cromatografia contracorrente na purificação de produtos...

"Cromatografia Contracorrente na purificação de produtos naturais: porque a vida fica mais fácil assim!"

Gilda Guimarães LeitãoUniversidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Pesquisas de Produtos Naturais

O que é....Cromatografia contracorrente ?

Animações criadas pela equipe do Institute of Bioengeneeringda Universidade de Brunel, Londres, Inglaterra. Disponível em http://www.brunel.blip.,tv/file/2046686/

PARTIÇÃO DE UM SOLUTO ENTRE DUAS FASES LÍQUIDAS

IMISCÍVEIS• UMA FORMA DE CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO, SEM SUPORTE SÓLIDO

• DOIS LÍQUIDOS IMISCÍVEIS

• O SOLUTO SE REPARTE DE ACORDO COM SEU COEFICIENTE DE DISTRIBUIÇÃO, K

ALGUMAS VANTAGENS DA TÉCNICA

✓VERSATILIDADE: SISTEMAS DE SOLVENTES, FASE MÓVEL, QUANTIDADE DE AMOSTRA, TIPO DE AMOSTRA, ETC

✓RAPIDEZ, EFICIÊNCIA, BOA RESOLUÇÃO

✓TÉCNICA PREPARATIVA

✓ECONOMIA: COLUNAS (SISTEMAS DE SOLVENTES X COLUNAS), VOLUME DE SOLVENTES, ETC.

✓ALTA TAXA DE RECUPERAÇÃO

✓RECUPERAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA EM FRACIONAMENTOS GUIADOS POR TESTES BIOLÓGICOS

Cromatografia de Partição Líquido-líquido:

Com suporte sólido Sem suporte sólido

AdsorçãoPartiçãoTroca IônicaFiltração em gel

Cromatografia e Distribuição Contracorrente

Campo centrífugo Campo gravitacional

CCDDCCC, RLCC

Um eixo de rotação, CPC

Dois eixos de rotação, HSCCC

Adaptado de www.everseiko.co.jp

http://www.everseiko.co.jp/

Tipos de CCC:

Que utilizam a força gravitacional:

✓Cromatografia Contracorrente de Gotículas (DCCC)

✓Cromatografia Contracorrente de Rotação Locular (RLCC)

EQUIPAMENTOS FORA DE FABRICAÇÃO

Cromatografia Contracorrente de Gotículas (DCCC)

• Modo Ascendente: Fm menos densa

• Modo Descendente: Fm mais densa

• Sistemas de solventes: ALGUMAS LIMITAÇÕES:

FORMAÇÃO DE GOTÍCULAS DE TAMANHO E MOBILIDADE APROPRIADAS

Hostettmann et al.,1984,Nat.Prod. Rep., 1(5), 409-512

DCCC Eyela no Trinity CollegeDublin

Cromatografia Contracorrente de Rotação Locular (RLCC):

• MODO ASCENDENTE E MODO DESCENDENTE

Figuras: Conway, W.D. (1990) Countercurrent Chromatography: Apparatus. Theory

and Applications, VCH Pub.

Tipos de CCC:Que utilizam força centrífuga:

✓ Cromatografia Contracorrente Centrífuga de Partição

✓ Hidrodinâmica (dois eixos de rotação, centrífugas planetárias - HSCCC)

✓ Hidrostática (um eixo de rotação - CPC)

EQUIPAMENTOS MODERNOS

Figura: Berthod, A. et al. 2009, Pure and Appl. Chem., 81, 355-387.

Equilíbrio hidrostática (um eixo de rotação)

Espiral (Coil)

Equilíbrio hidrodinâmico (dois eixos de rotação)

Figura J. Chromatog. A, 658, 315-341 (1994)Foto: cortesia Kromatron, França

Movimento da Espiral e Distribuição de Líquidos dentro da Coluna

Animações criadas pela equipe do Institute of Bioengeneering da Universidade de Brunel, Londres, Inglaterra. Disponível em

http://www.brunel.blip.,tv/file/2046686/

http://www.brunel.blip.,tv/file/2046686/

Trabalhando com CCC

Início do trabalho:

escolha do sistema de solventes ADEQUADO

90% tempo total do trabalho

Y. Ito, J. Chromatogr. A 1065 (2005) 145

Utilização e operação dos equipamentos de CCC:

MODOS DE ELUIÇÃO

cada sistema bifásico = uma “nova” coluna

1. Berthod et al., J. Chromatog. A, 1218, 2011, 6061

2. Berrthod, A. et al., Analytical Chemistry, Vol. 79, No. 9, May 1, 2007

3. Yin, L. et al., Sep. & Purification Reviews, 2010, 33: 39-62

4. Berthod, A., Countercurrent Chromatography: From the Milligram to the Kilogram.

Cap. 9 In: Advances in Chromatography, 47, 209, 322-352.

Modo convencional ou clássico (incluindo modo normal ou reverso)

Dual-mode CCC - mudança da direção de fluxo e da natureza da fase móvel

Eluição-extrusão (elution-extrusion - EECCC)mudança apenas da natureza da fase móvel

CCC multidimensional e 2D-CCC

✓ Gradiente – linear x não-linear•Variação de pH

•pH-zone-refining CCC•Gradiente de pH

ISO

CR

ÁTI

CO

S

Como escolher o sistema de solventes adequado?

Cálculo de k (cromatograficamente)

ESTIMATIVA VISUAL DE k (POR CCD)

Como escolher o Sistema de solventes adequado?

1. CÁLCULO DE k:• CROMATOGRAFICAMENTE

• OUTRAS TÉCNICAS ANALÍTICAS (UV, RMN, IV, etc.)

K = CS/CM

Exemplo: cálculo de K usando CG/DIC

CÁLCULO DO K DA quinona diterpenica 7a-hIdroxI-roileanona de Tetradenia riparia em 4 SISTEMAS DE SOLVENTES DIFERENTES

Dissertação de Mestrado de Jonatas Vicente Milatio

Sistemas de solventes testados para o cálculo de K

Sistema de solventes(v/v)

A Hexano-AcOEt-MeOH-H2O 3:1:3:1.5

B Hexano-Acetona-MeOH-H2O 3:1:3:1.5

C Hexano-ACN-MeOH 1:1:0.5

D Hexano-EtOH- H2O 4:3:1

Evaporação à secura e dissolução na fase móvel

para CGInjeção das fases superior e inferior de cada sistema de solventes separadamente

Dissertação de Mestrado de Jonatas Vicente Milatio

Sistema de solventes Fase estacionária K (CG/DIC)

A inferior 0.23

K = area fase inferior/area fase

supeior

K = 563236/2491626=0.226

K = CS/CM

EXEMPLO USANDO O SISTEMA A

2. ESTIMATIVA VISUAL DE K POR CCD

Como escolher o sistema de solventes adequado?

amostra Aplicação de iguais volumes das duas fases

superior inferior

Placa de gel de sílica

Ajuste do Sistema de solvents para K=1 para a substância-alvo

A vida mais fácil assim

Purificação de substâncias de baixa polaridade:

sistemas não-aquosos

sistemas aquosos

Fotos fonte: http://www.naturezabela.com.br/2014/04/copaiba-copaifera-langsdorfii.html

Óleo de Copaíba

óleoresina obtida de incisões nas cascas de plantas do genero

Copaifera

Atividades antissética e anti-inflamatória

Administração oral ou tópica in naturaou sob a forma de unguento

Amplamente distribuída nas regiões Amazoniica e Centro-oeste do Brazil

COMPOSIÇÃO DA ÓLEORESINA:MISTURA DE SESQUITERPENOS E DITERPENOS

Ácidos diterpenicos dos tipos kaurano, labdano e clerodano

ATIVIDADES BIOLÓGICAS IMPORTANTES

Análise da óleo-resina por CG/EM

Aproximadamente 30 substâncias

23 identificadas através de seus índices de retenção e espectros de massas

19.73% na óleoresina

0.98% na óleoresina

Ácido PoliálticoÁcido Kaurenóico

Composição dos sistemas de solventes (v/v)

Hexano-ACN 1:1Hexano-metanol 1:1

Hexano-ACN-metanol 1.5:1:0.5

Hexano-ACN-metanol 1.5:0.5:0.5

hexano-ACN-metanol1:1:0.4

hexano-ACN-acetato de etila1:1:0.4

Sistemas de solventes não-aquosos testados para o fracionamento da óleoresina de Copaifera glycycarpa

CCC

Fracionamento isocrático de 600mg da oleoresina de c. glycycarpacom o sistema de solventes hexano-acetonitrila- acetato de etila 1:1:0,4, fase superior como móvel, coluna de 95ml, Quattro CCC HT Prep, 3ml/min

Frações 2-10

mistura de Sesquiterpenos

Frações 11-13

35mg de ácido Kaurenóico

Frações 49-53

150mg de ácido poliáltico

FRAÇÕES 54-56Mistura de ácidos agático, poliáltico e pinifólico

TAXA DE RECUPERAÇÃO ACIMA DE 95%

✓ Nomes populares: cataia, craveiro

✓ Usos na medicinapopular

✓ Flavorizante de cachaça

Nativa do Brasil ocorrendo no cerrado, caatinga, restinga e Floresta Atlântica

Isolamento anterior por CCD preparativa - 39.1% de perda da substância-alvo

Óleo essencial35.3% chavibetol11.3% metileugenol

Sistemas de solventes testdos para a purificação do óleo essencial

Sistema de solventes que apresentou K próximo a 1 para as substancias-alvo e foi escolhido

para otimização

Fracionamento de 600mg do óleo essencial hexano-n-butanol-metanol-água (12:4:4:3, v/v)

fase superior como móvel

98% de pureza (HPLC)94.4% de taxa de recuperação

50mg200mg

Purificação de substâncias de média a alta polaridades

O sistema HEMWat

hexano-acetato de etila-metanol-água

O sistema HEMWathexano-acetato de etila-metanol-água

Hex EtOAc MeOH H2O

-H 6 0 6 0

-G 6 1 6 1

-F 6 2 6 2

-D 6 3 6 3

-C 6 4 6 4

-B 6 5 6 5

A 6 6 6 6

B 5 6 5 6

C 4 6 4 6

D 3 6 3 6

F 2 6 2 6

G 1 6 1 6

H 0 6 0 6

EBuWat

Dissertação de mestrado de Fernanda das Neves Costa

✓ CLAEColuna: Lichrosorb RP-18

(Tamanho da partícula: 5 µm, 250 x 4.6 mm i.d.)

Gradiente de MeOH:H2O 40:60 100:0 em 35 min, 1

ml/min✓ CCDEluente: AcOEt-Acetona-H2O

25:10:5

Revelador: H2SO4 20%

2,05

2,32

2,83 3,09 3,55

3,87

6,59

8,53

10,43

11,76

12,16

12,53

13,89

14,91

16,21

18,21

19,76

20,19

21,49

22,45 23,44 24,37

25,17

25,81

27,97

29,23

29,65

30,72

31,79 32,13

33,01

34,53

0 5 10 15 20 25 30 35

Retention Time (min)

-0,10

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

Absorbance (AU)

Pico I Pico II Pico III

Hexano-acetato de etila-ÁLCOOL-água

Sistema de Solventes Hex-AcOEt-MeOH-H2O (HEMWat)

Proporção 1:1:1:1

S I

Proporção 1 5:9:5:9



1S 1I 2S 2I 3S 3I

Fracionamento da Partição em AcOEt por CCC

Peso da amostra: ~150 mgSistema de Solventes: Hex-AcOEt-MeOH-H2O 4:10:4:10Fase estacionária: aquosa/ inferiorFase móvel: orgânica/ superiorFluxo: 2 ml/min Frações: 4 mlRotação: 850 rpm

2K com rotação + 1K sem rotação

VCOLUNA: 80 ml1,6 mm d.i VCOLUNA: 95 ml

2,1 mm d.i

Partição em AcOEtde S. leucanthum

Fração 1 Fração 2 Fração 3 Fração 4

1,92 2,53

3,12

3,92

4,48 5,09

6,19

6,64

7,97 10,40

10,88 11,65

12,11 13,28

14,05

14,61

16,40

18,27

18,75

20,05

24,48 26,24

26,45

30,29

32,03

33,47

34,61

0 5 10 15 20 25 30 35


-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Absorbance (AU)

2,72 2,99 3,20

3,47

3,79 4,37 5,47

5,84 6,29

6,72

7,68 8,19

8,59

9,76 10,53

11,39

12,11

14,56

14,83

15,55

16,27

17,55

18,59

21,81

23,17

24,77

25,57 27,44

33,49

34,69

0 5 10 15 20 25 30 35


-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Absorbance (AU)

1,92 2,53

3,12

3,92

4,48 5,09

6,19

6,64

7,97 10,40

10,88 11,65

12,11 13,28

14,05

14,61

16,40

18,27

18,75

20,05

24,48 26,24

26,45

30,29

32,03

33,47

34,61

0 5 10 15 20 25 30 35


-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Absorbance (AU)

Pico III Pico I + Pico II

Novo Fracionamento

Pinocembrina 7-O (6”-O-acetil)-neoesperidosídeo

CLAE analítica das Frações obtidas por CCC

Purificação da Fração 4 por CCC

Sistema de Solventes AcOEt-BuOH-H2O

1S 1I 2S 2I 3S 3I

Proporção 1 9:1:10



Sistema de Solventes K Pico I α K Pico II

AcOEt-BuOH-H2O 9:1:10 1,86 1,8 1,01

AcOEt-BuOH-H2O 8:2:10 1,15 2,1 0,559

AcOEt-BuOH-H2O 7:3:10 0,362 1,2 0,441

CLAE analítica das Frações obtidas por CCC

Partição em AcOEtde S. leucanthum

Fração 1 Fração 2 Fração 3

0,690,91

2,59

2,80 3,33

3,795,01

5,41

7,04

7,39

9,01

10,48

11,79

12,45

13,36

14,11

14,83

16,08

17,36

18,99

19,57

20,13

21,07

21,41

21,87

22,96

23,81 25,63

26,29

27,41

28,21

28,88

29,41 31,65

32,48 33,28

33,97

34,77

0 5 10 15 20 25 30 35


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Absorbance (AU)

2,00 2,40

2,75

6,27

9,81

10,88

11,76

18,24

22,13

23,04

24,72

25,20 32,13

33,15

34,53

0 5 10 15 20 25 30 35


-0,10

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

Absorbance (AU)

Pico II Pico I

Pinocembrina 7-O-neoesperidosídeo2’,4’,6’-trihidroxi-4’-O--b-glucopiranosildihidrochalcona

Purificação de substâncias de alta polaridade

O sistema acetato de etila-butanol-água

EBuWat

uso de gradientes

O sistema EBuWatacetato de etila-butanol-água

EtOAc BuOH H2O

-5 10 0 10

-4 9 1 10

-3 8 2 10

-2 7 3 10

-1 6 4 10

0 5 5 10

1 4 6 10

2 3 7 10

3 2 8 10

4 1 9 10

5 0 10 10

EXCELENTE SISTEMA PARA FAZER GRADIENTE

Purificação de Fenilpropanóides e Iridóides Glicosilados do Gervão-Roxo

Stachytarpheta cayennensis

Dissertação de Mestrado: Pierre A. de Souza

Otimização do Teor de BuOH no Sistema de Solvente

AcOEt-BuOH-H2O

A B C

S I S I S I

A B

S I S I

A: AcOEt:H2O 1:1

B: BuOH:H2O 1:1

A: X= 0,2

B: X=0,5

C: X=1,0

AcOEt-BuOH-H2O 1:X:1

16 32 42 54 70 Tubo

AcOEt:BuOH:H2O 1:X:1, fase orgânica como fase móvel, 2ml/min., 850RPM, SF = 78,7%

0,05

0,5

0,2

1,0 Rotação desligada

6 7 8 9 10 11 12 13 16 1718 19 20 21 22 23 26 27 28

Rotação desligada

5152 53 5455 56 5859 60 6162 63 64 65 66 67 68

Ipolamiida

Verbascosídio

Isoverbascosídio

OO

OHO

O

OH

O

OHO

HO

O

OOH

HO

HO

Martinosídio

OO

OHO

O

OH

OH

HO

O

OOH

HO

HO

O

HO

H

OO

OHO OH

OH

OHO

HO

HOO

OOH

HO

HO

O

OO

OGlu

HO

HO

Isolamento de Alcalóides

refinamento por zona de pH (pH-zone refining CCC)

Erythroxylum subsessile

Triclisia dictyophylla

•Técnica preparativa da CCC, introduzida por Yoichiro Ito, que produz picos característicos retangulares dos analitoscomparáveis àqueles obtidos em cromatografia de deslocamento (displacement chromatography)

A técnica de refinamento por zonas de pH (pH-zone refining CCC)

Ito, Y e Ma, Y. J. Chromatog.A,1996, 753, 1-36

Aplicações da técnica

• Na separação de substâncias ionizáveis: ácidos aminados, pigmentos do tipo hidroxi-xantonas, ALCALÓIDES, ácidos carboxílicos, etc.

• Na separação de enanciômeros e diastereoisômeros

Modos de Operação:

• Deslocamento normal (displacement mode):

o agente de deslocamento (displacer ou eluter), presente nafase orgânica móvel, transfere o analito, retido na faseaquosa estacionária, para a fase orgânica móvel.

• Deslocamento reverso (reverse displacement mode): a fasemóvel aquosa elui o analito, retido na fase orgânica pormeio de um agente de retenção (retainer).

Isolamento de Alcalóides deErythroxylum subsessile O. E. Schulz por

pH-zone refining CCC

Tese de doutorado de Rodrigo A. S. Cruz

Herbário virtual JBRJ

Fração alcaloídica bruta (800 mg)

Folhas

Extrato bruto

etanólico

HSCCC

HSCCC – pH x frações

Eluente da CCD: acetato de etila-metanol-trietilamina (9:1:1); Revelação: Dragendorff.

NOH

O

O

Sistema de solventes: acetato de etila-água, modo reverso. Agente de retenção: trietilamina, agente de eluição: HCl

Isolamento de Alcalóides deTriclisia dictyophylla

A SELEÇÃO DO SISTEMA DE SOLVENTES:

K x pKb

Sistemas de solventes testados HEMWata)1:1:1:1,b) 4:6:4:6,c) 3:7:3:7,d) 3:7:1:9, e) 1:6:1:6

TEA 5mM na fase orgânica e HCl 5mM na fase aquosa

Sistemas de solventes testados:EBuWat

a) 7:3:10, b) 6:4:10,c) 5:5:10

TEA 5mM na fase orgânica e HCl 5mM na fase aquosa

SEPARAÇÃO DE 1g DE EXTRATO NO HSCCC

Phaeanthine (2)

MeN

OMe

OMe

OMe

NMe

MeO

O

O

Trigilletine (3)

MeN

OMe

NMe

OHO

O

O

MeN

OMe

OH

NMe

MeO

O

O

Obamegine (4)

MeO O

OMe

NMeOH

OMe

MeO

Tridictyophylline (6)

Fracionamento do extrato de T. dictyophyllapor pH-zone refining CCC com o sistema de solventes EBuWat 5:5:10

23 4

6

Estruturas propostas para as frações

FRAÇÕES ANALISADAS POR CLAE-EM

Perfil do extrato por CLAE

TODA A BELEZA

SISTEMAS DE SOLVENTES GENÉRICOhexano-etanol-água

Frações de média a alta polaridade

Frações de média polaridade

Frações de alta polaridade

Isocrático x gradiente EBuWat

Isocrático x gradiente HEMWat

ISOCRÁTICO, Hexano-EtOH-H2O (4:2:2), modo reverso

A

8.0726 g

B

111.7 mg

C

33 mgD

111.7 mg

E

85 mg

Ormocarpum kirkii S. Moore

Extrato etanólico bruto

Á

A1

1.4215 gA2

165.9 mg

A3

32.6 mg

A4

200.2 mg

ISOCRATICO

AcOEt-nBuOH-H2O (9:0.5:10)

ISOCRÁTICO AcOEt-H2O (1:1), modo reverso

GRADIENTE, Hexano-AcOEt-MeOH-H2O (1:X:1:1)

X = 1, 2, 2.5, 39-14

A1.a 5 A1.c A1.d.… …A1.g

Menos polar

Mais polar

GRADIENTE AcOEt-BuOH-H2O (X:Y:10)

(X:Y) = (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (5:5), (4:6), (3:7)

1, 2

and15

4, 5 and

mixt. 7-8

by

Sephadex

LH-20

Fracionamento Isocrático do extrato etanólico de O. kirkii

Hexano-etanol-água

Seleção das proporções de solventes

Sistema de solventes genérico hexano-etanol-água

frações de baixa-média-alta polaridades

Evita-se o processo tedioso de partição liquido-liquido do extrato bruto em funil de separação!

Seleção das proporções dos solvents:1. hexano-etanol-água 4:3:12. hexano-etanol-água 4:2:2

U1 L1 U2 L2

Silica gel TLC plate eluted with EtOAc-acetone-water100:20:10, sprayed with vannillin in sulfuric acid

Perfil por CLAE de extrato bruto de Ormocarpum kirkii

Fração polar A

Fração polar B

HSCCC

Fracionamento ISOCRATICO do extrato bruto por HSCCC hexano-etanol-água 4:2:2, 2g, coluna de 224 ml

OKB= O. kirkii extrato bruto das cascas

Purificação da fração AEluição Isocrática

AcOEt-H2OModo reverso

Isolamento dos metabólitos secundários da fração A por HSCC

Seleção do Sistema de solventes

Testes:AcOEt-H2O (1:1; Ua, La)

e n-BuOH-H2O (1:1; Ub, Lb)

Para um possível gradiente com EBuWat

Placas de gel de Silica, eluente AcOET-MeOH-H2O 100:20:10, revelador vanilina/H2SO4

A

1.807 g

A1

1.4215 g

A2

165.9 mg

A3

32.6 mg

A4

200.2 mg

AcOEt-H2O 1:1, isocrático, modo reverso

A1

A2 A3 A4

FRACIONAMENTO ISOCRÁTICO DA FRAÇÃO A

Purificação Isocrática de A1AcOEt–n-BuOH–H2O (9.5:0.5:10)

Fase superior como móvel

7 sub-frações (A1a-A1g)

A

8.0726 g

B

111.7 mg

C

33 mgD

111.7 mg

E

85 mg


Extrato etanólico bruto

A1

1.4215 g

A2

165.9 mgA3

32.6 mgA4

200.2 mg

ESTRATÉGIA DE FRACIONAMENTO

A1.a A1.d.… …A1.gA1.c

Eluição ISOCRÁTICA AcOEt-nBuOH-H2O

(9:0.5:10), modo normal

5

FRAÇÃO MAIS POLAR

A1.a35.5 mg

Subst. 58.6 mg

A1.c20.6 mg

A1.d80.6 mg

A1.e53.3 mg

A1.f35.5 mg

A1.g569.7 mg

HSCCC ISOCRÁTICO AcOEt-nBuOH-H2O (9:0.5:10)

HTPrep 98mL, fase superior móvel, 2ml/min, 4ml

A1804 mg

Fracionamento preparativo por GRADIENTE

AcOEt–n-BuOH–H2O (X:Y:10), (X:Y = 9:1 (I); 8:2 (II); 7:3 (III); 6:4 (IV); 5:5 (V); 4:6 (VI) 3:7 (VII) em 7 etapas.

Gel de Sephadex LH-20MeOH/H2O (3:7; 5:5)

substancias 4, 5 e a mistura de 7 e 8

8

O

OH

OOH

O

O

OH

OH

HOHO

OO

OH

OHOH

HO

7 e 8

SUBSTANCIA MAJORITÁRIA: ORMOCARPINA, ISOLADA POR DISTRIBUIÇÃO CONTRACORRENTECOM O APARELHO CRAIG E

POST EM 1990 (GALEFFI et al.)

Purificação de A1g por gradiente preparativo

AcOEt–n-BuOH–H2O (X:Y:10) em sete etapas

(X:Y = 9:1 (I); 8:2 (II); 7:3 (III); 6:4 (IV); 5:5 (V); 4:6 (VI) 3:7 (VII)

A

8.0726 g

B

111.7 mg

C

33 mgD

111.7 mg

E

85 mg


EXTRATO BRUTO

ETANÓLICO

A2

165.9 mg

A3

32.6 mg

A4

200.2 mg

A1

1.4215 g

A1.a 5 A1.c A1.d.… A1.g

570mg

GRADIENTE Acoet-BuOH-H2O (X:Y:10)

(X:Y) = (9:1), (8:2), (7:3), (6:4), (5:5), (4:6), (3:7)

A1g1

48.2 mgCpd2

15.2 mg

A1g3

14.7 mg

Cpd15

11.2 mg

A1g5

7.1 mgCpd 1

12.4 mg

A1g7

94.4 mg

A1g8

206.8 mg

ESTRATÉGIA DE FRACIONAMENTO

OHO

OH O

O

O

OH

OH

HOHO

2

45

78

10

1

4

12

3

4

5

6

O

OHHO

O1

23

45

O

OH

OHOH

HO1 2

3

4

5

6

1

DOIS FLAVONOIDES INÉDITOS

Purificação da fração A4por eluição por gradiente

Fração menos polar

Sistema de solventes: HEMWat

A

8.0726 g

B

111.7 mg

C

33 mgD

111.7 mg

E

85 mg


Extrato etanolico bruto

A2

165.9 mg

A3

32.6 mg

A4

200.2 mg

A1

1.4215 g

GRADIENTE, Hexano-AcOEt-MeOH-H2O (1:X:1:1)

X = 1, 2, 2.5, 3

Escolha do gradiente de eluição para a fração A4

Sistema HEMWat 1:X:1:1, X=1; 2; 2,5; 3

Gradiente HSCCC

Sephadex LH-20MeOH-H2O (8:2)

Substancias 9 e 10

9

O

OH

HO

OO

OH

OH

O

OH

OH

10

O

OH

OH

HO

O

OH

O

HO

O

O

O

OH

OHOH

HO

11

O

O

HO

OO

OH

OH

O

OH

OH

12

O

O

HO

OO

O

OH

O

OH

OH

13

O

OH

OH

HO

O

OH

OH

HO

O

O

14

O

OH

OH

HO

O

OH

OH

HO

O

O

Um total de 15 substancias (incluindo as minoritárias) do extrato etanólico de cascas de O.

kirkii foram isoladas alternado-se eluições isocráticase por gradiente, sendo utilizadas diversas famílias de

sistemas de solventes de acordo com a polaridade das substancias em cada fração

As duas primeiras purificações isocráticas com sistemas de solventes genéricos possibilitaram o “clean-up” do extrato bruto etanólico em frações

que foram purificadas através de eluiçõesisocráticas ou por gradiente

Benzoquinona diterpênica com esqueleto do tipo abietano

• Antimicrobiana• Antibacteriana

A SUBSTÂNCIA DE INTERESSE

7a-hIdroxiroileanona


81

Extrato diclorometânico das folhas de

Tetradenia riparia

FIGUEIREDO, F. S. . Isolamento de metabólitos secundários das folhas de tetradenia riparia (hochst.) Codd por cromatografia contracorrente Dissertação de Mestrado. IPPN/UFRJ. Rio de Janeiro, 2012.

7α-hidroxiroileanona

Foto

: Fab

ian

a Fi

guei

red

o

Folhas de T. riparia

LEITÃO, G.G; FIGUEIREDO, F. S.; DANTAS, S.W.R.M.; VON GROLL, A.; SILVA, R.S.F.; ALMEIDA da SILVA, P.E. Isolation of bioactive diterpenes from Tetradenia riparia by HSCCC. Planta Medica, 11:78, 2012

ATIVIDADE BIOLÓGICA DO EXTRATO EM DICLOROMETANO

E DE SUBSTANCIAS ISOLADAS POR CCC

Figueiredo, F.S. Dissertação de Mestrado, NPPN. 2012.

Extração com CO2

supercrítico+

CCC

Hexano-CHCl3-PrOH-H2O

LIU DONGFENG. Extraction method of horminone. NANJING ZELANG MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. 2012.

Citotóxica: inibição de células de leucemia (camundongos)Anti-tripanossoma in vitro

Patente Chinesa

CN102826988A

Horminumpyrenaicum(Lamiaceae)


material de partida

para modificações estruturais

(derivados heterocíclicos)

Derivados fenazínicos –atividade anti-TB

Derivados imidazólicos e oxazólicos – atividade contra T. cruzi (doença de Chagas)

lapachol

é necessário:- obter a 7α-hidroxiroileanona do extrato diclorometânico das

folhas de Tetradenia riparia através de processo seletivo buscandootimizar a duração do processo, grau de pureza do material obtido etaxa de recuperação

Para poder realizar as transformações

químicas....

Para essa otimização é necessário:- quantificar a quinona no extrato e avaliar sua taxa de

recuperação

Validação de método (CG-DIC)

QUANTIFICAÇÃO da quinona no extrato em diclorometano de T. riparia

Técnica:

Cromatografia com fase gasosa

Guias de Validação

Padrão InternoLapachol

Padrão7α-hidroxiroileanona

Laboratório de Química Heterocíclica Antônio Ventura

Pinto (IPPN / UFRJ)

Método: Padronização Interna

A quantificação permitiu verificar que o extrato bruto emdiclorometano das folhas de T. riparia, continha 24.7%do diterpeno 7α-hidroxiroileanona.

Escolha do processo seletivo:

?

7α-HIDROXIROILEANONA x LAPACHOL

Ferreira, L. G. (1975). Lapachol - Processo extrativo. Revista Brasileira de Farmácia, 153-156.

Lapachol

Processo Extrativo: Solução de Na2CO3

= Sal característico

Ipês branco e roxo

Prof. Antônio Ventura PintoEstudo da Reatividade Química de Quinonas Naturais

e Sintéticas

Investigar a extração fazendo uso de

Na2CO3(aq)

Processo extrativo: adaptado para extrato

diclorometânico das folhasde Tetradenia riparia

Extrato em CH2Cl2 Maceração72/24 Horas

Neutralização com HCl concentrado

Recuperação com AcOEt

EXTRAÇÃO COM Na2CO3(aq)

Neutralização com HCl concentrado

Recuperação com AcOEt

[Na2CO3(aq)] RECUPERAÇÃOPUREZA CG-

DIC

EXT-5 5% 1,46% 76,60%

EXT-10 10% 1,54% 59,15%

EXT-20 20% 1,58% 22,45%

Baixo rendimento e taxa de recuperação

Provavelmente efeito da matriz: extrato em diclorometano –rico em diterpenos

VERSÁTIL

RÁPIDA

ECONÔMICA

REPRODUTIBILIDADE E PREVISIBILIDADE

RECUPERAÇÃO TOTAL DA AMOSTRA

CCC

ALTERNATIVA

ISOLAMENTO POR CCC

SELEÇÃO DE SISTEMAS DE SOLVENETS PARA CCC

taxa de recuperação

duração do processo

grau de pureza

ESCOLHA DO SISTEMA DE SOLVENTE

Sistemas de solventes selecionados e suas relações de volume

Sistema de solventeProporção

(v/v)A Hexano-AcOEt-MeOH-H2O 3:1:3:1.5B Hexano-Acetona-MeOH-H2O 3:1:3:1.5C Hexano-ACN-MeOH 1:1:0.5D Hexano-EtOH- H2O 4:3:1

FS FI FS FI FS FI FS FI

A B C D

A B C D

FS FI FS FI FS FI FS FI

solubilizar toda a amostra

Distribuição da substância de

interesse entre as fases

DETERMINAÇÃO DE K (CG-DIC)

Determinação do coeficiente de partição por CG-FID

Sistema de Solvente Proporção

FEdo Sistema

de Solvente

K

A Hexano-EtOAc-MeOH-H2O

3:1:3:1.5 FI 0.23

B Hexano-Acetona-MeOH-H2O

3:1:3:1.5 FI 0.54

C Hexano-ACN-MeOH 1:1:0.5 FS 0.36D Hexane-EtOH- H2O 4:3:1 FI 1.23

FE – Fase Estacionária, FM – Fase Móvel, FI – Fase Inferior, FS – Fase Superior

K = área do analito FE

área do analito FM

96

Perfil HSCCC - ELSD dos extratos em cada sistema de solvente

RESULTADOS DOS FRACIONAMENTOS MONITORADOS POR CCD. REVELADOR VANILINA E ÁCIDO SULFÚRICO

Coluna: 26 mlAmostra: 50,0 mg

Fluxo: 0,75 ml/minAlça de Injeção: 2,0 ml

2 min./tubo, sendo coletadas 20 frações com rotação ligada + 20 frações com rotação desligada (total de 80 min.)

FRACIONAMENTOSPOR CCC

Fracionamento por CCC

Frações coletadas do HSCCC (coluna de 26 ml) com suas respectivas purezas determinadas

por CG-DIC e rendimento a partir do extrato injetado.

Sistema de

SolventeRetenção da FE Frações

Pureza

(CG-DIC)Recuperação

A 76,92% 3 – 6 (4.7 mg) 79% 35,9%

B 73,08% 4 – 8 (3.3 mg) 86% 25,1 %

C 57,69% 4 – 6 (7.8 mg) 87% 61,1%

D 84,61% 18 – 28 (1,7 mg) 96% 13,4%

Recuperação ainda baixaescala analítica x escala preparativa NOVO SISTEMA DE SOLVENTES

CCC – NOVO SISTEMA DE SOLVENTE

Sistema de Solvente ProporçãoFE

do Sistema de Solvente

E Hexano – Na2CO3(aq) 5% 1 : 1 FS

Recuperação: 1,46%Pureza: 76,60%

EXTRAÇÃO DIRETA DO EXTRATO EM

DICLOROMETANO

CCC – NOVO SISTEMA DE SOLVENTE

Sistema de Solvente ProporçãoFE

do Sistema de Solvente

K

E Hexano – Na2CO3(aq) 5% 1 : 1 FS 0,12

ELUIÇÃO RÁPIDA E

SELETIVA

Neutralizada com HCl(conc.)

Recuperação em AcOEt

CCC – ELSD: comparação dos tempos de eluição

Amostra: 30mgFrações coletadas: 7-10

(2.7mg)Pureza: 80%

Recuperação: 35,9%


(1.9mg)Pureza: 83%


Hexano-EtOAc-MeOH-H2O

Hexano-Acetona-MeOH-H2O

20 min

30 min

CCC + ELSD


(4.5mg)Pureza: 86%



(1.0mg)Pureza : 92%


Hexano-ACN-MeOH

Hexano-EtOH- H2O

23 min

60 min

CCC - ELSD

Amostra: 30.mgFrações coletadas: 3-5

(6.1mg)Pureza: 97%


Hexano-Na2CO3 5% (aq)

10 min

TAXA DE RECUPERAÇÃO REAL

104

SISTEMA DE SOLVENTES ERecuperação: 81,8%

(Uso do divisor de fluxo 1:3)

Fracionamento de 1g de extratoFrações neutralizadas tubo-a-tubo Frações reunidas e neutralizadas

Retenção da Fase Estacionária

92.3% 92.3%

Frações com coloração avermelhada

3 - 28 3 - 28

Massa obtida após neutralização com HCl(conc.)

235,8 mg 237,9 mg

Recuperação

92,54% 93,48%

Pureza (%) - CG/DIC

97,8 97,4

O sistema desenvolvido permitiu a obtenção dabenzoquinona através de um processo com temporeduzido, alto grau de pureza e excelente taxa derecuperação

Devido a semelhança de nossa benzoquininacom o lapachol foi possível desenvolver um sistema de solvente inédito para CCC:

hexano- Na2CO3(aq) 5%

A CCC COMO UM EXTRATOR SELETIVO

Conclusão

A cromatografia contracorrente quando explorada em seu potencial máximo é sem dúvida a melhor técnica preparativa de isolamento e purificação de produtos naturais!

Agradecimentos:

Aos organizadores da 26ª Semana de Química da UFRJAo IPPNAos meus alunos e ex-alunosÀ CAPES, FAPERJ, CNPq

Obrigada pela atenção!

E porque a gratidão é enorme...aos orientadores Profa. Emérita Dr.a Maria Auxiliadora C. Kaplan e Prof. Dr. Corrado Galeffi

cromatografia contracorrente na purificação de produtos...

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