de la rosa - core

M.ªCarmendelaRosaJorgeetal.|75

ESTUDIO4

MicrobiologíadelaguamineromedicinaldelBalneariodeVillavieja

TitleinEnglish:MicrobiologyofthenaturalmineralwaterofVillaviejaSpa

M.ª Carmen de la Rosa Jorge, Concepción Pintado García, Carmina RodríguezFernández

DepartamentodeMicrobiologíaII,FacultaddeFarmacia,UniversidadComplutense,Madrid.

An.Real.Acad.Farm.Vol82,SpecialIssue(2016)pp.75‐86.

RESUMEN ABSTRACT

Se ha estudiado la microbiota autóctona yalóctona del agua mineromedicinal delBalneario de Villavieja (Castellón). El númerototaldemicroorganismosenelaguahasidode4,7x104/mL y el número de bacterias viablesheterótrofasyoligotrofasde103ufc/mL.Nosehan encontrado indicadores fecales nimicroorganismospatógenosen250mLdeagua.La microbiota autóctona está constituida,principalmente, por bacilos Gram negativos nofermentadores del Phylum Proteobacteria(64,4%) y, en menor proporción, por bacilosGrampositivos(24,4%)ycocosGrampositivos(6,7 %). Las especies más frecuentes han sidoPseudomonas pseudoalcaligenes (15,5 %) yLeifsonia aquatica (13,3 %). Se han detectadobacterias con actividades amonificantes,proteolíticas, amilolíticas y sulfato‐reductorasen 100mL de agua que contribuyen a laautodepuracióndelagua

Theautochthonousandalocthonousmicrobiotaof the natural mineral water of Villavieja Spahave been studied. The total number ofmicroorganisms in the water was of 4.7x104/mL and the number of heterotrophic andoligotrophic viable bacteria was 103cfu/mL.Neither faecal indicators nor pathogenicmicroorganismswerefoundin250mLofwater.The autochthonous microbiota mostly belongsto Gram‐negative bacilli, from the PhylumProteobacteria (64.4%) and in smallerpercentagetotheGram‐positivebacilli(24.4%)and cocci (6.7%). The most frequently foundspecies were Pseudomonas pseudoalcaligenes(15.5%) and Leifsonia aquatica (13.3%).Moreover ammonifying, proteolytic, amylolyticand sulphato‐reducted bacteria have beendetected in 100mL of water, all of theminvolvedinself‐purificationprocessofwater.

Palabrasclave:Manantialhipertermal;Microbiotaautóctona;Biodiversidad;Aguamineromedicinal.

Keywords: Hyper thermal spring;Autochthonous microbiota; Biodiversity;Mineralwater.

76|MicrobiologíadelaguamineromedicinaldelBalneariodeVillavieja

1.INTRODUCCIÓN

El Balneario de Villavieja se encuentra situado en el municipio del mismonombre, también llamado La Vila Vella, en la comarca de la Plana Baja, en la zonasurorientaldelaprovinciadeCastellón,pertenecientealaComunidadValenciana.Eltérminomunicipalseencuentraen lasestribacionesde laSierradelEspadánymuycercadelaCostadeAzahardelmarMediterráneo(Figura1).

Figura1.MunicipiodeVillavieja:rotondadeentrada,vistageneral.

Laspropiedadescurativasdelasaguasdeestalocalidadyaeranconocidasporlos romanos, pero fue a finales del sigloXVII cuando se construyeron las primerascasetasdebañosyenel sigloXIX semencionanhastaoncebalnearios.ElBalnearioactual, situado en el centro de la población, fue reconstruido después de la GuerraCivil sobre el antiguo Balneario de Monlleó y ampliado con varias construccionesvecinas,constituyendolaAgrupacióndeBalneariosdeVillavieja(1)(Figura2).

Figura2.EdificiodelbalneariodeVillavieja.

El objetivo principal de este trabajo ha sidodeterminar losmicroorganismosque pueden suponer un riesgo para la salud de los usuarios que reciben lostratamientosterapéuticosenelBalneario,comosonlosindicadoresdecontaminaciónfecalyalgunospatógenosquesetrasmitenporelagua.Además,porprimeravez,sehaestudiado la microbiota autóctona de estas aguas mineromedicinales, no solo para


conocersunúmero,identidadydiversidadsinotambiénsuactividadmetabólicaquetantaimportanciatieneenlaautodepuracióndelasmismas.

2.RESULTADOS

2.1.Muestras

Estasaguasmineromedicinalesemergenaunatemperaturade39ºC,tienenunpH neutro y se clasifican como híper termales, demineralizaciónmedia, sulfatadascálcicasmagnésicas,radiactivasyextremadamenteduras(2).

El Balneario utiliza el agua mineromedicinal procedente de un pozo que seencuentra en el interior del edificio, en una pequeña habitación en la entrada delmismo (Figura 3). El agua se capta con una bomba y se conduce por tuberías a lasinstalacionesdelbalnearioparasuusoenlosdistintostratamientos.

Pararealizaresteestudiosetomaronmuestrasdeaguaenelpozo,enjuniodelaño 2014. Las muestras se recogieron en recipientes estériles de 1,5 litros, porduplicado y se trasladaron, a temperatura ambiente y en oscuridad, hasta ellaboratorioanalizándolasantesdelas24horas.

Figura3.Puntodeemergencia:entrada,pozo.

2.2.Microorganismostotalesyvivos

Elnúmerodetodoslosmicroorganismospresentesenelaguaseharealizadopor el método del recuento directo, utilizando varios fluorocromos: naranja deacridina, Syto®9 y yoduro de propidio (BacLight Live/Dead) que nos permitedistinguirlosmicroorganismosmuertosdelosvivos.Lasmuestrasteñidassefiltraronpor unamembrana Nucleopore de 0,2 μm de diámetro de poro y se observaron ycontaronconunmicroscopiodefluorescenciayobjetivodeinmersión.

Elnúmerodemicroorganismostotaleshasidode4,7x104/mLyelporcentajede vivos, 72,2 %. Estos resultados son semejantes a los encontrados en otros


manantialesdeaguasmineromedicinalesextremadamenteduras(3,4),siendomenorelporcentajedemicroorganismosvivos.

2.3.Bacteriasaerobiasviables

La determinación del número de bacterias aerobias viables en las aguasmineromedicinalesesútilpuespermiteconocersielaguahasidotratadaconalgúnprocesodedesinfecciónosihahabidocontaminacióndelacuífero.Diversosautoreshan estudiado las condiciones de cultivo más adecuadas para detectar el mayornúmerodebacteriaspresentesenestetipodeaguas,concluyendoquehayqueutilizarmedios de cultivo con diferentes nutrientes, períodos de incubación largos y variastemperaturas (5, 6). En este trabajo se han determinado las bacterias heterótrofas,utilizando el medio agar extracto de levadura (7) y las bacterias oligotrofasempleandoagarR2A(5).Elrecuentodeestasbacteriasserealizóporlastécnicasdefiltración con filtrosMillipore de 0,22 μm y dilución en placa, e incubando a 22ºC,cincodías,a37ºC,48horasya45ºC,24horas.LosresultadossehanexpresadoenunidadesformadorasdecoloniaspormLdeagua(ufc/mL).

Elnúmerodebacteriasviableshasidoelevado,tantoenlasincubadasa22ºCcomo a 37ºC, con unamedia de 103 ufc/mL (Tabla 1), presentandomás bacteriasoligotrofas que heterótrofas, propio de aguas subterráneas pobres en materiaorgánica (6). Se ha observado una relación con la temperatura de emergencia delagua,39ºC,yaqueaunqueelnúmerodebacteriasviablesincubadasa37ºChasidomayorque las incubadas a 22ºC, no significa que el acuífero esté contaminado conbacteriaspatógenas.Además,elnúmerodebacteriastermófilas,incubadasa45ºC,hasidomenor que el demesófilas lo que indica que lamicrobiota de estas aguas estáconstituida por bacterias mesófilas que se han adaptado a las condiciones detemperatura del manantial. Los valores obtenidos son semejantes a los de otrosmanantialesespañoleshípertermales(8,9,10).

En este estudio hemos obtenido que las bacterias cultivables son diez vecesmenores que los microorganismos vivos, observados con microscopio defluorescencia, lo que coincide con los resultados de Leclerc y da Costa en diversasaguasminerales(11).Estadiferenciasedebeaquemuchasdelasbacteriaspresentesse encuentran en el estadode viableno cultivable yno crecen en las condiciones ymediosdecultivoutilizadosenellaboratorio(12).


Tabla1.Númerodebacteriasaerobiasviables(ufc/mL).Tª Bacterias Manantial

22ºC Heterótrofas 1,6x103

37ºC 2,4x103

45ºC

22ºC

Oligotrofas

7,2x10

6,7x103

37ºC

45ºC

7,3x103

1,5x102

2.4.Microorganismosdeinteréssanitario

Las aguas mineromedicinales se utilizan en los balnearios con finesterapéuticos, por lo que deben tener ausencia de bacterias que indiquencontaminación fecal y de microorganismos patógenos que puedan transmitirse atravésdelaguaporvíaoral,tópicaoinhalatoria.

Paradetectar laposiblepresenciade indicadores fecales sehanrealizado losrecuentos de coliformes totales, coliformes fecales, enterococos, esporas deClostridiumsulfito‐reductoresyC.perfringens,ademássehainvestigadolapresenciade Escherichia coli, Salmonella y Pseudomonas aeruginosa, utilizando los métodosoficialesespañolesdelasaguasdeconsumohumano(7)ydebebidaenvasadas(13).TambiénsehaestudiadolapresenciadeStaphylococcusaureus, filtrando250mLdeagua,cultivandoelfiltroencaldotriptonasojayaislandoenagarBaird‐ParkerydeLegionellapneumophila,segúnlaNormaISO11731(14).

No se han encontrado ninguno de los microorganismos indicadores decontaminación fecal, ni bacterias patógenas (E. coli, Salmonella, P. aeruginosa,S.aureusyL.pneumophila)en250mLdeagua.

2.5.Microorganismosdeinterésecológico

La microbiota autóctona de las aguas mineromedicinales es de gran interésecológico yaqueparticipa en losprocesosbiogeoquímicosdel carbono, nitrógenoyazufre. Estos microorganismos poseen diversas capacidades metabólicas,transformando los compuestos orgánicos en inorgánicos lo que contribuye a laautodepuración de las aguas ymantiene el equilibrio biológico de estos ambienteshidrotermales(6).

Enesteestudiosehadeterminadoelnúmerodebacteriasqueintervienenenelciclo del carbono (proteolíticas, amilolíticas, celulolíticas), del nitrógeno


(amonificantes, nitrificantes) y del azufre (sulfato‐reductoras). Se ha utilizado latécnicadelnúmeromásprobable(NMP)ylosmediosdescritosenotrotrabajo(15),incubando a 30°C durante 30 días. Los resultados se han expresado comoNMPdemicroorganismosen100mLdeagua(Tabla2).

Tabla2.Númerodemicroorganismosdeinterésecológico(NMP/100mL).Microorganismos Manantial

Proteolíticos >2,4x104

Amilolíticos >2,4x104

Celulolíticos <3

Amonificantes >2,4x104

Nitrificantes <3

Sulfatoreductores 4,3x10

El agua del manantial ha presentado bacterias proteolíticas, amilolíticas yamonificantes. Las bacterias proteolíticas detectadas hidrolizan la gelatina y se hanidentificado como Stenotrophomonas maltophilia y Leifsonia aquatica. Las bacteriasamilolíticas que hidrolizan el almidón son de los géneros Bacillus y Leifsonia. Encuanto a las bacterias amonificantes que producen amoniaco de la asparraginapertenecen,principalmente,algéneroArthrobacter.

Los microorganismos con actividades proteolíticas, amilolíticas yamonificantessonmuyabundantesenloshábitatsnaturalesysonimportantesenlaeliminación de materia orgánica, en las aguas subterráneas, siendo frecuente supresenciaenmanantialesdediferentecomposiciónquímicatantohipertermales(8,9,10)comohipotermales(3,15,16,17,18).

Además se han encontrado bacterias sulfato reductoras del géneroDesulfovibrioqueintervienenenelciclodelazufre,quepodríanconvertirlossulfatospresentesenestasaguasensulfuros,enausenciadeoxígeno.Estasbacteriastambiénsehandetectadoenotrosmanantialesmineromedicinalessulfatados(16,19).

Se han estudiado los microorganismos halófilos moderados, utilizando agarhalófilocon15%declorurosódicoe incubandoa30°C,durante7días,peronosehandetectadodebido,probablemente,aquetienenunacantidadmuybajadeclorurosysodio.

También se han estudiado otros tipos de microorganismos: hongos,cianobacteriasy algas.El recuentodehongos se realizóporelmétodode filtración,utilizandoelmedioagarSabouraudconcloranfenicolal0,05%.Sehanencontradounnúmero bajo de hongos 11 por 100 mL que pertenecen a levaduras y hongos


filamentososdelosgénerosPenicilliumyAlternaria.Lapresenciadehongosenaguasminerales es poco frecuente pero se han detectado en otros manantialesmineromedicinalesenpequeñonúmero(3,4,15,16).

Nosehandetectadocianobacteriasnialgasenningunamuestradeagua.

2.6.Identificacióndebacteriasheterótrofas

Lascepasaisladasenlosdistintosmediosderecuentosehanidentificadoporvariascaracterísticasmorfológicas,fisiológicasybioquímicasdescritasenuntrabajoanterior (20). Además se utilizó el sistema de identificación miniaturizado API®(bioMérieux), empleando las galerías: 20 NE para los bacilos Gram negativos nofermentadores, StaphparaloscocosGrampositivosyCoryneparalosbacilosGrampositivosirregulares.

En las muestras estudiadas se han aislado 45 cepas de bacterias viablesheterótrofasyoligotrofas,quecorrespondenalostiposmorfológicosdebacilosGramnegativos(68,8%),bacilosGrampositivos(24,4%)ycocosGrampositivos(6,7%)(Figura 4). Según la clasificación taxonómica del Manual de Bergey (21) las cepasidentificadas pertenecen, en su mayoría, al Phylum Proteobacteria (64,4 %), y enmenor proporción a los Phyla: Actinobacteria (17,9 %), Firmicutes (13,3 %) yBacteroidetes(4,4%)(Figura4).

EnestasaguaslamayoríadelascepasaisladassonbacilosGramnegativosnofermentadores de la clase Gammaproteobacteria (48,8%) pero también se hadetectado una gran proporción de bacterias Gram positivas lo que coincide con loencontrado en otros manantiales minerales extremadamente duros tantohipertermales(8,9,10)comohipotermales(3,4,15).

Figura4.Clasificaciónmorfológicaytaxonómica(%cepas).

En laTabla3 sedetallan losgénerosyespeciesdebacteriasaisladasenestemanantial.


Tabla3.Génerosyespeciesdebacterias(nºy%decepas).Bacterias Manantial(n=45)

Phylum Géneros‐Especies (nº) (%)

Bacteroidetes Chryseobacteriumgleum 2 4,4

Proteobacteria Brevundimonasvesicularis 5 11,1

Alpha Sphingomonaspaucimobilis 2 4,4

Gamma Acinetobacterjunii 1 2,2

Photobacteriumdamselae 2 4,4

Pseudomonasalcaligenes 2 4,4

Pseudomonasoryzihabitans 2 4,4

P.pseudoalcaligenes 7 15,5

Stenotrophomonasmaltophilia 5 11,1

Noidentificados 3 6,6

Actinobacteria Arthrobacter 2 4,4

Leifsoniaaquatica 6 13,3

Firmicutes

Bacillussp. 3 6,6

Staphylococcuswarneri 1 2,2

Vagococcusfluvialis 2 4,4

ElgéneromásaisladohasidoPseudomonas,habitualenaguasminerales(11,20),ademássehanencontradocepasdeStenotrophomonasySphingomonas.Ambosgéneros están ampliamente distribuidos en la naturaleza y pueden considerarseautóctonosdeaguasminerales(22,23).

Entre los bacilos Gram negativos, la especie más frecuente ha sidoPseudomonaspseudoalcaligenesquehasidoencontradaenambientesnaturales.Estaespeciesecaracterizaporqueutilizamuypocoscompuestosorgánicosypuedecrecera 42ºC (23) por lo que las cepas aisladas en este manantial pueden vivir a latemperatura de emergencia del mismo. Las otras especies de Proteobacteria,presentesenestemanantial,sonfrecuentesenaguasmineralesyhansidodetectadasenotrosmanantialesmineromedicinales(3,4,15,17,18).Tambiénsehanaisladodoscepas del género Chryseobacterium perteneciente al Phylum Bacteroidetes. Estegénero,propuestoparaincluiradiversasespeciesdeFlavobacterium,estásiendomuyestudiadoenlosúltimosaños,describiéndosenuevasespeciesaisladasdeambientesmuyvariadosquepresentanactividadesmetabólicasconaplicaciones industrialesymedioambientales ya que pueden degradar herbicidas, insecticidas y otroscompuestosquímicos.Lascepasaisladasenestemanantialsehanidentificadocomo


Chryseobacteriumgleum,especieubicuaqueviveenelaguayelsueloyescapazdecrecera42ºC(24).

Los bacilos Gram positivos detectados son, en su mayoría, de morfologíairregular y pertenecen a los géneros Arthrobacter y Leifsonia, así mismo se haencontradounpequeñonúmerodecepasdebacilosesporuladosdelgéneroBacillus.Arthrobacter y Bacillus proceden del suelo, pero son frecuentes en manantialestermales(9,19,20).Leifsoniaaquatica(antesCorynebacteriumaquaticum)viveenelaguaysehaaisladoenotrosmanantialesmineromedicinales(3,4,16,17).

LoscocosGrampositivosseencuentranenbajaproporciónycorrespondenalosgénerosStaphylococcusyVagococcus.Losestafilococossonmuyubicuosysehandetectadoenmuchasaguasmineromedicinales(3,4,15,16,17,18,20).AdemássehaaisladoV.fluvialiscuyohábitateselaguadulceyquetambiénhemosencontradoenotrosmanantialesminerales(18,25).

Enestemanantialsehanaisladovariascepasdebacteriaspigmentadasloqueesfrecuenteenaguasminerales(15,16,18),debidoaquelospigmentoslasprotegende las radiaciones evitando la muerte fotodinámica. Entre ellas, destacamos lasespecies de bacilos Gram negativos: Brevundimonas vesicularis, StenotrophomonasmaltophiliayChryseobacteriumgleumydebacilosGrampositivosLeifsoniaaquatica,todasellasconpigmentosamarillos(Figura5).

Figura5.Bacteriaspigmentadas

Stenotrophomonasmaltophilia

Leifsoniaaquatica

Brevundimonasvesicularis

Chryseobacteriumgleum


3.CONCLUSIONES

Enlasmuestrasestudiadasnosehandetectadoindicadoresdecontaminaciónfecalnimicroorganismospatógenosporloquecumplenconlanormativadeaguasdeconsumo humano. La microbiota autóctona está constituida, principalmente, porbacterias oligotróficas, predominando los bacilos Gram negativos de la ClaseGammaproteobacteria, ademáspresenta bacteriasGrampositivas lo que es habitualen los manantiales hipertermales. Se han detectado bacterias con actividadproteolítica,amilolíticayamonificantequeintervienenenlosciclosbiogeoquímicosycontribuyenalaautodepuracióndelasaguas.

4.AGRADECIMIENTOS

Las autoras agradecen a los propietarios del Balneario y en especial aD.VicenteCaballerAlmela, las facilidadesdadaspara la tomademuestras.Además,queremosagradeceraDªMªElenaArgüellesRojo, técnicode laboratorio,suvaliosaayudaenlapreparacióndelmaterialdelaboratorioylosmediosdecultivo.

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