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CLEIDE MARIA SENRA VENOSA CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DO CULTIVO DE Aspergillus niger NRRL 337 EM MEIO CONTENDO FARINHA DE MANDIOCA COMO PRINCIPAL FONTE DE CARBONO - INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE FARINHA DE MANDIOCA E DA TEMPERATURA DE FERMENTAÇÃO Díssertapão apresentada a Escola Politécnica da Universidade de São Paulo para a obtenção do Título de "Mestre em Engenharia" SÃO PAULO 1972

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CLEIDE MARIA SENRA VENOSA

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DO CULTIVO DE

Aspergillus niger NRRL 337 EM MEIO CONTENDO

FARINHA DE MANDIOCA COMO PRINCIPAL

FONTE DE CARBONO

- INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE FARINHA DE MANDIOCA

E DA TEMPERATURA DE FERMENTAÇÃO

D í s s e r t a p ã o a p r e s e n t a d a a E s c o l a

P o l i t é c n i c a da U n i v e r s i d a d e de

S ã o P a u l o para a o b t e n ç ã o d o

T í t u l o de "Mest re e m E n g e n h a r i a "

SÃO PAULO

1972

CLEIDE MARIA SENRA VENOSA

CONTRIBUIÇÃO ÂO ESTUDO DO CULTIVO DE

A*-r.;:* niger NRRL 337 EM MESO CONTENDO

FARINHA DE MANDIOCA COMO PRINCIPAL

FONTE DE CARBONO

- INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE FARINHA DE MANDIOCA

E DA TEMPERATURA DE FERMENTAÇÃO

D i s s e r t a ç ã o apresentada a E s c o l a P o l i t é c n i c a da U n i v e r s i d a d e de

S ã o P a u l o para a obtenção do

T í t u l o d e " M e s t r e e m E n g e n h a r i a "

Orientador:

Prof. Dr. Walter Borzani

SAO PAULO

1 9 7 2

AGRADECIMENTOS

Agradeço»

Ao orientador Prof. Dr. Walter Borzani, Professor Titular do

Departamento de Engenharia Química da E.P..U.S.P. pela segurança e dedi­

cação com as quais conduziu este trabalho.

À Fundação de Amparo n Pesquisa do Estado de São Paulo, pela

Bolsa de estudos concedida durante a execução deste trabalho.

Ao Prof» Dr. Giovanni Hrunello, Chefe do Departamento de Enge

nharia Química da E.P.U.S.P. por ter permitido o uso dos laboratórios

do Departamento para a realização dos trabalhos experimentais e dos ser

riços de datilografia do Departamento.

Aos companheiros Eng. Eduardo Walter Leser e Eng. Verônica

Maria Negreiros do Couto Martins pelas sugestões e colaboração na execu

çao de todos os trabalhos experimentais.

Ao Eng» Antonio Maria Francisco Luiz José Bonomi pela elabora­

ção da programação de computador utilizada neste trabalho.

Ao moinho OClílM pelo fornecimento da farinha de raspa de mandi

oca.

Ao Dr„ Willibaldo Schmidell Netto, à Dra. Marina Lia Ribeiro

Vairo e ao Eng, José Luiz Magnnni pelas sugestões emitidas.

Ao Prof. Dr. Miguel Falcone, Professor Adjunto do Departamento

de Engenharia Química da E.P.U . S. P . por sugestões emitidas durante a

execução das experiências e pala revisão dos origina is.

Ao Prof, Dr. Robert Wasicky do Departamento de Farmac ia da Fa­

culdade de Ciências Farmacêuticas da U.S.P. pela realização das a n á l i ­

ses de identificação dos açucares.

Ao Riof. Dr. Franco Maria Lajolo do Departamento de Alimentos

e Nutrição Experimental da U.S.P. por efetuar os ensaios de determinação

do teor de nitrogênio.

Ao Professor Antonio C. de Matos Paiva da Escola Paulista de

Medicina, pelas determinações de aminoácidos»

Ao Laboratório Flrury de Análises Clinicas pela permissão do .

uso do contador eletrônico de partículas*

A Srtas. Sxel Ribeiro de Lima e fiaria das Graças Henriques

de Araujo pelos serviços de datilografia.

Ao Sr» Smanoel Robles dp Departamento de Engenharia Naval

pela execução dos desenhos».

Aos funcionários Maria de Lourdes Guedes Dutra. Euclides Go-~

ro.es de Lima e Benedito Candido de Oliveira pela colaboração prestada

•durante a realização deste trabalho.

R E S U M O :

Estudou-se a influência da temperatura de fermentação (25,

30. 35. 40 e 45°C) e da concentração de farinha de mandioca (20, 30,

40 e 50 g/l) no cultivo do Aspergillus niger NRRL 337 em frascos

agitados e em meios contendo farinha de mandioca como principal fon­

te de carbono. Apresenta-se um modelo cinético que explica as varia

ções de concentrações de glicídeos durante o crescimento do microrga

nismo. 0 modelo permite calcular diversos parâmetros do processo fer

mentativo estudado.

A B S T R A C T .

The author studied the influence of the temperature ( 25 ,

30, 35, 40 and 15oc) and of the cassava meal concentration (20, 30,

40 and 50 g/l) on shaken flaks cultures of Aspergillus niger NRRL -

337 carried out in culture media containing cassava meal as the

main carbon source. A kinetic model is presented to explain the vari­

ation of carbohydrate concentrations during the cell growth. The

proposed model permits to calculated several parameters of the fer¬

mentation process.

índice

1 a I n t P O d U Ç £ Q . e . . « , s 9 o e « o « * • • fl • , e « « « ^ » ^ 1

2* Etapas do trabalho 5

3» Revisão bibliográfica 8

4. Materiais e métodos 10

4.1 Microrganismo 10

4.2 Conservação da cultura do A. niger NRRL 337 11

4.3 Matéria prima . 12

4.4 Determinação da umidade da farinha 13

4.5 Determinação da porcentagem de amido na farinha 13

4.6 Determinação do teor de açúcares redutores na farinha . . 15

4.7 Determinação do teor de açúcares redutores totais na fari­

nha 16

4.8 Preparo dos meios de fermentação à base de farinha de man-

5 Í. O C & . . « . » « . . ,„ • • • • • • • • • •« • 9 « • O 10

4.9 Evaporação do meio de fermentação na esterilização . . , , 17

4.10 Evaporação do meio de fermentação em agitador rotativo 18

4.11 Determinação das concentrações de A.R. e de A,R,T, do

meio de fermentação 18

4.12 Determinação da concentração celular . 19

4.13 Preparo do inoculo 22

4.14 Ensaios visando o estudo da influência da temperatura e

da concentração de farinha de mandioca na hidrólise do

araido da farinha de mandioca pelo A. niger 22

4.15 Determinação do rendimento do processo fermentativo . . 26

4.16 Identificação dos açúcares formados . 28

4.17 Determinação do teor de nitrogênio . . . . 28

4.18 Determinação do teor de aminoácidos 28

4.19 Receitas dos meios de cultura 29

5. Resultados 32

5.1 Verificação qualitativa do poder amilolítico do microrga-—

5.2 Conservação da cultura do A.niger NRUL 337 32

5.3 Determinação da umidade da farinha de mandioca 32

5.4 Determinação de percentagem de amido da farinha . . . . 33

5.5 Determinação do t<?or de açucares redutores na farinha . . 35

5.6 Determinação do teor de açucares redutores totais na f a ­

rinha 3 5

5.7 Evaporação do meto de fermentação na esterilização . . . . 36

5.8 Evaporação do meio de fermentação em agitador rotativo . . 36

5.9 Ensaios visando o estudo da influência da temperatura e da

concentração d» farinha de mandioca na hidrolise do amido

da farinha de mandioca pelo A. niger 42

5.10 Determinação do rendimento do processo fermentativo . . . 73

5.11 Identificação dos açúcares formados 73

5.12 Determinação do teor de nitrogénio 74

5.13 Determinação do t^or de aminoácidos 75

6. Modelo cinético 76

7. Discussão dos resultados 102

8. Conclusões 118

9. Assuntos a pesquisar 121

10. Bibliografia 122

-1 -

CAPÍTULO - I

Os laboratórios de Engenharia Bioquímica da Escola Pol i técni_

ca (Universidade de são Paulo) , da Escola de Engenharia Mauá ( Institu

to Mauâ de Tecnologia) e da Faculdade de Engenharia Industrial ( Ponti

fícia Universidade Católica de são Paulo) vêm, aproximadamente há três

anos, trabalhando em conjunto sobre tópicos relativos a produção de

concentrados proteicos de origem microbiana ("single cell protein") .

A importância do assunto, os diversos problemas direta ou in

diretamente ligados à produção e a utilização desses concentrados, bem

'como o que poderá vir a ser a contribuição dessa tecnologia a solução

do grave problema da escassez mundial de proteínas, são aspectos que

já foram por diversas vezes destacados em excelentes trabalhos de rovi

sao. Neste particular, parece-nos desnecessária uma indicação de to

das as revisões conhecidas, bastando citar as recentes publicações de

Mateles e Tannenbaum ( 1 ) , Tannenbaum (2) e de Mc Loughlin (3) .

Os trabalhos em realização nas três Escolas citadas estão

distribuídos da seguinte maneira:

1. Na Escola Politécnica: obtenção de concentrados proteicos a

partir de mandioca pela ação de Aspergillus niger e Asper

gillus oryzae;

— 2 —

a) Temperatura (em °C) : 25, 30, 35, 40 e 45.

b) Concentração de farinha de mandioca (em g/litro) : 20, 30, 40 e

50 .

Outros fatores constituem objeto de estudo de Dissertações de

Mestrado em andamento.

Cumpre, neste ponto, justificar a escolha da matéria prima e

do microrganismo utilizados nos ensaios.

2. Na Escola de Engenharia Mauá e na Faculdade de Engenharia Indus

trial: obtenção de concentrados proteicos a partir de óleo die

sei bahiano pela ação de Cândida guilllermondii;

abrangendo atividades de pesquisa de oito Engenheiros Químicos cândida

tos ao Mestrado*

Esta Dissertação apresenta os resultados obtidos em um desses

trabalhos de Mestrado e se bem que, de per si, conduza a conclusões vá

lidas, é evidente que um exame mais geral do problema só poderá ser efe

tuado quando tiverem sido publicadas as outras duas Dissertações rela_

cionadas aos trabalhos com mandioca*

A presente Dissertação tem por finalidade estudar a influen¬

cia da temperatura e da concentração de farinha de mandioca no desenvol^

vimento do Aspergillus niger NRRL 337. Foram estudados os seguintes

níveis?

~3~

O objetivo, a mais longo prazo, dos trabalhos em desenvolvi

mento com mandioca, é o estabelecimento de um processo de tratamento

de resíduos de fecularias que conduza a dois resultados práticos, a

saber» redução dos problemas de poluição provocados por aquelas indus

irias e obtenção de um concentrado proteico que possa ser utilizado ,

pelo menos, na alimentação de animais. Nesta primeira etapa dos traba

lhos, pretende-se estudar o processo de um ponto de vista fundamental,

medindo-se velocidades, calculando-se parâmetros e examinando-se a in

fluência de fatores na transformação da matéria prima em material ce

lular. Os resultados desses trabalhos fundamentais permitirão, com

maior segurança, estudar o processo de tratamento dos resíduos em

apreço»

A escolha de um bolor se deve ao fato de que, em comunica»

çoes recentes ( 4 a 7) , os bolores têm sido apontados como uma prova

vel boa solução para o problema dos concentrados proteicos. Particu

lar atenção vem sendo devotada a esse assunto pelo The Lord Rank Re

search Center, da Inglaterra. Entre os bolores selecionamos o Asper

gillus niger NRRL 337 por seu conhecido e elevado poder amilolítico.

Espera-se, em futuro próximo, graças a trabalhos em realiza

ção no laboratório do Prof.Dr Lucio Penna de Carvalho Lima, contar cora

microrganismos isolados de nossas mandiocas, provavelmente mais eficJL

entes que os que vêm sendo utilizados até o momento.

Parece-nos adequado, ao terminar esta introdução, reprodu

zir um trecho de uma conferencia proferida em 17 de outubro de 1968

pelo Prof. A. Spicer, do The Lord Rank Research Center, em uma reuni^

ão conjunta do The Food Nutrition Group of the Royai Society of Che­

mical Industry (7) .

Nessa conferencia, realizada na The Royal Society, em Londres, 0

Prof* Spicer divulgou forccalmente a sseguinte resolugao do Board da

Insti tuiga-r. que representava :

** The Board considers that our work on the production of

proteins and protein enriched foods by fermentation ba

sed on carbohydrate substrates, in line with our Patent

Application, is of such vital importance to this Group

that it should be treated as being of top priority as

far as capital investment is concerned.

The Board has it very much in mind that any product re

suiting from this development could make a most impor¬

tant contribution to reducing human malnutrition through

out the under-developed world".

5 -

CAPÍTULO II

ETAPAS DO TRABALHO

A parte experimental foi desenvolvida segundo o esquema ge

ral representado na Fig» 2.1»

0 trabalho que conduziu à presente Dissertação compreendeu

as seguintes etapas principais?

1, Escolha de uma técnica de preparo do inoculo (suspensão de

e s p o r o s ) , de maneira a se operar, tanto quanto possível, sem

pre nas mesmas condições,

2» Escolha das condições de preparo do meio nutriente de modo

a se conseguir?

a) fluidez adequada à fermentação em frascos agitados

b) esterilização do meio sem escurecimento da farinha de

mandioca*

c) concentrações de farinha variáveis em um intervalo que

compreende os valores frequentemente encontrados em águas

residuárias de feculariasj

d) pll arbitrariamente escolhido no intervalo favorável a mai.

oria dos bolores»

3, Escolha das temperaturas de fermentação compreendendo o in

tervalo favorável à maioria dos bolores .

-6 -

4. Fixação das demais condições de fermentação, a saberí

a) relação entre o volesme de liquido e a capacidade do frasco;

o) tipo de rodilha© de algodão utilizado;

c) Frequência e excentricidade do agitador rotativo»

5, Verificação da perda por evaporação, nas condições de incuba»

cão, do meio de fermentação, a fim de poder corrigir, se neces

sário, as consequentes variações de concentrações,

8» 0 andamento do processe foi acompanhado verificando-se a pre

sença ou não de amido por* r«tição qualitativa cota lugol e me

dindo-se periodicamentej

a) pH do meio;

b) concentração de açucares redutores na fase liquida;

c) concentração de açucares redutores totais no sistema em fer

mentação;

d) concentração final de microrganismos.

-7 -

Cultura pura Farinha de

nandi oca

Cultivo em meio sói i

lido para obtenção j p a r o

de esporos m e i o

Preparo da suspençáo Esterilização

d® esporos em erlenrneyers

(inoculo)

Incubação em

agitador rotativo

A m o s 1r a s p a r a

controles perió

d icos

Fig. 2,1: Representação esquemática das fases principais do trabalho

experimental.

- 8 -

CAPÍTULO - III

REVISÃO BIBLIOGRlPICA

A importância da mandioca como alimento do homem e de ani

mais e como matéria prima de indústrias diversas, já foi objeto de

muitas publicações. Em artigo recente ( 8 ) t ao lado da revisão de

fatos conhecidos e do exame de aspectos econômicos relacionados com

o assunto, o autor da ênfase especial á mandioca como matéria prima

potencialmente indicada para indústrias nas quais vêm sendo utiliza

dos, até o momento, apenas milho, outros cereais e batata. Destaca

ainda o autor a posição do Brasil como primeiro produtor mundial de

mandioca, com 29,20 milhões de toneladas anuais, seguido imediata

mente da Indonésia cora 11,80 milhões, em levantamento realizado pe

la FAO em 1968 compreendendo 88 países e uma produção total de

85,63 milhões de toneladas.

0 uso da mandioca como matéria prima em processos fermen

tativos e conhecido, no Brasil, desde antes de seu descobrimento. 0

cauim, bebida largamente consumida entre os índios brasileiros, era

preparada com mandioca cozida (9) por um processo precário de hidró

lise e de fermentação.

Entre as relativamente pouco numerosas citações bibliográ

ficas relativas à utilização de mandioca como matéria prima na fa

bricaçao de substancias e de bebidas por fermentação, podem ser ci

- 0 -

tados os seguintes trabalhos. Almeida (10,11), Maia ( 1 2 ) , Teixeira

e colaboradores (13) , Teixeira (14) e Liames (15) aponta» a mandi

oca como matéria prima em íersasníaçao alcoólica, Underkofler e

íSickey (16) indicam-na para as fermentações alcoólicas e acetona -

butanólica, e Prescott e Dum* (17) referem-se, além disso, à adi_

çao de mandioca ao malte na fabricação de cerveja.

Mais escassas sâo as referencias ao emprego de mandioca,

na produção de proteínas microbianas»

Gray e colaboradores (4) referem-se a resultados satisfa

tórios obtidos com mandioca e diversos microrganismos, sem muitos

detalhes, Em trabalho posterior, Gray (5) cita novamente a mandio

ea com© matéria prima na produção de proteínas microbianas por fun

gos» Jarl (18), descrevendo eumnriamente o processo Symba, refo

re-se ao poss ível emprego de mandioca como matéria prima, utilizan

do Endomycopsis fibuliger e Cândida uttlis como microrganismos-

responsáveis pelo processo,, Brook e colaboradores (6) descrevem -

sumariamente a produção de proteinas por bolores a partir da man

dioca em meio "sói ido" e em meio liquide, Spicer (19) , em confe

* rd rencia realizada no 3 International „Congress of Food Science &

Technology, em 1970, refere-se ao emprego de mandioca na produção

de proteinas microbianas, ao lado de outras matérias primas, Tan

nenbaum (2) destaca a importância da mandioca na possível produção

de proteínas em países tropicais.

Nota-se, nos trabalhos consultados, escassez de detalhes

e de informações relativas à cinética e ao estudo da influência de

A .

fatores no desenvolvimento dos processos descritos.

-.10-

CAPfTUL0_j;:_JLV-

0 microrganismo utilizado «os ensaios foi o Aspergillus

que vinha sendo conservado no meio de cultura

M.l. *•)

A verificação qualitativa do poder amilolítico desse mi

crcrganísmo foi realizada empregando'-se o meio de cultura M . 2 , a

base de amido. 0 ensaio foi realizado da seguinte maneira: colo-

carasi-se 20 ml de meio a base de amido, previamente esterilizado,

em uraa placa de Petri, previamente esterilizada. A inoculação

com o Ac. aií|er foi feita com aux de uaa alça metálica, fazen

do-se ua risco no meio da cultura, A placa de Petri foi incubada

a 3Q°C? durante' 48 horas. Decorridas as 48 horas de incubação ,

despejou-se sobre a cultura 2,0 ml de solução de iodo (lugol) com

a seguinte composição:

Iodo 1,0 g

lodeto de potássio, 2,0 g

Agua destilada 300 ml

(*) Ver receitas dos meios de cultura no final deste Capítulo.

-II-

Esta solução tem a propriedade de colorir o amido de

eaiil» Se nos locais próximos ao desenvolvimento do microganismo

o meio de cultura apresentar zonas claras é sinal que o micror

ganismo produziu amilase e esta hidrolisou o amido»

4 * 2 ~ CONSERVAÇÃO DA CULTORA DO A. NIGER NRRL 337

Com a finalidade de selecionar um meio mais adequado â

conservação da cultura do A, niger visando maior produção de

amilase, foram ensaiados os meios de cultura M . 3 , M . 4 , M»5, M.6,

M . 7 , M.8 e M.9.

Cultivou-se o A» niger nos meios citados, em diferen

tes tempos de incubação (24, 48, 72 e 96 h) a 30°C. A partir de

cada cultura, inoculou-se meio sói ido à base de amido ( M . 2 ) , con

tido em placas de Petri, por meio de um toque com alça metálica»

As placas de Petri foram incubadas durante 48 horas a 30°C. Após

a incubação despejou-se sobre cada placa de Petri 2,0 ml de lu

gol. Ao redor do local inoculado, em virtude do poder amilolíti

co do microrganismo, o meio a base de amido não se tornou azul ,

havendo a formação de um halo. Pode-se então, por medida do dia

metro médio, calculado como média das medidas de dois diâmetros-

ortogonais, do halo formado, fazer uma comparação entre o poder

amilolítico do A. niger proveniente dos diversos meios em que

foi cultivado.

-12

Convém salientar que com este ensaio nao se pretendeu £a

«ar otimização de raeio de cultura, mas sim obter, dentre os sete

meios utilizados, uma avaliação qualitativa daquele que traria me

Inores resultados em ensaios futuros»

Éste ensaio foi real i«ado era triplicata„

4.3 - MATÉRIA PRIMA

A matéria prima usada foi a farinha de raspa de mandio¬

ca, procedente da fecularia Agro Feculeira Industrial de Araras e

fornecida pelo moinho OCRIM.

A farinha de raspa de mandioca é obtida por moagem da

"raspa de mandioca, proveniente de descase amen to, quebra e secagem

da mandioca,

A mandioca pertence à família Euphorbiaceae (13), porém

ainda não existem critérios definitivos para a classificação das

diversas espécies e variedades encontradas, o que impossibilita,no

momento, a identificação do material utilizado*

Em nosso laboratorio, a farinha de raspa de mandioca so

fren um tratamento de selecionamento, sendo peneirada em peneiras-

TYLER de 200 "mesh" (diâmetro nominal da malha 0,053 mm) . A eaco

lha dessa granulometria foi feita tomando-se por base o trabalho

de Brook e colaboradores (6) e visando principalmente aumentar a

velocidade de transformação do material pela ação microbiana.

A farinha de raspa de mandioca peneirada foi armazenada

em erlenmeyers de 5|, tapados com rolha de cortiça,

À farinha de raspa de mandioca obtida desta maneira foi

a utilizada nos ensaios, e será daqui por diante designada sim

plesraente por farinha»

4 * 4 ~ DETERMINAÇÃO DA UMIDADE DA FARINHA

A determinação da umidade da farinha foi efetuada pelo-

método de Jones(20) que consta do seguintes pesar exatamente em

torno de 5g de material em um pesa filtro de 38 a 64 mm de diame

tro e cuja altura não exceda 50 mm, provido da respectiva tampa ;

coloca-se o pesa filtro em uma estufa mantida a 100°C; após 5 ho

ras, tapa-se o pesa filtro, tira-se da estufa e deixa-se esfriar

em dessecador até temperatura ambiente e pesa-se em seguida.

4.5 - DETERMINAÇÃO DA P O R C E N T A G E M D E A M I D O NA FARINHA

A determinação da porcentagem de amido na farinha foi

realizada segundo o método de Sachsse (21) descrito a seguir: agi

tar uma quantidade conveniente da amostra (2,5 a 3,0 g de material

em base seca) em um erlenmeyer com 50 ml de água fria por 1 hora.

Transferir quantitativamente para um filtro e lavar cora 250 ml de

água fria. Aquecer o resíduo insolúvel por 2h 30 min com 200 ml

de água e 20 ml de HC1 (densidade relativa 1,125) em um balão pro

vido com condesador de refluxo. Resfriar e neutralizar comfaidró

xido de sódio.

Completar o volume a 500 ml em balão volumétrico, filtrar e deter

minar os açúcares calculados como glicose. A massa de glicose mui

tiplicada pelo fator 0,90 fornece a massa do amido.

A dosagem dos açúcares redutores, calculados como gli

cose, foi efetuada pelo método de Somogyi (22) que utiliza os se

guintes reagentes:

Solução I s 16g de Na H C 0 3 , 12g de sal de Rochelle, 24g de

Na_C0_ e 144g de N a o S 0 . dissolvidos em água des

tilada e diluidos a 800 ml.

Solução II : 36g de Na*SO* dissolvidos em 100 ml de uma solu

çao a 40g/l de C u S 0 4 . 5» 20 e diluidos a 200 ml

em água destilada.

Solução III: 25g de ( N H 4 ) 6 M o , 0 2 4 . 4 H 20 dissolvidos era 450

ml de água destilada ; adicionar 21 ml de solu

ção de HgSO* concentrada, juntar uma solução de Na SI AgO* . 7 11*0

(3g cm 25 ml de água destilada) . Homogeneizar e deixar em estufa-

a 37°C por 24 a 48h. Guardar em frasco escuro.

A técnica usada foi a seguinte: colocar 1,0ml de solução

de açúcar em tubo Follin - Wu . Adicionar 1,0 ml de mistura 4:1

(era volume) das soluções I e II. Aquecer em banho de água ferven

te durante 10 minutos exatos. Resfriar, adicionar 2,0 ml de solu

ção III, agitar bem até terminar o desprendimento gasoso e comple

tar volume a 25 ml, em balão volumétrico, com água destilada.

-15-

Paralelamente fazer prova em "branco", substituindo 1,0 sal de solu

ção de açúcar por l f0 ml de água destilada. A partir da transini

tancia medida a 540 um e da curva de calibração previamente cons

truída, calcula-se a concentração de açúcares redutores na alíquo­

ta usada.

0 ácido clorídrico disponível em nossos laboratórios

apresentava densidade relativa igual a 1,18 , o que requeria um

volume de água destilada de 208,1 ml para 13,9 ml de ácido para

efetuar a hidrolise nas mesmas condições descritas pelo método de

Sachsse.

Os tubos de Follin- Wu , citados no método de Somogyi, f o

ram substituídos por tubos de ensaio de 160 mm de comprimento e

10 mm de diâmetro, sem orla, fechados com rolha de borracha possu

indo uma fenda para permitir a saída dos gases.

0 espectrofotômetro usado para as leituras de transmitais

cia foi do tipo Coleman Júnior II, Ho dei o 6/20; previamente cali*

brado com soluções de glicose de concentrações conhecidas.

4.6 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES REDUTORES NA FARINHA

A solubilizaçao e separação por filtração dos açúcares

redutores da farinha foram feitas segundo o método de Sachsse (21),

sendo o filtrado diluido a 500,0 ml em balão volumétrico.

Os açúcares redutores, calculados como glicose, (abrevia

damente indicados por A.R) foram determinados pelo método de Somo

gyi (22), em uma alíquota do filtrado, da maneira descrita no item

4.5 .

4.7 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇUCARES REDUTORES TOTAIS NA FARINHA

A concentração de açúcares redutores totais, calculada

como glicose (abreviadamente indicada por A.R.T.) foi determinada

pelo método de Sachsse (21), eliminando-se a fase de solubilizaçao

e separação dos A.R. As dosagens dos açúcares redutores foram rea

lizadas pelo método de Somogyi (22) conforme técnica descrita no

item 4.5 .

4.8 - PREPARO DOS MEIOS DE FERMENTAÇÃO Â BASE DE FARINHA DE MAND10

CA

Em erlenmeyers de 250 ml colocaram-se massas convenien

tes de farinha e 50 ml do meio líquido M.10 . As massas de fari

nhn ensaiadas foram l,0g, 1,5g , 2,0g , e 2,5 g correspondendo a

20, 30, 40 e 50g de farinha por 1itro de meio, respectivamente.

Os frascos foram fechados com rodilhões de algodão hidró

fobo envoltos em gase. Esses rodilhões foram padronizados, possuin

do cada um deles 4,0g de algodão hidrófobo.

Com isto procurou-se evitar que rodilhões diferentes pu

dessem influir nas velocidades de troca de oxigênio.

As condições de esterilização foram 30 minutos a 12 0°C

Por simplicidade, esses meios serão designados apenas

como meios de fermentação.

Com a finalidade de melhorar a fluidez do meio de fer

mentação foram realizados ensaios com meios de fermentação conten

do 50 g/l de farinha e soluções 0,10 N; 0, 080 N, 0, 060 N, 0, 040 N,

0, 020 N, 0,010 N e 0, 0050 N de HC1 que conduziram a meios fluidos,

Porém para soluções cuja concentração de HC1 estava acima de -

0,010 N verificou-se alteração na cor do material (este se apre

sentava mais escuro) . Passou-se então a usar, no preparo do meio

de fermentação, solução de HC1 0,0050 N que, por simples observa­

ção visual, apresentava melhores resultados. Convém salientar que

no preparo da solução de HC1 0,0050 N dos meios de fermentação

usou-se água potável*

4 , 9 " EVAPORAÇÃO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO NA ESTERILIZAÇÃO

0 objetivo deste ensaio foi verificar se a evaporação

porventura havida na esterilização poderia provocar mudança signi

ficativa das concentrações no meio de fermentação,

Para tanto, prepararam-se 20 erlenmeyers de 250 ml con

tendo 50 ml de meio de fermentação com concentração de farinha de

50 g/l.

-18-

Determinaram-se as massas dos frascos antes e após a esterilização»

Por diferença, determinou-se a perda de massa na esterilização a

120°C, durante 30 minutos.

4.10 - EVAPORAÇÃO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO EM AGITADOR ROTATIVO

Este ensaio foi realizado com a finalidade de verificar

se a evaporação do meio de fermentação em agitador rotativo, com

circulação de ar, a 300 rpm, excentricidade de 2, 54 cm, durante 49

horas, a uma determinada temperatura, poderia provocar variações

significativas das concentrações no meio de fermentação.

Com esse objetivo prepararam-se 3 erlenmeyers de 250 ml

contendo 50 ml de meio de fermentação com concentração de farinha

de 50 g/l, esterilizados, da maneira descrita no item 4.8. Em segui

da determinou-se a massa de cada um dos frascos e colocou-se em agi

tador rotativo à uma determinada temperatura. De 6 em 6 horas òs

frascos eram retirados e, após pesagem, recolocados imediatamente -

no agitador, nas mesmas condições de temperatura e agitação.

Este ensaio foi realizado nas temperaturas de 25, 30, 40

e 450C.

4.11 - DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE A.R. E DE A.R.T. DO MEIO

DE FERMENTAÇÃO

As determinações das concentrações dos A.R. e dos A.R.T.,

-19-

calculados como glicose, foram efetuados do seguinte modo; de cada

erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio de fermentação, reti

rou-se uma alíquota de aproximadamente 10 ml. Esta alíquota foi

centrifugada a 14.000 rpm ou 12.300 x g durante 15 minutos. Em se

guida, retirou-se 1,0 ml do líquido sobrenadante no qual determi­

nou-se a concentração dosA.R», calculados como glicose, segundo o

método de Somogyi (22) . 0 restante do centrifugado foi transferido

quantitativamente para o frasco de origem. Todo o material conti

do neste frasco foi transferido para ura balão de 500 ml ao qual

adicionou-se água destilada, até que o material contido no balão

apresentasse uma massa de 208,1 g , e 13,9 ml de solução de HC1

(densidade relativa 1,18) . A seguir, procedeu-se a hidrolise ác¿

da do material, conforme técnica descrita no método de Sachsse(21)

Após resfriamento até temperatura ambiente elevou-se o volume do

hidrolisado a 500 ml, em balão volumétrico, filtrou-se em papel de

filtro analítico e determinou-se a concentração dos A.R.T., calcu

lados como glicose, pelo método de Somogyi (22), em uma alíquota -

do filtrado previamente neutralizada com solução 1,5 N de NaOH.

4 , 1 2 ~ DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Existem diversas técnicas que nos permitem a avaliação

da concentração celular em uma fermentação quando se trabalha cora

meio líquido.

20-

Poréra quando o moio liquido pos .sue solidos em suspensão e o micror

ganismo se desenvolve em forma filamentosa, nenhuma técnica conhe

cida se aplica com precisão»

Em trabalho publicado por Brook e colaboradores (6) é ci_

tado um método de recuperação de células filamentosas crescendo em

meio â base de farinha de mandioca. 0 método, em resumo, consta¬

do seguinte: a farinha de mandioca utilizada passava em peneiras

de 200 "mesh" (diâmetro nominal da malha 0,53 mm) ; a recuperação

do micelio era feita por filtrnçao a vacuo em peneiras de 100

"mesh" (diâmetro nominal da malha 0,1lOmm), o que provocaria reten

ção apenas do micélio» Desta forma seria evitada a interferência-

da farinha de mandioca na determinação da concentração celular»

Procurou-se, então, fazer ensaios prévios a fira de veri*

ficar a aplicabilidade do método descrito. Esses ensaios deram

origem a uma nota (23) e nos permitiram chegar a algumas conclu

soes: os valores de concentrações celulares obtidos pelo método

citado por Brook e colaboradores ( 6 ) , embora não representem a con

centração microbiana real, podem servir como índice dessa concen

tração, quando o bolor cresce na forma de "pellets" pois são repro

dutíveis e proporcionais à concentração verdadeira. Porém quando o

crescimento do microrganismo se dá sob a forma de micelio desagre

gado, o método citado por Brook não se aplica, devido â impossibi

lidade da realização da filtração à vácuo em telas de 100 "mesh".

Por não se ter encontrado um método de inoculação, com o

microrganismo na forma de "pellets", de modo que a concentração

inicial cie inoculo em todos os frascos de uni mesmo ensaio, conten

do meio de fermentação, fosse constante, a inoculação foi feita d_i

retamente com suspensão de esporos. A inoculação dos meios de fer

mentação com suspensão de esporos vai acarretar, nas condições ado

tadas, o crescimento do A. niger na forma de micélio desagregado.

Desta forma não foi possível acompanhar o desenvolvimento do mi_

crorganismo durante o processo fermentativo por medidas de concen¬

tração celular, por não se ter encontrado nenhum método aplicável»

Entretanto foi possível determinar a' concentração celu

lar no final do processo fermentativo, quando não havia mais a in

fluência da farinha por ter esta sofrido ataque microbiano. Essa

determinação foi feita da seguinte forma: no final de cada ensaio

de fermentação (item 4.14) efetuaram-se duas operações de centrifu

gaçao a 2.500 rpm,ou 1.100 x g, e lavagem do conteúdo total de 6

erlenmeyers. Em seguida procedeu-se a uma filtração por gravidade,

em papel de filtro analítico, do material centri fugado que posteri

ormente foi secado em estufa, com convecção natural a (105 * 2)©C,

durante 3 horas. Decorrido esse tempo o material foi esfriado até

temperatura ambiente em dessecador e sua massa determinada em ba

lança analítica. As concentrações celulares serão sempre expressas

em gramas de matéria seca por litro.

cl 1fl ™

4.13 - PREPARAÇÃO DO INOCULO

A inoculação do meio de fermentação foi feita com suspensão

de esporos» Para tanto, os esporos do A. niger foram cultivados em

um erlemeyer de 250 tnl contendo 100 ml de meio solido M.6, a base de

farinha de banana, inclinado de modo a não tocar o rodilhão, e incuba

dos em estufa a 30°C durante 7 dias. Após o período de incubação os

esporos foram suspensos, com auxílio de pérolas de vidro, em 80 ml de

solução aquosa de Tween-40 (15 mg/l) , previamente esterilizada. Em se

guida esta suspensão foi transferida para dois erlenraeyers de 125 ml

previamente esterilizados, contendo pérolas de vidro, e agitada vigo

rosamente durante 10 minutos. Após a agitação essa suspensão foi fi1_

trada assepticamente. 0 meio filtrante utilizado foi 1,0 g de lã de

3 A

vidro compactada em um volume de 9,5 cm em um tubo de 2,3 cm de dia

metro (Figura 4 . 1 ) .

A determinação da concentração de esporos na suspensão foi

efetuada em um contador eletrônico de partículas, tipo Coulter,

4.14 - ENSAIOS VISANDO 0 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E DA CON

CENTRAÇÃO DE FARINHA DE MANDIOCA NA HIDRÓLISE DO AMIDO DA FA

RINHA DE MANDIOCA PELO A. niger.

Os níveis ensaiados das variáveis estão representados na Ta

bela 4.1.

Esc. I>2

Representação em corte do fi 1tro usado para preparo

suspensão de esporos.

(T) algodão hidrófobo

(2) lã de vidro

(rT) funil de vidro

(T) erlenmeyer de 250 ml

TABELA-4.1

Níveis das variáveis nos ensaios realizados

Éste e t-itudo foi efetuado va ri ando-se a temperatura nos

níveis de 25, 30, 35 e 40 « C e a concentração de farinha nos ni

veis de 20, 30, 40 e 50 g/1 ( ver Tabela- 4 . 1 ) . 0 meio de formen

tação foi preparado da maneira descrita no ítem 4,8, utilizando -

se para cada ensaio 36 erlenmeyers de 250 ml contendo 50 ml de

meio de fermentação cada um, com concentração de farinha conforme

a desejada.

Por se ter notado variações sensíveis do valor do pH do

meio de fermentação após a esterilização, aquele foi ajustado nas

proximidades do valor 5(1) com solução de HC1. 0,4 N, previamente

esterilizada. As leituras do valor do pH foram efetuadas em po

tenciômetro.

A inoculação foi feita diretamente com suspensão de es

poros , preparada da maneira descrita no ít em 4,13, sendo adicio¬

nados 1,0 ml de suspensão de esporos em cada frasco contendo meio

de fermentação.

A incubação foi feita em agitador rotativo, com circula

ção de ar, a 300 rpm, excentricidade de 2,54 cm, na temperatura-

desejada»

A retirada das amostras foi feita obedecendo a tabela

dos números casuais de Fisher-*ates (24) . Os intervalos de tempo

de retirada das amostras foram de aproximadamente 3 horas e 6 ho

ras, conforme poderá ser visto no Capítulo de Resultados»

A cada instante de retirada de amostras, retiraram-se 3 erlemueyers

do agitador rotativo. Dos 3 erlenmeyers retirados do agitador, o

conteúdo de um deles foi reservado para leitura do ph* e teste quali_

tativo com lugol. No conteúdo dos outros dois dosou-se A.R. e A.R.

T. da maneira descrita no item 4.11, Os testes qualitativos com lu

gol foram feitos da seguinte forma: em uma cápsula de porcelana co

locaram-se 1,0 ml do material fermentado, 2,0 ml de água destilada-

e 1,0 ml de lugol. Conforme a coloração resultante pode-se ter um

índice qualitativo da hidrólise do amido,

Deste modo, durante a fermentação pudemos manter contro -

les do valor do pll, das concentrações de A.R. e A .R.T. do substrato

calculadas como glicose e um índice qualitativo do término da hidró

lise microbiana do amido mediante testes com lugol.

4.15 - DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO DO PROCESSO FERMENTATIVO

Podemos definir rendimento do processo de crescimento mi

crobiano pela seguinte expressão (25) :

X X - Xo Y = 1 ~ -

S S A, ç

onde: X Q = concentração celular inicial;

X = concentração celular final;

S T i=s concentração inicial de substrato;

S T f= concentração de substrato residual.

X pode ser considerado desprezível em relação a X pois o

a inoculação dos meios de fermentação foi feita com suspensão de

esporos sendo portanto a mansa de inoculo emito pequena quando -

comparada com a massa de microrganismos obtida no final do proces

ao ,

0 rendimento, assim definido, foi calculado para todos

os ensaios de fermentação indicados no item 4.14«,

Como nos ensaios de determinação da concentração celu

lar final utilizou-se somente o conteúdo total de 6 erlenmeyers ,

conforme técnica descrita no ít em 4.13, os valores das massas de

micélio obtido foram da ordem de décimos de grama. A fim de redu

zir o erro experimental que afeta esses resultados programou- se

o seguinte ensaio: prepararam-se 22 erlenmeyers contendo 50 ml

de meio de fermentação cada um com concentração de farinha de 20

g/l da maneira descrita no item 4.8. Após acerto do valor do pH,

inoeularam-se os erlenmeyers que foram incubados em agitador rota

tivo a 3 5 0 C e 300 rpm, excentricidade 2,59 cm, durante 40 horas ,

segundo técnica descrita no item 4.14.

Utilizando-se 4 erlenmeyers fez-se uma determinação dos

A.H.T. iniciais e dos A.R.T. após 40 horas de fermentação, confor

me item 4.11«

Decorridas 40 horas de fermentação, determinou-se a con

centração celular final no conteúdo total de 18 erlenmeyers con

forme item 4.12.

Desta maneira obteve-se o valor de Y.

-28-

4.1G - IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARES FORMADOS

A verificação da natureza dos açúcares formados no preces

so fermentativo foi feita pelo método cristalográfico de identifica

cao dos açúcares pelas o¡sazonas (26) . A amostra utilizada para esta

determinação foi obtida da mesma forma que a usada para a determi­

nação de açucares redutores (item 4.11) . em ensaio de fermentação

a 3 5"C t com concentração de farinha de 40 g/l. A amostra foi retira

da após 18 horas de fermentação.

Par«± confirmação dos resultados obtidos pelo método cris

talográfico de identificação dos açúcares pelas ozazonas,encaminhou

se amostra do mesmo material para o Departamento de Farmácia da Fa

culdade de Ciências Farmacêuticas da U. S. P. onde foram feitas as

identificações dos açúcares formados pelo método croiaatográfico»

4.17 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE NITROGÊNIO

A determinação do teor de nitrogénio foi efetuada em amos

tra de material celular proveniente de um ensaio de fermentação a

35°C com concentração de farinha de 40 g/l. 0 material celular foi

obtido da mesma maneira descrita para o ensaio de determinação da

concentração celular final (item 4,12) .

Esta determinação foi efetuada no Departamento de Al iment.it

ção e Nutrição Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas -

da U.S.P.

4.18 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AMINOÁCIDOS

A determinação do teor de aminoácidos foi realizada em uma

amostra de material celular proveniente de um ensaio de fermentação,

-29-

a 3 5 0 C com concentração de farinha de 40 g/l* 0 material celular foi

obtido do mesmo modo que o descrito para o ensaio de determinação da

concentração celular final (item 4.12) ,

Esta analise foi realizada no Laboratório de Biofísica da

Escola Paulista de Medicina.

4.19 - RECEITAS DOS MEIOS.DE Çj'LTlJRA

- Meio de cultura M.1 (Meio glirosado)

Peptona - 5,0 g

Glicose , 10,0 g

Agar 2 0,0 g

Água destilada „ . .100 0 ml

- Meio de cultura M.2 (Meio a base de amido)

Extrato de carne 3,0 g

Peptona 5,0 g

Agar 15,0 g

Amido solúvel „ 2,0 g

Agua destilada 1000 ml

- Meio de cultura M.3 ( Meio de mandioca)

Extrato de Mandioca 200 ml

Glicose 20,0 g

Agar 2 0,0 g

Agua 1000 ml

L

Preparo do extrato de mandioca: pesar 200 g de mandioca descasca

3

da eui pedaços de aproximadamente 2 cnT . Ferver em cerca de 200 ml

de água potável durante 3 horas* completando o volume para compen

sar evaporação e agitando regularmente* Coar em peneira doméstica

(diâmetro de malha lmm) sem forçar, Elevar o volume a 2 0 0 ml*

Meio de cultura M*4 (Meio de mandioca e milhocina)

Extrato de mandioca , , . . 200 ml

Glicose 20,0 g

Agar , , 2 0,0 g

Milhocina 3 0,0 g

Água * 10 0 0 ml

Preparo do extrato de mandioca: ver meio de cultura M<>3.

Meio de cultura M.5 (Meio de mandioca e banana)

Extrato de mandioca 200 ml

Extrato de banana 3 0 ml

Glicose 20,0 g

Agar 2 0,0 g

Agua 1000 ml

Preparo do extrato de mandioca: ver meio de cultura M , 3 .

Preparo do extrato de banana (28): pesar 90 g de banana nanica ma

dura sem casca» Esmagar em 100 ml de água potável. Ferver durante

10 minutos com agitação. Filtrar em pano, expremendo.

- Meio de cultura M.6 (Meio de farinha de banana) (27)

Farinha de banana 3 0,0 g

Glicose , , 10,0 g

Agar 2 0,0 g

Agua potável 1000 ml

-31-

Meio de cultura M.7 (Meio de banana) (28)

Extrato de banana 200 ml A g # e f l j « o © « * « f f l « « « « w u a » « * # « « » a B * * ! B & s « » * « « > e g

Agua potável « a o a . i a . s s e « « « « « » « » . » « » « » « » » « . « . . » 1000 nil

Prepare do extrato de banana; ver meio de cultura M.S.,

- Meio de cultura M.8 (Meio de batata)

Potato dextrose agar (Oxoid No CM 139)

Adicionar 39 g por litro de ngua destilada e aquecer por 15 minutos,

- Meio de cultura M.9 (Meio de malte)

Malt dextrose agar (Oxoid N° CM 59) Adicionar 50 g por litro de agua destilada e aquecer por 15 minutos.

CAPÍTULO - V

RESULTADOS

5.1 - VERIFICAÇÃO QUALITATIVA DO PODER AMILOLITICO DO MICRORGANISMO

A verificação qualitativa do poder amilolítico do A.niger

NRRL 337, realizada segunda técnica descrita no item 4.1, apresen

tou resultado positivo. Nas proximidades da colônia do microrganis¬

mo, o meio de cultura, tratado com lugol, não se coloriu de azul,

sinal evidente que o microrganismo é produtor de amilase e esta hi

drolizou o amido.

5.2 - CONSERVAÇÃO DA CULTURA DO A.niger NRRL 337

A Tabela 5.1 engloba os resultados das medidas dos diãrae

tros médios dos halos formados ao se efetuar o ensaio descrito no

item 4.2.

5.3 - DETERMINAÇÃO DA UMIDADE DA FARINHA DE MANDIOCA

Os resultados referentes a determinação da umidade da fa

rinha de mandioca (item 4.4) encontram-se na Tabela 5,2.

5.4 - DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE AMIDO NA FARINHA

Os resultados relativos à determinação da porcentagem de

amido na farinha, conforme técnica citada no item 4,5 encontram-se-

na Tabela 5,3,

Nota: No presente trabalho, a não ser observação em contrario, os

desvios apresentados sao sempre os desvios padrão das medidas.

-33

TABELA - 5.1

Influencia do meio e do tempo de incubação no poder arailolíti co do

A. niger NRRL 337«

Meio de

Incubação

Diâmetro médio do halo (cm) Meio de

Incubação

24

Tempo de i

48

ncubação (hi

72 96

Mandioca

(M.3)

2,50 2,80 2,70 2.85

Mandioca

(M.3)

2,30 2,65 2,90 2,95 Mandioca

(M.3) 2,70 2,65 2,90 3,00

Mandioca e mi-lhocina (M.4)

2,30 2,60 2.60 2,75 Mandioca e mi-lhocina (M.4) 2,40 2,60 2,70 2,70

Mandioca e mi-lhocina (M.4)

1.80 2,70 2.60 2 t 7 0 .

Mandioca e

banana (M.5)

2.60 2,70 2,RO 3*00 Mandioca e

banana (M.5) 2,30 2,60 2,60 2,70

Mandioca e

banana (M.5)

2,30 „ 2.60 2.90

Farinha de ba nana (M.6)

2.40 2,75 2,fiO 2 70 Farinha de ba nana (M.6) 2,30 2.80 2,60

9 ' V w

2.70

Farinha de ba nana (M.6)

2,50 2,70 2,60 2,70

Banana

(M.7)

2,40 . . 2.65 2,60 2 80 -Banana

(M.7) 2,00 2.75 2,60 2,90

Banana

(M.7)

2,20 2,60 2,70

Batata (M.8)

2,50 2,70 2.60 2,70

Batata (M.8) 2.40 2 r65 2,60 2,70

Batata (M.8)

2,30 2,70 2,60 2,70

Malte

(M.9)

2,20 2.85 2,60 3,00 Malte

(M.9) 2,00 2,80 2,75 2,70

Malte

(M.9)

1,80 2,85 2,60 2,70

„34

TABELA - 5.2

Ensaio

(N«)

Umidade

(%)

Media

1

11,66

11,68 í 0,04 1

11,64

11,68 í 0,04 1 11,66* 11,68 í 0,04 1

11,71

11,68 í 0,04 1

11,75

11,68 í 0,04

2

11,18

11,25 í 0,10 2

11,11

11,25 í 0,10 2 11,25

11,25 í 0,10 2

11,34

11,25 í 0,10 2

11,35

11,25 í 0,10

3

11,54

11,65 t 0,19

3 11.47

11,65 t 0,19

3 11,64

11,65 t 0,19

3

11,98

11,65 t 0,19

3

11,60

11,65 t 0,19

TABELA - 5.3

Determinação do teor de amido na farinha

Amostra Teor de amido na Média

(No) farinha (%) (%)

1 75,64

2 75,95 75,56 t 0,43 75,56 t 0,43

3 75,10

Umidade da farinha de mandioca. Estufa a (105 - 2)t>0 durante 5

horas

5.5 - DETERMINAÇÃO 1)0 TEOR DE AÇÚCARES REDUTORES NA FARINHA

Os resultados referentes à determinação do teor de A.R.,

calculados como glicose, encontram-se na tabela 5.4»

TABELA - 5.4

Determinação do teor de A.R. na farinha

Amostra

(No)

Teor de A,R. na farinha

(%)

Media

1 1,26

1,27 í 0,07 2 1,30

1,27 í 0,07

3 1 92 6

1,27 í 0,07

5.6 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS NA

FARINHA

Os resultados dos ensaios de determinação de A.R.T.,con

forme técnica descrita no item 4.7. encontram-se na Tabela 5.5.

TABELA - 5.5.

Determinação do teor de A.R.T. na farinha

Amostra

(No)

Teor de A.R.T, na farinha

(%)

Media

1 85,50

85,68 í 0,30 2 85,44 85,68 í 0,30

3 86,11

85,68 í 0,30

5.7 - EVAPORAÇÃO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO NA ESTERILIZAÇÃO

Os resultados referentes às medidas de evaporação do meio

de fermentação na esterilização encontram-se na Tabela 5.6,

TABELA - 5,6

Perda de massa do meio de fermentação na esterilização a 120°C, du­

rante 30 minutos ( Concentração de farinha no meio; 50 g/l )

Frasco Perda de massa

( N° )

1 4,71 2 6,82

3 5,54

4 3,91 5 4,71 6 4 ,54 7 4,75

8 5,59

9 4,64

10 4,04

11 4,22 12 5,65 13 5,59

14 4,23 15 4,09 16 3,70 17 3,75 18 4,66 19 3,41 20 3,85

Media: (4,62 + 0,82) %

5.8 - EVAPORAÇÃO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO EM AGITADOR ROTATIVO

Os ensaios para a determinação da perda de massa causada per

evaporação do meio de fermentação foram realizados em agitador rotati¬

vo a 300 rpm, passo de 2,54 cm, durante 49 horas e às temperaturas de

25, 30, 40 e 45°C. Os resultados dos ensaios encontram-se nas Tabelas

5.7, 5.8, 5.9, 5,10, e na Figura 5,1,

TACELA - 5.7

Perda de massa por evaporação, em agitador rotativo a 300 rpm e 25°C

Tempo de

Agi tação

(h)

Frasco

(N°)

Perda de massa

Tempo de

Agi tação

(h)

Frasco

(N°) (g) % da inicial Média ( % )

6

1 0,0916 0,18

0,18 6 2 0,0928 0,18

0,18 6

3 0.0974 0,18

0,18

12

1 0,1555 0,30

0,30 12 2 0,1522 0,29 0,30 12

3 0,1588 0r3 0

0,30

18

1 0,2227 0,43

0,42 18 2 0,2183 0,41 0,42 18

3 0.2238 0,42

0,42

24

1 0,2816 0,54

0,53 24 2 0,2776 0,53 0,53 24

3 0,2817 0,53

0,53

30

1 0.3515 0,67

0,66 30

2 0,3426 0,65 0,66 30

3 0,3512 0,66

0,66

36

1 0.4275 0.82

0,80 36 2 0,4161 0,79 0,80 36

3 0,4276 0,80

0,80

42

1 0.524.3 1,01

0,99 42 2 0,5110 0,97 0,99 42

3 0,5276 0,98

0,99

49

1 0,5978 1.15

1,14 49 2 0,5808 1,10 1,14 49

3 0,5978 1,12

1,14

-38-

T A 3 K U - 5.8

Perdei de massa por evaporação em agitador' rotativo a 3 00 rpm e 30°C

Tempo de

agitação

00 ' F'rasco (NO)

Perda de massa Tempo de

agitação

00 ' F'rasco (NO) ífí) (% da inicial) Média %)

5,5

1

2

Ü,2U79

0,2159

0,39

0,42 5,5

1

2

Ü,2U79

0,2159 0,41 0,42 5,5

3 (VMOÍ) 0,45

0,42

13,75

1 0*3980 0,7]

0,80 13,75 2 0,4094 0,77 0,80 13,75

3 0 46 98 n 88

0,80

17,75

1 0,4803 0,89

0,95 17,75 2 0,95 17,75

0,5548 J 0 4

0,95

20,75

1 ... „ a,j5ri34T, 1,03

1,09 20,75 2 0,5546 1,04 1,09 20,75

3 0,6352 1,19

1,09

24,75

1 0,6341 1,18

1,24 24,75 2 Ü4 ü2ia 1,18 1,24 24,75

3 0,7242 ... 1.36

1,24

28,50

1 0*7148 1,33

1,40 28,50 2 0,7110 1,33 1,40 28,50

3 0,8222 1,54

1,40

37,50

1 0,9229 1,72

1,80 37,50 2 0,9174 1 ,72 1,80 37,50 3 1,0518 1,97

1,80

41,50

1 1,0000 1,86

1,96 41,50 2 0,9996 1,87 1,96 41,50

3 1,1544 2,16

1,96

45,00

1 _ . 1,0861 2,02

2,12 45,00 2 1,0718 2,01 2,12 45,00

3 1,2389 2,32

2,12

49,00

1 1,1772 2,19

2,30 49,00 2 1,1668 2,18 2,30 49,00

3 1,3482 2,52

2,30

Perda de massa por evaporação em agitador rotativo a 3 00 rpm e 40°C

Tempo de

agitação

(h)

Frasco

(N°)

Perda de massa Tempo de

agitação

(h)

Frasco

(N°) (g) CG da inicial) Media (%)

5,5

1 0,3663 0,68

0,70 5,5 2 0,364 9 0,68 0,70 5,5

3 0,3920 0,73

0,70

13,75

1 0,7220 19 3£)

1,37 13,75 2 0,7156 1,38 1,37 13,75

3 0.7390 1,38

1,37

17,75

1 0,8827 1,65

1.67 17,75 2 0,8851 1,65 1.67 17,75

3 0,9119 1,70

1.67

1 1,0214 1,92

1,93 20,75 2 lt0185 1,90 1,93

3 1,0544 1,97

1,93

24,75

1 o o o

24,75 2 1.J.724 2,19 24,75 .1,2174 2,27

28,50

1

1

1,3508 2,54

2,55 28,50 2 1*3412 2,51 2,55 28,50

3 1,3919 2,60

2,55

37,50

1 1,7462 3.27

3,29 37,50 2 3,24 3,29 37,50

3 1 7 936

3,29

41,50

1 1,9180 3,60

3,61 41,50 2 1,9005 3,55 3,61 41,50

3 1,9779 3,69

3,61

45,00

1 2,0592 3,86

3,87 45,00 2 2*D34JT, 3,80 3,87 45,00

3 2,1234 3,96

3,87

49,00

1 2,2547 4,23

4,26 49,00 2 2,2276 4,17 4,26 49,00

3 2,3391 4,37 . . . .

4,26

erda de massa por evaporação em agitador rotativo a 300 rpm e 45<>C

Tempo de

agi taçao

(h)

Frasco (No)

Perda de massa Tempo de

agi taçao

(h)

Frasco (No) ( f f ) (% da inicial) Media (%)

6

1 0.5243 0,96

0,96 6 2 0,5406 1,00 0,96 6

3 0,53 72 0,93

0,96

12

1 0,0670 1,62

1,65 12 2 0,8993 l, 62 1,65 12

3 . . . 1,71

1,65

18

J L 1,2539 2,30

2,36 18 2 1,2909 2,40 2,36 18

3 , JLf .*\8lÍQ § ,3 0 ,

2,36

24

1 1,6323 3.04

3,03 24 2 1,6660 3,05 3,03 24

3 1,6728 3,02

3,03

30

1 2,0075 3, 68

3,71 30 2 2,000.1 3,71 3,71 30

3 2,0367 3,75

3,71

36 2

2,3908 4,4 6

4 ,47 36 2 2,3988 4,45 4 ,47 36

3 2,4385 4,50

4 ,47

42

1 2,7912 5,20

42 2,8076 5.20 42

3 5,30

40

1 3,2077 5,98

6,05 40 2 3,2330 5,99 6,05 40

3 3,2985 6,19

-41-

Curva 1 ( 2 5 0 C ) P

Curva 2 (30°C) í\.

Curva 3 (40<>C) P„

ia Curva 4 ( 4 5 0 C ) P,,

0,027 + 0,023 t

0,187 + 0,043 t

0,243 + 0,081 t

0,200 + 0,119 t

Figura 5.1 - Perda de massa por evaporação em agitador rotativo,

a 300 rpm, em diferentes temperaturas.

42-

5.9 - ENSAIOS VISANDO O ESTUDO DA INFLUENCIA DA TEMPERATURA E DA CONCEN

TRAÇ*O*DA F/lRINIÍA. JIANDIOCA*N. A KIWfllJSK DO AMIDO DA FARINMA

DE MANDIOCA PELO A . niger

Estes ensaios foram efetuados variando-se a temperatura nos

níveis de 2 5 , 30, 35„ 40 e 45°C e a concentração da farinha de mandioca

no meio de fermentação nos níveis de 2 0 9 30, 40 e 50 g/l, totalizando -

14 ensaios realizados eitv duplicata, conforme técnica descrita no item

4.14.

Ensaio n° 1

Temperatura: 25oc

Concentração de farinha: 50 g/l

plí inicial j 5,35

8

Concentração inicial de esporos? 2,6 x 10

Os resultados encontram-se na Tabela 5.11 e na Figura 5.2

Ensaio n° 2

Temperatura: 30«C

Concentração de farinha: 20 g/l

pH inicial: 5,80

~ 8 Concentração inicial de esporos: 1,8 x 10 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.12 e na Figura 5,3

Neste ensaio não houve acerto do pH inicial

Ensaio n° á

Temperatura: 30°C

Concentração de farinha: 30 g/l

pü inicial : 5,25

Concentração inicial de esporos: 5,4 x IO 8 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.13 e na Figura 5,4

TABELA - 5.11

Resultados obtidos no ensaio n° 1. Temperatura 25°C. Concentração de farinhas 50 g/l

Tempo de

fermentação

(h)

pH

Açúcares Redutores

(e/l)

Açúcares Redutores Tot ais

.Ca / D

Reação com lugol

(qualitativa) Tempo de

fermentação

(h)

pH

Asiostra

N° 1

Amostra N ° 2

Média Amostra

N ° 1

Amostra No 2

Media

Reação com lugol

(qualitativa)

0 , 0 5,35 0,55 0,57 0,56 4 0 , 0 0 37.» 2 4 38,62 Azul marinho

1 3 , 0 2,20 0,96 0 , 96 0,96 39,36 3 9,88 39t62 Azul marinho

1 8 , 0 4,50 4,25 3,74 3,99 41,12 41,35 41 , 2 5 Azul marinho

24,0 3,55 12,23 1 1 , 7 7 12 , 0 0 39,66 3 8 , 9 0 3 9 , 28 Marrom

3 0,0 13,92 13,92 X o ç 9 2 31,95 30,03 30,99 Marrom

36,0 2,00 14,79 14,27 14,53 28,32 27,96 28,14 Marrom

42,0 1,55 9,78 10,37 10,07 21,54 . 19,64 20,59 Amarelo escuro

48,0 5,14 6,18 5,66 17,94 17,86 17,90 Anarelo escuro

54,0 1,95 2,72 2,80 2,76 13,42 13,46 13,44 Amarelo escuro

60,0 1,90 2,68 2,73 2,70 13,89 14,27 14,08 Amarelo escuro

Concentração celular final: 13,0 g/l

I 1 1 1 1 A

O • 1 — 4 4 1 4 4- i i i _ i . 1

O 2 0 4 0 60

T e m p o d e F e r m e n t a ç ã o (h )

Figura 5.2 ; Variação do valor do pH ( • ) e das concentração

de A.R.T. ( O ) e de A.R ( • ) durante a fermentação realiza

da a 2 5«C. ~

Concentração de farinha: 50 g/l

TABELA - 5,12

Resultados obtidos no ensaio n° 2. Temperatura 30°C. Concentração de farinha: 20 g/l

Tempo de

fermentação

(h)

PH

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reação com lugol

(qualitativa)

Tempo de

fermentação

(h)

PH Amostra

No 1

Amostra No 2

Media Amostra

N° 1

Amostra

N° 2

Media

Reação com lugol

(qualitativa)

0,0 5,80 0,19 0,17 0,18 18,15 17,27 17,71 Azu1 marinho

6,0 5,85 0,19 0,14 0,16 17,64 17,75 17,69 Azul marinho

12,0 5,75 1,92 1,64 1,78 17,56 17,16 17,36 Marrom escuro

15,0 5,52 4,85 5,05 17,13 16,93 17,03 Verde

18, 0 3,22 7,70 7,85 7,77 15,68 15,13 15,40 Amarelo escuro

21,0 2,60 8,52 9,14 8,83 11,36 12,78 12,07 Amarelo escuro

24,0 2,15 7,08 5,65 6,36 8,92 8,78 8,85 Amarelo escuro

27,0 29 3 5 2,68 3,55 3,11 5,27 6,23 5,75 Amarelo escuro

30,0 2,25 0,44 2,76 1,60 3,43 - 5,2 7 4,35 Amarelo escuro

36,0 2,25 0,09 0,10 0,09 2,68 2,76 2,72 Amarelo escuro

Concentração celular final: 7,0 g/l

-46

20 1

T e m p o de F e r m e n t a ç ô o ( h í

Figura 5.3? Variação do valor do pH ( O ) e das concentrações de

A.R.T. (O) e de A.R. (•) durante a fermentação realizada a 30°C.

Concentração de farinha: 20 g/l

TABELA - 5.15

Resultados obtidos no ensaio n° 3. Temperatura 30°C. Concentração de farinha 30 g/l

Tempo de

fermentação

(h)

PH Açucares Redutores (g/l) Açucares Redutores Totais (g/l) Reação com lugol

(qual itatív£j)

Tempo de

fermentação

(h)

PH Amostra

No 1 Amostra

NO 2 Media Amostra

N°l

Amostra No 2

Media

Reação com lugol

(qual itatív£j)

0,0 5,25 0,34 C,42 0,38 26,09 26,35 26,22 Azul marinho

7,0 5,10 0,52 0,52 0,52 25,31 26,27 26,29 A zu1 raarínho

12,0 4,55 3,10 3,06 3,08 26,16 26,23 26,19 Verde escuro

15,5 3,40 7,16 7,28 7,22 24,85 25,05 Verde escuro

18, 0 2,70 9,81 9,43 9,62 • ->•-. -7T. r' ~ O P 22,85 Verde claro

21,0 2,30 12,10 11,89 11,99 19,-1 20,06 Marrom claro

24,0 2,15 10,81 10,93 10,87 15,75 16,03 15,89 Amarelo escuro

27,0 2,15 7,55 7,92 7,73 12,02 10 A s ; 12,03 Amarelo escuro

30,0 1,95 4,31 3,96 4,13 , ± - . o o

8,42 Amarelo escuro

39,0 1,95 0,94 0,91 0,92 5,32 5?3 8 5,35 Amarelo escuro

45,0 2,10 0,89 0,82 0,85 5,65 5,38 5,51 Amarelo escuro

Concentração celular final: 8,4 g/l

«•48

30 h

O 10 20 50 40 Tempo d® Fermentação ( h j

Figura 5.4 : Variação do valor do pH ( D ) e das concentra

ções de A.R.T. i O ) e de A.R. i • ) durante a fermenta¬

ção realizada a 30°C0

Concentração de farinhas 30 g/i

-4 9-

Ensaio n° 4

Temperatura: 3ü«C

Concentração de farinha: 40 g/l

pH inicial: 5,30

Concentração inicial de esporos! 5,0 x 10 esporos/1

Os resultados encontram-se na Tabela 5»14 e na Figura 5.5

Ensaio n° 5

Temperatura: 30°C

Concentração de farinha: 50 g/l

pH iniciais 5,35

«, 8 Concentração de esporos: 1,2 x 10 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.15 e na Figura 5,6

Ensaio n° 6

Temperatura: 35«C

Concentração de farinhas 20 g/l

pll inicial: 4,95

— 8 Concentração inicial de esporos! 2,2 x 10 esporos/l Os resultados encontram-se na Tabela 5.16 e na Figura 5.7

Ensaio n° _7

Temperaturat 35°C

Concentração de farinhas 30 g/l

pH iniciais 5,10

~ 8

Concentração inicial de esporos; 2,6 x 10 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5,17 e na Figura 5.8

TABELA - 5.14

Resultados obtidos ao ensaio n° 4. Temperatura 30°C# Concentração 40 g/l

1 1'eapo de

PH

Açúcares Redutores (g/i) A ç u c a r e s

R e d u t o r e s T o t a i s ( g / Í T ~ Reação com lugol

(qualitativa) Fermentação

(h)

PH Amostra NO i

Amostra No 2

ííedia Amostra

N° 1

Amostra No 2

U U. -L O V M 1 1 1

Media

Reação com lugol

(qualitativa)

°iP 5,50 2 i 4 7 0,45 33,08 55,37 33 A22 Azul marinho

6.0 5,20 0*71 0,69 ° i Z 2 31,07 31.72 Azul marinho

12,0 4,70 6? 57 5,60 6,08 30,97 28,22 29,59 Marrom escuro

19?0 2,65 1 3

x ? ° 14,64 14,22 26,07 26,44 26,25 Marrom escuro

21,0 2,35 15,26 15,40 15.33 28,37 27,31 27,84 í4 a r r o r a e s c u r o

24, 0 2,10 15,17 I4j_20 14,68 Ji Ik2il 26 ,06 26,22 Marrom escuro

27,0 _ j * 0 0 _ 13,55 13,93 15,74 19,53 Marrom claro

30,0 9.18 9,62 16*06 Amarelo escuro

36,5 1 j 85 1,86 1,94 9,31 9,31 Amarelo escuro

42,5 1,89 1,83 1,90 1,86 9,31 9,02 9,16 Amarelo escuro

48,0 1,80 1,81 1,79 1,80 9,70 9,24 9,47 Amarelo escuro

Concentração celular final: 9,0 g/l

-51-

40

0 10 2 0 3 0 40 50

T e m p o de F e r m e n t a ç ã o ( h )

Figura 5„5 í "ari.ação do valor do pll ( • ) e das concentrações

de A. R,T. ( O ) ti de A. R . ( 9 ) durante a fermentação realiza¬

da a 50«C,9

Concentração de farinha: 40 g/l

TABELA - 5.15

Resultados obtidos no ensaio n° 5« Temperatura! 30°C. Concentração de farinhas 50 g/l

Tempo de

fermeatação

(h) pH

Açúcares Redutores J j ç / l ) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reações com lugol (qualitativa)

Tempo de

fermeatação

(h) pH Amostra

N° 1

Amostra NO 2

Media Amostra NO 1

Amostra NO 2

Media Reações com lugol

(qualitativa)

5x3 o 0,85 0,65 41,49 4 1A3 4 Azul marinho

6 * 2 5,35 0,76 0X7 6 42*99* 42,63 42,81 Azul marinho

12,0 5,18 2 j 5 2 „„2,..52 2,52 40,43 42,08 Azul marinho

3,25 14,17 13*14 39,43 39,20 Azul marinho

25,0 1*70 23,13 22,37 22 t75_ r 31,71 30,83 31,27 Marrom escuro

30,0 18,04 17*53 1,7*8 25,02 26*30 2 5 , 6 6 Amarelo escuro

1*50 11 A88 14,76 13*32 23,13 Amarelo escuro

42,0 1,60 19,26 1 6 , 00 13,79 Amarelo escuro

48,0 5,93 4,78 5,35 15,02 J 5 t 2 8 Amarelo escuro

54,0 4,_75 1,72 3,23 18,32 12,59 15,35 Amarelo escuro

60,0 1,15 1,77 1,92 1,84 11,39 . 10,44 10,91 Amarelo escuro

Concentração celular final: 17,6 g/l

- 5 3 -

O 2 0 4 0 T a m p o d « F a r m a n t a c â o ( h )

60

Figura 5.6s Variação do valor do pH ( • ) e das concentrações de

A . R . T . ( O ) e de A.R. ( • ) durante a fermentação realizada a 30°C

Concentração de farinha; 50 g/l

O

TABELA - 5.16

Resultados obtidos -.-r, arraio xtG $» Temperatura 35<>C« Concentração de farinha: 20 g/l

ter? *; o

(h)

rr¿s Redutoras (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l)

ledia

Reação com lugol

(qualitativa)

Concentração celular final: 5,2 g/l

- 5 3 -

20

O 20 40 60 Tempo ás Fermentação h )

Figura 5.7 I Farlação do valor do pH ( O ) e das concentrações de A.R.T.

O ) e de A.Re @ ) durante a fermentação realizada a 35<>C.

Concentração de farinhas 20 g/l

TABELA - 5.17

Resultados obtidos no ensaio n° 7. Temperaturas 35°C. Concentração de farinha; 30 g/l

Tempo de

Fermentação

<h)

pH

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reação com lugol (qualitativaJ

Tempo de

Fermentação

<h)

pH Amostra NO 1

Amostra No 2

Média Amostra NO 1

Amostra N'o 2

Media

Reação com lugol (qualitativaJ

0,0 5,10 0,33 0,37" 26,85 26,67

26_j96

Azu1 marinho

6,0 5,00 0,36 0,45 . ... 0,40 26,59 27,53

2 6 tf f

26_j96 Azul marinho

12,0 4,80 6,46 6,52 6,49 25,95

27,53

2 6 tf f 26 * 02

«JfLfzLJk 5

19,60

Marrom

15,0 3,00 11,23 9,23 10,23 21,96

26 * 02

«JfLfzLJk 5

19,60

Marrom

18, 0 2,50 13,46 13,19 13,32 19,60 19,60

26 * 02

«JfLfzLJk 5

19,60 Marrom

21.0 2,25 11,89 11,69 11,79 15,90 15,80 15*85 Marrom claro

24,0 2,10 9,49 9.32 9,40 12,77 12,37 Amarelo escuro

..A. ?5 5,31. 5,46 5,38 .8,14 8,93 8 * 53 Amarelo escuro -Z*°-

~ 30,0 2,00 2,15 2,05 2,10 7,35 7,06 Amarelo escuro

36.0 2,00 0,63 0,63 0,63 5,90 7,01 6,45 Amarelo escuro

42,0 2,10 0,78 0,77 0,77 5,50 3,47 5,48 Amarelo escuro

Concentração celular finais 8,7 g/l

-57-

30 h

0 10 2 0 3 0 40

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 5,8í Variação do valor do pH ( O ) e das concentrações

de A.R.T. O ) e de A„11. ( ® ) durante a fermentação realiza

da a 3 5CC»

Concentração de farinha; 30 g/l

-58-

Ensaio n° 8

Temperatura: 35°c

Concentração de farinhas 40 g/l

pií iniciais 5,75

Concentração inicial de esporos: 2,8 x 10 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.18 e na Figura 5.9

Neste ensaio não houve acerto do pH inicial.

Ensaio n u 9

Temperatura: 35oc

Concentração de farinha: 50 g/l

pH iniciais 5,85

Concentração inicial de esporos: 3,4 x 10 a esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.19 e na Figura 5.10

Neste ensaio não houve acerto do pH inicial

Ensaio n Q 10

Temperatura: 40oc

Concentração de farinha: 20 g/l

pü inicial : 5,05

Concentração inicial de esporos: 1,4 x 10 8 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.20 e na Figura 5.11

Ensaio nQ 11

Temperatura: 40OC

Concentração de farinha: 30 g/l

pH inicial: 5,15

Por acidente, não foi possível medir a concentração inicial

de esporos .

Os resultados encontram-se na Tabela 5.21 e na Figura 5.12,

8

TABELA - 5.18

Resultados obtidos no ensaio n° 8. Temperatura: 35°C. Concentração de farinha: 40 g/l

Tempo de

Fermentação

(h)

pH

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reação com lugol

(qualitativa)

Tempo de

Fermentação

(h)

pH Amostra NO 1

Amostra

N° 2

Média Amostra No 1

Amostra NO 2

Média

Reação com lugol

(qualitativa)

0,0 0,45. 0.43 0,44 34,46 35,95 35,20 ' Azul marinho

6,0 5,68 0,53 0,75 0,64 33,94 34,97 34,45 Azul marinho

13 15 4,05 12,93 13,15 13,04 31,11 31,37 31,24 ''arroüi escuro

18,0 2,65 20,64 20,69 20,66 27,32 27,55 27,43 Marrom escuro

24, 0 2,00 15,56 15,79 15,67 19,51 19,48 19,49 Marrom escuro

30,0 1,90 4,68 4,76 4,72 13,78 14,29 14,03 Marrom claro

35,5 1,60 4,70 4,55 4,62 8,53 8,36 8,44 Amarelo escuro

43,0 1,75 2,17 2,17 2,17 8,08 8,17 8,12 Amarelo escuro

48,0 1,80 1,45 1,33 1,39 8,55 8,22 8,38 Amarelo escuro

54,0 1,90 1,36 1,30 1,33 7,61 8,01 7,81 Amarelo escuro

60,0 1,90 0,87 0,85 0,86 6,52 6,58 6,55 Amarelo escuro

Concentração celular final: 11,0 g/l

- 6 0 -

40

Tempo de Fermentação (h )

Figura 5 . 9 ! Variação do valor do pH ( O ) e das concentrações

de A . R . T . ( O ) e de A.R, ( • ) durante a fermentação realiza

da a 350C

Concentração de farinhas 40 g/l

TABELA - 5.19

Resultados obtidos no ensaio n° 9. Temperatura; 35°C. Concentração de farinha: 50 g/l

Tempo de

Fermentação

(h)

píl

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reação com lugol

(qualitativa)

Tempo de

Fermentação

(h)

píl Amostra

NO 1

Amostra NO 2

Média Amostra NO 1

Amostra NO 2

Média

Reação com lugol

(qualitativa)

0,0 ... 5,85 1,32 0,84 1,08 44,14 44,14 44,14 Azul marinho

6,5 5,82 0,90 0,65 0,77 43,30 42,59 42,94 Azul marinho

12,0 5,45 11,75 11,26 11,50 41,90 42,54 42,22 Marrom escuro

18,5 2,72 21,27 22,07 21,67 35,90 36,87 36,38 . Verde escuro

24, 5 2,12 23,76 22,74 23,25 28,74 28,00 28,37 Amarelo escuro

30,5 1,85 13,94 14,58 14,26 22,33 23,19 22,76 Amarelo escuro

36,0 1,70 9,49 9,17 9,33 16,75 16,75 16,75 Amarelo escuro

42,0 1,70 3,37 3,34 3,35 12,85 12,96 12,90 Amarelo escuro

48,0 1,85 2,53 2,39 2,46 12,10 11,94 12,02 Amarelo escuro

54,5 1,80 2,07 2,07 2,07 11,60 11,56 ,11,58 Amarelo escuro

60,0 1,90 2,25 2,78 2,51 11,38 11,21 11,29 Amarelo escuro

Concentração celular final: 12,9 g/l

-62-

Concentração de farinha; 5G g/l

TABELA - 5„20

Resultados obtidos no ensaio n° 10. Temperatura: 40°C. Concentração de farinhas 20 g/l

Tempo de

fermentação

(h)

pH

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reação cora lugol

(qualitativa)

Tempo de

fermentação

(h)

pH Amostra No 1

Amostra NO 2

Média Amostra No 1

Amostra NO 2

Media

Reação cora lugol

(qualitativa)

0,0 5,05 0,21 0,15 0,18 15,95 15,60 15,77 Azul marinho

6,0 5,05 0,22 0,27 0,24 18,70 17,51 18,10 A zu1 marinho

12,0 5,18 2,89 3,56 3,22 16,66 16,36 16,-51 Marrom escuro

15,0 5,10 5,04 5,38 5,21 16,59 16,82 16,70 Verde escuro

18,0 3,08 8,34 8,25 8,29 15,08 14,98 15,03 Verde claro

21,0 2,65 „ 13,98 12,82 13,40 Amarelo escuro

24,0 2,45 6,65 7,06 6,86 9,75 9,26 9,50 Amarelo escuro

27,0 2,25 2,02 3,88 2,95 7,15 5,51 6,33 Amarelo escuro

30,0 2,12 1,23 5,46 3,34 4,30 4,16 4,23 Amarelo escuro

36,0 2,18 0,18 0,20 0,19 3,75 3,92 3,83 Amarelo escuro

Concentração celular final: 9,8 g/l

-64-

a.

O 10 20 30 Tempo de Fermentação ( h )

Figura 5« 11: Variação do valor do pll ( O ) e das concentrações de

A. R. T. ( O ) e de A.R. ( • ) durante a fermentação realizada a

4 0 ° C

Concentração de farinha: 20 g/l

TABELA - 5.21

Resultados obtidos no ensaio no 11. Temperatura 40°C. Concentração de farinha: 30 g/l

Tempo de

fermentação

(h)

pH

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Tot ais (g/l) Reação com lugol

(qualitativa)

Tempo de

fermentação

(h)

pH Amostra

N'o 1

Amostra

N° 2 •

Média Amostra No 1

Amostra NO 2

Media

Reação com lugol

(qualitativa)

0,0 5,15 0,31 0,31 0,31 25,67 26,09 25,88 Azul marinho

6,5 5,15 Cf 3 v) 0,25 0,30 26,67 26,96 26,81 Azul marinho

12,0 5,10 1,31 0,97 1,14 23,57 24,16 23,86 Azul marinho

15,0 5,18 5,69 6,21 5,95 24,06 23,90 23,98 Azul marinho

18, 0 3,25 8,02 12,62 10,32 23,50 25,53 24,51 . Verde escuro

21,0 2,65 13,44 14,70 14,07 19,90 20,42 20,16 Marrom

24,0 2,35 13,72 14,02 13,87 18,43 17,86 18,14 Amarelo queimado

27,0 2,20 10,11 8,85 9,48 14,95 13,57 14,26 Amarelo queima do

30,0 2,05 6,09 6,59 6,34 10,27 10,90 10,58 Amarelo queimado

36,0 2,05 0,80 0,74 0,77 7,26 6,14 6,70 Amarelo queimado

42,0 2,00 0,61 0,93 0,77 6,50 7,47 6,98 Amarelo queimado

Concentração celular final: 11,5 g/l

I C5 O I

I

-66»

Figura 5.12: Variação do valor do pH (O ) e das concentrações

de A.H.T. ( O ) e de A.R. ( • ) durante a fermentação realiza

da a 4 0OC.

Concentração d© farinha: 30 g/l

TABELA - 5.22

Resultados obtidos no ensaio n° 12, Temperatura? 40OC. Concentração de farinha! 40 g/l

Tempo de

fermentação

íh) PH

Açúcares Redutores (g/l) Açúcares Redutores Totais (g/l) Reação com lugol

(qualitativa)

Tempo de

fermentação

íh) PH

Amostra NO 1

Amostra

N° 2 Media Amostra

NO 1

Amostra

NO 2

Média

Reação com lugol

(qualitativa)

0,0 5,10 0,87 35,26 35*46 35,36 Azul marinho

6,0 5,05 *0*59 0,56 0,57 36,88 „ . 34 , 3 7 35,62 Azul marinho

12, 0 3,27 _3j_98 33,80 34,23 . ..34A01. Verde escuro

2,93 17,28 15,31 16,29 3 0,17 2 9x2 5 29,71 Verde escuro

2J A£ 2 X 4 3 _ 19,71 18*83 19,27 - ™ A S l 2 5 2 4x3 0 Marrom escuro

50,0 2,20 10jl8 9,62 JJBj/70 18,48 Marrom claro

37,0 2,00 2,50 1,78 2,14.. . . 11,93 11,58 Amarelo escuro

2,00 0,99 0,99 0,99 10,49 10,12 10*3 0 Amarelo escuro

48,0 1,38 1,48 1,43 10,07 . 10,o4 10,05 Amarelo escuro

54, 0 2,00 1,38 1,48 1,43 9j69 2i 6 7 Amarelo escuro

60,0 2,20 1,48 1,40 1,44 9,77 9,64 9,70 Amarelo escuro

Concentração celular final? 15,0 g/l

-68-

4 0

j i i i i i i i i i i i i i.

0 20 40 60

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 5.13: Variação do valor do pH ( D ) e das concentrações

de A.R.T. ( O ) e de A.R. ( • ) durante a fermentação realiza

da a 40OC.

Concentração de farinha: 40 g/l

-89-

Ensaio n° 12

Temperatura; 40°C

Concentração de farinha: 40 g/l

pH iniciais 5,10

Concentração inicial de esporos: 2,6 x 10 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.22 e na Figura 5.13*

Ensaio n° 13

Temperatura: 4Q°G

Concentração de farinha: 50 g/l

pH inicial: 5,31

8 Concentração inicial de esporos: 2,4 x 10 esporos/l

Os resultados encontram-se na Tabela 5.23 e na Figura 5.15

Ensaio nQ 14

Temperatura: 45°C

Concentração de farinhas 50 g/l

pH inicial: 5,20 « 8

Concentração inicial de esporos: 4,0 x 10 esporos/litro.

Os resultados encontram-se na Tabela 5.24

Cora base nos resultados apresentados nas tabelas de n° 5.11

5,23 chegou-se às correlações apresentadas nas Figuras: 5,16

6.17, 5.18 e 5.19 .

TABELA - 5,23

Resultados obtidos no ensaio n° 13« Temperatura 40°C» Concentração de farinhas 50 g/l

Tempo de

ferraentaç ao pH

Açúcares Redutores

(g/l)

Açúcares Redutores Totais

C s / D

Reação com lugol

(qualitativa) Tempo de

ferraentaç ao pH

Amostra NO 1

Amostra

N° 2

Media Amostra NO 1

Amostra No 2 Medi a

Reação com lugol

(qualitativa)

0,0 5,31 0,58 0,65 0,61 42,89 42,75 42,72 Azul marinho

6,0 3,31 0,75 — 0,75 42,45 42,45 Azul marinho

12,0 4,75 2,57 1,90 29 2 3 41,49 41,55 41,52 Azul marinho

18,0 5,30 14,46 12,65 13,56 39,42 39,42 39,42 Azul marinho

24,0 2,00 26,66 23,34 25,25 33,42 32,57 32,99 Marrom escuro

30,0 1,50 17,30 17,70 17,50 26,68 25,47 26,07 Amarelo escuro

36,0 1,50 11,23 9,34 10,38 19,93 18,50 19,21 Amarelo escuro

42,0 1,35 2,83 2,26 2,54 12,44 ' 12,92 12,68 Amarelo escuro

48,0 1,45 1,86 1,73 1,79 12,33 12.18 12,26 Amarelo escuro

54,0 1,45 1,86 1,75 1,80 11,99 11,74 11,86 Amarelo escuro

6 0T0 1,65 1,72 1,75 1,73 15,07 13,85 14,46 Amarelo escuro

Concentração celular final: 16,6 g/l

-71-

0 20 40 60

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 5.14: Variação do valor do pH ( • ) e das concentrações de

A.R.T. ( O ) e de A.R. ( • ) durante a fermentação realizada a

4 0 ° C

Concentração de farinha: 50 g/l

TABELA - 5.24

Resultados obtidos »o ensaio n° 14. Temperatura 48°C. Concentração de farinha 50 g/l

Tempo de

Fermentação

(h)

pH

Açúcares Redutores r TÍ

Açucares edutores Totais Reação com lugol

(qualitativa)

Tempo de

Fermentação

(h)

pH

Amostra

N° 1

Amostra

Jí° 2 Media

Amostra NO 1

Amostra ' No 2

Média

Reação com lugol

(qualitativa)

0. 0 5,20 pj59 0153 42,72 40,13 43 , 4 2 Azul marinho

12,0 0 t 9 1 J ü > 9 1

0,91 45,30 41,69 42,49 . Azul marinho

24, 0 4,80 0,99 it 2 2 1,10 4A 5 J L 4 0 j 7 9 * 4 1 418 -v ' marinho

£ t 0 5 1±44 l_j50 1,47 3 0 T 5 8 3 6*71 \r - marinho

36,0 1,99 2,45 2,22 58,29 3 7 * 3 5 3J j l §2 Azul marinho

42,0 1,35 1,52 1,43 5G,65 37*87 j57i25 Azul marinho

50,0 5,00 1,21 1,34 1,27 4 1,97 4 2,55 42,26 Azul marinho

Concentração celular final; nao foi determinada, pois a fermentação não se completou»

-73-

5.10 - DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO DO PROCESSO FERMENTATIVO

Os valores de f obtidos nos ensaios de fermentação realista

dos a 25, 30, 35 e 40°C, com concentração de farinha de 20, 30, 40 e

50 g/l encontram-se na Tabela 5.25 . A determinação da concentração -

celular final de cada ensaio de fermentação, cujo valor ê usado para

c calculo de I , foi feita útil izando-se o conteúdo total de 6 er

lenmeyers, conforme técnica descrita no ítem 13, Capítulo II.

Com a finalidade de comprovar os valores de Y, obtidos e in

dicados na Tabela 5.25, realizou-se um ensaio de fermentação a 3 5 °C

com concentração de farinha no meio de fermentação de 20 g/l, cuja

determinação da concentração celular final foi efetuada utilizando -se

o conteúdo de 18 erlenmeyers da maneira descrita no item 15. 0 resul

tado do rendimento do processo neste ensaio : Y = 0,45,

A Tabela 5.25 apresenta os valores de Y calculados a partir

dos ensaios realizados, desprezando a concentração inicial de células.

Como se poderá ver mais adiante (Capítulo VI) , os valores de X q , con

contrações microbianas iniciais, praticamente não influem nos valores

de Y .

5.11 - IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARES FORMADOS

Através do método cristalográfico de identificação dos açú­

cares pelas ozazonas identificou-se, na amostra utilizada, glicose.

No Departamento de arraácia da Faculdade de Ciências Farma -

x

ceuticas da U.S.P. utilizando amostra do mesmo material, foram identi

ficados, por método cromatográfico, glicose e traços de rafinose.

,74*

TABELA - 5.25

Valores de ¥ obtidos nos ensaios de fermentação

Temperatura

(°C)

Concentração de farinha

no meio de fermentação

(g/l)

y

25 50 0,49

3 0 20 0,47

30 3 0 0,40

30 40 0,38

3 0 50 0.60

35 20 0,56

35 3 0 0,41

35 4 0

35 50

40 20 0j71

40 3 0 0 S 5 9

40 40 0,58

40 50 0,59

5,12 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE NITROGÊNIO

Essa determinação foi efetuada no Departamento de Alimentação

e -Nutrição Experimental da * acuidade de Ciências Farmacêuticas da U«S 9P

que nos forneceu o seguinte resultado:

Nitrogênio : 4,15 %

-75-

5.13 - DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AMINOÁCIDOS

Este ensaio foi realizado no Laboratório de Biofísica da

Escola Paulista de Medicina,, Os resultados encontram-se na Tabela

5,s2 6 „

Porcentagem de aminoácidos na. amostra analisada»

Amino-ácido Porcentagem

Xcido Aspártico 1,78

Xcido Glutamico 2,29

Alanina 1,30

Arginina 1,29

Fenilalanina 2,04

Galac t osam i na * 1,27

Glicina 1,00

Histidina 0,40

Isoleucina 0,91

Leucina 1,43

Lisina 1,07

Metionina 0,23

Prolina 0,89

Serina 0,97

Tirosina M 1

Treonina 1,07

Valina 1,29

* Natureza não comprovada

Porcentagem total de aminoácidos: 20,34 %

Os teores de Cistina e Triptofano não foram

determinados.

-76»

C A P Í T U L O - VI

MODELO ÇINfeTICO

O modelo apresentado a seguir tem por finalidades princi

.a) interpretar os resultados obtidos

b) representar as curvas experimentais por equações que permi

taia calcular os parâmetros do processo estudado.

Considere-se o resultado de um ensaio qualquer, represen_

tado esquematicamente na Figura 6.1

T e m p o

Figura 6.1 Representação esquemática dos resultados de um ensaio ge

nérico.

Curva Is açúcares redutores totais

Curva 2: açúcares redutores

Curva 31 diferença entre as curvas 1 e 2®

-77-

Na Figura 1, a Curva 2 nos da a concentração de açucares

r e d a t o r e s existentes no melo em c a d a instante, enquanto a Curva 3

a o s fornece a concentração de poiissac&rideos (expressa em gramas

de açúeerea r e d u t o r e s por litro) ainda não- hidrolisados pelo mi

crorganismo»

A e x p e r i ê n c i a mostra que, n a s condições adotadas neste -

trabalho, hâ sempre uma fração de polissacarídeos ( S** . Figu­

ra 1) que o microrganismo não consegue hidrolisar» Essa concentra

çao residual S*,* t nas»considerações que se seguem, sera sempre -

subtraída das concentrações de polissacarldeos no meiov conduzindo

a curvas representadas esquematicamente na Figura'6 . 2

Figura 6.2 Representação esquemática dos resultados de um ensaio ge

nérico.

= concentração de polissacarldeos ainda não hidrolisados, descon

tada a concentração residual de 'polissacarldeos*

S 9 = concentração de açucares redutores.

-78-

0 presente modelo baseia-se nas seguintes hipóteses

fundamentais:

1. A hidrólise dos polissacarídeos pelo microrganismo obedece a

seguinte expressão:

as -rr~ = - K S..X " 1 "

dx i

sendo:

velocidade de hidrólise dos polissacarídeos no instante

K = constante de velocidade da hidrólise considerada $

Sj s concentração de polissacarídeosno instante t;

X = concentração de microrganismos no instante t.

2. 0 valor de Y , definido pela equação " 2 e s , é constante durante

todo o processo.

Y = - % r 4 - . t n2 t i

" f t

3. No desenvolvimento do microrganismo, uma vez terminado o perí

odo de indução (ou fase "lag") , há duas fases distintas:

3.1 - Fase exponencial, caracterizada por.

f • • • • • •

3.2 - Fase de declínio, caracterizada, segundo Kono (29), por:

_ M, 2£ (x _ x) " 4 "

ra c

sendo:

c velocidade de desenvolvimento do microrganismo no i n s —

tante t;

J4. a velocidade específica de desenvolvimento do microrganis¬

mo na fase exponencial (constante);

X = concentração de microrganismo no instante t;

-79-

X c = concentração de microrganismos no fim da fase exponencial

í ou no início da fase de declínio) ;

X = concentração máxima de microrganismos produzidos.

Considerando como instante.zero aquele em que tem ini­

cio a fase exponencial e fazendo?

X q = concentração de microrganismos quando t = 0;

t = instante em que termina a fase exponencial (ou em que tem

início a fase de declínio);

as equações " 3 " e * * 4 n conduzem, respectivamente, a:

X « X e* 1 .. . , "5" o

X m - m ( X - cX ) „ e x x p - > r r r <* - V >>>>6" m c

4, A hidrólise dos polissacarídeos tem início quando t = 0, isto

é, no inicio da fase exponencial de desenvolvimento do micror¬

ganismo,

Uma vez estabelecidas as hipóteses básicas do modelo,

segue-se a sua apresentação por partes com o objetivo de sim­

plificar a exposição do assunto»

1 - Partes Hidrólise dos polissacarédeos na fase exponencial de

desenvolvimento do microrganismo

Considerando a fase exponencial de desenvolvimento do

microrganismo, as equações " 1 " e "5 ' 1 fornecem:

dS . = - KS.X fJ* '»7»

dt l o

Indicando com S o valor de quando t = 0, a equa- -

ção 1 7 " nos dá:

S l = S10' e X p [" V * ~ l 1 ) • • •

ou ainda:

lg S 1 = A - B e * 4 »»9»

-80

sendo:

á , ig s i o + JL- . . . . . . . . . . . . . . . . * i o «

1 v

* 2,303 /*» o 1 1

As equações ."8" ou H 9 " representara a variação da concen

tração de poiissacarídeos no meio durante a fase exponencial de

crescimento do microrganismo, ,

2* Parte: Determinação dos parâmetros J& , t*, Y , X Q , X q e K.

A determinação dos parâmetros do processo ê uma d e c o r ­

rência do ajuste da equação "9' 1 aos valores obtidos experimental­

mente. Tal ajuste pode ser realizado da maneira descrita a seguir.

1. s_c_o_.l_.h- — - d— -ins_t_.a_n-t—--i-n_i-<--al_ t o i 0 instante inicial

t e aquele em que se observa, na curva experimental, início de

hidrolise dos polissacar íd eos (Hipótese n° 4 ) .

2. Determinação deyn. e t : Procura-se ajustar a equação

" 9 " aos pontos experimentais no intervalo de tempo t Q H — S t + t',

para diferentes valores de t' escolhidos arbitrariamente desde

t1 = 6 h até o valor de t' ao qual corresponde = 0» 0 maior

dos valores de t' que conduz a um bom ajuste da equação " 9 " aos

pontos experimentais é considerado o valor de t. Esse ajuste con

duz também ao valor de . Destaque-se, neste ponto, o fato de

ser possível avaliar a velocidade espec ífi ca de crescimento do mi

crorganismo ( i n d e p e n d e n t e m e n t e do conhecimento de sua curva

de crescimento.

3. Calculo de X q S A partir do valor de t , pode-se d e ­

terminar o correspondente valor de S , que será indicado por S_ ,

e pela própria definição de Y tem-se:

x - x x - X

Y = -== f - - f § - »12» STi " Tf 'Tc ~ Tf

onde Xfll, S T c , S e s,* são valores experimentais.

Por outro lado, da equação " 5 " deduz-se:

-8.1-

As equações "12" e "13" conduzem a:

Xm l B T i ~ ° Tc »14»

Ti T e T f

4® Cálculo de Y: Ê possível, agora, o cálculo de ¥

(equação "12") levando-se em conta o valor de X q»

5. Calculo de X s Com o valor de X (equação "14") pode-

se calcular X c pela equação "13".

6. Calculo de K: A partir do ajuste da equação " 9 " e dos

valores de yí e de X* t a "11" nos dá o valor de K:

K = 2 , 3 0 3 B/t

o

m 1 5 »

5- Parte: Hidrólise dos polissacarídeos na fase de declínio de

desenvolvimento do microrganismo

Neste caso, as equações " 1 " e " 6 " fornecem:

dS.

dt- = - K B 1 X - (X - X )exp

m m c

r / x c c ) i X - X m c

Indicando com Sj o valor de para t = t*, a equação

" 8 " permite escrever:

A t

Blc B B1 0 * 6 X P 17 n

A integração da "16" no intervalo t I i t leva à se-...

guinte expressão:

B l =B lc e x p 1 ~ K X ™m t " ' « A * 7 ™ 1 - exp

m c

ou ainda

IgBj = A' - B*t - C exp x - X (t - t ). c

"19"

sendo:

l » i, H

K

L

„82™

lc 2,303

x r

'* - 2 r k » • • •

~ 2,3 03 /<- x , I o *

4~ Parte : Variação da concentração de açúcares redutores no meio

Sm qualquer instante t, a concentração de açúcares redu¬

tores no meio (82 ) pode ser expressa por:

S 2 « S S -2*

S0* = concentração de açúcares redutores formados pela hidrólise

dos polissacar íd eos até o instante t:

Sgr = concentração de açúcares redutores consumidos pelo microrga¬

nismo em seu crescimento até o instante t.

Por outro lado:

2 h =

X •- X

S 2 r « - y - 2 ."25«

Logo, a "23" nos dá:

s 2 s s i o i * * *

Durante a fase exponencial do crescimento do microrganie

mo ( t j £ t ) , as equações "2 6 H e "5** conduzem as

s2 = sio - si - r

Durante a fase de declínio de crescimento do microrganis

mo (t > t ) , as equações*26* e " 6 H permitem escrever:

9 •

X

2 h 2 P

l

-83-

S„ - S, - S . - Jòí -X - (X -X )exp __ __ ,»»28" 2 10 1 Y ] m o m e ^ X -X

m c

Equações gerais relacionando S g com o tempo podem ser

obtidas combinando "27" cosi '»8" e"2 8* com "18" respectivamente*

sã partes Reiaçno entre o valor máximo da concentração de açúca­

res redutores no meio e a concentração inicial de açú­

cares redutores totais.

A partir das equações " 8 " e "26" pode-se deduzir a

"29" que correlaciona o valor máximo da concentração de açúcares

redutores (Spjn) no meio durante a fermentação, com o valor da

concentração inicial o**.

S 2 m * S 1 0 ~ * l g S 1 0 * » * 2 9 *

sendo:

Aplicação do modelo aos valores experimentais

As Figuras 6.3 a 6.15 mostram os resultados obtidos no

ajuste das equações apresentadas neste Capítulo aos pontos experi

mentais obtidos nos ensaios já descritos (Tabelas 5.11 a 5.24,

Figuras 5.2 a 5.14' . Os trechos pontilhados das curvas das Figuras

6.3 a 6.15 correspondem à fase em que, terminado o crescimento cx

ponencial do microrganismo, o valor de , já bastante baixo (com

preendido no intervalo 0,2 a 2,0 g/l em onze dos treze ensaios),

é reduzido a zero. A imprecisão que afeta os pontos experimentais

nesse trecho não permitiu verificar a aplicabilidade do modelo

proposto,

A Tabela 6.1 reúne os valores dos parâmetros calculados

de acordo com o exposto na 2- Farte deste Capítulo. 0 valor de t

adotado foi de 6 h, com exceção do ensaio realizado a 25°C em que

se tomou t = 13 h . o

Nas figuras 6.16 a 6.19 apresentam-se os resultados dos

ajustes da equação "29" aos pontos experimentais.

• 84-

S_ = cone* de A,R.T,

0 IO 20 30 40 50 60

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 6.3 : Verificação da aplicabilidade do modelo proposto aos

resultados do Ensaio n° 1.

Temperatura = 25oC; Concentração de farinha = 50 g/l

•85-

0 ¡0 20

Tempo de Fermentação (h )

Figura 6.4: Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Cnsaio no 2.

Temperatura - 3QOC. Concentração de farinha = 20 g/i.

í

-86-

S = cone de A.R.T; S„ = cone. de A.R, ;

S> - dif. entre o A.R.T. e o A.R. residuais = ir

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 6.5: Verificação da apl icabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio nü 3«

Temperatura = 30°C. Concentração de farinha = 30 g/l

20 3 0

Tempo de Fermentação (h )

Figura 6 . 6 : Verificação da aplicabilidade do ir.odelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 4„

Temperatura = 30°C; Concentração de farinha - 40 g/l.

88-

S m = cone. de A. R. T; S 0 = cone„

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 6.7: Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 5«

Temperatura = 30°C; Concentração de farinha = 50 g/l

-89-

S m = cone. de A.R.T; Sn = cone. de A.R ;

S» = di . f. entre A.R.T. e o A.R. residuais =

,5 g / l S T - S 2 - S ' r ; 1 3 , 9 0 g / l

t - 6 , 0 h ; t = 1 1 , 0 h ; tí. = 0 , 3 1 h" 1 ;

A = 1 , 1 8 ; Ü= 0 , 0 3 9 5 X = 0 , 0 4 3 g / l ;

Y = 0 , 3 5 ; X = 1 , 3 2 g / l ; c

K = 0 , 6 4 1 / g h .

10 50 20 30 40

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 6.8: Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 6

60 0

Temperatura = 350C; Concentração de farinha = 20 g/l.

-90

S = cone de AcR^Tc ; S„ = cone. de A.R,

S« = dif, entre o A.K.T e o A.R. residuais = 4,0 g/l; i r

Tempo de Fermentação ( h )

Figura (>. 9X Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n°7

Temperatura = 35°C; Concentração de farinha = 30 g/l

-91-

Tempo de Fermentação h 1

Figura 6.10. Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos rosultados dc Ensaio n° 8»

Temperatura = 35«C; Concentração de farinhs = 4C- p-*i ,

-92-

Tempo de Fermentação ( h )

Figura 6.11: Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 9

Temperatura = 35°C; Concentração de farinha = 50 g/l

-93-

2 0 h

S = cone. de A.R.T; S 0 » cone. de A.R» ;

= dif. entre o A.R,T, e o A»R» residuais 'Ir

= 3,0 g/l S S» ;

• I

— - ~ > 3 l

S, "T

= 6,0 h; t c = 16,0 h;

-1

S r 0 A = 14.3 8 g/l

/l - 0,23 h "; A = 1,19 ;

B = 0,036 ; X =0,096 g/l

Y = 0,68; Xc = 4,01g/l

E = 0,2 0 1/gh

0 10 20 30

Tempo de Fermentação ( h)

Figura 6«12; Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 10

Temperatura = 40°C| Concentração de farinha = 20 g/l

Í

t

0

S T = cone. de A.R.T ; S p = cone. de A.R. ; S £ r = dif

entre o A.R.T. e o A.R. residuais = 4,5;

- S i r » 1 0 21,46 g/l; t = 6,0 h;

-1

t c = 16,0 h; yt = 0,30 h ; A = 1,34;

B = 0,012 ;

X — 0,034 g/l ;

Y = 0,5 8; X c = 4,0 9 g/l;

K = 0,25 1/gh

cr

0 10 2 0 3 0 4 0 50

T e m p o d e F e r m e n t a ç ã o (h )

Figura 6.13: Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 11

Temperatura = 40°C; Concentração de farinha = 30 g/l

-95

10 20 30 40

Tempo de Fermentação ( h )

50 60

Figura G.14. Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n° 12

O

Temperatura = 40°C; Concentração de farinha = 40 g/l

-96

Tempo de Fermentação (h )

Figura 6.15: Verificação da aplicabilidade do modelo proposto

aos resultados do Ensaio n» 13

Temperatura = 40e>C; Concentração de.farinha = 50 g/l

97-

¡0 20 30 40

"10 (Q/i)

0

Figura 6.16 - Concentração máxima de açúcares redutores no meio (S 0 )

durante a fermentação a 30°C em função da concentração

inicial de polissacarídeos (S l n)

-98-

S 2 m = 0 , 9 9 S 1 0 - 9 , 2 9 l o g S A-T- 4 , 5 0

10 2 0 3 0

(g /t)

Figura 6.17 - Concentração máxima de açúcares redutores no meio (S**)

durante a fermentação a 35°C em função da concentração

inicial de polissacarídeos ( S i n ) .

-99-

Figura 6.18 - Concentração máxima de «cucares redutores no meio

(S,, ) durante a fermentação a 40°C em função da con­

centração inicial de polissacarídeos (S,_)«

30

* J I , L 1 I I l I

30 40

s,0 Cg/4)

Figura 6.19 - Concentração máxima de açúcares redutores no meio (S,, ) -¿11

em função da concentração de polissacarídeos ( S j q ) .

Pontos experimentais obtidos a 30, 35 e 40°C.

0 10 20

I 1 —

-101-

TABELA 6.1

Parâmetros calculados de acordo com o modelo proposto

(22 Parte)

Tempera

tura

(°C)

Fari -

nha

(g/l)

t

c (h)

/ (ir 1)

X

o

(g/l)

Y X c

(g/l)

K

<RH>

25 50 22 0,10 0,661 0,48 6,52 0,05

30

20 16 0,28 0,037 0,46 3,24 0,32

30 30 16 0,26 0,051 0,40 3,18 0,20

30

40 18 0,10 0,612 0,38 4,12 0,09

30

50 16 0,31 0,026 0,55 3,67 0,21

35

20 11 0,31 0,043 0*35 . 1,32 0,64

35 30 14 0,28 0,075 0,40 4,07 0,29

35

40 12 0,21 0,229 0,39 2,95 0,23

35

50 16 0,16 0,351 0,40 4,69 0,13

40

20 16 0,23 0,096 0,68 4,01 0,20

40 30 16 0,30 0,034 0,58 4,09 0,25

40

40 16 0,24 0,114 0,57 5,47 0,20

40

50 16 0,25 0,074 0,59 4,00 0,14

t f i = Instante em que termina a fase exponencial.

Já, = velocidade específica de desenvolvimento do microrganismo na fase exponencial.

X = concentração de microrganismos no instante zero (ver hipó¬ tese n° 3)

Y - í\ X^3 (calculado levando-se em conta o valor de X Q )

X F I = concentração de microrganismos no fim da fase exponencial.

K = constante de velocidade da hidrólise dos polissaearídeos .

-10 2»

CAPÍTULO VII

DISCUSSÃO 1)0S RESULTADOS

Preliminarmente, convém tecer alguns comentários a respeito

das condições iniciais do sistema objeto do presente estudo.

No que se relaciona com a concentração inicial de farinha,

cumpre observar que, quando expressa em gramas de A.R.T. por litro,

os valores determinados situam-se em intervalos de amplitude relativa­

mente reduzida, a saber;

a) 15,8 g/l a 17,7 g/l para ensaios com 20 g de farinha por

litro?

b) 25,9 g/l a 26,8 g/l para aqueles com 30 g de farinha por

litro;

c) 33,2 g/l a 35,4 g/l nos casos em que se trabalhou cora

40 g de farinha por litro;

d) 41,3 g/l a 44,1 g/l nos meios com 50 g de farinha por 1i-

tro. (Neste caso, em um dos ensaios, dos cinco realizados,

encontrou-se 38,6 g/l) .

Observe-se ainda, na Figura 7.1, a correlação existente entre

a concentração inicial de A.R.T. e a de farinha, mostrando c o n c o r d â n ­

cia com a proporcionalidade que se deveria esperar.

Estes fatos permitem concluir que os cuidados tomados no pre¬

paro do meio e na conservação da farinha, bem como a técnica ana líti ca

adotada, foram de molde à assegurar boa reprodutibilidade no que diz

respeito à concentração da principal fonte de carbono no meio.

Quanto ao valor inicial do pH, em apenas tres dos 14 ensaios

efetuados, situou-se acima do intervalo 4,95 a 5,35. Esses tres v a l o —

res do pH foram 5,75 (Ensaio n© 8) , 5,80 (Ensaio n» 2) e 5,85 (Ensaio

no 9)

- 3 03 -

Figura 7.1. Relação entre a concentração inicial de A.R,T. e a con­

centração de farinha no meio. Os traços verticais representam os in­

tervalos em que se situam os valores de S** para cada valor de ¥.

Devem ser feitos também alguns comentários relativos á con¬

centração inicial de esporos no meio de fermentação. Exceção feita ao

Ensaio n° 11 em que, por acidente, a contagem não pode ser realizada,,

a concentração inicial de esporos situou-se no intervalo (1,2 a 5,4)xl0

esporos/l, com a maioria (9 ensaios) compreendida no intervalo

Q (1,2 a 2,8) x 10 esporos/l.

Tudo indica, pelo exame das curvas apresentadas nas Figuras

5.2 a 5.14, que essa variação da concentração inicial de esporos não

teve «ma influencia mensurável. Alias, fato análogo já tinha sido

observado por Brancato e Gol ding (.30) com bolores desenvolvendo-se em

meio sólidos u n i a variação de .15 para 182 no numero inicial de esporos

inoculados n a o afetou a velocidade de crescimento da colônia»

No que diz respeito, finalmente., ã possível influência da es

terilizaçao dos frascos nas concentrações dos materiais constituintes

do meio de fermentação, os valores da Tabela 5.6 permitem concluir

que essa influencia pode ser considerada como constante.

Em resumo, pode-se admitir que as condições iniciais do sis¬

tema em estudo foram suficientemente bei» controladas, principalmente

se forem levadas em conta as dificuldades inerentes a realização de

trabalhos de microbiologia em meios nutrientes naturais.

Os ensaios realizados com a finalidade de se escolher um meio

nutriente sólido para a conservação da cultura de A. niger não conduzi

ram a valores que possam ser considerados diferentes para os vários

meios experimentados (Tabela 5 . 1 ) . 0 meio de farinha de banana foi esco

lhido, dentre os ensaiados, unicamente por se saber que nele o micror¬

ganismo se desenvolve bem (27) e por ser de preparo muito fácil. Desta

que-se todavia o fato de que, decorri dos 18 meses de conservação do mi

crorganismo no meio em apreço, suas características, do ponto de vista

de sua atividade amilolítica, mantiveram-se praticamente inalteradas.

Observe-se (Tabelas 5„8 e 5.9) que, no intervalo de teraperatu

ra que conduziu a bons resultados (30 a 4 0 ° C ) , a evaporação durante a

incubação dos frascos não ultrapassou 5 % da massa inicial de meio» Por

este motivo, não se cogitou de corrigir concentrações determinadas du¬

rante a fermentação.

A variação do pH durante a fermentação, bem como a influencia

da concentração inicial de A . R. T. no valor do pH final (Figura 7.2) é

explicável, mesmo adiu i t i mlo-se que nao haja formação de ácidos a partir

da farinha, lembrando que a principal fonte de nitrogênio é o sulfato

de amónio. Nao se procurou, neste caso, correlacionar a variação do pH

com a variação da concentração de A.U.T.

Observe-se, nas Figuras 6.3 a 6.15, que os valores de t (ins

tante em que termina a fase exponencial de crescimento do microrganis¬

mo) calculados pelo inode lo sao muito próximos dos instantes era que o

pH do meio alcança seu valor ut í n i m o . Isto poderia indicar que o mieror

-105-

3,0

o e

Q. 2,0

o

O 30°C

• 35° C

0 40 ° C

O

1,0

20 30 40

Concentração inicial de A R T . (g/i)

Figura 7.2: Influência da concentração inicial de A.R.T. no valor do

pH final .

As Figuras 7.3 e 7.4 mostram, respectivamente, a influencia

da concentração inicial de A.R,T. na porcentagem de A.R.T. consumido

« na concentração final de A.R.T. no meio.

ganismo tem seu crescimento exponencial sustado pela diminuição do

pH„ Esta possível influencia do pH não foi comprovada por não se dis¬

por de equipamento para controlar adequadamente o pH durante a fermen

taçao em frascos agitados»

-106

Figura 7.3 - Variação da % de A.H.T. consumido em função da concentra­

ção inicial de A.R.T.

= concentração inicial de A.R.T,

S». = concentração final de A.R.T.

-107-

10 20 30 40 50 60

Sn (g/ í )

Figura 7.4: Variação da concentração final de A.R.T. (S T f) em função

da concentração inicial de A.R.T. (S_.) .

-108-

Os resultados da Figura 7.3 indicam que a atividade do micror

ganismo foi influenciada por algum fator limitante, pois, do contrário,

a % de A, R. T • consumido deveria ser a mesma para qualquer valor da con

centração inicial de A.R.T. Essa limitação poderia ser eventualmente,

ou devida a existência de um nutriente limitante no meio, ou devida a

uma inibição do microrganismo»

Se existisse, no meio, um nutriente limitante, a concentração

de A.R.T. consumido seria constante e determinada pela concentração do

nutriente limitante considerado. Neste caso, sendo:

*Ti = c o n c e n * r a Ç * ° inicial de A.R.T.

í>Tf - concentração final de A.R.T»

dever-se-ia ter, acima de um dado valor de S :

Ti STi ~ STf ' 1 (constante)

Logo:

S m « — O _ . — K . « , » » » « . . . » 0 9 » f t « E . . . « « 30 T f T i

isto é, deveria haver uma relação linear entre S**, e com coefici

ente angular igual a 1.

Admitindo-se a existência de uma correlação linear entre S*,* e

na Figura 7.4, obtém-se

A diferença entre os coeficientes angulares das retas n 3 0 n e

n3 1" parece indicar que a hipótese da existência de um nutri ente limi­

tante no meio não é aplicável.

Resta considerar a hipótese de uma eventual inibição do micror

ganismo, inibição esta que poderia ser devida, por exemplo, à d i m i n u i ¬

ção acentuada do pH do meio, 0 fato já apontado de que a fase exponen¬

cial do desenvolvimento do microrganismo, prevista no modelo, termina

quando o pll alcança praticamente seu valor mais baixo, pode ser conside

rado um suporte da hipótese em apreço. Saliente-se contudo, que não fo¬

ram realizados ensaios com o fim espec ico de comprovar a veracidade

de uma ou de outra das hipóteses aventadas.

Admitindo-se uma correlação linear entre a % de A.R.T. utiliza

da e a concentração inicial de A.R.T. (Figura 7,3:

*Tf ~ *Ti 100 ' 89,76 - 0,42 S_. ), chega-se à expressão:

-109-

S I f ' 4,2.10 M iS*. + C , 1 0 S T Í "32»

representada graficamente na Figura 7.4.

A Tabela 7,1 reúne os valores de Y calculados de duas m a n e i ­

ras: levando-se em conta X e desprezando-se X cm relação à X . As di

o o ra -

ferenças encontradas justificam o calculo de Y desprezando-se a concen

tração inicial de células X Q . NO ensaio realizado com a finalidade de

se medir o valor de Y a partir de um maior número de frascos (item

4 . 1 5 ) , trabalhando-se com 18 erlenmeyers, a 35°C e com 20 g de farinha

por litro, encontrou-se para Y o valor 0,45, valor este que, nas consi

derações que seguem substituirá, por ser mais digno de confiança, o va

lor Y ' 0,36 do ensaio a 35oc e 20 g/l da Tabela 7.1.

Uma análise de variância com os valores de Y calculados, mos¬

trou que:

1. não é significativa a influência da concentração de f a r i ­

nha ;

2. é significativa a influência da temperatura.

Desprezando Y = 0,60 (do ensaio a 30OC e 50 g/l) e Y = 0,71

(do ensaio a 40°C e 20 g/l) por estarem, ao que tudo indica, afetados

de considerável erro experimental, e calculando-se os valores médios

de Y para cada temperatura com os respectivos intervalos de confiança

para uma probabilidade de 80%, tem-se:

a) a 30OC: Y = 0,417 - 0,052

b) a 3 5 0 C : Y = 0,415 t 0,0204

c) a 40OC: Y ' 0,587 í 0,008

o que indica que os valores a 30°C e a 35oC devem ser considerados

iguais entre si, enquanto que o valor de Y a 45oc deve ser considerado

maior que os outros. Não há possibilidade de estabelecer comparações

seguras com o único resultado obtido a 2 5 ° C 0 ensaio a 45°C (Tabela

5,24) não foi considerado porque a essa temperatura não houve fermenta

ção.

A Figura 7.5 mostra a variação do tempo de fermentação,

t*(intervalo de tempo que decorre desde o instante de inoculação do

meio até o momento em que não há mais variação significativas de c o n ¬

centrações de A,il .T. e de A.Ti.) com a concentração de farinha e com a

temperatura,

- 1 1 0 -

T A B I I L A 7 . 1

Comparação entre os valores de Y calculados

levando-se em cconta X e riísprezando-ae X o o

cm relação a X

Temperatura

(°C)

Farinha

(g/l)

Va l,ores de 1 Temperatura

(°C)

Farinha

(g/l) Caldulados desprezan¬ do X em relação a X

o m

Calculados levando

em conta o valor

de X

2 5 5 0 0 , 4 9 o

0 , 4 8

3 0

2 0 0 , 4 7 0 , 4 6

3 0

3 0 0 , 4 0 0 , 4 0

3 0

40 0 , 3 8 0 , 3 8

3 0

5 0 0 , 6 0 0 , 5 5

3 5

2 0 0 , 3 6 0 , 3 5

3 5

3 0 0 , 4 1 0 , 4 0

3 5

40 0 , 4 0 0 , 3 9

3 5

5 0 0 , 4 0 0 , 4 0

40

2 0 0 , 7 1 0 , 6 8

40

3 0 0 , 5 9 0 , 5 8

40

40 0 , 5 8 0 , 5 7

40

5 0 0 , 5 9 0 , 5 9

X q ' concentração de microrganismos no instante zero (ver hipótese

no 3 )

*m ~ c o n c e " n * r a Ç * ° máxima de microrganismos produzidos

- 1 1 1 -

60

I / I /

4 0

O---

3 0

20 3 0 4 0 5 0

C o n c e n t r a ç ã o de f a r i n h a , W ( g / l )

Figura 7 . 5 : Influencia da temperatura e da concentração de farinha no

tempo de fermentação t*..

f

O 3 0 °C

I • 35 °C

5 0 • 40 °C

-112-

Observe-se que, corno decorrência da imprecisão que afeta a

determinação desse valor, não se pode afirmar qual o valor da tempera­

tura ótima no que se relaciona com o tempo de fermentação,

 influência da temperatura pode, porém, ser examinada de ura

outro ponto de vista.

Indicando com P a produtividade do processo, definida por:

¥(S~. - S_, _) TJ _ • ; H - T T I t

f

e considerando que:

a) Y varia com a temperatura;

b) tj. varia com a temperatura e com a concentração de farinha

(Figura 7.5) ;

c) S** - S,p£ varia com a concentração de farinha (Figura

7.6);

pode-se calcular os valores médios de P da Tabela 7,2

A partir desses valores, as condições recomendáveis de fermen

taçao, dentre as ensaiadas, seriam 4Ü CC e 50 g de farinha por litro.

0 modelo proposto (Capítulo 6 ) , permitiu calcular, para cada

ensaio, o valor da velocidade específica de crescimento do microrganis

mo na fase exponencial () e o valor da constante de velocidade de hi

drólise dos polissacarídeos (K) . A escassez de pontos experimentais na

fase exponencial não permite determinar, com segurança, a variação de

e de K com a temperatura. Considerando-se apenas os ensaios em que

a fase exponencial de crescimento do microrganismo compreende 4 ou 5

pontos experimentais e em que houve bom ajuste das curvas do modelo

(25oc, 50 g/l; 30OC, 20 g/l e 30 g/l; 350C, 30 g/l; 40OC, 20 g/l e

30 g/l) , obtém-se o gráfico da Figura 7.7 que parece indicar um valor

ótimo da temperatura em 35oc. Considerando-se todos os ensaios, mesmo

aqueles com menos de 4 pontos experimentais na fase exponencial de

crescimento do microrganismo, a única conclusão que se pode tirar é

que a temperatura ótima deve estar compreendida no intervalo 3 0°C a

40°C, com valores de yW. entre 0,2 e 0,3 h~* e valores de K provavelmen

te entre 0,2 e 0,3 1/gh.

-•113

Figura 7.6: Influencia da concentração de farinha e da temperatura na

concentração de A.R.T. utilizada (S, f i - $ T f) * A equação

indicada na figura é consequência das expressões indica¬

das nas Figuras 7.1 e 7.3

*Ti ~ c o n c r n * r a c a o inicial de A.R.T.

S„„ ' concentração final de A.R.T.

-114-

TAP.ELA 7.2

Variação da produtividade media, Pt com as condições de

fermentaç ao.

Tem¬ pera tura

(°C)

Cone.de farinha

(s/i)

- ç Ti Tf

(g/1)

Y ( 3 T Í - S T f )

(g/l) (h)

„ Y ( S T i " S Tf )

(g/lh)

30

20 14,7 6,13 36 0,17

30

30 20,6 8,59 35 0,24 30

40 25 ,6 10,67 37 0,29

30

50 2Q, 8 12,42 60 0,21

35

20 14, 7 6,10 35 0,17

35 30 20,6 8., 55 34 0,25

35

40 25,6 10,62 40 0,26

35

50 29,8 12,37 48 0,26

40

20 14,7 8,63 34 0 4 2 5

40

30 20,6 12,09 36 0,33

40 40 25,6 15,03 42 0,36

40

50 29,8 17,49 44 0,40

*Ti ' c o n c e n * r a Ç * ° inicial de A.R.T.

"*Tf ' concentração final de A.R.T.

Y ' - A X/ J s

t*, ' tempo de fermentação.

-115-

25 3 0 35 4 0

Temperatura (°C )

Figura 7.7: Variação da velocidade específica de crescimento do micror­

ganismos na Fase exponencial ( J4. ) e da constante de veloci

dade de hidrolise dos polissacarideos (K) com a temperatura.

(Valores médios dos ensaios em que a fase exponencial c o m ¬

preende 4 ou 5 pontos experimentais, com bom ajuste da cur¬

va do modelo) „

0 modelo proposto (Capitulo o) permitiu também correlacionar o

valor máximo da concentração de açúcares redutores no meio (S„ ) com o

-m

valor de S*Q (Equação"2 9") • Levando em conta.os erros experimentais e

8 imprecisão na determinação dos valores de 8* , os a justes podem ser

considerados bastante satisfatórios (Figuras 6.16 a 6,19) .

-116-

Resta, finalmente, tecer algumas considerações a respeito dos

teores de nitrogênio e de aminoácidos determinados eia uma das amostras

obtidas (Itens 5.12 e 5.13) .

já são bastante conhecidos os inconvenientes que decorrem de

se avaliar o teor de proteína simplesmente muitipiiçando-se por 6,25 o

teor de nitrogênio total do material. Apesar disso, porém, é bastante

frequente o emprego desse fator na comparação de teores de proteínas

em materiais diferentes» Aplicando-se esse mesmo critério ao caso ana­

lisado nesta Dissertação, chega-se a um teor de proteína ("crude p r o —

tein") igual a 25,9% do m i c é1i o seco. Este valor situa-se praticamente

no intervalo 10 a 25% em que se encontram os teores ce proteínas de

fungos filamentosos (31), mas é consideravelmente inferior ao apontado

por Spicer (da ordem de 40%) em sua comunicação já citada ( 7 ) .

A Tabela 7,3 compara os teores dos aminoácidos essenciais en¬

contrados no micé1io obtido neste trabalho com valores citados na comu

nicação de Spicer (7) .

Os valores da Tabela 7.3 apenas dizem que, quanto ao teor de

boa parte dos aminoácidos essenciais, o concentrado preparado pela

ação do A. niger NRRL 337 sobre mandioca ê comparável a outros. Nada

se pode concluir, porém, sobre o valor biológico do material obtido,

para o que se torna necessário o desenvolvimento de ensaios n u t r i c i o —

nais e toxicológicos que escapara do campo de trabalho deste laboratório.

„117-

TABELA 7.5

Aminoácidos Teor do aminoácido (g/16 g de N)

Aminoácidos FAO R H M

(*)

Concentrado Obt ido neste trai»a lho

Obtido de Chlorella

leocina 4,8 6,3 a 7,2 5,5 6,8

Isoleucina 4,2 3,1 a 3,6 3,5 3,1

Valina 4,2 5,0 a 6,9 5,0 • 4,8

Lisina 4,2 3,3 a 7,0 4,1 4,9

Metionina 9 0 4 0

V 2,0 a 2,8 0,9 1.4

Cistina 2,0 J 2,9 a. 3,5 (§) 0,8

Fenilalanina 2,8 3,6 a 3,9 7,8 3,5

Treonina 2,8 3,1 a 5,3 4,1 3,9

Tirosina 2,8 2,8 a 3,4 4,3 2,6

Triptofano 1,4 1,8

SOVA 31,4 33,7 a 38,7 35,3 33,6

(*) Fungo (The Lord Rank Research C-nter) (§) Nao foram determinados.

Aminoácidos essenciais em diferentes concentrados proteicos

- 1 1 8 -

CAPITULO VIII

c o n c l u s õ e s

Os resultados obtidos, nas condições experimentais descritas,

permitem concluir5

8.1 - 0 A. niger NRRL 33?, conservado em meio sólido obtido de farinha de

banana, manteve praticamente inalterada sua atividade amilolítica em

um período de observação de 18 meses»

8.2 - A concentração inicial de esporos, variável, no intervalo

8 8 ~

1,2 x 10 a 5,4 x 10 esporos/l, não influiu no desenvolvimento

do processo,

8.3 - A perda de massa, por evaporação, nos frascos agitados, em Tem­

peratura de 30 a 4 0 ° C , não ultrapassou, em um período de 60 h,

5% da massa inicial de in»*io,

8 .4 - 0 pll do meio sofre uma diminuição considerável, passando de um

valor inicial aproximadamente igual a 5 a ura valor final da or —

dem de 1 a 2, em um período de 23 a 32 h a contar do momento da

inoculação,

8 .5 - 0 instante em que termina a fase exponencial de crescimento do

microrganismo, calculado pelo modelo proposto, coincide pratica¬

mente com o instante em que o pH do meio atinge seu valor mínimo.

8.6 - Deve haver um fator limitante da atividade do microrganismo que,

ao que tudo indica, não e a concentração de nutriente do meio,

8.7 - 0 valor da concentração inicial de células não influe no cálculo

da massa de micelio produzido por unidade de massa de fonte d®

carbono utilizada.

8.8 - A massa de micélio produzido por unidade de massa de fonte de

carbono utilizada não depende da concentração de farinha.

8.9 - A massa de micélio produzido por unidade de massa de fonte de

carbono utilizada varia com a temperatura, sendo igual a

0,42 a 30OC e a 350C, e 0,59 a 4Q0C.

-119-

8*10 - A vroduti. videde o: iat «xprossa em grama de micelio por litro e

por hora, atingió o valor máximo 0,40 no ensaio a 40°C cora 50 g

de farinha per 1 i tro„

8.11 - 6 possivs). explicar v a r i a ç õ e s de concentrações de açúcares

r e d u t o r e s & <*- açucaras r e d a t o r e s totais, durante a fermentação,

bem conto calcular parâmetros do processo, por meio de um modelo

cinético desenvolvido a partir das seguintes hipóteses:

Ia») A hidrolise dos polissacarxdeos pelo microrganismo obedece

a expressão i

dS.

2a 0) 0 valor de Y e constante durante todo o processo.

3a.) No desenvolvimento do microrganismo, uma vez terminado o pe­

ríodo de indução (ou fase l a g ) , há duas fases distintas:

a - Fase exponencial» caracterisada oor d ^ = X** X

b - F a s e de declínio, caracterizada, segundo Kono (29) por

SIL l i ( X - X )

dt / Xra X e a i

4a.) A hidrólise do polissacarídeo tem início quando t = 0, isto

e, no início da fase exponencial de desenvolvimento do micror

ganismo«

8.12 - Os valores das velocidades específicas de desenvolvimento do m i -

crorganismo na fase exponencial, entre 30°C e 40OC, situam-se no

-1 -1

intervalo 0,2 h " a 0,3 h « Considerando-se apenas as curvas

mais dignas de confiança, o máximo valor desse parâmetro, foi

0,28 h""\ a 35°C.

8.13 - Os valores das constantes de velocidade de hidrólise dos polissa-

carídeos, entre 30°C e 40«C, situam-se no intervalo 0,2 l/g.h a

0,3 1/g.h. Considerando-se tão somente as curvas mais dignas de

confiança,, o máximo valor dessa constante foi 0,29 1/g.h a 35oC.

8.14 - 0 modelo proposto permitiu correlacionar, com bons resultados, o

valor máximo da concentração de açucares redutores no meio com a

concentração inicial de fonte de carbono assimilável pelo micror

ganismo»

-120-

8.15 - 0 míeélio obtido no ensaio a 35*0 com 40 g d® farinha por litro

apresentou um teor de proteína (calculado multiplicando por

6,25 o teor de nitrogênio total) igual a 25,9 %,. em. relação ao

micélio seco, e teores de aminoácidos essenciais comparáveis aos

obtidos em outros casos, Ressalte-se, contudo, que nada pode ser

afirmado quanto ao valor biológico do material obtido.

CAPITULO IX

ASSUNT05 A PESQUISAR

Cori iass nos resultados obtidos nesta Dissertação e nos outros

dois trabaliios sobre mandioca citados na Introdução, pretendeu-se pros

seguir esta linha de pesquisa estudando, em fermentador de 14 litros e

utilizando como meio o residue de fecularias de mandioca:

1, Influencia da temperatura e do pH#

2» Transporte de oxigênio do ar ao microrganismo, compreendendo:

2. ] - Influência da vazão específica do ar;

2.2 - Influencia da agitação (frequência do agitador, tipo de

agitador, potencia consumida na agitação)•

2.3 - Balanço gasoso completo,

3» Influencia das condições de fermentação no tipo de crescimen¬

to do microrganismo ("pellets" ou micélio desagregado; dimen¬

sões médias dos " p e l l e t s " ) .

4 . Fermentação contínua

5, A partir dos resultados obtidos no fermentador de 14 litros,

pretende-se estudar a ampliação de escala do processos

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-124-

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