desempenho e homogeneidade de cultivos em meio sólido de · coeficiente respiratório (rq, ) em...

MARIANA DE PAULA EDUARDO

Desempenho e Homogeneidade de Cultivos em Meio Sólido de

Monascus sp. em Biorreator do Tipo Tambor com Agitação Interna:

Efeitos do Padrão de Agitação.

São Paulo

2010





Tese apresentada à escola Politécnica da

Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Doutor em Engenharia

São Paulo

2010





Tese apresentada à escola Politécnica da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Engenharia

Área de concentração: Engenharia Química

Orientador: Profa Dra Beatriz Vahan Kilikian

São Paulo

2010

“Embora ninguém possa voltar atrás e

fazer um novo começo, qualquer um pode

começar de novo e fazer um novo fim.”

(Chico Xavier)

AGRADECIMENTOS

A Profa. Dra. Beatriz Vahan Kilikian, pelo incentivo, amizade, orientação e

dedicação.

Aos Professores Aldo, Andreas, Maria Cândida e Pedro pelo apoio, sugestões e

amizade.

Aos funcionários do laboratório, Andrea, Flávia, Orlinda e Valter pela ajuda e

colaboração em todos os momentos.

Aos funcionários do departamento, Alexandre, Antonio Carlos, Elisete, Graça,

Tadeu e Terezinha. Às bibliotecárias Lúcia e Fátima pelo auxílio.

Aos meus amigos Bianca, Bruno, Cadu, Cintia, Dani, Danielle, Felipe, Iara,

Isabela, Juliana, Kelly, Marcos, Marilena, Paula, Roberta, Saul, Thiago e todos

aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização do trabalho.

Ao meu amigo José Paulo pela ajuda em todos os momentos e pela amizade.

Ao meu marido Rodrigo e meu filho pela compreensão, paciência e amor.

À minha família por todo apoio e incentivo.

À Fapesp pela concessão de bolsa de estudos e apoio financeiro no projeto.

À todas as pessoas e instituições que de alguma forma, direta ou indiretamente,

colaboraram para a realização deste trabalho.

RESUMO

Este trabalho teve por objetivo verificar a influência da agitação no cultivo em meio

sólido, FES, quanto a crescimento microbiano, homogeneização do meio e remoção de

calor. As correlações obtidas contribuem na definição de critérios para ampliação de escala

da FES. O modelo adotado foi o cultivo do fungo Monascus sp. em arroz.

Os experimentos foram conduzidos em reator tubular horizontal de 40 l, com

agitação interna intermitente, camisa de resfriamento e vazão de ar de 2 l.min-1.Kgms-1. Os

cultivos foram realizados com base num planejamento fatorial rotacional: 12 a 60 rotações

das pás em 24 horas; 2 a 12 horas de intervalo entre os eventos de agitação. A intensidade

do crescimento celular foi considerada com base no consumo de O2, produção de CO2,

concentrações de proteína e ergosterol.

O consumo de O2 apresenta correlação de 81% com os padrões de agitação sendo

que tanto o número de rotações quanto o intervalo entre os eventos de agitação influenciam

negativamente o crescimento celular assim estimado. Por outro lado, a máxima velocidade

de consumo de oxigênio, OUR, obtida por volta de 24 horas, em cultivos com menores

intervalos entre os eventos de agitação, indica efeito positivo da agitação sobre a velocidade

do crescimento de fungos em superfície, enquanto não ocorre compactação do meio de

cultivo. Conclui-se, portanto, que a natureza do substrato empregado, arroz, cuja reologia é

sensivelmente alterada pela agitação, contribuiu de modo deletério à respiração celular e

que a adoção de reatores com agitação na FES, requer substrato com baixo teor de amido e

elevado teor de fibras.

As medidas de ergosterol apresentaram correlação de 85% com os padrões de

agitação mostrando que o intervalo entre os eventos de agitação é o fator com maior

impacto nesta resposta e os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação e

maior número de voltas apresentaram concentrações aproximadamente dez vezes maiores

de ergosterol em relação aos outros ensaios.

Os coeficientes de variação de umidade em cinco pontos do reator representam a

homogeneidade pois relacionam-se com os padrões de agitação com correlação de 95%.

Palavras-chave: Fermentação em meio sólido. Biorreator. Monascus.

Respiração. Agitação. Homogeneidade.

ABSTRACT

This investigation aimed to verify the influence of mixing microbial growth, medium

homogenization and heat removal within a solid state fermentation (SSF) bioreactor. The

correlations obtained will help to establish the scale-up criteria. The model system involved

the cultivation of the fungi Monascus sp. on rice. The assays were performed in a 40 l

bioreactor under internal intermittent mixing with a cooling jacket and an air flux of 2 l.min-

1kgdm-1. The cultivations followed a rotational factorial plan: 12 to 60 paddle revolutions in 24

hours; with an interval of 2 to 12 hours between mixing events.

Cellular growth rate was estimated by O2 consumption, CO2 production, and protein

and ergosterol concentrations. The O2 consumption showed an 81% correlation with the

revolutions pattern, and both the number of revolutions and interval between mixing events,

influenced cell growth negatively. The maximal oxygen consumption rate (OUR) was

reached after about 24 hours in cultivations submitted to shorter intervals between mixing

events which indicates a positive effect of shaking on the fungal growth rate on the particle

surface, as long as no medium compaction occurs. Thus it was concluded that the kind of

used substrate (rice), whose reology was perceptively modified by the mixing process, acted

harmfully on microbial respiration. If mixing is to be used in SSF bioreactors, the substrate

used should have a low starch content and a high fiber content

Ergosterol content showed an 85% positive correlation with the revolution pattern,

indicating that the interval between mixing events is the most important factor. Assays

performed with longer intervals between mixing events and greater numbers of turns

achieved about 10 times higher ergosterol concentration than the others

The coefficient of variation of the moisture at five sites of the reactor represents the

homogeneity, since they are related to the revolution patterns by 95%.

Key-words: Solid state fermentation. Bioreactors. Monascus. Respiration. Agitation.

Homogeneity.

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Composição centesimal do arroz (adaptação de TABELA BRASILEIRA

DE COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS, 2010) .......................................... 26

Tabela 2 - Resumo dos pontos monitorados no biorreator........................................ 38

Tabela 3 - Condições dos ensaios preliminares do conjunto I, na ordem de

execução. ............................................................................................... 43

Tabela 4 - Variáveis e níveis do Conjunto de Ensaios II ........................................... 44

Tabela 5 - Conjunto II de ensaios propostos em planejamento fatorial. .................... 44

Tabela 6 - Variáveis e níveis do conjunto III .............................................................. 45

Tabela 7 - Conjunto III de ensaios propostos em planejamento fatorial composto

rotacional. ............................................................................................... 45

Tabela 8 - Resultados ensaios do conjunto I de experimentos ................................. 61

Tabela 9 - Balanço de nitrogênio nos cultivos com suplementação de meio ............ 65

Tabela 10 - Consumo total de oxigênio, OU, em 138 horas de cultivo. ..................... 76

Tabela 11 - Análise de variância para consumo de oxigênio total. ............................ 77

Tabela 12 - Coeficientes de regressão estimados para o consumo de oxigênio total

............................................................................................................... 77

Tabela 13 - Velocidade de consumo de oxigênio em 138 horas de cultivo. .............. 81

Tabela 14 - Análise de variância para OUR máximo ................................................. 81

Tabela 15 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo ................... 82

Tabela 16 - Produção de dióxido de carbono em 138 horas de cultivo. .................... 85

Tabela 17 - Análise de variância para a variável resposta produção de CO2 ............ 85

Tabela 18 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo ................... 86

Tabela 19 - Medidas de Concentração de proteína e balanço de nitrogênio. ........... 90

Tabela 20 - Análise de variância para a concentração de proteína ........................... 92

Tabela 21- Dois métodos de extração de ergosterol ................................................. 93

Tabela 22 - Teor de ergosterol após 138 horas de cultivo ........................................ 96

Tabela 23 - Análise de variância para variável resposta teor de ergosterol .............. 96

Tabela 24 - Coeficientes de regressão estimados para concentração de ergosterol 97

Tabela 25 - Parâmetros da respiração calculados pelos modelos .......................... 100

Tabela 26 - Volume de água (mL) adicionado em cada ensaio para reposição de

água evaporada. .................................................................................. 103

Tabela 27 - Razão entre produção de pigmentos vermelho e laranja para os ensaios

do planejamento fatorial e os ensaios teste 1 e 3 ................................ 110

Tabela 28 - Coeficientes de variação médios (em função do tempo) entre os pontos

amostrados (a, b, c, d e e) do reator. ................................................... 121

Tabela 29 - Análise de variância para variável resposta coeficiente de variação

médio da umidade ................................................................................ 122

Tabela 30 - Coeficientes de regressão estimados para coeficiente de variação médio

da umidade ........................................................................................... 122

Tabela 31 – Dados do balanço de energia nos cultivos em reator .......................... 127

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - (A) Hifas de Monascus ruber cultivadas em meio líquido, observados em

microscópio, aumento de 1000x, (B) Monascus ruber em arroz,

observado em microscópio, aumento de 100x (fotos tiradas no

LEB/DEQ/EPUSP). ................................................................................... 23

Figura 2- Preparo de estoque de células congeladas para os cultivos em reator. .... 36

Figura 3 - Esquema do biorreator para fermentação semi-sólida do

LEB/DEQ/EPUSP ..................................................................................... 38

Figura 4 - Esquema lateral e frontal do reator com indicação dos diferentes pontos

de amostragens axial (A,B e C) e radial (D e E). ...................................... 39

Figura 5 - Umidades em base úmida medidas em estufa e no analisador de umidade

Ohaus, para amostras de sílica. ............................................................... 48

Figura 6 - Hidrólises ácidas de meio fermentado ao longo do cultivo. ...................... 49

Figura 7 - Determinações de AR nos ensaios testes 1, 2 e 3 .................................... 50

Figura 8 - Determinação de ART ............................................................................... 51

Figura 9 - Métodos de análise de ART. ..................................................................... 52

Figura 10 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □)

e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 1 em função do tempo

de cultivo (B) Análises químicas e físicas do meio fermentado.. .............. 55

Figura 11 - Fotos do meio em fermentação do ensaio 1 em diferentes tempos do

cultivo- (A) 67 horas, (B) 139 horas, (C) 185 horas. ................................. 56

Figura 12- (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □)


de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado.. ............................ 57

Figura 13- Fotos do meio em fermentação do ensaio 2 em diferentes tempos do

cultivo- (A) 45 horas, (B) 90 horas, (C) 187 horas. ................................... 58




Figura 15 - Fotos do meio em fermentação do teste 3 em diferentes tempos do

cultivo- (A) 48 horas, (B) 114 horas, (C) 228 horas. ................................. 60




Figura 17 - Aspecto do substrato do ensaio 1 após 24 (A), 48 (B), 96 (C) e 144 horas

(D) de cultivo. ........................................................................................... 62

Figura 18 - Aspecto do substrato do ensaio do ponto central no tempo inicial (A),

após 24 (B), 48 (C) e 72 horas (D). .......................................................... 63

Figura 19 - Redução de massa seca em ensaio com suplementação de N. ............. 64

Figura 20 - Massa total de proteína em ensaio de suplementação. .......................... 64

Figura 21 - Identificação dos experimentos com base nos fatores de agitação

definidos no planejamento fatorial rotacional............................................ 66

Figura 22 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊), produção de CO2 (CER, □) e

coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos

ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (ensaios C, H e

D). ............................................................................................................. 67

Figura 23 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e


ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios com intervalo médio (7 horas)

entre os eventos de agitação (ensaios E e F). ......................................... 68

Figura 24 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e


ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação (ensaios A, G e

B). ............................................................................................................. 69

Figura 25 - Esquema do reator e dos pontos de monitoramento da temperatura no

meio sólido (TFS-01, TFS-02, TFS-03 e TFS-04), do ar de entrada (TAR-

01), da fase gasosa (TFG-02) e de entrada e saída da água na camisa

(TAC-01 e TAC-02) .................................................................................. 71

Figura 26 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de

cultivo nos ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação

(ensaios C, H e D).. .................................................................................. 72


cultivo nos ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios com intervalo

médio (7 horas) entre os eventos de agitação (ensaios E e F).. .............. 73


cultivo nos ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação

(ensaios A, G e B).. .................................................................................. 74

Figura 29 - Distribuição dos resíduos de consumo total de oxigênio ........................ 78

Figura 30 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do consumo de oxigênio em

função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos

de agitação. .............................................................................................. 79

Figura 31 - Distribuição dos resíduos de velocidade máxima observada de consumo

de oxigênio ............................................................................................... 83

Figura 32 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da velocidade de oxigênio

máximo em função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre

os eventos de agitação. ............................................................................ 84

Figura 33 - Distribuição dos resíduos para a produção de dióxido de carbono. ........ 87

Figura 34 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da produção de CO2 em

função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos

de agitação. .............................................................................................. 88

Figura 35 - (A) Massa total de proteína em função do tempo de cultivo para os

ensaios (B) Massa total média de proteína em função do tempo de cultivo

para os ensaios no ponto central. As barras representam o desvio padrão

................................................................................................................. 91

Figura 36 - Correlação entre a massa de ergosterol e a massa seca de células. ..... 93

Figura 37 - Concentração específica de ergosterol em relação à massa de células

durante o cultivo em meio líquido. ............................................................ 94

Figura 38 - (A) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo para os

ensaios.; (B) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo

para os ensaios no ponto central. ............................................................. 95

Figura 39 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para a

concentração de ergosterol ...................................................................... 98

Figura 40 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da concentração de

ergosterol em função do número de rotações em 24 horas e intervalo

entre os eventos de agitação.................................................................... 99

Figura 41 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com maior intervalo

entre os eventos de agitação.................................................................. 103

Figura 42 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios no ponto central F.

............................................................................................................... 104

Figura 43 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com menor

intervalo entre os eventos de agitação. .................................................. 104

Figura 44 - Concentração de ART em função do tempo de cultivo ......................... 105

Figura 45 - Concentração de AR em função do tempo de cultivo, ( ) ensaio A; ( )

ensaio B; ( ) ensaio C; (-) ensaio I (ponto central) e ( ) ensaio G. .......... 105

Figura 46 - Pigmentos vermelhos (absorbância a 500nm) em função do tempo para

(A) ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (B) cultivos

no ponto central e com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de

agitação (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de agitação

............................................................................................................... 107

Figura 47 - Pigmentos laranja (absorbância a 400nm) em função do tempo para (A)

ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (B) cultivos no

ponto central e com intervalo médio ( 7 horas) entre os eventos de

agitação (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de agitação

............................................................................................................... 108

Figura 48 - Pigmentos em função do tempo para os ensaios teste 1 e ensaio teste 3.

............................................................................................................... 110

Figura 49: Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com

maiores intervalos entre os eventos de agitação, C, H e D em diferentes

pontos do reator ..................................................................................... 112

Figura 50 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com

intervalo médio entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto

central (I, J e K) em diferentes pontos do reator. .................................... 113

Figura 51 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com

menores intervalos entre os eventos de agitação, A, G e B em diferentes

pontos do reator ..................................................................................... 114

Figura 52 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com

maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes

pontos do reator ..................................................................................... 115


intervalos médios entre os eventos de agitação (E e F) em diferentes

pontos do reator ..................................................................................... 116


maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes

pontos do reator. .................................................................................... 117

Figura 55 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em

função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos

de agitação em diferentes pontos do reator. .......................................... 118


função do tempo para os ensaios com intervalos médios entre os eventos

de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K)em diferentes

pontos do reator. .................................................................................... 119


função do tempo para os ensaios com menores intervalos entre os

eventos de agitação em diferentes pontos do reator. ............................. 120

Figura 58 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para o

coeficiente de variação médio da umidade ............................................ 123

Figura 59 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do coeficiente de variação

médio da umidade em função do número de rotações em 24 horas e

intervalo entre os eventos de agitação. .................................................. 124

Figura 60 - Diferenças em relação à temperatura de ”set point” em função do tempo.

............................................................................................................... 125

Figura 61 - Calor removido e gerado nos ensaios com maiores intervalos entre os

eventos de agitação em função do tempo de cultivo .............................. 128

Figura 62 - Calor removido e gerado nos ensaios com intervalo médio (7 horas) entre

os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K)em

função do tempo de cultivo ..................................................................... 129

Figura 63 - Calor removido e gerado nos ensaios com menores intervalos entre os

eventos de agitação em função do tempo de cultivo .............................. 130

ÍNDICE DE SÍMBOLOS

µ Velocidade específica de crescimento

ρágua Densidade da água

ρar Densidade do ar seco

AR Açúcares redutores

ART Açúcares redutores totais

BSA Soro de albumina bovina

c Calor específico (J/kg.K).

CE Produção de dióxido de carbono (mol)

CER Velocidade de produção de dióxido de carbono

CV Coeficiente de variação

DEQ Departamento de engenharia química

DNS Ácido dinitrossalicílico

EPUSP Escola Politécnica da Universidade Estadual de São Paulo

F Vazão

FES Fermentação no estado sólido

GOD Glicose oxidase

he Entalpia do ar de entrada

hs Entalpia do ar de saída

Hv Calor latente de vapor de água a 0°C

I Intervalo entre os eventos de agitação

Jcamisa Calor removido pela camisa do reator (W).

Jevap Calor removido por evaporação (W).

LEB Labpratório de Engenharia Bioquímica

mo Coeficiente de manutenção

NR Número de rotações

OU Consumo de oxigênio

OUR Velocidade de consumo de oxigênio (mol O2.h-1)

PBa Pressão barométrica

PH2O Pressão de vapor da água

R Constante universal dos gases

Rmet Calor produzido pelo metabolismo do fungo (W).

RQ Coeficiente respiratório

T Temperatura

TAC Temperatura da água da camisa

TAR Temperatura do ar

TFG Temperatura da fase gasosa

TFS Temperatura da fase sólida

Ts Temperatura da água na saída da camisa, °C.

U Unidade de absorbância

UA Umidade absoluta do ar, kg de água / kg de ar seco.

YCO2 Fração molar de CO2 (na entrada e na saída do reator)

YO2 Fração molar de O2 (na entrada e na saída do reator)

Yx/o Fator de conversão de oxigênio a células

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

ÍNDICE DE TABELAS

ÍNDICE DE FIGURAS

ÍNDICE DE SÍMBOLOS

1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 20

2. OBJETIVOS ....................................................................................... 22

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 23

3.1. Monascus sp ......................................................................................... 23

3.2. Arroz ...................................................................................................... 25

3.3. Fermentação no estado semi-sólido .................................................. 26

3.4. Estimativa de crescimento em FSS .................................................... 30

3.5. Reatores para FES ............................................................................... 31

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................. 35

4.1. Microrganismo: armazenamento e inóculo ........................................ 35

4.2. Meios de cultivo ................................................................................... 36

4.2.1. Tratamento térmico do substrato para os cultivos em reator ......... 36

4.3. Inóculo do reator .................................................................................. 37

4.4. Biorreator .............................................................................................. 37

4.5. Etapas dos ensaios em biorreator ...................................................... 39

4.6. Metodologia Analítica .......................................................................... 40

4.6.1. Umidade......................................................................................... 40

4.6.2. Extrato etanólico ............................................................................ 40

4.6.3. Pigmentos vermelhos .................................................................... 40

4.6.4. Açúcares redutores (AR), açúcares redutores totais (ART) ........... 41

4.6.5. Proteína total .................................................................................. 41

4.6.6. Análise de ergosterol ..................................................................... 42

4.6.7. Análise do gás de saída do reator ................................................. 42

4.7. Cultivos ................................................................................................. 43

4.8. Balanços ............................................................................................... 45

4.8.1. Balanço de entalpia no reator ........................................................ 45

4.8.2. Cálculo do calor metabólico gerado ............................................... 46

4.8.3. Cálculo do calor removido pela camisa ......................................... 46

4.8.4. Cálculo do calor removido por evaporação .................................... 47

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 48

5.1. Padronização das metodologias de análise ...................................... 48

5.1.1. Umidade......................................................................................... 48

5.1.2. Hidrólise ácida para dosagem de ART .......................................... 49

5.1.3. Determinação de ART e AR........................................................... 50

5.1.4. Extração de pigmentos .................................................................. 52

5.2. Mudanças estruturais no reator .......................................................... 53

5.3. Ensaios para definição do tratamento térmico do substrato no

reator 54

5.4. Ensaios preliminares em reator – Conjunto I .................................... 55

5.4.1. Teste 1 ........................................................................................... 55

5.4.2. Teste 2 ........................................................................................... 56

5.4.3. Teste 3 ........................................................................................... 58

5.4.4. Teste 4 ........................................................................................... 60

5.4.5. Ensaios em reator - Conjunto II ..................................................... 62

5.5. Ensaio complementar com suplementação ....................................... 63

5.6. Ensaios em reator ................................................................................ 66

5.6.1. Desempenho do processo de cultivo em função da agitação ........ 66

5.6.1.1. Crescimento celular ............................................................... 75

5.6.1.2. Análises de Umidade, ART e Produção de Pigmentos ....... 102

5.6.2. Homogeneidade ........................................................................... 111

5.6.3. Balanço de energia térmica ......................................................... 126

6. CONCLUSÕES ................................................................................ 132

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 136

Introdução

20

1. INTRODUÇÃO

Fermentação no estado sólido, FES, é definida como o crescimento

microbiano em partículas sólidas na ausência de água livre (MOO-YOUNG;

CANNEL, 1980; PANDEY, 2003; MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006). O

substrato deve possuir água suficiente para garantir o crescimento microbiano.

Quando a capacidade de saturação do substrato sólido é excedida, ocorre água

livre, caracterizando a fermentação semi-sólida (FSS). Os cultivos em meio sólido

são mais restritivos quanto aos tipos de microrganismos capazes de se desenvolver,

recaindo praticamente nos bolores. No caso da fermentação semi-sólida, como há

água livre, bactérias e leveduras também podem se desenvolver, o que torna o

processo mais susceptível a contaminações.

FSS oferece várias oportunidades para o processamento e aproveitamento de

resíduos agro-industriais como casca e bagaço de mandioca, bagaço de cana e de

frutas, utilizados em bioprocessos para a produção de etanol, enzimas, ácidos

orgânicos, aminoácidos e metabólitos secundários biologicamente ativos. O Brasil

por ser uma das mais importantes economias agrícolas do mundo gera resíduos que

podem ser usados como substrato para produção de substâncias de alto valor

agregado.(SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003). Segundo Pandey (2003), processos

de fermentação semi-sólida resultam em menor quantidade de água residual e

menos danos ao meio ambiente do que fermentações submersas, minimizando os

problemas de disposição de resíduos.

Por outro lado, entre as desvantagens da FSS, pode-se citar a dificuldade

para remover o calor e CO2 gerados metabolicamente durante o crescimento,

sobretudo em escala industrial, devido à baixa capacidade de condução de calor do

substrato e da impossibilidade de submeter o cultivo a uma agitação vigorosa, que

pode causar aglomeração do meio ou desprendimento do microrganismo da

superfície do substrato (DOELLE ;MITCHELL; ROLZ, 1992).

Um grande número de patentes (ISI WEB OF KNOWLEDGE, 2006) e

trabalhos sobre fermentação semi-sólida tem sido publicado, enfocando

desenvolvimento e projeto de biorreatores, modelagem e produção de produtos de

interesse comercial, tais como alimentos, metabólitos primários e secundários (ácido

Introdução

21

cítrico, β-galactosidase, enzimas, pigmentos).

A despeito da produção de metabólitos primários ou secundários – produção

específica em relação à biomassa ou massa de meio - ser freqüentemente maior em

cultivos semi-sólidos em comparação a cultivos submersos, verifica-se limitada

aplicação industrial desses processos, sobretudo devido à incipiente tecnologia

quanto a reatores e critérios de ampliação de escala. Muitos processos de

fermentação semi-sólida em escala industrial são realizados em pequenos frascos,

sacos ou bandejas, para os quais a ampliação de escala resume-se ao aumento da

quantidade destes frascos, sacos ou bandejas. No caso de biorreatores, a ampliação

de escala deve considerar a capacidade de remoção do calor, transferência de O2 e

manutenção da umidade do meio (RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH,

2003).

Nesta tese estudou-se o efeito da agitação nos cultivos em meio sólido, foi

usado o cultivo de Monascus sp. em arroz e produção de metabólitos secundários

como estudo de caso. A produção de pigmentos orgânicos de cor vermelha

(rubropuntamina e monascorubramina) por Monascus sp. apresenta interesse devido

à sua aplicação na indústria de alimentos, uma vez que, atualmente, grande parte

dos corantes utilizados são importados. Além disso, pigmentos de Monascus podem

ser usados em substituição parcial ou total dos colorantes utilizados em produtos

cárneos (nitritos e nitratos), os quais dão origem a nitrosaminas (substâncias

cancerígenas) (BAKOŠOVÁ et al., 2001).

Espécies de Monascus produzem outros metabólitos, além dos pigmentos,

tais como: mevinolina (molécula de ação anticolesterolêmica), ácido dimerúmico

(antioxidante que retarda o envelhecimento e melhora a capacidade de memória) e

antibióticos (LIN et al., 2008). Por outro lado, Monascus sp. produz uma molécula

nefrotóxica, a citrinina, cuja produção é indesejável em alimentos. Para os pigmentos

vermelhos produzidos por Monascus sp., verificaram-se valores de absorbância (U)

da ordem de 10 a 15 vezes maiores na fermentação semi-sólida em comparação

aos cultivos submersos (OROZCO; KILIKIAN, 2008).

Objetivos

22

2. OBJETIVOS

O objetivo geral foi verificar a influencia da agitação em cultivo no estado

sólido visando o crescimento de Monascus sp. em arroz e produção de metabólitos

secundários. Para tanto, procurou-se atingir os seguintes objetivos específicos:

• Indicação das variáveis de operação do biorreator com influência significativa

no estabelecimento da homogeneidade térmica e química do meio.

• Estabelecer, através de análise fatorial, os parâmetros mais importantes no

crescimento,remoção de calor e homogeneidade de reatores com agitação.

• Determinação da cinética de crescimento, consumo de substrato e produção de

metabólitos secundários sob diferentes condições de agitação do substrato.

• Realizar balanços de massa e de energia, nos cultivos em biorreator.

Revisão bibliográfica

23

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Monascus sp

Monascus sp. são classificados como fungos filamentosos e são pertencentes a

classe dos Ascomicetos, isto é, que produzem esporos em corpos de frutificação

específicos chamados ascos. Os fungos do gênero Monascus são divididos em 24

espécies (THE DICTIONARY OF THE FUNGI, 2006). O fungo é constituído por

hifas, formadas por células longas e ramificadas de cerca de 5 µm de espessura

que, em conjunto com outras hifas formam o micélio. A reprodução assexuada

ocorre via formação de conídios e a reprodução sexuada envolve a formação dos

ascos. As células são típicamente constituídas por uma parede tubular de quitina e

β-Glicanos e são dividas por septos que dão estabilidade às hifas, já que evitam a

possibilidade de perda de citoplasma no caso de haver algum dano ou ruptura da

membrana celular (CARELS;SHEPHERD, 1975). Macroscopicamente, fazem parte

do grupo dos bolores, por apresentarem colônias filamentosas conforme ilustrado na

figura 1.

Figura 1 - (A) Hifas de Monascus ruber cultivadas em meio líquido, observados em microscópio, aumento de 1000x, (B) Monascus ruber em arroz, observado em microscópio, aumento de 100x (fotos tiradas no LEB/DEQ/EPUSP).

Historicamente, Monascus sp. tem sido utilizado em diversos países, sobretudo

China e Japão, para produção de vinho de arroz, queijo vermelho de soja e Anka

(arroz vermelho), através de cultivos semi-sólidos em arroz (LIN, 1973). Nestes

(A) (B)


24

países, produtos preparados com Monascus sp. são consumidos como alimentos

funcionais, para a prevenção de problemas gástricos e intestinais, controle dos

níveis de colesterol, estimulante da circulação sangüínea e da digestão.

Na Ásia, enzimas e metabólitos secundários de fungos são produzidos em

larga escala por fermentação em meio sólido, os processos variam de região para

região e são passados de pai para filho (HOLKER; LENZ, 2005)

O metabolismo dos microrganismos pode ser dividido em primário e

secundário. O metabolismo primário envolve as vias de síntese de produtos

intermediários de baixa massa molecular objetivando a produção de energia para as

reações de biossíntese de macromoléculas essenciais para a estrutura e o

funcionamento celular. O metabolismo secundário em fungos compreende vias

síntese de compostos que, a princípio, não apresentam papel essencial ao

crescimento e que são sintetizados a partir de precursores e energia gerados ao

longo do metabolismo primário (PAZOUKI; PANDA,2000).

O Monascus sp., bem como outros fungos filamentosos, utilizam

preferencialmente carboidratos como fonte de carbono e energia e produzem

compostos como etanol e enzimas e metabóilitos secundários pela via policetídica

(JUZLOVA; MARTINKOVA; KREN, 1996). Várias destas moléculas são de interesse

comercial como pigmentos para alimentos (rubropuntamina e monascorubramina),

anticolesterolêmico (mevinolina), antioxidantes, anti-hipertensivos, antibióticos (LIN

et al., 2008).

As principais vias glicolíticas para a utilização de carboidratos como fonte de

energia em fungos são a via de Embden-Meyerhof e a via das pentoses. As

moléculas de piruvato geradas nas vias glicolíticas podem seguir basicamente dois

caminhos (1) ciclo de Krebs, que degrada o piruvato a unidades de CO2 com

simultânea geração de coenzimas reduzidas do tipo NADH e FADH2 e precurssores

da síntese de aminoácidos (2) sob condições limitadas de oxigênio, o Monascus

ruber apresenta metabolismo respirofermentativo verificado através da produção de

etanol (HAJJAJ et al., 1999).

Dentre os metabólitos secundários produzidos pelo gênero Monascus, os

pigmentos são os mais estudados por seu potencial de aplicação na indústria de

alimentos (BAKOŠOVÁ et al., 2001) e são conhecidas duas moléculas vermelhas

(rubropuntamina e monascorubramina), duas moléculas de cor laranja

(rubropuntatina e monanascorubrina) e duas moléculas amarelas (monascina e


25

ancaflavina). Os pigmentos laranjas são sintetizados através da via dos policetídeos

e não são hidrossolúveis. Reações com aminoácidos levam à formação dos

pigmentos vermelhos, que são hidrossolúveis (HAJJAJ et al.,2000).

A produção dos pigmentos em Monascus sp. pode ocorrer simultaneamente à

produção de citrinina (monascidina A), molécula nefrotóxica, que não é produzida

por todas as espécies de Monascus e pode ter sua produção reduzida sob certas

condições de cultivo.

Atualmente, a principal molécula de interesse produzida por Monascus sp. é a

mevinolina, também conhecida como lovastatina que é um anticolesterolêmico por

ser um inibidor competitivo da enzima limitante da biossíntese do colesterol

(CHANG, 2002, VALERA, 2006, MIYAKE, 2006, PANDA, 2009)

Tradicionalmente Monascus sp. é cultivado em arroz, produto que é

amplamente consumido nos países asiáticos. Os pigmentos de Monascus,

entretanto, são proibidos no ocidente para uso como aditivo alimentar por causa da

ocorrência da citrinina. No Brasil é permitida a venda de um medicamento de nome

Monaless® que é indicado para redução dos níveis de colesterol sanguíneo e é

constituído exclusivamente de arroz fermentado por Monascus purpureus.

3.2. Arroz

O arroz (Oryzae sativa) é originário do sudeste da Ásia e as mais antigas

referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca de 5.000 anos.

O arroz foi levado para Europa pelos árabes entre os séculos VII e VIII e os

espanhóis o trouxeram para as Américas (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2010). A

tabela 1 apresenta a composição centesimal do arroz.

A produção de pigmentos por Monascus sp. em arroz é superior a outros

substratos sólidos (JOHNS; STUART, 1991) provavelmente por causa de sua

composição ou de sua estrutura microscópica que permite a penetração das hifas e

difusão dos pigmentos (EVANS; WANG, 1984 ; JUZLOVA; MARTINKOVA; KREN,

1996).


26

Tabela 1 – Composição centesimal do arroz (adaptação de TABELA BRASILEIRA DE COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS, 2010)

Valor por 100g (base úmida) Valor por 100g (base seca) Umidade (g) 12,33 -

Energia (kcal) 346 - Energia (kJ) 1.450 - Proteínas (g) 6,73 7,70

Lipídios Totais (g) 0,89 1,02 Carboidratos Totais (g) 79,57 90,80

Cinzas (g) 0,48 0,55 Fibra alimentar total 1,69 1,90

3.3. Fermentação no estado semi-sólido

A Fermentação em Estado Sólido (FES) tradicionalmente é definida como o

processo no qual microrganismos crescem em substrato insolúvel em água na

ausência de água livre (MOO-YOUNG; CANNEL, 1980). Neste tipo de cultivo, a

umidade necessária para o crescimento microbiano existe em estado absorvido ou

complexado na matriz sólida o que favorece a transferência de oxigênio para o meio,

pois o microrganismo permanece em contato direto com uma corrente de ar

(RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH, 2003). Quando ocorre água livre, o

cultivo é definido como Fermentação em Estado Semi-Sólido (FSS) (PANDEY, 2003

; COUTO; SANROMÁN, 2006). Há ainda outras definições de fermentação. De

acordo com Auria et al. (1993), o cultivo em meio sólido é caracterizado como um

sistema de 4 fases onde a fase móvel é o ar (ou mistura de gases), a fase sólida é

composta por um suporte insolúvel em água, contendo uma fase correspondente a

uma solução de nutrientes. O microrganismo constitui a quarta fase, e cresce no

interior ou superfície do suporte insolúvel. Pandey, Soccol e Mitchell (2000) definiram

2 tipos de processos: (1) Fermentação em Substrato Sólido, em que o substrato

serve como fonte de carbono, e o microrganismo cresce na ausência de água livre e

(2) Fermentação em Estado Sólido, em que a matriz sólida serve apenas como

suporte inerte.

Substratos sólidos tradicionalmente empregados para cultivo de

microrganismos incluem uma variedade de produtos agrícolas como grãos, polpa de

frutas e resíduos agrícolas, palhas, restos florestais e bagaços. Estes substratos são


27

naturalmente ricas fontes de açúcares (amido, glicose, sacarose) e nutrientes,

muitas vezes requerendo somente a adição de água para o cultivo. Em alguns

casos, um pré-tratamento ou preparo do substrato é necessário, incluindo etapas

como:

• Redução do tamanho das partículas por moagem ou quebra;

• Hidrólise enzimática, física ou química dos polímeros de açúcar;

• Suplementação com nutrientes (fósforo, nitrogênio e elementos traço),

adequação do pH e umidade;

• Cozimento ou tratamento com vapor de água para pré-degradação da

estrutura macromolecular e eliminação de contaminantes.

A literatura tem reportado a versatilidade do uso de FES, mostrando a

possibilidade de produção de uma variedade de produtos de interesse comercial,

como o cultivo de cogumelos (BANO et al., 1996), produção de enzimas (PANDEY

et al., 1999), ácidos orgânicos (VANDENBERGHE et al., 2000), antibióticos

(GONZALEZ et al., 1988), biopesticidas (DESGRANGES et al., 1993), etc.

Para alguns produtos, a FES apresenta vantagens em relação à fermentação

submersa (FSm), como por exemplo na economia de água, produtividade elevada,

utilização de fontes de carbono baratas (resíduos agrícolas) e reduzida possibilidade

de contaminação, já que a umidade utilizada nestes cultivos é baixa e restritiva para

muitos microrganismos (PANDEY; SOCCOL; MITCHELL, 2000). Além disso,

disponibilidade restrita de água em FES pode estimular a produção de alguns

produtos específicos que não seriam produzidos na fermentação submersa

(HOLKER; HOFER; LENZ, 2004) e, em alguns casos onde os produtos podem ser

produzidos por FES ou fermentação submersa, a FES apresenta uma maior

produtividade volumétrica (MOO-YOUNG; MOREIRA; TENGERDY, 1983; SATO;

SUDO, 1999).

A FES é indicada para o crescimento de fungos filamentosos, especialmente

em situações onde pode ocorrer repressão catabólica, já que FES apresenta fontes

de carbono de mais difícil acesso em relação a cultivos submersos (FAVELA-

TORRES et al., 1998). Viniegra-González et al. (2003), cultivando Aspergillus niger

em diversas fontes de carbono em FES e FSm, mostrou que em FES não ocorre a

repressão catabólica e que o consumo de substrato e produção de biomassa é mais

eficiente neste processo. Tengerdy (1996) relata que a eficiência da produção de

celulase por FES pode ser de cem vezes em relação a cultivos submersos.


28

O cultivo em substrato sólido pode apresentar dificuldades, como a elevada

demanda de energia em caso de processos que utilizem agitação contínua.

Substratos naturais são de composição variável, proporcionando fontes de carbono

mistas e fontes complexas de nutrientes, dificultando a padronização e

reprodutibilidade do processo. A formação de gradientes de temperatura ao longo do

leito de cultivo, devido à geração de calor metabólico é um fator prejudicial, pois

altas temperaturas não são favoráveis para o crescimento dos microrganismos, bem

como para a formação do produto.

O Brasil, assim como outros países com alta produção agrícola, apresenta

potencial para o desenvolvimento da tecnologia de FES. A atividade agroindustrial

gera grande quantidade de resíduos que podem ser aproveitados como substrato de

baixo custo gerando menos impacto ambiental e produzindo compostos de maior

valor agregado como ácido cítrico, ácido giberélico, corantes e aromas, entre outros

(PANDEY; SOCCOL; MITCHELL, 2000)

A dificuldade de aplicação da tecnologia de FES em larga escala são as

limitações na transferência de massa e calor que dificultam o controle das condições

de crescimento dos microrganismos. Associado a isso, a dificuldade de modelagem

dos reatores para FES em virtude da heterogeneidade do meio se traduz em

reatores construídos de forma empírica, gerando baixa eficiência e baixo

desempenho econômico. (MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006).

A modelagem de FES passou a despertar maior interesse por volta de 1990 e,

apesar dos avanços obtidos desde então, muitos aprimoramentos são necessários

antes que os modelos sejam rotineiramente usados no projeto de reatores de FES

(MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006).

Cada modelo matemático deve considerar as variáveis relevantes do

processo que são os fenômenos de transferência de calor e massa e a cinética de

crescimento dos microrganismos. Desse modo os modelos matemáticos em dois

submodelos:

• Submodelo cinético que descreve como o organismo cresce em função das

condições ambientais (especialmente fatores como gradientes de

temperatura, gradientes de umidade e gradientes de concentração de

oxigênio).


29

• Submodelo de transferência de massa e calor que descreve como o

crescimento do microrganismo e as condições de operação afetam a

temperatura, concentração de oxigênio e a umidade do ambiente em função

do tempo e da posição dentro do reator.

Com respeito aos submodelos de transferência de massa e calor, os

mecanismos são bem descritos matematicamente por serem princípios básicos da

engenharia química tradicional, embora cada novo substrato demande a

necessidade de determinação dos parâmetros de transferência de massa e calor.

Devido à natureza sólida dos substratos, é muito difícil homogeneizar uniformemente

o leito e, como resultados, os gradientes de temperatura, água e metabólitos são

inevitáveis (ASHLEY; MITCHELL; HOWES, 1999), e geram dificuldades de aumento

de escala, principalmente associadas com a remoção do calor metabólico gerado

pelo crescimento dos microrganismos (LEKANDA; PÉREZ-CORREA, 2004).

Um aspecto pouco conhecido é a influência do crescimento modificando os

parâmetros de transferência de calor e massa devido a alterações nas propriedades

do meio. A agitação é outro parâmetro pouco descrito. Schutyser et al. (2004)

publicaram resultados de pesquisa especialmente focada em análises experimentais

e matemáticas da mistura de leitos de substratos sólidos.

Com respeito aos submodelos de cinética, as equações freqüentemente

incorporadas na modelagem do reator são inadequadas. Por exemplo, o modelo

logístico é tipicamente usado para descrever o crescimento devido a sua

simplicidade matemática. Porém esse modelo não é adequado para descrever o

efeito da variação da temperatura que ocorre no leito nos parâmetros da equação de

crescimento ou os efeitos dos danos causados pela agitação no micélio e

conseqüente redução da velocidade de crescimento ou produção de metabólitos.

Além disso, o modelo logístico não descreve a complexidade dos processos de

reação e difusão que ocorrem na micro escala e que podem influenciar o

crescimento (RAHARDJO; TRAMPER; RINZEMA, 2006). É necessário agora,

demonstrar que essas estratégias podem otimizar a performance dos processos e

melhorar os modelos matemáticos para que eles possam ser usados para

estabelecer critérios para a ampliação de escala. Outros aspectos chave em FES

são a seleção das variáveis do processo que possuem efeito sobre o mesmo, bem

como a sua otimização. Nisso incluem-se os parâmetros físico-químicos e


30

bioquímicos, tais como: tamanho de partícula, umidade inicial, pH, pré-tratamento

dos substratos, umidade relativa, temperatura de incubação, agitação, aeração,

idade e tamanho do inóculo, suplementação de nutrientes, extração do produto e

purificação do mesmo, entre outros (PANDEY, 2003). Para a otimização dessas

variáveis a utilização da metodologia de planejamento de experimentos e análise de

superfície de respostas é uma boa ferramenta e pode auxiliar na escolha das faixas

apropriadas que levam a otimização do processo (RODRIGUES; IEMMA, 2005).

Entretanto, as correlações entre as condições do meio como demanda de oxigênio,

umidade e temperatura dificultam o controle das variáveis (HOLKER; LENZ, 2005).

Um exemplo disso é a evaporação da água, através da aeração, que facilita a

retirada de calor, porém resseca o meio e conseqüentemente pode ser prejudicial ao

microrganismo. Outro exemplo é que baixas umidades dificultam o transporte de

nutrientes, porém altas umidades dificultam a difusão de oxigênio (PANDEY, 2003).

3.4. Estimativa de crescimento em FSS

A dificuldade de separar o conteúdo de células do substrato é uma grande

dificuldade na modelagem do crescimento microbiano uma vez que o crescimento

não pode ser estimado. A falta de precisão na estimativa do crescimento celular é

uma desvantagem para a evolução da pesquisa em FES em relação aos cultivos

submersos (SMITS et al., 1996).

Desgranges e colaboradores (1991) classificaram os métodos indiretos de

medida de biomassa em FES em 3 categorias, (1) determinação de constituintes

celulares, tais como quitina, ergosterol, ácidos nucléicos, glicosamina e proteínas;

(2) determinação de atividade biológica, tais como ATP, atividade enzimática,

velocidade de respiração; e (3) consumo de nutrientes.

Nenhum método indireto de estimativa de biomassa é universal para todos os

substratos e microrganismos e para cada situação deve ser escolhido qual o método

mais eficiente baseado no custo, simplicidade e precisão (ROCHE et al., 1993;

KRISHNA, 2005).

Dentre os componentes celulares, o ergosterol é um componente da

membrana que não está presente nos vegetais. Desgranges et al. (1991) e Ooijaas;

Tramper; Buitelar (1998) verificaram grande variação no conteúdo de ergosterol de


31

acordo com a idade da cultura e não recomendam o uso desta metodologia,

entretanto, Matcham; Jordan; Wood (1985) e Raimbault (1998) indicam essa medida

para a estimativa de biomassa por ser mais simples e sensível que a medida de

glicosamina.

A medida do consumo de oxigênio e da produção de dióxido de carbono é,

provavelmente, o método de estimativa de crescimento celular mais estudado pois

são medidas “online” (RAIMBAULT, 1998) e que não necessitam de amostragem.

Muitos autores propuseram modelos de estimativa de crescimento baseada

na respiração. Sato et al. (1983) fizeram a medida de biomassa baseada no

consumo de oxigênio pelo microrganismo, para o cultivo de Candida lipolytica em

FES. A medida era feita a partir de dados de velocidade de consumo de O2 (OUR),

fator de conversão de O2 a células (YX/O) e coeficiente de manutenção celular de

oxigênio (m0). Rodriguez et al. (1988) também estimaram o crescimento de

Aspergillus niger através da respiração. Esta abordagem foi posteriormente

adaptada por Maiorano (1990) para o cultivo de Aspergillus oryzae em meio sólido,

com as constantes YX/O e m0 estimadas em cultivo submerso. A maior dificuldade de

utilização desta metodologia é a determinação dos parâmetros YX/O e m0. Koutinas;

Wang; Webb (2003) usam a produção de CO2 para estimar o crescimento e apesar

de conseguirem estimar velocidade específica de crescimento compatível com

dados de literatura, 0,21 h-1, concluem que o fator de conversão de CO2 a células

(YX/CO2) varia com as condições de cultivo causando erros. Marsh et al. (1998)

sugerem que não se deve converter o oxigênio consumido em biomassa pois

consumo de oxigênio é associado ao crescimento e à manutenção e então a

correlação com a biomassa não é direta. Além disso, os modelos de estimativa se

baseiam em parâmetros determinados na temperatura ótima de crescimento o que

não ocorre na maioria dos biorreatores.

3.5. Reatores para FES

A maior parte dos trabalhos publicados em FES reportam a produção em

escala de laboratório. A ampliação de escala é desafiante por causa da formação de

gradientes de temperatura, umidade e concentração de substrato, os quais se

intensificam ao longo do cultivo e têm efeito adverso sobre o crescimento


32

especialmente em leitos estáticos mas também em leitos com agitação (HOLKER;

LENZ, 2005).

Agitação ou rotação em fermentação em meio sólido é usada para aumentar

a velocidade de transferência de massa e calor, porém forças de cisalhamento

causadas pelo movimento podem ter efeitos adversos no micélio ou na porosidade

do meio (COUTO SANROMAN, 2006).

Ocorrem muitas variações nas construções e operação dos reatores para

tentar solucionar ou minimizar os problemas relacionados à ampliação de escala de

FES. Para a escolha do modelo de reator a ser utilizado deve ser considerada a

possibilidade de monitoramento e controle dos parâmetros do processo,

características do microrganismo e do substrato e custos envolvidos

(RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH, 2003). Mitchell et al. (2004) fazem

uma revisão dos modelos difusão de oxigênio, enzimas e substrato em meio sólido

que auxiliam no entendimento de sua influência no crescimento celular e no

desempenho de reatores.

Muitos reatores podem ser utilizados em FES e baseado em sua construção e

operação podem classificados em grupos pelo tipo de aeração e pelo sistema de

agitação (MITCHELL; KRIEGER; BEROVIC, 2006):

• Biorreatores de bandejas onde o leito permanece estático e o ar é

circulado sobre a camada de substrato.

• Biorreatores de leito fixo onde o meio de cultivo permanece estático e o

ar é forçado através do leito.

• Tambores rotativos ou agitados onde o leito é continuamente ou

intermitentemente agitado e o ar é circulado em torno ou sobre o meio.

• Reatores de mistura ou leitos fluidizados onde o meio é continuamente

ou intermitentemente agitado e o ar é forçado através do leito.

Os reatores de leito fixo, tanto com aeração forçada quanto em bandejas, são

recomendados para processos em que a agitação é prejudicial ao substrato e ao

microrganismo. A simplicidade e facilidade de operação são as vantagens desse tipo

de reator (DURAND, 2003). Entretanto, em larga escala os reatores em bandejas

ocupam muito espaço e mão de obra. Já os reatores de leito fixo, principalmente

quando se visa a larga escala, têm o inconveniente de gerar gradientes térmicos e

de nutrientes e dificuldade de aeração homogênea (ASHLEY; MITCHELL; HOWES,


33

1999). A remoção de calor por evaporação pode ser um mecanismo de controle da

temperatura de cultivo, porém em leito fixo a reposição da água evaporada é difícil.

Os biorreatores do tipo tambor rotativo podem sofrer agitação contínua ou

descontínua e se comportam como bandejas no período em que estão estáticos

(MITCHELL, 2000). A agitação branda impede a formação de grumos pelo

microrganismo que se adere ao substrato (KRISHNA, 2005), além disso, apresenta

bom potencial para a transferência de calor, de umidade e de nutrientes. Por um

lado, a agitação promove trocas gasosas e remoção de calor, por outro lado, pode

perturbar o crescimento. Uma desvantagem em relação aos reatores agitados é que

a ocupação deve ser de 30% a 50% da capacidade, ou a agitação não será

eficiente. (COUTO SANROMAN, 2006).

Os reatores agitados, ou seja, com agitação interna tem a desvantagem de

demandar mais energia e provocar mais danos ao microrganismo devido às forças

de cisalhamento do que os reatores rotativos. Teng e Feldheim (2000) relataram que

a produção de pigmentos por Monascus sp. é afetada pela agitação, porém a

influência da agitação é diferente para cada tipo de pigmento. A produção de

pigmentos vermelhos é reduzida quando se aplica maior agitação enquanto que a

produção de pigmentos amarelos não é afetada.

Os reatores com agitação e aeração forçada têm a perspectiva para a

ampliação de escala uma vez que podem promover a homogeneidade térmica e

mássica e a remoção de calor e permitem a reposição de água e nutrientes. Nagel et

al (2001) estudaram a remoção de calor no crescimento de Aspergillus oryzae em

reator com agitação interna e concluiram que acima de 2 m3 de volume de meio a

remoção de calor por evaporação é crucial para manter a temperatura controlada,

pois a remoção de calor por condução é insuficiente.

Apesar do interesse em desenvolver novos modelos de reatores que atendam

as necessidades específicas dos cultivos, é reduzido o número de artigos que

estuda o efeito da agitação sobre os cultivos. O consumo de oxigênio em cultivos de

Rhizopus sp. em reator do tipo tambor rotativo de 200 l foi estudado por Marsh et al.

(1998) que o uso de aletas na construção do reator para a promoção da

homogeneidade aumenta o dano ao microrganismo. Han; Kiers e Nout (1999)

estudaram duas cepas de Rhizopus cultivadas em soja e concluíram que alguns

microrganismos são mais resistentes à agitação.


34

Prado et al. (2004) compararam a produção de ácido cítrico por Aspergillus

niger em colunas de leito fixo e reatores tipo tambor rotativo concluindo que a

produção é maior em colunas e sob condições limitadas de crescimento. Gasiorek

(2008) verifica a melhor condição de operação (agitação e aeração) de um reator

com agitação interna para cultivo de Aspergillus niger em polpa de beterraba para a

produção de ácido cítrico e também conclui que a melhor condição de crescimento

não é a que favorece a produção de ácido cítrico.

Materiais e Métodos

35

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Microrganismo: armazenamento e inóculo

O Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB/DEQ/EPUSP) possui uma

coleção de Monascus sp. (micoteca) da qual fazem parte microrganismos isolados a

partir de produtos comerciais e cepas de coleções de cultura. Na referida micoteca,

esporos das cepas são preservados através de cultivos subseqüentes em arroz. O

uso de arroz – habitat comum de Monascus sp. – tem por objetivo manter o

desempenho das cepas, sobretudo quanto à produção de pigmentos.

Para esse trabalho foi utilizada a cepa LEB A1-3 de Monascus ruber, isolada

no LEB a partir de produto comercial (MIYASHIRA, 2003).

No preparo do estoque, esporos da cepa armazenada em arroz foram

suspensos em água e inoculados em 30 g de arroz, em erlenmeyer, e cultivados por

20 dias a 300C. Foram adicionados, então, 100 ml de água sob agitação manual. A

suspensão resultante (cada 20 ml) foi utilizada para inocular 100 ml de meio

glicosado líquido, contido em erlenmeyer de 500 ml, previamente esterilizado por 20

minutos, a 121ºC. Essa suspensão foi colocada em incubador rotativo a 300 rpm e

30ºC, até surgimento de coloração alaranjada (cerca de 40 horas), resultando em

suspensão de células vegetativas, com concentração celular de cerca de 3 g.l-1. Em

seguida, 10 ml dessa suspensão inocularam novamente 100 ml de meio glicosado

líquido, em erlenmeyers de 500 ml, e seguiram para propagação das células em

incubador rotativo a 300 rpm e 30ºC. À suspensão de células assim obtida (3 g.l-1),

adicionou-se solução de glicerol a 20% (v/v), em proporções iguais, resultando

suspensão de células em glicerol a 10% (v/v) que foi colocada em tubos criogênicos

de 10 ml. Os tubos foram armazenados em ultrafreezer a – 80ºC. A figura 2 mostra o

fluxograma de preservação e preparo do estoque de microrganismos.


36

Figura 2- Preparo de estoque de células congeladas para os cultivos em reator.

4.2. Meios de cultivo

• Meio glicosado líquido: peptona (5 g.l-1); extrato de carne (3 g.l-1) e glicose

(10 g.l-1).

• Arroz polido, água suficiente para umidade de 45% (base úmida).

Os meios foram preparados com água destilada e esterilizados em autoclave

121°C, por 20 minutos.

4.2.1. Tratamento térmico do substrato para os cultivos em reator

Para cada ensaios, foram preparados seis sacos de polipropileno com 1250 g

de arroz polido cada (totalizando 7500 g para uma batelada no reator) e água

destilada suficiente para resultar 45% de umidade em base úmida. Os sacos foram

colocados em autoclave a 121 ºC por 20 minutos para esterilização e gelatinização

do amido.

Micoteca em Arroz

Geração de esporos em arroz

Crescimento em meio glicosado líquido (2 etapas)

Congelamento para estoque em solução de glicerol 10 % (v/v) a -800C

Repiques em arroz para

preservação


37

4.3. Inóculo do reator

Para preparo do inóculo dos cultivos em reator, 20 ml de suspensão de

células congeladas inoculavam 100 ml de meio glicosado líquido, a seguir os frascos

foram colocados em incubador rotativo a 300 rpm e 30 ºC, até surgimento de

coloração alaranjada, resultando dessa forma uma suspensão de células

vegetativas, com concentração celular de cerca de 3 g.l-1.

Para cada ensaio em biorreator, foram utilizados 7,5 kg de arroz (o que

representa uma ocupação de cerca de 47 % do volume do reator), inoculados com

750 ml de inóculo, correspondendo a uma concentração de aproximadamente 0,3

mg de células por grama de substrato seco.

4.4. Biorreator

O Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) possui um biorreator do tipo

tambor com agitação interna, construído com o projeto PIPE (99/01861-0) (Nagel et

al., 2001), dotado de recursos para controle da aeração, temperatura, agitação e

umidade.

O biorreator, apresentado na figura 3, é composto por um tambor cilíndrico

com diâmetro interno de 325 mm e comprimento de 500 mm, com corpo de aço inox,

tendo um volume de 40 l. O sistema de agitação permite a variação da rotação do

eixo entre 2 e 20 rpm, com possibilidade de programação para função intermitente

ou seja, pode-se ajustar o intervalo de tempo sob agitação e sob repouso.

A parte superior do reator é dotada de dois bocais os quais foram previstos

para adição de água (reposição da água perdida por evaporação), suspensão de

células ou solução de nutrientes. O ar é distribuído no interior do reator entrando

pelo eixo central e saindo pelo suporte de cada pá, havendo dois orifícios no corpo

do reator para saída de gases. Na parte inferior do biorreator, há uma válvula

esterilizável por vapor, para a retirada de amostras.

A camisa de resfriamento permite troca de calor entre o meio e a parede,

parcela importante na remoção do calor metabólico gerado durante o crescimento

celular.

O reator conta ainda com um sistema de geração e vapor d’água e tanque de


38

condensado que permite a esterilização do reator de forma automática.

Os sensores e medidores do reator estão descritos na tabela 2 e a figura 3

apresenta um esquema do reator.

Tabela 2 - Resumo dos pontos monitorados no biorreator

Item Quantidade Total

Camisa Temperatura de entrada de água 1 Temperatura de saída da água 1 Vazão de água 1 Corpo do reator Temperatura da fase gasosa 2 Temperatura da fase sólida 4 Temperatura do ar de entrada 1 Temperatura do ar de saída 1 Umidade da fase gasosa interna 0 Umidade do ar de entrada 0 Pressão 1 Periféricos Medidor de fração molar de O2 na saída do gás 1 Medidor de fração molar de CO2 na saída do

gás 1

Controlador da vazão de ar 1

Figura 3 – Esquema do biorreator para fermentação semi-sólida do LEB/DEQ/EPUSP

Entrada de Ar

Água

Água da camisa Amostrador

Motor

Água da camisa

Entrada de Ar

Água

Água da camisa Amostrador

Motor

Água da camisa


39

4.5. Etapas dos ensaios em biorreator

Os ensaios em biorreator compreendem as seguintes etapas: esterilização do

meio nos sacos de polipropileno; esterilização do reator vazio; carregamento do

reator com o substrato esterilizado; preparo do meio no reator (ajuste da umidade

inicial, estabilização da temperatura e do fluxo de água na camisa); inoculação e

cultivo com amostragens periódicas (uma vez ao dia).

Os ensaios em biorreator foram conduzidos nas seguintes condições:

ocupação de cerca de 47 % do volume do reator, temperatura do meio de cultivo

ajustada inicialmente a 30ºC e umidade inicial do meio de cerca de 45% em base

úmida. As características da agitação e vazão de ar variaram como descrito no item

4.7.

Amostras foram retiradas em diferentes pontos do reator antes dos eventos

de agitação (figura 4) para avaliar a homogeneidade do meio de cultivo após o maior

período sem agitação em cada experimento, e pela válvula amostradora, no caso

das amostragens após o evento de agitação.

As amostras retiradas foram secas em estufa a 50ºC por 48 horas, moídas em

moinho de facas marca Marconi (modelo M345) por 1 minuto e armazenadas em

refrigerador.

Figura 4 - Esquema lateral e frontal do reator com indicação dos diferentes pontos de amostragens

axial (A,B e C) e radial (D e E).

A B CMotor

Camisa

Amostrador inferior

A B CMotor

Camisa

Amostrador inferior

Motor

Camisa

MotorMotor

Camisa

Amostrador inferior

Amostrador superior

D

E

Amostrador superiorAmostrador superior

D

E


40

4.6. Metodologia Analítica

4.6.1. Umidade

A umidade das amostras do meio de cultura foi determinada em analisador de

umidade por infravermelho, marca Ohaus, modelo M35. O conteúdo de umidade foi

expresso em porcentagem, tomando-se a razão entre o conteúdo de água expresso

em gramas e a massa do meio úmido (g água.g amostra úmida-1).

A umidade também foi feita em estufa a 50OC até peso constante.

4.6.2. Extrato etanólico

Suspenderam-se 0,5 g de amostra seca e moída em 25 ml de etanol 70% v/v.

A suspensão foi homogeneizada sob agitação em vórtice, levada a banho à 60ºC por

duas horas e filtrada através membrana de ésteres de celulose de porosidade 0,45

µm, sob vácuo.

4.6.3. Pigmentos vermelhos

O extrato etanólico filtrado foi analisado em espectrofotômetro de varredura

(Beckman DU®530, EUA). Os valores de absorbância nos comprimentos de onda de

400 e 500 nm foram utilizados para a quantificação indireta dos pigmentos de cor

laranja e vermelha, respectivamente. O resultado foi expresso em unidades de

absorbância por grama de massa seca da amostra (U.gms–1), considerando-se a

diluição para obtenção do extrato etanólico (equação 1 e 2). A relação entre de

produção de pigmentos vermelhos e laranjas é calculada como a razão entre a

absorbância a 500 nm e a 400 nm, conforme equação 3. A diluição utilizada variou

conforme as amostras.

diluição secaMassa

AbsvermelhosPigmentos 500nm ×= Eq. 1


41

diluiçãolaranjaPigmentos ×=seca Massa

Abs 400nm Eq. 2

nm 400

nm 500

Abs

Abs=pigmentosdeRazão Eq. 3

4.6.4. Açúcares redutores (AR), açúcares redutores totais (ART)

Para quantificar os AR suspendeu-se 0,5 g de amostra seca em 50 ml de

água em erlenmeyer de 250 ml. Colocou-se a suspensão em incubador rotativo a

30ºC, 300 rpm por 30 minutos. Em seguida a suspensão foi filtrada em papel de filtro

sob vácuo.

A despeito da notação “AR” trata-se de “glicose” uma vez que 80% do arroz é

amido, principal fonte de carbono e energia do meio de cultura.

Para quantificação dos ART foi feita a hidrólise de 0,1 g de meio fermentado

seco e moído, em 8 ml HCl 2 mol.l-1, em banho a 80°C por 1 hora. O pH da

suspensão foi elevado para 4, e filtrada em papel de filtro. A glicose foi dosada no

hidrolisado pelo método enzimático da glicose-oxidase (GOD) empregando-se o

Auto Analyzer II (Technicon). A curva de calibração foi feita utilizando-se glicose

como padrão em concentrações de 0 a 1 g.l-1. O resultado foi expresso em grama de

ART por grama de massa seca (g ART.gms-1).

Realizou-se também a análise dos ART pelo método do ácido dinitrosalicílico,

DNS (MILLER, 1959), para as análises de padronização e comparação de métodos

(item 5.1.2).

4.6.5. Proteína total

A dosagem de proteína total foi realizada pelo método Folin-Ciocalteau

(LOWRY, 1951), após a hidrólise de 0,1 g de meio fermentado seco e moído em 20

ml de NaOH 0,5 mol.l-1, a 100°C por 5 min. A curva de calibração foi feita utilizando-

se soro albumina bovina (BSA) como padrão em concentração de 0 a 2 g.l-1. O


42

resultado foi expresso em grama de proteínas por grama de massa seca (g

proteína.gms-1).

4.6.6. Análise de ergosterol

Implantou-se metodologia para dosar ergosterol para estimativa de

crescimento celular baseada em Carvalho et al. (2006): a 1 g de amostra adicionou-

se 4 ml de etanol e 2 ml NaOH (2M). Incubou-se a suspensão em banho a 70ºC por

30 minutos. Em seguida foram adicionados 4 ml de HCl, 2 ml de KHCO3 e 4 ml de

hexano. A suspensão foi então centrifugada a 3000 x g por 10 minutos para

separação da fase leve. A fase pesada foi “lavada” com 4 ml de hexano por 3 vezes.

Toda a fase leve foi então levada a um banho a 70ºC para evaporação em capela de

exaustão, até a secagem completa. A amostra foi, então, suspendida em 10 ml de

metanol. A quantificação foi realizada em HPLC com coluna C18 (Waters -

µBondapack) em detector UV com comprimento de onda de 282 nm e 1 ml.min-1 de

metanol como fase móvel.

4.6.7. Análise do gás de saída do reator

As concentrações de O2 e CO2 no gás de saída do reator foram analisadas

com sensor de oxido de zircônio e de infravermelho em analisador de gases,

modelo EX-2000, New Brunswick Scientific Co.

A velocidade de consumo de oxigênio, OUR , a velocidade de produção de

CO2, CER, e o coeficiente respiratório, RQ, foram calculados através de balanços

materiais de O2 e CO2 no biorreator e determinados pelas seguintes equações:

F T R

)Y - (Y )P(POUR

saídaOentradaOH2Oba 2 2

××

×−= Eq. 4

F T R

)Y - (Y )P(PCER

entrada COsaídaCOH2Oba 2 2

××

×−= Eq. 5


43

OUR

CER=RQ Eq. 6

Onde:

OUR - Velocidade de consumo de oxigênio (mol O2.h-1)

CER - Velocidade de produção de dióxido de carbono (mol CO2.h-1)

RQ – coeficiente respiratório F - Vazão total de gás de entrada no reator (l.h-1) R - Constante universal dos gases = 62,361 (mmHg.l.K-1.mol-1) T - Temperatura (K) PBa - Pressão barométrica no instante de medida e corrigida conforme norma ABNT – MB 372 (mmHg) PH2O - Pressão de vapor da água a 30°C (mmHg) YO2 - Fração molar de O2 (na entrada e na saída do reator) YCO2 - Fração molar de CO2 (na entrada e na saída do reator)

O consumo de oxigênio é destinado ao crescimento e à manutenção celular e

pode ser descrito pela equação 7 (RODRIGUEZ LEON et al., 1988)

+×= OURO Xm

dt

dXOUR .

Y

1

X/O

Eq. 7

4.7. Cultivos

Foram realizados 4 experimentos em reator, conjunto I, para obtenção de

dados preliminares e estabelecimento dos níveis adequados das variáveis

envolvidas para elaboração do planejamento fatorial conforme a tabela 3.

Tabela 3 - Condições dos ensaios preliminares do conjunto I, na ordem de execução.

Ensaio Substrato Aeração Agitação Objetivos

Teste 1 Arroz polido 8 l/min 10 voltas a

cada 24 horas Realizar um primeiro teste no reator

Teste 2 Arroz integral 8 l/min 10 voltas a

cada 24 horas Testar o substrato arroz integral para melhorar a reologia do meio.

Teste 3 Arroz polido

20 l/min 10 voltas a cada 24 horas Aumentar a vazão de ar.

Teste 4 Arroz polido 20 l/min 1 volta a cada

2 horas

Manter as condições do teste 3, porém mudando o padrão de agitação.


44

Mediante avaliação dos resultados e dificuldades encontradas durante a

realização dos ensaios do Conjunto I, definiram-se os níveis das variáveis para o

Conjunto II, conforme descrito na Tabela 4.

Tabela 4 - Variáveis e níveis do Conjunto de Ensaios II

Variáveis Níveis

-1 +1 PC (0) Aeração 8l/min 20l/min 14l/min Intervalo das agitações 2 h 12 h 7 h Numero de voltas/24horas 12 120 66

Com base na Tabela 4, foi projetado o conjunto de experimentos da Tabela 5

em delineamento fatorial completo totalmente casualisado com 4 repetições no

ponto central. A casualização da ordem de execução dos ensaios foi realizada no

programa Minitab.

Tabela 5 - Conjunto II de ensaios propostos em planejamento fatorial.

Ensaios propostos Aeração

Intervalo agitações

Número de voltas/24horas Padrões de agitação

Ensaio 1 -1 +1 -1 6 voltas/12 horas Ensaio 2 -1 +1 +1 60 voltas/12 horas Ensaio 3 -1 -1 -1 1 volta/2 horas Ensaio 4 -1 -1 +1 10 voltas/2 horas Ensaio 5 +1 +1 -1 6 voltas/12 horas Ensaio 6 +1 +1 +1 60 voltas/12 horas Ensaio 7 +1 -1 -1 1 volta/2 horas Ensaio 8 +1 -1 +1 10 voltas/2 horas 4 repetições no ponto central

0 0 0 16 voltas/6 horas

Baseado nos resultados do conjunto I, nos dois primeiros ensaios do conjunto

II proposto e visando incluir os pontos rotacionais no delineamento experimental,

fez-se a modificação dos níveis anteriormente estipulados para a agitação


45

diminuindo o número máximo de voltas de 120 para 60 e retirando a variável

aeração que tornou-se parâmetro fixado em 14l/min. A tabela 6 apresenta as

variáveis e seus níveis modificados e a tabela 7 o novo conjunto de experimentos do

planejamento fatorial completo (conjunto III):

Tabela 6 - Variáveis e níveis do conjunto III

Variáveis Níveis

-1,41 -1 PC (0) +1 +1,41 Intervalo entre as agitações 2 h 3h 7 h 11h 12 h Numero de voltas/24horas 12 19 36 53 60

Tabela 7 - Conjunto III de ensaios propostos em planejamento fatorial composto rotacional.

Ensaios Propostos Numero de

voltas/24horas Intervalo agitações Padrões de Agitação

Ensaio A -1 -1 8,72 voltas/11 horas Ensaio B +1 -1 6,63 voltas/3 horas Ensaio C -1 +1 2,38 voltas/3 horas Ensaio D +1 +1 24,31 voltas/11 horas Ensaio E -1,41 0 3,5 voltas/7 horas Ensaio F +1,41 0 17,5 voltas/7 horas Ensaio G 0 -1,41 3 voltas/2 horas Ensaio H 0 +1,41 18 voltas/12 horas 3 repetições no ponto central 0 0 10,5 voltas/7 horas

As análises estatísticas foram feitas de acordo com o delineamento composto

central rotacional totalmente casualisado.

4.8. Balanços

4.8.1. Balanço de entalpia no reator

Utilizando a vazão de água na camisa, dados de temperatura da água que

entra e da água que sai da camisa, do ar que entra e do gás que sai do reator,

efetua-se o balanço de entalpia. Considerou-se que o ar de entrada está seco pois

vem diretamente do compressor e passa por uma coluna se sílica. Para o cálculo

mais preciso da entalpia no gás de saída seria necessária a medida de umidade,

porém como não foi possível essa medida, considerou-se o gás de saída como ar


46

saturado.

O balanço de entalpia para o biorreator compreende três parcelas de fluxos: o

calor removido pela água da camisa Jcamisa, o calor removido pelo ar circulante Jevap,

e o calor gerado pelo metabolismo microbiano Rmet (Nagel et al., 2001).

evapcamisamet

i

ii JJRcmdt

dT−−=∑ . Eq. 8

Onde:

dT/dt : variação de temperatura no biorreator. mi : é a massa do i-ésimo componente do meio fermentado (biomassa, amido,

fibras) (kg). ci : calor específico do i-ésimo componente (J/kg.K). Jcamisa : calor removido pela camisa do reator (W). Jevap : calor removido por evaporação (W). Rmet : calor produzido pelo metabolismo do fungo (W).

4.8.2. Cálculo do calor metabólico gerado

O calor gerado devido ao processo de respiração microbiana foi determinado

a partir da correlação entre o consumo de oxigênio e a geração de calor (Roels et

al., 1983).

][ 10.460 23 Wdt

dORmet ⋅= Eq. 9

sendo dO2/dt a demanda microbiana por oxigênio, em mol/s.

4.8.3. Cálculo do calor removido pela camisa

O calor removido pela camisa será determinado pela diferença de

temperatura entre os sensores na entrada e saída de água da camisa, e pela vazão

mássica de água.


47

][ )( , WFCTTJ águaáguaáguapescamisa ρ⋅⋅⋅−= Eq. 10

Onde:

Ts : temperatura da água na saída da camisa, °C. Te : temperatura da água na entrada da camisa, °C. Cp,água : calor específico da água, com o valor de 4175 J/(kg de água .°C). Fágua : vazão volumétrica de água, l/ s. ρágua : densidade da água, com o valor de 1,0 kg/l.

4.8.4. Cálculo do calor removido por evaporação

O cálculo da entalpia do ar envolve a determinação de uma parcela de calor

sensível e uma parcela de calor latente, esta última dependente da determinação do

valor de umidade absoluta do ar a partir dos valores de pressão absoluta, umidade

relativa e temperatura. A entalpia do ar é dada pela equação:

( ) ]/[,, kgJ TCHUTCh arvpvAararp ⋅+⋅+⋅= Eq. 11

Onde:

Cp,ar : calor específico do ar, com o valor de 1005 J / (kg de ar seco .°C) Tar : temperatura do ar, °C. UA : umidade absoluta do ar, kg de água / kg de ar seco. Hv : calor latente de vapor de água a 0°C, sendo 2,5.106 J/ kg. Cp,v : calor específico da água, com o valor de 1884 J/(kg de ar seco .°C) O calor removido por evaporação é calculado pela diferença de entalpia do ar

de entrada e do gás de saída do reator

][ )( WFhhJ araresevap ρ⋅⋅−= Eq. 12

Onde:

hs : entalpia do ar de saída, J/ kg de ar seco. he : entalpia do ar de entrada, J/ kg de ar seco. Far : vazão do ar, l de ar seco/s. ρar : densidade do ar seco, com o valor de 1,29. 10-3 kg / l de ar seco.

Resultados e Discussão

48

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Padronização das metodologias de análise

As metodologias de análise de umidade, açúcares redutores e extração de

pigmentos foram testadas a fim de modificá-las e torná-las mais confiáveis. Foi

estabelecida a análise de ergosterol visando a estimativa de crescimento celular.

5.1.1. Umidade

O uso do analisador de umidade por aquecimento infravermelho Ohaus visa a

diminuição do tempo de resposta, de 48 horas para, aproximadamente, 15 minutos,

da análise de umidade para a correção da umidade do meio em fermentação no

reator.

Foram realizados testes para aferição da precisão do analisador de umidade.

Para tanto comparou-se a umidade de algumas amostras de sílica submetidas a

secagem em estufa até massa constante, com as medidas realizadas no analisador

Ohaus, com duas massas de amostras, 3 e 7 g. A figura 5 apresenta os resultados

obtidos com base nos 2 métodos para 5 valores de umidade inicial.

Figura 5 - Umidades em base úmida medidas em estufa e no analisador de umidade Ohaus, para amostras de sílica de, ( ) 3 g, ( ) 7 g.

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

Umidade da estufa (%)

Um

idad

e n

o A

nal

isad

or

(%)


49

A relação entre a umidade medida pelo analisador e a umidade medida na

estufa é dada pela equação 15.

Umidade Analisador = 0,989 * Umidade Estufa Eq. 13

A correlação entre os dois métodos foi boa, sendo que o R2 para amostras de

3 g foi de 0,9872 e para 7 g foi de 0,9903. Também foi analisada uma mesma

amostra com 9 repetições no analisador Ohaus obtendo-se umidade média de

13,45% com desvio padrão de 0,37. A partir desses resultados, foi possível afirmar

que o analisador de umidade é eficiente para uma medida mais rápida em

comparação com a secagem em estufa, permitindo a reposição de água perdida por

evaporação de forma controlada.

5.1.2. Hidrólise ácida para dosagem de ART

Foram testadas diferentes concentrações de HCl para a hidrólise do amido

residual do meio em fermentação, e, em seguida, os açúcares redutores foram

quantificados pelo método do DNS. A figura 6 apresenta a diferença obtida entre a

hidrólise com HCl 1 mol.l-1 e HCl 2 mol.l-1.

Figura 6 - Hidrólises ácidas de meio fermentado ao longo do cultivo. ( ) HCl 1 mol.l-1, ( ) HCl 2 mol.l-1

Como o conteúdo de amido no arroz polido é da ordem de 80% foi possível

concluir que a hidrólise com o ácido mais concentrado (2 mol.l-1) resulta melhor

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo de cultivo (h)

Conc

ent

raçã

o AR

T (g

AR

T/gm

s)


50

desempenho. Também foram feitas hidrólises usando HCl 3 mol.l-1 porém os

resultados não diferiram da hidrólise com 2 mol.l-1, sendo então adotada esta

concentração de HCl na metodologia.

5.1.3. Determinação de ART e AR

Foi feita a comparação dos métodos de dosagem de açúcares redutores por

DNS e pelo método enzimático da glicose oxidase. A figura 7 mostra os gráficos com

os resultados obtidos nas amostras das fermentações do item 4.7 (tabela 3).

Figura 7 – Determinações de AR nos ensaios testes 1, 2 e 3 através do método do. ( ) DNS e ( ) GOD

teste 3

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 48 96 144 192 240


conc

entra

ção (g

AR/g

ms)

teste 2

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 48 96 144 192 240


Conc

entraç

ão (g

AR/g

ms)

teste 1

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 48 96 144 192 240


Con

cent

raçã

o (g

AR/g

ms)


51

Os dados mostram que a análise de açúcares redutores quando feita pelo

método do DNS quantifica mais açúcares. Isso ocorre porque esse método não

quantifica apenas glicose mas qualquer substância redutora. Dessa forma, foi

adotado o método enzimático de dosagem, por ser mais específico para as análises

de AR.

Além disso, verificou-se o desempenho da análise enzimática após a hidrólise

ácida do amido a valores de pH 6,0 e 8,0. A figura 8 mostra a diferença de

resultados da dosagem com glicose oxidase (GOD) para pH 6 e 8 (após a hidrólise),

em comparação com dosagem por DNS.

Figura 8 – Determinação de ART através dos métodos, ( ) GOD com pH 6, ( ) GOD com pH 8 e ( )

DNS

Verifica-se que o pH menor aumentou a atuação da enzima reduzindo a

diferença entre os resultados obtidos pelos dois métodos. A fim de verificar se um

pH menor após a hidrólise se aproximaria mais do resultado obtido pelo método

DNS, testou-se também a dosagem por glicose oxidase com pH 4 para a análise

ART em outra amostra (Figura 9).

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216


Conce

ntraç

ão (g /g d

e m

assa

sec

a)


52

Figura 9 - Métodos de análise de ART.( ) DNS, ( ) GOD em pH 4

Os resultados correspondem ao Teste 1 (descrito no item 4.7) que mostram

que no pH 4 os valores encontrados se aproximam, principalmente no início, quando

o teor de ART é conhecido e próximo de 80%. A diferença no final da fermentação

pode se dever ao aumento das substâncias redutoras que elevam as leituras em

DNS, assim como comentado para as análises de AR. Dessa forma a dosagem com

glicose-oxidase também foi a metodologia escolhida para quantificar ART usando pH

4 após a hidrólise.

5.1.4. Extração de pigmentos

Após a extração observou-se que a amostra residual conservava a coloração

inicial, um indicativo de que a extração do pigmento não era completa. Por isso

buscou-se um protocolo de extração para uma maior eficiência.

Foram testados 4 novos processos:

• Uso de α-amilase para a hidrólise do amido e possível maior liberação do

pigmento

• Uso de glucanase para a hidrólise da parede celular do microrganismo

• Uso de sonicador para a ruptura da parede celular do microrganismo

• Uso de glutamato para conversão de pigmentos da cor laranja a vermelhos

Todas as leituras de absorbância a 500 nm foram semelhantes às leituras do

padrão e, portanto não houve aumento na extração em nenhum dos procedimentos

testados e a metodologia não foi modificada.

teste 1

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 24 48 72 96 120 144 168 192


Con

cent

raçã

o AR

T (gA

RT/g

ms)


53

5.2. Mudanças estruturais no reator

Foram realizadas algumas mudanças estruturais no reator a fim de melhorar

seu desempenho e adequá-lo à aquisição de dados necessários. Com a realização

de ensaios preliminares foi possível detectar quais alterações eram necessárias.

• Inicialmente havia sido previsto modificar os modelos das pás, porém foi

verificado que para o uso proposto o modelo existente é adequado desde que

se mudasse a posição das mesmas dentro do reator. As pás estavam

posicionadas no eixo do reator, em forma de rosca sem fim, o que causava

acúmulo de meio na parte frontal do tambor. As pás foram inclinadas

(giradas), aproximadamente 30º na direção contrária da rosca, para

compensar essa movimentação.

• O sensor de umidade relativa (Marcare) foi substituído por um modelo da

mesma marca supostamente mais adequado que suportaria a condição de

saturação do ar com água durante a fermentação e as temperaturas de

esterilização o que não ocorreu. O sinal do sensor oscilou continuamente e

portanto os valores registrados não eram confiáveis. Além disso, o sensor

novo, por conter cobre, provocou corrosão no corpo do reator e em um dos

dois sensores de temperatura que foram introduzidos no corpo do reator após

5 dias de fermentação. Desta forma, não foi possível utilizar o medidor de

umidade na fase gasosa.

• Dois sensores de temperatura foram introduzidos em dois pontos no corpo do

reator para medir a temperatura no meio do substrato e não só na superfície

interna da parede do reator (em contato com a camisa), como era a

configuração inicial.

• Foi feita uma abertura no corpo do reator para introdução de amostradores

para que fosse possível a retirada de amostras em diferentes pontos do

reator, tanto na direção radial quanto na axial.

• Foi introduzida uma linha de ar estéril no sistema de aspersão de água, a fim

de provocar nebulização da mesma na tentativa de uma aspersão

homogênea no meio quando houvesse necessidade de reposição de água.

Durante os ensaios preliminares esse sistema foi ajustado. Porém, ocorreu

um dano na comunicação do sistema com o controlador que impediu a sua


54

utilização pois não foi possível restabelecer a comunicação em tempo hábil. O

problema foi posteriormente resolvido.

• Outro problema constatado foi a condensação de água na linha do gás de

saída do reator. Isso acontece pois o ar entra seco no reator e ocorre a

evaporação de água do meio e a umidade do ar de saída é alta. Essa água,

condensada na tubulação, molha o filtro hidrofóbico existente na saída do gás

e provoca o aumento da pressão dentro do reator. Para solucionar esse

problema foi adicionado um ciclone com um dreno antes do filtro para que a

água pudesse ser separada do gás.

5.3. Ensaios para definição do tratamento térmico do substrato no

reator

Foram realizados ensaios a fim de testar qual o tratamento térmico do

substrato (arroz), mais adequado à reologia do meio durante o cultivo. A primeira

tentativa foi a esterilização do reator vazio, seguida do preenchimento com arroz cru

e a passagem de vapor pelo mesmo para gelatinização do amido e esterilização.

Esse processo além de tornar o meio aglomerado e de consistência heterogênea

ainda dificulta o controle da umidade inicial do cultivo.

A segunda tentativa foi a esterilização do reator vazio, seguida do

preenchimento com arroz cru estéril (por radiação) e água na quantidade adequada

para a umidade inicial requerida (45%). O arroz ficou sob maceração por 24 horas e,

em seguida, ocorreu a passagem de água a 80ºC pela camisa do reator apenas para

gelatinização do amido. Esse processo se mostrou demorado, levando cerca de 2

horas. O meio ficou muito heterogêneo e aglomerado, pois o arroz não absorveu

toda a água e houve necessidade de agitação constante para que todo substrato se

mantivesse a 80ºC.

Finalmente estabeleceu-se submeter o arroz a esterilização em autoclave, em

sacos de polipropileno (item 4.2.1) e subseqüentemente, preencher o reator

previamente esterilizado. O substrato foi transferido por uma abertura no corpo do

reator de forma asséptica.


55

5.4. Ensaios preliminares em reator – Conjunto I

5.4.1. Teste 1

O ensaio teste 1 foi realizado com aeração de 8l. min-1 que corresponde a 1,2

l.min-1.kgms inicial-1 , em arroz polido com 45% de umidade inicial em base úmida. A

agitação adotada foi de 12 voltas a cada 24 horas. Os resultados da análise dos

gases de saída (OUR e CER) do reator e do meio fermentado estão apresentados

na figura 10.

Figura 10 – (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 1 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas e físicas

do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( ) umidade. A interrupção corresponde a dados não registrados por falha elétrica.

Teste 1

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 48 96 144 192 240


OU

R, C

ER

(m

mol

/h)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

RQ

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 48 96 144 192 240


Con

cent

raçã

o (g

.gm

s-1)

,

umid

ade

(gH

2O.g

-1)

0

100

200

300

400

500

600

Abs

500

nm

(U

.gm

s-1)

A

B


56

Neste cultivo o RQ permaneceu abaixo de 1 ao longo de todo o ensaio

indicando o consumo de outras fontes de carbono que não a glicose.

A umidade aumentou no decorrer do processo indicando fixação de água

durante o crescimento. Houve consumo de amido indicado pela redução da medida

de ART, porém a produção de proteína, principalmente nos primeiros três dias foi

baixa. A produção de pigmento vermelho atingiu 63 U.gms-1 que fica muito abaixo de

valores atingidos em experimentos do LEB/DEQ/EPUSP, em colunas de leito fixo

com aeração forçada, que chegam a 3000 U.gms-1 (dados não publicados).

O meio adquiriu consistência pastosa ao longo dos dias, provavelmente devido ao

aumento da umidade associado à agitação, dificultando a transferência de O2. A

figura 11 mostra fotos das amostras retiradas do reator.

Figura 11 - Fotos do meio em fermentação do ensaio 1 em diferentes tempos do cultivo- (A) 67 horas,

(B) 139 horas, (C) 185 horas.

5.4.2. Teste 2

Para melhorar a reologia do meio, o segundo cultivo em reator foi realizado

mantendo a aeração de 8 l.min-1 que corresponde a 1,2 l.min-1. kg ms inicial-1 e o

regime de agitação mas utilizando arroz integral com 45% de umidade em base

úmida. Os resultados da análise dos gases de saída do reator e do meio fermentado

estão apresentados na figura 12.

A B C


57

Figura 12- (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 2 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( )

umidade. A interrupção corresponde a dados não registrados por falha elétrica.

A análise dos gases de saída do reator mostra uma maior atividade

respiratória em relação ao teste 1 até aproximadamente 64 horas de cultivo, com o

RQ chegando a 1,2 e a concentração de CO2 no gás de saída atingindo valores em

torno de 4,5%. Porém, essa condição não se manteve e tanto o consumo de O2

quanto a produção de CO2 tiveram um declínio importante até aproximadamente 100

horas. Neste momento, o RQ, estava em torno de 0,8, apresentando variações

intensas que podem se explicadas pelo baixo consumo de O2 que interfere na

sensibilidade do analisador.

Pode-se observar que o consumo de substrato, estimado através do ART,

tem forte declínio até 100 horas assim como a atividade respiratória a despeito da

disponibilidade de fonte de carbono (ART) indicando que pode ter havido

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 48 96 144 192 240

Tempo de cultivo(h)

OU

R,

CE

R (

mm

ol/h

)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

RQ

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 48 96 144 192 240


Conce

ntraçã

o (g.g

ms-

1),

um

idade (gH

2O

.g-1

)

0

100

200

300

400

500

600

Abs

500 n

m (U

.gm

s-1)

A

B


58

aglomeração do meio prejudicando a transferência de oxigênio (aumento do RQ) e a

dissipação de calor.

A figura 13 mostra fotos das amostras retiradas do reator em diferentes

instantes. A umidade que, assim como no ensaio 1, ficou acima de 60% em base

úmida, provavelmente influenciou na aglomeração do meio de cultura.

Figura 13- Fotos do meio em fermentação do ensaio 2 em diferentes tempos do cultivo- (A) 45 horas,


A foto (B) indica que com 90 horas de cultivo o meio já se encontrava

bastante compactado, impedindo a transferência de O2 para o interior do substrato.

Comparando-se os ensaios 1 e 2, observa-se que para a mesma umidade (em torno

de 60%) o arroz integral, além de aglomerar mais, propiciou menor produção de

pigmento (43 U.gms-1).

5.4.3. Teste 3

A fim de controlar a umidade no reator e fornecer melhores condições de

crescimento, o ensaio 3 teve a vazão de ar aumentada para 20 l.min-1 ou 3 l.min-

1.kgms inicial-1. O regime de agitação foi mantido em 12 voltas a cada 24 horas. Os

resultados da análise dos gases de saída do reator e do meio fermentado estão

apresentados na figura 14.

A B C


59

Figura 14 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 3 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( )

umidade.

O RQ se manteve constante e próximo a 1 durante todo o cultivo. Apesar da

análise dos gases indicar que esta era uma condição favorável ao crescimento, a

quantificação da proteína não mostrou crescimento acentuado.

O aumento da vazão de ar resultou em um maior ressecamento do meio e foi

necessário o controle de umidade nesse ensaio, com a adição de 500 ml de água

nos instantes 48, 118, 163, 187, 231 horas de cultivo. Dessa maneira, a umidade se

manteve em torno de 45 %, conservando o meio sem aglomerações até o final do

cultivo (figura 15), porém a vazão de ar adotada nesse cultivo (20 l.min-1) pode ser

considerada alta uma vez que demandou diversas reposições de água. A produção

de pigmentos atingiu 300 U.gms-1 em 192h que é mais do que o triplo dos ensaios

anteriores para o mesmo tempo de fermentação.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 48 96 144 192 240


OU

R, C

ER

(m

mol

/h)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

RQ

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 48 96 144 192 240


Conce

ntraçã

o (g.g

ms-

1),

um

idade (gH

2O

.g-1

)

0

100

200

300

400

500

600

Abs

500 n

m (U

.gm

s-1)

A


60

Figura 15 - Fotos do meio em fermentação do teste 3 em diferentes tempos do cultivo- (A) 48 horas,


5.4.4. Teste 4

Para o ensaio 4 foi mantida a vazão de ar de 20 l.min-1 ou 3 l.min-1.kgms

inicial-1 e foi modificado o padrão de agitação tornando os eventos mais freqüentes

e melhor distribuídos ao longo de 24 horas (1 volta a cada 2 horas). Os resultados

são apresentados na figura 16.

Figura 16 - (A) Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) do ensaio teste 4 em função do tempo de cultivo (B) Análises químicas do meio fermentado. ( ) concentração de ART, ( ) produção de pigmentos ( ) concentração de proteína e ( )

umidade.

A B C

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 48 96 144 192 240 288 336 384 432


OU

R, C

ER

(m

mol/h

)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

RQ

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 48 96 144 192 240 288 336 384


Conc

entra

ção

(g.g

ms-

1),

um

idade (g

H2O

.g-1

)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Abs

500 n

m (U

.gm

s-1)

B

A


61

Observa-se um aumento maior da quantidade de proteína nas amostras a

partir de 48 horas atingindo valores três vezes maiores que o inicial após 12 dias de

cultivo. Houve também um aumento de 50% na produção de pigmentos vermelhos

em relação ao ensaio 3 porém cerca de 4 a 5 dias mais tarde, provavelmente devido

ao maior crescimento microbiano que retardou a síntese de metabólitos secundários.

A tabela 8 mostra um resumo dos resultados obtidos para os 4 testes

preliminares realizados.

Tabela 8 - Resultados ensaios do conjunto I de experimentos

Tipo de

arroz

Umidade

final (%)

OUR máximo

(mmol O2.h-1)

Proteína máxima

(g proteína. gms-1)

Consumo de

ART (%)

Teste 1 Polido 65 720 (63-87h) 0,15 67,5

Teste 2 Integral 61 900(42–66h) 0,23 65,5

Teste 3 Polido 41 750 (46–106h) 0,17 58,0

Teste 4 Polido 42 600 (58–160h) 0,21 76,2

Descartado o arroz integral por ter adquirido consistência pastosa, a análise

geral dos resultados para arroz polido mostra maior crescimento celular com base no

aumento da concentração de proteína, para o teste 4, no qual aplicou-se a maior

vazão de ar, igual a 20 l.min-1, também aplicada no teste 3, que todavia sofreu

agitação somente a cada 24h, em contraste com o teste 4, onde a agitação ocorreu

a cada 2h. É, portanto, uma conclusão preliminar, a vantagem de uma menor

intermitência na agitação, provavelmente pela melhor condição de retirada de calor.

Aumentando a aeração (teste 3) obteve-se uma reologia bem melhor, pois a

umidade se manteve entre 35% e 45% (foi necessária a adição de água) e a

produção de pigmentos aumentou 8 vezes em relação ao teste 1. No teste 4, o meio

ressecou mais, demandando maior adição de água para manter a umidade nos

mesmos níveis.

No teste 4, a relação entre a massa de proteína e de matéria seca chegou a

0,21 g por grama de massa seca e o pigmento aumentou mais 50% em comparação

com os valores obtidos no teste 3. Tal variação na concentração final de proteína,

tomando-se os testes 3 e 4, não se correlaciona com a variação no consumo de


62

ART, o que denota uma variabilidade do metabolismo, não denunciada pelo valor de

RQ, ligeiramente inferior a 1,0.

Os resultados obtidos nos ensaios teste, indicando a ordem de grandeza das

variáveis, levam a propor um conjunto inicial de ensaios que contemple apenas a

fase de crescimento do fungo (2 a 5 dias) por ser aquela em que há maior demanda

de retirada de calor do meio.

5.4.5. Ensaios em reator - Conjunto II

Foram iniciados os ensaios do conjunto II de acordo com o delineamento

fatorial totalmente casualizado. Foram realizados dois experimentos: ensaio 1 e

ponto central (Tabela 4, item 4.7) de acordo com o sorteio do programa Minitab.

Nesses experimentos iniciou-se a amostragem em diversos pontos do reator

com a introdução de amostradores esterilizados no corpo do reator durante a

fermentação (Figura 4). Houve contaminação dos experimentos, provavelmente

devido a esse novo procedimento, pois nenhuma outra modificação foi realizada em

relação aos experimentos do conjunto I.

O ensaio 1 (aeração de 8 l.min-1 e agitação de 6 voltas a cada 12 horas)

decorreu no tempo inicialmente previsto de 6 dias, mesmo contaminado. O ensaio

no ponto central (aeração de 14 l.min-1 e agitação de 16 voltas a cada 6 horas) foi

interrompido no terceiro dia devido à contaminação e também à fragmentação dos

grãos de arroz. As Figuras 17 e 18 ilustram o meio em fermentação retirado através

do amostrador imediatamente após um ciclo de agitação.

Figura 17 - Aspecto do substrato do ensaio 1 após 24 (A), 48 (B), 96 (C) e 144 horas (D) de cultivo.


63

Figura 18 - Aspecto do substrato do ensaio do ponto central no tempo inicial (A), após 24 (B), 48 (C) e 72

horas (D).

Observa-se na figura 17 D, ensaio 1, que o meio de cultivo se torna

aglomerado e de consistência pastosa. A contaminação pode ter contribuído para

que isso ocorresse, porém esse ensaio tem o menor nível de agitação e aeração do

conjunto escolhido e era esperado que não fosse a melhor condição de cultivo.

A figura 18 mostra que o ensaio no ponto central apresentava contaminação

visível em 48 horas e 24 horas mais tarde o cultivo foi inteiramente tomado, levando

à interrupção do experimento. Apesar disso, foi possível verificar que o nível de

agitação (16 voltas a cada 6 horas) foi muito intenso, causando a fragmentação do

substrato em apenas 72 horas. Essas observações foram relevantes para a decisão

de mudança nos níveis das variáveis escolhidas anteriormente. Além disso, optou-se

por não retirar amostras nos diversos pontos do reator durante as primeiras 48 horas

do ensaio para evitar a contaminação na fase de adaptação do microrganismo.

5.5. Ensaio complementar com suplementação

Foi realizado um experimento com suplementação do meio de cultivo para

verificar a possibilidade de os cultivos realizados em reator estarem sendo

limitados pela falta de nitrogênio no meio.

O experimento foi conduzido em frascos erlenmeyer de 100 ml contendo 50 g

de massa seca de arroz com umidade inicial de 45%, autoclavado a 120oC por 20

minutos. Foram testadas as seguintes suplementações:

A) sem suplementação

B) 5% de sulfato de amônio

C) 1% de sulfato de amônio


64

D) 0,1 % de glutamato monossódico

Os cultivos foram realizados em duplicata e foram retiradas amostras após 24,

48, 96, 240 e 288 horas. As figuras 19 e 20 apresentam a perda de massa seca

durante o cultivo e os resultados em massa total de proteína. A Tabela 9 apresenta

os dados de balanço de nitrogênio.

Figura 19 – Redução de massa seca em ensaio com suplementação da fonte de N : sulfato de

amônio no meio ( ) 0%, ( ) 5%, ( ) 1% e com suplementação de glutamato monossódico (x) 0,1 %.

Figura 20 – Massa total de proteína em ensaio de suplementação de amônio no meio: ( )

0%, ( ) 5%, ( ) 1% e com suplementação de glutamato monossódico (x) 0,1 %.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 48 96 144 192 240 288


Mass

a se

ca (g

ms/

gm

s in

icia

l)

0

2

4

6

8

10

12

0 48 96 144 192 240 288


Mass

a d

e p

rote

ina (g)


65

Tabela 9 - Balanço de nitrogênio nos cultivos com suplementação de meio

Início Final Massa de nitrogênio (g) Massa de

meio (g) Concentração de proteína (g.gms-1)

Massa de nitrogênio **(g) Substrato* adicionada Total

A 0,88 0 0,88 16,72 0,36 0,71 B 0,88 0,525 1,405 38,21 0,10 0,45 C 0,88 0,105 0,985 36,63 0,20 0,87 D 0,88 0,0042 0,8842 13,62 0,34 0,54 *Calculada com a composição elementar do arroz : CH1,4455O0,7973N0,0335 (Rosemblitt et al., 2000) **Calculado considerando toda proteína contida no microrganismo. Composição elementar do Monascus : CH1,4737O0,8118N0,0947 (Rosemblitt et al., 2000).

Os resultados mostram que a suplementação com sulfato de amônio inibiu o

crescimento nas duas concentrações utilizadas em relação ao ensaio padrão. O

ensaio B aumentou em 60 % o nitrogênio disponível e o ensaio C em 12 %. Apesar

da suplementação com glutamato não ter alterado significativamente a

disponibilidade de nitrogênio no ensaio D, este não apresentou o mesmo

desempenho que o ensaio padrão quanto à concentração de proteína, porém foi

importante para o aumento da produção de pigmentos vermelhos de 1910 U.gms-1

no padrão para 4340 U.gms-1 no ensaio suplementado ao final de 288 horas de

cultivo. A produção de pigmentos de cor laranja também aumentou de 2730 U.gms-1

para 9840 U.gms-1 no ensaio suplementado com glutamato. Nota-se que a razão

entre pigmentos vermelhos e laranjas é de 0,70 para o ensaio padrão e cai no

ensaio suplementado com glutamato para 0,44 provavelmente a falta de oxigênio

para a conversão do pigmento laranja em vermelho. Com base nesses resultados

todos os cultivos deveriam ter sido suplementados com glutamato pois valores

maiores de produção de pigmentos reduziriam as margens de erro das medidas,

mas isso demandaria repetir todos os cultivos realizados até então. Desta forma

decidiu-se continuar os experimentos sem suplementação.


66

5.6. Ensaios em reator

5.6.1. Desempenho do processo de cultivo em função da agitação

Na Figura 21 indicam-se os experimentos realizados de acordo com o

planejamento fatorial rotacional. Os ensaios foram nomeados de acordo com a

ordem padrão dos experimentos fatoriais rotacionais (4.7 de materiais e métodos) e

foram realizados de maneira aleatória através de sorteio.

Figura 21 - Identificação dos experimentos com base nos fatores de agitação definidos no

planejamento fatorial rotacional

As Figuras de 22, 23 e 24 apresentam as velocidades de consumo de

oxigênio (OUR (mmol.h-1)), produção de dióxido de carbono (CER (mmol.h-1)) e o

quociente respiratório (RQ) em função do tempo de cultivo dos experimentos. As

Figuras à direita apresentam os mesmos dados, porém somente até 36 horas de

cultivo, momento em que todos os ensaios já apresentam declínio na velocidade de

crescimento. Os gráficos foram divididos em 3 grupos: (a) ensaios com maior

intervalo entre os eventos de agitação (C, H e D); (b) ensaios do ponto central (I, J e

K) e ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (E, F); (c)

E

C

A BG

DH

FI, J, K

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60

Número de Voltas a cada 24 horas

Inte

rval

o e

ntr

e os

even

tos

de

agitaç

ão (h)


67

ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação (ensaios A, G e B). Os

ensaios no ponto central foram feitos em triplicata.

Figura 22 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊), produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos ensaios com maior intervalo entre os eventos

de agitação (ensaios C, H e D).

Ensaio D (24,3 voltas/11 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio C (8,72 voltas/11 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio H (18 voltas/12 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36

Tempo de cultivo (h)O

UR

, CE

R (m

mol

/h).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


68

Figura 23 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios

com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (ensaios E e F).

Ensaio K (10,5 voltas/7 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio J (10,5 voltas/7 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio I (10,5 voltas/7 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio F (17,5 voltas/7 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio E (3,5 voltas/7 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36

Tempo de cultivo (h)O

UR

, CE

R (m

mol

/h).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


69

Figura 24 - Velocidades de consumo de O2 (OUR, ◊); produção de CO2 (CER, □) e coeficiente respiratório (RQ, ) em função do tempo de cultivo nos ensaios com menor intervalo entre os eventos

de agitação (ensaios A, G e B).

Ensaio A (2,83 voltas/3 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio G (3 voltas/2 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ

Ensaio B (6,63 voltas/3 horas)

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96 120 144


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36


OU

R, C

ER

(mm

ol/h

).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

RQ


70

Observa-se que os cultivos com maiores intervalos entre as agitações (figura

22) apresentam uma fase lag de 6 a 12 horas e que entre esses ensaios (C, H e D),

a OUR máxima é decrescente com o aumento do número de voltas, variando de 600

a 400 mmol.h-1, indicando que a agitação interfere no crescimento de forma

negativa.

Para o grupo de ensaios com intervalo médio entre as agitações a fase lag se

estende por aproximadamente 12 horas (figura 23). As OUR máximas alcançam

valores próximos de 700 mmol.h-1 para os ensaios E e F e 600 mmol.h-1 para os

ensaios do ponto central com exceção do I que chega a 750 mmol.h-1 apenas após

48 horas.

Para o grupo dos ensaios com menores intervalos entre os eventos de

agitação (figura 24), a fase lag se prolonga além de 12 horas, chegando a 18 horas

para o ensaio B e a OUR máxima fica próxima de 800 mmol.h-1, sendo que para o

ensaio G os dados de OUR para as primeiras 40 horas não foram apresentados por

problemas ocorridos com o analisador.

Desta forma nota-se que a agitação no início do cultivo pode estar

aumentando a fase lag, o que pode ser atribuído a uma maior dificuldade das hifas

se fixarem sobre o substrato, em resultado à agitação mais freqüente. Entretanto,

esses mesmos ensaios, isto é, os ensaios com os menores intervalos entre os

eventos de agitação alcançaram valores de OUR mais altos. Há algumas hipóteses

para explicar o decaimento da velocidade de consumo de oxigênio a partir de um

determinado instante do cultivo (1) a temperatura do meio alcança níveis deletérios

para o microrganismo, (2) ocorre a compactação do meio dificultando a transferência

de oxigênio e a remoção de calor. A primeira hipótese explicaria a OUR ter atingido

valores mais altos nos cultivos com maior agitação, pois teria havido maior

dissipação de calor e, inclusive, de gases do metabolismo. Teng e Feldheim (2000)

enfatizam a necessidade de remoção de CO2 para promover o crescimento e

também a produção de pigmentos. A segunda hipótese explicaria o declínio rápido

da respiração nos cultivos com maior número de voltas (ensaios B e F). Todos os

cultivos atingiram temperaturas elevadas e não foi possível separar o efeito deletério

da temperatura dos efeitos da agitação.

Durante os cultivos foram monitoradas temperaturas nos pontos indicados por

TFS na Figura 25.


71

Figura 25 - Esquema do reator e dos pontos de monitoramento da temperatura no meio sólido (TFS-

01, TFS-02, TFS-03 e TFS-04), do ar de entrada (TAR-01), da fase gasosa (TFG-02) e de

entrada e saída da água na camisa (TAC-01 e TAC-02)

As figuras 26, 27 e 28 apresentam os dados de temperatura armazenados “on-line”

durante os cultivos.

Motor

Camisa

Amostrador inferior

TAC-02

TAC-01

TFS-02TFS-01

TFS-03

TFS-04

TFG-02

TAR-01

3 cm 8 cm

Motor

Camisa

MotorMotor

Camisa

Amostrador inferior

TAC-02

TAC-01

TFS-02TFS-01

TFS-03

TFS-04

TFG-02

TAR-01

3 cm 8 cm


72

Figura 26 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de cultivo nos ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação (ensaios C, H e D). Temperatura do ar de entrada, ( ); temperatura da fase gasosa, ( ); temperatura do meio na parede (próximo à saída de água da camisa), ( ); temperatura do meio na parede (próximo à entrada de água da camisa), ( ); temperatura do meio a 8 cm da parede, ( ); temperatura do meio a 3 cm da parede, ( ).


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


73

Figura 27 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de cultivo nos ensaios do ponto central (I, J e K) e ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (ensaios E e F). Temperatura do ar de entrada,( ); temperatura da fase gasosa,( ); temperatura do meio na parede (próximo à saída de água da camisa),( ); temperatura do meio na parede (próximo à entrada de água da camisa),( ); temperatura do meio a 8 cm da parede, ( ); temperatura do meio a 3 cm da parede, ( ).


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Te

mpe

ratu

ra (o

C)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


74

Figura 28 - Temperaturas em diferentes pontos do reator em função do tempo de cultivo nos ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação (ensaios A, G e B). Temperatura do ar de entrada,( ); temperatura da fase gasosa,( ); temperatura do meio na parede (próximo à saída de água da camisa),( ); temperatura do meio na parede (próximo à entrada de água da camisa),( ); temperatura do meio a 8 cm da parede, ( ); temperatura do meio a 3 cm da parede, ( ).

Os perfis de temperatura no interior do meio de cultura têm as mesmas

características dos perfis de respiração (figuras 22, 23 e 24), isto é, a temperatura do

meio inicialmente sobe para em seguida decrescer tal como verificado com o valor

de OUR, indicando que os padrões de agitação aplicados e a camisa de

resfriamento do reator não são suficientes para retirar, de forma eficiente, o calor

gerado pelo microrganismo. Todos os cultivos atingem temperaturas entre 46 e 48oC

a 8 cm da parede do reator. Entretanto, cultivos como os do ponto central mantêm


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144

Tempo de cultivo (h)T

empe

ratu

ra (o

C)


15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96 120 144


Tem

pera

tura

(oC

)


75

temperaturas acima de 30oC até próximo de 144 horas (figura 27), indicando

produção de calor e crescimento, enquanto que nos ensaios mais agitados como o B

e o F (figuras 27 e 28), a temperatura no meio (8 cm da parede) se estabiliza perto

do valor de controle, 30oC, por volta de 72 horas.

5.6.1.1. Crescimento celular

A quantificação do crescimento celular nos cultivos em meio sólido deve

prescindir da separação entre biomassa e meio de cultivo, uma vez que tal

separação é inviável. Dentre os métodos indiretos, foram analisados neste trabalho

o consumo de oxigênio, a produção de CO2, a concentração de proteína e de

ergosterol.

A respiração microbiana apresenta a vantagem não só de dispensar a

extração da biomassa mas também de dispensar a amostragem do meio, a qual não

é representativa uma vez que não é possível assegurar a homogeneidade como nos

cultivos submersos. Considerando que os cultivos de Monascus sp. foram realizados

sob aeração a vazão molar conhecida e controlada e análise da composição do gás

de saída, pôde-se estimar o crescimento celular indiretamente através do consumo

de oxigênio (item 4.6.7). O crescimento celular assim estimado foi relacionado aos

padrões de agitação aplicados e ao consumo total de oxigênio, OU, através do

ajuste de um modelo e análise de variância. A Tabela 10 mostra os valores do

consumo de oxigênio nos cultivos.


76

Tabela 10 - Consumo total de oxigênio, OU, em 138 horas de cultivo.

Número de rotações em

24 horas Intervalo entre os

eventos de agitação

Consumo de oxigênio (OU) (138 horas)

Ensaios Não

codificada Codificada Não

codificada Codificada (mol de O2)

A 17 -1 3 -1 68 B 53 1 3 -1 30 C 17 -1 11 1 50 D 53 1 11 1 50 E 12 -1,41 7 0 49 F 60 1,41 7 0 31 G 36 0 2 -1,41 68 H 36 0 12 1,41 35 I 36 0 7 0 71 J 36 0 7 0 37 K 36 0 7 0 31

Para o ajuste do modelo foi excluído o ensaio I que é um ponto central pois

apresentou consumo de oxigênio (OU) muito acima dos valores encontrados para as

duas outras repetições (ensaios J e K). Uma possível explicação para a falta de

reprodutibilidade pode estar na esterilização do substrato. O arroz é um material

composto principalmente de amido (80%) que é suscetível ao calor e a umidade.

Apesar dos cuidados tomados para minimizar as diferenças, as condições de

esterilização podem causar diferenças de consistência no meio modificando o

desempenho microbiano.

Os valores de consumo de oxigênio (OU) determinados nos cultivos deste

trabalho são da mesma ordem de grandeza de valores relatados na literatura. Marsh

et al. (1998) encontraram valores de 7,5 a 19,5 mol de O2/kg de substrato inicial

cultivando Rhizopus oligosporus em arroz, por 50 horas, em tambor rotativo.

Transformando os dados deste trabalho para as mesmas unidades obteve-se de 2 a

3 mol de O2/kg de substrato inicial em 50 horas e de 4,5 a 10 mol de O2/kg de

substrato inicial ás 138 horas de cultivo. Em ensaios em colunas de leito fixo

utilizando o mesmo microrganismo utilizado neste trabalho, obteve-se 3,5 mol de

O2/kg de substrato inicial nas primeiras 50 horas de cultivo e 10 mol de O2/kg de

substrato inicial ás 138 horas de cultivo (dados de trabalho de iniciação científica).

Desta forma, conclui-se que para os ensaios A, G e I não houve efeito deletério da


77

agitação sobre o consumo total de oxigênio. A Tabela 11 apresenta a análise da

variância do consumo total de oxigênio.

Tabela 11 - Análise de variância para consumo de oxigênio total.

Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 1523,23 304,65 3,38 0,131 Linear 2 754,35 377,18 4,19 0,104 Quadrático 2 426,63 213,31 2,37 0,210 Interação 1 342,25 342,25 3,80 0,123 Resíduo 4 360,19 90,05 Falta de ajuste 3 342,43 114,14 6,43 0,280 Erro puro 1 17,76 17,76 Total 9 1883,42

Através da análise da variância é possível afirmar que pelo menos uma das

variáveis tem significância ao nível de 85%. O “P” para a fonte regressão é maior

que 0,1, ou seja, não há significância ao nível de 90% mas podemos considerar que

85% é razoável por se tratar de um processo biológico sujeito a alta variabilidade.

Além disso, o erro devido ao ajuste do modelo tem valor de P igual a 0,28 sugerindo

que o modelo se ajusta aos dados. A tabela 12 apresenta os coeficientes calculados

para as variáveis codificadas e o P estimado para cada termo e a figura 29

apresenta os resíduos para o consumo de oxigênio total.

Tabela 12 - Coeficientes de regressão estimados para o consumo de oxigênio total

Termo Coef SE Coef T P

Constante 34,25 6,71 5,104 0,007

numero de rotações (NR) -7,87 3,36 -2,346 0,079

Intervalo (I) -5,69 3,36 -1,695 0,165

numero de rotações*numero de rotações 3,83 4,44 0,862 0,437

intervalo*intervalo 9,65 4,44 2,175 0,095

numero de rotações*intervalo 9,25 4,75 1,950 0,123

R-Sq = 80,88%


78

Excluindo o termo quadrático da variável número de rotações por não

apresentar significância ao nível de 85%, a equação do modelo ajustado para as

variáveis codificadas é a seguinte:

Consumo de O2 = 34,25 - 7,87*NR - 5,69*I + 9,65*I 2 + 9,25*NR*I Eq. 14

Observa-se que tanto a variável “número de voltas” quanto a “intervalo entre

os eventos de agitação” influenciam negativamente o desempenho do processo pois

apresentam coeficientes negativos. Todavia, os termos quadrático do intervalo e a

interação entre as variáveis têm sinal positivo. O coeficiente de correlação é de 0,81.

Figura 29 - Distribuição dos resíduos de consumo total de oxigênio

151050-5-10-15

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Residual

Perc

ent

Normal Probability Plot(response is OUR acumulado)

7060504030

10

5

0

-5

-10

Fitted Value

Residual

Versus Fits(response is OUR acumulado)


79

Através da figura 29, pode-se notar que os resíduos seguem uma distribuição

normal (todos os pontos estão próximos a linha azul) e que os resíduos estão

aleatoriamente distribuídos em torno do zero no gráfico de resíduos versus valores

ajustados, significando que a variância é constante para todos os níveis dos fatores

e não há nenhum ponto discrepante.

A figura 30 apresenta a superfície de resposta para a variável consumo de O2

Figura 30 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do consumo de oxigênio em função do

numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.

O maior consumo de oxigênio (OU) ocorre com menor número de voltas e

menor intervalo entre os eventos de agitação, ou seja, cultivos pouco agitados mas

40

60

80

2040

80

100

6

3

60

9

6

12

OUR acumulado

intervalo

numero de rotações

OUR acumulado (138h)


inte

rvalo

6050403020

11

9

7

5

3

>

–

–

–

–

< 30,0

30,0 40,0

40,0 50,0

50,0 60,0

60,0 70,0

70,0

acumulado

OUR

OUR acumulado (138 h)

A B

J, K

G

C

E

H

D

F

OU

OU


80

com eventos freqüentes (ensaio A). Isso pode ser explicado pela necessidade de

agitação para remoção de calor e metabólitos gasosos mas sem que o meio de

cultivo seja danificado ou compactado pela ação das pás.

Com base na equação 7 (Materiais e Métodos), verifica-se que a correlação

entre o aumento da biomassa e o consumo de oxigênio depende dos parâmetros

fator de conversão de oxigênio em biomassa (Yx/o) e coeficiente de manutenção (mo)

que refere-se à respiração necessária para manutenção da vida. Esses parâmetros

são na maioria das vezes determinados em meio líquido e em temperatura

controlada o que não ocorre nos cultivos em meio sólido em biorreatores. Dessa

forma pode-se optar por não converter o consumo de oxigênio em biomassa, a

exemplo de Marsh et al. (1998). Rearranjando a equação 7 (IKASARI;

MITCHELL,1998):

+== OO m

X

OURq

X/OY 2

µ Eq.15

A aplicação das equações 7 ou 18, em geral, pressupõe que YX/O seja

constante durante o cultivo, entretanto estes parâmetros não o são, pois dependem

da fisiologia do microrganismo, sendo que no início do cultivo e na fase exponencial

do crescimento mO pode ser desprezado em relação a µ. Assumindo-se YX/O e mO

constantes, tem-se que a maior velocidade especifica de crescimento, µ, ocorre com

a maior velocidade específica de consumo de oxigênio, qO2. Além disso, dado que

consumo de oxigênio e crescimento celular apresentam estreita correlação, pode-se

afirmar que ao maior consumo de oxigênio corresponde o cultivo com melhor

desempenho quanto ao crescimento.

Para determinar se existe relação entre a máxima velocidade de consumo de

oxigênio (OUR) observada e o padrão de agitação, foi feito um ajuste de modelo e

uma análise de variância para essa variável resposta (Tabelas 13 e 14).


81

Tabela 13 - Velocidade de consumo de oxigênio em 138 horas de cultivo.

Número de rotações em

24 horas Intervalo entre os

eventos de agitação OUR máximo

Ensaios Não

codificada Codificada

Não codificada

Codificada (mmol.h-1 de O2)

A 17 -1 3 -1 818 B 53 1 3 -1 779 C 17 -1 11 1 738 D 53 1 11 1 577 E 12 -1,41 7 0 705 F 60 1,41 7 0 720 G 36 0 2 -1,41 912 H 36 0 12 1,41 570 I 36 0 7 0 826 J 36 0 7 0 540 K 36 0 7 0 573

Para o ajuste deste modelo também foi excluído o ensaio I que é um ponto

central pois assim como no cálculo do consumo total do O2, também apresentou

valor discrepante dos valores encontrados para as duas outras repetições (ensaios J

e K).

Os valores apresentados para a velocidade máxima observada de O2 estão

na unidade de mmol.h-1. Quando apresentamos os dados em função da massa seca

inicial obtemos valores entre 80 e 122 µmol.h-1.gms-1 que são muito próximos dos

valores apresentados por Han and Mudgett (1992) que variaram de 113 a 156

µmol.h-1.gms-1 para cultivo de Monascus purpureus em coluna de leito fixo

suplementado com sulfato de zinco.

Tabela 14 - Análise de variância para OUR máximo

Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 128526 25705,1 8,75 0,028 Linear 2 77275 38637,6 13,16 0,017 Quadrático 2 47529 23764,7 8,09 0,039 Interação 1 3721 3721,0 1,27 0,323 Resíduo 4 11748 2937,0 Falta de ajuste 3 11203 3734,5 6,86 0,272 Erro puro 1 544 544,5 Total 9 140274


82

Através da análise da variância é possível afirmar que o termo linear e

quadrático da regressão têm influência ao nível de 90% e que, além disso, o erro

devido ao ajuste do modelo tem um p de 0,27 que sugere que o modelo se ajusta

aos dados de forma significativa. Os coeficientes calculados para as variáveis

codificadas e o P estimado estão na tabela 15

Tabela 15 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo


Constante 556,50 38,32 14,522 0,000

Numero de rotações (NR) -22,35 19,16 -1,166 0,308

Intervalo -95,71 19,16 -4,995 0,008

Número de Rotações*Número de Rotações 78,31 25,35 3,090 0,037

Intervalo*Intervalo 92,56 25,35 3,652 0,022

Número de rotações*intervalo -30,50 27,10 -1,126 0,323

R-Sq = 91,62%

Excluindo o termo da interação das variáveis por não apresentar significância

ao nível de 85%, a equação do modelo ajustado para as variáveis codificadas é a

seguinte:

OUR máx (mmol.h-1) = 556,5 - 22,35*NR - 95,71*I + 78,31*NR2 + 92,56*I 2 Eq. 16

Observa-se que tanto a variável “número de rotações” quanto a “intervalo

entre os eventos de agitação” influenciam negativamente a resposta pois

apresentam coeficientes negativos. Também se observa a maior influência do

intervalo pois seu coeficiente é mais que 4 vezes maior que o do número de

rotações. O coeficiente de correlação para esta variável resposta é de 0,92. A figura

31 apresenta a distribuição dos resíduos para a OUR máxima


83

Figura 31 - Distribuição dos resíduos de velocidade máxima observada de consumo de oxigênio

Através da figura 31 pode-se notar que os resíduos seguem uma

distribuição aproximadamente normal (todos os pontos estão próximos a linha azul)

e que os resíduos estão aleatoriamente distribuídos em torno do zero no gráfico de

resíduos versus valores ajustados, significando que a variância é constante para

todos os níveis dos fatores e não há nenhum ponto discrepante.

A figura 32 apresenta a superfície de resposta para a variável OUR máxima

100500-50-100

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Residual

Perc

ent

Normal Probability Plot(response is max OUR)

900850800750700650600550

50

25

0

-25

-50

Fitted Value

Residual

Versus Fits(response is max OUR)


84

Figura 32 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da velocidade de oxigênio máximo em

função do numero de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.

Pode-se observar que para essa variável resposta existe um valor mínimo, ou

seja a OUR será mínima com 40 rotações em 24 horas e com 9 horas de intervalo

entre os eventos de agitação.

A evolução da concentração de CO2 no gás de saída do biorreator pode ser

utilizada para acompanhar a respiração e conseqüentemente o crescimento celular.

A tabela 16 apresenta a produção total de CO2 dos cultivos.


inte

rvalo

6050403020

11

9

7

5

3

>

–

–

–

–

< 600

600 700

700 800

800 900

900 1000

1000

max OUR

OUR máxima

500

750

2040

1000

6

3

60

9

6

12

max OUR

intervalo


OUR máximo

A B

J, K

G

C

HD

F


85

Tabela 16 - Produção de dióxido de carbono em 138 horas de cultivo.

Número de rotações em 24 horas

Intervalo entre os eventos de agitação

Produção de CO2

Ensaios Não codificada

Codificada Não codificada

Codificada (moles CO2)

A 17 -1 3 -1 61 B 53 1 3 -1 35 C 17 -1 11 1 47 D 53 1 11 1 61 E 12 -1,41 7 0 63 F 60 1,41 7 0 42 G 36 0 2 -1,41 57 H 36 0 12 1,41 50 I 36 0 7 0 71 J 36 0 7 0 50 K 36 0 7 0 49

Para o ajuste deste modelo também foi excluído o ensaio I que é um ponto

central pois assim como no cálculo do consumo total do O2 e OUR máxima, este

também apresentou valor discrepante dos valores encontrados para as duas outras

repetições (ensaios J e K). A Tabela 17 apresenta a análise de variância para os

valores experimentais de produção de CO2

Tabela 17 - Análise de variância para a variável resposta produção de CO2


Através da análise da variância é possível afirmar que os termos lineares tem

influência ao nível de 90% e os termos quadráticos não tem influência significativa.

Desse modo os coeficientes calculados para as variáveis codificadas e o P estimado

estão na tabela 18


86

Tabela 18 - Coeficientes de regressão estimados para o OUR máximo


Constante 49,34 3,60 13,70 0,000

Numero de rotações (NR) -5,28 1,80 -2,933 0,043

Intervalo 0,33 1,80 0,19 0,862

Número de Rotações*Número de Rotações 1,15 2,38 0,48 0,654

Intervalo*Intervalo 1,38 2,38 0,58 0,595

Número de rotações*intervalo 10,03 2,55 3,94 0,017

R-Sq = 85,99%

Excluindo os termos quadráticos das variáveis por não apresentar significância ao

nível de 90%, a equação do modelo ajustado para as variáveis codificadas é a

seguinte:

Produção de CO2 (mol) = 49,34 - 5,28*NR + 0,33*I + 10,03*NR*I Eq. 17

Observa-se que a variável “intervalo entre os eventos de agitação” tem pouca

influência na resposta pois o coeficiente é baixo e o valor p não tem significância ao

nível de 90%. O coeficiente de correlação do modelo é de 0,86. A figura 33

apresenta a distribuição dos resíduos para a produção total de CO2


87

Figura 33 - Distribuição dos resíduos para a produção de dióxido de carbono.

Através da figura 33 pode-se notar que os resíduos seguem uma

distribuição normal (todos os pontos estão próximos a linha azul) e que os resíduos

estão aleatoriamente distribuídos em torno do zero no gráfico de resíduos versus

valores ajustados, significando que a variância é constante para todos os níveis dos

fatores e não há nenhum ponto discrepante.

A figura 34 apresenta a superfície de resposta para a produção de CO2.

7065605550454035

5,0

2,5

0,0

-2,5

-5,0

Fitted Value

Residual

Versus Fits(response is produção de CO2)

1050-5-10

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Residual

Percent

Normal Probability Plot(response is produção de CO2)


88

Figura 34 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da produção de CO2 em função do numero

de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.

Da mesma forma que para o cálculo do consumo de total de oxigênio,

os maiores valores de produção de CO2 são os dos ensaios com menor número de

voltas e frequentemente agitados (ensaio A). As duas superfícies, apesar de

apresentarem curvaturas diferentes, têm o mesmo perfil (figuras 30 e 34). Os

ensaios na região de maior número de voltas e maior intervalo entre os eventos de

agitação também apresentam alta produção de CO2.

20

40

60

2040

60

80

6

3

60

9

6

12

CO2 (moles)

intervalo


Produção de CO2


inte

rvalo

6050403020

11

9

7

5

3

>

–

–

–

–

–

< 30

30 40

40 50

50 60

60 70

70 80

80

de CO2

produção

Produção de CO2 (moles)

A B

J, K

G

C

E

H

D

F


89

Ao observarmos a máxima OUR alcançada, notamos que o ensaio A

também fica na região de maiores valores. O ensaio B também se localiza numa

região de valores elevados de máxima OUR, porém em relação ao consumo total de

O2 e produção de CO2 está localizado na região de pior desempenho. Isso

provavelmente ocorre pois a maior e mais freqüente agitação na fase de

crescimento favorece a dissipação de calor e a homogeneidade mas também

compacta o meio dificultando a transferência de oxigênio e a continuidade do cultivo.

A Figura 22 mostra claramente queda da respiração a partir de 50 horas para o

ensaio B.

Foram feitas medidas de proteína total, com amostras retiradas a cada 24

horas (sempre após um evento de agitação) a fim de tentar estimar o crescimento

celular apesar da concentração inicial de proteína no arroz ser significativa (cerca de

7% em massa) e única fonte de nitrogênio (TABELA BRASILEIRA DE

COMPOSIÇÃO DE ALIMENTOS, 2010).

O conteúdo de proteína no instante inicial dos cultivos corresponde apenas ao

substrato, sendo desprezível a parcela relativa ao inóculo. Conforme o crescimento

microbiano evolui, o nitrogênio presente no arroz, quase que unicamente na forma

de proteína, vai sendo consumido pelo microrganismo e incorporado à proteína

celular. Desta forma não é possível determinar, qual a proporção de proteína

presente nas células, e qual a proporção que ainda não foi consumida e encontra-se

no substrato.

Durante os cultivos em reator são perdidos de 30 a 50 % da massa seca na

forma de CO2 e outros compostos voláteis como etanol e ácidos orgânicos. Essa

perda de massa chega a 60 % em cultivos em erlenmeyer (item 5.5). Deste modo, a

concentração de proteína deve ser corrigida.

É conhecida apenas a massa seca inicial, que consiste em substrato e

inóculo, e a massa seca final que resta no reator ao término do cultivo. Utilizando as

medidas de proteína e a composição elementar do arroz e do microrganismo

(ROSEMBLITT et al., 2000), foi feito um balanço entre o conteúdo de nitrogênio

inicial e final. Os resultados não são precisos devido a erros de medida da massa

final (perda de massa durante a retirada de amostras) ou algumas considerações

como utilizar apenas a composição elementar do microrganismo no cálculo do

nitrogênio ao final do cultivo uma vez que não é possível saber qual é a proporção

de arroz e de microrganismo no meio. As quantidades de proteína e nitrogênio no


90

inóculo foram consideradas desprezíveis pois são aproximadamente 800 ml com 2,5

g/l de massa seca, o que significa 0,9 g de proteína por ensaio distribuídos em 6750

g de arroz das quais, 230 g são proteína. As quantidades de proteína e nitrogênio no

inóculo foram desprezadas, pois num inóculo de aproximadamente 800 ml de

suspensão de células a 2,5 g/l, haveria 0,9 g de proteína distribuída em 6750 g de

arroz das quais 479 g são proteína, portanto, o aporte de proteína através do

inóculo, representa somente 0,2% da proteína do arroz. A tabela 19 apresenta os

dados de proteína e balanço de nitrogênio.

Tabela 19 - Medidas de Concentração de proteína e balanço de nitrogênio.

Instante inicial (0 h) Instante final (138 h) Massa

seca substrato

(g)

Proteína medida

(g.gms-1)

Proteína Total (g)*

Nitrogênio (g) **

Massa seca meio (g)

Proteína (g.gms-1)

Proteína Total (g)

Nitrogênio (g) ***

A 6750 0,054 479 119 3277 0,27 885 105 B 6750 0,075 479 119 4247 0,21 892 106 C 6750 0,061 479 119 3646 0,34 1240 147 D 6750 0,080 479 119 3266 0,35 1143 135 E 6750 0,040 479 119 3288 0,32 1052 125 F 6750 0,100 479 119 4737 0,43 2037 241 G 6750 0,081 479 119 3105 0,26 807 96 H 6750 0,090 479 119 4133 0,45 1860 220 I 6750 0,069 479 119 3708 0,27 1001 118 J 6750 0,060 479 119 3695 0,3 1108 131 K 6750 0,070 479 119 3707 0,4 1483 175 *Calculada utilizando o valor de 0,071 g.gms-1 (média das medidas nos instantes inicias). **Composição elementar do arroz : CH1,4455O0,7973N0,0335 (Rosemblitt et al., 2000) ***Calculado considerando toda proteína contida no microrganismo. Composição elementar do Monascus : CH1,4737O0,8118N0,0947 (Rosemblitt et al., 2000).

Observa-se que há um substancial aumento na massa de proteína, chegando

esse aumento a quatro vezes para o ensaio F, entretanto a massa de nitrogênio se

mantém da mesma ordem de grandeza no início e no final do cultivo para a maioria

dos ensaios como seria o esperado. Os ensaios F, H e K apresentam conteúdos de

nitrogênio acima do esperado. Uma possível explicação seria o erro nas análises

uma vez que a concentração inicial de proteína nesses ensaios é maior do que os

demais. A medida de concentração de proteína no início dos cultivos variou de 4 a

10% sendo que a matéria prima usada foi sempre a mesma.


91

Para a correção da concentração de proteína foi estabelecida uma curva de

decaimento de massa seca, utilizando dados de experimentos em coluna e em

frascos (como os do ensaio de suplementação, item 5.5), com base nas quais se

aproximou uma função linear entre a massa (inicial e final) e o tempo de cultivo. A

figura 35 apresenta os resultados de dosagem de proteína para os ensaios e a

média dos pontos centrais com o desvio padrão.

Figura 35 - (A) Massa total de proteína em função do tempo de cultivo para os ensaios. Os ensaios com intervalos maiores entre os eventos de agitação têm símbolos cheios – ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e ( ) ensaio H; os ensaios com os menores intervalos entre os eventos de agitação têm os símbolos vazados – ( ) ensaio A, ( ) ensaio B e ( ) ensaio G; os ensaios com os intervalos de agitação médios são – (∗) ensaio E e (+) ensaio F; (B) Massa total média de proteína em função do tempo de cultivo para os ensaios no ponto central. As barras representam o desvio padrão

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 24 48 72 96 120 144

Tempo (h)

Mas

sa d

e p

rote

ína

(g)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 24 48 72 96 120 144

Tempo (h)

Mas

sa d

e p

rote

ína

(g)

A

B


92

Verifica-se que os resultados são muito próximos para todos os cultivos, com

exceção dos ensaios H e F que assim como no conteúdo de nitrogênio, apresentam

valores acima dos demais conforme já foi discutido com base na Tabela 19.

Esse comportamento é confirmado pelo ajuste de um modelo para uma

superfície de resposta para a concentração de proteína que apresenta um

coeficiente de correlação menor do que 55%. A tabela 20 apresenta análise de

variância para os resultados de concentração de proteína.

Tabela 20 - Análise de variância para a concentração de proteína


Os valores de P indicam que os fatores estudados não tem efeito sobre a

variável resposta ao nível de 90% de significância. Isso mostra que não se encontra

relação direta entre a concentração de proteína e o padrão de agitação aplicado

durante os cultivos.

Outro método para a estimativa de concentração celular é o uso de medidas

de componentes celulares que são exclusivos do microrganismo como o ergosterol

que é um componente da membrana celular

Para implantação da rotina de ergosterol foram consideradas algumas

metodologias publicadas (MONTGOMERY et al., 2000; KLAMER e BAATH, 2004) e

entre elas optou-se por testar aquelas empregadas por Carvalho e colaboradores

(2006), que usou o método na determinação de ergosterol em Monascus, e

Jedlickova e colaboradores (2008), que apresentam a concentração de ergosterol

em variedades de malte e cevada e é o artigo mais recente. A tabela 21 mostra

resumidamente os métodos testados.


93

Tabela 21- Dois métodos de extração de ergosterol

Etapas Carvalho et al.. (2006) Jedlickova (2008) Substrato 0,5 g 10 g Solvente 2 ml etanol + 1ml NaOH (2M) 50 ml metanol Incubação 700C por 30 min 650C por 30 min

Solvente 2ml HCl + 1ml KHCO3 + 2ml

hexano 3 g KOH + 10 ml hexano + 5 ml

água Centrífugação 3000 g por 10 min _ Extração 2 ml hexano (3x) 10 ml hexano (3x) Evaporação Vácuo 350C 700C até secar Ressuspensão 200 ml hexano 5 ml metanol

Embora a estimativa de crescimento celular através da medida de ergosterol

seja contestada por haver mudanças de seu conteúdo nas células em diferentes

estágios do crescimento (Desgranges et al.,1991), os resultados obtidos para

Monascus sp. cultivado em meio líquido foram bastante satisfatórios. A figura 36

mostra a correlação da massa de ergosterol e da massa seca e a figura 37 mostra a

concentração de ergosterol nas células em função do tempo de cultivo.

Figura 36 - Correlação entre a massa de ergosterol e a massa seca de células.

y = 2.8428x - 0.142

R2 = 0.8486

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 0.1 0.2 0.3 0.4

Massa celular seca (g)

Erg

ost

erol

(mg

)


94

Figura 37 - Concentração específica de ergosterol em relação à massa de células durante o cultivo

em meio líquido.

O valor médio da concentração de ergosterol foi de 2,16 mg.gcél-1. Observa-

se que a distribuição dos pontos é homogênea e que não há tendência de aumento

com o tempo apesar do valor do desvio padrão ser de aproximadamente 17%.

A figura 38 mostra a variação da concentração de ergosterol ao longo do

cultivo para os experimentos do planejamento fatorial rotacional.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 24 48 72 96 120 144


Co

ncen

traçã

o de

erg

ost

erol

(m

g/gc

él)


95

Figura 38 - (A) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo para os ensaios. Os ensaios com intervalos maiores entre os eventos de agitação têm símbolos cheios – ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e (•) ensaio H; os ensaios com os menores intervalos entre os eventos de agitação têm os símbolos vazados – ( ) ensaio A, ( ) ensaio B e ( ) ensaio G; os ensaios com os intervalos de agitação médios são – (∗) ensaio E e (+) ensaio F; (B) Concentração de ergosterol em função do tempo de cultivo para os ensaios no ponto central. As barras mostram o desvio padrão.

Observa-se que os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de

agitação apresentaram maiores valores de ergosterol, com exceção do ensaio C,

indicando maior crescimento celular.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 24 48 72 96 120 144

Tempo (h)

Erg

ost

ero

l (m

g/g

ms)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 24 48 72 96 120 144

Tempo (h)

Erg

oste

rol (

mg/

gm

s)

A

B


96

Para verificar se existe influência dos padrões de agitação sobre a

concentração de ergosterol foi feita uma análise de regressão dos experimentos

realizados.

A tabela 22 mostra os resultados obtidos para cada experimento.

Tabela 22 - Teor de ergosterol após 138 horas de cultivo

Número de rotações em 24

horas Intervalo entre os eventos

de agitação Ergosterol

Ensaios Não codificada Codificada Não

codificada Codificada (mg. gms-1)

A 17 -1 3 -1 0,25 B 53 1 3 -1 0,06 C 17 -1 11 1 0,17 D 53 1 11 1 0,72 E 12 -1,41 7 0 0,43 F 60 1,41 7 0 0,31 G 36 0 2 -1,41 0,29 H 36 0 12 1,41 0,54 I 36 0 7 0 0,65 J 36 0 7 0 0,55 K 36 0 7 0 0,62

Tabela 23 - Análise de variância para variável resposta teor de ergosterol


Através da análise da variância, é possível afirmar que os termos linear,

quadráticos e a interação têm influência ao nível de 90%. Desse modo, os

coeficientes calculados para as variáveis codificadas e o P estimado para cada

efeito do modelo estão na tabela 24.


97

Tabela 24 - Coeficientes de regressão estimados para concentração de ergosterol

Termo Coef SE Coef T P Constante 0,60667 0,06497 9,338 0,000 Numero de rotações 0,02530 0,03978 0,636 0,553 intervalo 0,11607 0,03978 2,918 0,033 Numero de rotações*numero de rotações -0,14271 0,04735 -3,014 0,030 intervalo*intervalo -0,11896 0,04735 -2,512 0,054 Numero de rotações*intervalo 0,18625 0,05626 3,310 0,021 R-Sq = 86,43%

A equação do modelo ajustado para as variáveis codificadas é a seguinte:

Ergosterol = 0,61 + 0,021*NR + 0,12*I - 0,14*NR2 - 0,12*I2 + 0,19*NR*I Eq. 18

(mg. gms-1)

Através dos valores de P é possível afirmar que todos os efeitos têm

influência sobre o modelo exceto o fator número de rotações linear, pois o

coeficiente é pequeno em relação aos outros efeitos e o p não indica significância ao

nível de 85%. O coeficiente de correlação do modelo é de 0,86.

As análises de distribuição não mostram desvios da normalidade (figura 39) e

as superfícies de resposta geradas estão apresentadas na figura 40.


98

Figura 39 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para a concentração de ergosterol

0,20,10,0-0,1-0,2

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Residual

Perc

ent

Normal Probability Plot(response is Teor ergosterol)

0,70,60,50,40,30,20,10,0

0,15

0,10

0,05

0,00

-0,05

-0,10

-0,15

Fitted Value

Residual

Versus Fits(response is Teor ergosterol)


99

Figura 40 - Superfície de resposta e gráfico de contorno da concentração de ergosterol em função do

número de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.

A Figura 40 mostra que a região de maior concentração de ergosterol, e

portanto de maior crescimento microbiano, ocorre entre os cultivos com maior

número de voltas e maiores intervalos entre os eventos de agitação e os pontos

centrais. Isso indica que agitação favoreceu o aumento de biomassa desde que

usado em níveis adequados.

A tabela 25 apresenta um resumo dos resultados de consumo de oxigênio

(OU), produção de CO2 (CE) e concentração de ergosterol calculados pelos modelos


inte

rvalo

6050403020

11

9

7

5

3

>

–

–

–

< 0,0

0,0 0,2

0,2 0,4

0,4 0,6

0,6

ergosterol

Teor

Teor de ergosterol

A B

I, J, K

G

C

E

H nume ro de rotações

intervalo

6050403020

119

753

D

F

-0,5

0,0

2040

0,5

6

3

60

9

6

12

Teor ergosterol

intervalo


Teor ergosterol


100

(equações 15, 19 e 20), apresenta também os resultados de proteína total e RQ. O

coeficiente respiratório foi calculado separadamente para cada fase dos cultivos: (1)

fase de maior crescimento (entre 6 e 30 horas), (2) fase entre o início do decaimento

da respiração até a OUR atingir 250 mmoles.h-1. Abaixo desse valor, o erro de

medida do equipamento fica grande em relação ao valor da leitura, distorcendo os

resultados.

Tabela 25 - Parâmetros da respiração calculados pelos modelos

Ensaios OU (138 horas) CE (138 horas)

RQ1* RQ2

** Proteína Ergosterol

(mol) (mol) (g) (mg/gms) A 69,44 66,34 1,13 0,87 885 0,39 B 35,20 35,71 1,20 1,12 892 0,07 C 39,57 46,93 1,08 1,02 1240 0,25 D 42,33 56,44 1,07 1,21 1143 0,67 E 49,76 58,83 1,09 1,30 1052 0,29 F 27,50 43,89 1,36 1,20 2037 0,36 G 62,69 50,89 - 0,86 807 0,20 H 46,61 51,82 1,57 1,3 1860 0,53 I 38,62 51,36 1,13 0,88 1001 0,61 J 38,62 51,36 1,43 1,29 1108 0,61 K 38,62 51,36 1,46 1,42 1483 0,61

* RQ calculado para a fase de crescimento ** RQ calculado para a fase após o declínio da respiração

Nota-se que não existe relação direta entre os parâmetros adotados para

estimativa do crescimento celular.

A região de mínimo consumo de O2 (figura 30) é também a região de mínima

produção de CO2 (figura 34) e de mínima concentração de ergosterol (figura 40),

enquanto que a região de máxima concentração de ergosterol também apresenta

alto consumo de O 2 e alta produção de CO2, embora não sejam os pontos de

máximo. Isso deve ocorrer devido à adaptação do metabolismo do fungo às

diferentes condições do meio. O crescimento ocorre em fases e é dependente de

uma série de fatores, como temperatura, umidade, pH, disponibilidade de nutrientes

e oxigênio, consistência do substrato. Desta forma é possível pensar que para cada

fase do crescimento deva ser adotado um tipo de controle e também que cada

variável seja mais adequada para avaliar o desempenho de diferentes etapas.


101

Os ensaios que apresentaram as menores fases lag foram dos ensaios com

maiores intervalos entre os eventos de agitação (figura 22), desta forma, para

minimizar o tempo de adaptação do microrganismo ao meio, talvez deva-se deixar o

leito sem agitação, uma vez que não há calor a retirar do meio e o microrganismo

poderia “colonizar” o substrato sem interferência.

A obtenção de energia pelo microrganismo pode oscilar entre aeróbia e

respirofermentativa durante todo o cultivo. Num mesmo instante é possível haver

pontos no reator onde esteja ocorrendo aerobiose enquanto que em outros, ocorre

anaerobiose devido a não homogeneidade do meio. O consumo de glicose como

fonte de carbono e energia por vias aeróbias resulta RQ muito próximo a 1,

entretanto Bajracharya e Mudgett (1980) consideram RQ entre 1,3 e 1,0 como

crescimento tipicamente aeróbio de Aspergillus oryzae cultivado em arroz.

No metabolismo respirofermentativo ocorre formação de etanol e produção de

CO2 sem consumo de O2 e portanto o RQ seria maior que 1. O Monascus sp. é

produtor de etanol (ROSENBLITT et al., 2000) e também o utiliza como fonte de

carbono e energia (JUZLOVA et al., 1994). O consumo de fontes de carbono tais

como ácidos graxos e ácidos orgânicos, em cujo catabolismo é consumido maior

número de moléculas de oxigênio do que liberação de moléculas de CO2 resulta RQ

menor do que 1. Deste modo o RQ oscila durante todo o cultivo trazendo pouca

informação.

Os cultivos mais freqüentemente agitados (A, G e B) atingiram valores

maiores de OUR, indicando que agitação promoveu a retirada de calor e as

transferências gasosas necessárias. Porém, principalmente o ensaio B parece ter

sido afetado pelo excesso de agitação uma vez que a respiração cai rapidamente e

chega a menos de 200 mmol.h-1 (leitura de 20,3 de oxigênio) perto de 72 horas.

Ensaios que não atingem OUR tão altas, como os do ponto central e os menos

agitados, como o G e o E, permanecem com velocidades de respiração maiores que

200 mmol.h-1 por mais de 120 horas. O ensaio A apresentou alta OUR com 24 horas

e permaneceu com atividade até 144 horas.

O parâmetro conteúdo de proteína não apresentou correlação com os

padrões de agitação adotados, porém, os resultados estão de acordo com os de teor

de ergosterol. Os melhores resultados ocorrem para os cultivos na região mais

agitada e com intervalos maiores entre os eventos de agitação como os pontos

centrais e os ensaios F e H. Nessa região, o consumo de oxigênio abaixo do


102

consumo máximo pode ser atribuído à agitação excessiva, que compacta o meio

mais rapidamente.

5.6.1.2. Análises de Umidade, ART e Produção de Pigmentos

Além das medidas relacionadas ao crescimento celular, também foram

determinadas as variáveis ART (açúcares redutores totais), umidade do meio e

produção de pigmentos de cor vermelha e laranja. As medidas dessas variáveis

permitiram não somente avaliar o desempenho do cultivo de Monascus sp., bem

como avaliar a homogeneidade do meio com base na variação dos valores das

referidas variáveis em diferentes pontos do reator, contemplando assim, o objetivo

de definir metodologia para ampliação de escala no reator com agitação interna.

A medida de ART representa o consumo da fonte de carbono mais abundante

– glicose – além de representar indiretamente o crescimento celular. Considerando-

se que ácidos orgânicos e produtos de fermentação também podem ter sido

empregados pelo fungo para crescimento e manutenção, fica claro que relacionar o

consumo de ART ao crescimento celular é uma aproximação. Já a quantificação dos

pigmentos não pode ser diretamente relacionada ao crescimento uma vez que se

trata de metabólito secundário.

A medida de açúcares redutores, AR, foi na verdade a medida exclusiva de

glicose, de modo que havendo AR, é possível supor que há limitação ao consumo

da mesma pelo fungo, que não a limitação pela disponibilidade da fonte de carbono

e energia.

Para padronizar os ensaios, tentou-se manter a umidade constante e próxima

a 45% em base úmida. Para tanto, se recorreu à reposição de água quando a

umidade, medida, no analisador infravermelho, resultava abaixo de 45%.

Padronizou-se adicionar a água juntamente com um evento de agitação para que

essa fosse imediatamente misturada ao meio sem a necessidade de alterar o padrão

de agitação estabelecido. A tabela 26 apresenta as quantidades de água e os

instantes em que foram adicionadas.


103

Tabela 26 - Volume de água (mL) adicionado em cada ensaio para reposição de água evaporada.

Tempo Ensaios 24 horas 48 horas 96 horas

A 500 ml 500ml B 500 ml C 500 ml 500 ml D 500 ml E 500 ml 500 ml F G 500 ml H I 750 ml 500 ml J K 500 ml

O planejamento inicial previa a adição gradual de água para que não

houvesse oscilações na umidade, porém problemas de comunicação entre o sistema

de aspersão e o computador impediram seu uso como relatado no item 5.2.

As figuras 41, 42 e 43 apresentam os valores de umidade retirados pelo

amostrador após um evento de agitação dos ensaios em função do tempo de cultivo.

Figura 41 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e ( ) ensaio H.

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

H2O

/g t

ota

l)


104

Figura 42 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios no ponto central, (-) ensaio I, ( ) ensaio J e ( ) ensaio K e com intervalo médio entre os eventos de agitação, (∗) ensaio E, (+) ensaio

F.

Figura 43 - Umidade em função do tempo de cultivo dos ensaios com menor intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio A, ( ) ensaio G e ( ) ensaio B.

Observa-se que a umidade permaneceu estável durante os cultivos com

menor intervalo entre os eventos de agitação, A, G e B, entre 0,45 e 0,5. Os cultivos

com intervalos médios entre os eventos de agitação oscilaram um pouco mais.

As figuras 44 e 45 apresentam os valores de ART e AR em função do tempo.

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

H2O

/g t

ota

l)

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

H2O

/g t

ota

l)


105

Figura 44 - Concentração de ART em função do tempo de cultivo, ( ) ensaio A; ( ) ensaio B; ( )

ensaio C e (-) ensaio I (ponto central)

Figura 45 - Concentração de AR em função do tempo de cultivo, ( ) ensaio A; ( ) ensaio B; ( ) ensaio

C; (-) ensaio I (ponto central) e ( ) ensaio G.

Observa-se que houve um consumo entre 45% (ensaio A) e 60 % (ensaio I)

do ART inicial (amido), ou seja, havia fonte de carbono na forma de amido quando

da cessação do crescimento, mas, provavelmente inacessível por estar no interior

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 24 48 72 96 120 144


AR

T (

g g

lico

se/g

ms)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0 24 48 72 96 120 144


AR

(g

gli

cose

/gm

s)


106

dos grãos ou por outros fatores como a compactação do meio. Somente alguns

ensaios foram apresentados, pois, alguns resultados foram perdidos.

A figura 45 mostra que há uma tendência de aumento na concentração de AR

por volta de 48 de cultivo, momento em que a OUR já começa a diminuir para todos

os cultivos. Entretanto, não há queda no consumo de substrato nesse momento,

indicando apenas que a quantidade de amido que está sendo hidrolisada está sendo

gradativamente consumida. O excesso de glicose pode induzir a formação de etanol

pela via aeróbia (PASTRANA et al., 1995 e ROSENBLITT et al., 2000), porém isso

inibe a produção de pigmentos (CARELS e SHEPHERD, 1975 e CHEN e JOHNS,

1994).

As figuras 46 e 47 apresentam os resultados da medida da absorbância 500

nm (pigmentos vermelhos) e 400 nm (pigmentos laranja) em função do tempo de

cultivo


107

Figura 46 - Pigmentos vermelhos (absorbância a 500nm) em função do tempo para (A) ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio C, ( ) ensaio D e ( ) ensaio H. (B) cultivos no

ponto central, (-) ensaio I, ( ) ensaio J e ( ) ensaio K e com intervalo médio ( 7 horas) entre os eventos de agitação, (∗) ensaio E, (+) ensaio F; (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de

agitação , ( ) ensaio A, ( ) ensaio G e ( ) ensaio B.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 24 48 72 96 120 144


Ab

s (5

00n

m)/

gm

s

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 24 48 72 96 120 144


Ab

s (5

00n

m)/

gm

s

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 24 48 72 96 120 144


Ab

s (5

00n

m)/

gm

s

A

C

B


108

Figura 47 - Pigmentos laranja (absorbância a 400nm) em função do tempo para (A) ensaios com maior intervalo entre os eventos de agitação, ( ) ensaio C, ( ) ensaio H e ( )ensaio D. (B) cultivos no

ponto central, (-) ensaio I, ( ) ensaio J e ( ) ensaio K e com intervalo médio ( 7 horas) entre os eventos de agitação, (∗) ensaio E, (+) ensaio F; (C) cultivos com menor intervalo entre os eventos de

agitação , ( ) ensaio A, ( ) ensaio G e ( ) ensaio B.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Ab

s (4

00n

m)/

gm

s

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Ab

s (4

00n

m)/

gm

s

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Ab

s (4

00n

m)/

gm

s

A

B

C


109

Nota-se que os ensaios com intervalos menores entre os eventos de agitação

produziram significativamente menos pigmentos nos dois comprimentos de onda e

que o ensaio mais agitado (ensaio B) foi o que menos produziu, provavelmente pela

dificuldade de transferência de oxigênio causada pela compactação do meio. Para

os ensaios com intervalos médios entre os eventos de agitação houve bastante

variação na produção, principalmente entre os ensaios no ponto central,

evidenciando a grande variabilidade do processo e impedindo o ajuste de uma

superfície de resposta.

Os perfis de produção de pigmentos vermelhos e laranja são muito

semelhantes para todos os cultivos, indicando que as produções são dependentes.

Porém todos os ensaios produziram cerca de 2 a 4 vezes mais pigmentos laranja do

que vermelho o que pode ser resultado da limitação por glutamato monossódico, o

qual participa da reação química de conversão da cor laranja à vermelha (Li e

Demain, 1991) ou falta de oxigênio.

Rosenblitt et al. (2000) encontraram quantidades insignificantes de pigmentos

vermelhos em relação aos laranjas em cultivos de Monascus em arroz (quantificando

em HPLC) e atribuem isso ao fato de não terem usado peptona como suplemento,

uma vez que produção total de pigmentos se compara à obtida por Chen e Johns

(1994) que usaram o suplemento.

Quando se compara a produção de pigmentos nos ensaios teste 1 e 3, cuja

diferença é a vazão específica de ar, de 1,2 e 3,0 l.min-1.kgms inicial-1

respectivamente, com padrão de agitação de 10 rotações a cada 24 horas item

5.1.4), observa-se que a razão entre os pigmentos vermelho e laranja, de 0,4 vezes

no ensaio 1 aumenta para 0,7 no ensaio 3 que é a mesma razão obtida para o

ensaio de suplementação padrão em frascos (item 5.5).

A figura 48 apresenta a evolução da produção de pigmentos para os ensaios

teste 1 e 3 e a Tabela 27 apresenta as relações entre a produção de pigmentos

laranja e vermelho.


110

Figura 48 - Pigmentos em função do tempo para os ensaios teste 1 ( ) 400 nm, ( ) 500 nm e ensaio

teste 3 ( ) 400 nm, ( ) 500 nm.

Tabela 27 - Razão entre produção de pigmentos vermelho e laranja para os ensaios do planejamento

fatorial e os ensaios teste 1 e 3

Absorbância 500nm/Absorbância 400nm

Tempo 1* 3* A B C D E F G H I J K

0 0,93 1,00 0,38 0,38 1,00 0,50 0,00 0,32 1,00 0,43 0,26 0,45 0,33

24 0,86 0,50 0,26 0,38 0,27 0,26 0,23 0,22 0,53 0,30 0,21 0,22 0,24

48 0,48 0,31 0,26 0,33 0,37 0,23 0,26 0,24 0,31 0,28 0,25 0,28 0,25

72 0,49 0,58 0,26 0,29 0,31 0,30 0,29 0,25 0,27 0,26 0,30 0,25 0,25

96 0,42 0,72 0,26 0,29 0,29 0,30 0,30 0,25 0,23 0,27 0,37 0,60 0,28

120 0,44 0,65 0,29 0,32 0,37 0,41 0,34 0,26 0,22 0,29 0,51 0,27 0,28

144 0,39 0,70 0,34 0,33 0,42 0,44 0,35 0,26 0,24 0,28 0,47 0,30 0,33

• Ensaios teste (5.1.4)

De acordo com a Tabela 27, a razão entre pigmentos vermelho e laranja é

maior no ensaio mais aerado (teste 3) em relação a todos os outros ensaios. Além

disso, verifica-se com base nos dados das figuras 46, 47 e 48 que a produção de

pigmentos vermelhos atingiu 144 U.gms-1 no ensaio 3 (10 rotações em 24 horas) e

75 U.gms-1 no ensaio F (melhor produção do planejamento fatorial), indicando que a

0

100

200

300

400

500

600

0 48 96 144 192 240


Ab

s /g

ms


111

aeração influencia na produção de pigmentos e na razão entre os pigmentos

vermelhos e laranjas. Juzlova; Martinkova e Kren (1996) escreveram que a falta de

oxigênio prejudica mais a produção de pigmentos do que o crescimento, uma vez

que o fungo é capaz de fermentar. Pereira; Tonso e Kilikian (2008) verificaram

aumento de 100% na produção de pigmentos vermelhos em cultivos líquidos

aumentando a concentração de oxigênio dissolvido de 10 para 60%.

Observando o ensaio teste 4 (item 5.4.1), também pode-se notar que há um

atraso na produção de pigmentos em relação ao ensaio teste 3. A diferença entre

esses cultivos é o intervalo entre os eventos de agitação. O ensaio 3 foi agitado 10

rotações das pás a cada 24 horas e o ensaio 4 foi agitado com 1 rotação das pás a

cada 2 horas. Esse resultado está de acordo com os resultados obtidos nos ensaios

do planejamento fatorial que mostram os ensaios mais frequentemente agitados com

a produção menor de pigmentos até 144 horas (figura 47c).

A maior produção ocorreu no ensaio F e foi, até 144 horas, de 75 U.gms-1 de

pigmentos vermelhos e de 287,2 U.gms-1 de pigmentos laranjas. Vale ressaltar que a

produção de pigmentos laranjas para o ensaio 3 foi de 207 U.gms-1 em 144 horas

mas chegou a 668 U.gms-1 em 255 horas.

Os experimentos foram conduzidos até 144 horas para privilegiar o estudo do

crescimento do microrganismo e foram executados com aeração média (14 l.min-1),

o que pode ter ocasionado falta de oxigênio para a produção de pigmentos por

deficiência da transferência ou por compactação do meio devido a agitação. Isso

explicaria o fato dos cultivos A ,G e o I, que consumiram tanto oxigênio quanto os

cultivos em colunas conduzidos sob a mesma vazão específica de ar (2 l.gms-1.h-1),

terem produzido, respectivamente, 37, 14 e 43 U.gms-1 contra 450 U.gms-1 em

colunas (trabalho de iniciação científica desenvolvido no laboratório).

5.6.2. Homogeneidade

Foram retiradas amostras de diferentes pontos do reator antes dos eventos de

agitação conforme descrito no item 4.5 (figura 4), para avaliação da homogeneidade

do meio com base na determinação da umidade, proteína e pigmentos. As figuras

49, 50 e 51 apresentam a variabilidade da umidade nos pontos amostrados durante

o cultivo.


112

Figura 49: Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação, C, H e D em diferentes pontos do reator ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Ensaio C

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio D

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio H

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)


113

Figura 50 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com intervalo médio

entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K) em diferentes pontos do

reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Ensaio E

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio F

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio I

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio J

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio K

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)


114

Figura 51 - Umidade do meio de cultivo em função do tempo para os ensaios com menores intervalos

entre os eventos de agitação, A, G e B em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Os valores de umidade nos diferentes pontos amostrados no reator ilustram a

maior ou menor homogeneidade do meio de cultivo. Os ensaios com maiores

intervalos entre os eventos de agitação (figura 49) apresentam maiores diferenças

entre os pontos amostrados e, entre esses ensaios, o número de voltas também

influencia. O ensaio C (figura 49) apresenta maior variação de umidade entre os

pontos amostrados. Os ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de

agitação também apresentam diferenças e mais uma vez o número de rotações

influenciou e o ensaio com menor numero de rotações (E) apresentou maiores

Ensaio A

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio B

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)

Ensaio G

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0 24 48 72 96 120 144


Um

idad

e (g

/g)


115

diferenças enquanto que o ensaio com maior número de voltas se mostrou bastante

homogêneo. Dentre os ensaios mais frequentemente agitados (figura 51), o ensaio B

(um dos mais agitados) apresenta maior homogeneidade. Observa-se que para a

maioria dos ensaios os pontos “d” e “e” que foram retirados da superficie e do fundo

do reator respectivamente, apresentam umidades muito próximas indicando maior

homogeneidade no sentido radial. As maiores diferenças ocorrem no sentido axial

(pontos a, b e c). Essa constatação sugere a necessidade de projeto de reator e

sistema de agitação que melhore a homogeneidade no sentido axial.

As figuras 52, 53 e 54 apresentam os resultados de concentração de proteína

para os diferentes pontos amostrados.

Figura 52 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+)

e.

Ensaio H

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio D

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio C

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)


116

Figura 53 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com intervalos médios entre os eventos de agitação (E e F) em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Ensaio K

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio J

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio I

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)Ensaio F

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio E

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)


117

Figura 54 - Concentração de proteína em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação (C, H e D) em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+)

e.

Os resultados de concentração de proteína não ilustram a diferença nos

padrões de agitação, ou seja, apesar de haver diferença de umidade não foi possível

notar diferença de concentração de proteína nos diversos pontos amostrados.

Foi feita também a medida de produção de pigmentos vermelho e laranja nos

pontos amostrados (figura 55, 56 e 57).

Ensaio G

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio B

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)

Ensaio A

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 24 48 72 96 120 144


conc

entr

ação

(g

prot

eina

/gm

s)


118

Figura 55 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em função do tempo para os ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação em diferentes

pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Ensaio C

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio C

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio H

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio H

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio D

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio D

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s


119

Figura 56 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em função do tempo para os ensaios com intervalos médios entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto

central (I, J e K)em diferentes pontos do reator, ( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Ensaio E

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio E

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio I

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio I

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio J

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio J

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio K

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio K

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio F

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio F

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s


120

Figura 57 - Concentração de pigmentos vermelhos (500nm) e laranja (400nm) em função do tempo para os ensaios com menores intervalos entre os eventos de agitação em diferentes pontos do reator,

( ) a, ( ) b, ( ) c, (∗) d e (+) e.

Os resultados obtidos para pigmentos, assim como os de umidade, podem ser

usados para a medida da homogeneidade do reator porém pode-se notar que uma

maior homogeneidade (figura 57) não tem relação com o aumento da produção de

pigmentos uma vez que nos ensaios menos homogêneos como o E (figura 56) o

ponto de menor produção ao final do cultivo atingiu concentração da ordem de 50

Uabs.gms-1 para pigmentos vermelhos enquanto que os pontos do ensaio B que são

homogêneos atingiram no máximo 15 U.gms-1 para a mesma absorbância. O cultivo

F é o que apresentou maiores produções de pigmentos sendo que é um cultivo de

intervalos entre as agitações médio e alto número de rotações em 24 horas (60

voltas).

Ensaio A

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio A

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio G

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio G

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(40

0nm

)/gm

s

Ensaio B

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Uab

s(50

0nm

)/gm

s

Ensaio B

0

50

100

150

200

250

300

350

0 24 48 72 96 120 144

Tempo de cultivo (h)U

abs(

400n

m)/

gms


121

Os ensaios no ponto central apresentaram muitas diferenças entre si, como já

foi discutido no item anterior, mostrando a dificuldade na reprodutibilidade dos

experimentos. O melhor resultado no ponto central, ensaio K, apresenta bons

resultados de produção de pigmentos e também apresenta homogeneidade entre os

pontos amostrados, ou seja, deve existir um nível de agitação que favoreça as

trocas gasosas e a transferência de calor, sem prejudicar o meio de fermentação

causando compactação.

Para estabelecer um critério de homogeneidade, ou seja, para definir se o

meio está ou não homogêneo, foram calculados os coeficientes de variação para

cada tempo de fermentação nos diversos parâmetros analisados. A tabela 25 mostra

os coeficientes de variação médios para os parâmetros umidade, proteína e

pigmento nos dois comprimentos de onda analisados.

Tabela 28 - Coeficientes de variação médios (em função do tempo) entre os pontos

amostrados (a, b, c, d e e) do reator.

O coeficiente de variação da umidade pode ser considerado um bom

indicador de homogeneidade, devido aos diferentes valores nos coeficientes de

variação observados para cada padrão de agitação. O coeficiente de variação da

umidade vai de 1,3 % para o ensaio B que é um dos ensaios com maior agitação

(maior número de voltas com menor intervalo de tempo entre os eventos de

agitação) até 8,5 para o ensaio C que é um dos ensaios com menor agitação.

O coeficiente de variação da produção de pigmentos também pode ser

considerado um indicador de homogeneidade, pois varia de 33% no ensaio C para

9,4% no ensaio B. No ensaio C o coeficiente de variação para a produção de

pigmentos chega a 54% no tempo de 96 horas. A proteína, no entanto, não

Coeficientes de variação (%) A B C D E F G H I J K

Umidade 4,0 1,3 8,5 3,1 7,1 2,2 2,9 4,5 3,9 4,0 3,9 Proteína 9,1 8,6 7,5 5,0 9,6 4,6 5,7 7,0 8,6 10,4 5,3 Pigmento (500nm) 21,6 9,4 33,1 13,5 15,2 12,4 13,6 15,0 18,3 24,9 10,2

Pigmento (400nm) 19,5 11,9 29,3 14,8 19,2 11,9 11,4 16,7 16,1 28,3 10,7


122

apresenta diferenças nos coeficientes de variação entre os ensaios com diferentes

padrões de agitação. Não é possível estabelecer se há homogeneidade no reator

através da medida de proteína. A fim de verificar qual dos parâmetros tem relação

com o padrão de agitação aplicado, foi feito a análise de variância para os

coeficientes de variação da umidade e do pigmento (400 nm). A Tabela 29

apresenta a análise da variância do coeficiente de variação da umidade.

Tabela 29 - Análise de variância para variável resposta coeficiente de variação médio da umidade

Fonte GL Soma Quadrados Quadrados médios F P Regressão 5 40,28 8,06 18,14 0,003 Linear 2 37,40 18,70 42,11 0,001 Quadrático 2 1,06 0,53 1,19 0,378 Interação 1 1,82 1,82 4,10 0,099 Resíduo 5 2,22 0,44 Falta de ajuste 3 2,21 0,74 221,36 0,005 Erro puro 2 0,0067 0,003 Total 9

Através da análise da variância, é possível afirmar que os termos lineares e a

interação tem influência ao nível de 90% . Desse modo, os coeficientes calculados

para as variáveis codificadas e o P estimado para cada efeito do modelo estão na

tabela 30

Tabela 30 - Coeficientes de regressão estimados para coeficiente de variação médio da umidade

Termo Coef SE Coef T P Constante 3,933 0,38 10,22 0,000 Numero de rotações -1,879 ,24 -7,97 0,001 intervalo 1,070 0,236 4,54 0,006 Numero de rotações*numero de rotações 0,371 0,280 1,32 0,243 intervalo*intervalo -0,1042 0,280 -0,37 0,726 Numero de rotações*intervalo -0,675 0,333 -2,03 0,099 R-Sq = 94,78%

Excluindo os termos quadráticos das variáveis por não apresentarem

significância ao nível de 90%, a equação do modelo ajustado para as variáveis

codificadas é a seguinte:


123

CV (umidade) = 3,933 – 1,879*NR + 1,070*I - 0,675*NR*I Eq. 19

Através dos valores dos coeficientes é possível afirmar que quanto maior o

valor do fator “número de rotações”, menor o coeficiente de variação (sinal negativo),

ou seja, maior a homogeneidade. Enquanto que, quanto maior o intervalo entre os

eventos de agitação maior o coeficiente de variação, ou seja, menor a

homogeneidade. O coeficiente de correlação do modelo é de 0,95.

As análises de distribuição não mostram desvios da normalidade (figura 58) e

as superfícies de resposta geradas estão apresentadas na figura 59.

Figura 58 - Análise de resíduos do ajuste da superfície de resposta para o coeficiente de variação

médio da umidade

87654321

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

Fitted Value

Residual

Versus Fits(response is CV umidade)

1,51,00,50,0-0,5-1,0

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Residual

Perc

ent

Normal Probability Plot(response is CV umidade)


124

Figura 59 - Superfície de resposta e gráfico de contorno do coeficiente de variação médio da umidade

em função do número de rotações em 24 horas e intervalo entre os eventos de agitação.

Nota-se que dois ensaios que ficam na região de maior homogeneidade da

superfície de resposta (B e F) apresentaram os menores e os maiores resultados de

produção de pigmentos respectivamente. Esse fato reforça a idéia de que é possível

agitar o meio e ter um bom resultado de crescimento e produção de pigmentos. O

ensaio F tem maior número de voltas do que o B, mas o fato do intervalo ser maior

pode ter favorecido o desempenho do cultivo.

Além das diferenças de composição do meio nos pontos amostrados, outro

parâmetro para verificar a homogeneidade do meio poderia ser a temperatura. A


inte

rvalo

6050403020

11

9

7

5

3

>

–

–

–

< 2

2 4

4 6

6 8

8

umidade

CV

CV umidade

A B

I, J, K

G

C

E

H nume ro de rotações

intervalo

6050403020

119

753

D

F

3

6

2040

9

6

3

60

9

6

12

CV umidade

intervalo


CV umidade


125

figura 60 apresenta o perfil dos desvios em relação ao “set point” medido a 3 cm da

parede e a 8 cm da parede.

Figura 60 – Diferenças em relação à temperatura de ”set point” em função do tempo para os cultivos com maiores intervalos entre os eventos de agitação, ( ) C, ( ) H e (-) D; para os cultivos com

intervalos médios entre os eventos de agitação (+) E e (-) F; para ensaio no ponto central ( ) I, ( ) J e ( )K e ensaios com menores intervalos entre os eventos de agitação (∗) A, ( ) G e (x) B.

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

3 c

m d

a p

ared

e

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

8 c

m d

a p

ared

e

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

3 c

m d

a p

ared

e

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

8 c

m d

a p

ared

e

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

3 c

m d

a p

ared

e

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0C

) 8

cm

da

par

ede

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

3 c

m d

a p

ared

e

-10

-5

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96 120 144


Gra

die

nte

de

tem

per

atu

ra (

0 C)

8 c

m d

a p

ared

e


126

Observa-se que a 3 cm da parede as temperaturas permanecem mais

próximas do “set point” do que a 8 cm para todos os ensaios. Entretanto, nos

ensaios mais freqüentemente agitados, as temperaturas a 3 cm da parede

apresentam um gradiente maior em relação ao set point e ficam mais próximas da

temperatura a 8 cm da parede. Isso deve ocorrer pois a temperatura a 3 cm da

parede fica mais equilibrada com a temperatura a 8 cm. Os ensaios com intervalos

médios entre os eventos de agitação apresentam altos gradientes a 8 cm, porém a 3

cm as temperaturas se mantêm próximas ao “set point”. Os resultados no ponto

central mostram que, diferente de outros parâmetros analisados, os ensaios são

reprodutíveis pois as repetições apresentam perfis muito semelhantes.

Nota-se também que alguns padrões de agitação como os ensaios com maior

número de rotações das pás e mais freqüentemente agitados (F e B) e os ensaios

pouco agitados e com intervalos grandes entre os eventos de agitação (C e H)

equilibraram a temperatura a 8 cm da parede com aproximadamente 72 horas de

cultivo. Isso indica o final do crescimento e conseqüentemente da produção de calor.

Porém somente os ensaios F e H produziram pigmentos.

As temperaturas registradas abaixo da temperatura de “set point” podem estar

em equilíbrio com a temperatura do ar de entrada no reator que é de

aproximadamente 250C, ou ainda mais baixas devido ao efeito de resfriamento do

meio pela evaporação. Isso indica necessidade de controlar a temperatura do ar de

entrada.

5.6.3. Balanço de energia térmica

Foi feito o balanço de energia térmica no reator conforme item 4.8.1 para

verificar se o calor gerado pelo microrganismo foi removido e de que forma ocorreu.

A tabela 31 apresenta os valores da temperatura ambiente média dos

cultivos, a vazão de água na camisa de resfriamentos e os valores dos cálculos de

calor removido e gerado estimado a partir da integração das equações apresentadas

no item 4.8.1. Para os cálculos, considerou-se que não houve perda de energia

térmica para o ambiente uma vez que o reator possui isolamento térmico.


127

Tabela 31 – Dados do balanço de energia nos cultivos em reator

Temperatura

ambiente média

Vazão de água na camisa

Calor removido Calor gerado camisa evaporação microrganismo

0C l.min-1 J J J A 24,0 2,0 -39,5 3918,6 9004,6 B 24,2 1,0 400,5 3443,2 8808,7 C 22,0 2,0 -5260,7 3560,7 6698,0 D 24,7 1,0 3671,2 3308,1 6442,1 E 24,4 1,0 3838,5 3237,9 6190,9 F 24,9 0,9 1413,3 3030,2 4054,8 G 26,0 1,1 1085,0 3457,2 7316,4 H 26,6 1,0 3607,0 3058,5 4524,7 I 24,4 1,0 3220,2 3420,1 9549,0 J 26,0 1,1 3197,3 3041,8 4786,7 K 26,5 1,0 3637,2 3172,6 4047,7

Houve muita variação nos valores de calor removido pela camisa para os

ensaios. Foi adotada uma estratégia de elevar a temperatura da camisa para 320C

no início dos cultivos a fim de elevar a temperatura do meio para a temperatura de

“set point” (300C) rapidamente e assim tentar diminuir a fase lag.

A vazão da água da camisa foi fixada em 1,0 l.min-1 com exceção dos ensaios

A e C nos quais a vazão foi de 2,0 l.min-1. Esses foram os primeiros ensaios e notou-

se que com a vazão mais alta, a diferença de temperatura da entrada e da saída da

camisa ficou muito pequena e a temperatura de saída acabou muitas vezes menor

do que a de entrada. Dessa forma optou-se por diminuir a vazão de água para

aumentar a diferença das temperaturas e tornar possível o cálculo do balanço. Além

disso, a temperatura ambiente média dos ensaios variou de 22 a 26,60C sendo que

no ensaio C, além da vazão alta da água da camisa, a temperatura de entrada do ar

foi muito baixa o que pode ter contribuído para que a camisa ao invés de retirar

calor, cedesse calor tornando o valor tão discrepante dos outros ensaios.

Apesar da temperatura na parede do reator ter precisado de calor para se

manter na temperatura de “set point”, o meio de cultivo alcançou gradientes de

temperatura de até 150C em resultado à baixa condutividade do meio de cultivo.

As figuras 61, 62 e 63 apresentam os perfis da remoção de calor pela parede

e por evaporação e a geração de calor pelo microrganismo.


128

Figura 61 – Calor removido e gerado nos ensaios com maiores intervalos entre os eventos de agitação em função do tempo de cultivo ( ) calor gerado pelo microrganismo, ( ) calor removido pela

camisa, ( ) calor removido por evaporação

Ensaio C

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Cal

or (

W)

Ensaio H

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Cal

or (

W)

Ensaio D

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Cal

or (W

)


129

Figura 62 – Calor removido e gerado nos ensaios com intervalo médio (7 horas) entre os eventos de agitação (E e F) e ensaios no ponto central (I, J e K)em função do tempo de cultivo ( ) calor gerado

pelo microrganismo, ( ) calor removido pela camisa, ( ) calor removido por evaporação

Ensaio E

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor

(W)

Ensaio F

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor

(W)

Ensaio I

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor

(W)

Ensaio J

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor

(W)

Ensaio K

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Cal

or (

W)


130

Figura 63 – Calor removido e gerado nos ensaios com menores intervalos entre os eventos de agitação em função do tempo de cultivo ( ) calor gerado pelo microrganismo, ( ) calor removido pela

camisa, ( ) calor removido por evaporação

Não foi possível estabelecer uma relação entre os padrões de agitação e a

remoção de calor. Entretanto, nota-se que o calor removido pela evaporação é

praticamente constante para todos os cultivos durante todo o tempo. Esse fato pode

Ensaio A

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor (

W)

Ensaio G

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor (

W)

Ensaio B

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144


Ca

lor

(W)


131

ser explicado pois o calor removido por evaporação é dependente da vazão de ar

que é igual para todos os ensaios; da temperatura na fase gasosa do reator que

variou muito pouco para todos os ensaios e da umidade absoluta que foi estimada

considerando o gás saturado o tempo todo.

Para melhorar a remoção de calor durante os cultivos, poder-se-ia aumentar a

vazão de ar, porém será necessário fazer um controle rigoroso da reposição de água

para prevenir o ressecamento do meio. Jorge (2005), trabalhando no mesmo reator

e usando vazão de ar de 8 l.min-1 também obteve remoções de calor constantes mas

da ordem de 10 J.h-1. Neste trabalho com vazão de ar de 14 l.min-1 obteve-se

remoção de aproximadamente 25 J.h-1.

A figura 64 mostra que para todos os cultivos a retirada de calor pela parede

tem relação direta, ou seja, é proporcional ao calor gerado que foi estimado pelo

consumo de oxigênio. Porém, as considerações feitas para o balanço estão

acarretando erros pois ensaios como H, J e K teriam balanços negativos, ou seja, o

calor removido teria sido maior do que o calor gerado e as medidas de temperatura

no interior do meio de cultivo mostram que há a formação de gradientes de

temperatura em todos os cultivos.

Observa-se também que assim como para os gradientes de temperatura

(figura 60), a agitação freqüente dificultou a retirada de calor pela camisa (figura 64)

pois esses ensaios apresentaram as maiores diferenças entre o calor retirado pela

camisa e o calor gerado pelo microrganismo.

Conclusões

132

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos na padronização das metodologias permitem as seguintes

conclusões:

• Na dosagem de ART o meio oriundo da hidrólise ácida deve ter pH ajustado

para 4 a fim de permitir a ação da enzima.

• Na dosagem de pigmentos, o uso de α-amilase, glucanase, sonicador e

glutamato não melhoraram a extração dos pigmentos das amostras.

As mudanças estruturais feitas no reator permitem a seguinte conclusão:

• Por ser um equipamento montado no laboratório para pesquisa, o reator

precisa de constantes modificações e correções em sua construção a fim de

atender e melhorar a aquisição de dados. No caso do tratamento térmico do

substrato, a inserção de vapor direto no meio de cultura não resultou

adequada. A distribuição de vapor não é homogênea no meio e dificulta o

controle da umidade.

• É necessário melhorar a distribuição do ar no interior do reator, fazendo com

que o ar passe mais eficientemente pelo meio em fermentação.

Os resultados obtidos no ensaio de suplementação permitem as seguintes

conclusões:

• Glutamato monossódico, embora não seja fonte de nitrogênio para o

crescimento do fungo, foi eficaz no aumento da produção de pigmentos, a

qual foi de 1910 U.gms-1 para o ensaio padrão e de 4340 U.gms-1 para o

ensaio suplementado. A produção de pigmentos laranjas passou de 2730

U.gms-1 no ensaio padrão para 9840 U.gms-1 no ensaio suplementado.

• O sulfato de amônio adicionado nas concentrações de 1 e 5% da massa seca

inibiu o crescimento em relação ao ensaio sem suplementação.

Conclusões

133

• O elevado residual em ART ao término dos cultivos não pode ser atribuído a

uma limitação por nitrogênio, visto que a adição deste nutriente não resultou

aumento na concentração protéica nem aumento da redução da massa seca.

Os resultados obtidos nos ensaios em reator permitem as seguintes conclusões:

• Os diferentes padrões de agitação causaram diferentes comportamentos nas

variáveis avaliadas.

• Os resultados de respiração indicam que o crescimento foi afetado tanto pela

agitação que causou a compactação do meio (ensaio B) quanto pela falta de

agitação que pode ter prejudicado a transferência de oxigênio (ensaio A).

• O consumo de oxigênio pode ser um bom indicador on-line de crescimento e

tem correlação com o padrão de agitação adotado. O ajuste do modelo

explica 81% dos dados e é igualmente afetado pelo número de rotações e

pelo intervalo entre os eventos de agitação. O maior consumo de oxigênio, 68

mol, e, portanto, o maior crescimento foi obtido para cultivos com menor

número de rotações e menores intervalos entre os eventos de agitação,

enquanto o menor consumo foi de 30 mol.

• Existe correlação entre a máxima OUR e o padrão de agitação adotado com

coeficiente de correlação de 92%. Tanto o fator intervalo entre os eventos de

agitação quanto o número de rotações influenciam negativamente a máxima

OUR, ou seja, quanto maior o intervalo ou maior o número de rotações menor

a OUR máxima. Além disso, o fator intervalo entre os eventos de agitação é

quatro vezes mais significativo do que o número de rotações.

• Também existe correlação entre a produção de CO2 e o padrão de agitação

empregado. O modelo se ajusta com coeficiente de correlação de 86% e para

esse parâmetro o fator intervalo entre os eventos de agitação é pouco

significativo e o número de rotações influencia negativamente.

Conclusões

134

• A medida de proteína como parâmetro de estimativa de crescimento

apresentou resultados satisfatórios. Não foi possível relacionar o padrão de

agitação e a massa total de proteína.

• A medida de ergosterol, apesar da variação de seu teor em células cultivadas

em meio líquido com desvio padrão da ordem de 17%, apresentou correlação

com o padrão de agitação empregado. As maiores concentrações de

ergosterol ocorreram nos ensaios com maior número de rotações e maiores

intervalos entre os eventos de agitação

• Não foi possível estabelecer correlação entre as metodologias adotadas para

a estimativa de crescimento.

• Não ocorre limitação de crescimento pela falta de fonte de carbono (amido),

pois o consumo é de aproximadamente 60 % da massa inicial. É possível que

o amido esteja inacessível no interior dos grãos.

• O intervalo entre os eventos de agitação afeta significativamente a produção

de pigmentos. Os ensaios frequentemente agitados (A, B e G) produziram

menos pigmentos vermelhos e laranjas do que os demais. Porém, o consumo

de oxigênio também é afetado pelo intervalo entre os eventos de agitação e

os ensaios A e G foram os ensaios que mais consumiram oxigênio. O ensaio

B alcançou a maior OUR e provavelmente sofreu a compactação do meio

pelo excesso de rotações.

• Parâmetros como a umidade e a produção de pigmentos podem ser bons

indicativos da homogeneidade do meio. A concentração de proteína não

variou entre os pontos amostrados para nenhum dos ensaios indicando que

não foi um bom indicador de homogeneidade.

• O coeficiente de variação da umidade possui boa correlação com os padrões

de agitação aplicados. O modelo se ajusta com coeficiente de correlação de

Conclusões

135

95%. Quanto menor o coeficiente de variação, maior a homogeneidade do

meio.

• Padrões de agitação com maior número de rotações das pás e mais

freqüentemente agitados (F e B) e os ensaios pouco agitados e com

intervalos grandes entre os eventos de agitação (C e H) equilibraram a

temperatura no valor do “set-point” a 8 cm da parede com aproximadamente

72 horas de cultivo indicando uma sensível redução da velocidade do

crescimento.

• Para todos os cultivos a retirada de calor pela parede tem relação direta, ou

seja, é proporcional ao calor gerado pelo microrganismo que foi estimado pelo

consumo de oxigênio.

• Controle da FES é possível com base na velocidade de respiração, OUR, com

base na qual o sistema de agitação pode ser acionado e a vazão de ar

ajustada. Medidas de umidade em diferentes pontos do reator, também

podem auxiliar não controle dos eventos de agitação. A agitação por si só não

é suficiente para remover o calor metabólico gerado, requerendo maior

participação da remoção de calor por evaporação, o que, por conseguinte,

demandará mais freqüente adição de água com efeito positivo no controle da

temperatura.

• Ampliação de Escala de FES em reator com agitação interna deve modular a

aplicação dos eventos de agitação os quais devem ser pouco freqüentes na

fase de colonização do meio pelo fungo (fase “lag”); mais freqüentes na fase

de crescimento celular intenso; e, finalmente, após a desaceleração da OUR,

controlados pelo gradiente de temperatura na fase de acúmulo de produtos

oriundos de metabolismo secundário. Devem ainda ser consideradas a

eficiência da aeração e natureza do substrato.

Referências Bibliográficas

136

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desempenho e homogeneidade de cultivos em meio sólido de · coeficiente respiratório (rq, ) em...

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