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CRISTIANE APARECIDA PEREIRA

EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA

BIOFILMES FORMADOS

Staphylococcus aureus


EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA IN VITRO

BIOFILMES FORMADOS POR Candida albicans

Staphylococcus aureus E Streptococcus mutans

2009

IN VITRO EM

Candida albicans,

Streptococcus mutans

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EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA IN VITRO EM BIOFILMES

FORMADOS POR Candida albicans, Staphylococcus aureus E

Streptococcus mutans.

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São

José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE,

pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área

Biopatologia Bucal.

Orientador: Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge

São José dos Campos

2009

Apresentação gráfica e normalização de acordo com: Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2008

P414e Pereira, Cristiane Aparecida.

Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans / Cristiane Aparecida Pereira. __ São José dos Campos : [s.n.], 2009

91f. : il. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia

de São Jose dos Campos,Universidade Estadual Paulista, 2009. Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge 1. Biofilme. 2. Candida albicans. 3. Staphylococcus aureus. 4. Streptococcus

mutans. 5. Terapia fotodinâmica. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. III. Título

tD17

Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP

AUTORIZAÇÃO

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte. São José dos Campos, 20 de julho de 2009. Assinatura : E-mail: [email protected]

BANCA EXAMINADORA

Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador)

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos

Universidade Estadual Paulista – UNESP

Prof. Dr. Aguinaldo Silva Garcez Segundo

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares – IPEN

Universidade de São Paulo – USP

Profa Dra Luciane Dias de Oliveira

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos

Universidade Estadual Paulista – UNESP

São José dos Campos, 20 de Julho de 2009.

DEDICATÓRIA

À eterna guerreira, minha amada mãe Maria da

Conceição Pereira. Mulher de fibra, que sozinha educou e criou os cinco

filhos, nos guiando sempre pelo caminho da honestidade.

Ao meu noivo, Renato Santana Correia, pela paciência,

compreensão e dedicação. Minha fortaleza, meu porto-seguro, meu amor,

amigo e companheiro.

Aos meus queridos irmãos Simone, César, Elisiane e

Elisimar. Mesmo tão diferentes vocês são parte de mim, por isso são

essenciais.

Aos meus tesouros, razão da minha vida, meus amados

sobrinhos Pedro e Laura.

Àquela que sempre foi o meu maior incentivo, minha

inesquecível amiga Érica de Sá Lopes da Costa (in memorian).

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao meu orientador, Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso

Jorge.

Toda minha admiração por sua sabedoria e

profissionalismo acadêmico se torna secundária quando contemplo o seu

lado humano simples, sensato e honesto, que contribui para construir um

mundo bem mais bonito.

Orientar é ajudar a trilhar um caminho até então

desconhecido, e sob sua orientação eu dei os primeiros passos para este

novo mundo.

Muito obrigada pela confiança, amizade e conhecimentos

transmitidos.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por ter me dado o privilégio de concretizar mais

este sonho.

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

Filho”, na pessoa do diretor Prof. Dr. José Roberto Rodrigues e do vice-

diretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli da Faculdade de Odontologia

de São José dos Campos.

Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal,

na coordenação da Prof.ª Dra. Cristiane Yumi Koga Ito e Prof.ª Adj.

Rosilene Fernandes da Rocha.

À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior) pela bolsa de estudo concedida.

Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de

Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria

Aparecida Consíglio de Souza, por serem sempre solícitas.

Aos docentes do Programa de Pós-graduação em

Biopatologia Bucal.

À querida Prof.ª Dra. Juliana Campos Junqueira, pessoa

sábia, que além de compartilhar todo conhecimento adquirido, sempre foi

paciente e atenciosa, e tornou-se uma grande amiga.

À Prof.ª Dra. Luciane Dias de Oliveira, a primeira pessoa

que me acolheu no laboratório, com toda calma e carinho.

À Prof.ª Sônia Khouri, quem me abriu as portas deste

fascinante mundo da Microbiologia.

À Prof.ª Dra Adriana Aigotti Haberbeck Brandão, e toda a

sua família, em especial ao Henrique Haberbeck Brandão, pelo incentivo

e amizade.

À querida Sílvia Scarpel, por toda atenção sempre.

Às minhas adoradas amigas que sempre torceram por

mim e entenderam a minha ausência em muitos momentos: Flávia Villas

Boas Simões Lopes, Flávia Morciani, Aline Carvalho Fava Gomes, Isabel

Chaves Silva Carvalho, Hérica Braga Carneiro, Suzana Costa, Rafaela

Costa, Tábata Bagatim e Bruna Renata Sperandim.

À minha companheira e grande amiga, a aluna de

PROAC Anna Carolina Borges Pereira da Costa. Obrigada seria pouco

para agradecer o quanto você sempre me ajudou e incentivou.

À minha equipe, que sempre me ajudou nos experimentos

e nos demais trabalhos do laboratório, e que se tornaram grandes

amigas, as alunas de Iniciação Científica: Fernanda Freire, Jéssica Mina

Zambrana, Sarah Almeida Coelho Oliveira e Fernanda Silva

Aos meus companheiros do curso de mestrado e do

laboratório de Microbiologia/Imunologia: Joyce da Silva Martins, Bruno

Mello de Matos e Polyana das Graças Figueiredo Vilela. Eu nunca poderia

ter escolhido pessoas tão maravilhosas para trilhar comigo mais este

caminho. Vocês tornaram esta fase muito mais especial, muito obrigada

pela amizade e o carinho.

Às alunas de PROAC, Ana Karina Machado e Vanessa

Maria de Campos Rasteiro, que chegaram recentemente, mas já

enriqueceram a nossa equipe.

À querida Claudia Carreira, por toda sua simpatia e

amizade.

Ao aluno de doutorado Rogério de Lima Romeiro, por

toda ajuda e companheirismo.

Aos alunos de Iniciação Científica, Rodney Rossoni e

Evelyn Santos, pela determinação e amizade.

Às alunas do curso de doutorado Graziella Nuremberg

Back Brito, Marta Majewski e Rosilene Batista de Aguiar Almeida.

Às alunas de mestrado Mary Anne Moreira Bárbara,

Nívea Cristina Sena Costa, Ana Paula Lima e Simone Vilela, muito

obrigada pelo companheirismo sempre.

Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Dias Colombo, por ter

participado do meu exame geral de qualificação, contribuindo com

sugestões que foram essenciais para o desenvolvimento desta

dissertação.

Aos funcionários do laboratório: Sérgio, Domingos e Ana

Paula, muito obrigada pela colaboração e paciência.

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SUMÁRIO

RESUMO.............................................................................................. 11

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS......................... 12

1 INTRODUÇÃO................................................................................... 14

2 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................. 17

2.1 Biofilme dentário............................................................................ 17

2.1.1 Colonização por Streptococcus mutans....................................... 19

2.1.2 Colonização por Candida albicans............................................... 20

2.1.3 Colonização por Staphylococcus aureus..................................... 21

2.2 Terapia fotodinâmica...................................................................... 23

2.2.1 Fotossensibilizador....................................................................... 23

2.2.2 Laser............................................................................................. 24

2.2.3 Terapia fotodinâmica antimicrobiana............................................ 25

3 PROPOSIÇÃO.................................................................................... 31

4 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................. 32

4.1 Corpos-de-prova............................................................................. 32

4.2 Microrganismos e preparo de suspensões padronizadas......... 33

4.3 Grupos e condições experimentais.............................................. 33

4.4 Formação dos biofilmes................................................................ 34

4.4.1 Lavagem dos corpos-de-prova...................................................... 35

4.5 Terapia fotodinâmica em biofilmes............................................... 35

4.6 Microscopia eletrônica de varredura............................................ 38

5 RESULTADOS.................................................................................. 44

6 DISCUSSÃO...................................................................................... 59

7 CONCLUSÃO....................................................................................... 66

8 REFERÊNCIAS.................................................................................... 67

APÊNDICE A .......................................................................................... 78

ANEXO A ................................................................................................ 90

ABSTRACT.............................................................................................. 91

PEREIRA CA. Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans [dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2009.

RESUMO O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por C. albicans (GI), S. aureus (GII) e S. mutans (GIII), isolados e em associações (GIV-VII). Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada para remover as células não-aderidas. Foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/mL por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultra-sônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log10 foram analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser. As reduções (log10) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22% para C. albicans (GI), 55.91% para S. aureus (GII) e 47.35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log10) foram: 35.08% para C. albicans e 43.9% para S. aureus (GIV); 31.54% para C. albicans e 38.7% para S. mutans (GV); 40.12% para S. aureus e 37.14% para S. mutans (GVI); 19.56% para C. albicans, 28.41% para S. aureus e 24.94% para S. mutans (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes. Conclui-se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais. PALAVRAS-CHAVES: Biofilme. Candida albicans. Staphylococcus aureus. Streptococcus mutans. Terapia fotodinâmica.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

%= por cento

µg/mL= microgramas por mililitro

µL= microlitro

µm= micrômetro

AM= azul de metileno

AsGaAl= arseneto gálio alumínio

AT= azul de toluidina

BHI= Brain heart infusion (infusão cérebro coração)

células/mL= células por mililitro

cm2=centímetro quadrado

CO2= gás carbônico

F= fotossensibilizador

FDA= ftalocianina dissulfonada de alumínio

h= hora

He-Ne= Hélio-Neônio

HILT= Hight Intensity Laser Treatment

J/cm2 = Joule por centímetro quadrado

J= Joule

kGy= KiloGray

L= laser

L= litro

Laser= Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

LED= Light Emitting Diode

LILT= Low Intensity Level Treatment

Log= logarítmo

MEV= microscopia eletrônica de varredura

mg/L= miligrama por litro

mg/mL= miligrama por mililitro

min= minuto

mL= mililitro

mm= milímetro

MSBS= Mitis salivarius bacitracina sacarose

mW/cm2= miliwatts por centímetro quadrado

mW= miliwatts

NaCl= cloreto de sódio

NADH= nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida

nm= nanômetro

ºC= grau Celsius

p/v= peso por volume

s= segundo

TFD= Terapia fotodinâmica

UFC/mL= unidade formadora de colônia por mililitro

UI/mL= unidade internacional por mililitro

W= watt

1 INTRODUÇÃO

A cavidade bucal apresenta diversos nichos ecológicos

que são colonizados por microrganismos, permitindo a sobrevivência de

uma diversidade de bactérias, vírus e fungos (Socransky et al., 1998).

Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de microrganismos já

foram detectadas na cavidade bucal de seres humanos, e grande parte

dessas espécies encontram-se organizadas na forma de biofilme (Wilson,

2004).

O biofilme dentário é formado por uma comunidade

diversificada de microrganismos que se acumula em tecidos duros

(dentes) como um filme, embebidos em uma matriz extracelular de

polímeros do hospedeiro e de origem microbiana (Marsh, 2004).

A colonização da cavidade bucal é influenciada

diretamente pela película adquirida (Marsh, 2004); uma camada acelular

constituída de proteínas, glicoproteínas e lipídios (Marcotte; Lavoie,

1998). A película adquirida é formada pela saliva imediatamente após a

profilaxia dos dentes, e pode favorecer a adsorção de microrganismos à

superfície dentária (Marsh, 2004). Se as condições forem favoráveis, os

colonizadores primários, primeiros microrganismos a aderirem à película

adquirida, podem multiplicar-se no substrato e formar micro-colônias

(Rickard et al., 2003). A seguir, ocorre o aumento da diversidade

microbiana até atingir uma comunidade clímax em duas ou três semanas

(Nyvad; Fejerskov, 1995).

Os estreptococos do grupo mutans, principalmente as

espécies Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus são os

principais agentes etiológicos do desenvolvimento da cárie de superfície

lisa dos dentes. O acúmulo de estreptococos na superfície dentária é

15

considerado um fator crítico no desenvolvimento do biofilme cariogênico,

devido à produção de ácidos que proporcionam diminuição do pH do

biofilme, aumentando a possibilidade de desmineralização dos tecidos

dentários (O’Toole et al., 2000).

As leveduras mais freqüentes na cavidade bucal são do

gênero Candida, sendo a espécie Candida albicans considerada um dos

fungos patogênicos normalmente encontrados neste local (O´Sullivan et

al., 2000). As leveduras também podem ser isoladas do biofilme dentário

(Sen et al., 1997) e coagregam-se a espécies bacterianas presentes ou

aderidas diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980;

Nikawa et al., 1998).

Outro microrganismo patogênico oportunista que pode ser

isolado da cavidade bucal é Staphylococcus aureus. Esta bactéria pode

atuar como microbiota suplementar, sendo freqüentemente encontrada

em abscessos periapicais e estomatites protéticas (Martins et al., 2002).

Staphylococcus aureus possui um plasmídio que codifica para ß-

lactamase e proporciona o desenvolvimento de resistência a antibióticos,

principalmente à penicilina (Machado, 2000). Além disso, tem a

capacidade de produzir enzimas extracelulares, tornando-se uma bactéria

muito agressiva (Sader et al., 1993).

Os antimicrobianos auxiliam a remoção química do

biofilme, porém o uso prolongado de tais agentes pode levar à seleção de

espécies resistentes (Moran et al., 1992). A estrutura do biofilme e as

características das células que o constituem conferem resistência aos

agentes antimicrobianos e às defesas naturais do organismo (Dunne,

2003).

Desta forma, vê-se a necessidade de se desenvolver

tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana, capazes

de interferir no desenvolvimento do biofilme. Neste contexto, a terapia

fotodinâmica (TFD) surge como uma alternativa de tratamento.

16

O processo de TFD consiste na irradiação de uma luz de

comprimento de onda apropriado que ativa uma substância

fotossensibilizadora, causando a morte celular por meio da produção de

espécies reativas de oxigênio (Machado, 2000).

Em vista do decréscimo da susceptibilidade de

microrganismos aos métodos convencionais de tratamentos, a avaliação

do efeito antimicrobiano da TFD em biofilmes formados in vitro por

Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e suas

associações, sobre resina acrílica, torna-se de interesse científico.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Biofilme dentário

A cavidade bucal dos seres humanos apresenta

microbiota complexa, que reflete a diversidade dos habitats e dos

ecossistemas ali localizados (Thylstrup; Fejerskov, 1995). Diferentes

locais na cavidade bucal são colonizados por populações distintas de

microrganismos. Todas as superfícies expostas da boca (dentes, tecidos

periodontais e língua) apresentam microrganismos residentes (Wen;

Brune, 2002). Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de

microrganismo já foram detectadas na cavidade bucal dos seres humanos

e grande parte delas encontra-se organizada na forma de biofilmes

(Wilson, 2004).

Biofilme pode ser definido como uma comunidade

estruturada de micro-colônias de células microbianas envolvidas em uma

matriz extracelular de polissacarídeos, aderida a um substrato sólido

úmido ou meio líquido do qual elas podem retirar seus nutrientes

(Costerton et al.,1999; Portera, 1999; Wimpenny et al., 2000).

A colonização microbiana não é um processo passivo e

requer aderência do microrganismo à superfícies dentárias (Nyvad;

Fejerskov, 1995). A adesão inicial ocorre por meio da película adquirida

(Marsh, 1992), uma camada acelular que se deposita no esmalte

superficial dos dentes, tendo como principais constituintes substâncias

originárias da saliva e do fluido gengival, como proteínas, glicoproteínas e

lipídios, além de componentes bacterianos, como as glicosiltransferases

(Marcotte; Lavoie, 1998). Por este processo de especificidade, os

18

microrganismos com pouca ou nenhuma afinidade à película são

eliminados pelo fluxo salivar. Assim as interações microrganismo/película

são de suma importância nos estágios iniciais de formação do biofilme

dentário (Gibbons et al., 1990).

A película adquirida começa a ser formada poucas horas

após a limpeza profissional (Bowden; Edwardsson, 1995), e atua como

substrato para a primeira população de microrganismos, conhecida como

colonizadores primários. Após a colonização inicial, os microrganismos

primários crescem rapidamente formando micro-colônias que ficam

embebidas em uma matriz extracelular (Thylstrup; Fejerskov, 1995).

Quando ocorrem mudanças nas condições ambientais no interior do

biofilme em formação e o substrato existente apresenta-se coberto por

bactérias responsáveis pela colonização primária, microrganismos

distintos tornam-se capazes de se unirem aos primários, e a partir deste

momento o biofilme começa a se desenvolver com múltiplas espécies

(Rickard et al., 2003), até atingir uma comunidade clímax em duas ou três

semanas (Nyvad; Fejerskov, 1995).

A formação de biofilme tem sido considerada uma

importante estratégia microbiana para a sobrevivência e proliferação no

ambiente bucal. A complexa estrutura do biofilme permite a organização

das populações de microrganismos de modo a oferecer proteção contra

os mecanismos de remoção pela saliva e dificultar a ação de agentes

antimicrobianos (Kirkpatrick et al., 2000).

Por estar intimamente relacionada à formação de

biofilmes, a prevenção da doença cárie baseia-se principalmente na

remoção mecânica desses biofilmes (Marsh; Martin, 1992). No entanto,

muitos indivíduos são incapazes ou desmotivados para realizar esse

procedimento com a regularidade e eficiência necessárias. Outro aspecto

importante foi o aumento nas últimas décadas do uso de agentes anti-

sépticos, o que resultou na seleção de espécies resistentes (Wilson et al.,

1996).

19

Os microrganismos organizados em biofilmes apresentam

características de resistência, principalmente devido a penetração

insuficiente de antimicrobianos, velocidade de crescimento e alteração do

estágio metabólico que garante a sobrevivência de tais células em

ambientes hostis (Stewart; Costerton, 2001). Adicionalmente, os biofilmes

apresentam característica de desenvolvimento e traços fenotípicos

únicos, quando comparados com as mesmas células crescidas em

culturas planctônicas, que os tornam 10 a 1000 vezes mais resistentes a

agentes antimicrobianos e fatores imunes do hospedeiro (Davey; O’Toole,

2000; Zanin et al., 2006).

Frente às limitações dos métodos mecânicos de remoção,

e do decréscimo da susceptibilidade de microrganismos em biofilmes aos

antimicrobianos convencionais, a avaliação da eficácia de novas

alternativas como a TFD, torna-se de interesse científico.

2.1.1 Colonização por Streptococcus mutans

Estreptococos são as bactérias predominantes no biofilme

dentário (Jenkinson; Lamont, 1997), sendo Streptococcus mutans

considerado o principal agente etiológico no desenvolvimento da cárie de

superfície lisa (Shen et al., 2004).

Para aderir à superfície dos dentes no biofilme, S. mutans

produz enzimas extracelulares, como as glicosiltransferases que atuam

na formação dos polissacarídeos extracelulares da sacarose. Os glucanos

promovem o acúmulo dos estreptococos (e outros microrganismos bucais)

na superfície do dente, sendo um fator crítico para a formação e estrutura

integral do biofilme, com o acúmulo de ácidos que levam a diminuição do

pH e desmineralização do esmalte dos dentes (Ooshima et al., 2000;

Duarte et al., 2006).

20

O potencial cariogênico de S. mutans é principalmente

dependente das suas propriedades acidogênicas e da habilidade de se

acumular nos dentes, principalmente devido à síntese de glucanos

extracelulares a partir da sacarose (Gibbons, 1984). A produção de ácidos

e a capacidade de metabolização de substratos em meio ácido, foram os

primeiros fatores de virulência atribuídos a microrganismos específicos

relacionados à etiologia da cárie (Köhler et al., 1995).

Além da tolerância aos ácidos e sua produção, S. mutans

ainda possuem como mecanismos de virulência, a capacidade de

sobrevivência no biofilme dentário devido à alta capacidade de adaptação

ao ambiente, presença de adesinas na superfície celular, produção de

glicosiltransferases, mutacinas e polissacarídeos extracelulares

(Harrington; Russel, 1994; Jackson et al., 1999).

2.1.2 Colonização por Candida albicans

As leveduras mais comuns na cavidade bucal são as do

gênero Candida, sendo Candida albicans considerado um dos fungos

patogênicos normalmente encontrados neste local (O’Sullivan et al.,

2000).

C. albicans são encontradas principalmente no dorso da

língua, onde as papilas filiformes e reentrâncias, como o forame cego e

fissura mediana, servem de sítios que fornecem proteção e favorecem o

desenvolvimento de infecções (Arendorf; Walker, 1980).

A mudança entre a forma de leveduras para hifas

desempenha papel importante no desenvolvimento do biofilme.

Observações realizadas em microscopia demonstraram que as primeiras

camadas do biofilme são formadas pela forma de levedura e em seguida,

nas camadas de hifas, envolvidas por uma extensiva matriz de

21

exopolissacarídeo (Lamfon et al., 2003; El-Azizi et al., 2004; Jãrvensivu et

al., 2004).

Durante a maturação do biofilme, as leveduras

desenvolvem novas propriedades fisiológicas diferentes dos seus

similares planctônicos, o que torna C. albicans resistente a vários

componentes antifúngicos que são rotineiramente utilizados no ambiente

clínico. Dados da literatura relatam que já existem biofilmes formados por

C. albicans resistentes a uma variedade de antifúngicos, incluindo

anfotericina B e fluconazol (Chandra et al., 2001). Os mecanismos

responsáveis pela resistência a antifúngicos podem estar relacionados

com limitações difusionais à passagem do agente pela matriz extracelular,

com as alterações fenotípicas das células no biofilme e ainda com o

desenvolvimento de mecanismos de resistência por alteração do genótipo

das células (Dunne, 2003).

As diferentes formas de candidose bucal, superficial ou

sistêmica, são freqüentemente associadas a biofilmes formados por

C. albicans (Ramage et al., 2005). Porém, existem relatos de isolamento

dessas leveduras em biofilmes dentários (Sen et al., 1997; Nikawa et al.,

1998) coagregadas a espécies bacterianas presentes ou aderidas

diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980; Nikawa et al.,

1998), o que demonstra que os mesmos podem estar correlacionados no

desenvolvimento de cáries e na patogênese de doenças periodontais

(Hannula et al., 2001; Jãrvensivu et al., 2004).

2.1.3 Colonização por Staphylococcus aureus

A espécie Staphylococcus aureus é uma bactéria

reconhecida como um dos principais patógenos responsáveis por ampla

22

incidência de infecções, desde moderadas infecções de pele até

bacteriemias e septicemias graves (Hardy et al., 2004; Kim et al., 2004).

A presença de S. aureus como residente da microbiota

bucal ainda é controversa. Porém, estudos relatam a presença da

bactéria S. aureus na cavidade bucal, sendo neste caso consideradas

pertencentes à microbiota transitória. Dados da literatura revelaram que

94 a 100% dos adultos saudáveis apresentam Staphylococcus spp. na

cavidade bucal, e que o predomínio de S. aureus é de 24 a 36% (Jackson

et al., 1999; Kim et al., 1995).

As infecções bucais causadas por S. aureus incluem:

infecções endodônticas, osteomielites da mandíbula, infecção da glândula

parótida e, uma forma de mucosite oral em idosos, principalmente em

pacientes recebendo nutrição parenteral (Smith et al., 2001).

O uso de antibióticos para o tratamento de doença

periodontal ou outras infecções pode predispor o aumento do número de

Staphylococcus spp. na cavidade bucal, pois estes adquirem facilmente

resistência aos antibióticos podendo resultar em superinfecção. S. aureus

foi o primeiro microrganismo no qual foi verificado o desenvolvimento de

resistência a antibióticos, através do plasmídio ß-lactamase, que

proporcionou resistência à penicilina (Loberto et al., 2004).

Os biofilmes formados por S. aureus são comunidades

embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares, composta

principalmente de polissacarídeos de adesão intercelular (Chokr et al.,

2005), que diminuem a penetração de agentes antimicrobianos,

representando uma significante barreira terapêutica para muitos

antibióticos.

23

2.2 Terapia fotodinâmica (TFD)

A primeira demonstração dos efeitos da TFD sobre

microrganismos foi realizada por Raab em 1900, que durante um estudo

sobre os efeitos da acridina em Paramecium caudatum descobriu que a

associação deste corante com a luz era letal para este protozoário

causador da malária. Em 1907, Von Tappeiner e Jodlbauer demonstraram

a necessidade da presença de oxigênio nas reações de

fotossensibilização e introduziram o termo “Ação Fotodinâmica” para

descrever este fenômeno (Ackroyd et al., 2001).

O processo de TFD pode ocorrer por dois mecanismos. No

mecanismo do tipo I ocorrer a transferência de elétron entre o

fotossensibilizador no estado triplete excitado e componentes do sistema,

gerando íons-radicais que tendem a reagir com o oxigênio no estado

fundamental, resultando em produtos oxidados. Já no mecanismo do tipo

II ocorre a transferência de energia do fotossensibilizador no estado

triplete, com a geração de oxigênio singleto, um agente altamente

citotóxico (Machado, 2000).

2.2.1 Fotossensibilizador

Para produzir o efeito fotodinâmico, o fotossensibilizador

precisa ser biologicamente estável, fotoquimicamente eficiente e

minimamente tóxico aos tecidos normais (Garcez et al., 2003). Quanto

menos tóxicos forem os corantes e com bandas de absorção próximas ao

comprimento de onda das luzes utilizadas, a eficácia da TFD é elevada,

sem causar danos aos tecidos adjacentes (Bhatti et al., 1997).

24

Como a maioria das espécies bacterianas não apresenta

componentes fotossensíveis ao comprimento de onda utilizado, é

importante a utilização de um fotossensibilizador que absorva para si esta

luz e inicie a formação de radicais livres (Wilson et al., 1992). Assim,

células desprovidas de componentes fotossensíveis endógenos podem

tornar-se sensíveis a luz, quando coradas com fotossensibilizadores ou

agentes cromóforos exógenos, como o azul de metileno (AM), azul de

toluidina (AT), eosina e hematoporfirinas (Wilson, 1993).

O AM é um corante catiônico da classe das fenotiazinas.

É solúvel tanto em água como em álcool, e tem sido utilizado como

corante indicador bacteriológico. Seu estudo tem despertado interesse por

apresentar propriedade eletrocatalítica em relação ao NADH, uma

coenzima da classe das desidrogenases, que tem participação em várias

reações enzimáticas (Shiavo et al., 2000).

O AM possui alta absorção de luz, com picos de bandas

em 660 nm, é efetivo na TFD, demonstrando habilidade em gerar

espécies reativas de oxigênio sendo constantemente utilizado em

aplicações clínicas contra diversas doenças (Tardivo et al., 2005).

2.2.2 Laser

A palavra “laser” é o acrônimo de “Light Amplification by

Stimulated Emission of Radiation”, ou seja, “amplificação da luz por

emissão estimulada de radiação”. É uma luz monocromática que produz

linhas espectrais estreitas, altamente direcional, coerente, podendo ser

focalizada em região muito pequena com grande precisão, concentrando

alta quantidade da energia luminosa (Halliday et al., 2003). Os lasers são

classificados em duas famílias conforme sua potência e a capacidade de

interação com os tecidos: laser de baixa intensidade de energia (LILT -

25

Low Intensity Level Treatment); também chamados de terapêuticos e

lasers de alta intensidade de energia (HILT - Hight Intensity Laser

Treatment) conhecidos como cirúrgicos (Neves et al., 2005).

Os lasers de alta intensidade interagem com os tecidos

por reações fototérmicas, nas quais a energia da luz absorvida pelos

tecidos é transformada em calor. Os de baixa potência são baseados em

efeitos onde a radiação absorvida desencadeará reações fotoquímicas ou

fotofísicas intracelulares ou teciduais, não ocorrendo aumento de

temperatura. O comprimento de onda dos lasers pode cobrir do

infravermelho ao ultravioleta, cada tipo emite um determinado

comprimento de onda (Mello et al.,2004; Rosa et al, 2005).

Os lasers de baixa intensidade também denominados

laser mole, laser frio, laser terapêutico ou soft-laser, emitem radiação de

baixa potência, sem potencial destrutivo e possuem uma ação

fotoquímica de analgesia, anti-inflamatória e de bioestimulação tecidual,

caracterizados por um comprimento de onda no espectro eletromagnético

geralmente do ultravioleta ao infravermelho, variando de 630 a 940 nm

(Kurachi et al., 2002). Os lasers de baixa potência mais utilizados na TFD

são aqueles com emissão na região vermelha do espectro

eletromagnético, como os lasers de Hélio Neônio (He-Ne) e diodo

Arseneto Gálio Alumínio (AsGaAl). Os lasers de He-Ne estão sendo

substituídos pelos lasers de diodo, que apresentam maior potência, são

mais robustos, não necessitam de espelhos e possuem menor custo

(Garcez et al., 2003).

2.2.3 Terapia fotodinâmica antimicrobiana

Os primeiros trabalhos utilizando a TFD em bactérias

orais in vitro foram realizados por Wilson et al. (1992) que demonstraram

26

a eficácia de diferentes associados ao laser He-Ne, com 7,3 mW de

potência, na redução de Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium

nucleatum e Actinobacillus actinomycetemcomitans. Os autores

observaram que os fotossensibilizadores AT, AM foram eficazes, pois

possibilitaram a eliminação das quatro espécies, após a exposição a luz

laser por apenas 30 s.

Dobson e Wilson (1992) observaram destruição de

biofilmes formados in vitro por Streptococcus sanguis, Porphyromonas

gingivalis, Fusobacterium nucleatum e Actinobacillus

actinomycetemcomitans, sensibilizados por AT e AM seguido da

irradiação pelo laser de baixa potência He-Ne, com 632,8 nm de

comprimento de onda e potência de 7,3 mW. Estes achados sugerem que

a fotossensibilização letal pode ser um meio eficaz de eliminar as

bactérias periodontopatogênicas do biofilme dental.

Sarkar e Wilson (1993) testaram amostras de biofilme

dentário subgengival de pacientes com periodontite crônica utilizando o

laser com 7,3 mW de potência e AT como fotossensibilizador, o que

reduziu significativamente a viabilidade de bactérias aeróbias e

anaeróbias, sendo esta redução de 94,2% para os estreptococos.

Em 1994, Burns et al. aplicaram laser AsGaAl e o

fotossensibilizador ftalocianina dissulfonada de alumínio (FDA) em

algumas espécies de bactérias cariogênicas tal como Streptococcus

mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei e Actinomyces

viscosus. Os autores relataram que o fotossensibilizador isoladamente

não demonstrou efeito satisfatório na viabilidade dos microrganismos

tratados. Porém, quando o fotossensibilizador foi associado a irradiação

laser foi observada uma redução das bactérias de lesões cariogênicas.

Em estudo realizado para avaliar o potencial bactericida

da TFD na remoção de biofilmes dentários, Wilson (1994) utilizou os

lasers de baixa potência de He-Ne e AsGaAl, conjugados

respectivamente com os fotossensibilizadores AT e FDA por 60 s. O autor

27

confirmou como efetivo o uso da TFD na eliminação de bactérias

cariogênicas e periodontopatogênicas.

Wilson e Pratten (1995) estudaram o efeito da TFD sobre

cepas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina, utilizando um

laser de AsGaAl, de 660 nm de comprimento de onda e 11 mW de

potência, em conjunto com uma FDA por 60 s e 300 s. Os resultados

demonstraram uma redução de 99,6% (60 s) e 99,9% (300 s).

Wood et al. (1999) analisaram, in vitro, o uso da TFD na

eliminação de bactérias em biofilmes formados in vivo, utilizando

ftalocianina catiônica e luz branca de uma lâmpada de filamento de

tungstênio de 600/700 nm de comprimento de onda. Os autores

observaram redução considerável das bactérias do biofilme. Além disso,

os biofilmes tratados apresentaram-se mais delgados e com estruturas

diferentes daquelas dos biofilmes controles.

Usacheva et al. (2001) avaliaram a eficácia bactericida

dos fotossensibilizadores AM e AT sobre diferentes bactérias, na

presença e na ausência dos lasers de argônio e diodo, com 630 e 664 nm

de comprimento de onda, respectivamente. Foram testados os seguintes

microrganismos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,

Enterococcus faecalis, Haemophylus influenzae, Escherichia coli e

Pseudomonas aeruginosa. O aumento da densidade de energia e

potência dos lasers, mantendo a concentração constante de

fotossensibilizador, resultou em uma eliminação maior das bactérias.

Zeina et al. (2001) avaliaram a redução microbiana

através da TFD in vitro, utilizando uma combinação de AM e luz visível e

algumas espécies microbianas representativas daquelas encontradas na

pele saudável e doente como: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Streptococcus pyogenes, Corynebacterium minutissimum,

Propionibacterium acnes e Candida albicans. Todas as espécies testadas

foram susceptíveis à TFD, porém a redução de Candida albicans foi

menor do que as bactérias. Os autores concluíram que a TFD na pele

28

pode representar uma alternativa ao tratamento antimicrobiano

convencional.

Com laser de He-Ne, de 632,8 nm de comprimento de

onda e 35 mW de potência, e o fotossensibilizador AT, Komerik e Wilson

(2002) conseguiram redução microbiana das seguintes bactérias Gram-

negativas: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella

pneumoniae .

Zanin et al. (2002) observaram que quando um “pool” de

saliva humana era sensibilizado por AT e irradiado pelo laser AsGaAl com

660 nm de comprimento de onda, ocorria um efeito bactericida total sobre

estreptococos do grupo mutans, e efeito bactericida parcial sobre

estreptococos totais. A relevância desse estudo está na eliminação das

espécies mais patogênicas com a preservação de parte da microbiota

residente, já que a atividade antimicrobiana sobre todos os

microrganismos da cavidade bucal não é recomendada por tornar o

hospedeiro mais susceptível ao aparecimento de infecções oportunistas.

O’Neill et al. (2002) obtiveram redução de 97,4% dos

microrganismos de biofilmes bucais multi-espécies após a aplicação de

AT e irradiação com laser de He-Ne com 632 nm de comprimento de

onda e 35 mW de potência.

Williams et al. (2003) estudaram a ação antibacteriana do

fotossensibilizador AT e do laser de He-Ne, com 632,8 nm de

comprimento de onda, sobre uma matriz de colágeno e dentina cariada,

ambos infectados por Streptococcus mutans. No colágeno a terapia foi

testada por 30 s e 180 s, já na dentina os tempos utilizados foram de 30 s

e 60 s. Os resultados foram mais eficazes quando utilizado o período de

tempo maior (180 s no colágeno e 60 s na dentina).

Lee et al. (2006) demonstraram a ação do laser diodo na

redução de biofilmes de S. mutans formados em dentina humana com

espessuras variadas (500, 1000 e 2000 µm). Os resultados demonstraram

29

eliminação de 97,7% das bactérias em dentinas com 500 µm de

espessura. Com o aumento da espessura, a redução bacteriana diminuiu.

Soukos et al. (2006) analisaram os efeitos da TFD em

patógenos endodônticos, como Enterococcus faecalis. Os

microrganismos foram sensibilizados com azul de metileno e expostos a

irradiação de luz vermelha por 5 min com 665 nm e densidade de energia

de 35 J/cm2. Os autores concluíram que a TFD pode ser um procedimento

complementar para eliminar microrganismos residuais no canal radicular

após tratamento endodôntico convencional.

Wood et al. (2006) compararam a eficácia do corante

eritrosina, azul de metileno e photofrin em biofilme formado por

Streptococcus mutans. Os corantes foram utilizados e irradiados por 15

min com 400 W de energia. A eritrosina foi mais efetiva do que o

photofrin, que por sua vez foi mais efetivo que o azul de metileno. Os

autores concluíram que a PDT utilizando a eritrosina como

fotossensibilizador é um tratamento eficaz para prevenir a formação do

biofilme dentário.

Garcez et al. (2007) avaliaram o efeito de dois

fotossensibilizadores associados a laser diodo (660 nm) na eliminação de

bactérias em biofilmes crescidos por 3 dias em canais radiculares. A TFD

promoveu uma redução microbiana de 95%, o que, segundo os autores,

pode desempenhar um importante papel na terapia endodôntica.

Fimple et al. (2008) encontraram 80% de redução de

biofilmes multi-espécies do canal radicular, com a aplicação de AM e

irradiação de laser diodo (665 nm), e concluíram que a TFD pode ser um

complemento eficaz ao tratamento endodôntico convencional.

Recentemente, Fontana et al. (2009) compararam o efeito

antimicrobiano do AM e luz vermelha tanto em culturas planctônicas como

em biofilmes multi-espécies formados por bactérias isoladas da cavidade

bucal. Os autores alcançaram 64% e 32% de redução para culturas

planctônicas e biofilmes, respectivamente. Os autores concluíram que os

30

biofilmes formados por bactérias orais são menos afetados pela TFD do

que na forma planctônica.

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo desta dissertação foi avaliar o efeito

antimicrobiano da terapia fotodinâmica, aqui representada pelo

fotossensibilizador azul de metileno e laser de Arseneto Gálio Alumínio

(AsGaAl), na viabilidade de biofilme formados sobre resina acrílica por

Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,

isolados e em associação.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos

Campos/UNESP-SJC, conforme protocolo n° 019/2008 – PH/CEP

(Anexo A)

4.1 Corpos-de-prova

Para o desenvolvimento do presente estudo foram

utilizados como corpos-de-prova 280 discos para confecção de prótese

ocular com pino (Clássico, São Paulo, Brasil), constituídos de resina

acrílica incolor, com 11 mm de diâmetro (figura 1a). Cada corpo-de-prova

recebeu duas camadas de esmalte para unhas (Colorama, São Paulo,

Brasil), no pino (figura 1b) e na base (figura 1c). Desta forma, a área de

aderência do microrganismo para a formação do biofilme foi delimitada

somente para a parte superior do corpo-de-prova. A seguir, os corpos-de-

prova foram embalados e encaminhados para esterilização por radiação

gama (cobalto 60), com dosagem de 20 kGy por 6 h (Embrarad, São

Paulo, Brasil).

33

4.2 Microrganismos e preparo de suspensões padronizadas

Inicialmente foram preparadas suspensões padronizadas

utilizando cepas padrão de C. albicans (ATCC 18804), S. aureus (ATCC

6538) e S. mutans (ATCC 35688). As cepas de C. albicans (figura 2a)

foram repicadas em ágar Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, USA). Já as

cepas de S. aureus (figura 2b) e S. mutans (figura 2c) foram repicadas em

ágar infusão cérebro coração - BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit,

USA).

Os microrganismos foram incubados em estufa

bacteriológica a 37ºC por 24 h. Todos os ensaios com cepas de

S. mutans foram incubados em estufa bacteriológica sob condições de

microaerofilia (5% de CO2).

Decorrido o período de incubação, colônias dos

microrganismos foram suspensas em solução fisiológica esterilizada

(NaCl 0,9%), e ajustada em espectrofotômetro (B 582, Micronal, São

Paulo, Brasil), até obtenção de suspensão padronizada contendo 106

células/mL. Os parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda

utilizados foram, respectivamente: 0,284 e 530 nm para C. albicans (figura

3a), 0,374 e 490 nm para S. aureus (figura 3b), e 0,620 e 398 nm para

S. mutans (figura 3c).

4.3 Grupos e condições experimentais

Após a esterilização, os corpos-de-prova foram divididos

aleatoriamente em 7 grupos, os quais foram submetidos às seguintes

condições experimentais: a) L+F-: biofilmes com a associação de solução

fisiológica e laser; b) L-F+: biofilmes tratados somente com o

34

fotossensibilizador; c) L-F-: biofilmes que receberam apenas solução

fisiológica; e, d) L+F+: biofilmes tratados com o fotossensibilizador e

irradiados pelo laser, conforme quadro 1.

Quadro 1 - Grupos de microrganismos e condições experimentais analisadas

Grupos Condições Experimentais

Microrganismos L+F- L-F+ L-F- L+F+

I – C. albicans 10 10 10 10

II – S. aureus 10 10 10 10

III – S. mutans 10 10 10 10

IV – C. albicans e S. aureus 10 10 10 10

V – C. albicans e S. mutans 10 10 10 10

VI – S. aureus e S. mutans 10 10 10 10

VII - C. albicans, S. aureus e S. mutans 10 10 10 10

Total 70 70 70 70

4.4 Formação dos biofilmes

Os corpos-de-prova esterilizados foram colocados, com o

auxílio de pinça estéril (figura 4a), na primeira fileira de placas de 24

poços (Costar Corning, New York, EUA). Em seguida foram adicionados 2

mL de caldo infusão de cérebro coração - BHI (Brain Heart Infusion, Difco,

Detroit, USA) acrescido de 5% de sacarose em cada poço da placa (figura

4b). Para a formação de biofilmes isolados (grupos I, II e III) cada poço da

placa contendo caldo BHI e um corpo-de-prova foi inoculado com 0,1 mL

da suspensão microbiana (figura 4c). Já nos grupos com associações

(grupos IV, V, VI e VII) foram inoculados 0,1 mL de cada suspensão

35

microbiana referente ao microrganismo utilizado. Por exemplo, para o

grupo IV, foi utilizado 0,1 mL da suspensão de C. albicans e 0,1 mL da

suspensão de S. aureus.

As placas foram mantidas incubadas em estufa

bacteriológica à 37ºC por cinco dias.

4.4.1 Lavagem dos corpos-de-prova

A fim de remover as células microbianas não-aderidas

após o período de formação dos biofilmes, foi realizada a lavagem dos

corpos-de-prova.

Os corpos-de-prova foram transferidos para os poços da

segunda fileira contendo 2 mL de solução fisiológica esterilizada (figura

5a), e a placa foi agitada por 5 min (figura 5b) em agitador orbital (Solab,

Piracicaba, Brasil). Este processo de lavagem foi realizado novamente

nos poços da terceira fileira da placa (figura 5c).

4.5 Terapia fotodinâmica em biofilmes

No processo de TFD foi utilizado laser de baixa potência

de Arseneto Gálio Alumínio (figura 6a) - AsGaAl- (Photon lase III, DMC

Equipamentos, São Carlos, Brasil), com sistema de entrega por fibra

óptica. Como fotossensibilizador foi utilizado azul de metileno (Sigma,

Aldrich, Germany), dissolvido em solução fisiológica esterilizada a uma

concentração de 0,1 mg/mL, seguido de filtração em membrana de

acetato de celulose estéril (figura 6b), com poros de 0,22 µm de diâmetro

(Millipore, São Paulo, Brasil).

36

A irradiação pelo laser AsGaAl, seguiu o protocolo

demonstrado no quadro 2.

Quadro 2 - Protocolo utilizado para irradiação com laser AsGaAl

nm: nanômetros J/cm2:joules por centímetro quadrado J: joules mW: miliwats cm2: centímetro quadrado min: minutos s: segundos

Após a lavagem todos os corpos-de-prova foram

transferidos para a quarta fileira da placa de 24 poços.

Os corpos-de-prova submetidos às condições

experimentais L+F+ e L-F+ receberam 0,1 mL de azul de metileno (figura

7a), por 5 min. Já os corpos-de-prova das condições experimentais L+F- e

L-F- receberam 0,1 mL de solução fisiológica esterilizada, também por 5

min (figura 7b). Decorrido este período, os corpos-de-prova das condições

experimentais L+F+ e L+F- foram irradiados, com as placas abertas, pelo

laser por 98 s (figura 7c).

Todo o experimento de TFD foi realizado no escuro, em

câmara de fluxo laminar, com o auxílio de um anteparo negro fosco

colocado sob as placas para evitar o espalhamento de luz.

Para avaliar o efeito das diferentes condições

experimentais realizadas foram quantificados os números de unidades

formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de microrganismos, obtidos

a partir da suspensão de cada biofilme dos corpos-de-prova.

Comprimento de onda 660 nm

Densidade de energia 10,42 J/cm2

Energia 9,8 J

Potência 100 mW

Área irradiada 0,94 cm2

Tempo 98 s

37

Cada corpo-de-prova foi colocado em um tubo falcon

contendo 10 mL de solução fisiológica esterilizada, e em seguida

homogeneizada por 30 s, utilizando homogeneizador ultra-sônico

(Sonoplus HD 2200 – Bandelin Eletronic) com potência de 50 W (figura

8a), a fim de desprender o biofilme. A suspensão microbiana obtida foi

considerada com fator diluição 10-1, e a partir desta foram realizadas

novas diluições decimais (10-2, 10-3 e 10-4) em solução fisiológica

esterilizada.

Alíquotas de 0,1 mL de cada diluição foram semeadas em

duplicatas em placas de Petri com meio de cultura sólido (figura 8b). No

grupo I, as diluições obtidas do biofilme isolado de C. albicans foram

semeadas em ágar Sabouraud dextrose. Nos biofilmes isolados de

S. aureus e S. mutans (grupos II e III, respectivamente) as diluições foram

semeados em ágar BHI. Já nos grupos mistos, as diluições dos biofilmes

foram semeadas em meios de cultura seletivos para cada microrganismo,

como segue: a) C. albicans em ágar Sabouraud dextrose com 50 mg/L de

cloranfenicol (União Química, São Paulo, Brasil); b) S. aureus em ágar

manitol (Difco, Detroit, USA); e, c) S. mutans em ágar Mitis Salivarius

(Difco, Detroit, USA) acrescido de 0,2 UI/mL de bacitracina (União

Química, São Paulo, Brasil) e 15% de sacarose (MSBS).

As placas foram incubadas em estufa a 37 ºC por 48 h.

Após o período de incubação, as placas contendo de 30 a 300 colônias

foram contadas e o número UFC/mL transformado em logarítmo de base

10 (Log10).

Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente

pela análise de variância ANOVA, teste Tukey, considerando-se diferença

estatística quando p < 0,05, com o software Minitab 14 (Inc. PA, USA).

38

4.6 Microscopia eletrônica de varredura

Com o objetivo de ilustrar os efeitos da TFD sobre os

biofilmes formados nos corpos-de-prova foi realizada a microscopia

eletrônica de varredura (MEV) no Instituto Nacional de Pesquisas

Espaciais (INPE) de São José dos Campos/SP.

Para a MEV os biofilmes foram crescidos conforme

mencionado anteriormente, sendo dois corpos-de-prova por grupo,

(quadro 3) submetidos as condições experimentais L-F- e L+F+.

Quadro 3 - Corpos-de-prova submetidos a microscopia eletrônica de varredura

Grupos Condições Experimentais

Microrganismos L-F- L+F+

I – C. albicans 01 01

II – S. aureus 01 01

III – S. mutans 01 01

IV – C. albicans e S. aureus 01 01

V – C. albicans e S. mutans 01 01

VI – S. aureus e S. mutans 01 01

VII - C. albicans, S. aureus e S. mutans 01 01

Em seguida, os corpos-de-prova transferidos para placas

de 24 poços e fixados em 2 mL de glutaraldeído a 2,5% por 1 h.

Posteriormente os corpos-de-prova foram submersos por 20 min em cada

uma das seguintes concentrações de álcool: 10%, 25%, 50%, 75% e

90%. E finalmente, por 1 h em álcool a 100%. As placas foram incubadas

em estufa bacteriológica por 24 h para a secagem completa dos corpos-

de-prova.

39

Após a secagem os corpos-de-prova foram transferidos

para stubs metálicos (figura 9a) e submetidos ao processo de metalização

por sputtering (Denton Vacuum Desk II, Denton Vacuum, USA) com 10-9

m de espessura de fio de ouro (figuras 9b e 9c). Posteriormente, os

corpos-de-prova foram examinados e fotografados em microscópico

eletrônico de varredura (JSM-5310, JEOL, Japão), operando em 15 kV

nos aumentos de 1000 e 5000 vezes (figura 9d).

40

A B C

Figura 1 – Preparo do corpo-de-prova utilizado para formação de biofilme. a) corpo-de-prova sem pintura; b) corpo-de-prova com o pino pintado; c) corpo-de-prova pronto para esterilização, com pino e base pintados com esmalte para unhas.

A B C

Figura 2 - Placas com crescimentos de 24 h em meio de cultura sólido, dos microrganismos utilizados para a formação dos biofilmes. a) C. albicans em ágar Sabouraud dextrose; b) S. aureus em ágar BHI; c) S. mutans em ágar BHI.

A B C

Figura 3 - Parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda, em

espectrofotômetro, utilizados para os diferentes microrganismos. a) parâmetros utilizados para C. albicans; b) parâmetros utilizados para S. aureus; c) parâmetros utilizados para S. mutans.

A

Figura 4 - Processo de formação do biofilme. a) transferência dos corpos

a primeira fileira da placa de 24 poços; b) adição do caldo BHI sacarosado; c) inoculação da suspensão microbiana.

A

Figura 5 - Lavagem dos corpos

com solução fisiológica esterilizada nos poços da segunda fileira da placa; b) agitador orbital onde as placas permaneceram por 5 minutos para auxiliar o processo de remoção das células lavagem dos corpos

Figura 6 - Laser e fotossensibilizador utilizados na TFD. a) aparelho de laser AsGaAl;

b) filtração do fotossensibilizador azul de metileno.

A B

Processo de formação do biofilme. a) transferência dos corpos-de-a primeira fileira da placa de 24 poços; b) adição do caldo BHI sacarosado;

o da suspensão microbiana.

B

Lavagem dos corpos-de-prova. a) lavagem dos corpos-de-prova realizada com solução fisiológica esterilizada nos poços da segunda fileira da placa; b) agitador orbital onde as placas permaneceram por 5 minutos para auxiliar o processo de remoção das células microbianas não-aderidas; c) repetição da lavagem dos corpos-de-prova na terceira fileira da placa.

A

Laser e fotossensibilizador utilizados na TFD. a) aparelho de laser AsGaAl; b) filtração do fotossensibilizador azul de metileno.

41

C

-prova para a primeira fileira da placa de 24 poços; b) adição do caldo BHI sacarosado;

C

prova realizada com solução fisiológica esterilizada nos poços da segunda fileira da placa; b) agitador orbital onde as placas permaneceram por 5 minutos para auxiliar o

aderidas; c) repetição da

B

Laser e fotossensibilizador utilizados na TFD. a) aparelho de laser AsGaAl;

42

A B C

Figura 7 - Processo de TFD. a) aplicação do fotossensibilizador azul de metileno, por 5

minutos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L-F+; B) aplicação de solução fisiológica, por 5 minutos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F- e L-F-; c) irradiação pelo laser AsGaAl, por 1 minuto e 38 segundos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L+F-.

A B

Figura 8 - Quantificação de microrganismos. a) dispersão do biofilme formado no disco de resina acrílica, através da homogeneização em solução fisiológica com homogeneizador ultra-sônico; b) semeadura em meio de cultura sólido.

43

A B

C D

Figura 9 - Processos de metalização e análise em MEV dos corpos-de-prova; A)

corpos-de-prova no “stub” metálico antes da metalização. B) aparelho metalizador. C) “stub” com os corpos-de-prova metalizados; D) microscópio eletrônico de varredura.

5 RESULTADOS

As médias obtidas através dos ensaios realizados e

as análises estatísticas de UFC/mL (Log10) para os biofilmes isolados de

C. albicans, S. aureus e S. mutans, grupos GI, GII e GIII, estão

apresentadas na tabela 1. Através destes resultados foi possível

visualizar os efeitos produzidos pela TFD nos biofilmes isolados.

Tabela 1 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, nos seguintes grupos: GI - biofilmes de C. albicans; GII - biofilmes de S. aureus; e, GIII - biofilmes de S. mutans

Condição

Experimental

GI – Biofilme de GII – Biofilme de GIII - Biofilme de

C. albicans S. aureus S. mutans

L+F- 5,69±0,03A 5,75±0,04A 5,85±0,02A

L-F+ 5,71±0,04A 5,81±0,04AB 5,87±0,02A

L-F- 5,77±0,03A 5,89±0,03B 5,93±0,04A

L+F+ 3,45±0,12B 2,60±0,21C 3,12±0,13B

Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

Na tabela 2 estão os valores de p obtidos quando as

diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente.

45

Tabela 2 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais nos seguintes grupos: GI - biofilmes de C. albicans; GII - biofilmes de S. aureus; e, GIII - biofilmes de S. mutans

Comparação GI – Biofilme de GII – Biofilme de GIII - Biofilme de


L-F- e L-F+ 0,267 0,371 0,295

L-F- e L+F- 0,052 0,036 0,061

L-F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000

L-F+ e L+F- 0,854 0,636 0,848

L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000

L+F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000

Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

Para os ensaios realizados com biofilmes dos grupos GIV,

GV, GVI e GVII formados pela associação de microrganismos, as médias

e as análises estatísticas, bem como os valores de p obtidos quando as

diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente,

estão apresentadas nas tabelas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

46

Tabela 3 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV: biofilme associado de C. albicans e S. aureus

Condição

Experimental

GIV – Biofilme de

C. albicans S. aureus

L+F- 5,38±0,03A 5,45±0,06A

L-F+ 5,41±0,04A 5,50±0,07AB

L-F- 5,43±0,04A 5,55±0,07B

L+F+ 3,52±0,11B 3,11±0,10C

Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser

Tabela 4 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições

experimentais no grupo GIV: biofilme associado de C. albicans e S. aureus

Comparação GIV – Biofilme de

C. albicans S. aureus

L-F- e L-F+ 0,874 0,555

L-F- e L+F- 0,386 0,056

L-F- e L+F+ 0,000 0,000

L-F+ e L+F- 0,827 0,555

L-F+ e L+F+ 0,000 0,000

L+F- e L+F+ 0,000 0,000


47

Tabela 5 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV: biofilme associado de C. albicans e S. mutans

Condição

Experimental

GV – Biofilme de

C. albicans S. mutans

L+F- 5,42±0,06A 5,63±0,04A

L-F+ 5,43±0,05A 5,66±0,02A

L-F- 5,48±0,05A 5,71±0,04A

L+F+ 3,75±0,14B 3,50±0,15B


Tabela 6 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GV: biofilme associado de C. albicans e S. mutans

Comparação GV – Biofilme de

C. albicans S. mutans

L-F- e L-F+ 0,569 0,421

L-F- e L+F- 0,474 0,156

L-F- e L+F+ 0,000 0,000

L-F+ e L+F- 0,998 0,929

L-F+ e L+F+ 0,000 0,000

L+F- e L+F+ 0,000 0,000


48

Tabela 7 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI: biofilme associado de S. aureus e S. mutans

Condição

Experimental

GVI – Biofilme de

S. aureus S. mutans

L+F- 5,44±0,06A 5,57±0,06A

L-F+ 5,48±0,06A 5,60±0,06A

L-F- 5,53±0,06A 5,65±0,07A

L+F+ 3,31±0,14B 3,55±0,12B


Tabela 8 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições

experimentais no grupo GVI: biofilme associado de C. albicans e S. mutans

Comparação GVI – Biofilme de

S. aureus S. mutans

L-F- e L-F+ 0,672 0,514

L-F- e L+F- 0,107 0,149

L-F- e L+F+ 0,000 0,000

L-F+ e L+F- 0,624 0,858

L-F+ e L+F+ 0,000 0,000

L+F- e L+F+ 0,000 0,000


49

Tabela 9 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII: biofilme associado de C. albicans, S. aureus e S. mutans

Condição

Experimental

GVII – Biofilme de


L+F- 5,07±0,07A 5,08±0,08A 5,14±0,06A

L-F+ 5,08±0,07A 5,13±0,07A 5,15±0,06A

L-F- 5,12±0,07A 5,18±0,06A 5,21±0,06A

L+F+ 4,12±0,11B 3,71±0,20B 3,96±0,10B


Tabela 10 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GVI: biofilme associado de C. albicans, S. aureus e S. mutans

Comparação GVII – Biofilme de


L-F- e L-F+ 0,704 0,741 0,358

L-F- e L+F- 0,637 0,272 0,161

L-F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000

L-F+ e L+F- 0,999 0,842 0,964

L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000

L+F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000


A aplicação do fotossensibilizador azul de metileno por 5

minutos, seguida pela irradiação do laser AsGaAl por

redução significativa no número de UFC/mL (Log

organizados em todos os biofilmes dos grupos testados, quand

comparados com os grupos que receberam somente solução fisiológica

(L-F-). Os percentuais de redução de UFC/mL em

analisados estão ilustrados na figura 10. Nos biofilmes isolados os

percentuais de redução foram:

para. S. aureus (GII)

mistos os percentuais foram

aureus (GIV); 31,54% para

40,12% para S. aureus

C. albicans, 28,41% para

Figura 10 – Médias e desvio

grupos sem aplicação do fotossensibilizador e (L-F-) e, com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do por 98 s (L+F+).

0

10

20

30

40

50

60

GI

Redução Percentual (%) de UFC/m

L

C. albicans S.aureus

licação do fotossensibilizador azul de metileno por 5

minutos, seguida pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s, promoveu uma

redução significativa no número de UFC/mL (Log10) dos microrganismos

organizados em todos os biofilmes dos grupos testados, quand


Os percentuais de redução de UFC/mL em Log10 dos biofilmes


percentuais de redução foram: 40,22% para C. albicans (GI)

(GII); e, 47,35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes

os percentuais foram: 35,08% para C. albicans e 43,9% para

(GIV); 31,54% para C. albicans e 38,7% para S. mutans

aureus e 37,14% S. mutans (GVI); 19,56%

28,41% para S. aureus 24,94% para S. mutans (GVII)

Médias e desvio-padrão das reduções de UFC/mL (Log10) obtidas entre os sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser

) e, com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do (L+F+).

GII GIII GIV GV GVI

Grupos

S.aureus S. mutans

50

licação do fotossensibilizador azul de metileno por 5

, promoveu uma

) dos microrganismos

organizados em todos os biofilmes dos grupos testados, quando


dos biofilmes


(GI); 55,91%

(GIII). Nos biofilmes

e 43,9% para S.

S. mutans (GV);

19,56% para

(GVII).

) obtidas entre os irradiado pelo laser

) e, com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser

GVII

51

Pela análise das imagens produzidas por MEV foi

possível visualizar a aderência dos microrganismos apresentadas pelos

diferentes grupos, condição controle (L-F-), bem como compará-las com

os mesmos submetidos ao processo de TFD (L+F+). Através desta

comparação, observou-se que as reduções ocorreram

predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes (figuras 11 a

17).

52

A B

C D

Figura 11 – MEV de biofilmes de C. albicans (grupo I) formados em corpos-de-prova de

resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

53

A B

C D

Figura 12 – MEV de biofilmes de S. aureus (grupo II) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

54

A B

C D

Figura 13 – MEV de biofilmes de S. mutans (grupo III) formados em corpos-de-prova de

resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

Figura 14 – MEV de biofilmes de associados de

formados em corposA) MEV do corpofotossensibilizador e MEV do corpoirradiação do de-prova com biofilmepelo laser (Laplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do (L+F+), aumento de 5000x.

A

C

MEV de biofilmes de associados de C. albicans e S. aureus formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo

prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não(L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-

aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser (L+F+), aumento de 5000x.

55

B

D

(grupo IV) prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento.

sem aplicação do ), aumento de 1000x; B)

fotossensibilizador por 5 min e (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-

não-irradiado -prova com

laser por 98 s

56

A B

C D

Figura 15 – MEV de biofilmes de associados de C. albicans e S. mutans (grupo V)

formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

57

A B

C D

Figura 16 – MEV de biofilmes de associados de S. aureus e S. mutans (grupo VI)

formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

58

A B

C D

Figura 17 – MEV de biofilmes de associados de C. albicans, S. aureus e S. mutans

(grupo VII) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

6 DISCUSSÃO

A análise macroscópica dos biofilmes formados nos

corpos-de-prova de resina acrílica, após 5 dias de crescimento, revelou

padrões diferenciados para os grupos com microrganismos isolados em

relação aqueles onde houve associação microbiana.

Nos grupos com microrganismos isolados, observou-se

no GI ausência de biofilme visível a olho nu, formado pela levedura

C. albicans. Já no grupo GII, o biofilme formado por S. aureus foi mais

visível. Entretanto, o grupo GIII de S. mutans foi aquele onde se obteve

biofilme mais aparente.

Nas associações de microrganismos, a análise

macroscópica mostrou aumento da espessura dos biofilmes formados. Tal

característica ficou mais evidente quando os microrganismos C. albicans

e S. mutans foram inoculados juntos, o que produziu um biofilme mais

espesso. Resultado semelhante foi obtido por Barbieri et al. (2007), que

ao analisarem a aderência, in vitro, de S. mutans na superfície dentária

verificaram que a mesma foi mais extensa quando esta bactéria foi

cultivada com C. albicans. Esses dados indicam que a interação de C.

albicans e S. mutans em biofilmes pode ter uma característica

mutualística, onde ambos os microrganismos são favorecidos.

Corroborando com esta afirmação, Branting et al. (1989), ao estudarem

a aderência de C. albicans em associação com S. mutans em

superfícies acrílicas, sugeriram que a presença de glucanos insolúveis

produzidos pela bactéria podem aumentar a capacidade adesiva da

levedura. Ainda sobre tal característica, Barbieri et al. (2007) concluíram

que as células de C. albicans poderiam ser usadas pela bactéria S.

mutans como suporte para sua aderência.

60

Os biofilmes representam o tipo de crescimento

microbiano predominante na natureza e são cruciais no desenvolvimento

de infecções, uma vez que servem de nicho aos agentes patogênicos e

estão associados a altos níveis de resistência aos antimicrobianos (Kuhn

et al. 2002).

Pode-se atribuir ao biofilme uma série de vantagens para

a colônia microbiana, como melhor comunicação entre células, em função

da continuidade entre as mesmas, o que facilita as atividades

bioquímicas, maior proliferação, acesso a nichos e recursos que não

poderiam ser utilizados por células isoladas e a defesa coletiva contra os

mecanismos de remoção pela saliva e ação de agentes antimicrobianos

(Kirkpatrick et al. 2000).

Neste contexto, a TFD surge como uma alternativa de

tratamento, pois apresenta potente atividade antimicrobiana, apresenta

baixo custo, efeitos colaterais mínimos, ausência de efeitos sistêmicos e

não causa resistência microbiana (Garcez et al., 2003).

A TFD é baseada nos chamados fotossensibilizadores

que são ativados por luz, com comprimento de onda apropriado, gerando

espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singleto, e superóxidos

(Machado 2000, Romanova et al. 2003). Estes produtos são citotóxicos

para a célula alvo, causando desordens na parede celular (Malik et al.

1990) e danos no DNA (Romanova et al. 2003), levando a morte do

microrganismo.

No presente estudo a fotossensibilização pelo AM por 5

min, seguido pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s (L+F+), promoveu

reduções estatisticamente significantes nos biofilmes formados em resina

acrílica em todos os grupos analisados, tanto em relação aqueles onde só

foram utilizadas solução fisiológica, considerado controle (L-F-), quanto

nas demais condições experimentais testadas (L-F+ e L+F-). Esta

redução foi mais acentuada quando os microrganismos estavam

organizados em biofilmes isolados.

61

Dentre os biofilmes isolados, aqueles formados por

C. albicans (GI) foram os que sofreram menores reduções, apresentando

média de 2,32 Log10 (40,22%) em relação aos controles. No estudo de

Donnelly et al. (2007), os biofilmes formados por uma cepa de C. albicans

isolada de da cavidade bucal de um paciente com estomatite, crescidos

por 24 h em discos plásticos, apresentaram reduções que variaram de 1,5

log10 até 100%, de acordo com o tempo de incubação do

fotossensibilizador AT e o aumento da densidade de energia da fonte de

luz utilizada (635 nm).

Os biofilmes mais sensíveis a TFD foram aqueles

formados isoladamente por S. aureus, os quais apresentaram uma

redução média de 3,29 Log10 (47,35%). Lin et al., (2004) obtiveram

reduções que variaram de 1,2 log até 100%, quando biofilmes de

S. aureus foram submetidos ao fotossensibilizador merocianina por 10

min, seguido de irradiação por diferentes densidades de energia de uma

fonte de luz verde (512 nm). Já no estudo de Sharma et al. (2008), a

média de redução foi de aproximadamente 3,5 log em biofilmes formados

por uma cepa de S. aureus resistente a meticilina, tratados com AT e

irradiados por laser (640 nm).

A TFD promoveu redução média de 2,81 Log10 (55,91%)

nos biofilmes isolados formados por S. mutans (GIII). Resultado

semelhante foi obtido por Wood et al. (2006), que alcançaram reduções

de 1,5 a 2,6 Log10 em biofilmes de S. mutans com 2 e 12 dias de

crescimento, respectivamente, quando utilizaram o fotossensibilizador AM

em conjunto com uma fonte de luz de 400 W. No estudo realizado por

Zanin et al. (2005), os autores também encontraram reduções similares,

de 2,10 a 3,11 log10 de S. mutans organizados em biofilmes tratados com

AT, conforme o aumento do tempo de irradiação pelo laser He-Ne (632,8

nm).

Os biofilmes mistos foram mais resistentes aos processos

de TFD utilizados no presente estudo, com reduções médias que

62

variaram de 1,00 (19,56%) até 2,44 (43,9%) log10. Estes resultados

demonstram que quanto mais complexo o biofilme, maior é a resistência a

TFD.

Qin et al. (2008) também conseguiram uma redução

mínima, em torno de 21%, do biofilme coletado de pacientes com

periodontite, com a aplicação do AT e laser diodo. Porém no estudo

realizado por Müller et al. (2007) com biofilmes mistos crescidos em

discos de esmalte bovino, foi alcançada redução de apenas 0,4 log10,

considerada sem diferença estatística, com a aplicação de azul de

metileno e laser diodo (665 nm).

Atualmente, existe um consenso de que a obtenção de

efeito antimicrobiano de um determinado agente sobre microrganismos

crescidos em cultura planctônica é apenas um dado indicativo. Os

microrganismos organizados na forma de biofilmes apresentam um

aumento expressivo de resistência aos agentes antimicrobianos (Mah;

O`Toole, 2001). Esta resistência parece estar relacionada à presença da

matriz de polissacarídeos, a alterações na composição da parede celular,

a uma taxa de crescimento celular mais lento, bem como pela expressão

de genes de resistência aos agentes antimicrobianos (Costerton et al.,

1999). Assim, quando estudamos o uso TFD sobre biofilmes devemos

considerar que essas bactérias encontram-se mais resistentes.

Através de relatos da literatura, se observou uma

diferença quanto aos efeitos produzidos pela TFD em culturas

planctônicas dos mesmos microrganismos utilizados no presente estudo.

De acordo com os estudos de William et al. (2003) e Bevilacqua et al.

(2007), onde foi utilizado o fotossensibilizador AT e laser diodo no

primeiro e, Led no segundo, ambos conseguiram reduções de 100%

de S. mutans em culturas planctônicas.

Porém, em outros estudos as reduções encontradas

foram similares, ou até menores as mesmas obtidas na presente

dissertação. Em relação às reduções similares, o estudo realizado por

63

Peloi et al. (2008) com células em suspensão, utilizando Led (663 nm) e

fotossensibilizador AM, as reduções foram de 2,32 a 3,69 log10 e 2,78 a

3,88 log10, para S. aureus e C. albicans, respectivamente, conforme o

aumento do tempo de irradiação da fonte de luz. Outro Já no trabalho

realizado por Souza et al., (2006) com culturas planctônicas de C.

albicans, as reduções obtidas foram inferiores as observadas no atual

estudo, com 0,99 log10 com aplicação de AM e laser diodo (685 nm).

Alguns autores concluíram que a capacidade de formar

biofilmes está estritamente relacionada com a resistência dos

microrganismos a TFD. Gad et al. (2004) relataram que as cepas de S.

aureus incazapes de produzir biofilmes são as mais sensíveis aos

procedimentos de TFD. Esta informação ficou mais evidente no estudo

realizado por Grinholc et al. (2008), onde cepas de S. aureus formadoras

de biofilmes foram mais resistentes, do que as mesmas sem esta

capacidade, quando sensibilizadas por porfirina e irradiadas por fonte de

luz de 624 nm.

Além da resistência produzida por cepas formadoras de

biofilmes a TFD, alguns parâmetros utilizados são alterados para que os

efeitos produzidos nessas situações sejam semelhantes àqueles obtidos

em culturas planctônicas de microrganismos. Lin et al. (2004)

demonstraram que as doses de luz requeridas para inativar biofilmes de

S. aureus, usando merocianina 540, são muito mais altas daquelas

utilizadas para culturas planctônicas, devido a penetração de luz dentro

dos biofilmes. No estudo realizado por Donnelly et al. (2007), também

foram observadas tais diferenças pois os autores necessitaram de

concentrações maiores de fotossensibilizador e doses mais altas de laser

para conseguir reduções iguais de C. albicans em biofilmes em relação

aos seus similares planctônicos.

A diferença de susceptibilidade de microrganismos em

culturas planctônicas e biofilmes, também foram encontradas em outras

espécies. Rovaldi et al. (2000) obitveram 6 log10 de redução pela

64

fotossensibilização com AM e laser de baixa potência. Entretanto, o

mesmo modelo de tratamento aplicado às amostras de biofilmes

bacterianos, isolados do periodonto de pacientes, realizado por Soukos et

al. (2003), reduziu uma média de 2 Log10.

Em relação aos efeitos isolados do laser (L+F-), foram

observadas reduções significativas nos biofilmes isolados de S. aureus

(GII), quando comparadas com a condição controle (L-F-), o que sugere

uma possível suscetibilidade deste microrganismo ao laser.

O efeito isolado do fotossensibilizador AM na ausência de

irradiação laser (L-F+) não apresentou diferença estatisticamente

significante em relação a condição controle (L-F-) em todos os grupos

analisados. Estes resultados sugerem que o AM não possui efeito

citotóxico para os microrganismos testados. Porém tais dados divergem

de relatos de estudos nos quais, sem a irradiação de luz, o AM

demonstrou atividade antifúngica e antibacteriana natural (Wainwright e

Crossley, 2002, Calzavara-Pinton et al., 2005).

Através das imagens de MEV pode-se observar que a

TFD produziu reduções predominantemente nas primeiras camadas dos

biofilmes, deixando alguns microrganismos em seu interior. De acordo

com O'Neill et al. (2002), este fato pode ser devido a incapacidade do

fotossensibilizador de se difundir através das camadas superficiais para

as mais internas do biofilme. Isto ilustra um potencial problema associado

a TFD, que segundo os autores, poderia ser superado com a seleção de

um fotossensibilizador capaz de penetrar através da matriz do biofilme,

seguido pela irradiação interna do mesmo através de fibra óptica.

As divergências encontradas no presente estudo, em

relação à literatura vigente, devem-se a ausência de protocolos pré-

definidos para utilização da TFD. Ocorre que a grande variedade de

modelos laboratoriais, luzes, fotossensibilizadores e parâmetros utilizados

para se estudar a TFD sobre biofilmes orais, tornam a comparação dos

resultados bastante complexa. A concentração, tempo de incubação e

65

tipo do fotossensibilizador, além do estágio fisiológico dos

microrganismos, período de exposição e densidade de energia do laser,

também pode influenciar os resultados da técnica de TFD (Wilson e Mia,

1993).

7 CONCLUSÃO

Tendo em vista os parâmetros utilizados, pode-se concluir

que a terapia fotodinâmica (TFD), representada neste estudo pela

fotossensibilização com azul de metileno seguida pela irradiação com

laser de baixa potência AsGaAl, apresentou significativo efeito

antimicrobiano nos biofilmes formados in vitro pelos microrganismos

C. albicans, S. aureus e S. mutans, isolados e em associações. Assim,

parece ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais.

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78

APÊNDICE A – Dados individuais dos ensaios realizados para cada

grupo de biofilme

Tabela 11 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GI de biofilme de C. albicans.

Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+

1 5,74 5,76 5,80 3,40

2 5,68 5,70 5,81 3,48

3 5,69 5,71 5,73 3,30

4 5,65 5,62 5,76 3,43

5 5,70 5,77 5,79 3,30

6 5,72 5,71 5,76 3,54

7 5,69 5,76 5,78 3,34

8 5,69 5,72 5,75 3,48

9 5,67 5,69 5,73 3,65

10 5,66 5,68 5,75 3,54

Média 5,69A 5,71A 5,77A 3,45B

DP 0,03 0,04 0,03 0,12

Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

79

Tabela 12 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GII de biofilme de S. aureus


1 5,72 5,81 5,88 2,60

2 5,82 5,88 5,90 2,30

3 5,73 5,73 5,86 2,48

4 5,73 5,80 5,95 2,70

5 5,74 5,83 5,88 2,90

6 5,78 5,83 5,93 2,30

7 5,72 5,81 5,89 2,85

8 5,72 5,80 5,92 2,60

9 5,78 5,83 5,91 2,48

10 5,81 5,82 5,83 2,78

Média 5,75A 5,81AB 5,89B 2,60C

DP 0,04 0,04 0,03 0,21


80

Tabela 13 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIII de biofilme de S. mutans


1 5,83 5,83 5,94 3,15

2 5,81 5,86 5,95 3,18

3 5,88 5,89 5,91 3,00

4 5,86 5,88 5,89 3,08

5 5,88 5,90 5,98 3,18

6 5,83 5,90 5,93 3,00

7 5,83 5,85 5,87 3,00

8 5,86 5,89 5,90 3,34

9 5,84 5,88 5,98 3,30

10 5,87 5,86 5,94 3,00

Média 5,85A 5,87A 5,93A 3,12B

DP 0,02 0,02 0,04 0,13


81

Tabela 14 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV de biofilme de C. albicans e S. aureus. Os dados referem-se a levedura C. albicans


1 5,35 5,45 5,40 3,38

2 5,40 5,38 5,41 3,48

3 5,38 5,37 5,38 3,60

4 5,36 5,34 5,40 3,48

5 5,34 5,40 5,45 3,40

6 5,41 5,44 5,48 3,70

7 5,37 5,45 5,51 3,54

8 5,38 5,40 5,41 3,65

9 5,45 5,45 5,45 3,60

10 5,37 5,38 5,39 3,40

Média 5,38A 5,41A 5,43A 3,52B

DP 0,03 0,04 0,04 0,11


82

Tabela 15 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV de biofilme de C. albicans e S. aureus. Os dados referem-se a bactéria S. aureus


1 5,54 5,59 5,62 3,04

2 5,54 5,54 5,57 3,00

3 5,38 5,41 5,45 3,18

4 5,45 5,63 5,69 3,08

5 5,39 5,54 5,56 3,18

6 5,40 5,43 5,54 3,00

7 5,51 5,47 5,57 3,18

8 5,45 5,43 5,46 3,20

9 5,45 5,51 5,53 3,26

10 5,43 5,45 5,47 3,00

Média 5,45A 5,50AB 5,55B 3,11C

DP 0,06 0,07 0,07 0,10


83

Tabela 16 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV de biofilme de C. albicans e S. mutans. Os dados referem-se a levedura C. albicans


1 5,32 5,34 5,41 3,85

2 5,40 5,45 5,45 3,78

3 5,52 5,41 5,57 3,70

4 5,51 5,53 5,54 3,88

5 5,42 5,44 5,46 3,90

6 5,38 5,45 5,48 3,81

7 5,37 5,40 5,45 3,70

8 5,43 5,38 5,44 3,48

9 5,45 5,46 5,51 3,54

10 5,40 5,40 5,45 3,85

Média 5,42A 5,43A 5,48A 3,75B

DP 0,06 0,05 0,05 0,14


84

Tabela 17 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV de biofilme de C. albicans e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans


1 5,53 5,68 5,66 3,48

2 5,67 5,62 5,72 3,30

3 5,65 5,64 5,68 3,65

4 5,60 5,63 5,66 3,40

5 5,63 5,66 5,72 3,70

6 5,65 5,64 5,76 3,60

7 5,67 5,68 5,71 3,54

8 5,64 5,66 5,72 3,30

9 5,62 5,70 5,73 3,38

10 5,68 5,65 5,76 3,65

Média 5,63A 5,66A 5,71A 3,50B

DP 0,04 0,02 0,04 0,15


85

Tabela 18 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI de biofilme de S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. aureus


1 5,47 5,48 5,59 3,00

2 5,40 5,42 5,45 3,34

3 5,46 5,51 5,56 3,30

4 5,34 5,40 5,45 3,40

5 5,36 5,45 5,51 3,18

6 5,46 5,57 5,62 3,40

7 5,48 5,54 5,54 3,30

8 5,40 5,40 5,45 3,48

9 5,46 5,51 5,54 3,40

10 5,54 5,56 5,57 3,30

Média 5,44A 5,48A 5,53A 3,31B

DP 0,06 0,06 0,06 0,14


86

Tabela 19 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI de biofilme de S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans


1 5,53 5,58 5,62 3,70

2 5,53 5,57 5,68 3,54

3 5,62 5,65 5,65 3,60

4 5,56 5,62 5,66 3,70

5 5,48 5,51 5,53 3,54

6 5,68 5,68 5,76 3,48

7 5,62 5,65 5,68 3,65

8 5,60 5,64 5,71 3,48

9 5,53 5,51 5,54 3,54

10 5,60 5,63 5,72 3,30

Média 5,57A 5,60A 5,65A 3,55B

DP 0,06 0,06 0,07 0,12


87

Tabela 20 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans, S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a levedura C. albicans


1 5,08 5,10 5,11 4,26

2 5,11 5,08 5,15 4,00

3 5,00 5,06 5,10 3,95

4 4,95 5,00 5,04 4,20

5 5,10 5,08 5,11 4,11

6 5,13 5,15 5,15 4,15

7 5,11 5,13 5,18 4,08

8 5,13 5,08 5,16 4,00

9 5,16 5,18 5,20 4,23

10 4,98 4,93 4,98 4,18

Média 5,07A 5,08A 5,12A 4,12B

DP 0,07 0,07 0,07 0,11


88

Tabela 21 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans, S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. aureus


1 5,02 5,08 5,18 3,30

2 5,10 5,11 5,18 3,78

3 5,11 5,18 5,26 3,70

4 5,00 5,04 5,11 3,85

5 5,11 5,11 5,13 3,90

6 5,16 5,18 5,20 3,60

7 5,13 5,20 5,23 3,48

8 5,22 5,24 5,26 3,85

9 5,00 5,02 5,06 3,70

10 4,98 5,10 5,18 3,90

Média 5,08A 5,13A 5,18A 3,71B

DP 0,08 0,07 0,06 0,20


89

Tabela 22 – Números de UFC/mL (Log10), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans, S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans


1 5,13 5,16 5,30 4,04

2 5,18 5,22 5,28 4,11

3 5,08 5,11 5,15 3,95

4 5,20 5,24 5,27 3,90

5 5,15 5,11 5,15 3,78

6 5,08 5,10 5,13 3,85

7 5,26 5,23 5,26 4,00

8 5,15 5,18 5,23 3,90

9 5,11 5,08 5,18 3,95

10 5,04 5,11 5,15 4,08

Média 5,14A 5,15A 5,21A 3,96B

DP 0,06 0,06 0,06 0,10


90

ANEXO A – Certificado do comitê de ética em pesquisa

Pereira CA. In vitro effects of photodynamic therapy in biofilms of Candida albicans, Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans. [dissertation]. São José dos Campos: School of Dentistry of São José dos Campos, UNESP – São Paulo State University; 2009.

ABSTRACT The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial effect of photodynamic therapy (PDT) in biofilms formed by C. albicans (GI), S. aureus (GII) and S. mutans (GIII), alone and in associations (GIV-GVII).The biofilms were grown in acrylic resin discs immersed in sterile brain heart infusion broth (BHI) containing 5% sucrose, inoculated with microbial suspension and incubated for 5 days. On the fifth day, the discs were washed in sterile saline solution in order to remove loosely bound material. The effects of the methylene blue (MB) photosensitizers at a concentration of 0,1 mg/mL for 5 min and AsGaAl laser (660 nm) for 98 s, alone and conjugated were evaluated. The dics were placed into tubes with sterile saline solution and sonicated for 30 s in order to disperse the biofilms. Ten-fold serial dilutions were carried out and aliquots plated in selective agar which were then incubated for 48 h. Then the numbers CFU/mL (log10) were counted and analyzed statistically (ANOVA, Tukey´s test, p< 0,05). Scanning electron microscopy (SEM) on discs with PDT and control biofilms groups were performed. Significant decreases in the viability of all microorganisms were observed when biofilms were exposed to both MB and laser. Reductions (log10) in single-species biofilms were greater than associated biofilms with: 40.22% for C. albicans (GI), 55.91% for S. aureus (GII) and 47.35% for S. mutans (GIII). In associated biofilms the reductions (Log10) were: 35.08% for C. albicans and 43.9% for S. aureus (GIV); 31.54% for C. albicans and 38.7% for S. mutans (GV); 40.12% for S. aureus and 37.14% for S. mutans (GVI); 19.56% for C. albicans, 28.41% for S. aureus and 24.94% for S. mutans (GVII). Scanning electron microscopy micrographs suggested that lethal photosensitization occurred predominantly in the outermost layers of the biofilms. It was concluded that PDT using MB photosensitizer and laser may be a useful approach in the control of oral biofilms. Keywords: Biofilm. Candida albicans. Staphylococcus aureus. Streptococcus mutans. Photododynamic therapy.

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