48 23,07 22,775 600 23,3843 97,4 % Amostra de Produto Farmacêutico Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1

9 23,04 23,01 23,025 30 25,86057 89,0 % 10 21,92 22,06 21,99 100 24,86537 88,4 % 11 23,11 22,9 23,005 300 23,95725 96,0 % Amostra de Produto Alimentício Amostra Ct1 Ct2 Ctmédio UFC.mL-1

12 22,41 24,39 23,40 30 25,86057 90,5 % 13 30,23 27,6 28,915 100 24,86537 116,3 % 14 19,55 19,72 19,635 300 23,95725 82,0 %

51

5 DISCUSSÃO

Existem várias técnicas para quantificar e avaliar a qualidade da população microbiana

de uma determinada amostra. Esses microrganismos presentes nas amostras podem ser

quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o número de células presentes

num determinado material ou superfície, ou indiretamente, efetuando-se análises da turbidez,

determinação do peso seco, concentração de substâncias químicas (proteínas, pesquisa de

determinada enzima ou produto final de uma via metabólica, DNA, RNA) ou através da

contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado

(VASAVADA et al., 1993). Essa possibilidade permite que se avalie a quantidade de

microrganismos na água, em alimentos como leite e nos produtos farmacêuticos. Na seleção

de meios de cultura deve-se considerar a presença de nutrientes na forma assimilável, estes

servem como fonte de energia e de carbono para os microrganismos, sendo que as

necessidades nutricionais geralmente são específicas. Observa-se que, normalmente as

populações fúngicas se desenvolvem melhor em meios com alta relação carbono - nitrogênio,

enquanto que para as populações bacterianas o melhor desenvolvimento acontece em meios

com baixa relação carbono - nitrogênio (GRAY e WILLIAMS, 1975).

A maioria das amostras possui uma microbiota natural, ou em muitos casos existem

microrganismos que são adquiridos durante a sua manipulação ou contato com superfícies, ou

então são intencionalmente adicionados durante o seu processamento. Os testes microbianos

são considerados como um dos indicadores gerais de “Carga Bacteriana”, sendo utilizados na

avaliação da qualidade microbiológica de água e alimentos. No caso de “água potável” a

Contagem de Bactérias Heterotróficas é utilizada para avaliar o atendimento a legislação

vigente (até 5x10 2 UFC.mL-1) (US Pharmacopéia, 2005). No caso de alimentos e os produtos

farmacêutico a “Contagem de Bactérias” além de indicar a qualidade microbiológica, permite

avaliar o risco de deterioração à estabilidade do produto. A contagem do total de bactérias

viáveis é uma técnica que em virtude do grande uso muitas vezes recebe denominações

distintas como Contagem Padrão em Placa ou Contagem de Bactérias, Aeróbias e

Facultativas, Mesófilas, Viáveis (que especifica as características dos microrganismos

quantificados) (GRAY e WILLIAMS 1975).

52

A contagem de bactérias viáveis em placa é realizada pela adição de alíquotas da

amostra, ou de suas diluições, sobre ou meio de cultura da placa de Petri (Técnica de

Espalhamento em Superfície ou “Spread Plate”) ou misturadas ao meio de cultura sólido

ainda no estado líquido, ou seja, fundido e resfriado a 40-45ºC (Técnica de Espalhamento em

Profundidade ou “Pour-Plate”). Cada uma destas técnicas apresenta características próprias,

como no volume máximo a ser transferido para o meio de cultura ou na possibilidade ou não

da utilização de meios opacos. Apesar da reprodutibilidade ser baixas e um maior risco de

interpretação dos resultados, ainda é largamente utilizado, apresentando algumas vantagens

como, somente células viáveis são contadas, permite o isolamento das colônias, estas podem

ser sub-cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente estudadas e identificadas

(GRAY e WILLIAMS 1975). Entretanto, a lista de desvantagens é muito maior como, não

existe um meio que permita o crescimento de todos os microrganismos; é necessária a

incubação apropriada para permitir o desenvolvimento das colônias; usa-se muitas vidrarias e

é relativamente trabalhoso; a necessidade de muita manipulação pode originar erros nas

contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento; formação de muitos resíduos; todo o

material utilizado precisa ser autoclavados e descontaminado e o tempo de análise levam no

mínimo 48 horas.

Para se obter uma qualidade melhor nas análises microbiológicas dos produtos

industrializados dependemos dos métodos que estão sendo desenvolvidos, e nesse aspecto, os

cuidados com contaminação microbiana se tornaram um item de preocupação para a saúde

publica. Como consequência, tem aumentando o interesse das indústrias no padrão de

qualidade microbiológicas dos produtos industrializados (BARRICHELLO e ALLIL,1997),

visto que caso ocorra contaminação, o produto perde suas características rapidamente, além

de poder causar sérios danos à saúde do consumidor. Dessa forma, métodos mais sensíveis

para a detecção de células microbianas podem contribuir de forma significativa com a

qualidade dos produtos industrializados.

A introdução da PCR em diagnóstico microbiano estabeleceu uma alternativa viável aos

métodos tradicionais de cultura (MARLONY et al., 2003). Esta técnica apresenta diversas

vantagens em relação aos métodos convencionais, como maior poder quantificação e

discriminação, maior rapidez, bom limite de detecção, maior seletividade, especificidade,

potencial para automação e a possibilidade de trabalhar com bactérias que não são cultiváveis

em meios de cultura normalmente utilizados (BUSH e NITSCHKON, 1999). Mas, os

principais obstáculos à sua implementação na rotina laboratorial são a incapacidade do

53

método em diferenciar entre células vivas e mortas, a presença de inibidores de enzima

polimerase em alguns alimentos, o alto investimento em equipamentos e reagentes e a falta de

aprovação, padronização e regulamentação por parte dos órgãos oficiais (MARLONY et al.,

2003). Outra desvantagem está na complexidade do método, principalmente para ser utilizado

em análises de rotina, apesar do recente desenvolvimento de kits básicos em PCR que tem

facilitado a sua utilização e difusão (BOER e BEUMER, 1999).

A sensibilidade da técnica de PCR encontrada no presente estudo para E. coli e S.

aureus foi maior que a encontrada por (HALL et al., 1992). No entanto, a análise dos

resultados da técnica proposta para contagem bacteriana em PCR em tempo real nos permite

dizer em comparação com a metodologia convencionais, maior poder de quantificação, maior

rapidez, bom limite de detecção, maior seletividade, especificidade, reprodutibilidade,

potencial para automação, possibilidade de trabalhar com bactérias que não são cultiváveis em

meios de cultura normalmente utilizados e a diminuição dos resíduos gerados pelos métodos

tradicionais. E uma participação em programas de acreditação e qualidade laboratorial

contribuem para a credibilidade da utilização da técnica.

54

6 CONCLUSÕES

Ao final deste estudo pode-se concluir que:

Os resultados demonstraram ser possível quantificar DNA bacteriano em amostras de

produtos industrializado através da técnica qPCR utilizando uma suspensão com concentração

conhecida em UFC padronizada com curva de calibração, seguida de avaliação da carga

bacteriana nos produtos industrializados por comparação com a curva de calibração. O que

viabiliza a técnica proposta como alternativa para analise microbiológicas de produtos

industrializados.

- A técnica de PCR foi sensível para detectar DNA bacteriano em soluções

contaminadas por E. coli e S. aureus mesmo baixas concentrações bacterianas de 6 x 102

UFC.mL-1 à 0,1 x 101 UFC.mL-1 tanto da curva de calibração como das amostras analisadas.

- Na avaliação da sensibilidade da técnica de PCR convencional em detectar o limite

mínimo de DNA em relação à metodologia tradicional o nível de detecção pode variar de

acordo com as características de cada microrganismo. A bactéria E. coli gram negativo

apresentou maior sensibilidade sendo detectado o aparecimento de banda na análise de PCR

convencional na suspensão com concentração de 0,1 x 101 UFC.mL-1 , entretanto o mesmo

não ocorreu com o microrganismo S. aureus, onde só foi detectado o aparecimento de banda

em suspensão com concentração de 0,5 x 101 UFC.mL-1.

- Em relação à curva padrão as extrações de DNA genômico total das amostras

industrializadas apresentaram uma qualidade razoável. Foi observado amplificação de DNA

degradado em gel de agarose 1%.

- Sabendo da sensibilidade da técnica PCR convencional em detectar e não quantificar

o DNA bacteriano foi realizado o teste de PCR em tempo real nas amostras para quantificar o

nível de contaminação em relação à curva de calibração. Sendo observado que a maiorias das

amostras foram detectadas em ciclos abaixo do valor teórico em comparação à curva de

calibração e quanto menor o numero de ciclos maior a quantidade de DNA presente na

amostra o que explica da possibilidade da técnica ter detectado bactérias não cultiváveis e

para as amostras que foram detectados em ciclos acima do valor teórico pode ter ocorrido

perda da amostra durante a pipetagem por ser tratar de volumes muitos pequenos. Alguns

produtos também podem aumentar a eficiência do PCR em tempo real devido a diferenças dos

55

produtos e o caso do leite que apresenta em sua formulação diversos nutrientes e quando

incubado pelo o período de 48 hora pode ter aumentado a carga microbiana inicial.

- Observou-se que o método molecular é menos variável em comparação ao método

tradicional: não existe um meio seletivo para o crescimento de todos os microrganismos; as

características do produto podem turvar o meio de cultura dificultando a leitura; é necessária a

incubação apropriada para permitir o desenvolvimento das colônias; são utilizadas diversas

vidrarias e é muito trabalhoso; há muita manipulação, podendo originar erros analíticos e a

formação de muitos resíduos; todo o material utilizado precisa ser autoclavados e

descontaminado, além disso, o tempo de análise é de no mínimo 48horas. Já o método

molecular: os resultados poderão ser liberados em um período menor de tempo, maior

sensibilidade; repetitividade; reprodutibilidade; potencial para automação e a possibilidade de

trabalhar com bactérias que não são cultiváveis em meios de cultura normalmente utilizados. As técnicas tradicionais de cultura de microrganismos continuarão ainda, por algum

tempo, ocupando a sua posição como métodos analíticos oficiais para determinação da carga

microbiana em produtos industrializados, principalmente no Brasil. Mas em um futuro

próximo, as técnicas moleculares estarão presentes em todos os laboratórios de análises,

complementando e sendo alternativa viável as técnicas tradicionais para o controle de

microrganismos.

56

7 REFERÊNCIAS

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