Cristalização de Macromoléculas Biológicas

Laboratório de Sistemas Biomoleculares

Departamento de FísicaIBILCE-UNESP

A cristalografia de raios X revela as posições tridimensionais da maioria dos átomos em uma molécula de proteína.

As características da estrutura terciária revelam muito sobre as funções das proteínas e suas evoluções.

Aspectos Gerais

Para que obter cristais de macromoléculas?

O objetivo da cristalização de uma

macromolécula biológica, tal como, proteína ou

ácido nucléico, é o estudo estrutural dessas

macromoléculas, pelo método de difração de

raios X.

Purificação da Macromolécula

Cristalização

Coleta de Dados

Densidade Eletrônica

Refinamento do Modelo

Estrutura

Resolução de Estrutura

•Toxinas:problemas vasculares, processos inflamatórios, mecanismos de dor, processos alérgicos, asma bronquial drogas anti-trombóticas e drogas anti-convulsivante

Estrutura cristalográfica de toxinas do escorpião Hottentottajudaica (esquerda) e da bactéria Clostridium tetani.

• Quinases: Sua função é ativar ou desativar cada etapa do ciclo celular, desde a duplicação do DNA até a separação em duas células→ drogas contra o câncer.

Estrutura terciária da quinase dependente de ciclina humana (CDK).

• Hemoglobinas: compreensão dos mecanismos funcionais de Hbs normais e mutantes, bem como, Hbs talassêmicas e relacionadas à anemia.

Estrutura quaternária de hemoglobinas, do lobo guará (esquerda) e humana (direita).

Princípios Gerais para Cristalização de

Macromoléculas Biológicas

Parte crítica: obter cristais.

Cristais de INHA de Mycobacterium tuberculosis, PNP humana e Hemoglobina do peixe Hoplosternum littorale.

Pureza da Macromolécula

• A purificação é um ponto importante para a cristalização;

• A cristalização de uma amostra de proteína não pura, resulta em cristais pequenos e mal formados;

• Uma amostra de macromolécula deve estar, no mínimo, 97% pura e um cristal deve ter, no mínimo, 0,2mm de tamanho.

Cristais pequenos e/ou mal formados

Estabilização e Armazenamento

• Armazenadas em soluções com propriedades próximas às do meio celular;

• A desnaturação é minimizada evitando-se condições extremas de pH e temperatura;

• Agentes bactericidas ou fungicidas podem ser adicionados.

Nucleação, Crescimento e término do crescimento.

• Nucleação: formação dos primeiros agregados ordenados. Requer um estado de supersaturação.

• Crescimento: É o aumento do cristal.

• Término do crescimento: Desconsiderando algumas causas, tais como, remoção da macromolécula do meio de cristalização, tem-se: defeitos de crescimento, defeitos das faces, envelhecimento da macromolécula, etc.

Cristais imperfeitos

Fatores que Afetam a Cristalização

• Temperatura: a solubilidade de uma proteína édependente da temperatura, assim, é necessário que os experimentos de cristalização sejam realizados em temperatura constante;

•pH: proteínas são polieletrólitos com uma carga líquida que varia conforme o pH. Quando a carga líquida de uma proteína é nula, a proteína apresenta uma maior facilidade em se agregar;

• Compostos Orgânicos e Polímeros: os polietilenoglicóis

influenciam na cristalização diminuindo a atividade de água,

ou seja, diminuindo a quantidade destas moléculas em

solução e assim, a solução é levada a um estado de

supersaturação;

Força Iônica: Os sais podem diminuir ou aumentar a

solubilidade de uma proteína;

Efeito de Solubilização por Sais

Salting-inOs íons interagem com os grupos iônicos das moléculas, diminuindo as interações soluto-soluto e, aumentando a solubilidade.

Representação esquemática da solubilização por salting-in.

Salting-out

Os íons atraem as moléculas de água resultando em menor disponibilidade das mesmas para realizar interações com as moléculas de proteína.

Diagrama de fases de Macromoléculas Biológicas

Representação do diagrama de fases de macromoléculas biológicas

Técnicas de Cristalização

O método da Matriz Esparsa

• Dra. Jaru Jancarick (UC Berkeley);

• Diversas condições são testadas;

•Três parâmetros como variáveis principais:pH, aditivos e agentes precipitantes

SaisTartarato de Sódio e Potássio; Fosfato de Amônio; Sulfato de Amônio;

Acetato de Sódio; Sulfato de Lítio; Formiato de Sódio e Potássio; Citrato deSódio; Formiato de Magnésio.

Não Voláteis

MDP;PEG 400; PEG1500; PEG 4000; PEG 8000

Voláteis

2-Propanol

Mistura

Sulfato de Amônio+PEG; 2-Propanol + PEG

Aditivos

Cloreto de Cálcio, Citrato de sódio, Cloreto de Magnésio, Acetato deAmônio, Sulfato de Amônio, Acetato de Magnésio, Acetato de Zinco e

Acetato de Cálcio.

Faixa de pH

4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5

Tabela 1. Componentes do método da matriz esparsa.

Kits para cristalização da Hampton Research®

Screens

Cristalização em Batch

A macromolécula é misturada ao agente cristalizante atingindo a supersaturação instantaneamente.

Representação da cristalização em batch.

Cristalização por Difusão de Vapor

A supersaturação é alcançada por meio da difusão das espécies voláteis.

Representação da montagem de uma gota de cristalização.

Passos para montagem de um placa de cristalização

Análise das gotas de cristalização

Cristalização por Diálise

A solução precipitante pode ser facilmente trocada.

Cristalização de proteínas por diálise.

Cristalização por Microdiálise

Cristalização de proteínas pelo processo de microdiálise.

Melhoria das Condições de Cristalização

Passo 1) Diminuição da concentração da macromolécula.

Após uma semana, se não houver melhora nos cristais:

Passo 2) Manter a concentração da macromolécula biológica e

abaixar a concentração do agente precipitante.

Após uma semana, se ainda não houver melhora nos cristais:

Passo 3) Tentar microssemeadura ou macrossemeadura, ou

tentar variar a temperatura.

Cristais adequados para coleta de dados de difração de raios X

Como identificar cristais de proteínas?

Cristais de proteína corados com Izit

Cristalização Coleta de dados

LNLS Difração de raios X

Resolução da estrutura

cristalográficaAnálise

Montagem dos cristais

Analisando o modelo

Qual o grande objetivo da cristalografia de proteínas?

Cristalizando proteínas na presença de ligantes

Há duas alternativas:

• por co-cristalização, incubando-se a proteína com

o(s) ligante(s)

• Soaking, adicionando o(s) ligante(s) no cristal já

formado

Desenho de Drogas

Sítio ativo da PNP humana, na presença do substrato e na presença de um inibidor.

Inosina Imucilina H

Mapa de densidade eletrônica da região do sítio ativo da PNP humana na presença de ligantes.