• O “feito” de Chagas, considerado único na história da medicina, constitui um marco decisivo na história da ciência e da saúde brasileiras.Trazendo uma contribuição inovadora ao campo emergente da medicina tropical e dos estudos sobre as doenças parasitárias transmitidas por insetos-vetores.

• A preocupação comum a todos os que se associam ao legado de Carlos Chagas, com o objetivo de disseminá-lo entre as novas gerações, nas instituições de ciência, saúde e educação e nos tantos outros espaços da vida social do país e do continente americano: suscitar a reflexão sobre o passado, e, a partir do presente, pensar os desafios que nos convidam a planejar o futuro.

• A doença de Chagas, uma infecção

parasitária amplamente distribuída na

América Latina, é um problema grave de

saúde pública com conseqüências

devastadoras em termos de morbidade e

mortalidade humana. A enzima cruzaína é a

principal cisteíno protease do Trypanosoma

cruzi, agente etiológico da tripanossomíase

Americana, e foi selecionada como alvo

atrativo para o desenvolvimento de novos

fármacos tripanocidas.

• A doença se apresenta como grande causa

de mortalidade, afetando cerca de 18

milhões de pessoas no continente

americano e causando 21.000 mortes, a

cada ano. Atualmente, estima-se que 100

milhões de pessoas estejam sob risco de

contaminação nos 18 países da área

endêmica da doença

• A Cruzaína é membro da superfamília papaína, mas diferente de outras enzimas deste tipo, apresenta uma extensão C-terminal atípica contendo 130 aminoácidos altamente glicosilados, com função desconhecida e não requeridos para a atividade proteolítica. Apesar de seu papel desconhecido, o domínio C-terminal representa a porção mais imunogênica da cruzaína em indivíduos naturalmente infectados.

• Esta enzima pertence a uma família de genes polimórficos, cuja expressão é regulada diferencialmente entre as variadas formas do parasito. Os genes que a codificam estão dispostos em tandem, localizados em 2 a 4 cromossomos distintos nas diferentes cepas de T. cruzi.

• A cruzipaína ou cruzaína é uma glicoproteína sintetizada na forma de zimogênio, que é ativado pela clivagem do pró-domínio N-terminal para gerar a protease madura. A enzima madura apresenta uma região catalítica com alta similaridade à catepsina L, sendo caracterizada como uma endopeptidase com especificidade semelhante a da catepsina L .

• A expressão simultânea dos diferentes genes leva a produção de uma mistura complexa de isoformas. As isoformas reunidas no grupo denominado cruzipaína 1 diferem entre si essencialmente no domínio C-terminal, em sua seqüência de aminoácidos e em seu padrão de N-glicosilação.

• A cruzipaína é expressa por diferentes cepas de T. cruzi e em todos os seus estágios de desenvolvimento. Nas epimastigotas, a cruzipaína encontra-se primordialmente em organelas denominadas reservossomos. É nesta forma que a proteína apresenta sua maior abundância. Nas amastigotas, sua localização é dada majoritariamente na superfície celular, enquanto que nas tripomastigotas situa-se nos lisossomos e na bolsa flagelar.

• Cruzaina, a principal cisteína protease do

Trypanosoma cruzi, é uma enzima essencial para o

cilo de vida do parasita e tem sido validado como um

alvo viável para tratar Doença de Chagas.

• Exerce papéis importantes na sobrevivência do

organismo, incluindo imunoevasão, aquisição de

nutrientes, crescimento, sobrevivência no organismo

hospedeiro e diferenciação parasita. Além do mais, é

de extrema importância na modulação da resposta

imune frente à infecção e a ausência de redundância

desta enzima faz com que os parasitas fiquem

vulneráveis à inibição da cruzaína. Recentemente,

K11777 ( um inibidor seletivo de cruzaína) tem

demonstrado a erradicação da infecçãp T. cruzi na

cultura de células, de ratos e cachorros. Estes

estudos provam que os inibidores de protease

cisteína poderiam servir como um agente para

intervenção quimioterápica viável.

• A cruzaína sua completa purificação foi feita por Bontempi e colaboradores (1984), a partir de epimastigotas cultivadas em meio livre de células, através de um procedimento seqüencial de fracionamento utilizando técnicas cromatográficas.

• A estrutura tridimensional da cruzaína (forma recombinante da cruzipaína, truncada na extremidade C-terminal) foi complexada com o inibidor peptídico irreversível Z-Phe-Ala-fluorometil cetona, através da técnica de cristalografia por difração de raios-X.

• A estrutura cristalográfica revelou que é composta por uma cadeia polipeptídica de 215 resíduos de aminoácidos, estruturada em dois domínios: um predominantemente formado por alfa-hélices e o outro constituído por interações do tipo folhas beta antiparalelas. A tríade catalítica da cruzaína é composta pelos resíduos Cys 25, His 159 e Asn 175 . Tanto a tríade catalítica, como o sítio global de ligação ao substrato, são encontrados em uma fenda entre os dois domínios.

• A cruzipaína possui forte atividade endopeptidásica, agindo sobre substratos como azocaseína, albumina de soro bovino, hemoglobina e algumas proteínas solúveis de T. cruzi. Interage com seus substratos através dos subsítios (S4 - S4’) presentes na região do sítio ativo, onde cada um deles apresenta especificidade variada a diferentes resíduos de aminoácidos.

• Cruzaina trata-se de um tiol-protease

da família papaína (sensível a E-64 e cistatina), capaz de degradar substratos protéicos de alto peso molecular, tanto em pH neutro quanto ácido.

• Empregando anticorpos monoclonais a-GP57/51, verificou-se que o antígeno tinha um padrão delocalização eminentemente lisossomal.

• Contendo vários sítios preditivos de N/O-glicosilação, esta extensão C-terminal une-se ao domínio catalítico (central) através de uma sequência (tipo-dobradiço) rica em treonina e prolinas. Os flancos da dobradiça continham sequências sensíveis à clivagem por mecanismos autoproteolíticos.

• Confirmaram seu caráter sendo como imunoprotetor.

• Estudos indicaram que cruzipaína era inativada eficientemente por compostos que apresentavam resíduos aromáticos volumosos na posição P2

• Não obstante o progresso alcançado no desenvolvimento de fármacos capazes de inativar cruzipaína, o mecanismo de ação destas enzimas ainda não foi bem esclarecido.

• Cruzipaína hidrolisa peptídeos que apresentam as sequências flanqueadoras da bradicinina nas moléculas de cininogênios

• Estes resultados sugeriram que os cininogênios (substrato da cruzipaína) são hidrolisados nas regiões de contato entre as membranas plasmáticas do parasito e da célula alvo. Estudos em andamento visam esclarecer se a atividade da cruzipaína (presumivelmente secretada na região da bolsa flagelar) é potencializada por interações com outros elementos da superfície celular.

• Primeiras Descobertas

Carlos Chagas

Descoberta de uma doença humana. Seu agente causal (o protozoário que denominou de Trypanosoma cruzi, em homenagem ao mestre Oswaldo Cruz) e o inseto que o transmitia (triatomíneo conhecido como “barbeiro”) haviam sido por ele identificados, ao final de 1908.

• Considerando que o ergosterol é o principal esterol do T. cruzi, na última década pesquisas vêm sendo orientadas desenvolver um inibidor eficaz do esterol.

• Hoje:

Julio Scharfstein

• Suas pesquisas sobre estrutura e função biológica de proteases do Trypanosoma cruzi subsidiaram o conhecimento sobre a importância da regulação de proteólise extracelular nos mecanismos de virulência e imunopatogenicidade na doença de Chagas.

• Atualmente, apresentou dados indicando que a bradicinina pode induzir atividade imunológica contra o T. cruzi .

• Pacientes com Doença de Chagas desenvolvem sintomas parecidos com gripe durante o estágio agudo, seguido por lesões gastrintestinais e cadiopatia no estágio crônico. O agente etiológico da doença é o parasita protozoário, Trypanosoma cruzi, o qual é comumente transmitido ao hospedeiro humano através da mordida do mosquito, transfusão dr sangue infectado ou transmissão da mãe para a criança. Nifurtimox e benznidazole, as duas drogas usadas no tratamento da doença, tem significantes inconvenientes, como eles são moderavelmente eficazes nos estágios crônicos da infeccção e causam efeitos colateriais severos. Portanto, desenvolver outras formas de tratamento é essencial.

• São várias formas de abordar os tratamentos para a Doença de Chagas, porem estamos abordando :

• Método Cisteína Protease

• T. cruzi possui uma cisteína proteinase semelhante a L-catepsina denominada de cruzipaína (ou cruzaína), que é a principal responsável pela atividade proteolítica em todos as fases do ciclo evolutivo do parasito. Inibidores irreversíveis de cruzipaína do tipo peptidil tais como diazometilcetonas, fluorometilcetonas, alilsulfonas, vinilsulfonas e vinilsulfonamidas, foram investigados como potenciais agentes anti-T. cruzi. Em epimastigotas, inibidores do tipo peptidil bloquearam a maturação de cruzipaína e seu transporte para lisosomas, levando ao acúmulo da sua proteína precursora no complexo de Golgi e à interferência na via de secreção. Utilizando N-piperazinil-F-Ala-homoF-Ala-vinilsulfona-fenila, Engel e colaboradores observaram um aumento no número de vesículas que se dirigem do Golgi para a bolsa flagelar do parasito, interferindo na função do Golgi. Tratamento de camundongos infectados com a peptidil vinilsulfona, N-metilpiperazina-FhomoF-vinilsulfona-fenila, levou à redução da carga parasitária e das lesões cardíacas. O mesmo composto foi utilizado em cães, sendo observada uma regressão do dano do miocárdio induzido pela infecção por T. cruzi. Além disso, outros inibidores de cruzipaína (não do tipo peptidil) que foram estudados incluem acilhidrazidas, aril uréias, ariltiouréias e tiosemicarbazonas.

• http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3LXS

• http://www.plosntds.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pntd.0000825

• http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.dometodo=apresentar&id=K4783543E3

• http://www.fiocruz.br/chagas/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=1

• http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p&nextAction=lnk&exprSearch=515417&indexSearch=ID

• http://www.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ioc.fiocruz.br/pages/informerede/corpo/noticia/2006/outubro/DSCF2708.

• http://pt.wikipedia.org/wiki/Cruzipa%C3%ADna

• http://www.uff.br/RVQ/index.php/rvq/article/viewFile/198/193.

• Todos os sites foram acessados no dia 11/11/2012