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SALOMON, CULTURAS MISTAS DE LEVEDURAS EM FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, PAG. 1

WWW.INFOWINE.COM – REVISTA INTERNET DE VITICULTURA E ENOLOGIA, 2007, N.4/2

CULTURAS MISTAS DE LEVEDURAS EM FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA SALMON Jean-Michel Directeur de Recherches - Unité Mixte de Recherches « Sciences pour l’Œnologie », Equipe « Microbiologie et technologie des fermentations », INRA, 2, place Viala, F-34060 Montpellier Cedex 1, France. Email : [email protected] Article extrait du compte-rendu de la 2ème Journée Scientifique Vigne-Vin, Agro.M, Montpellier, 20 mars 2006 A complexidade aromática é um parâmetro da vinificação dos vinhos que assume cada vez mais importância e a utilização de Saccharomyces como única estirpe nem sempre conduz aos efeitos desejados. Por este motivo, nos últimos anos, os investigadores têm vindo a mostrar cada vez mais interesse pela diversidade da flora presente no bago de uva, não se centrando apenas na Saccharomyces cerevisiae. Uma parte não negligenciável da tipicidade aromática dos vinhos deverá ser atribuída às outras espécies de leveduras Saccharomyces ou não-Saccharomyces que se desenvolvem ou não no início da fermentação espontânea dos mostos. Um dos programas de investigação efectuados no nosso departamento tem por objectivo procurar simular e estudar as sucessões da flora no laboratório, para melhor delinear o seu eventual contributo à qualidade final do produto, mas também para, em função dos resultados obtidos, ser colocada a hipótese de a prazo, em enologia, se realizarem inóculos mistos de leveduras. Introdução: Tradicionalmente, a fermentação alcoólica durante o processo de vinificação é assegurada pelas populações indígenas, nas quais a espécie Saccharomyces cerevisiae é amplamente dominante. Contudo, há cerca de quinze anos, a tendência é a generalização da inoculação de uma estirpe pura sob a forma de Levedura Seca Activa (LSA) para melhor controlar as fermentações e evitar incidentes organolépticos. É neste contexto que, há vários anos, numerosos estudos têm sido realizados em monocultura, nomeadamente no nosso departamento. O objectivo é conhecer melhor os diferentes fenómenos ocorridos ao longo da fermentação alcoólica, melhorando a fiabilidade das fermentações, e compreender melhor as diferenças entre as estirpes já comercializadas (mais de 200 estirpes no mercado mundial), aumentando, assim, a qualidade dos vinhos. Contudo, as estirpes industriais comercializadas são frequentemente seleccionadas por algumas das suas propriedades para alcançar objectivos específicos (rapidez de fermentação, resistência ao stress térmico ou ao etanol, produção de aromas ou de enzimas de interesse, etc.), mas, por vezes, não satisfazem os enólogos em todo o percurso tecnológico da produção de vinho. Foram efectuados numerosos estudos sobre a co-fermentação de mostos com, ao mesmo tempo, S. cerevisiae e outras espécies de leveduras susceptíveis de interferir no equilíbrio organoléptico final do vinho. Entre estas, foi estudada particularmente a adição qualitativa potencial de leveduras não-Saccharomyces ao nível das fermentações enológicas, nomeadamente a nível da expressão aromática. Uma análise dos resultados experimentais obtidos mostra que, em geral, estas espécies têm dificuldades de desenvolvimento em meio fermentativo, e são, sobretudo, facilmente eliminadas pelo crescimento simultâneo de Saccharomyces, devido à sua extrema sensibilidade ao etanol. Neste âmbito, foi algumas vezes testada com sucesso a nível industrial a associação totalmente empírica de várias estirpes de leveduras, porque permite, combinar interesse tecnológico (boas cinéticas de fermentação e bom rendimento de transformação açúcar/etanol) e rendimento qualitativo ao nível do produto final (maior diversidade e complexidade aromática). É interessante notar que, em todos os casos estudados, foi realizada uma análise nos produtos de fermentação obtidos, sem considerar as cinéticas de fermentação. É necessário igualmente observar que, embora seja reconhecido que fortes interacções entre estirpes de leveduras



(Saccharomyces/Saccharomyces e Saccharomyces/não-Saccharomyces) possam ter lugar em co-inoculação, nenhum estudo fundamentado dos mecanismos subjacentes foi realizado. Que estirpes utilizar ? Entre as 200 estirpes de Saccharomyces cerevisiae já comercializadas à escala mundial, é ainda possível procurar pares de estirpes que apresentem complementaridades para “tirar partido” das respectivas vantagens de cada uma das estirpes. Este método foi pouco estudado, visto que requer um estudo exaustivo de cada uma destas estirpes, ainda não efectuado actualmente. Poucas estirpes indígenas (não-Saccharomyces) estão seleccionadas e são conhecidas por exercerem um impacto organoléptico ao longo da fermentação. Muitas apresentam frequentemente defeitos organolépticos prejudiciais à qualidade organoléptica final procurada ou condições de utilização demasiado restritas. Entre as leveduras potenciais, continuam a ser interessantes as Torulaspora delbrueckii, Hansenula anomala e Candida stellata, por serem susceptíveis de fermentar uma grande parte de açúcar do mosto, de influir ao mesmo tempo na acidez volátil (geralmente baixa), e de aumentar de maneira significativa as concentrações em álcoois superiores e em ésteres dos vinhos. O objectivo principal da utilização destas estirpes é, portanto, o melhoramento organoléptico dos vinhos neutros (geralmente brancos). Inoculação simultânea ou sequencial ? Os estudos realizados no nosso departamento mostraram que, para a utilização de pares de estirpes de Saccharomyces cerevisiae, as inoculações simultâneas com proporções conhecidas de cada estirpe podiam ser realizadas com sucesso, obtendo um efeito significativo na qualidade do vinho final. No que se refere à utilização de pares de estirpes Saccharomyces/não-Saccharomyces, os estudos realizados mostraram que continuava a não ser possível controlar a duração de sobrevivência das estirpes não-Saccharomyces através das variações da relação inicial de inoculação. Nestas condições, somente as inoculações sequenciais devem ser realizadas. Não é, contudo, tão necessário procurar insistentemente uma forte sobrevivência da estirpe não-Saccharomyces na fermentação. Neste sentido, os resultados obtidos mostram, portanto, que é necessário tentar reproduzir a sucessão natural de diversas espécies de leveduras para a utilização destes pares de estirpes.

Contudo, podem verificar-se interacções entre estirpes … Quando duas estirpes de levedura se desenvolvem e fermentam de forma simultânea no mesmo meio, podem ocorrer trocas de metabolitos entre as diferentes estirpes, podendo provocar modificações sensíveis nas propriedades cinéticas de cada uma das estirpes, podendo, igualmente, provocar fortes modificações dos produtos finais de fermentação. Um estudo realizado no nosso departamento num modelo de culturas mistas Saccharomyces uvarum/Saccharomyces cerevisiae permitiu observar uma troca de acetaldeído entre as duas protagonistas. Este tema está a ser actualmente estudado, no âmbito de uma tese, por avaliação da resposta de várias estirpes industriais à eliminação ou, pelo contrário, à adição de acetaldeído durante as fases iniciais de crescimento, em relação às cinéticas fermentativas e à produção de sub produtos. Alguns exemplos : Levedura mista S. cerevisiae / S. cerevisiae Foram utilizadas duas estirpes de Saccharomyces cerevisiae: a estirpe “A”, conhecida pela sua cinética de fermentação e a estirpe “B” pelas suas qualidades organolépticas (libertação importante de polisacáridos). Contudo, a estirpe “B” apresentava frequentemente finais de fermentação difíceis. A associação potencial desta estirpe a uma outra conhecida pelas



suas propriedades de fermentação permite obter uma união que combinaria as qualidades tecnológicas das duas estirpes. Diferentes proporções de inóculo foram testadas à escala laboratorial, assim como à escala industrial. Figura 1 : influência da relação de inoculação na eficácia dos finais de fermentação, que revelam um efeito de sinergia entre as estirpes de levedura em associação (mosto de

Mourvèdre). O comportamento de uma inoculação mista não é, portanto, proporcional à relação de inoculação; pelo contrário, evidencia a existência de interacções entre as estirpes. Tendo em conta o grande número de fermentações realizadas tanto à escala de laboratório como à escala piloto com este modelo, podemos dizer que a cultura mista parece ser um meio eficaz para corrigir defeitos cinéticos de uma estirpe (Figura 1). A evolução ao longo do tempo dos polisacáridos, libertados ao longo das fermentações realizadas à escala piloto nos mostos Mourvèdre, mostra igualmente as diferenças significativas entre os ensaios (Figura 2). Como mostra a evolução da tonalidade dos polisacáridos precipitados, existem interacções polsacáridos/taninos que acontecem precocemente ao longo da fermentação. A estirpe “B” induziu uma evolução mais precoce destas interacções em comparação com a estirpe “A”. As tonalidades das amostras relativas às culturas mistas continuam a ser intermédias em relação às tonalidades obtidas pelas amostras provenientes das fermentações puras.

Souche A

Souche B

40% A, 60% B

30 %A, 70% B

20% A, 80% B

Efficacité des fins de ferm

entations

(%)

0

20

40

60

80

100

120



Figura 2 : Influência da relação de inoculação na qualidade e nos parâmetros da cor dos polisacáridos libertados no mesmo momento das fermenrtações (mosto de Mourvèdre).

As tonalidades das amostras relativas às culturas mistas são intermédias quando comparadas às tonalidades obtidas pelas amostras provenientes das fermentações puras. Os vinhos obtidos foram sujeitos a uma avaliação sensorial que mostrou que os vinhos elaborados a partir de inoculações mistas não são significativamente diferentes dos vinhos cuja fermentação foi efectuada somente pela estirpe “B”. Leveduras mistas S. cerevisiae / não-Saccharomyces Diversas estirpes de leveduras não-Saccharomyces foram inoculadas num mosto branco (Maccabeu) numa população de 106 células por ml; 35 horas após esta inoculação, foi inoculada numa dose de 7 g/hl uma estirpe comercial de S. cerevisiae (sob forma de levedura seca activa). Após a fermentação completa do mosto, os vinhos foram analisados para verificação da concentração em ésteres (Figura 3 e 4), e submetidos a um painel de prova para classificação. Os perfis de ésteres voláteis obtidos na inoculação sequencial são muito diferentes dos obtidos na fermentação pela S. cerevisiae. Além disso, de acordo com a estirpe de não-Saccharomyces inoculada, os perfis obtidos são diferentes. Nenhum dos vinhos obtidos apresentava qualquer defeito (nem em análise sensorial, nem em análise química clássica).

a* (couleur rouge)

4 6 8 10 12 14

b* (couleur jaune)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Souche B

Souche A

60% souche B, 40% souche A

70% souche B, 30% souche A

Moût initial



Figura3 : Incidência de uma inoculação preliminar de T. delbrueckjj durante 35 horas nas

quantidades relativas de ésteres produzidos (mosto de Maccabeu).

Figura 4 : Influência de um inoculação preliminar de C stellata durante 35 horas em

quantidades relativas de ésteres produzidos (mosto de Maccabeu). A prova, por um painel especializado, dos vinhos obtidos permitiu quantificar a nível olfactivo (O) e gustativo (G) as diferenças entre os vinhos fermentados por inoculação mista sequencial e os vinhos fermentados pela S. cerevisiae (Figura 5 e 6). Com a utilização de T. delbrueckjj (Figura 5), as notas de “picante”, de “maça”, de “banana”, de “animal”, de

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

160%

180%

200%

Acétate d'isoamyle

Butanoate d'éthyle

Hexanoate d'éthyle

Acétate d'hexyle

Octanoate d'éthyle

Décanoate d'éthyle

100 % = valeur du témoin fermenté par S. cerevisiae

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

160%

180%

200%

Acétate d'isoamyle

Butanoate d'éthyle

Hexanoate d'éthyle

Acétate d'hexyle

Octanoate d'éthyle

Décanoate d'éthyle

100 % = valeur du témoin fermenté par S. cerevisiae



“citrinos” são reduzidas e caracteriza-se gustativamente pelo nível de doçura e de volume na boca. O vinho obtido apresenta diferenças marcadas em comparação com o vinho testemunha nas seguintes características: “especiarias doces”, “frutos cozidos”, “floral”, “gordura” e “doçura”. Com a utilização de C. stellata (Figura 6), as notas de “pêra” e de “banana” aumentaram consideravelmente durante a inoculação sequencial. As notas de “maça”, “vegetal” e “picante” foram reduzidas. Na boca, o vinho obtido com inoculações mistas é bastante semelhante ao vinho testemunha.

. Figura 5 : Perfil sensorial médio do vinho fermentado unicamente por S. cerevisiae (traço maior) e do vinho fermentado pela inoculação mista sequencial T. delbrueckjj/S. cerevisiae

(traço ponteados) (mosto Maccabeu).



Figura 6 : Perfil sensorial médio do vinho fermentado unicamente por S. cerevisiae (traço maior) e do vinho fermentado pela inoculação mista sequencial C. stellata/S. cerevisiae

(traço ponteados) (mosto Maccabeu). Conclusões : A utilização de culturas mistas de leveduras Saccharomyces/Saccharomyces e Saccharomyces/não-Saccharomyces representam, a partir de agora, um novo meio para desenvolver a complexidade da estrutura gustativa dos vinhos. As modalidades de utilização destas culturas, dependendo das estirpes a utilizar e dos perfis finais procurados, requerem mais investigação. No entanto, os resultados já obtidos evidenciam que, de facto, existe uma dominância sucessiva de populações de leveduras não-Saccharomyces seguidas de leveduras Saccharomyces que permite um aumento homogéneo das concentrações em ésteres, compostos essenciais do aroma fermentativo dos vinhos. Assim, a escolha de uma inoculação sequencial de estirpes utilizadas numa cultura mista continua a ser privilegiada, em detrimento de uma inoculação mista directa para harmonizar e intensificar a complexidade aromática dos vinhos. O desenvolvimento de inóculos mistos baseados nestes dados, permitirá ao enólogo dispor de utensílios inovadores que lhe permitem exprimir o melhor possível as potencialidades aromáticas da sua colheita, garantindo ao mesmo tempo fiabilidade nas fermentações. Notas bibliográficas : Languet P., Salmon J.M., Ortiz-Julien A., 2004. Development of a mixed ADY starter. 7th International Symposium on Innovations in Enology, « Quality, Typicity and Originality of Wine, Optimisation Methods », Stuttgart, 10-11 mai 2004. Cheraiti N., Guezenec S., Salmon J.M., 2005. Redox interactions between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum in mixed culture under enological conditions. Applied and Environmental Microbiology, 71(1), 255-260. Salmon J.M., Savin M. 2005. L’inoculation séquentielle favorise des vins blancs plus complexes. Réussir Vigne, Septembre, 111, 31. Languet P., Aguera E., Samson A., Ortiz-Julien A., Salmon J.M. 2005. Valorisation aromatique des moûts par l’utilisation séquentielle de levures d’espèces não-Saccharomyces et Saccharomyces. Revue des Oenologues, 117, 31-33.

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