dengue no estado do rio grande do norte, 2010-2012: … · aceitar fazer parte da banca de defesa...

MINISTÉRIO DA SAÚDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Mestrado em Medicina Tropical

DENGUE NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012: VIGILÂNCIA VIROLÓGICA E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS.

MÁRIO SÉRGIO DUARTE BRANCO

Rio de Janeiro

Fevereiro de 2014


Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical

Mário Sérgio Duarte Branco

Dengue no Estado do Rio Grande do Norte, 2010-2012: Vigilância Virológica e

Aspectos Epidemiológicos.

Dissertação apresentada ao Instituto

Oswaldo Cruz como parte dos requisitos

para obtenção do título de Mestre em

Medicina Tropical

Orientador (es): Profa. Dra. Rita Maria Ribeiro Nogueira

Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo

RIO DE JANEIRO

Fevereiro de 2014

Ficha catalográfica elaborada pela

Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ

B816 Branco, Mário Sérgio Duarte

Dengue no estado do Rio Grande do Norte, 2010-2012: vigilância

virológica e aspectos epidemiológicos / Mário Sérgio Duarte Branco. –

Rio de Janeiro, 2014.

xvii, 96 f.: il. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em

Medicina Tropical, 2014.

Bibliografia: f. 78-96

1. Dengue. 2. Rio Grande do Norte. 3. Epidemiologia. 4. Vigilância virológica. I. Título.

CDD 616.91852

iii


Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical

Mário Sérgio Duarte Branco

Dengue no Estado do Rio Grande do Norte, 2010-2012: Vigilância Virológica e

Aspectos Epidemiológicos.

ORIENTADOR (ES): Profa. Dra. Rita Maria Ribeiro Nogueira

Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo

Aprovada em: 14/ 02 / 2014

EXAMINADORES:

Profa. Dra. Ana Maria Bispo de Filippis- Presidente (IOC-FIOCRUZ-RJ)

Prof. Dr. Gonzalo José Bello Bentancor (IOC-FIOCRUZ-RJ)

Profa. Dra. Marli Tenório Cordeiro (CPqAM-FIOCRUZ-PE)

Prof. Dr. Marcos César Lima de Mendonça (IOC-FIOCRUZ-RJ)

Profa. Dra. Elzinandes Leal de Azeredo (IOC-FIOCRUZ-RJ)

Rio de Janeiro, 14 de Fevereiro de 2014

iv

Dedico este trabalho aos meus

pais, Maria Lúcia e Paulo

Sérgio, ao meu irmão, Luiz

Paulo e à minha namorada,

Julieth Sousa. Obrigado por

tudo. Amo vocês!

v

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,

CAPES, pela bolsa concedida durante o Mestrado. Ao Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, e à Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (UFRN), pelo financiamento deste projeto.

Ao Laboratório Central Dr. Almino Fernandes pela parceria e

permissão na utilização de suas amostras. À Carmélia Dantas da Costa e

Francisca Paiva pelo imenso apoio e cooperação, imprescindíveis à realização

deste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical por minha

formação acadêmica. Ao Coordenador, Dr. Filipe Anibal Carvalho Costa, por

todo apoio concedido durante o curso. À Lìvia e Ingrid, secretárias do

programa, por todo apoio e atenção.

Agradeço à minha orientadora, Dra. Rita Maria Ribeiro Nogueira, por

sua acolhida, por toda sua atenção e por ter me dado a oportunidade de

aprender com seus ensinamentos.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Josélio Maria Galvão de Araújo,

por ser tudo o que se espera de um orientador, pelo seu exemplo profissional,

dedicação e amizade.

À Dra. Flávia Barreto, por sua gentileza e disposição em sempre me

ajudar.

À Dra. Ana Bispo de Filippis, pelo conhecimento compartilhado e por

aceitar fazer parte da Banca de Defesa desta Dissertação, como Presidente.

À Dra. Marli Tenório Cordeiro, por aceitar ser revisora deste trabalho

e por aceitar fazer parte da Banca de Defesa desta Dissertação, obrigado por

engrandecer este trabalho com os seus comentários.

Aos Doutores José Gonzalo Bello Bentancor, Marcos César Lima de

Mendonça e á Doutora Elzinandes Leal de Azeredo, por aceitarem fazer parte

de minha Banca de Defesa e por enriquecerem este trabalho com suas

sugestões.

A todos do Laboratório de Doenças Infecciosas e do Câncer, da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial à Daíse Sousa,

vi

Denise Sousa e Joelma Monteiro, pela participação direta neste trabalho e

apoio imprescindível.

A todos do Laboratório de Flavivírus do Instituto Oswaldo Cruz, pelo

ótimo convívio e por todo apoio dado durante minha estada no Rio de Janeiro.

Agradeço aos meus pais, por todo o carinho e compreensão, pelos

momentos de amizade e de ensinamentos, por toda a confiança creditada a

mim, pelo suporte em momentos difíceis e pelos risos em inúmeros momentos

felizes.

Ao meu irmão, Luiz Paulo que sempre me ensina a valorizar

pequenas atitudes e a me importar menos com problemas pequenos.

À Julieth de Oliveira Sousa, a qual sempre está disposta a me ouvir

e a compartilhar os momentos felizes e de angústia, obrigado por me fazer

feliz, por todo seu carinho e amor.

A todos os meus familiares, por sempre torcerem pela minha

felicidade.

vii

Todos tem o desejo de vencer, mas apenas campeões tem o desejo de se preparar. (Autor desconhecido)

viii

RESUMO

A dengue é a arbovirose mais importante do mundo. Nos últimos 50 anos, vem

progressivamente alcançando o status de pandemia global. Este trabalho descreve a

vigilância virológica e os aspectos epidemiológicos da dengue no Estado do Rio

Grande do Norte, no período de 2010 a 2012. Foram estudados 1581 casos pela

metodologia de isolamento viral e/ou RT-PCR para detecção e tipagem viral,

provenientes de diferentes Centros de Saúde do Estado do Rio Grande do Norte, no

período compreendido entre Janeiro de 2010 e Dezembro de 2012. A infecção foi

confirmada através do isolamento viral em 27% dos casos, enquanto a RT-PCR

confirmou 24% dos casos estudados, a união das duas metodologias confirmou 30%

dos casos estudados. Este estudo detectou a circulação de todos os quatro sorotipos

do vírus Dengue no Rio Grande do Norte, havendo a circulação do DENV-1, DENV-2 e

DENV-3 em 2010, já em 2011 ocorreu a circulação do DENV-1, DENV-2 e a

introdução do DENV-4 no Estado, após um período de 30 anos sem registro no país.

Em 2012 foi detectada apenas a circulação do DENV-4. O sorotipo predominante em

2010 foi o DENV-2, representando 53,33% dos casos positivos, seguido do DENV-1,

com 45,33% e DENV-3 com 1,33%. Em 2011, o DENV-1 foi predominante com

75,49% dos casos positivos, seguido por DENV-2 e DENV-4. Em 2012, o DENV-4 foi o

único detectado, com 100% dos casos positivos. A distribuição geográfica dos casos

concentrou-se em Natal, com 53,97% dos casos confirmados. Em relação à

distribuição mensal, tivemos um maior número de casos nos meses de Maio e Abril,

23% e 21% dos casos positivos respectivamente (p< 0,0001). A faixa etária mais

acometida foi a de 0 a 10 anos, com 38% dos casos positivos, sendo que apenas em

2012, a faixa etária de 11 a 30 anos foi a mais acometida com 51,33% dos casos

(p=0,0001). A média de idade dos casos confirmados por sorotipo foi

significativamente maior para o DENV-4 (p<0,0001), sendo de 29,87 anos (DP: 17,01).

Em relação ao gênero, o sexo feminino representou 52% dos casos. A média de idade

de mulheres afetadas pela Dengue foi maior (p=0,0345) que a dos homens afetados,

sendo de 22,69 (DP: 18,85). A caracterização genética das cepas circulantes

confirmou a circulação do genótipo V, genótipo Sudeste Asiático/Americano e genótipo

II, respectivamente para DENV-1, DENV-2 e DENV-4. Este trabalho subsidiará uma

melhor compreensão sobre a ação desses vírus na população Norte-Riograndense,

fornecendo auxílio às ações voltadas ao controle da doença na região, constituindo

uma importante contribuição ao se considerar o grande impacto dessa doença no RN.

Palavras-chave: Dengue; Rio Grande do Norte; Epidemiologia; Vigilância virológica.

ix

ABSTRACT

Dengue is considered as the most important arthropod-borne viral disease throughout

the world, which currently represents a major public health problem in tropical and

subtropical countries, including Brazil. This work presents results of virological

surveillance and epidemiological aspects of dengue in the state of Rio Grande do

Norte, Brazil, 2010-2012. A total of 1,581 cases, reported from January 2010 to

December 2012 at various health centers in the state, were studied by the method of

viral isolation and / or RT-PCR for viral detection and typing. The infection was

confirmed by virus isolation in 27% of the cases, while the RT-PCR confirmed 24% of

the cases studied; the union of the two methodologies confirmed 30% of the cases

studied. This study detected the circulation of all four serotypes of dengue virus in Rio

Grande do Norte, with the circulation of DENV-1, DENV-2, and DENV-3 in 2010, and

the circulation of DENV-1, DENV- 2, and the introduction of DENV-4 in the state in

2011, after a 30-year period without registration in the country. The predominant

serotype in 2010 was the DENV-2, representing 53.33% of the positive cases, followed

by DENV-1, with 45.33% and DENV-3 with 1.33%. In 2011, DENV-1 was predominant

with 75.49% of the positive cases, followed by DENV-2 and DENV-4. In 2012, DENV-4

was predominant and exclusive, 100% of positive cases. Regarding the spatial

distribution, most of cases occurred in Natal, with 53,97% of confirmed cases. The

monthly distribution showed a greater number of positive cases in the months of April

(21%) and May (23%) (p <0.0001). The most affected age group was 0-10 years with

38% positive cases, and only in 2012, the age group 11-30 years was the most

affected with 51.33% of the cases (p = 0.0001). The average age of confirmed cases

was significantly higher for serotype DENV-4 (p <0.0001), being 29.87 years (SD:

17,01). Regarding gender, females represented 52% of the cases. The average age of

women affected by dengue was higher (p = 0.0345) than the affected men, with 22.69

(SD: 18.85). Genetic characterization of circulating strains confirmed the circulation of

genotypes V, Southeast Asian / American and II, respectively, for DENV-1, DENV-2

and DENV-4.This work furthers a better understanding of the action of these viruses in

the local population. Providing assistance to efforts aimed at controlling the disease in

the region is an important contribution when considering the major impact of this

disease.

Keywords: Dengue; Rio Grande do Norte; Epidemiology; Virological Surveillance.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Estrutura e composição dos DENV. A) e C) Crio microscopia eletrônica de partícula

imatura e madura do DENV, respectivamente. B) Desenho esquemático do DENV,

demonstrando sua composição e o processo de maturação da partícula (Adaptado de

Lindenbach et al. 2007). ................................................................................................................ 3

Figura 1.2 Organização do Genoma dos DENV (Adaptado de Rodenhuis-Zybert et al. 2010) .. 3

Figura 1.3 Modelo de biossíntese do vírus da Dengue (Adaptado de Van der Schaar 2009). ... 6

Figura 1.4 Hipótese Integral para o desenvolvimento da DHF/SCD.(Adaptado de Guzman &

Kouri 2002) .................................................................................................................................. 11

Figura 1.5 Ciclos de transmissão da dengue (Adaptado de Weaver & Vasilakis 2009). ........... 13

Figura 1.6 Períodos de incubação dos DENV (Adaptado de CDC, 2002). ................................ 15

Figura 1.7 Resumo didático do curso da doença da dengue, demonstrando aspectos clínicos e

laboratoriais(Adaptado de World Health Organization 2009). .................................................... 17

Figura 1.8 Classificação sugerida pela Organização Mundial de Saúde para classificação de

casos de Dengue e níveis de gravidade (Adaptado de WHO, 2009). ........................................ 19

Figura 1.9 Vírus da Dengue, antígenos e respostas de anticorpos utilizados no diagnóstico,

correlacionados ao período da doença (Adaptado de Guzman et al. 2010). ............................. 21

Figura 1.10 Títulos de Anticorpos IgM e IgG, em resposta à infecção primária e secundária do

DENV (Adaptado de Peeling et al. 2010) .................................................................................... 23

Figura 1.11 Construção das quatro vacinas quiméricas (Adaptado de Guy et al. 2010)........... 27

Figura 1.12 Países ou áreas de risco de infecção por DENV (Adaptado de World Health

Organization 2009) . .................................................................................................................... 29

Figura 1.13 Evolução da Dengue nas Américas, 1980-2010 (Adaptado de Brathwaite Dick et al.

2012). .......................................................................................................................................... 31

Figura 1.14 Mapa do Rio Grande do Norte, demonstrando os 20 municípios do Estado que

possuem prioridade de monitoramento estratégico. ................................................................... 34

Figura 4.1 Localização do Estado do Rio Grande do Norte. ...................................................... 37

Figura 5.1 Eletroforese em gel de agarose a 1%. Visualização dos produtos amplificados pela

transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para tipagem dos

DENV. Linha 1: Marcador de PM de 100pb (Promega); Linha 2: Controle Negativo; Linhas 3:

Controle positivo para DENV-1; Linha 4: Controle positivo para DENV-2; Linha 5: Controle

positivo para DENV-3; Linhas 6: Controle positivo para DENV-4; Linha 7: Amostra positiva para

DENV-1; Linha 8: Amostra positiva para DENV-2; Linha 9: Amostra positiva para DENV-3;

Linha 10: Amostra positiva para DENV-4; Linha 11: Amostra positiva para DENV-1; Linha 12:

Amostra positiva para DENV-4. .................................................................................................. 50

Figura 5.2 Distribuição de Sorotipos detectados por mês, no período de janeiro de 2010 a

dezembro de 2012. ..................................................................................................................... 51

Figura 5.3 Mapa do Rio Grande do Norte, demonstrando a circulação de sorotipos por

município, em 2010. .................................................................................................................... 52

xi


município, em 2011. .................................................................................................................... 53


município, em 2012. .................................................................................................................... 53

Figura 5.6 Distribuição mensal acumulada dos casos estudados por isolamento viral e/ou RT-

PCR, durante o período 2010 - 2012, no Estado do Rio Grande do Norte. ............................... 56

Figura 5.7 Distribuição mensal de casos estudados e confirmados para Dengue, nos anos

2010-2012 ................................................................................................................................... 56

Figura 5.8 Casos estudados para dengue, relacionados à faixa etária, no período acumulado

de 2010-2012. ............................................................................................................................. 58

Figura 5.9 Casos estudados para dengue, relacionados à faixa etária, em 2010. .................... 58

Figura 5.10 Casos estudados para dengue, relacionados à faixa etária, em 2011. .................. 59

Figura 5.11 Casos estudados para dengue, relacionados à faixa etária, em 2012. .................. 59

Figura 5.12 Média de idade dos casos positivos por sorotipo, 2010-2012. ............................... 60

Figura 5.13 Número de casos estudados para dengue, relacionados ao gênero, no período

acumulado de 2010-2012. ........................................................................................................... 61

Figura 5.14 Média de idade dos casos confirmados para dengue, relacionados ao gênero, no

período acumulado de 2010-2012. ............................................................................................. 62

Figura 5.15 Análise filogenética das amostras de DENV-1. As sequencias dos diferentes

genótipos estão selecionadas por colchetes. As amostras do RN estão em destaque. Os

valores de bootstrap estão indicados nos branchpoints. ............................................................ 63







xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 Classificação genotípica dos DENV(de acordo com Rico-Hesse 2003). ................... 7

Tabela 1.2 Classificação genotípica dos DENV (de acordo com Weaver & Vasilakis 2009). ..... 8

Tabela 4.1 Meio L-15 para cultivo celular de células C6/36 de Ae.albopictus ........................... 39

Tabela 4.2 Antibióticos utilizados no meio de cultura L-15 para cultivo celular de células C6/36

de Ae.albopictus .......................................................................................................................... 39

Tabela 4.3 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na transcrição reversa seguida pela reação

em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para a tipagem dos DENV. ............................................ 42

Tabela 4.4 Reagentes utilizados na Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela

Polimerase (RT-PCR). ................................................................................................................ 43

Tabela 4.5 Oligonucleotídeos iniciadores para sequenciamento do gene do envelope dos

DENV-1. ...................................................................................................................................... 44


DENV-2. ...................................................................................................................................... 45


DENV-4. ...................................................................................................................................... 45

Tabela 4.8 Oligonucleotídeos iniciadores internos específicos para DENV- 2 .......................... 45

Tabela 4.9 Valores de referência para comparação do amplicon obtido com peso molecular de

massa para determinação da quantidade ideal de DNA a ser aplicada na reação de

sequenciamento .......................................................................................................................... 46

Tabela 5.1 Metodologias utilizadas para diagnóstico da Dengue, no período de 2010 a 2012. 49

Tabela 5.2 Percentual de detecção dos DENV, por metodologia e ano estudado. ................... 50

Tabela 5.3 Descrição por município de número de casos positivos, percentual de positividade e

sorotipos circulantes, no período de Janeiro de 2010 a Dezembro de 2012. ............................ 54

Tabela 5.4 Distribuição mensal dos casos estudados por isolamento viral e RT-PCR durante o

período 2010 -2012, no Estado do Rio Grande do Norte. .......................................................... 55

Tabela 5.5 Distribuição de casos positivos para Dengue, por faixa-etária, nos anos 2010-2012.

..................................................................................................................................................... 57

Tabela 5.6: Demonstrativo do número de casos positivos por gênero, no período 2010-2012. 61

Tabela 5.7 Relação de amostras selecionadas para o presente estudo, com seus respectivos

números de identificação do LADIC, sorotipos, origem e ano de coleta. ................................... 62

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

l: microlitro

ºC: Graus Celsius

Acs: Anticorpos

Ae. aegypti: Aedes aegypti

BR: Brasil

C: Proteína estrutural do capsídeo viral

cm: centímetros

D.C.: Depois de Cristo

DC: Dengue clássico

DCC: Dengue com complicações

DENV: Vírus dengue

DENV-1: Sorotipo 1 dos vírus dengue




DP: Desvio padrão

E: Proteína estrutural do envelope

ECP: Efeito citopático

ELISA: do inglês, enzyme linked immunosorbent assay

EUA: Estados Unidos da América

FHD: Febre hemorrágica da dengue

g: Gramas

gl: Graus de Liberdade

IFI: Imunofluorescência indireta

IgG: Imunoglobulina G

IgM: Imunoglobulina M

Kb: Kilobase

kDa: Kilodaltons

LADIC: Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer

M: Proteína estrutural da membrana

MAC: do inglês, IgM antibody capture

xiv

MS: Ministério da Saúde

NC: Não codificante

NS: Proteína não estrutural do vírus

OMS: Organização Mundial de Saúde

ORF: do Inglês Open reading frame

PAHO: Pan American Health Organization

pb: Pares de bases

PCR: Reação em cadeia pela polimerase

pH: potencial de hidrogênio

PNCD: Programa Nacional de Controle da Dengue

PrM/M: Proteínas estruturais Pré-Membrana/Membrana

qRT-PCR: Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase

quantitativo

RN: Rio Grande do Norte

RNA: Ácido ribonucleico

Rpm: Rotações por minuto

RT-PCR: Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase

SCD: Síndrome de choque da dengue

SINAN: Sistema de Informação de Agravos de Notificação

ssRNA: do inglês, single stranded RNA

WHO: World Health Organization

xv

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 HISTÓRICO 1

1.2 AGENTE ETIOLÓGICO 2

1.2.1 DIVERSIDADE GENÉTICA 6

1.3 PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES POR DENGUE 9

1.4 VETORES 12

1.5 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS 16

1.6 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 20

1.6.1 ISOLAMENTO VIRAL 21

1.6.2 TESTES IMUNOENZIMÁTICOS 22

1.6.3 MÉTODOS MOLECULARES 24

1.7 PREVENÇÃO E CONTROLE 25

1.7.1 VACINA 26

1.8 EPIDEMIOLOGIA 28

1.8.1 DENGUE NAS AMÉRICAS 29

1.8.2 DENGUE NO BRASIL 31

1.8.3 DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE 33

2. JUSTIFICATIVA 35

3. OBJETIVOS 36

3.1 OBJETIVO GERAL 36

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 36

4. MATERIAIS E MÉTODOS 37

4.1 DESENHO DE ESTUDO 37

xvi

4.2 ÁREA DE ESTUDO 37

4.3 AMOSTRAS CLÍNICAS E BANCO DE DADOS 38

4.4 ISOLAMENTO VIRAL 38

4.5 TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) 39

4.6 RT-PCR (LANCIOTTI ET AL. 1992) 41

4.6.1 EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL 41

4.6.2 TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA DIAGNÓSTICO 41

4.7 SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE FILOGENÉTICA 43

4.7.1 CONSTRUÇÃO DO BANCO DE SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS 43

4.7.2 SEQUENCIAMENTO DO GENOMA VIRAL 44

4.7.3 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS 48

4.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS 48

4.9 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 48

5. RESULTADOS 49

5.1 MONITORAMENTO DOS SOROTIPOS DOS VÍRUS DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 49

5.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DOS CASOS DE DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 51

5.3 DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL DOS CASOS DE DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 55

5.4 DADOS DEMOGRÁFICOS DOS CASOS ESTUDADOS 57

5.4.1 FAIXA ETÁRIA 57

5.4.2 GÊNERO 60

5.5 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS SOROTIPOS ISOLADOS NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012 62

6. DISCUSSÃO 66

6.1 MONITORAMENTO DOS SOROTIPOS DOS VÍRUS DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 67

6.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DOS CASOS DE DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 71

6.3 DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL DOS CASOS DE DENGUE NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 72

6.4 DADOS DEMOGRÁFICOS DOS CASOS ESTUDADOS 73

6.5 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS SOROTIPOS ISOLADOS NO RIO GRANDE DO NORTE, 2010-2012. 74

7. PERSPECTIVAS 76

8. CONCLUSÕES 76

xvii

9. REFERÊNCIAS 78

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico

O termo “dengue” provavelmente originou-se na Espanha no início do

século XIX, sendo um homônimo para a expressão de origem africana Ki Denga

Pepo, ou Denga, cujo significado é “pancada ou golpe causado por um espírito mau

que provocava um ataque doloroso”. Em 1828, a literatura médica inglesa adotou o

termo durante uma epidemia, ocorrida no Caribe, de doença exantemática com

artralgia (Halstead 1980; Schatzmayr 2008).

Existem registros históricos da ocorrência de doença clinicamente

compatível com a dengue na China durante a Dinastia Chin, 265 – 420 D.C., sendo

relatada formalmente nas Dinastias Tang, 610 D.C, e Sung do Norte, 992 D.C., a

enfermidade foi chamada naquela época de “veneno da água”, já havendo a

associação de mosquitos voadores com a água (Gubler 1998; Weaver & Vasilakis

2009). Surtos ocorridos nas Índias Francesas Ocidentais e no Panamá em 1635 e

1699, respectivamente, também são relacionados à Dengue, porém os primeiros

registros de grandes epidemias ocorreram nos anos de 1779 e 1780, atingindo os

continentes da Ásia, África e América do Norte. Estes episódios importantes da

dengue ocorreram, quase que simultaneamente em 1779, em Jakarta, Indonésia e

Egito, e em 1780 na Filadélfia (Gubler 1998; Halstead 1980).

Em 1907, Ashburn e Craig encontraram um agente filtrável e infeccioso

no sangue humano (Ashburn & Craig 1907). A transmissão do vírus da dengue

(DENV) pelo Aedes aegypti foi primeiramente descrita por Bancroft, em

1907,(Bancroft 1907) e mais tarde confirmada por Cleland et al., em 1918, ao

testarem, em voluntários humanos, a capacidade de transmissão do vírus da dengue

pelos mosquitos Culex fatigans e Aedes aegypti, obtendo sucesso apenas com o

Aedes aegypti (Cleland et al. 1919).

O vírus da Dengue foi isolado em camundongos por Kimura e Hotta, em

1943, e por Sabin e Schelinger, em 1944, sendo neste caso, feito o isolamento das

cepas Hawai e Nova Guiné. Pesquisas realizadas por Sabin, durante a segunda

guerra mundial, forneceram a prova da existência de diferentes características

antigênicas entre os vírus Dengue, sendo a cepa Hawai caracterizada como sorotipo

2

1 e a cepa Nova Guiné como sorotipo 2, hoje sendo consideradas protótipos (Kimura

& Hotta 1944; Sabin 1952; Sabin & Schlesinger 1945).

Os sorotipos 3 e 4 foram isolados a partir de pacientes com quadro grave

de febre hemorrágica, durante epidemia ocorrida em Manila, nas Filipinas, em 1956,

onde se registrou a cocirculação dos quatro sorotipos de Dengue, havendo a

percepção do maior surgimento de casos graves da doença devido a esse fator

(Hammon et al. 1960).

Provavelmente, a origem dos vírus da Dengue ocorreu na Ásia, onde os

quatro sorotipos de vírus da Dengue foram demonstrados em ciclos silvestres. Os

acontecimentos da Segunda Guerra Mundial, nessa região, criaram condições

favoráveis à expansão dos vetores da Dengue, tornando-a epidêmica e

proporcionando o surgimento de formas clínicas graves da doença, a Febre

Hemorrágica por Dengue (FHD) e a Síndrome do Choque por Dengue (SCD)

(Rudnick 1986; Schatzmayr 2008)

1.2 Agente etiológico

Os vírus da Dengue pertencem à família Flaviviridae, gênero Flavivirus.

Este gênero abrange mais de 70 vírus, onde todos são classificados como arbovírus

(arthropod-borne viruses), com transmissão e desenvolvimento mediado, em sua

maioria, por carrapatos ou mosquitos. No caso dos vírus da Dengue, mosquitos

hematófagos do gênero Aedes e o homem são responsáveis pela manutenção do

ciclo de transmissão, sendo esse vertebrado, o único a desenvolver as formas

clínicas da doença. Os vírus da Dengue possuem genoma de ácido ribonucleico fita

simples (ssRNA) com polaridade positiva, protegido por um capsídeo de simetria

icosaédrica, formando o nucleocapsídeo. O DENV é circundado por um envelope

constituído por dupla camada lipídica associada à proteína de membrana (M) e a

glicoproteína do Envelope (E) que representa as espículas, formando uma partícula

com cerca de 40 a 50 nanômetros (nm) (Figura 1.1). Existem quatro sorotipos com

características antigênicas diferenciadas, sendo chamados DENV-1, DENV-2,

DENV-3, DENV-4 (Gubler 1998; Lindenbach et al. 2007; Rodenhuis-Zybert et al.

2010; Ross 2010). Estudos recentes indicam o isolamento e a caracterização de um

novo sorotipo de dengue de transmissão silvestre em Sarawak, Malásia, onde este

3

novo e emergente sorotipo foi detectado em humanos, associado inclusive a casos

graves da doença (Vasilakis 2013).

O genoma dos Flavivirus é considerado infeccioso, como para todos os

vírus de ácido ribonucleico (RNA) com polaridade positiva. O genoma dos vírus

Dengue é composto por cerca de 11.000 nucleotídeos, possuindo apenas uma fase

aberta de leitura (ORF). O RNA genômico é inicialmente transcrito em um ssRNA de

polaridade negativa que serve como molde de replicação, a partir do qual são

sintetizados os RNAs de polaridade positiva, os quais servirão de material genético

empacotado no interior de novas partículas virais ou de RNA mensageiro viral, que

será traduzido em uma única poliproteína com mais de 3000 aminoácidos.

Posteriormente, ao ser clivada, a poliproteína originará as proteínas estruturais do

capsídeo (C), envelope (E) e pré-membrana (prM/M), e as não-estruturais que são

as NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4b, NS5 (do inglês: “Non-structural”) (Lindenbach et

al. 2007; Rice et al. 1985; Ross 2010) (Figura 1.2).

Figura 1.2 Organização do Genoma dos DENV (Adaptado de Rodenhuis-Zybert et al. 2010)

Figura 1.1 Estrutura e composição dos DENV. A) e C) Crio microscopia eletrônica de partícula imatura e madura do DENV, respectivamente. B) Desenho esquemático do DENV, demonstrando sua composição e o processo de maturação da partícula (Adaptado de Lindenbach et al. 2007).

4

Regiões não codificantes (NC) flanqueiam a ORF nos terminais 3´ e 5´,de

aproximadamente 450 e 100 nucleotídeos respectivamente. A porção 5´NC possui

um Cap terminal, além de ser uma região altamente conservada entre os sorotipos

dos DENV. A porção 3´NC carece de poliadenilação, mas possui uma estrutura

stem-loop conservada em sua região terminal, de papel crucial para a síntese de

RNA viral (Lodeiro et al. 2009). Estas regiões NC são requeridas para a biossíntese

viral, atuando na regulação e expressão da replicação viral (Alvarez et al. 2005;

Alvarez et al. 2008).

A proteína do capsídeo (C) é altamente básica e de aproximadamente 12

kilodaltons (kDa), constituindo um dímero simétrico, onde cada monômero é

composto de quatro alfa hélices. A presença de resíduos hidrofóbicos e a

distribuição assimétrica de cargas positivas determinam as superfícies de interação

desta proteína com a membrana viral e o RNA genômico do vírus (Ma et al. 2004).

A proteína M (22 kDa) é originada de uma glicoproteína precursora,

identificada como prM e de aproximadamente 26 kDa. A clivagem deste precursor

está relacionada à maturação do vírus e à atividade fusogênica da glicoproteína E

(Stadler et al. 1997).

A glicoproteína E é dimérica e de aproximadamente 57 kDa, cada

monômero é composto de três domínios: I que forma um barril beta; II que é

projetado na superfície do vírus entre as regiões transmembrana das subunidades

homodiméricas; III que mantém uma conformação semelhante à imunoglobulina

(Lindenbach et al. 2007). O domínio III está envolvido na interação com receptores

celulares, influenciando na virulência do vírus (Modis et al. 2004). A glicoproteína do

envelope possui papéis biológicos importantes, atuando na adsorção viral e fusão de

membranas, além de ser o principal alvo para anticorpos neutralizantes (Chambers

et al. 1990).

Em relação às proteínas não estruturais, a NS1(46 kDa) é dimérica, N-

glicosilada, sendo uma glicoproteína altamente conservada que parece ser essencial

para a atividade infecciosa do vírus, embora sua função precisa ainda não tenha

sido descoberta (Young et al. 2000). O fato da NS1 ter circulação extracelular

durante fase aguda da doença sugere uma contribuição desta proteína na

fisiopatologia do dengue (Alcon et al. 2002). A proteína NS2A (22 kDa) é hidrofóbica

e transmembrana, sendo sugerido sua coordenação na mudança entre o

5

empacotamento do RNA e a sua replicação (Khromykh et al. 2001). A proteína

NS2B (14 kDa) é associada à membrana e forma um complexo estável com a NS3

exercendo papel de cofator na atividade proteolítica de clivagem das proteínas não

estruturais (Falgout et al. 1991). A proteína NS3 (70kDa) é multifuncional, tem

atividade nucleotídeo trifosfatase, RNA helicase e RNA trifosfatase, também agindo

no processamento da poliproteína e na replicação do RNA (Li et al. 1999). A NS3

Associa-se a proteína NS5 para montagem do complexo de replicação. As proteínas

NS4A e NS4B são hidrofóbicas e relativamente pequenas (16 kDa e 24 kDa,

respectivamente), ambas atuam no processo de replicação, sendo a NS4B através

de uma interação com a proteína NS3, ambas também atuam na inibição de

sinalização de interferon (Jones et al. 2005; Lindenbach et al. 2007; Umareddy et al.

2006). A proteína NS5 (103 kDa) é altamente conservada e multifuncional, com

atividade de metiltransferase e de polimerase RNA dependente (Lindenbach et al.

2007).

Em infecções naturais, estudos demonstram que células da linhagem

mononuclear fagocitária são alvos primários para a replicação dos DENV (Jessie et

al. 2004; Wu et al. 2000). Porém, outros sítios de replicação já foram evidenciados,

com a detecção de partículas virais nos tecidos do fígado, coração, pulmão, rim,

baço, cérebro e até mesmo na medula óssea. (Araújo et al. 2009b).

Os DENV entram na célula hospedeira via endocitose mediada por

receptor. Após a ligação do vírus a um receptor na superfície celular, o vírus é

endocitado em processo mediado por clatrinas (Chu & Ng 2004). O endossomo

possui o lúmen ácido, o qual induz mudanças conformacionais na proteína E do

vírus, o que ativa a sua atividade fusogênica, resultando na fusão da membrana viral

com a membrana do endossomo e consequente liberação do nucleocapsídeo no

interior da célula (Gollins & Porterfield 1986; Kuhn et al. 2002; Modis et al. 2004).

Assim que o genoma viral é liberado no citosol celular dá-se início a

tradução e replicação viral. Vírions imaturos são formados pelo brotamento de

nucleocapsídeos recém-formados no lúmen do retículo endoplasmático, assim

adquirindo o envelope bilipídico com as proteínas estruturais prM e E (Van der

Schaar et al. 2007). A maturação do vírion ocorre durante o transporte através das

vesículas do complexo de Golgi, onde ocorre a clivagem da proteína prM, através de

uma proteína do tipo furina, a clivagem distingue vírions infecciosos de defectivos

6

(Stadler et al. 1997). Em seguida, ocorre a liberação destes vírions através de um

mecanismo semelhante à exocitose (Figura 1.3).

1.2.1 Diversidade Genética

Os vírus, que possuem RNA, demonstram grande variabilidade genética,

devido à alta taxa de mutação intrinsecamente associada a RNA polimerase RNA

dependente (Drake & Holland 1999), suas rápidas taxas de replicação e seus

imensos tamanhos populacionais. Nos DENV, podemos perceber claramente esta

variabilidade na existência de quatro sorotipos distintos antigenicamente. Com a

utilização de métodos de sequenciamento e análise do genoma viral, podemos ter

uma maior elucidação da estrutura genética dos DENV e dos processos que

permeiam a evolução destes vírus (Holmes & Twiddy 2003).

Em 1990, Rico-Hesse realizou um trabalho que seria um dos principais

pontos de referência na análise de variação intra-sorotípica dos DENV. Ao analisar

Figura 1.3 Modelo de biossíntese do vírus da Dengue (Adaptado de Van der Schaar 2009).

7

um fragmento de 240 pares de bases (pb) da região de junção dos genes E/NS1, ela

pôde reconhecer distintos genótipos, definidos como um grupo de DENV que não

possuíssem uma divergência nucleotídica maior que 6% (Holmes & Twiddy 2003;

Rico-Hesse 1990).

Numa tentativa de esclarecer ou unificar a classificação dos genótipos

dos DENV, Rico-Hesse, em 2003, realizou estudos filogenéticos dos quatro

sorotipos, utilizando sequências nucleotídicas do gene E. Foram descritos cinco

genótipos para DENV-1, quatro para DENV-2 e DENV-3 e três genótipos para

DENV-4, caracterizados por diferenças genéticas e distribuição geográfica (Rico-

Hesse 2003) (Tabela 1.1).

Tabela 1.1 Classificação genotípica dos DENV(de acordo com Rico-Hesse 2003).

Sorotipo Genótipos

DENV-1

Ásia Tailândia

Pacífico Sul Américas/África

Malásia

DENV-2

Malásia/Subcontinente Indiano Sudeste Asiático

Américas Oeste Africano

DENV-3

Sudeste Asiático/Pacífico Sul Tailândia

Subcontinente Indiano Américas

DENV-4 Indonésia

Sudeste Asiático Malásia

Em trabalho mais recente, uma revisão realizada por Weaver e Vasilakis,

em 2009, também analisando trabalhos realizados com sequências nucleotídicas do

gene E caracterizaram cinco genótipos para DENV-1, seis para DENV-2, cinco para

DENV-3 e quatro para DENV-4 (Weaver & Vasilakis 2009)(Tabela 1.2). Sendo esta,

a classificação adotada em nosso estudo.

8

Sorotipo Genótipo Distribuição Geográfica

I Sudeste Asiático, China, Leste da África

II Tailândia (1950-1960)

III Malásia (cepas selvagens)

IV Ilhas do Oeste do Pacífico e Austrália

V Américas, Oeste da África, Ásia

Asiático I Malásia e Tailândia

Asiático II Vietnã,China,Taiwan, Sri Lanka e Filipinas

Cosmopolita Austrália, Leste e Oeste da África, Ilhas do Pacífico/Índico,subcont. Indiano e Oriente Médio

Americano América Latina, Caribe (1950-1960)

Sudeste Asiático/ Americano Tailândia, Vietnã, Américas

Selvagem Oeste Africano e Sudeste Asiático

I Indonésia, Malásia, Filipinas e Sul das Ilhas do Pacífico

II Tailândia, Vietnã e Bangladesh

III Sri Lanka, Índia, África, Samoa, Tailândia (1962)

IV Porto Rico, América Latina e Central, Taiti (1965)

V Filipinas (1956), Japão (1973), China (1980), América do Sul (2002-2004)

I Tailândia, Filipinas, Sri Lanka e Japão

II Indonésia, Malásia, Taiti, Caribe e Américas

III Tailândia (cepas recentes)

IV Malásia (cepas selvagens)

DENV-1

DENV-2

DENV-3

DENV-4

No Brasil, Dos Santos e colaboradores (2011) demonstraram que os

DENV-1 isolados no período entre 2009 e 2011, pertencem ao genótipo V. Porém

linhagens distintas são reconhecidas. As amostras isoladas em 2009/2010 agrupam

em clados distintas (Linhagem II) das cepas brasileiras de 1986 e 2001 (Linhagem I),

além de sugerirem uma possível origem asiática. Ademais, cepas isoladas em 2010

e 2011 agruparam formando outro clado (linhagem III), sugerindo uma origem

Latino-americana para estas cepas. Estes achados indicam origens virais diferentes

e possível substituição de linhagens ocasionando casos da doença no país.

As cepas brasileiras de DENV-2 foram descritas como pertencentes ao

genótipo Sudeste Asiático/Americano, todavia duas linhagens distintas dentro deste

genótipo foram identificadas. A primeira linhagem corresponde às amostras

brasileiras isoladas no período entre os anos de 1990 a 2003, a segunda linhagem

corresponde à amostras isoladas no período de reemergência do sorotipo 2, após

2007, sendo a linhagem a qual ocasionou uma das piores epidemias de Dengue no

país, em 2007-2008. Provavelmente, esta circulação temporal de vírus

geneticamente distintos foi resultado de uma evolução local, ou a introdução de uma

Tabela 1.2 Classificação genotípica dos DENV (de acordo com Weaver & Vasilakis 2009).

9

nova linhagem proveniente da região do Caribe (Faria et al. 2013; Oliveira et al.

2010).

Em relação ao DENV-3, temos a circulação do genótipo III. Araújo et al.

(2012), demonstram quatro linhagens filogeneticamente distintas, deste mesmo

genótipo. Três linhagens foram introduzidas através da região das Ilhas do Caribe e

uma pela Colômbia ou Venezuela. O trabalho ainda sugere que as regiões

brasileiras do Norte e Sudeste são importantes na introdução e disseminação das

linhagens de DENV-3 no país.

O DENV sorotipo 4, após um período de 28 anos sem detecção, voltou a

circular no Brasil, sendo primeiramente detectado em Roraima (Temporão et al.

2011), Estado da região norte e último local a reportar casos deste sorotipo, em

1981-1982 (Osanai et al. 1983). Estudos filogenéticos demonstram que os genótipos

I e II encontram-se em circulação no Brasil. O genótipo II é o mais comum na

América do Sul e nas Ilhas do Caribe, enquanto o genótipo I foi caracterizado em

apenas uma amostra proveniente do Estado da Bahia e recentemente foi

demonstrada sua circulação em Ae. aegypti coletados em 2008, em Manaus (de

Figueiredo et al. 2013; Nunes et al. 2012).

Diante do exposto, pode-se verificar que a variabilidade genética dos

DENV é de grande importância para o entendimento dos padrões de disseminação

do vírus, para o monitoramento de introdução e reintrodução de cepas

potencialmente virulentas e o impacto das mesmas sobre a população, como

mudanças na gravidade da doença. Isto enfatiza a necessidade de uma rígida e

eficaz vigilância virológica, com o objetivo de auxiliar nas medidas de controle da

Dengue, no Brasil e no Mundo (Araújo et al. 2012; dos Santos et al. 2011; Faria et al.

2013).

1.3 Patogênese das infecções por Dengue

A patogenia da Dengue ainda permanece com lacunas a serem

preenchidas, não sendo ainda totalmente entendida. Acredita-se que os sintomas

sistêmicos são, em parte, resultado da liberação de citocinas, devido à infecção viral

nas células dendríticas e macrófagos e da ativação de linfócitos T-CD4 e T-CD8. O

interferon, liberado pelos linfócitos T, inibe a atividade da medula óssea, tendo como

10

resultado a depleção de células da linhagem sanguínea, sendo as plaquetas as mais

afetadas (Romanos 2008).

A falta de consenso em relação aos mecanismos patogênicos da febre

hemorrágica por dengue e a síndrome do choque por Dengue são, principalmente,

consequência da falta de um modelo animal adequado, o qual desenvolva todas as

manifestações clínicas da doença (Chaudhry et al. 2006).

Rosen, em 1977, sugeriu que a virulência viral varia entre os sorotipos e

genótipos dos vírus. Ele propõe que os quatro sorotipos do vírus dengue e diferentes

linhagens dentro dos genótipos diferem em termos de patogenicidade. Esta hipótese

enfatiza apenas aspectos relacionados à virulência do agente etiológico, não

levando em consideração fatores imunológicos do hospedeiro, o que pode explicar a

ocorrência de episódios graves da dengue (FHD/SCD) em infecções primárias

(Rosen 1977).

Halstead, em 1988, propôs a teoria da infecção sequencial ou da

facilitação dependente de anticorpos (do inglês ADE: antibody dependent-

enhancement), onde a formação de imunocomplexos entre anticorpos heterólogos

da classe IgG de infecções anteriores estaria relacionada à resposta imunológica

exacerbada em uma segunda infecção com um sorotipo viral diferente (Halstead

1988). A endocitose de partículas virais recobertas por anticorpos heterólogos, via

receptor para FC de IgG, presente nas células da linhagem mononuclear, se

constitui num mecanismo adicional de entrada dos vírus nestas células resultando

em uma amplificação da replicação viral. Os anticorpos heterólogos se ligam às

partículas virais circulantes formando complexos antígeno-anticorpo. Esses

complexos imunes circulantes vão se depositar nas paredes dos vasos, onde ocorre

ativação do complemento resultando em um processo inflamatório. Os anticorpos

circulantes também podem se ligar ás células do endotélio vascular que estão

infectadas e apresentam proteínas virais em sua membrana, o que leva a ativação

do complemento promovendo a lise dessas células, resultando em lesão nas

paredes dos vasos. Em ambos os mecanismos a ativação do complemento resulta

na liberação de citocinas responsáveis por inflamação aguda tendo em vista a

indução de quimiotaxia para neutrófilos e a ativação de mastócitos, bem como a

liberação de anafilotoxinas, relacionadas ao aumento da permeabilidade vascular o

11

que resulta em extravasamento de plasma resultando em choque hipovolêmico

(Abbas et al. 2008; Nielsen 2009).

Trabalhos de Kouri et al., em 1987 e em 1989, sugerem uma teoria

integral. Ao detalharem os principais achados da epidemia ocorrida em 1981, em

Cuba, perceberam que fatores individuais, epidemiológicos e virais estariam

relacionados e seriam responsáveis por casos graves da doença (Kouri et al. 1987;

Kouri et al. 1989) (Figura 1.4). Desta forma, sem exclusão ao que foi proposto por

Rosen (1977) e Halstead (1988), mas indicando que há um caráter multifatorial

associado à gravidade da doença.

Em dengue, a teoria do pecado original antigênico foi primeiramente

descrita por Halstead et al., em 1983. Nesse trabalho, percebeu-se que a resposta

imunológica humoral possui grande afinidade pelo sorotipo infectante em infecções

primárias. Ao ocorrer uma infecção secundária, por outro sorotipo, os linfócitos B de

memória são rapidamente ativados e produzem anticorpos específicos ao epítopo

viral da primeira infecção, tornando a resposta ineficaz e inibindo a ativação de

linfócitos B naive, os quais produziriam anticorpos específicos para o sorotipo da

Figura 1.4 Hipótese Integral para o desenvolvimento da DHF/SCD.(Adaptado de Guzman & Kouri 2002)

12

infecção secundária (Halstead et al. 1983). Mais recentemente, o pecado original

antigênico também foi descrito para a resposta imunológica celular direcionada para

dengue (Mongkolsapaya et al. 2003). Uma maior ativação de células T CD8+ e T

CD4+, com elevada proliferação e morte celular, contribui para uma maior liberação

de citocinas pró-inflamatórias, dano tecidual, e alteração na permeabilidade

vascular, podendo ocorrer extravasamento de plasma. Adicionalmente, esta

ineficácia da resposta celular e humoral, em infecções secundárias, resulta em maior

carga viral, diretamente relacionada à gravidade da doença (Mongkolsapaya et al.

2003).

O mimetismo molecular é um dos mecanismos de resposta autoimune

devido à infecção viral. Este tipo de mecanismo, em dengue, foi primeiramente

demonstrado por Markoff et al., em 1991, onde foi evidenciado reatividade cruzada

entre anticorpos dirigidos a proteína do Envelope (E) do vírus Dengue e o

plasminogênio humano (Devido a uma similaridade de 20 aminoácidos) (Markoff et

al. 1991). Atualmente, já foi demonstrado que anticorpos dirigidos a outras regiões

do vírus, como a proteína não estrutural 1 (NS1) e a proteína da pré-membrana

(prM), também podem apresentar reatividade cruzada com o plasminogênio, células

do tecido endotelial e plaquetas do hospedeiro (Chuang et al. 2011; Lin et al. 2001;

Lin et al. 2003). Este funcionamento anormal da coagulação sanguínea e a mudança

na permeabilidade vascular podem ser responsáveis pela patogênese da FHD/SCD,

porém Halstead, em 2012, questiona o porquê da não ocorrência de trombocitopenia

e permeabilidade vascular crônica, já que a resposta de anticorpos pode perdurar

por anos e esses mesmos anticorpos são os causadores desta resposta autoimune

(Halstead 2012).

1.4 Vetores

Os vírus da Dengue circulam em ambientes florestais por mosquitos do

gênero Aedes e primatas inferiores, porém, os DENV são os únicos arbovírus que se

adaptaram ao ambiente urbano a ponto de não necessitarem de ciclos silvestres

para a sua manutenção (Gubler 2002). Sendo assim, o seu principal ciclo de

transmissão envolve apenas humanos e mosquitos de gênero Aedes, com Aedes

aegypti como principal vetor e Aedes albopictus como vetor secundário (Gubler et al.

2007) (Figura 1.5).

13

Aedes aegypti é o principal vetor urbano dos vírus da dengue em todo o

mundo. Nos últimos 25 anos, um aumento global da dengue e da distribuição do Ae.

aegypti tem ocorrido, causando inúmeras epidemias (Jansen & Beebe 2010).

Esse mosquito possui características determinantes para o agravamento

da disseminação do vírus da Dengue, sendo bastante domiciliado e adaptado a

ambientes urbanos. Seu repasto sanguíneo ocorre durante o dia, estando adaptado

ao horário de atividade humana no peridomicílio, além de realizar inúmeros repastos

para apenas um evento de oviposição. As fêmeas possuem preferência de

alimentação em humanos, fator que determina o aumento de ovos quando

comparado com alimentação em outros vertebrados. Os ovos são postos em objetos

antrópicos que acumulam água e podem resistir à dessecação por mais de um ano,

outro agravante é o modo de transmissão transovariana que facilita a transmissão

do vírus para os humanos, modificando a epidemiologia da doença (Jansen & Beebe

2010; Woke 1937).

Figura 1.5 Ciclos de transmissão da dengue (Adaptado de Weaver & Vasilakis 2009).

14

De origem africana, Ae. aegypti, se adaptou bem a regiões áridas,

passando também a acompanhar as migrações humanas. Por meio de navios e

outras formas de dispersão, este vetor chegou as Américas e a Ásia. O comércio de

escravos, durante os séculos XVIII e XIX, favoreceu a introdução desse mosquito,

afetando principalmente cidades portuárias com saneamento precário. Na África, a

raça formosus do Ae. aegypti demonstra baixa capacidade vetorial para a Dengue, o

que explica o baixo impacto desta doença no continente (Schatzmayr 2008).

Aedes albopictus é um vetor competente para pelo menos 26 arbovírus.

Dentre eles, a importância deste artrópode, na transmissão e ecologia viral, é

reconhecida para os 4 sorotipos de Dengue e o vírus Chikungunya. O que não exclui

o seu intenso potencial para disseminação de outras doenças virais (Paupy et al.

2009).

Nos últimos 10 anos, esta espécie foi o vetor primário em surtos de

Dengue no Havaí, em Ilhas do Oceano Índico, na África Central e na China

meridional, além de ter sido responsável pela transmissão dos primeiros casos

autóctones de Dengue na Europa (Bonizzoni et al. 2013). Em países do sudeste da

Ásia e nas Ilhas do Pacífico, este mosquito tem papel de vetor secundário da

Dengue, atuando apenas em áreas rurais. A larga disseminação deste vetor, sendo

encontrado na Europa, Ásia, Américas e África, aliada à capacidade competitiva em

relação ao Aedes aegypti e à competência na transmissão de inúmeros patógenos,

tem colocado esta espécie como uma das principais preocupações das autoridades

de saúde (Gratz 2004).

Estudos sugerem que a emergência do DENV, do ciclo selvagem para o

epidêmico/endêmico urbano, só foi possível devido à adaptação às espécies Aedes

aegypti e Aedes albopictus, não havendo necessidade de grande adaptação aos

hospedeiros vertebrados, o que implica na possível reemergência de linhagens

selvagens em ciclos endêmicos de Dengue (Moncayo et al. 2004; Vasilakis et al.

2007).

As fêmeas desses mosquitos ingerem o vírus da Dengue ao realizarem o

repasto sanguíneo em humanos, no período de viremia. Após ser ingerido pelo

mosquito, o vírus infecta as células epiteliais do intestino médio, onde se replica e é

disseminado para outros tecidos e órgãos, incluindo ovários, cordão nervoso ventral,

e gordura corporal. O mecanismo de disseminação dos DENV ainda não foi bem

15

elucidado, mas estudos sugerem que o sistema traqueal possa estar envolvido. Do

oitavo ao décimo segundo dia, já se pode detectar os DENV nas glândulas salivares

do inseto, finalizando o período de incubação extrínseca, o que torna o mosquito

apto à disseminação a outro humano suscetível. O período de incubação intrínseca

dura entra 4 a 10 dias, reiniciando o ciclo (Gubler et al. 2007; Salazar et al. 2007;

World Health Organization 2009) (Figura 1.6).

Fatores ambientais e inerentes ao mosquito modulam a habilidade desses

insetos na transmissão do vírus da Dengue (Gubler et al. 2007). Os fatores inerentes

influenciam diretamente na competência vetorial dos mosquitos, onde a variabilidade

genética entre o vetor e o vírus é o principal fator. A infecção do DENV nas

glândulas salivares do mosquito não só regula genes que modulam a replicação

viral, mas também genes que aumentam a busca por alimentação, amplificando a

probabilidade de transmissão do vírus (Sim et al. 2012). A susceptibilidade oral dos

mosquitos pode variar por seleção genética, assim como diferentes genótipos virais

podem ter capacidade de infecção distinta em uma mesma população de mosquitos,

o que demonstra a interação específica entre patógeno e vetor em nível de genótipo,

afetando a dinâmica da Dengue e sua epidemiologia(Lambrechts 2011).

Os fatores ambientais são principalmente as condições climáticas, pois o

metabolismo e a biologia dos vetores são afetados pela temperatura, umidade,

Figura 1.6 Períodos de incubação dos DENV (Adaptado de CDC, 2002).

16

velocidade do vento, índice pluviométrico, entre outros fatores naturais (Gubler et al.

2007). Já tem se demonstrado que o período de incubação extrínseca pode durar de

5-33 dias a 25°C e de 2-15 dias a 30°C, afirmando a influência climática no ciclo de

vida do mosquito e consequentemente na replicação e disseminação viral (Chan &

Johansson 2012).

1.5 Manifestações Clínicas

A dengue é uma infecção sistêmica dinâmica, apresentando um amplo

espectro de manifestações clínicas. O período de incubação é em média de 4 a 7

dias, após este período o quadro clínico tem início súbito e é seguido de três fases:

febril, crítica e de recuperação. Podem ocorrer de quadros assintomáticos a graves

de formas hemorrágicas e de choque, podendo até mesmo evoluir ao óbito. Todas

estas variações assumidas pela doença dificultam o correto diagnóstico e

influenciam no devido tratamento (Souza et al. 2008; World Health Organization

2009).

A fase febril aguda dura em média de 2 a 7 dias e é geralmente

acompanhada por rubor facial, eritema cutâneo, dor retrorbital, cefaléia, mialgia e

artralgia. Anorexia, náusea e vômitos também são comuns. Nesta fase inicial há

dificuldades de distinção entre dengue e outras doenças febris. O monitoramento de

sinais de alerta é crucial para que se possa reconhecer a entrada na fase crítica da

doença e a possível evolução para um caso de alta gravidade (World Health

Organization 2009).

Na fase de defervescência, entre o terceiro e sexto dia, o paciente pode

apresentar aumento na permeabilidade capilar e aumento nos níveis do hematócrito,

marcando o início da fase crítica. O período clinicamente significante de vazamento

de plasma dura de 24 a 48 horas. Neste ponto a diminuição ou o aumento de

extravasamento capilar determinará a melhora ou agravamento da situação do

paciente, respectivamente. O choque ocorre quando um volume crítico de plasma é

extravasado. Com o choque prolongado pode haver danos aos órgãos, acidose

metabólica e coagulação intravascular disseminada, este por sua vez leva a

hemorragias graves. Entretanto, prejuízos aos órgãos, como fígado, encéfalo e

coração, além de sangramentos, podem ocorrer sem óbvio extravasamento capilar e

choque. A melhora após a fase de defervescência é dita como dengue branda ou

17

clássica, enquanto alguns pacientes podem evoluir para a fase crítica sem ao menos

passar por esta fase de diminuição da temperatura, o que torna o monitoramento

sanguíneo importante (Souza et al. 2008; World Health Organization 2009).

O período de recuperação ocorre após a passagem pelo período de 24 a

48 horas da fase crítica. Uma reabsorção extravascular ocorre gradualmente nas 48

a 72 horas posteriores, enquanto os sintomas gerais apresentam melhora. Há

estabilização do hematócrito, do número de leucócitos e, mais tardiamente, do

número de plaquetas (Figura 1.7) (World Health Organization 2009). Podem ser

necessárias de 3 a 4 semanas para a recuperação completa do paciente. Neste

período pode haver persistência de anorexia, emagrecimento, prostração, edemas

de mão e quadros de desânimo à depressão (Souza et al. 2008).

Figura 1.7 Resumo didático do curso da doença da dengue, demonstrando aspectos clínicos e laboratoriais(Adaptado de World Health Organization 2009).

18

A classificação de casos clínicos para a dengue passou, recentemente,

por um estudo multicêntrico de avaliação, no intuito de melhorar o manejo clínico

dos pacientes. Trabalhos como os de Phuong et al. (2004) e Bandyopadhyay et al.

(2006) demonstraram falta de aplicabilidade da antiga classificação estabelecida

pela Organização Mundial de Saúde (OMS), demonstrando que a rigidez de

definições e incompatibilidade de critérios para a definição de formas graves da

doença são os principais problemas (Bandyopadhyay et al. 2006; Phuong et al.

2004).

A classificação de casos estabelecida pela OMS há mais de 30 anos, e

ainda extensamente utilizada, estabelece a classificação da Dengue em

assintomática, indiferenciada, clássica e febre hemorrágica por Dengue (World

Health Organization. 1997).

A forma assintomática pode ocorrer devido a fatores relacionados ao

vírus, como a baixa virulência da cepa, ou devido a fatores ligados ao hospedeiro,

devido ao seu tipo de resposta imunológica. Estima-se que seja a forma clínica mais

comum, ocorrendo cinco casos assintomáticos para cada caso sintomático (Souza et

al. 2008).

Quando sintomática indiferenciada o paciente normalmente apresenta-se

com febre, tendo manifestação clínica semelhante à gripe. Pacientes com este

quadro, às vezes, erroneamente são diagnosticados como simples virose, ou até

mesmo gripe (Souza et al. 2008).

A dengue clássica é a forma branda da doença, com manifestações

clínicas já explicitadas neste trabalho, onde o paciente apresenta melhora após a

fase de defervescência, sem agravamento hemorrágico e extravasamento de

plasma (Souza et al. 2008)

Segundo Souza e colaboradores (2008), o termo “Febre Hemorrágica por

Dengue” é a classificação mais imprecisa, pois o que caracteriza essa forma da

doença não é a presença de sufusões hemorrágicas, mas sim o aumento da

permeabilidade vascular (Souza et al. 2008).

A OMS estabelecia a divisão da Dengue hemorrágica em graus de I a IV,

sendo os Graus III e IV classificados como síndrome do choque por Dengue. Em

resumo, a Febre hemorrágica por Dengue de Grau I só apresenta manifestações

hemorrágicas provocadas, a de Grau II apresenta manifestações hemorrágicas

19

espontâneas, a de Grau III apresenta além de hemorragias espontâneas,

instabilidade hemodinâmica, havendo hipotensão postural ou choque. A de Grau IV

apresenta além de manifestações hemorrágicas, choque profundo (World Health

Organization. 1997).

No Brasil, o Ministério da Saúde (MS) sugeriu a classificação como

Dengue com complicações (DCC) para casos graves que não se enquadram nos

critérios sugeridos pela OMS. A presença de um destes fatores caracteriza este tipo

de Dengue sugerido: alterações graves do sistema nervoso, disfunção

cardiorrespiratória, insuficiência hepática, plaquetopenia igual ou inferior a

50.000/mm³ e óbito (Brasil 2008).

Com vistas à simplificação do manejo clínico de pacientes e

melhoramento no tratamento de casos graves da Dengue, a OMS sugeriu uma nova

forma de classificação e triagem para os casos de Dengue. Os pacientes com

dengue foram agrupados em dois grupos: Dengue com ou sem sinais de alerta e

Dengue grave. Fatores determinantes para a classificação em Dengue grave são:

intenso extravasamento de plasma, grave envolvimento de órgãos e hemorragia

grave (World Health Organization 2009) (Figura 1.8).

Figura 1.8 Classificação sugerida pela Organização Mundial de Saúde para classificação de casos de Dengue e níveis de gravidade (Adaptado de WHO, 2009).

20

Segundo a OMS (2009), a classificação em níveis de gravidade tem alto

potencial prático no uso clínico, facilitando a tomada de decisão em relação ao tipo e

intensidade do tratamento, além de resultar em dados mais consistentes para a

vigilância epidemiológica e para os testes de drogas e vacinas (World Health

Organization 2009).

Trabalhos recentes têm demonstrado que a nova classificação de casos,

sugerida pela OMS, é mais específica e sensível na detecção e triagem de casos

graves da Dengue. Porém faz-se necessário um maior refinamento nos critérios de

definição para extravasamento de plasma, comprometimento hemodinâmico,

sangramento grave, e envolvimento de órgãos para uma melhora na relevância

clínica. Além disso, é fundamental uma definição mais precisa para os sinais de

alerta, no intuito de se evitar uma alta taxa de hospitalização desnecessária. Foi

averiguado que esta nova classificação, apesar de promissora na perspectiva

clínica, ainda precisa ser melhor avaliada quanto a sua efetividade em estudos

epidemiológicos e fisiopatológicos (Gan et al. 2013; Hadinegoro 2012; Narvaez et al.

2011; van de Weg et al. 2012; Wanigasuriya et al. 2011).

A partir de janeiro de 2014, o Brasil começou a utilizar a nova

classificação de casos de dengue da Organização Mundial de Saúde, de acordo

com documento emitido pelo MS na página da internet do Sistema de Informação de

Agravos de Notificação (SINAN) (Ministério da Saúde 2014).

1.6 Diagnóstico laboratorial

Aliados ao manejo clínico estão os métodos de diagnóstico laboratoriais

específicos para Dengue, os quais se fazem necessários devido à semelhança

clínica em relação a várias outras doenças. Por ser uma doença aguda, inclusive de

notificação compulsória, a Dengue necessita de métodos rápidos e eficazes na

constatação da enfermidade, com vistas a auxiliar nas medidas de controle do vetor

na região e no manejo clínico, além de melhorar o conhecimento da epidemiologia

da doença. A escolha do teste diagnóstico estará condicionada à infraestrutura do

laboratório e ao período da doença em que o paciente se encontra, sendo este fator

de suma importância para um resultado preciso (Figura 1.9) (Nogueira 2008).

21

Os métodos mais utilizados são: isolamento viral em cultivo de células,

detecção do ácido nucléico viral pelo método de transcrição reversa seguida de

reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) e RT-PCR quantitativo em tempo real

(qRT-PCR), técnicas sorológicas para a pesquisa de anticorpos específicos

(IgM/IgG) e antígenos específicos (NS1).

1.6.1 Isolamento viral

O isolamento viral é o método que fornece o resultado mais específico,

pois se comprova de forma direta a infecção viral, sendo considerado “Padrão-Ouro”

no diagnóstico para Dengue (Yamada et al. 2002). As amostras de casos suspeitos

de dengue devem ser coletadas nos primeiros 4-5 dias, de início dos sintomas, ou

seja, na fase aguda da doença e período virêmico do paciente. Geralmente o soro é

utilizado para o isolamento viral, porém o plasma, leucócitos, sangue total e tecidos

de casos fatais (fígado, baço, pulmão, rim, cérebro, coração, medula óssea) também

podem ser utilizados (Araújo et al. 2009b; Guzman et al. 1999; Guzman et al. 2010).

Como o DENV é termolábil, o manejo rápido e adequado das amostras,

para entrega ao laboratório, é necessário para o êxito do isolamento viral. Para o

armazenamento de curto prazo, os espécimes podem ser mantidos à temperatura

Figura 1.9 Vírus da Dengue, antígenos e respostas de anticorpos utilizados no diagnóstico, correlacionados ao período da doença (Adaptado de Guzman et al. 2010).

22

de 4ºC, no entanto, para um armazenamento mais prolongado é recomendada a

temperatura de -70°C (Guzman & Kouri 2004).

O vírus da dengue pode ser isolado através da inoculação em mosquitos,

cultura de células, utilizando linhagens celulares de mosquito, como C6/36 e AP61

ou linhagens celulares de mamíferos, tais como células Vero e LLC-MK2, ou a

inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos (Peeling et al. 2010).

Os sistemas de isolamento viral em linhagens celulares de mosquito são mais

fáceis de serem mantidos, sendo facilmente cultivados e estocados à temperatura

ambiente, além de apresentarem uma maior sensibilidade à infecção do DENV em

comparação às linhagens celulares de mamíferos (Race et al. 1978; Race et al.

1979; Teles et al. 2005; Tesh 1979). Atualmente, a inoculação de espécimes em

culturas de células de mosquitos Ae. albopictus clone C6/36 tem sido amplamente

utilizada em laboratórios de pesquisa e/ou diagnóstico. O DENV induz efeito

citopático (ECP) nas linhagens celulares de mosquito, em seguida, é realizada a

técnica de imunofluorescência indireta, para detecção e tipagem viral, utilizando

anticorpos monoclonais específicos para os quatro sorotipos dos DENV. Porém,

nem todas as culturas com vírus produzem ECP, sendo submetidas à técnica de IFI

utilizando soros hiperimunes, desta forma, as culturas com resultado negativo são

consideradas negativas. (Gubler et al. 1984; Igarashi 1978; World Health

Organization 2009).

1.6.2 Testes Imunoenzimáticos

Os testes imunoenzimáticos são os mais utilizados na confirmação de

casos suspeitos de Dengue. Quando comparados ao isolamento viral e a métodos

moleculares, esses testes sorológicos são relativamente mais baratos e fáceis de

serem executados, além de possibilitarem o processamento de um número elevado

de amostras (Guzman et al. 2010; Nogueira 2008).

Uma das mais importantes ferramentas no diagnóstico de rotina para

dengue é o MAC-ELISA (do inglês: IgM Antibody-capture enzyme-linked

immunosorbent assay), um teste imunoenzimático usado para detecção da

Imunoglobulina M (IgM) específica para Dengue (Guzman & Kouri 2004). O teste

consiste na captura do IgM anti-dengue do soro por um anticorpo anti-IgM humano

ligado a uma fase sólida, em seguida, uma mistura dos antígenos dos quatro

23

sorotipos reage com o IgM anti-dengue e esta reação é detectada por anticorpos

policlonais ou monoclonais para Dengue ou Flavivírus em geral, conjugados a uma

enzima fluorescente (Innis et al. 1989; Kuno et al. 1991; Nawa et al. 2001). A IgM

pode ser detectada precocemente até antes do quinto dia de início dos sintomas,

permanecendo de 30 a 60 dias, com o pico de detecção após uma semana do início

do quadro (Nogueira 2008).

O Elisa para a Imunoglobulina G (IgG) pode ser usado para confirmar

infecções passadas ou ativas, quando disponíveis amostras pareadas. Infecções por

dengue podem ser classificadas como primária ou secundária, por determinação da

proporção de unidades de dengue de IgM para IgG (Innis et al. 1989), por

quantificação dos títulos de IgG (Miagostovich et al. 1999) ou por testes de avidez

da IgG (de Souza et al. 2004). Durante uma infecção primária a IgM possui títulos

elevados e mais específicos, enquanto na resposta a uma infecção secundária, a

IgG possui uma titulação mais elevada e maior avidez (Peeling et al. 2010) (Figura

1.10)

O antígeno Não estrutural 1 (NS1) é uma glicoproteína altamente

conservada, presente em todos os Flavivírus, e possui um importante papel na

viabilidade viral. É secretada por células infectadas, como um hexâmero solúvel e

Figura 1.10 Títulos de Anticorpos IgM e IgG, em resposta à infecção primária e secundária do DENV (Adaptado de Peeling et al. 2010)

24

também já foi demonstrado estar associada à membrana sob forma de dímero

(Flamand et al. 1999; Winkler et al. 1989).

Desde o aparecimento dos sintomas até o nono dia, a NS1 pode ser

encontrada no sangue periférico, o que é de grande valia para o diagnóstico precoce

do Dengue (Alcon et al. 2002). Kits comerciais, dentre eles, o pan-E DENGUE

EARLY ELISA (Panbio Diagnostics, Brisbane, Australia), PLATELIA™ DENGUE

NS1 ANTIGEN e DENGUE NS1 Ag STRIP (Biorad Laboratories, Marnes La

Coquette, França), estão disponíveis e apresentam boa sensibilidade e

especificidade (Lima et al. 2010). Estes testes também podem ser usados para

captura do antígeno NS1 em outros tipos de amostras, além do soro e plasma, tais

como, fígado, pulmão, rim, cérebro, baço e timo. A detecção do antígeno NS1 tem

se mostrado uma ferramenta alternativa e bastante útil no diagnóstico prematuro

para Dengue, podendo ser utilizada como mecanismo de triagem para o isolamento

viral e em conjunto com o MAC-ELISA para o aumento nas taxas de confirmação de

casos (Lima et al. 2011; Lima et al. 2010).

1.6.3 Métodos Moleculares

Todos os ensaios de amplificação molecular envolvem três passos

básicos: 1- Extração e purificação do ácido nucleico, 2- Amplificação do ácido

nucleico, 3- Detecção/ Caracterização do produto amplificado. O ácido ribonucleico

(RNA) do DENV pode ser detectado em uma variedade de amostras, como tecidos,

líquor, sangue total, soro ou plasma, através das técnicas moleculares (Lanciotti

2003).

A técnica de RT-PCR se mostra uma ferramenta rápida, sensível e

específica para detecção e confirmação da Dengue em fase aguda (Tang & Ooi

2012). Vários protocolos têm sido desenvolvidos e se baseiam na utilização de

iniciadores de oligonucleotídeos (primers) dirigidos a regiões específicas do genoma

de cada sorotipo do DENV(Peeling et al. 2010). Nas Américas, o protocolo mais

utilizado é o descrito por Lanciotti e colaboradores, em 1992, e indicado pela

Organização Pan-Americana de Saúde. Este protocolo descreve um procedimento

semi-nested onde inicialmente se amplifica uma região conservada para os 4

sorotipos do DENV, localizada na junção dos genes das proteína C e prM. Em etapa

posterior, são utilizados primers específicos para cada sorotipo (Lanciotti et al.

25

1992). Este processo é capaz de detectar os quatro sorotipos do DENV de modo

qualitativo, podendo detectar até mesmo coinfecções de sorotipos diferentes (Araújo

et al. 2006; dos Santos et al. 2003). Técnicas de Nested PCR aumentam a

sensibilidade de detecção, pois o produto de amplificação inicial é usado como alvo

na segunda etapa de amplificação (Peeling et al. 2010).

A técnica de PCR convencional também pode ser utilizada na vigilância

entomológica. A detecção do vírus nos mosquitos serve de sentinela, fornecendo

informações sobre quem são os vetores que transportam o DENV na natureza e o

que está acontecendo em termos de transmissão do vírus antes e durante estes

surtos (de Figueiredo et al. 2010; Kow et al. 2001).

A técnica de qRT-PCR em tempo real combina a amplificação por RT-

PCR com a marcação fluorescente de sondas específicas capazes de detectar o

material genético viral amplificado durante a reação, desta forma já quantificando a

carga viral (Lanciotti 2003). Esta quantificação permite relacionar a gravidade da

doença com a carga viral, já havendo estudos demonstrando que há correlação

positiva (Araújo et al. 2009a; Kong et al. 2006; Vaughn et al. 2000). A qRT-PCR em

tempo real é realizada em um sistema fechado e tem duração de aproximadamente

3 horas, sem necessidade de manipulação após a amplificação, o que diminui

bastante o risco de contaminação (Johnson et al. 2005).

1.7 Prevenção e Controle

Apesar de muito pesquisada, ainda não está disponível uma vacina

preventiva eficaz, assim como terapêutica etiológica e uma quimioprofilaxia efetiva.

O combate ao Ae. aegypti ainda é o único elo passível de intervenção no controle e

prevenção da dengue (Medronho 2008; Tauil 2002). A luta contra este mosquito,

extremamente urbanizado, é multifacetada e exige ações coordenadas de múltiplos

setores públicos e privados da sociedade, além de ações educativas que

possibilitem a conscientização e a mudança de hábitos da população, visando à

eliminação de criadouros para o inseto. Devido a esta complexidade de fatores,

observamos uma falta de efetividade das medidas de controle (Tauil 2007).

No Brasil, após a introdução do DENV-3 no Rio de Janeiro, em 2000, e a

confirmação da cocirculação do DENV-1, DENV-2 e DENV-3 em outros Estados, foi

implantado o Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD) (Brasil 2002). O

26

plano tinha como objetivo: diminuir a infestação pelo Aedes aegypti, reduzir a

incidência e a letalidade da doença. Porém, já foi demonstrado que os objetivos não

foram atingidos, havendo até mesmo agravamento de alguns índices pós-

implantação do plano, o que aponta para uma necessidade de revisão operacional

do PNCD (Pessanha et al. 2009).

Em 2012, a OMS publicou um documento instituindo o novo plano de

estratégias globais para a prevenção e controle da Dengue. Os objetivos específicos

são reduzir a mortalidade e morbidade da Dengue em pelo menos 50% e 25%,

respectivamente, até o ano de 2020. Para atingir estes objetivos, são frisados cinco

elementos técnicos: a) o rápido diagnóstico e tratamento clínico adequado; b)

vigilância integrada e prevenção de surtos; c) medidas efetivas de controle do vetor;

d) futura implantação da vacina; e) pesquisa básica, operacional e de execução,

embasando toda a estratégia (World Health Organization. 2012).

1.7.1 Vacina

O desenvolvimento de drogas anti-dengue enfrenta inúmeros desafios.

Apesar do grande aumento no conhecimento da biologia estrutural do vírus da

Dengue, vários pré-requisitos são necessários para a garantia de eficácia e bom

custo-benefício. Entre eles estão, a atividade contra todos os sorotipos, eficácia em

infecções primárias e secundárias, a escolha de um alvo viral adequado, além de

possuir baixo custo de produção e necessitar ser administrada como meio profilático.

Embora existam inúmeras barreiras no desenvolvimento e implantação de drogas

anti-dengue, progressos substanciais tem ocorrido (World Health Organization

2009).

Em relação às vacinas, existem várias candidatas em desenvolvimento.

Entre as vacinas com vírus atenuados podemos citar algumas estratégias de

desenvolvimento, como a tecnologia clássica de atenuação em cultura, a atenuação

através de engenharia genética, a construção de vacinas quiméricas e vacinas de

DNA. Também existem as vacinas com vírus inativados e vacinas contendo

proteínas recombinantes do envelope do vírus, com ou sem adjuvantes, além de

tecnologias mistas (Bricks 2008).

A vacina candidata em fase mais avançada está sendo desenvolvida pela

Sanofi Pasteur, a vacina tetravalente ChimeriVaxTM-Dengue (CYD-TDV). Os vírus

27

que compõem a CYD-TDV foram construídos por meio da substituição dos genes

que codificam as proteínas prM/M e E da cepa utilizada na vacina de febre amarela,

pelos respectivos genes de cada um dos quatro sorotipos da dengue. Trata-se,

portanto, de uma vacina combinada, que contém as cepas recombinantes

resultantes CYD1, CYD2, CYD3 e CYD4 em uma única preparação (CYD1-4) (Guy

et al. 2010; Monath 2007)(Figura 1.11).

Três estudos independentes de fase I foram realizados na Austrália e nos

Estados Unidos revelando a indução de significante resposta do tipo T-CD4 e T-CD8

(Guy et al. 2008). Em estudo anterior, Deauvieu e colaboradores (2007)

demonstraram que a vacina quimérica induz a maturação de células dendríticas e

resposta controlada, acompanhada por limitada produção de citocina inflamatória e

consistente expressão de interferons e outros fatores antivirais, assegurando um

padrão que condiz com as observações clínicas de segurança e imunogenicidade

(Deauvieau et al. 2007).

Figura 1.11 Construção das quatro vacinas quiméricas (Adaptado de Guy et al. 2010)

28

Estudos de fase I e II, realizados na Ásia, nos Estados Unidos e na

América Latina, com vacina quimérica tetravalente atenderam a todas as exigências

para a realização de estudos de fase III (Bricks 2008). A fase IIb foi iniciada em

crianças no final de 2009 para dar suporte ao início de estudos de fase III na Ásia e

na América Latina (Trent et al. 2010). Na Tailândia um estudo de fase 2b realizado

em crianças, demonstrou segurança, porém baixa eficácia (30%), além de não ter

induzido proteção contra o sorotipo 2 do vírus (Sabchareon et al. 2012). No Peru e

na Malásia, estudos de fase II e III, respectivamente, em crianças de 2 a 11 anos,

demonstraram um satisfatório perfil de segurança e uma resposta humoral

balanceada para os 4 sorotipos, sendo administrada em esquema de três doses.

Estes resultados apoiam a continuidade no desenvolvimento da CYD-TDV. Estudos

adicionais em áreas endêmicas estão em andamento para expandir a compreensão

de problemas potenciais no uso da vacina (Hss et al. 2013; Lanata et al. 2012).

Embora muito se tenha avançado e exista uma expectativa de

licenciamento da vacina para Dengue nos próximos anos (Bentsi-Enchill et al. 2013),

muitas perguntas não respondidas a respeito da patogênese de casos graves da

Dengue e a falta de um modelo animal perfeito que manifeste todos os aspectos

clínicos da doença são os principais fatores limitantes para o sucesso no

desenvolvimento da vacina (Kumar et al. 2010).

1.8 Epidemiologia

Nos últimos 50 anos a dengue vem progressivamente alcançando o

status de pandemia. Aproximadamente 2,5 bilhões de pessoas residem nos mais de

100 países, de clima tropical e subtropical, localizados em regiões da África,

Américas, Mediterrâneo oriental, sudeste da Ásia e Pacífico Ocidental, endêmicos

para esta enfermidade (Figura 1.12). A OMS estima que 50 milhões de infecções por

dengue ocorram anualmente e que 500.000 pessoas desenvolvam a forma grave da

doença, das quais 2,5% evoluem a óbito (World Health Organization 2011).

29

A dinâmica da transmissão do vírus da dengue é afetada pela interação

de fatores ambientais e sociais, agente etiológico, vetor e população de hospedeiros

(Silva Júnior & Pimenta Júnior 2008). Gubler (2011) aponta quatro fatores que

podem ser citados como principais impulsionadores do aumento da incidência e

propagação da dengue: a falta de um controle efetivo do vetor, o novo estilo de vida

consumista e insustentável dos seres humanos, a urbanização não planejada e a

globalização (Gubler 2011).

1.8.1 Dengue nas Américas

Em 1947, foi aprovado pela Organização Pan-Americana de Saúde

(OPAS) o plano de erradicação continental do Ae. aegypti, proposto pelo Brasil e

com o objetivo de eliminar a febre amarela urbana nas Américas (Pan American

Health Organization 1997). O grande sucesso deste plano pôde ser verificado com a

erradicação do vetor em 18 países continentais e em algumas ilhas do Caribe, já em

1962. Apesar dos esforços neste período, em 1953 foi isolado o DENV-2 do sangue

de paciente em Trinidad, porém em situação não epidêmica (Anderson et al. 1956).

Figura 1.12 Países ou áreas de risco de infecção por DENV (Adaptado de World Health

Organization 2009) .

30

Em 1972, mais três países foram adicionados à lista de erradicação do

Ae. aegypti. Porém já nos anos 60, alguns países começaram a ser reinfestados,

tendo como fonte os países que não haviam erradicado o mosquito, como:

Venezuela, Cuba, Estados Unidos da América e algumas áreas do Caribe (Pan

American Health Organization 1997, 1998). Dois grandes eventos epidêmicos

ocorreram, na década de 60, devido a estes países. O primeiro foi em 1963-1964 e

iniciado na Jamaica, disseminando-se por Porto Rico, Ilhas do Caribe e Venezuela.

O agente etiológico causador desta epidemia foi o DENV-3 de origem asiática

(Halstead 2006). O segundo ocorreu em 1968-1969, iniciando novamente na

Jamaica e alastrando-se por Porto Rico, Pequenas Antilhas e Venezuela. O DENV-2

foi isolado em todos os países envolvidos e o DENV-3 apenas na Jamaica

(Brathwaite Dick et al. 2012).

A falta de sustentação e até mesmo abandono dos programas de

vigilância vetorial, devido à perda de importância política em países que haviam

conseguido a erradicação, ocasionou a reintrodução e expansão geográfica do

mosquito, na década de 70 (Brathwaite Dick et al. 2012; Pan American Health

Organization 1997, 1998).

Em 1977, o DENV-1, de origem asiática, foi reportado pela primeira vez

causando epidemias, atingindo Cuba, Jamaica, Venezuela, Porto Rico, alastrando-

se pelas Ilhas do Caribe, México, Texas e América Central (Guzman & Kouri 2003;

Halstead 2006).

Em 1981, uma epidemia em Cuba, causada pelo DENV-2, foi reconhecida

como a primeira epidemia na região com casos graves da doença, registrando

10.312 casos de DHF e 158 mortes (Kouri et al. 1989). No mesmo ano, o DENV-4 foi

introduzido através de ilhas caribenhas orientais (Guzman & Kouri 2003).

O DENV-3 havia sido isolado pela última vez na Colômbia e Porto Rico,

em 1977-1978, permanecendo 16 anos sem detecção. Em 1994, foi reintroduzido

nas Américas, sendo isolado no Nicaraguá e Panamá, porém, pertencente a

genótipo diferente do qual já havia circulado nas Américas e com associação a

casos de DHF (Centers for Disease Control and Prevention. 1995; Guzman et al.

1996).

Desde o início do século 21, tem ocorrido um grande aumento no número

de casos de Dengue nas Américas, com circulação dos 4 sorotipos. Durante este

31

período, dois surtos Pan-americanos ocorreram. Em 2002, 1.015.420 casos foram

registrados, incluindo 14.374 casos de DHF/SCD e 255 mortes. O Brasil

correspondeu a mais de 75% dos casos do continente. O sorotipo mais frequente foi

o DENV-3, seguido do DENV-2. Em 2010, ocorreram mais de 1,7 milhões de casos

e 1.185 mortes, os sorotipos DENV-1 e DENV-2 foram os mais frequentes. Os

países mais afetados foram: Brasil, Colômbia, Venezuela, Honduras, Guadalupe e

Martinica (Brathwaite Dick et al. 2012).

A América evoluiu de um estado de baixa endemicidade para um estado

hiperendêmico, com casos autóctones em quase todos os países e circulação dos

quatro sorotipos. Nos últimos 30 anos, ocorreu um aumento de 4,6 vezes no número

de casos notificados e aumento no número de casos graves, especialmente em

crianças (Brathwaite Dick et al. 2012; San Martin et al. 2010) (Figura 1.13).

1.8.2 Dengue no Brasil

No Brasil, a reintrodução do Aedes aegypti em 1975, após uma intensa

campanha de erradicação deste mosquito nas décadas de 40 e 50, adicionada a

Figura 1.13 Evolução da Dengue nas Américas, 1980-2010 (Adaptado de Brathwaite Dick et

al. 2012).

32

epidemia de DENV-1 ocorrida na América em 1978 e a introdução do DENV-4 em

1981 pelo Caribe oriental, moldou um quadro epidemiológico favorável à introdução

da Dengue no país (Schatzmayr 2008; Teixeira et al. 2009).

Em 1981-1982 ocorreu no Brasil o primeiro surto de Dengue registrado

clinica e laboratorialmente, causado pelos sorotipos 1 e 4, com um total de 7.000

casos, no Estado de Roraima (Osanai et al. 1983). Em 1986, houve o isolamento do

DENV-1 em soro de pacientes residentes em Nova Iguaçu, no Rio de Janeiro

(Schatzmayr et al. 1986). Foram estimados mais de 1 milhão de casos por DENV-1

neste surto, desde então, a Dengue se tornou um grande problema de saúde pública

no Brasil (Nogueira et al. 1991). Em Abril de 1990, após quatro anos da detecção do

DENV-1, o DENV-2 foi isolado em paciente residente em Niterói, também no Rio de

Janeiro, alastrando-se e causando os primeiros casos de FHD/SCD(Nogueira et al.

1990; Nogueira et al. 1991).

A circulação do DENV-3 foi identificada em Dezembro de 2000, no

município de Nova Iguaçu, mais uma vez no Rio de Janeiro (Nogueira et al. 2001).

Em 2002, foram notificados cerca de 700.000 casos, onde ocorreram 1831 casos de

FHD e 91 óbitos, excedendo o somatório do número de casos graves notificados e

óbitos desde a introdução da doença no país. A rápida dispersão deste sorotipo

determinou a cocirculação, em 2004, dos sorotipos 1, 2 e 3 em 23 dos 27 estados

brasileiros (Brasil 2009).

A introdução do sorotipo 3 gerou aspectos epidemiológicas marcantes no

Brasil, com a ocorrência de FHD e óbitos em crianças e adolescentes, além de

casos fatais em infecções primárias, demonstrando maior virulência do DENV-3, em

relação aos sorotipos previamente introduzidos (Nogueira et al. 2005). O Brasil

passou de um quadro endêmico e de baixa letalidade, para um quadro epidêmico

com casos graves e fatais (Schatzmayr 2008).

Desde a introdução do vírus da dengue na década de 80, tem sido

observado que ocorre a circulação predominante de um sorotipo, com revezamentos

de predominância ao passar dos anos, mudança esta normalmente acompanhada

de epidemias. O sorotipo 3 do vírus da dengue predominou na grande maioria dos

estados do Brasil entre 2002 e 2006. No período entre 2007 e 2009, ocorreu uma

alteração no sorotipo predominante, sendo o DENV-2 o mais incidente (Ministério da

Saúde 2010).

33

Em 2008, foram notificados 555.266 casos de dengue, 4.195 casos de

FHD e 229 óbitos, em epidemia causada pela reemergência do DENV-2. Em 2009,

A Secretaria de Vigilância em Saúde, do Ministério da Saúde, registrou 393.583

casos suspeitos de dengue. Foram confirmados 2.338 casos e 159 óbitos por

FHD/SCD, e 6.376 casos de DCC, com 153 óbitos, havendo circulação do DENV-2 e

reemergência do DENV-1 (Ministério da Saúde 2010, 2012).

Em 2010, durante epidemia causada predominantemente pelo DENV-1,

foram notificados 1.011.548 casos de dengue no Brasil, havendo 656 casos que

evoluíram a óbito por tal enfermidade. Este ano ainda foi marcado pela introdução

do DENV-4 no país, pelo Estado de Roraima, após 28 anos sem detecção

(Temporão et al. 2011). O ano de 2011 obteve 764.032 casos notificados e 191

óbitos, ocorrendo ainda a predominância do DENV-1, mas com a propagação do

DENV-4 por praticamente todo o país (Ministério da Saúde 2011, 2012). Atualmente,

o Brasil vive um contexto hiperendêmico para a Dengue, o que nos traz sérias

consequências, como o aumento da diversidade genética viral, resultando numa

ampla gama de propriedades patogênicas, no aumento da transmissibilidade e em

maior virulência. O controle vetorial ainda é a maior forma de prevenção da Dengue,

porém o país tem falhado constantemente na luta contra o Ae. aegypti. Desta forma,

uma vacina eficaz permanece como a grande esperança de controle desta

enfermidade na população brasileira (Figueiredo 2012).

1.8.3 Dengue no Rio Grande do Norte

Há 20 anos que a Dengue representa um problema de saúde pública no

Estado do Rio Grande do Norte. Em 1994, foram registrados os primeiros casos de

Dengue, no município de Assú, disseminando-se por todo o Estado ao longo dos

anos. Recentemente, de acordo com critérios epidemiológicos e demográficos, 20

municípios do Estado possuem prioridade de monitoramento estratégico, pois

registram o equivalente a 78% de todos os casos do RN, dentre eles estão: Natal,

Parnamirim, Macau, Apodi, São Miguel, Currais Novos, João Câmara, Assú,

Mossoró, São José de Mipibú, Ceará-Mirim, Acari, Caicó, Extremoz, São Gonçalo do

Amarante, São Paulo do Potengi, Macaíba, Santa Cruz, Jardim do Seridó e Pau dos

Ferros (Figura 1.14) (Secretaria de Estado da Saúde Pública do Rio Grande do

Norte 2010).

34

Já foram registrados índices de infestação por Aedes aegypti em 99,4%

dos municípios do Estado e a circulação dos quatro sorotipos: DENV-1, DENV-2,

DENV-3 e DENV-4 (Secretaria de Estado da Saúde Pública do Rio Grande do Norte

2010). O ano de 2009 no RN foi caracterizado como um período interepidêmico, com

2528 casos notificados de dengue. Foram confirmados 28 casos de FHD, 5 óbitos e

8 casos de DCC. A letalidade por formas graves no Estado do Rio Grande do Norte

foi de 13,9%. No ano de 2010, o Rio Grande do Norte obteve a notificação de 7846

casos de Dengue, com óbito em 7 casos, demonstrando aumento aproximado de

110% no número de casos notificados quando comparados a 2009. No ano de 2011

foram notificados 23.171 casos e 17 óbitos, mais que o dobro em relação ao ano

anterior (Ministério da Saúde 2012) Em 2012, 26.534 casos e 11 óbitos foram

registrados para Dengue (Ministério da Saúde 2013).

Figura 1.14 Mapa do Rio Grande do Norte, demonstrando os 20 municípios do Estado que possuem prioridade de monitoramento estratégico.

35

2. Justificativa

Apesar da grande importância da dengue no Estado do RN, poucos

estudos têm sido realizados para caracterizar estas epidemias, principalmente

aqueles que envolvem métodos de diagnóstico específicos para dengue, como o

isolamento viral e métodos moleculares de detecção e tipagem. Estas informações

são essenciais para traçar o perfil epidemiológico, compreender a atividade desses

vírus e dar suporte a pesquisas relacionadas à patogênese, caracterização genética,

filogenia e evolução molecular dos vírus dengue no RN. Além disso, muitas

vantagens têm sido atribuídas ao diagnóstico molecular dos vírus dengue, como

sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e rapidez (Araújo et al. 2009b).

A vigilância virológica contínua, através do isolamento viral e de métodos

moleculares específicos, é de suma importância para a Dengue. Este monitoramento

é primordial não apenas para a detecção precoce da introdução de um novo

sorotipo, mas também para a previsão de graves epidemias e para podermos

entender as mudanças no padrão epidemiológico da doença, como mudanças na

faixa etária acometida e na melhor compreensão das circunstâncias que ocasionam

os casos graves da doença (Féres et al. 2006).

No contexto do desenvolvimento tecnológico, foram implantados métodos

rápidos de diagnóstico dos vírus dengue, no Rio Grande do Norte. As metodologias

de caracterização genética dos vírus dengue permitirão o entendimento dos padrões

de dispersão da doença, substituição de genótipos, os quais poderão levar a novas

epidemias, e servirão para estudos da dinâmica de transmissão.

36

3. Objetivos

3.1 Objetivo Geral

Descrever o perfil epidemiológico dos vírus dengue no Estado do Rio

Grande do Norte, no período de 2010 a 2012.

3.2 Objetivos Específicos

Monitorar os sorotipos dos DENV circulantes no período e local estudado;

Descrever a distribuição geográfica dos casos de Dengue no RN;

Descrever a distribuição temporal dos casos de Dengue no RN;

Descrever e analisar os dados demográficos dos casos estudados;

Caracterizar geneticamente os vírus dengue circulantes, a partir do

sequenciamento do gene E.

37

4. Materiais e Métodos

4.1 Desenho de estudo

Estudo epidemiológico observacional transversal, predominantemente

descritivo, de dados primários.

4.2 Área de estudo

O Estado do Rio Grande do Norte possui área de 52.811,047 km2,com

uma população estimada em 3.373.959 habitantes e densidade demográfica de 63,9

hab./km2 (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 2011). O RN possui 167

municípios, 4 mesorregiões e 19 microrregiões divididas de acordo com aspectos

físicos e humanos. A região metropolitana é composta por 10 municípios: Natal,

Parnamirim, Ceará-Mirim, Extremoz, Macaíba, Monte Alegre, Nísia Floresta, São

Gonçalo do Amarante, São José de Mipibú e Vera Cruz. O Estado está situado na

região Nordeste do Brasil, entre os paralelos de 4°49’53’’ e 6°58’57” latitude sul, e os

meridianos de 35°58’03” e 38°36’12” a oeste de Greenwich. Limita-se com o Estado

do Ceará a Oeste, ao Sul com o Estado da Paraíba, e a Leste e ao Norte com o

Oceano Atlântico (Figura 4.1).

O clima do RN pode ser dividido em tropical chuvoso, no litoral oriental e

extremo oeste (precipitação anual de 800 até mais de 1.200 mm), tropical típico nas

Figura 4.1 Localização do Estado do Rio Grande do Norte.

38

áreas da Chapada do Apodi e das Serras de Santana, São Bernardo e Serra Negra

do Norte (600-800 mm), semiárido no Vale do Açu, parte do Seridó e do Sertão

Central e o litoral que vai de São Miguel do Gostoso ao município de Areia Branca

(400-600 mm) e árido, nos municípios de Equador, Parelhas, Carnaúba dos Dantas,

São Tomé, Lajes, Pedro Avelino, Fernando Pedrosa, Angicos e Afonso Bezerra (em

torno de 400 mm) (Rio Grande do Norte 2013).

4.3 Amostras Clínicas e banco de dados

Foram estudados 1581 amostras de casos suspeitos de Dengue (323 de

2010, 658 de 2011 e 600 de 2012) com até uma semana após o inicio dos sinais e

sintomas da doença, entre o período de Janeiro de 2010 a Dezembro de 2012.

Foram analisadas amostras de soros provenientes de pacientes com suspeita de

dengue, atendidos em diferentes Centros de Saúde e Hospitais da Rede Pública do

Estado do Rio Grande do Norte, aonde cada amostra vinha acompanhada de ficha

de notificação compulsória de Dengue, com dados de informação pessoal e de

coleta. As informações disponíveis nas fichas de identificação e os resultados de

diagnóstico foram armazenados em banco de dados nos programas Microsoft

Access e Microsoft Excel.

Os espécimes clínicos foram enviados para o Laboratório Central Doutor

Almino Fernandes (LACEN-RN), para a realização do isolamento viral, e para o

Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer - LADIC

(DMP/CB/UFRN), para análise molecular visando à detecção do genoma viral. As

amostras foram mantidas a -70ºC até o momento da utilização.

4.4 Isolamento viral

Foram inoculadas 1433 amostras de soro em tubo de culturas de células

de Ae. albopictus clone C6/36 (Igarashi 1978). Após inoculação, as culturas foram

incubadas à temperatura de 28ºC e observadas diariamente, por um período de 10 a

14 dias.

39

Foi utilizado o meio L-15 (Leibovitz)(Tabela 4.1) modificado com 0,29 g/l

de L-Glutamina, triptose fosfato (10%) e antibiótico-antimicótico (1%)(Tabela 4.2),

adquirido sob forma desidratada (Sigma Chemical Company, St. Louis, USA).

Tabela 4.1 Meio L-15 para cultivo celular de células C6/36 de Ae.albopictus

Reagente Peso/Vol

Leibovitz 15 14,69 g

Água tridestilada q.s.p. 1000 ml

Tabela 4.2 Antibióticos utilizados no meio de cultura L-15 para cultivo celular de células C6/36 de Ae.albopictus

Reagente Peso/Vol

Penicilina Sódica Cristalina (Gibco BRL, USA) 100 U/ml

Sulfato de estreptomicina (Gibco BRL, USA) 1mg/ml

O meio foi filtrado em membrana Milipore (0,22) e após prova de

esterilidade, conservado a 4OC. A este meio foi adicionado soro fetal bovino (SFB)

(Sigma Chemical Company, St. Louis, USA) nas concentrações de 2% ou 10%,

conforme utilizado para manutenção ou crescimento celular, respectivamente.

As células foram cultivadas em tubos de 1,5 x 16 cm contendo 2,0 ml de

meio L-15 (Sigma Chemical Company, St. Louis, USA), com 10% SFB (Sigma

Chemical Company, St. Louis, USA). Após formação de monocamada, o meio foi

substituído por igual volume de meio L-15 contendo 2% de SFB.

Os soros diluídos 1/10 em meio L-15 foram inoculados em alíquotas de

0,1ml na monocamada celular. Para cada grupo de espécimes inoculados, foram

incluídos controles de vírus e controle de células. Após inoculação, os tubos foram

incubados à temperatura de 28oC e observados diariamente, por um período de até

14 dias, em microscópio óptico invertido com aumento de até 400 vezes, para a

verificação de ECP.

4.5 Técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI)

As culturas, mesmo não apresentando ECP, foram inicialmente testadas

com fluído hiperimune de camundongo para dengue. Posteriormente, confirmada a

40

positividade da amostra, foi feita a tipagem viral, empregando-se anticorpos

monoclonais específicos para os quatro sorotipos dos DENV, sendo visualizados

pela técnica de imunofluorescência Indireta (IFI) (Gubler et al. 1984; Henchal et al.

1982).

Após agitação, os tubos de células inoculados foram mantidos a 4OC por

no mínimo 2 horas para sedimentação das células. Aproximadamente 1ml do fluido

de cada cultura foi retirado e as células ressuspensas no meio restante.

Para a detecção viral, cerca de 0,02 ml de suspensão celular de cada

cultura foi depositada sobre um dos 10 círculos existentes nas lâminas de 26 x

76mm (Biolab Merieux, New Zealand). Após secagem à temperatura ambiente, as

células foram fixadas com acetona P.A. (Merck, Darmistadt, Germany) a –20ºC

durante 20 minutos. Controles de células infectadas e não infectadas foram incluídos

em cada grupo de lâminas processadas.

Após secagem à temperatura ambiente, foi adicionado em cada orifício da

lâmina 0,02 ml de fluido ascítico hiperimune de camundongo inoculado com

amostra, Research Reference Reagent, Bethesda, USA, do inglês “mouse immune

ascitic fluid” (MIAF), diluído 1:50 em PBS (Tampão Salina Fosfato, do inglês:

Phosphate Buffer Saline) pH 7,5. As lâminas foram então incubadas em câmara

úmida a 37OC durante 30 minutos e, em seguida, foram lavadas duas vezes em PBS

pH 7,2 por 10 minutos e deixadas à temperatura ambiente para secagem.

Posteriormente, foram adicionados 0,02 ml de anti-IgG de camundongo conjugado

com fluoresceína (Antibodies Incorporated, Davis, USA.), diluído 1:20 em preto de

naftaleno a 0,1% e incubados em câmara úmida a 37OC por 30 minutos. Após duas

lavagens em PBS pH 7,2 por 10 minutos, as lâminas foram rinsadas com água

destilada, colocadas à temperatura ambiente para secagem e montadas com

glicerina tamponada e lamínulas (24 x 60mm) (Sigma Chemical Company, St. Louis,

USA).

Para tipagem viral, foi preparada uma lâmina para cada amostra,

depositando cerca de 0,02 ml de suspensão celular em seis orifícios da lâmina. As

lâminas foram colocadas à temperatura ambiente para secagem e após 18 horas

fixadas com acetona a –20OC durante 20 minutos.

Em cada orifício, foram adicionados 0,02 ml de anticorpos monoclonais

específicos para os DENV-1 (15F3), DENV-2 (3H5), DENV-3 (5D4) e DENV-4

41

(1H10) (Henchal et al. 1982), diluídos 1:5 (DENV-1, DENV-3 e DENV-4) e 1:20

(DENV-2) em PBS pH 7,5. Em cada lâmina, foram incluídos um controle positivo

(Policlonal (DENV 1+2+3+4+F.A) diluído 1:50 em PBS pH 7,5) e um controle

negativo (PBS pH 7,5).

Após incubação em câmara úmida a 37OC durante 30 minutos, as lâminas

foram lavadas duas vezes em PBS pH 7,2 por 10 minutos e colocadas à

temperatura ambiente para secagem. A seguir, foram adicionados 0,025 ml de IgG

de cabra anti-camundongo conjugado com fluoresceína (Sigma Chemical Company,

St. Louis, USA) diluída 1:20 em preto de naftaleno 0,1% em PBS pH 7,5. Após

incubação em câmara úmida a 37OC durante 30 minutos, as lâminas foram lavadas

duas vezes em PBS pH 7,2 por 10 minutos, rinsadas em água destilada, secas à

temperatura ambiente e montadas com glicerina tamponada e lamínulas (24 x

50mm).

As lâminas foram observadas em microscópio óptico de epifluorescência

(Zeiss, Alemanha), com aumento de 400 vezes, equipado com lâmpada de mercúrio

de alta pressão HBO 50W e jogo de filtro convencional (FT 510 / LP 520).

4.6 RT-PCR (Lanciotti et al. 1992)

4.6.1 Extração do RNA viral

Os RNAs das amostras de soro de pacientes foram extraídos através do

QIAmp Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA), de acordo com o protocolo

descrito pelo fabricante, para a realização da técnica de RT-PCR.

4.6.2 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase para diagnóstico

Foi utilizada a metodologia descrita por Lanciotti et al. (1992) para

detecção e tipagem dos DENV a partir de amostras de soro ou sangue total. Um

total de 804 amostras foram submetidas a este método. Este procedimento

consegue detectar os quatro sorotipos simultaneamente em um procedimento semi-

nested, gerando produtos amplificados (amplicons) com tamanhos específicos (pb)

para cada sorotipo dos DENV.

42

A técnica de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia de

polimerase (RT-PCR) foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa, foram

utilizados iniciadores consensuais, D1 e D2, para os quatro sorotipos dos DENV,

complementares as sequências dos genes que codificam as proteínas C e prM. No

procedimento semi-nested, foram utilizados iniciadores específicos TS1, TS2, TS3 e

TS4 para os DENV-1 a 4, respectivamente, além do iniciador D1 (Tabela 4.3).

Na 1ª etapa (transcrição reversa seguida de PCR) foi realizado o seguinte

procedimento: em tubo tipo eppendorf de 0,3ml, 2,5l do RNA extraído foram

adicionados a 8 µl de água livre de nucleases, 0,75 µl dos iniciadores D1 e D2, em

concentração de 100µM, 0,5µl da enzima AMV-RT à 5U/µl e 12,5µl do PCR

Acessquick Master Mix (2x) (Promega, Madison, EUA), totalizando 25l da mistura

RT-PCR (Tabela 4.4).Os tubos foram colocados imediatamente no bloco aquecido

do termociclador. Após a transcrição reversa (45OC por 45 minutos), a enzima foi

ativada (95°C por 2 minutos) e as amostras foram submetidas a 30 ciclos

subsequentes de desnaturação (94OC por 35 segundos), hibridização (56OC por 1

minuto), extensão (72OC por 2 minutos) e um tempo de extensão final (72OC por 10

minutos).

Para a realização da etapa semi-nested PCR, os produtos obtidos da 1a

etapa foram diluídos 1:100 em água deionizada (IDT, Iowa, USA) (2,5l do produto

da 1a etapa + 247,5l de água). Em novos tubos tipo eppendorf de 0,3mL, foram

adicionados 6,25l de água livre de nucleases, 0,75l dos iniciadores D1, TS1, TS2,

TS3 e TS4 (100M), 12,5µl do PCR Acessquick Master Mix (2x) (Promega, Madison,

EUA)e 2,5l da amostra diluída (Tabela 4.4). As amostras foram submetidas a

ativação da enzima (95°C por 2 minutos) e em seguida, 18 ciclos de desnaturação

Tabela 4.3 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na transcrição reversa seguida pela reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para a tipagem dos DENV.

43

(94O.C por 35segundos), hibridização (56OC por 1 minuto), extensão (72OC por 2

minutos) e um tempo de extensão final (72OC por 10 minutos).

Tabela 4.4 Reagentes utilizados na Transcrição Reversa seguida pela Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR).

Reagentes Mistura para RT-PCR

(1X) Mistura para Semi-nested

(1X) Água livre de nucleases 8 µl 6,25 µl

100µM iniciador D1 0,75 µl 0,75 µl

100µM iniciador D2 0,75µl ------------

100µM iniciadores TS1-4

------------ 0,75µl

5 U/µl enzima AMV-RT 0,5µl ------------

PCR Master Mix 2X 12,5 µl 12,5 µl

RNA 2,5µl -----------

cDNA da RT-PCR ------------ 2,5µl

Para a análise dos amplicons, foi realizada eletroforese à 100V por 60

minutos onde 5l do produto amplificado acrescido de 2,5l de azul de bromofenol

(Amresco, Ohio, USA) e 2,5l de GelRed foram aplicados em um gel de agarose

(BioAmerica, Inc., Miami,USA) a 1% em Tris-Ácido Bórico-EDTA 0,5X, acrescido de

brometo de etídio 0,1% (Invitrogen), em seguida foi visualizado em luz ultravioleta.

4.7 Sequenciamento e Análise Filogenética

4.7.1 Construção do Banco de Sequências Nucleotídicas

Foram coletadas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) sequencias

completas do gene do envelope (E) dos DENV-1, DENV-2, e DENV-4 (com vistas a

estabelecer relações filogenéticas entre os DENV aqui estudados e os DENV

isolados em outras localidades ou países). Cada uma das cepas foi identificada pelo

local (utilizando a sigla de duas letras dos países, disponível em

http://www.inf.ufrgs.br/~cabral/Paises.html), ano de isolamento e número de acesso

ao GenBank. Sequências previamente identificadas como recombinantes (Worobey

et al. 1999) foram excluídas, utilizando os mesmos critérios adotados por Twiddy et

al. (2003).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

44

4.7.2 Sequenciamento do Genoma viral

Foi utilizado o sequenciador automático da Applied Biosystem ABI-3730

(Applied Biosystems, Foster City, CA) da plataforma genômica de sequenciamento

de DNA do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz. Para caracterização

genética dos DENV, foi realizada a estratégia de primer walking. Foram utilizados

oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar fragmentos de aproximadamente

900 pb por região, com aproximadamente 200 pb de sobreposição entre regiões. A

região que codifica o gene do envelope foi o alvo do estudo. Esta região é descrita

como informativa para estudos de filogenia e evolução (Araújo 2009; Lanciotti et al.

1994).

4.7.2.1 Oligonucleotídeos Iniciadores

Os oligonucleotídeos iniciadores para DENV-1 (Tabela 4.5) e DENV-2

(Tabela 4.6) utilizados neste procedimento foram desenhados e avaliados durante a

tese de doutorado de Araújo (2009). Para o DENV-4 (Tabela 4.7), iniciadores foram

desenhados especificamente para este trabalho. Também foram desenhados

primers internos específicos para regiões não sequenciadas do DENV-2 (Tabela

4.8).

Tabela 4.5 Oligonucleotídeos iniciadores para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-1.

Região Primer sense A (5’-3’)

Primer antisense B (5’-3’)

Posição do genoma

(de acordo com AF513110)

Produto (pb)

Tm (ºC) A/B

1 TTA GTC TAC GTG GAC CGA CAA GAA

GCC TAT TCC CAC GCA TCG

6 - 938 932 62/63

2 TGA CCT ATG GGA CGT GTT CTC A

GAG TCC AAT GTG AGG GCT CC

660 - 1469 809 63/63

3 GAC GCG AAC TTT GTG TGT CG

GGC GCA TCT GTT CCT TCG TA

1193 - 1900 707 63/64

4 GTG GGA TCA CAA GAA GGA GCA

CCA ATG GCT GCT GAC AGT CTT

1691 - 2539 848 63/63

5 GGG ATT AAA TTC AAG GAG CAC G

ACT TGC CTA GAT GCC ATG GC

2332 - 3217 885 62/62

45




Posição do genoma (de acordo com AF489932)

Produto (pb)

Tm (ºC) A/B

1 CGT GGA CCG ACA AAG ACA GA

GGA GCG ACG GCT GTC AGT AA

14 - 906 892 62/64

2 GAT CAG TGG CAC TCG TTC CA

CTC CGC GTA GCC ATG GTA AC

708 - 1586 878 62/62

3 ATG GCA CTG TCA CGA TGG AG

CAC TAT CAG CCT GCA CCA TAG CT

1467 – 2405 938 62/63

4 GGA TCC CTG GGA GGA GTG TT

TCC ATT GCT CCA GAG GGT GT

2202 - 3106 904 63/63

5 GAC TCA AAA CTC ATG TCA GCG G

GTC CTT TGG GAA AGG AGT GC

2958 - 3800 842 62/62




Posição do genoma (de acordo com JN559741.2)

Produto (pb)

Tm (ºC) A/B

1 TCC AAA TCG GAA GCT TGC TT

GAC CCA TGC TCC ACC TGA GA

11 - 978 967 59/60

2 GGA AGC ATG CTC AGA GAG TAG AGA

ATC CCA GCA CTG TCA CAT CCT

767 - 1678 911 58/58

3 GTC ACC ATC GGT TGA AGT CAA A

GCA CGT CAT GGC CAT TGA

1416 - 2352 936 59/59

4 TCA TTG GGA AAG GCT GTG C

CCA TGG ACC CAC GGT TTG

2206 - 3187 981 58/59

5 GTG TGT GAC CAC AGG CTG ATG

CCT CA AGC CAT GAC CAA TG

2932 - 3932 1000 59/60

Tabela 4.8 Oligonucleotídeos iniciadores internos específicos para DENV- 2

Região Primer sense (A) Primer anti-sense (B) Tm (ºC) A/B

1(I) GGG AAC CCA GTC TAA ATG AAG GAC ATC TGG ATT TCT GTA GCC 62

2(I) CGC CTG ATT ACA GTT AAC CCA TTT GAA GGG GAT TCT GGT TGG 62

4.7.2.2 RT-PCR para Sequenciamento

Em um tubo tipo eppendorf adicionamos 14µl de água livre de nucleases

(Promega, Madison, EUA), 2,5µl (10µl) do iniciador sense (Invitrogen, EUA), 2,5µl

(10µl) do iniciador antisense (Invitrogen, EUA), 1µl da enzima AMV-RT (Promega,

Madison, EUA) e 25µl do Acessquick Master Mix (2x) (Promega, Madison, EUA). Em

seguida foi adicionado 5µl do RNA extraído e o tubo foi submetido à agitação.

O RNA extraído foi reversamente transcrito a 45°C por 60 min., ativação

da enzima a 95ºC por 2 min., diretamente seguidos de 30 ciclos de desnaturação

46

94°C por 30 seg., 54°-62°C por 1 min. (dependendo do par de iniciadores utilizado)

e 72°C por 2 min., com uma extensão final a 72°C por 10 min. A amplificação foi

realizada utilizando termociclador modelo 22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER).

Após o término da RT-PCR, analisamos os produtos amplificados por

eletroforese em gel de agarose (BioAmerica Inc., Miami, USA – cat nº D1500 – LE)

a 1% em TBE 0,5X, por 60 minutos a 100V.

Quando foram observados amplicons únicos na eletroforese em gel de

agarose, a purificação foi feita diretamente do produto da PCR usando o kit

comercial PCR Purification (Qiagen, Inc., Valencia, CA) de acordo com o protocolo

descrito pelo fabricante. Havendo a presença de múltiplos amplicons, o produto foi

isolado e purificado utilizando o kit comercial Gel Extraction (Qiagen, inc., Valencia,

CA) conforme protocolo descrito pelo manual do fabricante.

4.7.2.3 Quantificação do DNA e reação de sequenciamento

A partir do produto da purificação, realizamos uma eletroforese em gel de

agarose a 2% em TBE 0,5X com objetivo de quantificar o DNA presente em cada

amostra. Aplicamos 4 l de peso molecular de Massa (Invitrogen, Carlsbad, CA) no

primeiro orifício do gel e 4 l do DNA a ser quantificado nos demais orifícios,

juntamente com 2l de GelRed e 2l de sacarose. O procedimento teve duração

de 60 minutos a 100v. A concentração foi estimada de acordo com os parâmetros

de comparação entre o DNA a ser quantificado e o “low mass DNA”, conforme bula

apresentada pelo fabricante. (Tabela 4.9).

Tabela 4.9 Valores de referência para comparação do amplicon obtido com peso molecular de massa para determinação da quantidade ideal de DNA a ser aplicada na reação de sequenciamento

Tamanho do fragmento Low DNA Mass (4 L) DNA (L/reação)

1200 pb 120ng 2L

800 pb 80ng 4L

400 pb 40ng 5L

200 pb 20ng 6L

100 pb 10ng 8L

47

Os fragmentos de cDNA, amplificados por RT-PCR, foram submetidos a

reação de sequenciamento (cycle sequencing), de ambos os sentidos das amostras

.Em um microtubo, adicionamos 2l do primer específico (sense ou anti-sense), 2l

de Big Dye Terminator Cicle Sequencing Ready Reaction(Applied Biosystems,

Foster City, CA), a quantidade de cDNA determinada pelo processo de

quantificação e completamos o volume com água livre de nucleases até atingir o

volume final de 10l.

A solução foi submetida aos seguintes parâmetros de termociclagem: 30

ciclos de 94ºC por 1 minuto, 30 ciclos de 2 minutos com a temperatura de

hibridização específica do primer utilizado e 30 ciclos de 3 minutos a 72ºC. A

amplificação foi realizada utilizando termociclador modelo 22331 (Eppendorf AG,

Hamburg, GER).

4.7.2.4 Purificação do DNA para remoção de Dye Terminators e

processamento da amostra

O DNA foi purificado e precipitado utilizando colunas “Centri-Sep”

(Princeton Separations, Inc, Adelphia, NJ), de acordo com o protocolo descrito pelo

fabricante. Em seguida o DNA foi seco a 37oC, por 18 horas. O sedimento foi

ressuspenso em 10 l de Formamida Hi-Di (Applied Biosystems, Foster City, CA) e

aplicado em placa de 96 orifícios para ser colocado no sequenciador Applied

Biosystems ABI-3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

48

4.7.3 Análise de Sequências

A análise dos produtos da reação de sequenciamento foi realizada

utilizando o Programa Chromas Lite versão 2.1 (Technelysium Pty Ltd). A identidade

da sequência foi determinada pelo uso do BLAST (Altschul et al. 1990)

(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/Entrez).

Para alinhamento e edição de sequências, foram utilizados os programas

CLUSTAL W (Larkin et al. 2007) (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

As árvores filogenéticas foram construídas utilizando o programa MEGA

versão 5 (Tamura et al. 2011). Foi estipulado um bootstrap de 1000 pseudoréplicas,

utilizou-se o método Neighbor-Joining, modelo Tamura-Nei

(http://www.megasoftware.net/).

4.8 Análises Estatísticas

Os programas Microsoft Excel e GraphPad Prism 6 foram utilizados para

a configuração de gráficos, tabelas e análises estatísticas. Foram realizados testes

de Qui-quadrado para avaliar a dispersão de variáveis de escala nominal. O teste t

de student foi utilizado para a comparação de duas médias. A análise de variância

(One-way Anova, teste F) foi utilizada para a avaliação de três médias e o teste de

Tukey foi utilizado para a comparação, entre si, destas três médias.

4.9 Considerações éticas

Para a realização deste estudo, este projeto foi aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolo N°

136/2009 CEP-UFRN).

http://www.megasoftware.net/

49

5. RESULTADOS

5.1 Monitoramento dos sorotipos dos vírus Dengue no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

Foram estudados 1581 casos pela metodologia de isolamento viral e/ou

RT-PCR para detecção e tipagem viral, provenientes do período compreendido entre

Janeiro de 2010 e Dezembro de 2012. A infecção foi confirmada através do

isolamento viral em 27,01% (387/1433) dos casos, enquanto a RT-PCR confirmou

24,13% (194/804) dos casos estudados, a junção das duas metodologias confirmou

30,23% dos casos em análise (478/1581) (Tabela 5.1). Ao estratificarmos os anos,

em 2010, evidenciamos um percentual de detecção de 17,84% (48/269) para a RT-

PCR e 15,34% (27/176) para o isolamento viral. Em 2011, o percentual é de 39,57%

para a RT-PCR e 34,80% para o isolamento viral. No ano de 2012, obtivemos

18,03% (55/305) para a RT-PCR e 21,87% (131/599) para o isolamento viral (Tabela

5.2). Este estudo detectou a circulação de todos os quatro sorotipos do vírus

Dengue no Rio Grande do Norte (Figura 5.1), havendo a circulação do DENV-1,

DENV-2 e DENV-3 em 2010, já em 2011 ocorreu a circulação do DENV-1, DENV-2 e

a introdução do DENV-4, no mês de Maio. Em 2012 foi detectada apenas a

circulação do DENV-4 (Figura 5.2).

Tabela 5.1 Metodologias utilizadas para diagnóstico da Dengue, no período de 2010 a 2012.

ISOLAMENTO VIRAL

Positivo Negativo Não realizado Total

RT-PCR

Positivo 103 72 19 194

Negativo 48 433 129 610

Não Realizado 236 541 0 777

Total 387 1046 148 1581

50

Tabela 5.2 Percentual de detecção dos DENV, por metodologia e ano estudado.

O sorotipo predominante em 2010 foi o DENV-2, representando 53,33%

(40/75) dos casos positivos, seguido do DENV-1 com 45,33% (34/75) e do DENV-3

com 1,33% (1/75). Em 2011, a predominância foi do DENV-1 com 75,49% (191/253)

dos casos positivos, enquanto o DENV-2 representou 20,55% (52/253) e o DENV-4

foi identificado em 3,95% (10/253) dos casos confirmados. Já no ano de 2012,

apenas o DENV-4 foi detectado, representando 100% (150/150) dos casos positivos

(Figura 5.2).

Diagnóstico/Ano 2010 2011 2012 2010-2012

RT-PCR (Positivos/Analisados)

17,84% (48/269)

39,57% (91/230)

18,03% (55/305)

24,13%

(194/804)

Isolamento viral (Positivos/Analisados)

15,34% (27/176)

34,80% (229/658)

21,87% (131/599)

27,01% (387/1433)

Figura 5.1 Eletroforese em gel de agarose a 1%. Visualização dos produtos amplificados pela transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para tipagem dos DENV. Linha 1: Marcador de PM de 100pb (Promega); Linha 2: Controle Negativo; Linhas 3: Controle positivo para DENV-1; Linha 4: Controle positivo para DENV-2; Linha 5: Controle positivo para DENV-3; Linhas 6: Controle positivo para DENV-4; Linha 7: Amostra positiva para DENV-1; Linha 8: Amostra positiva para DENV-2; Linha 9: Amostra positiva para DENV-3; Linha 10: Amostra positiva para DENV-4; Linha 11: Amostra positiva para DENV-1; Linha 12: Amostra positiva para DENV-4.

51

5.2 Distribuição geográfica dos casos de Dengue no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

Em 2010, a presença do vírus da Dengue foi evidenciada em 17 dos 167

municípios do Rio Grande do Norte. Todas as quatro mesorregiões do Estado

obtiveram pelo menos um município com caso confirmado da doença. O maior

número de casos ocorreu nos municípios de Natal, Parnamirim, Pau dos Ferros,

Guamaré, Jardim do Seridó e Santana dos Matos. A cocirculação do DENV-1 e

DENV-2 ocorreu apenas nos municípios de Natal, Guamaré e Caicó, já em

Parnamirim ocorreu a cocirculação do DENV-1, DENV-2 e DENV-3 (Figura 5.3).

No ano seguinte, ocorreu uma maior distribuição dos vírus Dengue no

Estado, passando a atingir 25 municípios. Natal continuou sendo o município mais

afetado, seguido de Parnamirim, Santa Cruz e Santo Antônio. No município de

Santa Cruz, foi confirmado o primeiro caso de Dengue pelo Sorotipo 4 no Estado,

sendo posteriormente detectado em Natal, ainda no mesmo ano (Figura 5.4).

No ano de 2012 foi verificada enorme dispersão do DENV-4 no Estado,

sendo confirmado em 32 municípios, além de ser o único sorotipo com circulação

detectada no referido ano. Mais uma vez, Natal obteve o maior número de casos,

seguido de Parnamirim, Taipu, João Câmara, Guamaré, Santo Antônio e Jardim do

Seridó (Figura 5.5).

Figura 5.2 Distribuição de Sorotipos detectados por mês, no período de janeiro de 2010 a dezembro de 2012.

52

No período acumulado entre os anos de 2010 a 2012, podemos verificar

que 50 municípios tiveram confirmação para o vírus da Dengue e que 73,85% dos

casos confirmados ocorreram em apenas 7 municípios do Estado, são eles: Natal,

Parnamirim, Santo Antônio, João Câmara, Guamaré, Jardim do Seridó e Caicó.

Cabe ainda destacar que Natal, a capital do Estado, representou 53,97% dos casos

confirmados de 2010 a 2012, além de ter registrado a cocirculação do DENV-1,

DENV-2 e DENV-4, demonstrando papel fundamental na manutenção e dispersão

da Dengue no Rio Grande do Norte (Tabela 5.3).

Figura 5.3 Mapa do Rio Grande do Norte, demonstrando a circulação de sorotipos por município, em 2010.

53



54

Tabela 5.3 Descrição por município de número de casos positivos, percentual de positividade e sorotipos circulantes, no período de Janeiro de 2010 a Dezembro de 2012.

55

5.3 Distribuição temporal dos casos de Dengue no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

Considerando os três anos estudados, os meses com maior incidência

foram Abril e Maio, representando 21,12% (101/478) e 23,01% (110/478) dos casos

confirmados, respectivamente, diferindo significativamente dos outros meses (X2:

61,13; gl= 11; p<0,001) (Figura 5.6). No ano de 2010 pode-se verificar um aumento

no número de casos desde o início do ano estendendo-se a Agosto, onde ocorre um

pico, havendo uma queda drástica em Setembro. Em 2011 verificamos um aumento

no número de casos até o mês de Maio, caindo gradativamente nos meses

seguintes. Já em 2012, o pico ocorre no mês de Abril e também decai

gradativamente nos meses seguintes (Tabela 5.4) (Figura 5.7).

Tabela 5.4 Distribuição mensal dos casos estudados por isolamento viral e RT-PCR durante o período 2010 -2012, no Estado do Rio Grande do Norte.

Mês

Isolamento viral RT-PCR

Ano

Positivo/Total testados (Sorotipo)

2010 2011 2012 2010 2011 2012

Janeiro 0/2 1/8(1) 5/30(4) 0/1 0/0 5/27(4)

Fevereiro 0/0 13/53(1;2) 8/56(4) 0/0 0/0 5/56(4)

Março 3/13(1;2) 20/91(1;2) 27/90(4) 0/10 0/2 4/63(4)

Abril 3/13(1;2) 53/152(1;2) 35/170(4) 0/8 1/3(2) 21/82(4)

Maio 4/23(1;2) 64/148(1;2;4) 27/117(4) 4/20(1;2) 35/57(1;2;4) 11/38(4)

Junho 4/30(1;2) 53/106(1;2;4) 7/43(4) 6/21(1;2) 28/70(1;2;4) 2/15(4)

Julho 3/33(2) 14/44(1;2;4) 5/28(4) 11/65(1;2) 19/43(1;2;4) 2/11(4)

Agosto 4/23(1) 8/30(1) 14/38(4) 17/42(1;2;3) 4/30(1) 4/7(4)

Setembro 2/11(2) 1/11(1) 0/5 6/35(1;2) 2/11(1;4) 0/0

Outubro 0/7 1/2(1) 0/3 3/37(1;2) 1/2(1) 0/0

Novembro 1/8(2) 0/4 1/4(4) 0/23 0/4 0/0

Dezembro

Não inf.

3/9(1) 1/7(1) 0/1 1/5(1)

0/2

1/7(1) 0/2

0/4 0/5 2/14(4) 0/1 1/4(4)

Total 27/176 229/658 131/599 48/269 91/230 55/305

56

Figura 5.7 Distribuição mensal de casos estudados e confirmados para Dengue, nos anos 2010-2012

Figura 5.6 Distribuição mensal acumulada dos casos estudados por isolamento viral e/ou RT-PCR, durante o período 2010 - 2012, no Estado do Rio Grande do Norte.

57

5.4 Dados demográficos dos casos estudados

5.4.1 Faixa Etária

No período acumulado de 2010 a 2012, a faixa etária com maior número

de casos confirmados foi a de 0-10 anos com 38,08% (182/478), sendo a faixa de

11-20 anos a segunda mais afetada com 23,85% (114/478) dos casos (Tabela 5.5),

porém, não houve diferença significativa entre as faixas etárias ao analisarmos o

período acumulado de três anos (X2=8,539; gl=6; p= 0,2012) (Figura 5.8). Em 2010,

a faixa etária de 0-10 anos representou 42,67% (32/75) dos casos positivos, mas

apesar do número elevado de casos confirmados nesta faixa etária, a diferença não

foi significativa quando comparada aos outros estratos (X2=3,387; gl=6; p= 0,7589)

(Figura 5.9). No ano de 2011, a maioria dos casos também se concentrou na faixa

etária de 0-10 anos, com 54,15% (137/253) dos casos positivos para o referido ano,

mas como em 2010, a diferença entre as proporções não foi significativa (X2=7,317,;

gl=6; p= 0,2926) (Figura 5.10). Entretanto, quando analisamos apenas o ano de

2012 podemos ver diferenças quanto à faixa etária predominante. A faixa etária de

11 a 30 anos obteve 51,33% (77/150) dos casos positivos, demonstrando uma

diferença significativa na distribuição de casos confirmados por faixa etária

(X2=27,83; gl=6; p=0,0001) (Figura 5.11), cabe a ressalva de que nesse ano só

houve a circulação do DENV-4 no Estado.

Tabela 5.5 Distribuição de casos positivos para Dengue, por faixa-etária, nos anos 2010-2012.

Ano 2010 2011 2012 2010 – 2012

Idade (Anos) Positivos % Positivos % Positivos % Positivos %

0 – 10 32 42,67% 137 54,15% 13 8,67% 182 38,08%

11 – 20 13 17,33% 57 22,53% 44 29,33% 114 23,85%

21 – 30 10 13,33% 18 7,11% 33 22,00% 61 12,76%

31 – 40 8 10,67% 18 7,11% 18 12,00% 44 9,21%

41 – 50 5 6,67% 8 3,16% 18 12,00% 31 6,49%

51 – 60 4 5,33% 6 2,37% 17 11,33% 27 5,65%

> 60 3 4,00% 8 3,16% 6 4,00% 17 3,56%

Não informado 0 0,00% 1 0,40% 1 0,67% 2 0,42%

Total 75 100,00% 253 100,00% 150 100,00% 478 100,00%

58

Figura 5.9 Casos estudados para dengue, relacionados à faixa etária, em 2010.

Figura 5.8 Casos estudados para dengue, relacionados à faixa etária, no período acumulado de 2010-2012.

59



60

Ao analisarmos a média de idade por sorotipo, também verificamos um

aumento significativo da média de idade em relação ao sorotipo (F= 34,79;

p<0,0001). A média de idade das pessoas infectadas pelo DENV-4 foi

significativamente maior quando comparadas as médias de idade das pessoas

infectadas por DENV-1 e DENV-2, enquanto os mesmos não obtiveram diferença

significativa entre si. O sorotipo 1 obteve média de idade 15,8(DP: 16,95), DENV-2

média de 16,92 anos (DP: 16,98) e DENV-4 obteve média de 29,87 anos (DP:

17,01) (Figura 5.12).

5.4.2 Gênero

Em relação ao gênero, no período de 2010 a 2012, a maior incidência foi

observada no sexo feminino, representando 52% (249/478) dos casos positivos,

enquanto o sexo masculino obteve 48% (229/478) dos casos, mas a diferença não

foi significativa (OR: 0,9871; IC: 0,7962-1,224; X2= 0,01404; gl=1; p=0,9057) (Figura

5.13). Apenas em 2011 o sexo masculino obteve um maior número de casos,

representando 51% (128/253) dos casos positivos (Tabela 5.6). A média de idade de

mulheres afetadas pela Dengue foi significativamente maior (t=2,414; gl=474;

Figura 5.12 Média de idade dos casos positivos por sorotipo, 2010-2012.

61

p=0,0345) que a média de idade de homens afetados, sendo respectivamente 22,69

(DP: 18,85) e 18,69 (DP: 17,17) (Figura 5.14).

Tabela 5.6: Demonstrativo do número de casos positivos por gênero, no período 2010-2012.

Ano 2010 2011 2012 2010 - 2012

Gênero Positivos % Positivos % Positivos % Positivos %

Feminino 39 52% 125 49% 85 57% 249 52%

Masculino 36 48% 128 51% 65 43% 229 48%

Total 75 100% 253 100% 150 100% 478 100%

a

)

b

)

Figura 5.13 Número de casos estudados para dengue, relacionados ao gênero, no período acumulado de 2010-2012.

62

5.5 Caracterização genética dos sorotipos isolados no Rio Grande do Norte,

2010-2012

Foram selecionadas 2 amostras representantes de cada sorotipo isolado

no RN, (Tabela 5.7), no período estudado, para o sequenciamento da região do

gene que codifica a proteína E (1485 pb). O RNA do único DENV-3 identificado

nesse estudo não pôde ser recuperado para o sequenciamento do gene do

envelope.

Tabela 5.7 Relação de amostras selecionadas para o presente estudo, com seus respectivos números de identificação do LADIC, sorotipos, origem e ano de coleta.

Nº IDENT. SOROTIPO ORIGEM ANO

81 DENV-1 Caicó 2010

129 DENV-1 Guamaré 2011

45 DENV-2 Natal 2011

169 DENV-2 Caicó 2010

05 DENV-4 Guamaré 2012

380 DENV-4 Santa Cruz 2011

A análise filogenética das sequências de DENV-1 revelou a circulação do

genótipo V (Figura 5.15). Para DENV-2, o genótipo Sudeste Asiático/Americano foi

Figura 5.14 Média de idade dos casos confirmados para dengue, relacionados ao gênero, no período acumulado de 2010-2012.

63

2010 CN JN029816.1

1991 CN FJ196845.1

2002 PH AY422782.1

1974 PH AF425627.1

1983 AU AF425612.1

2004 RE DQ285558.1

1995 CN FJ196846.1

2004 MY EU448410.1

GIV

1972 MY EF457905.1

1972 MY AF425622.1GIII

1960 TH JF297570.1

2012 ID KC589010.1GII

2010 CN JN029812.1

2002 MM AY726552.1

1996 LA AB003090.1

1990 TH JN638337.1

2002 TW AB608788.1

2005 VN JN376781.1

2008 KH GQ868636.1

2007 MY EU448395.1

2009 SG JF960217.1

2009 LK JN054256.1

GI

2009 BR RJ HM043710.1

2010 81 BR RN CAICO

2011 129 BR RN GUAMARE

1968 NG AF425625.1

1998 MM AY722803.1

2008 IN JN415507.1

2011 SG JN544404.1

1980 TH AY732476.1

2006 KR FJ687475.1

2010 MY JF967935.1

GV

100

100

100

59

100

52

99

100

100

97

99

99

97

41

82

100

51

100

72

57

100

99

97

100

74

80

99

75

100

0.01

evidenciado (Figura 5.16). Em relação ao DENV-4, foi confirmado o genótipo II

(Figura 5.17)

Figura 5.15 Análise filogenética das amostras de DENV-1. As sequencias dos diferentes genótipos estão selecionadas por colchetes. As amostras do RN estão em destaque. Os valores de bootstrap estão indicados nos branchpoints.

64

2011 45 BR RN NATAL

2007 BR HQ012525.1

2010 169 BR RN CAICO

1998 US PR EU687212.1

2001 KN FJ898460.1

2005 BR FJ024475.1

2005 CO EU854294.1

2005 BR FJ850085.1

1997 BR RN HQ012514.1

2002 BR ES HQ012523.1

1988 VN JN819418.1

Sudeste Asiático/ Americano

1994 PH DQ518643.1

1975 ID GQ398268.1

2009 US HQ541798.1

2008 TW HQ891023.1

Asiático I

1964 TH GQ868591.1

2011 VN JX093597.1

2003 KH GQ868620.1

2010 AU JN568246.1

2009 CN JQ815199.1

2010 MM JF968026.1

Asiático I

1998 NC JQ650036.1

1996 PF JQ650020.1

1998 WF JQ650041.1

1991 SG AF410368.1

2010 AU JN568279.1

2001 TW DQ518630.1

2000 PH AY786405.1

2001 CN FJ196852.1

1983 BF EU056810.1

2003 PG JN568266.1

Asiático II

2005 IN FJ807635.1

2007 BD JN036378.1

2009 BD JN036374.1

2004 IN EU448422.1

1992 AU AF410370.1

1996 LK FJ882602.1

1991 SG AF410379.1

1993 UG AF410375.1

2010 SG JN030345.1

1993 IN FJ538911.1

Cosmopolita

1980 IN FJ538921.1

1983 MX GQ868589.1

1987 VE GQ868599.1

1986 CO GQ868592.1

2000 PE JX051766.1

1977 PR EU056812.1

1974 TO HM582113.1

1972 AS HM582106.1

1971 PF HM582109.1

1971 NC HM582102.1

Americano

100

89

55

76

50

81

47

98

100

89

91

68

100

93

100

99

91

98

99

44

91

57

100

93

99

100

92

100

85

87

99

78

100

69

47

90

98

94

100

65

99

58

100

78

57

52

44

99

0.01


65

2012 BR RN 05 GUAMARE

2011 BR RN 380 SANTACRUZ

2011 BR AM JQ513343.1

2006 PE GQ139563.1

2001 CO GQ868581.1

2011 BR PA JQ513335.1

1992 US PR AY152160.1

1982 BR RR JN559740.2

2000 EC GQ139576.1

1997 MY FM986672.1

GII

1961 IN JF262783.1

2005 PH EU448448.1

2005 AU JN575596.1

1985 TH AY618960.1

1986 TH AY618963.1

2011 BR BA JQ513345.1

2010 MM JF967792.1

2006 TH JQ993264.1

2008 KH JN638570.1

2011 VN JX556941.1

GI

1978 CN EF436282.1

1978 ID JN022608.1

2005 SG GQ398256.1

2004 PH EU448458.1

2008 SB JN575593.1

2009 CK JN575582.1

2009 AU JN575581.1

2009 NC JQ650093.1

2009 PF JN832530.1

2009 WF JN832499.1

GIII

1975 MY EF457906.1

1973 MY JF262780.1

1975 MY JF262779.1

Selvagem

54

100

72

100

100

76

71

78

100

99

98

99

62

100

88

37

88

79

45

99

97

28

97

77

71

71

53

100

24

39

0.02


66

6. DISCUSSÃO

O Rio Grande do Norte tem registrado casos de dengue desde outubro de

1994, quando os primeiros casos autóctones foram notificados no município de

Assú, após um carnaval fora de época da região. Desde então, o Estado têm

demonstrado um perfil endêmico para a doença, com anos epidêmicos cada vez

mais frequentes e intensos, decorrentes de vários aspectos, tais como: emergência

ou reemergência de sorotipos, cocirculação de sorotipos, aumento ou diminuição de

susceptíveis, fatores sanitários e ambientais (Secretaria de Estado da Saúde Pública

do Rio Grande do Norte 2010).

Até o período estudado por este trabalho, as mais graves epidemias do

Estado haviam ocorrido em 2001, onde 37.485 casos foram notificados e ocorreram

10 óbitos, sendo a cocirculação do DENV-1 e DENV-2, responsável por tal epidemia.

No ano de 2002, onde ocorreu a introdução do DENV-3 e foram notificados 21.824

casos, sendo 107 de FHD. E em 2008, quando houve 28.531 casos de Dengue

notificados, com 344 casos de FHD e 11 óbitos, na ocasião, o DENV-2 foi o mais

incidente, após reemergência no país (Barbosa et al. 2012; Ministério da Saúde

2012). Estas epidemias refletem o impacto da introdução, emergência e

reemergência de sorotipos e a importância de um sistema de vigilância virológica

eficiente.

Apesar da importância desta enfermidade no Rio Grande do Norte, até o

final do ano de 2009, não havia um sistema de vigilância virológica para Dengue

estabelecido no próprio estado. Haja vista o informe epidemiológico, referente a

2009, do Ministério da Saúde (2010), onde é informado que apenas duas amostras

suspeitas de dengue foram encaminhadas para isolamento viral, sendo ambas

negativas. Em 2010, o isolamento viral foi finalmente implantado no Laboratório

Central Doutor Almino Fernandes, concomitantemente à consolidação da

implantação do diagnóstico molecular por RT-PCR, estabelecida em nosso

Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer na

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Desta forma, podemos destacar este projeto como a implantação e

consolidação de um sistema de vigilância virológica através de métodos moleculares

67

específicos, realizado no próprio Estado, o qual visa à melhoria no diagnóstico

laboratorial para Dengue e suporte na prevenção de surtos e epidemias.

Quanto ao histórico de estudos sobre Dengue no Rio Grande do Norte,

existem poucas referências, sendo de Cunha et al. (1999), o único e último trabalho

científico, de dados primários. Barbosa et al. (2012) publicaram mais recentemente

um artigo científico, tratando de um estudo de dados secundários do SINAN e de

planilhas paralelas do dengue, relativo ao período de 2000 a 2009. Além da carência

de trabalhos no Estado, dados insuficientes divulgados pelo MS e pela Secretaria da

Saúde Pública do RN (Ministério da Saúde 2012, 2013; Secretaria de Estado da

Saúde Pública do Rio Grande do Norte 2010), aliada à limitada informação dos

Boletins Epidemiológicos da Subcoordenadoria de Vigilância Epidemiológica, os

quais não possuem atualização desde setembro de 2010 (Secretaria de Estado da

Saúde Pública do Rio Grande do Norte 2013), demonstram a dificuldade na

obtenção de dados precisos acerca desta enfermidade no RN e manifestam a

necessidade da realização de estudos adicionais, no intuito de descrever e analisar

a atual situação da Dengue nesta Unidade Federativa.

6.1 Monitoramento dos sorotipos dos vírus Dengue no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

Em nosso estudo, a utilização da metodologia de isolamento viral

demonstrou um percentual de confirmação de casos de 27% (387/1433) no triênio

estudado. Porém pôde-se perceber que ocorreu variação entre os anos estudados,

obtendo 15,3% (27/176), 34,8% (229/658) e 21,9% (131/599), em 2010, 2011 e

2012, respectivamente.

A justificativa para esta variação, provavelmente está relacionada ao fato

de 2010 ter sido um ano interepidêmico, enquanto os outros dois anos foram

epidêmicos, considerados de alta incidência de dengue e relacionando apenas 2011

e 2012, corresponderam a 28,6% (360/1257) de confirmação. Outros percentuais de

isolamento de vírus como 4,2% (Cunha et al. 1999), 6,4% (Macedo et al. 2013),

15,9% (De Simone et al. 2004), 18,5% (Rigau-Perez 2000), 20,8% (Vasconcelos et

al. 1993), 22,8% (Féres 2004), 30,7% (Da Silva 2013), foram descritos em anos

epidêmicos e a grande maioria corrobora os nossos achados.

68

Miagostovich et al. (1993) descreveram um alto percentual de isolamento

(41,2%) na epidemia causada pela introdução do DENV-1 no Rio de Janeiro. Uma

alta taxa de isolamento não foi repetida pela epidemia causada pela introdução do

DENV-4 no Rio Grande do Norte (21,87%), em 2012, apesar de também ter ocorrido

em contexto epidemiológico de suscetibilidade imunológica de praticamente toda a

população do Estado. Portanto, outros fatores devem ser averiguados, dentre eles:

viremia, tempo de coleta, condições de envio ao laboratório e imunidade da

população.

Um importante benefício do isolamento viral, é que os vírus, de poucas

passagens em cultura de células, podem ser utilizados em caracterizações

genéticas (De Simone et al. 2004), como a que foi realizada neste projeto.

O diagnóstico molecular por RT-PCR convencional demonstrou

positividade em 24,13% (194/804) dos casos testados no triênio. No ano

interepidêmico de 2010, a detecção foi de 17,84% (48/269), em 2011 foi de 39,6%

(91/230) e em 2012 foi de 18% (55/305). Apenas no ano de 2012, o percentual de

confirmação do RT-PCR foi menor que o de isolamento viral, o que demonstra sua

importância na vigilância virológica e na casuística deste estudo, haja vista a

detecção de 72 casos por esta metodologia, onde o isolamento viral havia sido

negativo (Tabela 5.1). Quando consideramos apenas o período epidêmico de 2011 a

2012, o percentual é de 27,3% (146/535), estando um pouco abaixo de alguns

trabalhos, mas em consonância com outros, realizados em períodos de epidemia,

onde são observados índices de 20,7% (De Simone et al. 2004), 27% (Cunha et al.

1999), 29,3% (Féres 2004),29,6% (De Paula et al. 2002), 30,6% (Macedo et al.

2013), 31,3% (Bastos et al. 2012), 32,4% (Miagostovich et al. 1993), 34,2% (Sudiro

et al. 1997), 50,1% (Da Silva 2013).

Podemos perceber que a detecção por RT-PCR, em 2012 no RN, foi

quem causou a maior discrepância nos dados, ficando até mesmo abaixo do

percentual do isolamento viral para o mesmo ano. Fato bastante peculiar, devido à

conhecida sensibilidade e especificidade dos métodos moleculares frente às

técnicas de isolamento viral. Cabe salientar, que em 2012, só obtivemos a detecção

da circulação viral do DENV-4, portanto o protocolo de RT-PCR pode estar

necessitando de revisão e adequação de primers para o referido sorotipo, visando à

otimização da técnica e uma maior sensibilidade às cepas circulantes no Estado.

69

Entretanto, a utilização do diagnóstico molecular por RT-PCR já foi

demonstrado, por trabalhos de Miagostovich et al. (1997; 1993) e De Paula &

Fonseca (2002), como uma importante ferramenta na vigilância virológica,

confirmando casos onde o isolamento viral não foi viável e devido a sua

sensibilidade e rapidez, permitindo o diagnóstico específico em menos de 2 dias.

Nossos resultados demonstraram a cocirculação do DENV-1, DENV-2 e

DENV-3 (caso isolado) em 2010. Em 2011, ocorreu a cocirculação dos sorotipos 1, 2

e 4, destacando a importante introdução do DENV-4 no Estado, em Maio de 2011,

após a ocorrência de festividades religiosas no município de Santa Cruz, já sendo

detectado em Natal, no mesmo mês. Já em 2012, confirmamos apenas o DENV-4.

Cunha et al. (1999) e Barbosa et al.(2012), demonstram que este padrão

de cocirculação dos sorotipos 1 e 2 já ocorreu em epidemias passadas, como em

1997 e nos anos 2000 e 2007, culminando nas grandes epidemias de 2001 e 2008.

Este cenário, em consonância com a teoria da infecção sequencial (Halstead 1988),

coloca o RN como um local bastante propício aos casos graves de dengue. Além

disto, Wikramaratna et al. (2010) demonstraram através de modelos matemáticos,

que a possibilidade de infecções terciárias e quaternárias aumentam a força de

infecção e tendem a diminuir, significativamente, a idade da primeira infecção pelo

vírus da dengue.

Apesar de qualquer um dos 4 sorotipos de dengue causarem DHF em

infecções secundárias (Guzman et al. 2013), estudos na Tailândia e em Cuba

demonstram que existem sequências de infecção mais propícias ao

desenvolvimento de casos graves (Guzman et al. 2012). Anantapreecha et al.(2005),

demonstraram que o DENV-1 causa casos graves em infecções primárias, enquanto

o DENV-2 é mais propício a causar DHF em infecções secundárias. Já Gibbons et

al. (2007) também sugerem que a infecção secundária por DENV-2 é mais

associada à casos graves e adiciona que a sequência DENV-1/DENV-2 é sujeita a

um maior risco que as demais. No Brasil, De Carvalho Bittencourt et al. (2012)

observaram que os casos graves possuem associação com o DENV-2 e infecções

secundárias.

No Brasil, a descrição da cocirculação dos quatro sorotipos da dengue

simultaneamente, em Manaus (Bastos et al. 2012) e no Estado do Rio de Janeiro

(Da Silva 2013), demonstra uma tendência de hiperendemicidade da dengue nos

70

Estados do país, como demonstramos ter ocorrido em 2011, onde houve circulação

dos DENV-1, DENV-2 e DENV-4 no RN. Bastos et al. (2012) também relatam a

presença de coinfecções por sorotipos diferentes, assim como em trabalhos de

Gubler et al.(1985), dos Santos et al. (2003), e Araújo et al. (2006). No entanto,

ainda não há dados suficientes para afirmar a importância destas coinfecções,

apenas sabemos que isso já pode estar acontecendo no Rio Grande do Norte e

merece ser alvo de maiores estudos.

A introdução do sorotipo 4 no Estado do RN tem enorme importância

epidemiológica, pois após a introdução de um novo sorotipo, o número de casos tem

um grande aumento (Cordeiro et al. 2008).

Tratando-se do DENV-4, temos um cenário epidemiológico onde

praticamente toda a população estava susceptível, devido a não circulação deste

sorotipo no país, desde o trabalho descrito por Osanai et al. (1983) e que ressurgiu,

em 2010, naquele mesmo Estado.

Nosso trabalho demonstrou a substituição de predominância de sorotipos

ao longo dos três anos de estudo (Figura 5.2), algo normal durante sucessivas

epidemias, devido ao número crescente de pessoas que se tornam imunes ao antigo

sorotipo (Cordeiro et al. 2007).

Em 2012, além de ter ocorrido a substituição do sorotipo predominante,

do DENV-1 para o DENV-4, pudemos também observar apenas a circulação do

sorotipo 4 e a sua distribuição por praticamente todo o Estado (Figura 5.5). Ademais,

foi registrada incidência de 821,93 casos por 100.000 habitantes, sendo uma

altíssima incidência, até mesmo quando comparada a epidemia de 2011, quando

tivemos incidência de 731,24 (Ministério da Saúde 2012), estes aspectos sugerem

um grande poder de infecção e disseminação do DENV-4.

Nogueira et al. (2001) relataram a introdução do DENV-3 no estado do

Rio de Janeiro e três anos depois, Nogueira et al. (2005), demonstraram a

importância epidemiológica que a introdução deste novo sorotipo causou, como

aumento no número de casos de FHD/SCD, resultando na maior epidemia

registrada até então no Brasil, em 2002. Desta forma, são necessários estudos

posteriores, os quais esclareçam o impacto da introdução do DENV-4, no Rio

Grande do Norte, não apenas em números de casos, mas também em relação à

gravidade deles.

71

6.2 Distribuição geográfica dos casos de Dengue no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

Em relação à distribuição espacial dos casos e sorotipos no Rio Grande

do Norte, podemos perceber através da Figura 5.3, Figura 5.4 e Figura 5.5, que a

região metropolitana possuiu a circulação de todos os sorotipos registrados para o

Estado. Contudo, verificamos que o vírus circulou em todas as zonas climáticas do

RN, estando de acordo com outros trabalhos também realizados na região do

nordeste brasileiro (Cordeiro et al. 2008; Melo et al. 2010).

A alta circulação viral e grande número de casos na região metropolitana,

provavelmente é resultado da alta urbanização e densidade populacional, além do

intenso fluxo de pessoas e maior acesso aos serviços médicos, o qual resulta no

maior registro de casos, como também já apresentado por De Simone et al.(2004) e

Da Silva (2013), no Rio de Janeiro, Cordeiro et al. (2007), em Pernambuco e Melo

(2010), na Bahia. Vale salientar que a capital do Estado, Natal, representou 53,97%

dos casos confirmados em todo o período estudado, correspondendo a mais da

metade dos casos confirmados para todo o Estado. Aspecto já atestado por Cunha

et al. (1999), na epidemia de 1997, quando Natal foi o município mais afetado, com

56,6% dos casos relatados.

Recente estudo, feito por Barcellos & Lowe (2013), demonstra que ondas

de difusão de dengue provêm das áreas metropolitanas para cidades de médio e

pequeno porte, causando surtos em suas áreas de influência. O trabalho ainda

conclui que cidades grandes e de clima quente são responsáveis pela sustentação e

disseminação dos DENV.

A concentração de 73,85% dos casos confirmados em apenas 7

municípios, concorda em parte com os 20 municípios considerados prioritários pela

Secretaria de Estado de Saúde pública do RN, para monitoramento estratégico

(Secretaria de Estado da Saúde Pública do Rio Grande do Norte 2010), e sugere a

adição de Guamaré e Santo Antônio à referida lista.

72

6.3 Distribuição temporal dos casos de Dengue no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

O período anual com a maior incidência de dengue no Estado foram os

meses de Abril e Maio, representando 21,12% (101/478) e 23,01% (110/478) dos

casos confirmados, (X2: 61,13; gl= 11; p<0,001). Câmara et al. (2007),

demonstraram que, na região Nordeste, a maior concentração de notificações

ocorrem realmente no segundo trimestre e que a significativa incidência sazonal da

dengue nos meses quentes está relacionada ao ciclo reprodutivo do Ae. aegypti.

Outros trabalhos no Nordeste do Brasil, como o de Gonçalves Neto &

Rebêlo (2004), em São Luís, comprova a ocorrência da maioria dos casos na

estação chuvosa, concentrados entre Março e Junho, havendo correlação positiva

com a precipitação pluviométrica e umidade relativa. Cordeiro et al.(2007), em

Pernambuco, evidenciam um maior número de casos no primeiro semestre, com

picos em Abril e Maio. No Estado da Paraíba, observou-se uma curva de incidência

da dengue, com picos oscilando entre os meses de março a maio (Souza et al.

2007). Na cidade de Teresina, Monteiro et al.(2009) constatam uma maior incidência

no primeiro semestre de cada ano, coincidindo com o período de maior índice

pluviométrico e de infestação predial. Alves et al. (2011), no município de Aracaju,

também expõem uma maior incidência entre os meses de Janeiro a Junho.

Na região Sudeste, Gomes et al. (2012), em trabalho realizado na cidade

do Rio de Janeiro, verificaram que a maioria dos casos estão concentrados no

primeiro semestre do ano, principalmente em Março, Abril e Maio, semelhante ao

que também ocorre na região Nordeste. Viana & Ignotti (2013), em uma revisão de

trabalhos científicos, concluem que a variação meteorológica está fortemente

relacionada à incidência de dengue, sendo as variações sazonais da temperatura e

de índices pluviométricos influentes na dinâmica vetorial e da doença.

No Rio Grande do Norte existem heterogeneidades climáticas, as quais

dependem da localização geográfica de cada município (Rio Grande do Norte 2013).

Contudo, em todos os municípios, os maiores índices pluviométricos ocorrem no

primeiro semestre do ano, e em sua maioria iniciam-se no final do primeiro trimestre,

podendo se prolongar por todo o segundo trimestre (Empresa de Pesquisa

Agropecuária do Rio Grande do Norte 2013). Aspectos que corroboram os

73

resultados demonstrados neste e no outro trabalho realizado no Rio Grande do

Norte, por Barbosa et al. (2012), indicando a importância de um maior efetivo de

ações voltadas ao controle e prevenção da dengue, nestes períodos cruciais do ano.

6.4 Dados demográficos dos casos estudados

A faixa etária de 0-10 anos obteve o maior número de casos, no período

acumulado de 2010-2012, sendo responsável por 38,08% dos casos confirmados.

Na epidemia ocorrida em 2007, Teixeira et al.(2008) já haviam demonstrado que

pela primeira vez, no Brasil, a maioria dos casos de FHD ocorreram em crianças

abaixo dos 15 anos e, em Pernambuco, Cordeiro et al.(2007), também perceberam

uma tendência no aumento da incidência de casos em menores de 15 anos, ao

longo do período estudado de 1995 a 2006. No Ceará, Cavalcanti et al. (2011)

atestaram a mudança no padrão de idade afetada pela Dengue, com a maior

incidência sendo deslocada para a faixa de 0-10 anos, no ano de 2008.

Estes resultados são consequência da obtenção de imunidade por parte

dos indivíduos adultos devido à hiperendemicidade do dengue, o que resulta na

maior infecção em crianças não imunes. Um estudo sorológico realizado na cidade

do Recife verificou a presença simultânea de anticorpos para os DENV-1, 2 e 3 em

11% das crianças avaliadas, demonstrando uma intensa cocirculação dos DENV em

idade precoce (Castanha et al. 2013). A velocidade deste deslocamento na faixa

etária é proporcional ao número de sorotipos circulantes e à magnitude da força de

infecção dos vírus dengue (Rodriguez-Barraquer et al. 2011; Wikramaratna et al.

2010).

Com a introdução do sorotipo 4, o nosso trabalho atestou uma nova

mudança no padrão de incidência por idade no Rio Grande do Norte. A faixa etária

de 11 a 30 anos obteve 51,33% (77/150) dos casos positivos (X2=27,83; gl=6;

p=0,0001) (Figura 5.11). O DENV-4 foi o responsável pelo aumento na média de

idade da população afetada (Figura 5.12; p<0,0001), quando comparado aos outros

sorotipos. Resultado já esperado, devido à introdução deste sorotipo, o qual nunca

havia sido registrado no RN. Estabeleceu-se um cenário epidemiológico onde

praticamente toda a população é susceptível a infecção.

74

Em relação ao gênero, este trabalho verificou a maior incidência no sexo

feminino, representando 52% dos casos confirmados, apesar de não ter havido

diferença significativa, nossos achados estão de acordo com trabalhos realizados

em Belém, por Travassos Rosa et al. (2000), em Recife, por Cordeiro et al.(2007),

em Aracaju, por Alves et al. (2011) e em Vitória, por Cardoso et al. (2011).

Também pôde ser verificado que a média de idade de mulheres afetadas

pela dengue foi significantemente maior que a média de idade de homens afetados

(p=0,0345), em concordância com o que também foi verificado por De Simone et al.

(2004), no Rio de Janeiro.

Estes resultados podem ser explicados pelo comportamento social

humano, onde mulheres utilizam mais os serviços de saúde e, desta forma,

possuem mais notificações deste agravo e/ou devido à mulher passar mais tempo

no intra e peridomicílio, estando mais exposta ao Ae. aegypti (Cardoso et al. 2011).

6.5 Caracterização genética dos sorotipos isolados no Rio Grande do Norte,

2010-2012.

A caracterização genética dos DENV presentes no Rio Grande do Norte

confirmou a circulação do genótipo V, do DENV-1 (Figura 5.15). No Brasil, outros

estudos corroboram este achado, sendo o único genótipo evidenciado como

circulante no país até então (Bona et al. 2012; Carneiro et al. 2012; dos Santos et al.

2011; Drumond et al. 2012).

Trabalhos de Carneiro et al. (2012) e Drumond et al. (2012) sugerem que

diferentes linhagens do DENV-1, genótipo V, têm sido introduzidas no Brasil,

gerando um aumento na diversidade genética deste vírus e que surtos associados

com a reemergência do DENV-1 ocorrem, desde 2009, provavelmente devido à

substituição destas linhagens.

Quanto ao DENV-2, evidenciamos o genótipo Sudeste Asiático/Americano

(Figura 5.16). Resultado que também está em consonância com o cenário brasileiro

demonstrado por outros trabalhos (Bona et al. 2012; Cruz et al. 2010; Drumond et al.

2013; Faria et al. 2013; Oliveira et al. 2010).

Assim como para o DENV-1, já tivemos a descrição da circulação de

diferentes linhagens para o DENV-2, no Brasil. As circulações destas linhagens

geneticamente distintas podem estar influenciando na gravidade dos casos de

75

dengue, visto que, epidemias de grande porte foram evidenciadas após a introdução

de novas linhagens virais (Drumond et al. 2013; Faria et al. 2013; Oliveira et al.

2010).

Para o DENV-4, foi atestada a circulação do genótipo II (Figura 5.17), em

concordância com Nunes et al. (2012) e de Souza et al. (2011), os quais verificaram

a circulação dos genótipos I e II deste sorotipo, no Brasil. A reemergência do

sorotipo 4 representa grande preocupação e suscita a necessidade de estudos

filogenéticos que possam detectar a introdução ou substituição de linhagens e que

elucidem a dinâmica da evolução e da dispersão geográfica deste sorotipo/genótipo,

não só no Rio Grande do Norte, como também no Brasil (de Souza et al. 2011;

Nunes et al. 2012).

A identificação precisa da variante genética dos vírus da dengue é muito

importante, principalmente num cenário hiperendêmico onde ocorre a circulação de

vários sorotipos e genótipos do DENV, como no Rio Grande do Norte. A vigilância

genotípica é crucial para a compreensão da dispersão, virulência e eventos de

mutação, os quais podem resultar em vírus com propriedades patogênicas

expandidas, alta transmissibilidade e virulência (Bona et al. 2012; Drumond et al.

2012).

Neste contexto, friso a importância da implantação do sequenciamento

genômico do DENV no Estado do Rio Grande do Norte, o qual nos proverá novas

ferramentas para estudo e nos levará a uma maior compreensão da dinâmica que

rege esta enfermidade nesta unidade federativa.

76

7. PERSPECTIVAS

Esses resultados possibilitaram uma melhor compreensão da atividade

desses vírus no Estado do Rio Grande do Norte, servindo de base para ações de

controle e pesquisas relacionadas à patogênese da doença, caracterização

genética, filogenia e evolução dos DENV no RN. Os avanços alcançados quanto à

implantação e estruturação de método de vigilância virológica no Estado, além do

sequenciamento genômico, reforçam a necessidade do contínuo monitoramento

dos DENV no Estado do Rio Grande do Norte nos próximos anos.

A continuidade deste trabalho, com a utilização de estudos filogenéticos

e evolutivos deve ser realizada para a verificação das linhagens circulantes no

Estado e as implicações epidemiológicas que decorrem desta verificação. Espera-

se também que novas metodologias sejam estruturadas em nosso laboratório

(LADIC), como o PCR em tempo real, o teste de captura do antígeno NS1 e o

isolamento viral em cultura de células, para que possamos avaliar outras variáveis

que concernem à infecção pelo vírus dengue, tais como: viremia, status

imunológico e testes de antivirais.

Parcerias bem estruturadas com Laboratórios de Referência, no Estado

e no Brasil, serão mantidas para o aprimoramento da vigilância da Dengue no Rio

Grande do Norte, com vistas à prevenção e controle de casos da doença.

8. CONCLUSÕES

1. A técnica de RT-PCR contribuiu com um maior percentual de positividade

nos anos de 2010 e 2011. Em 2012, o isolamento viral teve maior

percentual de detecção.

2. No período estudado de 2010-2012, ocorreu a circulação dos quatro

sorotipos da Dengue. Com destaque para a introdução do DENV-4 no

Estado, pelo município de Santa Cruz, em 2011.

77

3. Em 2010, ocorreu a cocirculação dos DENV-1, DENV-2 e DENV-3. Em

2011, a cocirculação dos DENV-1, DENV-2 e DENV-4. Em 2012, houve

apenas a circulação do DENV-4.

4. Houve alternância de predominância dos sorotipos. Em 2010, o sorotipo

predominante foi o DENV-2. Em 2011, o DENV-1 predominou e no ano

seguinte, apenas o DENV-4 foi confirmado no Estado do RN.

5. A maior quantidade de casos de Dengue ocorreu no município de Natal,

representando mais da metade dos casos confirmados, seguido de

Parnamirim.

6. Os meses com maior incidência foram Abril e Maio, representando 21,12%

e 23,01% dos casos confirmados, respectivamente.

7. A faixa etária com maior número de casos confirmados foi a de 0-10 anos,

no período acumulado. Porém, em 2012, houve um maior número de

casos nas faixas etárias de 11-30 anos, devido a introdução do sorotipo 4.

8. Em relação ao gênero, a maior incidência foi observada no sexo feminino,

embora não fosse estatisticamente significativo. A média de idade das

mulheres infectadas também foi maior.

9. A caracterização genética das cepas circulantes confirmou a circulação do

genótipo V, genótipo Sudeste Asiático/Americano e genótipo II,

respectivamente para DENV-1, DENV-2 e DENV-4.

.

78

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