cultura de cÉlulas - ff.ul.ptsantoscostaq/santoscostaq/mac_virologiaclinica_files/... · tipos de...

Quirina Santos-CostaURIA-CPM, FFUL

Parte III:

1.CULTURA DE CÉLULAS

a)Objectivo

b)Tipo de Culturas Celularesc)Passagem das Células

2.COLECÇÃO DE CÉLULAS

a)ECACC

b)ATCC

c)NIH

3.MEIOS DE CULTURA

4.Como escolher um meio

5.Constituintes básicos do meio de cultura

6.DESCONGELAÇÃO: COMO INICIAR UMA CULTURA

7.TRIPSINIZAÇÃO

8.CONTAGEM DE CÉLULAS

CULTURA DE CÉLULAS

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


Objectivo: Isolamento viral a partir de material biológico adequadoPropagação in vitro de vírus já isolados

Condições:

CULTURA DE CÉLULAS

EsterilidadeFrascos de cultura em plástico ou vidro tratadosMeios de cultura*Estufa de CO2

Microscópio invertidoHote de fluxo laminar vertical

*Meios de cultura: satisfação das exigências nutricionais das células

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


TIPOS DE CULTURAS CELULARES

Modo de propagação: 1. Suspensão2. Monocamada

Natureza das células:1. Primárias2. Secundárias3. Contínuas

Morfologia das células:1. Epiteliais2. Fibroblásticas3. Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9



Modo de propagação:

1. Suspensão: as células crescem sem estarem aderentes entre si ou ao suporte sólido (paredes interiores do frasco de cultura ou outro recipiente onde estejam a ser cultivadas)

2. Monocamada: crescem aderindo ao suporte sólido e entre si. Estas células necessitam, para serem transferidas para outro suporte sólido, de serem dissociadas entre si e do suporte sólido onde se fixaram (métodos enzimáticos e/físicos).

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


Natureza das células

Células primárias: resultam directamente de um órgão ou tecido animal;têm uma vida limitada.

Células secundárias: Derivam de subculturas das células primárias;Podem atingir as 50 passagens ou subculturas.

Células contínuas: Derivam de tecidos cancerosos ou de células primárias e secundárias que sofreram transformação;Têm a capacidade de se multiplicarem ilimitadamente, sem inibição de contacto e com grande rapidez.


II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9



Modo de propagação: 1. Suspensão2. Monocamada

Natureza das células:1. Primárias2. Secundárias3. Contínuas

Morfologia das células:1. Epiteliais2. Fibroblásticas3. Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


COLECÇÃO DE CÉLULAS

Será possível introduzir, propagar, consolidar e disseminar erros durante a manipulação numa linha celular?

Sim, repare-se que, muitos contaminantes são invisíveis ao olho nu (micoplasma ou vírus que não induzem efeito citopático), ou seja existem contaminações inaparentes!

Sistematizam as técnicas de culturaCrioconservação em Azoto LíquidoTécnicos permanentes e especializadosControlo de Qualidade para contaminações microbianas, nomeadamente o MicoplasmaGarantem a identidade e a pureza da linha celularRecomendações

características a linha celularcomo manter a linha celularcomo lidar com dificuldadesqual o meio de cultura apropriadoqual o material necessárioquais as condições de incubação, etc.formulários de encomendaquem pode depositarcomo pode depositaretc.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


AS “MEGASTORES”European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), HLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, UK. Telephone (44) 980610391; fax (44) 980 611315.

“Description of holdings: 1200 cell lines and hybridomas, 250 HLA-defined cell lines, and approximately 7000 human genetic and chromosome abnormality cell lines (2000 stored as untransformed lymphocytes).”

American Type Culture Collection (A TCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. Telephone (301) 991 2600; fax (301) 231 5826.

“The A TCC has a large and comprehensive stock of material built up over a considerable period of time. A certain number of deposits carry 'certified cell line' status and extensive testing programmes have been carried out on this material. The whole of the collection comprises over 3200 cell lines and hybridomas from approximately 75 different species.”

National Institute of Health (NIH)About us….

“The NIH AIDS Reagent Program evolved from a small bank of HIV research materials into a unique worldwide resource of state-of-the art reagents for HIV and other pathogens. Many of these reagents are not commercially available. The first Catalog, published in 1988, listed 62 reagents from 20 contributors. Reagents are shipped to scientists all over the world. The value of the NIH AIDS Reagent Program is evident from the diversity of registered users; as of June 2003, scientists from the US and 65 foreign countries registered to receive reagents. During the past year over 14,000 reagents were provided. US scientists obtaining AIDS reagents from the program work primarily in academ-ic settings.”

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9

http://www.aidsreagent.org/























http://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfm












http://www.ecacc.org.uk/




















COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR

EPITELIAL: 293T

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9



EPITELIAL/FIBROBLÁSTICA: GHOST (derivadas das Hos=osteosarcoma humano)

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


FIBROBLÁSTICA:Vero; Fibroblastos de Salmão, MRC-5


II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


LINFOCÍTICA:Linfócitos humanos mortos…


II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


SUSPENSÃO: J774

LINFOBLASTÓIDE PROMONOCÍTICA: U937


II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


MEIOS DE CULTURA

De um modo geral as células requerem um ambiente estéril, componentes nutricionais, pH e temperatura estáveis.Hoje em dia já existem várias formulações de meios de cultura disponíveis, de acordo com o tipo de cultura com que se está a trabalhar.

Exemplos:• BME (basal medium Eagle´s)• EMEM (minimum essencial medium with Earl´s salts)• DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium, meio sintético complexo)• RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio sintético complexo)• CMRL (basal médium designed for serum-free formulations)• D-22 (basal medium for insect cell culture)

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


COMO ESCOLHER UM MEIO?

a. Tipo de célulasi. Aderentes (Vero)ii. Suspensão (Ly Humanos)iii. Tipo de densidade celular (baixa, para clonagens: 293T, meio com HEPES)(elevada: bio-reactores com densidades na ordem do s108células/mL)

b. Sistemas estáticosSão os sistemas clássicos de cultura em frasco deitado ou na vertical, em laboratório de baixa ou média produtividade.

c. Sistemas dinâmicos ou perfusão contínua (sistema aberto)O meio terá que ter à partida todos os nutrientes necessários para a duração da cultura, nomeadamente em termos de fontes de energia, mas tendo em conta que a degradação destes aumenta os níveis de toxicidade. Portanto podem ser introduzidos controladamente no meio.II M

AC VIRO

LGO

IA C

LÍNIC

A QSC

_09

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.html
























http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1
























CONSTITUINTES BÁSICOS DO MEIO?

a. Água

b. Sais inorgânicos (oligoelementos)• Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3-• Mantêm o potencial de membrana• São co-factores nas reacções ezimáticas intracelulares • Factores de adesão (tripsinização)

c. sistemas tampão O meio de cultura necessita de sistemas tampão para compensar a evolução do CO2, libertado pelas células e da produção de ácido láctico, resultante do metabolismo da glucose.

Explos (não tóxicos, com pKa=6,1):• Bicarbonato• Fosfato

A conjugação da concentração de bicarbonato e a tensão de CO2 promove a osmolaridade e pH correctos.

d. hidratos de carbono• Glucose• Maltose • Sacarose• Frutose• Galactose

A glucose é o hidrato de carbono mais usado como fonte de energia do meio.

e. Indicadores de pH• Vermelho de fenol (2mg/L)

Qualquer que seja o meio requer a presença de um indicador de pH, que nos chamará mais facilmente à atenção para as alterações que possam ocorrer devidas ao metabolismo das células.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


f. vitaminas • Ácido para-amino benzóico• Biotina• Ácido fólico• Ácido nicotínico• Riboflavina• Tiamina• Inositol• Vit. B12• Vit. E• Vit. A

São intervenientes em numerosos processos metabólicos.

g. Aminoácidos essenciais• Arginina• Cisteína• Prolina• L-Glutamina, etc.

h. lípidos (ácidos gordos)• Colesterol• Ácido linolénico e linoleico• Ácido palmítico, etc.

É um dos componentes fornecido pelo soro.

CONSTITUINTES BÁSICOS DO MEIO?

i. SUPLEMENTOSi. Hormonasii. Soroiii. P r o t e í n a s e péptidos para meios sem s o r o ( a l f a - g l o b u l i n a , fibronectina, albumina e transferrina)iv. A n t i b i ó t i c o s e Antifúngicos• Gentamicina (50ug/mL)• Penicilina (100UI)/mL / Estreptomicina (50ug/mL)• A n f o t e r i c i n a B (fungisona)

Mantêm a esterilidade do meio, mas numa escala industrial estão ausentes.Não podem ser citotóxicosTêm que ser de largo espectro, e induzir o mínimo de resistênciasAtenção à relação custo/benefício.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


MEIOS COM SORO, PORQUÊ?

Em 1950 o primeiro meio com soro teve um sucesso imenso, porque este aditivo fornecia elementos essenciais, mas desconhecidos, ao meio, e de uma forma empírica:

• Factores de Crescimento (estimulam e aceleram o crescimento e diferenciação celular; previnem os processos de Apoptose)

o EGF, IL-6, PDGF, Insulina• Albumina

o liga-se aos iões tóxicos, funcionando como agente desintoxicante;o é um “carrier” de Vit. lipossolúveis e esteróideso é um factores de protecção contra os choques físicos das pipetagens, etc.

• Factores de Adesão celularo Fibronectinao Lamininao Fetuína

• Transportador do ião Fe+++. O complexo Transf/Fe+++ é fundamental nos receptores celulares.

o Transferrina• Antiproteases (previne a degradação proteolítica das células e do próprio meio)

o Alfa1-antitripsina (tripsinização) Alfa2-macroglobulina

TIPOS DE SOROFCS (soro bovino fetal)NCS (soro de recém-nascido de vitela), com altos teores de biotina.Várias espécies animais e de animais de diferentes idades.Os soros de animais adultos não são tão eficientes, porque não são tão ricos.São obtidos no matadouro, por punção cardíaca asséptica, ou por animais “dadores”.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


MEIOS SEM SORO

Sempre que possível seria desejável que não se usasse soro nos meios de cultura:

É um componente empírico e com elementos não quantificados (albumina); Não pode ser usado no fabrico de produtos bio-farmacêuticos; Não pode ser usado em técnicas que requerem um meio sintético de composição bem definida e conhecida, nomadamente em estudos de factores de crescimento, citocinas, moléculas de adesão, etc.; Pode transportar vírus ou factores de inibição.

O meio sem soro: É reprodutível; Não tem factores desconhecidos.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


TÉCNICA DE DESCONGELAÇÃO:COMO INICIAR UMA CULTURA

Processo rápidoLibertar do DMSO que é tóxico. Lançar as células em cultura (Controlo de qualidade do processo de CONGELAÇÃO: Descongelar uma ampola criopreservada com 24h, para que se veja se a congelação foi eficiente e se as células têm boa viabilidade).

I. A partir de Frascos de Cultura, transportados à T. A.

O frasco de Cultura vem com o volume completo até ao máximo, de modo a evitar entradas de ar o contaminações. Assim que chega ao laboratório, as células devem ser passadas de imediato, para evitar o prolongamento do sofrimento de ausência de temperatura ideal e % de CO2.

1. Transferir a suspensão ou fazer uma desagregação por enzimática (tripsinização), química (EDTA) ou mecânica (cell-scrapper) para tubo(s) estéril de 50mL 2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4ºC3. Rejeitar o sobrenadante por decantação.4. Ressuspender as células na quantidade de volume de Meio de Cultura adequado. 5. Transferir para frasco de cultura de cultura adequado6. Examinar ao MO invertido

Incubar em estufa 37ºC, 5%CO2.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


TÉCNICA DE DESCONGELAÇÃO:COMO INICIAR UMA CULTURA

II. A partir de Criotubos, transportados em Gelo Seco (-20-30ºC)

Material:

Material técnico protector (luvas, bata, protector dos sapatos, óculos ou viseira)Câmara de fluxo estabilizadaEstufa CO2Banho a 37ºC Frasco de cultura T25 identificado com: Nome do técnico; data; nº de passagem tipo de culturaMarcadorFalcon50mLPipetas graduadasPipetador automáticoSuporte com gelo1 Criotubo com células J774 Suspensão40mL Meio RPMI 1640 N, pré-aquecido1 Criotubo com células aderentes40mL Meio DMEM N, pré-aquecidoCentríuga JOUANÁlcool 70º

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


PASSAGEM DE CÉLULAS

Passagem das células ou subcultura:

Consiste na d issoc iação, por acção enzimática (tripsina) ou física (raspadores), de uma cultura celular e utilização das células daí resultantes para estabelecer uma nova cultura.

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


TRIPSINIZAÇÃO

Objectivo: Libertar as células do suporte sólido (parede do frasco de

cultura) e dissociar as células entre si.

Material:frascos de culturaTripsina-EDTAPBS sem Ca2+ nem Mg2+

Meio Dulbecco’s DMEM completo:•1mM L-Glutamina•1mM piruvato de sódio•1mM A.A. não essenciais•10% (v/v) soro bovino fetal•2,5 µg/ml fungizona•50 µg/ml gentamicina

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


TRIPSINIZAÇÃO

Técnica adaptada à aula prática de Virologia:

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


CONTAGEM DE CÉLULAS EM

HEMATÍMETRO DE NEUBAUER

1 2

3 4

N/4 * 105 células / ml

1m

1m

Altura= 0,1 mmÁrea= 1mm*1mm=1mm2

Volume= 0,1mm3

N (1+2+3+4) 0,1 µL 4

X 1000 µL

Diluição com Azul de Tripan 1/10 (90 µL + 10 µL)

II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9


BIBLIOGRAFIA


http://www.atcc.org/

http://www.cdc.gov/


http://www.invitrogen.com/

http://www.nuncbrand.com/

http://www.sigmaaldrich.com/II MAC V

IROLG

OIA

CLÍN

ICA Q

SC_0

9

cultura de cÉlulas - ff.ul.ptsantoscostaq/santoscostaq/mac_virologiaclinica_files/... · tipos de...

Documents