http://www.ufpa.br/ccen/quimica/cromatografia_arquivos/page0002.htm

A cromatografia de troca iônica, que geralmente é chamada de cromatografia iônica, refere-se a métodos modernos e eficientes de separação e determinação de íons com base em resinas trocadoras de íons. A cromatografia iônica foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátion e ânion podem ser facilmente resolvidas em colunas de HPLC com resinas trocadoras de cátion e ânions como fases estacionárias. Nesta época, a detecção era feita por medidas de condutividade. Atualmente, outros detectores estão disponíveis p/ a cromatografia iônica.

A cromatografia iônica foi conseqüência de troca iônica, desenvolvida durante o projeto Manhattan para a separação de cátions de terras raras de propriedades semelhantes entre si, com resinas trocadoras de cátions. Esse trabalho monumental, que forneceu a base teórica das separações de troca iônica, após a Segunda guerra Mundial, foi estendido para muitos outros tipos de materiais. Em ultima analise, levou aos métodos automáticos para separação e detecção de aminoácidos e outras espécies iônicas em misturas complexas. O desenvolvimento da técnica moderna HPLC começou no final dos anos 60 mas a sua aplicação na separação de espécies iônicas foi retardada pela falta de um método geral sensível para detecção das espécies iônicas eluídas, como cátions alcalinos e alcalinos terrosos e ânions haletos, acetatos e nitratos. Essa situação foi remediada em 1975, com o desenvolvimento de trabalhos na Dow Chemical Company de uma técnica de supressão do eluente que tornou possível a detecção condutométrica dos íons eluidos.

CROMATOGRAFIA IÔNICA

EQUILIBRIO DE TROCA IÔNICA

Os processos de troca iônica estão baseados em equilíbrios de troca entre íons em solução e íons de

mesmo sinal na superfície de um sólido essencialmente insolúvel de alto peso molecular. Alguns trocadores de íons naturais, como argilas e zeólitas, foram identificados e têm sido utilizados por décadas. Resinas trocadoras sintéticas foram produzidas em meados dos anos 1930 para amolecer água, para deionização de água e para purificação de soluções. Os sítios ativos mais comuns para as resinas trocadoras de cátions são o grupo acido sulfônico – SO3

-H+ , um ácido forte, e o grupo ácido carboxílico –COO-H+, um ácido fraco. Trocadores aniônico contêm grupos amina terciárias – N(CH3)3

+OH- ou grupos de aminas primárias – NH3

+OH- . O primeiro é uma base forte e o segundo, uma base fraca.Quando um trocador iônico de ácido sulfônico é colocado em contato com um solvente aquoso

contendo um cátion Mx+, o equilíbrio de troca estabelece pode ser descrito como onde RSO3-H+

representa um dos muitos grupos sulfônicos ligados a moléculas poliméricas grandes. Analogamente, um trocador que seja uma base forte interage com ânion A-x como mostrado na reação.

Como exemplo da aplicação da lei de ação das massas no equilíbrio de troca iônica, vamos considerar a reação entre um íon com carga monopositiva com a resina de acido sulfônico mantida em uma coluna cromatográfica. A partir da solução neutra, a retenção inicial de íons no topo da coluna ocorre devido à reação

Neste caso, os símbolos (s) e (aq) enfatizam que o sistema contém um sólido e uma fase aquosa. A eluição com solução diluída desloca o equilíbrio da eq.28-5 para a esquerda, fazendo com que parte dos íons B+ na fase estacionaria seja transferência para a fase móvel. Esse íons movem-se então coluna abaixo em uma série de transferências entre as fase estacionarias e móvel.

A constante de equilíbrio Ktr para a reação mostrada na eq. 28-5 toma a formaNeste caso. [(RSO3

- ) x B x+ (s) ] e [RSO3- H + (s)] são concentrações( arigor, atividades) de B+ e H+ na

fase sólida. Rearranjando, temos:Durante a eluição, a concentração aquosa de íons hidrogênio é muito maior do que a concentração dos

íons monopositivos na fase móvel. Alem disso, o trocador tem um numero enorme de sítios de troca relativos aos íons B+ que estão sendo retidos. Assim, as concentrações totais de [H+]aq e de [RSO3

-H+(s)] não são afetadas de modo significativo pelos deslocamentos no equilíbrio.

Portanto, quando [RSO3-H+(s)] > > [RSO3

-B+(s)] e [H+aq ] > > [B+]aq, o lado direito da eq. É essencialmente constante e podemos escrever: onde K é a constante que corresponde à constante de distribuição definida na eq.. todas as eq. Na tabela podem ser aplicada à cromatografia de troca iônica da mesma forma que aos demais tipos que já foram considerados.

Observe que Ktr na eq. Representa a afinidade da resina pelo íon B+ em relação a outro íon(aqui, H+). Quando Ktr for grande, existirá uma tendência da fase em reter B+. Quando Ktr for pequena, tem-se o inverso. Por seleção de um íon de referencia comum, como H+, as razões de distribuição para os diferentes íons com um mesmo tipo de resina podem ser comparadas experimentalmente. Esses experimentos revelam que íons polivalentes ficam presos muito mais fortemente do que espécies monocarregadas. Dentro de um dado grupo, entretanto, aparecem diferenças relacionadas com o tamanho do íon hidratado e com outras propriedades.

EMPACOTAMENTO DE TROCA IÔNICA

Historicamente, a cromatografia de troca iônica foi feita em pequenos leitos porosos formados

durante copolomerização de emulsão de estireno e divinilbenzeno. A presença de divinilbenzeno (usualmente = 8%) resulta em ligações cruzadas que conferem estabilidade mecânica aos leitos. Para tornar o polímero ativo com relação aos íons, grupos funcionais ácidos ou básicos são quimicamente ligados à sua estrutura. Os grupos mais comuns são ácidos sulfônicos e aminas quaternárias.

A figura 2 mostra a estrutura de uma resina ácida forte. Observe que as ligações cruzadas mantêm juntas as moléculas lineares de poliestireno. Os outros tipos de resinas têm estruturas similares, exceto pelo grupo funcional ativo.

Partículas poliméricas porosas não são inteiramente satisfatórias para empacotamento cromatográfico devido à lenta velocidade de difusão das moléculas do analito através dos microporos da matriz polimérica e à compressibilidade da matriz. Para contornar ees problema, dois novos tipos de fase estacionarias foram desenvolvidos e têm uso mais geral do que os tipo polímero poroso e relativamente grande, é recoberto com resina de troca iônica sintética. Um segundo tipo de empacotamento é preparado por recobrimento de micropartículas porosas de sílica, como as usadas em cromatografia de adsorção, com um filme Lino do trocador. Com qualquer tipo, a difusão mais rápida no filme polimérico leva a um aumento da eficiência. Por outro lado, a capacidade de amostra dessa partículas é menor, particularmente para o tipo pelicular.

APLICAÇÕES INORGÂNICAS DA CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

A fase móvel na cromatografia de troca iônica deve ter as mesmas propriedades gerais requerida nos outros tipos de cromatografia. Isto é, deve dissolver a amostra, ter uma força de solvente que leve a tempos de retenção razoáveis e interagir com solutos de modo a levar á seletividade. As fases moveis da cromatografia de troca iônica.

Cromatografia de Troca Iônica em Colunas Supressoras de Eluente

A ampla aplicação da cromatografia iônica para a determinação de espécies inorgânicas foi restringida pela falta de um bom detector genérico que permitisse a determinação quantitativa de íons com base nas áreas dos picos cromatográficos. Detectores de condutividade seriam uma escolha obvia para esta tarefa. Eles podem ser altamente sensíveis, são universais para espécies carregadas e, como regra geral, respondem de modo previsível a mudanças e manutenção baratas, fáceis de serem miniaturizados e comumente funcionam por longo tempo sem problemas. Somente uma limitação dos detectores de condutividade provou ser muito seria e atrasou o seu uso geral. Essa limitação vem da alta concentração de eletrólito necessária para eluir a maioria dos analitos iônicos em um tempo razoável. Em conseqüência, a condutividade dos componentes da fase móvel tende a sobrepujar a dos íons do analito, reduzindo acentuadamente a sensibilidade do detector.

Em 1975, o problema da alta condutância do eluente foi resolvido com a introdução da chamada coluna supressora de eluente imediatamente após a coluna analítica de troca iônica. A coluna supressora é empacotada com uma segunda resina de troca iônica que efetivamente converte os íons do solvente a espécies moleculares de ionização limitada, sem afetar os io0ns do analito. Por exemplo, quando cátions estão sendo separados e determinados, freqüentemente, é escolhido ácido clorídrico como reagente eluente e acoluna supressora é resina de troca aniônica na forma de hidróxido. É evidente que os cátions do analito não são retidos por esta segunda coluna. Para separações aniônicas, a fase estacionaria supressora é a forma ácida de uma resina de troca catiônica. Neste caso, carbonato ou bicarbonato de

sódio serve como agente de eluição. Neste caso, o ácido carbônico muito pouco dissociado não contribui de modo significativo para a condutividade.

Uma inconveniência associada às colunas supressoras originais era a necessidade de regeneração periódica para reconverter a coluna à forma original ácida ou básico . recentemente, entretanto,foram disponibilizados supressores de membrana fibrosa que operam continuamente, como mostra na figura 3. Neste caso, o eluente e a solução supressora fluem em direção oposta, de cada lado de uma membrana permeável de troca iônica, indicada como M. para analise de anions as membranas são de troca catiônicas. Para cátions são de troca aniônica.

Em equipamentos comerciais projetados recentemente, a regeneração de soluções supressoras é feita automaticamente com íons hidroxila ou hidrogênio eletroregenerados de modo que não são necessárias interrupções no uso dos equipamentos.

CROMATOGRAFIA IONICA EM COLUNA ÚNICA

Estão disponíveis no mercado equipamentos para cromatografia iônica nos quais nenhuma coluna supressora é usada. Esta abordagem depende de pequenas diferenças na condutividade entre íons eluídos da amostra e os íons prevalentes no eluentes. Para amplificar essas diferenças, são usados trocadores de baixa capacidade, o que torna possível a eluição com espécies de baixa condutância equivalente. A cromatografia em coluna única tende a ser um pouco menos sensível a ter uma faixa mais limitante do que a cromatografia iônica com coluna supressora. Recentemente, foi descoberto um método fotométrico indireto que permite separação e detecção de anions e cátions que não absorvem sem uso de uma coluna supressora. A figura 5 mostra um cromatograma obtido por esse método. Neste caso, o eluente é uma solução diluída de FTALATO DE SÓDIO e o ÍON deslocado e que absorve no U.V. a detecção indireta apresenta uma faixa de trabalho mais restrita do que a detecção direta.

Aplicações da Cromatografia de Troca Iônica em Sistema Orgânicos e Bioquímicos A cromatografia de troca iônica tem sido aplicada a vários sistemas orgânicos e bioquímicos,

incluindo drogas e seus metabólitos, soros, conservantes de alimentos, misturas de vitaminas, açucares e preparados farmacêuticos. A figura 6 mostra um exemplo dessas aplicações, no 1.10-8 mol de cada um de 17 aminoácidos foram separados por uma coluna catiônica.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE ÍONS

A cromatografia de exclusão de íons não é uma forma de cromatografia iônica porque é a espécie neutra, em vez dos íons, que é separada. Entretanto, convém discuti-la porque a cromatografia de exclusão de íons, como cromatografia iônica, emprega colunas de troca iônica para fazer as separações.

A teoria e as aplicações da cromatografia de exclusão de íons estão convenientemente ilustradas pela separação de ácidos carboxílicos simples apresentada no cromatograma da figura 7. Neste caso, a fase estacionária era uma resina de troca de cátions na sua forma ácida e a eluição foi feita com solução diluída de acido clorídrico.A cromatografia de exclusão de íons encontra numerosas aplicações na identificação e determinação de espécies ácidas em materiais como leite, café, vinho e muitos outros produtos comerciais. Sais de ácidos fracos também podem ser analisados porque são convertidos ao acido correspondente por íons hidrogênio no trocadores. Bases fracas e seus sais também podem ser determinados por cromatografia de exclusão de íons. Nessas aplicações empregam-se uma coluna de troca aniônica na forma de hidróxido.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO

A cromatografia de exclusão por tamanho, também pode ser chamada de cromatografia por permeação em gel ou por filtração em gel é uma técnica poderosa aplicável particularmente a espécies de alto peso molecular. Os empacotamentos para cromatografia de exclusão por tamanho consistem de partículas pequenas de sílica ou de polímeros contendo uma rede de poros uniformes nos quais moléculas do soluto e do solvente podem se difundir. Enquanto estão nos poros, as moléculas estão efetivamente retidas e ausentes do fluxo da fase móvel. O tempo médio de residência nos poros depende do tamanho efetivo das moléculas do analito. Moléculas maiores do que o tamanho médio dos poros da fase são excluídas e essencialmente não sofrem retenção. Essas espécies são as primeiras a serem eluídas. Moléculas com diâmetros significativamente menores do que os poros podem penetrar ou permear através do emaranhado de poros e ficar retidas por tempos maiores. Estas são as últimas a serem eluídas. EMPACOTAMENTO DA COLUNA

Dois tipos de empacotamento para cromatografia de exclusão por tamanho são encontrados: leitos de polímeros e partículas à base de sílica, ambos com diâmetros de 5 a 10mm. O segundo tem vantagens de maior rigidez, que leva ao empacotamento mais fácil e permite o uso de pressões mais altas; maior estabilidade, que permite o uso em uma variedade de solvente, incluindo água; maior rapidez para atingir o equilíbrio com novos solventes e estabilidade em temperaturas mais altas. As desvantagens das partículas à base de sílica incluem sua tendência a reter solutos por adsorção e seu potencial para catalisar a degradação de moléculas do soluto.

Vidros porosos e partículas de sílicas com tamanho médio de poro variando de 40 A a 2.500A(angstron) estão agora disponíveis no mercado. Para produzir a adsorção, as superfícies destas partículas são freqüentemente modificados por reação com substituintes orgânicos. Por exemplo, a superfície de uma fase estacionaria hidrofílica. A tabela 2 lista as propriedades de algumas fases estacionárias comerciais típicas para exclusão por tamanho.

TEORIA DA CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO

O volume total Vt de uma coluna empacotada com um polímero poroso ou sílica gel é dado por:

Vt = Vg + Vi + VoOnde Vg é o volume ocupado pela matriz sólida de gel, Vi é o volume de solvente mantido nos seus

poros e Vo é o volume livre fora das partículas de gel. Considerando que não há mistura nem difusão, Vo também representa o volume teórico de solvente necessário para transportar através da coluna os componentes muito grandes para penetrar nos poros do gel. Mas, na verdade, alguma mistura e difusão irá ocorrer e, em conseqüência, os componentes não-retidos vão aparecer em uma banda de forma gaussiana com concentração máxima em Vo. Para componentes pequenos o suficiente oara penetrar livremente nos poros do gel, o Maximo da banda aparecerá na saída da coluna em um volume de eluente correspondente a ( Vi + Vo). Geralmente, Vi,Vo e Vg são da mesma ordem de magnitude. Assim, uma coluna de gel permite a separação de moléculas grandes das pequenas de uma amostra, com um mínimo de volume eluente.

Moléculas de tamanho intermediário são capazes de transferir para uma fração K do solvente retido nos poros. O volume de eluição Vê para essas moléculas retidas é:

Ve = Vo + K ViA eq. acima aplica-se a todos os solutos na coluna. Para moléculas grandes demais para penetrar nos

poros do gel, K=0 e Ve =0 . Para moléculas que podem penetrar em poros não escondidos, K=1 e Ve = (Vo+Vi). Com adsorção, a quantidade de soluto retido nas intersticialidades irá aumentar. Com moléculas menores, K será maior do que a unidade. Os valores de K variam de zero para grandes moléculas totalmente excluídas até um para moléculas pequenas. A constante de distribuição é um parâmetro valioso para a comparação de dados de diferentes fases estacionarias.

O limite de exclusão define a massa molecular da espécie alem da qual não ocorre retenção. Todas as espécies com massa molecular maior do que o limite de exclusão são grandes demais e não podem ser retidas e eluem juntas para dar o pico ª o limite de permeação é a massa molecular abaixo da qual as moléculas do soluto podem penetrar completamente nos poros. Todas as moléculas abaixo dessa massa molecular são pequenas demais e eluem em uma única banda denominada D. Conforme a massa molecular diminui abaixo do limite de exclusão, as moléculas do soluto gastam mais tempo nos poros das partícula e, portanto, movem-se de modo progressivamente mais lento. Na região de permeação seletiva ocorre fracionamento, gerando picos individuais de soluto com B e C no cromatograma. Aplicação da Cromatografia de Exclusão por Tamanho

Os métodos de exclusão por tamanho são subdivididos em cromatografia por filtração em gel e permeação em gel. A primeira está baseada em solventes aquosos e fases estacionarias hidrofílicas. A segunda está baseada em solventes orgânicos não-polares e fases estacionarias hidrofóbicas. Os métodos são complementares no sentido em que um se aplica a amostras solúveis em água e o outro a substancias solúveis em solventes orgânicos menos polares.

Uma aplicação útil do procedimento de exclusão por tamanho é a separação de moléculas de produtos naturais de alta massa molecular de espécies de baixa massa molecular e sais. Por exemplo, um gel com limite de exclusão de alguns milhares de unidades pode separar claramente proteínas de aminoácidos e de pepitídeos de baixa massa molecular.

Uma outra aplicação importante da cromatografia de exclusão por tamanho é a rápida determinação da massa molecular de polímeros maiores ou de produtos naturais. Neste caso, os volumes de eluição da amostra são comparados com os volumes de eluição da amostra são comparados com os volumes de eluição de uma série de compostos-padrão que possuem as mesmas características químicas.

As vantagens mais importantes desse procedimento incluem: (1) tempos de separação pequenos e bem – definidos [ todos os solutos deixam a coluna entre Vo e (Vo+Vi) na eq.]; (2) bandas estreitas que levam à boa sensibilidade; (3) não há perde de amostra porque o soluto não interagem com a fase estacionaria e (4) não-desativação da coluna devido à interação do soluto com a fase estacionaria.

Desvantagens são: (1) somente um numero limitado de bandas podem ser acomodadas porque a escala de tempo do cromatograma é pequeno e (2) não-aplicável a amostras de tamanhos similares como isômeros. Geralmente, é necessária uma diferença de 10% na massa molecular para resolução razoável.

Cromatografia em Camada Delgada

Os métodos planares de cromatografia incluem cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia de papel (CP) e eletrocromatografia. Cada um usa uma camada relativamente fina e plana de material que é auto-suportado ou reveste uma superfície vítrea, plástica ou metálica. A fase móvel desloca –se através da fase estacionária por ação de capilaridade, algumas vezes assistida por potencial elétrico ou gravitacional bidimensional, embora essa descrição não seja estritamente correta uma vez que a fase estacionaria tem espessura finita.

Como São Feitas as Separações em Camada Delgada

Separações em camada delgada típicas são feitas sobre placas de vidro ou plásticos recobertos com uma camada fina e aderente de partícula finamente divididas. Essa camada constitui a fase estacionaria. As partículas são similares às descritas na discussão sobre adsorção, partição em fase reversa e em fase normal e sobre cromatografia em coluna de exclusão por tamanho. As fases moveis também são similares às empregadas em cromatografia liquida de alta eficiência em coluna. APLICAÇÃO DE AMOSTRA

Aplicação da amostra é talvez o aspecto mais critico da cromatografia em camada delgada, principalmente para medidas quantitativas. Usualmente, a amostra, como solução 0,01 a 0,1% é aplicada como uma mancha de 1 a 2 cm na borda da placa. Para melhor eficiência na separação, a mancha deve ter um diâmetro mínimo- cerca de 5mm para trabalhos qualitativos e menores para analise quantitativa. Para soluções diluídas, são 3 ou 4 aplicações repetidas, com secagem entre elas.

A aplicação manual de amostras é feita trocando um tubo capilar contendo a amostra em uma placa ou usando uma seringa hipodérmica. São oferecidos comercialmente vários aplicadores mecânicos, que aumentam a precisão e exatidão da aplicação da amostra.

Os detectores de absorção UV mais simples são os fotômetros com uma lâmpada de mercúrio como fonte. Comumente, a linha intensa em 254 nm é isolada por filtros. Em alguns equipamentos, as linhas em 250, 313, 334 e 365 também podem ser empregadas fazendo-se a substituição dos filtros. Obviamente esse tipo de detector está restrito a solutos que absorvem em um desses comprimentos de onda. Vários grupos funcionais orgânicos e varias espécies inorgânicas apresentam banda de absorção larga, compreendendo um ou mais desses comprimentos de onda. Fontes de filamentos de deutério e tungstênio com filtros de interferência também proporcionam um meio simples de detectar espécie que absorvem, a medida que são eluídas em uma coluna. Alguns equipamentos modernos são equipados com discos contendo vários filtros que podem ser rapidamente trocados para detectar as varias espécies, conforme elas eluem. Esses dispositivos são úteis principalmente para analises quantitativas repetitivas nas quais a composição qualitativa da amostra é conhecida de modo que uma seqüência adequada de filtros pode ser escolhida. Muitas vezes, a mudança de filtro é controlada por computador.

A maioria dos fabricantes de HPLC oferece detectores que consistem de espectrofotômetro de varredura com redes ópticas. Alguns são limitados à radiação UV.Outros compreendem a radiação UV-Visível. Vários modos de operação podem ser escolhidos. Por exemplo, um cromatograma inteiro pode ser obtido em um único comprimento de onda. Alternativamente, quando os picos eluídos são suficientemente separados no tempo, comprimentos de ondas diferentes podem ser escolhidos para cada pico. Neste caso, o controle por computador é geralmente empregado para selecionar o melhor comprimento de onda para cada eluente. Quando se deseja espectros completos para finalidades de identificação, o fluxo de eluente pode ser interrompido por um período suficiente para permitir a varredura na região do comprimento de onda de interesse.

Os detectores espectrofotométricos UV mais poderosos são os equipamentos com arranjos de diodos. Vários fabricantes oferecem esses instrumentos que permitem a coletas de dados de um espectro inteiro em aproximadamente um segundo. Assim, dados espectrais para cada pico cromatográfico podem ser coletados e armazenados à medida que aparecem na saída da coluna. Uma forma de apresentação dos dados espectrais, útil na identificação de espécies e na escolha de condições para a determinação quantitativa, é uma curva tridimensional como mostrado na figura abaixo.

Neste caso, os espectros foram obtidos em intervalos sucessivos de cinco segundos. O aparecimento e

o desaparecimento de cada dos esteróides no eluente é evidente.

DETECTORES DE ABSORBÂNCIA NO INFRAVERMELHO Dois tipos de detectores de infravermelho são comercializados. O primeiro com varredura de

comprimento de onda feita por três filtros de cunha semicirculares. A faixa desse instrumento é de 2,5 a 14,5mm ou de 4.000 a 690 cm-1.

O segundo, e muito mais sofisticado, está baseado em equipamentos com transformada de Fourier. Vários fabricantes desses equipamentos oferecem acessórios que permitem seu uso como detectores de HPLC.

Celas detectoras de infravermelho tem construção semelhantes às usadas com radiação UV, exceto que as janelas são feitas de NaCl ou CaF2. Os comprimentos das celas variam de 0,2 a 1,0 mm e os volumes de 1,5 a 10 mL.

Os equipamentos de infravermelho mais simples podem ser operados em um ou mais comprimentos de onda. Alternativamente, os espectros dos picos podem ser varridos com interrupção de fluxo no

momento da eluicão. Os instrumentos com transformada de Fourier são usados de modo análogo ao instrumento com arranjo de diodo para medidas de absorbância no UV.

Uma limitação importante no uso de detectores de infravermelho esta na baixa transparência de muitos solventes úteis. Por exemplo, as bandas largas de absorção no infravermelho de água e álcoois impedem o uso desse detector em muitas aplicações.

Os detectores de fluorescência para HPLC têm projetos similares aos fluorímetros e espectrofluorímetros. Na maioria deles, a fluorescência é observada por um detector fotoelétrico posicionado perpendicularmente ao eixo de excitação. Os detectores mais simples empregam uma fonte de excitação de mercúrio e um ou mais filtros para isolar uma banda de emissão de radiação. Os equipamentos mais sofisticados possuem uma fonte de Xenônio e empregam um monocromador de rede para isolar a radiação fluorescente. É provável que, futuramente, detectores por fluorescência usarão fontes de laser sintonizáveis, o que levará a um aumento na sensibilidade e na seletividade.

Uma vantagem inerente dos métodos de fluorescência é sua alta sensibilidade, tipicamente mais de uma ordem de magnitude maior do que a da maioria dos procedimentos de absorbância. Essa vantagem foi explorada na cromatografia liquida para a separação e determinação dos componentes de amostras que fluorescem. Compostos fluorescentes são encontrados freqüentemente na analise de materiais farmacêuticos, produtos naturais, amostras clinicas e produtos de petróleo. Muitas vezes, o numero de espécies fluorescentes pode ser aumentado por tratamento preliminar com reagentes que formam derivados que fluoerscem. Por exemplo, cloreto de dansila ( 5-dimetilamonionaftaleno-1-sulfonilcloro), que reage com aminas primarias e secundarias, aminoácidos e fenóis dando compostos fluorescentes, tem sido muito usado para a detecção de aminoácidos em proteínas hidrolisadas.

DETECTORES DE ÍNDICE DE REFRAÇÃO

A figura mostra esquematicamente um detector de índice de refração diferencial, no qual o solvente

passa através de uma metade da cela no seu para a coluna. O eluido então flui através de outra câmara. Os dois compartimentos são separados por uma placa de vidro montada em um ângulo tal que a curvatura do feixe incidente ocorre se as duas soluções tiverem índices de refração diferentes.

O deslocamento resultante diferente do feixe com relação a superfície fotossensível de um detector causa uma variação no sinal de saída, que é amplificada e registrada, fornecendo um cromatograma.

Os detectores de índice de refração têm uma vantagem significativa por responderem a quase todos os solutos. Isto é, são detectores genéricos, análogos aos detectores de condutividade térmica e de chama da cromatografia gasosa. Alem disso, são confiáveis e não são afetados pela vazão. Entretanto, são altamente sensíveis à temperatura e devem ser mantidos a uma temperatura constante, dentro de um intervalo de alguns milésimos de graus Celsius. Alem disso, não são tão sensíveis quanto a maioria dos outros tipos de detectores.

DETECTOR DE ESPALHAMENTO DE LUZ POR EVAPORAÇÃO

Recentemente, tornou-se disponível no mercado um novo tipo de detector genérico para HPLC, o detector de espalhamento de luz por evaporação – DELE (em inglês, ELSD – evaporative light scattering detector). Neste detector, o efluente da coluna passa por um nebulizador no qual é convertido em nevoa fina por um fluxo de nitrogênio ou ar. As gotículas são então conduzidas através de um tubo com temperatura controlada no qual ocorre a evaporação da fase móvel, levando a formação de finas partículas de analito. A nuvem de partículas de analito passa então através de um feixe de laser. A radiação espalhada é detectada perpendicularmente ao fluxo por um fotodiodo de silício.

A principal vantagem desse tipo de detector é que sua resposta é aproximadamente a mesma para todos os solutos não-voláteis. Alem disso, é significativamente mais sensível do que o detector de índice de refração, com limites de detecção começando em 5 ng/ 25mL.

Detectores eletroquímicos de vários tipos estão atualmente disponíveis, de vários fabricantes. Esses

dispositivos baseiam-se em amperometria, polarografia, coulometria e condutometria.Embora os procedimentos eletroanalíticos ainda não tenham sido tão explorados como detectores

ópticos, eles parecem oferecer vantagens, conveniência e ampla aplicabilidade.Esta ultima propriedade está ilustrada na figura abaixo, que apresenta um quadro dos intervalos de potenciais nos quais ocorre a oxidação ou a redução de 16 grupos funcionais orgânicos.

Em principio, então, espécies contendo qualquer um desses grupos poderiam ser detectadas por procedimentos amperométricos, polarográficos ou coulométricos. Assim a detecção eletroquímica aparentemente teria potencial para atender as necessidades da HPLC que resiste por longo tempo, a saber, ser um detector sensível, gera ou universal.

Várias celas de detectores eletroquímicos/HPLC foram descritas na literatura e varias são produzidas comercialmente. Afigura abaixo é um exemplo de uma cela de fluxo de camada delgada simples para detecção amperométrica .

Neste caso a superfície do eletrodo é parte de uma parede do canal formado pela colocação de uma

tira de teflon de 50 mm entre dois blocos de plástico Kel-F. O eletrodo indicador é de platina, ouro,carbono vítreo ou pasta de carbono. Um eletrodo de referencia, e geralmente também um contra-eletrodo, são localizados corrente abaixo, após o bloco do eletrodo indicador. O volume da cela é de 1 a 5 mL. Uma modificação útil desta cela, disponível no mercado, inclui dois eletrodos de trabalho que podem operar em serie ou em paralelo. A primeira configuração, na qual o eluente flui primeiramente sobre o segundo, requer que o analito sofra uma oxidação (ou redução) reversível no primeiro eletrodo. O segundo eletrodo opera, então, como catodo (ou um anodo) para determinar o produto de oxidação (ou de redução). Esse arranjo aumenta a seletividade do sistema de detecção. Uma aplicação interessante desse

sistema é a detecção e a determinação dos componentes de misturas contendo tiois e dissulfetos. Neste caso, o primeiro eletrodo de mercúrio reduz os dissulfetos a –1,0 V. Isto é,

RRSS + 2 H + 2e- ® 2RSH Um eletrodo de mercúrio posterior é, então, oxidado na presença de tiois da amostra original e

também dos que foram formados no primeiro eletrodo. Isto é, 2RSH + 2 Hg(l) ® Hg(SR)2 (s) + 2H+ + 2e-

Na configuração em paralelo, dois eletrodos estão posicionados, de modo que o eixo entre eles é de 90

graus em relação a corrente. Os dois eletrodos podem ser operados em potenciais diferentes (em relação ao eletrodo de referencia), o que costuma dar uma indicação de pureza de pico. Alternativamente, um eletrodo pode ser operado como catodo e o outro como anodo, tornando possível a detecção simultânea de oxidantes e redutores. DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

Um problema fundamental no acoplamento de cromatografia com espectrometria de massa é o enorme descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes da primeira e os requisitos de vácuo da segunda. Várias interfaces foram desenvolvidas para resolver esse problema. Em uma, disponível no mercado, o eluente da coluna é dividido, e apenas uma pequena fração é introduzida diretamente no espectrômetro de massa.Sistema de introdução direta de liquido parecem promissores quando usados em conjunção com de microdiâmetros, que tipicamente trabalham com vazões de 10 a 50 mL/min. Em um segundo tipo de interface, que também é vendida comercialmente, o efluente é depositada sobre uma correia continua ou sobre um fio que se move e transporta o solvente e o analito para uma câmara aquecida para remoção do primeiro por volatização. Após a evaporação do solvente, os resíduos do analito sobre a correia ou sobre passam pela da fonte de íons na qual ocorre a desorção-ionização.

Uma interface nova e promissora, atualmente no mercado, é a chamada termospray – ou seja, é um termonebulizador que atua como uma interface, permitindo a introdução direta do efluente total da coluna em vazões tão altas como 2 mL/min. Com essa interface o liquido é vaporizado a medida que ele passa através de um tubo capilar aquecido, de aço inoxidável para formar um jato de aerossol de moléculas de solvente e do analito. Na nuvem formada o analito é ionizado através de um mecanismo de troca de carga com um sal, como acetato de amônio que ‘q incorporado ao eluente. Assim, o termonebulizador não é apenas uma interface, mas também uma fonte de ionização. Os espectros resultantes são geralmente simples e fornecem dados de peso molecular porem eles não apresentam os detalhes que fazem os espectros por impacto de elétrons tão úteis para fins de identificação.E ainda mais, o termonebulizador é aplicável somente a moléculas polares de analito e a fases moveis polares que dissolvem um sal como acetato de amônio. Com essas limitações o termonebulizador fornece espectros para um amplo intervalode compostos termicamente estáveis e não-voláteis como peptídeos e nucleotídeos. Foram relatados limites de detecção baixos como 1 a 10 picogramas.

Recentemente foi introduzida no mercado uma nova interface que possibilitou a obtenção de espectros por ionização química ou por impacto de elétrons. Neste dispositivo a nebulizacao térmica e a dessolvatação ocorrem simultaneamente para produzir uma mistura de moléculas de soluto particulado e de molécula da fase móvel gasosa. Este aerossol é acelerado através de um esguicho para a região de vácuo onde as moléculas da fase móvel são bombeadas para fora. As moléculas do analito são então ionizadas por um feixe de elétrons ou quimicamente.

Controle por computador e armazenamento de dados são geralmente usados como detectores de espectrometria de massa. Pode-se obter tanto os cromatogramas em tempo real ou reconstruídos por computador e os espectros dos picos eluídos. Atualmente, os equipamentos pra HPLC/MS ainda não estão completamente desenvolvidos como os equipamentos para GC/MS. No entanto, essa situação deve mudar nos próximos anos.