866 ISSN 0326-2383

PALAVRAS-CHAVE: Aciclovir, Caracterização físico-química, Liberação prolongada, Quitosana, Spraydrying.KEY WORDS: Acyclovir, Chitosan, Physical chemical characterization, Spray drying, Sustained release.

* Autor a quem a correspondência deverá ser enviada: E-mail: hellen.stulzer@gmail.com

Latin American Journal of Pharmacy(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)

Lat. Am. J. Pharm. 26 (6): 866-71 (2007)

Trabajos originales

Recibido el 8 de septiembre de 2007Aceptado el 30 de septiembre de 2007

Desenvolvimento, Avaliação e Caracterização Físico Químicade Micropartículas Constituídas de Aciclovir/Quitosana

Desenvolvidas pela Técnica de Spray-drying

Hellen K. STULZER 1,2*, Monika P. TAGLIARI 1,Marcos A.S. SILVA 1 & Mauro C.M. LARANJEIRA 2

1 Laboratório de Controle de Qualidade,Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, e

2 Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Catarina,Campus Trindade, 88040-900, Florianópolis, SC, Brasil.

RESUMO. Micropartículas de aciclovir/quitosana de liberação prolongada foram desenvolvidas pela téc-nica de spray-drying, apresentando uma eficiência de encapsulação em torno de 90%. Os resultados obti-dos por calorimetria exploratória diferencial (DSC), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e di-fração de raios-X de pó (DRX) apontaram a formação de um sistema amorfo. Nas análises obtidas por ter-mogravimetria (TG) foi observado que as micropartículas são termicamente estáveis até a temperatura de242,4 °C. Os espectros na região do infravermelho (IV) indicaram que não ocorreram interações químicas,entre o fármaco e a quitosana. O revestimento do aciclovir com o biopolímero promoveu uma liberação dofármaco por um período de 2 horas, seguindo o modelo proposto por Higuchi. Dessa forma, conclui-se queo revestimento além de propiciar uma liberação prolongada do fármaco, contribuiu para aumentar a solu-bilidade do mesmo, uma vez que as micropartículas desenvolvidas apresentaram caráter amorfo.SUMMARY. “Development, Evaluation and Physical Chemical Characterization of Acyclovir/chitosan Micropar-ticles produced by Spray-drying Technique”. Delayed release acyclovir/chitosan microparticles were developedby spray drying technique with entrapment efficiency about 90%. The results obtained by differential scanningcalorimetry (DSC), scanning electron microscopy (SEM) and X-ray powder diffraction (XRPD) had pointed thatan amorphous system was formed. The analysis obtained by thermogravimetry (TG) indicated that the micropar-ticles were thermal stable until temperature of 242,4 ºC. The Fourier transforms infrared (FT-IR) did not presentany interactions between acyclovir and chitosan. The covering of drug with chitosan promoted a delayed releaseof acyclovir during 2 h, following the model considered for Higuchi. In this way, it was concluded that the cover-ing promotes an acyclovir delayed release and improving the solubility of the drug, a time that the microparticlesdeveloped presented amorphous characteristics.

INTRODUÇÃO

O aciclovir, 2-amino 1-9-dihidro-9-[(2-hidro-xietoxi)metil]-6H-purina-6 (Fig. 1), apresenta-sesob a forma de um pó cristalino branco, muitopouco solúvel em água, insolúvel em álcool e li-geiramente solúvel em soluções ácidas ou alcali-nas diluídas. Em relação a constante de disso-ciação, pKa apresenta dois valores: 2,3 e 9,2 1.Quando administrado por via oral é parcialmen-te absorvido no trato gastrointestinal, apenas20% da dose são absorvidos e as concentraçõesplasmáticas máximas são atingidas em 1-2 h,sendo necessário a sua administração várias ve-zes ao dia 2.

Alguns sistemas de liberação de fármacosdestinam-se a liberar o fármaco no organismode modo que seja absorvido com rapidez ecompletamente, enquanto outros devem liberaro princípio ativo lentamente para que a ação dofármaco seja prolongada 3. Sendo assim, um sis-tema de liberação prolongada objetiva eliminaras mudanças cíclicas na concentração de fárma-

Figura 1.Estrutura químicado aciclovir.

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co no plasma, observada após a administraçãode um sistema de liberação convencional, per-mitindo uma redução da freqüência de doses 4.

Entre as diferentes estratégias disponíveis pa-ra alcançar um controle na liberação de fárma-cos estão os sistemas microparticulados. A mi-croencapsulação de fármacos é uma técnica que,como o nome sugere, envolve a encapsulaçãode pequenas partículas do fármaco ou soluçãodo fármaco, num revestimento polimérico 5.

A quitosana é um polímero natural, biode-gradável e atóxico, devido às suas característicastem se tornado um material potencialmente atra-ente para diversos usos, principalmente na áreafarmacêutica. Este polissacarídeo vem sendousado como sistema polimérico na liberação defármacos de diversas classes terapêuticas, taiscomo, antibióticos, antiinflamatórios, antihiper-tensivos bem como, peptídeos, proteínas e vaci-nas 6,7.

A Classificação Biofarmacêutica Internacional(CBI) distingue os fármacos em 4 classes distin-tas, levando em conta a solubilidade e a perme-abilidade, podendo prever o comportamento invivo de um fármaco formulado, levando-se emconta o ensaio de dissolução deste in vitro. Osfármacos de Classe IV, classe a qual pertence oaciclovir, apresentam baixa solubilidade e baixapermeabilidade, sendo estes alvos de diversosestudos em tecnologia farmacêutica, justamentepor apresentarem problemas de dissolução eabsorção em termos de administração via oralde medicamentos 8.

Para melhorar a solubilidade, alterações po-dem ser feitas na formulação do medicamento,sem partir para modificações moleculares. Paraisto, existem técnicas laboratoriais promissorasem termos da modulação da dissolução e ab-sorção de fármacos 9. Uma delas é a tecnologiade spray-drying, utilizada em diversos segmen-tos industriais, incluindo o farmacêutico. Embo-ra seja uma tecnologia que necessita de eleva-dos investimentos em instalações e operações,muitas são as razões pelas quais a mesma é am-plamente utilizada, apesar do custo. Estas vanta-gens incluem a produção de partículas de quali-dade consistente, a facilidade em relação ao usocontínuo, a aplicabilidade da técnica em mate-riais tanto sensíveis quanto resistentes ao aque-cimento e capacidade de processar vários tiposde matéria prima, produção de sistemas de libe-ração prolongada, além de aumentar a solubili-dade de fármacos insolúveis 10,11.

As propriedades físicas, no estado sólido, defármacos e excipientes farmacêuticos são de

grande interesse, uma vez que podem afetartanto a formulação do produto quanto o com-portamento biológico da fórmula final. A nature-za da forma cristalina de uma substância podeafetar sua estabilidade no estado sólido, suaspropriedades de fluidez e disponibilidade bioló-gica, neste último caso afetando a velocidade dedissolução 5.

Para que uma substância seja absorvida apartir da mucosa gastrintestinal, esta precisa es-tar dissolvida. A dissolução é o processo atravésdo qual uma substância sólida interage com umsolvente para formar uma solução 3.

Considerações entre estados cristalinos eamorfos são importantes em relação ao proces-so de absorção. Sólidos amorfos são, geralmen-te, mais absorvidos que sólidos no estado crista-lino. Tal fato baseia-se na energia envolvida noprocesso de dissolução, pois em um sólidoamorfo as moléculas são arranjadas ao acaso e,portanto, baixa energia é requerida para separá-las, consequentemente a dissolução é mais rápi-da. Assim, o desenvolvimento de formulaçõescontendo o fármaco na forma amorfa é frequen-temente benéfico nos termos de dissolução ebiodisponibilidade 9.

Assim, o presente trabalho visa o desenvolvi-mento de microparticulas de aciclovir/quitosanade liberação modificada pela técnica de spraydrying, bem como a caracterização físico quími-ca do sistema.

MATERIAIS E MÉTODOSMateriais

O fármaco aciclovir (lote 4507062001), pro-veniente do fornecedor Chemo SA, foi cedidopela empresa Eurofarma. A quitosana foi forne-cida pela empresa Purifarma, apresentando umgrau de desacetilação de 90% e massa molecularrelativa de 122,74. Todos os reagentes utilizadosapresentavam grau analítico.

Desenvolvimento das micropartículasO aciclovir (200 mg) foi previamente solubi-

lizado em 100 mL de ácido clorídrico 0,1 N (so-lução 1). A esta solução foi adicionado 1 g dequitosana, sendo homogeneizada por uma horacom o auxílio de um agitador magnético (so-lução 2). A solução resultante foi nebulizada emspray-driyng Buhi (modelo B-191, Suíça) dandoorigem as micropartículas contendo aciclovir(Figura 2). As condições experimentais foram:temperatura do ar (entrada) e saída 180 °C e 92°C respectivamente, fluxo da solução 7 mL/min,fluxo de ar 500 L/h e aspiração a 100%.

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Eficiência de encapsulaçãoAmostras de 100 mg de micropartículas ana-

liticamente pesadas foram dissolvidas em 10 mLde etanol 90% e colocadas em banho de ultra-son por 15 min, sendo o volume completadocom fase móvel. Uma alíquota de 6 mL foi reti-rada e diluída com fase móvel até o volume de50 mL e centrifugada. As amostras foram anali-sadas em cromatógrafo líquido (Shimadzu LC-10A Japão), equipado com bombas LC-10AD,detector UV/VIS SPD-10 AV e controlador SCL-

Figura 2. Esquema representativo do desenvolvimento das micropartículas de aciclovir/quitosana.

10 AVP. Empregou-se uma coluna de fase rever-sa (150 mm x 4,6 mm de diâmetro interno e ta-manho de partícula de 5 µm). A fase móvel éconstituída de água:acetonitrila (95:5 v/v), pH2,5; eluída em uma razão de 0,8 mL/min, modoisocrático. O volume injetado foi 20 µL para to-das as amostras e os dados foram obtidos atra-vés do software Class VP. A porcentagem de en-capsulação foi calculada conforme equaçãoabaixo:

Massa de aciclovir presentes nas microesferasEficiência Percentual de encapsulação = x 100

Massa teórica de aciclovir( )Difração de Raios-X de Pó (DRX)

Os difratogramas foram obtidos em equipa-mento PHILIPS (fonte de radiação Cu-Kα, varre-dura angular 2θ) modelo X-Pert, nas seguintescondições: filtro de níquel, tubo com ânodo decobre, voltagem de 40 kV, corrente de 40 mA.

Avaliação morfológica Para a avaliação morfológica, utilizou-se

equipamento de Microscopia Eletrônica deVarredura, modelo XL30 da marca PHILIPS. Asamostras foram recobertas com ouro (35 nm)sob vácuo com o auxílio do aparelho Polaronmodelo E 5000. As fotomicrografias foram obti-das sob magnificação de 200 x e 2000 x.

Calorimetria exploratória diferencial(DSC)

As curvas DSC foram obtidas na faixa detemperatura entre 25 °C e 600 °C, utilizando-secélula calorimétrica modelo DSC-60 da Shimad-zu, sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50mL/min), razão de aquecimento de 10 °C/min,utilizando cápsula de alumínio parcialmente fe-chada contendo a amostra.

Termogravimetria (TG) As curvas TG foram obtidas na faixa de tem-

peratura entre 25 °C e 600 °C, utilizando-se ter-mobalança modelo TGA-50 da marca Shimadzu,sob razão dinâmica de nitrogênio (50 mL/min),razão de aquecimento de 10 °C/min, utilizando

cadinho de platina contendo aproximadamente4 mg da amostra.

Espectroscopia na região do infravermelho(IV)

As amostras foram previamente trituradas eprensadas com KBr na forma de pastilhas. Osespectros foram obtidos na região do infraver-melho através de espectrofotômetro FT PerkinElmer modelo 16 PC na região de 4000 - 400cm–1.

Perfil de LiberaçãoOs estudos de liberação foram conduzidos

de acordo com o método proposto pela USP 26,utilizando-se aparato I (cesto), temperatura de37 ± 0,5 °C e velocidade de rotação de 100 rpm.O meio de dissolução utilizado foi fluído gas-trintestinal (pH 1,2 e 6,8); volume de 500 mL.Alíquotas de 10 mL foram retiradas nos interva-los de 5, 10, 15, 30, 60, 90 e 120 min, sendo re-posto o volume. As amostras foram centrifuga-das e a quantidade de aciclovir liberada deter-minada através da leitura das absorbâncias emespectrofotômetro na região do UV, em 254 nm.

RESULTADOS E DISCUSÃOA concentração de aciclovir encapsulado nas

micropartículas revestidas com quitosana emspray dryer e determinada por cromatografia lí-quida de alta eficiência foi de 92% ± 0,79 (n=3).Os resultados foram obtidos a partir da compa-

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ração dos dados com uma curva de calibração(1-10 µg/mL e r2 = 0.9999). O método foi pre-viamente validado de acordo com preconizadopela Internacional Conference on Harmoniza-tion Q2 (R1) 12. O cromatograma referente aopico de absorção do aciclovir encapsulado nasmicroesferas está representado na Fig. 3.

A curva DSC (Fig. 4) evidenciou o ponto defusão do aciclovir em 256,7 °C (Tpico = 256,7 °C,ΔHfusão = -125,29 J/g), resultado condizendocom o especificado para este fármaco 13. A cur-va DSC da quitosana apresenta um pequenoevento endotérmico relacionado à evaporaçãode água na faixa de temperatura entre 90 °C e110 °C (ΔHfusão = -21,8 J/g). Na faixa de tempe-ratura acima de 270 °C ocorre o processo de de-composição térmica. Na curva DSC das micro-

Figura 3. Cromatograma das micropartículas conten-do aciclovir (6 µg/mL).

Figura 4. Curvas DSC do aciclovir, quitosana e micro-partículas.

Figura 5. Curvas TG do aciclovir, quitosana e micro-partículas.

partículas pode-se observar o desaparecimentodo pico característico da fusão do fármaco,apresentando um evento endotérmico na faixade temperatura de 43 °C a 52 °C (ΔH = 50,5J/g), que está relacionado a perda de água e lí-quidos residuais remanescentes do processo dedesenvolvimento das formulações.

As curvas TG obtidas para as amostras estãorepresentadas na Fig. 5. O aciclovir apresentoudois eventos de perda de massa, o primeiro naregião entre 269,62 °C e 330,45 °C (Δm= 24,13%) e o segundo na região compreendida entre435 °C e 514 °C (Δm= 16,03 %). A curva TG daquitosana apresenta um único evento de perdade massa na faixa de temperatura compreendidaentre 237,87 °C e 349,6 °C (Δm= 54,92 %). Asmicropartículas apresentaram-se termicamenteestáveis até a temperatura de 242,4 °C, após estainiciou-se um evento de decomposição até449,66 °C. Dessa forma, sugere-se que não ocor-reu uma diminuição significativa da estabilidadetérmica das micropartículas em relação ao fár-maco e ao polímero isolados.

As fotomicrografias do aciclovir (Fig. 6 A) in-dicam que o fármaco apresenta estrutura cristali-na. As micropartículas (Fig. 6 B) apresentaramuma forma arredondada e com a superfície in-terna côncava com tamanho médio de 5,52 ±1,8 µm.

Figura 6. Fotomicrografias do aciclovir (A) magnificação de 200x e (B) micropartículas magnificação de 2000x.

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Os cristais contêm arranjos ordenados demoléculas e átomos, mantidos em contato porinterações não covalentes. Um sólido amorfo écaracterizado pelo estado desorganizado ourandômico de suas moléculas 5.

A difração raios-X de pó (DRX) é uma técni-ca que permite a identificação e descrição preci-sa de substâncias cristalinas, que pode ser de-monstrada conforme estudos realizados por Ma-rona e colaboradores (2004), que determinarama estrutura cristalina da flutamida 14,15. A técnicaconsiste na incidência da radiação em umaamostra e na detecção dos fótons difratados,que constituem o feixe difratado. Em um mate-rial onde os átomos estejam arranjados periodi-camente no espaço, característica das estruturascristalinas, o fenômeno da difração de raios-Xocorre nas direções de espalhamento que satis-fazem a Lei de Bragg 16.

O aciclovir possui características cristalinas,que no difratograma (Figura 7) se apresentamsob a forma de picos. Neste estudo foram toma-dos como referência os picos com maior intensi-dade relativa para o fármaco puro que corres-pondem a 2 theta = 4,18; 9,36; 19,73; e 23,40, jáa quitosana apresentou um difratograma sem pi-cos, indicando um comportamento amorfo. Asmicropartículas produzidas não apresentaram ospicos relativos ao aciclovir, sugerindo que omesmo foi modificado para a forma amorfa,condizendo com os resultados obtidos por calo-rimetria exploratória diferencial e microscopiaeletrônica de varredura (Fig. 7).

Este fenômeno pode ser atribuído à secagempor spray drying, técnica que frequentementeproduz compostos amorfos, devido ao rápidoprocesso de secagem, o que impede a organi-zação de uma fase cristalina 17. O mesmo com-

Figura 7. Difratogramas obtidos para o aciclovir, qui-tosana e microparticulas.

Figura 8. Espectros infravermelhos do aciclovir, qui-tosana e micropartículas.

portamento foi observado por outros autores,envolvendo o uso de polímeros e subsequente-mente a nebulização em spray-drying 18.

O espectro na região do infravermelho doaciclovir (Fig. 8) apresenta as principais bandasde absorção, estando de acordo com o apresen-tado na literatura 19. Na região de 2500 a 3700cm–1 observa-se uma banda larga, a qual corres-ponde ao estiramento vibracional referente aogrupo OH presente na molécula. As bandas em3382 e 3332 cm–1 referem-se aos estiramentosvibracionais das aminas primárias e secundárias.Assim como a banda de alta intensidade em1584 cm–1 corresponde às vibrações de R-NH. Abanda fraca de amina secundária situa-se em2912 cm–1. O grupo CH tem sua banda caracte-rística em 1346 cm–1, e os grupos metileno em1468 cm–1. Na região de 1584 cm–1 e 1036 cm–1,estão representadas as bandas referentes à ami-da e ao álcool primário, respectivamente.

No espectro infravermelho da quitosana (Fig.8), observa-se uma banda na região de 3437cm–1, referente à banda de estiramento da li-gação –OH, de modo que as bandas em 2924 e2881 cm–1 são bandas de estiramento C-H. Asbandas em 1656 e 1537 cm–1 referem-se ao esti-ramento C=O de amida secundária e as vi-brações de deformação N-H de amina primária,respectivamente. Na região de 1375 cm–1 ocorrea vibração referente ao CH do grupo CH3, dafunção acetamida remanescente na cadeia poli-mérica, em 1086 cm–1, ocorre o estiramentoC–O de álcool primário. O espectro IV das mi-cropartículas é praticamente uma sobreposiçãodos espectros isolados do aciclovir e da quitosa-na, indicando que não ocorre nenhuma inte-ração química entre os mesmos.

O perfil de liberação (Figura 9) apresentadopara as micropartículas indicou que o aciclovirfoi liberado por um período de 120 min, o quecaracteriza um perfil de liberação prolongada.Assim, pode-se considerar que o revestimentoformado pela quitosana em torno do aciclovir

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foi eficiente para promover uma liberação modi-ficada do fármaco. A farmacopéia americana(USP 26) preconiza que as cápsulas de aciclovirexistentes no mercado farmacêutico liberam ofármaco por um período de até 45 min 20.

As micropartículas em ambos os valores pH1,2 e 6,8 apresentaram como o mecanismo en-volvido na liberação do fármaco o modelo pro-posto por Higuchi, que correlaciona a raiz qua-drada do tempo versus a porcentagem de fár-maco dissolvida, que de forma geral é um mo-delo adequado a formulações destinadas a libe-rar o fármaco lentamente. Os coeficientes decorrelação obtidos estão expostos na Tabela 1.

Ordem da pH 1,2 pH 6,8liberação

Ordem zero 0,8819 0,8684Primeira ordem 0,9395 0,9312

Higuchi 0,9434 0,9331

Tabela 1. Coeficientes de correlação obtidos atravésdos diferentes modelos matemáticos aplicados.

CONCLUSÕESOs ensaios de DSC, DRX e MEV indicaram

que ocorreu a formação de sistemas amorfos, oque do ponto de vista tecnológico é interessan-te, pois a biodisponibilidade de fármacos estádiretamente relacionada à solubilidade dos mes-mos em meio aquoso. Os espectros IV nãoapresentaram a ocorrência de interações quími-cas entre o aciclovir e a quitosana. A curva TGapontou que a estabilidade térmica das micro-partículas não sofreu alterações significativas emrelação aos componentes isolados. A formu-lação desenvolvida promoveu uma liberação di-ferenciada do aciclovir seguindo o modelo pro-posto por Higuchi. As micropartículas também

Figura 9. Perfil de liberação das micropartículas empH 6,8 e 1,2.

apresentaram uma considerável eficiência deencapsulação, o que torna o seu desenvolvi-mento e a investigações de outros sistemas mi-croparticulados envolvendo diferentes concen-trações fármaco/polímero promissoras.

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