desenvolvimento de esferas de alginato de cálcio goma guar para

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  • Universidade Federal do ABC

    Centro de Cincias Naturais Humanas - CCNH

    Desenvolvimento de esferas de alginato de clcio-

    goma guar para utilizao como fase estacionria na purificao de jacalina.

    ALESSANDRA MELLO DA ROCHA.

    Santo Andr, SP 2014.

  • Universidade Federal do ABC

    Centro de Cincias Naturais Humanas - CCNH

    Desenvolvimento de esferas de alginato de clcio-

    goma guar para utilizao como fase estacionria na purificao de jacalina.

    ALESSANDRA MELLO DA ROCHA. RA: 11096008

    Orientador: prof. Dr. Alexandre Zatkovskis Carvalho.

    Trabalho de concluso de curso apresentado ao Centro de Cincias Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, como requisito para obteno do ttulo de Bacharel em qumica.

    Santo Andr, SP 2014.

  • Resumo:

    O isolamento e purificao protenas se tornaram processos de grande relevncia para

    investigao cientfica e para a indstria. Um grupo particularmente importante de protenas

    o das lectinas, que se caracterizam pela capacidade de se ligar reversivelmente a resduos

    especficos de acares, dentre as quais se destaca a jacalina, lectina presente no caroo da

    jaca e que apresenta especificidade por resduos de D-galactose. Essa lectina capaz de

    aglutinar eritrcitos de diferentes tipos de animais e inclusive do homem, independente do

    tipo sanguneo, alm de promover o estimulo clulas T CD4 e apresentar afinidade por IgA1.

    Matrizes biolgicas so complexas, por isso, mtodos tradicionais para purificao de

    protenas se caracterizam por apresentar grande nmero de etapas, baixa eficincia na

    purificao e um elevado tempo de execuo, logo, o uso de tcnicas e materiais que

    possibilitem uma melhor eficincia na separao de protenas, com nmero reduzido de etapas

    de grande interesse. A utilizao da cromatografia de afinidade vem apresentando resultados

    eficientes, rpidos e cuja purificao realizada atravs de uma nica etapa. Tais resultados

    podem ser atribudos ao tipo de material utilizado como fase estacionria na coluna de

    separao. Dentre os possveis materiais a serem utilizados como fase estacionria em

    cromatografia de afinidade est o alginato de clcio-goma guar, que neste projeto foi

    empregado como fase estacionria devido afinidade da jacalina por resduos de D-galactose

    presentes na estrutura da goma guar.

    O emprego da fase estacionaria constituda por alginato de clcio goma guar,

    reticulada com glutaraldedo demonstrou-se eficaz na purificao de jacalina por meio de

    cromatografia de afinidade. A tcnica de SDS-PAGE revelou uma nica banda aps a etapa

    de cromatografia, com a obteno de 5,0 mL de extrato purificado contendo 6,8mgmL-1 de

    jacalina.

    Palavras chave: alginato de clcio, cromatografia de afinidade, goma guar, jacalina.

  • ndice

    1 Introduo ............................................................................................................................ 3

    1.1 Mtodos cromatogrficos de separao de protenas ................................................... 3

    1.2 cido algnico .............................................................................................................. 3

    1.3 Lectinas ........................................................................................................................ 4

    1.3.1 Jacalina .............................................................................................................. 5

    1.4 Goma Guar ................................................................................................................... 6

    2 Objetivos ............................................................................................................................. 6

    3 Materiais e mtodos ............................................................................................................. 7

    3.1 Obteno de farinha de semente de jaca e do extrato protico bruto ........................... 8

    3.2 Estudo do tempo de obteno do extrato protico bruto e quantificao de protenas

    atravs do reagente de biureto .............................................................................................. 10

    3.3 Estudo para preparao de esferas de CaAlg e CaAlg-Guar ...................................... 10

    3.4 Purificao do extrato protico bruto e quantificao da jacalina .............................. 11

    4 Resultados e discusses ..................................................................................................... 11

    4.1 Obteno de farinha de semente de jaca e do extrato protico bruto ......................... 11

    4.2 Estudo do tempo de obteno do extrato protico bruto e quantificao de protenas

    atravs do reagente de biureto .............................................................................................. 13

    4.3 Estudo para preparao de esferas de CaAlg e CaAlg-GUAR .................................. 16

    4.4 Purificao do extrato protico bruto e quantificao da jacalina .............................. 18

    5 Concluses ......................................................................................................................... 19

    6 Referncias bibliogrficas ................................................................................................. 19

    7 Assinaturas ........................................................................................................................ 22

  • 3

    1 Introduo

    1.1 Mtodos cromatogrficos de separao de protenas

    A cromatografia uma tcnica de separao onde uma amostra transportada por uma

    fase mvel (gs, lquido ou fludo supercrtico) e forada a passar atravs de uma fase

    estacionria[1]. Os mtodos cromatogrficos so divididos em diferentes categorias com base

    no mecanismo de interao entre soluto e fase estacionria, sendo estes: adsoro do soluto

    superfcie da fase estacionria devido a interaes hidrofbicas ou hidroflicas, por partio

    entre dois lquidos, por troca inica (oriunda das interaes eletrostticas entre ons do soluto

    e a fase estacionria), por excluso molecular ou ainda por afinidade[2].

    A cromatografia por afinidade utiliza de interaes entre molculas especficas do

    soluto e molculas que se encontram covalentemente ligadas fase estacionria[2]. Essa

    tcnica tem sido aplicada com grande frequncia para purificao de protenas.

    1.2 cido algnico

    O cido algnico um biopolmero produzido de forma abundante por algas marrons e

    pertence famlia dos polissacardeos com estrutura no ramificada, com ligaes -D-(14)

    entre resduos de cido -D-manurnico (M) e de cido -L gulurnico (G), que podem estar

    em blocos nicos (MM) ou (GG), ou alternados (MG)[3], conforme ilustrado na figura 1. O

    produto de ionizao do cido algnico o alginato, que em contato com solues de cloreto

    de clcio forma hidrgeis de alginato de clcio (AlgCa) [4][5], material que extensamente

    utilizado em biotecnologia para preparar nanocpsulas e microcpsulas usadas como veculo

    para administrao de protenas com liberao controlada [6] e como envelope de clulas ou

    ilhotas pancreticas para transplante [7]. Este uso se deve boa biocompatibilidade do cido

    algnico, ausncia de toxicidade, biodegradabilidade, gelificao controlada e propriedades de

    formao de filme [8].

  • 4

    Figura 1: Estrutura qumica de bloco G (cido gulurnico), bloco M (cido manurnico) e bloco alternado MG (cido gulurnico e cido manurnico) - Extrado de LEE, 2012. [7]

    Os hidrogis de AlgCa e seus derivados podem ser empregados como fase estacionria

    para algumas separaes cromatogrficas por afinidade, incluindo a separao de algumas

    lectinas, como por exemplo, a jacalina, onde outro polissacardeo, a goma guar (GUAR),

    incorporado ao AlgCa atravs de ligaes covalentes cruzadas [9]. Neste caso, a GUAR a

    molcula responsvel pelas interaes de bioafinidade, conforme discutido adiante.

    1.3 Lectinas

    Lecitinas pertencem classe de glicoprotenas que se ligam de forma especfica e

    reversvel a acares[10]. Geralmente so constitudas por diferentes isoformas arranjadas em

    sua estrutura quaternria na forma de dmeros, tetrmeros, heterodmeros, entre outros. As

    lectinas podem ser monovalentes, isto , possuir um stio glicdico por monmero, ou

    polivalentes, mais de um stio ligante glicdico por monmero. [11]

    As lectinas so amplamente distribudas na natureza, sendo expressas por diversos

    organismos vivos, tais como: microorganismos, plantas (fitolectinas) e animais, tanto

    vertebrados como invertebrados [10]. Essas protenas desempenham importantes atividades

    biolgicas, principalmente a habilidade de reconhecer, de forma especfica, e aglutinar

  • 5

    eritrcitos, linfcitos, espermatozides, fungos, bactrias, partculas virais e clulas vegetais

    [11], razo pela qual as lectinas so tambm chamadas de aglutininas, representando um

    importante tpico de estudo. A jacalina (presente no caroo de jaca) e fitohemaglutinina de

    Phaseduosvulgaris PHA (presente no gro do feijo) so exemplos de fitolectinas, extradas

    de uma extensa lista [12]. Neste trabalho a extrao e purificao da jacalina por

    cromatografia de afinidade sero abordadas.

    1.3.1 Jacalina

    A jacalina uma lectina encontrada no caroo da Artocarpus integriflia,

    popularmente chamada de jaca. Acredita-se que a origem desta fruta seja nas florestas

    tropicais da ndia, e que tenha se distribudo para o sudeste asitico, Filipinas, leste africano,

    Brasil e Suriname, tor

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