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CONSTRUÇÃO DE GENES SINTÉTICOS CODIFICANDO PROTEÍNAS DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA: ANÁLISE DE EXPRESSÃO E TRÁFEGO CELULAR DE POLIPEPTÍDEOS SELVAGENS E FUSIONADOS A PROTEÍNA DE ASSOCIAÇÃO À MEMBRANA LISOSSOMAL (LAMP)

MARIANA DE LUCENA PALMA

RECIFE 2010

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RECIFE 2010

Orientador: Dra. Laura Helena Vega Gonzales Gil, PhD

Co-orientador: Dr. Rafael Dhalia, PhD

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE

MARIANA DE LUCENA PALMA

CONSTRUÇÃO DE GENES SINTÉTICOS CODIFICANDO PROTEÍNAS DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA: ANÁLISE DE EXPRESSÃO E TRÁFEGO CELULAR DE POLIPEPTÍDEOS SELVAGENS E FUSIONADOS A PROTEÍNA DE ASSOCIAÇÃO À MEMBRANA LISOSSOMAL (LAMP)

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__________________________________________ 1º Examinador: Dr. Antônio Carlos de Freitas

Departamento de Genética/UFPE

__________________________________________ 2º Examinador: Dr. José Luiz de Lima Filho

Biologia Molecular/LIKA

__________________________________________ 3º Examinador: Dr. Tercílio Calsa Júnior

Departamento de Genética/UFPE

__________________________________________ Orientador: Dra. Laura Helena Vega Gonzales Gil, PhD

LaViTE/CPqAM-FIOCRUZ

__________________________________________ Co-orientador: Dr. Rafael Dhalia, PhD

LaViTE/CPqAM-FIOCRUZ

__________________________________________ Coordenador: Dr. Antônio Carlos de Freitas

A comissão examinadora considera o presente trabalhoAPROVADO

Portanto, cumpridas todas as exigências regimentais, Mariana de Lucena Palma faz jus ao grau de Mestre em Genética e Biologia Molecular pela UFPE. Recife, 09/04/2010

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOOPPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMMGGEENNÉÉTTIICCAA EE BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR

Parecer da comissão examinadora da dissertação de Mariana de Lucena Palma

intitulada: Construção de genes sintéticos codificando proteínas do vírus da Febre Amarela: Análise de expressão e tráfego celular de polipeptídeos selvagens e fusionados a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal (LAMP)

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““VVooccêê ppooddee ddiizzeerr aaddeeuuss aa ssuuaa ffaammíílliiaa ee aa sseeuuss aammiiggooss ee aaffaassttaarr--sseemmiillhhaass ee mmiillhhaass ee,, aaoo mmeessmmoo tteemmppoo,, ccaarrrreeggáá--llooss eemm sseeuu ccoorraaççããoo,,

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AAggrraaddeecciimmeennttooss

À minha orientadora, Dra. Laura Gil, pela prestatividade e ao meu co-orientador, Dr. Rafael Dhalia, pelos ensinamentos passados sempre com muito humor, pelo incentivo, confiança e compreensão.

Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães pelo suporte técnico, financeiro e humano. À FACEPE pela bolsa de estudos cedida.

Aos meus companheiros do LaViTE pelas experiências trocadas e, em especial, à Isabelle, Fábia, Georgia, Andréa Barbosa, Gabriel e Renato, parceiros de bancada que contribuíram diretamente na realização deste trabalho através de colaborações e distrações.

Aos amigos da Microbiologia, em especial à minha amiga de longas datas Amaranta pelo companheirismo e ombro amigo sempre presentes.

Em especial:

Aos meus pais e irmã pelo amor incontestável, dedicação extrema, apoio e confiança em todas as minhas decisões profissionais e pessoais, e pelo suporte emocional fornecido a todo momento, apesar da distância. Tenho muito orgulho de fazer parte desta família linda!

A toda a minha família, pelo carinho e incentivo demonstrados de inúmeras maneiras. Ao meu cunhado, pela alegria contagiante e atenção.

Aos meus amigos para toda a vida, Juliana, Mylla, Raísa, André, Gabriel e Marcelo, família substituta e companheiros na alegria e na tristeza. Em especial a July e Mylla, “amigas-irmãs” que adoro e admiro, obrigada pela dedicação e demonstração de carinho.

A meu namorado Gilberto, que caminhou ao meu lado por grande parte da minha vida, testemunha de todos os sonhos realizados, pelo incentivo, dedicação e amor. Aos meus sogros e cunhadas, por me considerarem membro da família e pelo incentivo constante.

A todos, meus sinceros agradecimentos!

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SUMÁRIO

Item Página

Lista de Abreviaturas ......... iLista de Figuras ......... ii Lista de Tabelas ......... iv Resumo ......... vAbstract ......... vi Introdução ......... vii

1. Revisão da Literatura ......... 81.1. Epidemiologia da Febre Amarela (FA) ......... 81.2. Histórico da FA no Brasil ......... 121.3. Patogenia e quadro clínico da FA 1.3.1. Patogenia 1.3.2. Quadro clínico 1.4. Diagnóstico e tratamento da FA 1.4.1. Diagnóstico 1.4.2. Tratamento 1.5. Prevenção da FA 1.5.1. Vacina contra FA 1.6. O Vírus da Febre Amarela (VFA) 1.6.1. Características gerais 1.6.2. Ciclo replicativo 1.6.3. Proteínas não-estruturais NS1 e NS3 1.7. Desenvolvimento e avaliação de vacinas de DNA contra os flavivírus

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332. Objetivos

2.1. Objetivo Geral 2.2. Objetivos Específicos

......... 37

3. Materiais e Métodos ......... 383.1. Otimização e síntese de seqüências para expressão em células eucarióticas ......... 383.2. Otimização e síntese de seqüências para expressão em bactérias 3.3. Expressão e purificação das proteínas MBP-NS1 e MBP-NS3 3.4. Imunização de coelhos para obtenção de anticorpos específicos contra NS1 e NS3 3.5. Imunoadsorção dos anticorpos produzidos contra as proteínas recombinantes NS1 e NS3 3.6. Avaliação da produção de anticorpos específicos contra as proteínas NS1 e NS3 de VFA, através da técnica de Western-blot 3.7. Cultivo, infecção e transfecção de células eucarióticas 3.8. Análise da expressão de células transfectadas, através da técnica de Western-blot 3.9. Análise da expressão das células transfectadas, através de Microscopia de Fluorescência 3.10. Avaliação da resposta imune induzida em camundongos imunizados com as construções p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT/LAMP 3.10.1. Obtenção dos vetores vacinais em larga escala 3.10.2. Animais e protocolos de imunização 3.10.3. Obtenção de células esplênicas 3.10.4. Obtenção de peptídeos sintéticos da proteína NS1 3.10.5. Ensaios de Enzyme-linked ImmunoSpot Assay (ELISPOT)

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4. Resultados ......... 464.1. Construção de genes sintéticos ......... 46

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4.1.1. Otimização para expressão em células eucarióticas 4.1.2. Otimização para expressão em bactérias

4.2. Construção dos vetores de expressão 4.2.1. Vetores de expressão em células eucarióticas4.2.2. Vetores de expressão em bactérias

4.3. Expressão das proteínas recombinantes MBP-NS1 e MBP-NS3 4.4. Purificação das proteínas de fusão MBP-NS1 e MBP-NS3 4.5. Imunização de coelhos e avaliação da produção de anticorpos específicos contra as proteínas NS1 e NS3 de VFA, por Western-blot4.6. Análise da expressão das construções vacinais de NS1 e NS3 em células eucarióticas 4.7. Análise da localização celular das proteínas NS1 e NS3 em células eucarióticas, através de microscopia de fluorescência 4.8. Avaliação da resposta imune celular, induzida em camundongos imunizados com as construções p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT/LAMP

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5. Discussão ......... 656. Conclusões ......... 727. Referências Bibliográficas ......... 738. Anexos ......... 98

Anexo 1. Relatório da otimização do gene NS1 para expressão em células humanas Anexo 2. Relatório da otimização do gene NS3 para expressão em células humanas Anexo 3. Relatório da otimização do gene NS1 para expressão em E. coliAnexo 4. Relatório da otimização do gene NS3 para expressão em E. coli

9. Memorial da aluna

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LLiissttaa ddee aabbrreevviiaattuurraass

aa Aminoácidos

AEC 3-amino-9-etil-carbazole

APC Antigen Presenting Cell – Célula Apresentadora de Antígenos

BSA Bovine Serum Albumin- Albumina Sérica Bovina

CEUA Comitê de Ética para Uso de Animais

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DENV Dengue vírus – vírus da Dengue

ECL Enhanced Chemioluminescency – Reação de Quimioluminescência

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ELISPOT Enzyme-linked ImmunoSpot Assay

FA Febre Amarela

hLAMP-1 human Lysosome Associated Membrane Protein 1 – Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana 1

IPTG Isopropílico !-D-1-thiogalactopyranoside

LB Luria-Bertani

MBP Maltose Binding Protein – Proteína de Ligação à Maltose

MHCI Major Histocompatibility Complex class I – Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I

MHCII Major Histocompatibility Complex class I – Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II

ORF Open Reading Frame – Quadro Aberto de Leitura

PCR Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia de Polimerase

PFU Plaque Forming Unit – Unidade Formadora de Placa

PRNT Plaque Reduction Neutralization Test – Teste de Neutralização de Placa

TCA Trichloroacetic acid – Ácido Tricloroacético

TLR3 Toll-like Receptor 3

UTR Untranslated Region – Região Não Traduzida

VNF Vacina Neurotrópica Francesa

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LLiissttaa ddee FFiigguurraass

Figura 1 Distribuição geográfica do vírus da Febre Amarela na África e América do Sul 8

Figura 2 Ciclos de transmissão da Febre Amarela 9

Figura 3 Distribuição geográfica do mosquito Aedes aegypti nas Américas em 1930, 1970 e 2004

10

Figura 4 Mosquito Haemagogus janthinomys, principal transmissor da Febre Amarela na América do Sul

11

Figura 5 Histórico da Febre Amarela no Brasil 13

Figura 6 Série histórica de casos de Febre Amarela e taxas de letalidade entre os anos de 1982 e 2008

14

Figura 7 Áreas de risco para Febre Amarela silvestre 15

Figura 8 Distribuição dos casos de Febre Amarela silvestre no Brasil de 1999 a 2008 15

Figura 9 Mapa das áreas com recomendação de vacina contra a Febre Amarela no Brasil, 2008

16

Figura 10 Árvore filogenética representando as linhagens dos sete genótipos do VFA, baseada nas seqüências nucleotídicas da região gênica prM/E

24

Figura 11 Representação do Vírus da Febre Amarela 25

Figura 12 Eletromicrografia do Vírus da Febre Amarela 25

Figura 13 Organização da ORF do Vírus da Febre Amarela 26

Figura 14 Representação esquemática do ciclo de vida do vírus da Febre Amarela 28

Figura 15 Apresentação antigênica pela via MHCII, mediada pela Proteína de Associação à Membrana Lisossomal – LAMP

34

Figura 16 Esquema representativo do vetor pMAL-c4X 39

Figura 17 Esquema representativo das construções gênicas 46

Figura 18 Otimização de codon usage, para o aminoácido lisina, visando melhorar a eficiência de expressão da proteína NS3 de VFA em células eucarióticas humanas

47

Figura 19 Estruturas secundárias e distribuição do conteúdo de GC da seqüência de NS1 48

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Figura 20 Estruturas secundárias e distribuição do conteúdo de GC da seqüência de NS3 48

Figura 21 Sítios crípticos de splicing e sítios internos de restrição da seqüência de DNAque codifica NS1

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Figura 22 Sítios crípticos de splicing e sítios internos de restrição da seqüência de DNAque codifica NS3

49

Figura 23 Domínios hidrofílicos das proteínas NS1 e NS3 selecionados pelo perfil de hidrofilicidade Kyte-Doolittle

51

Figura 24 Esquema representativo das construções gênicas 51

Figura 25 Estruturas secundárias e distribuição do conteúdo de GC da seqüência de NS1 52

Figura 26 Estruturas secundárias e distribuição do conteúdo de GC da seqüência de NS3 52

Figura 27 Sítios internos de restrição da seqüência de DNA que codifica NS1 53

Figura 28 Sítios internos de restrição da seqüência de DNA que codifica NS3 53

Figura 29 Esquema de subclonagem das seqüências otimizadas de NS1 e NS3 no vetor p43.2, sem fusão com LAMP

54

Figura 30 Esquema de subclonagem das seqüências otimizadas de NS1 e NS3 no vetor p43.2, fusionadas à LAMP

54

Figura 31 Esquema de subclonagem das seqüências otimizadas de NS1 e NS3 no vetor pMAL-c4X

55

Figura 32 Expressão das proteínas recombinantes MBP-NS1 e MBP-NS3 56

Figura 33 Purificação das proteínas de fusão MBP-NS1 e MBP-NS3 57

Figura 34 Análise da sensibilidade/especificidade dos anticorpos policlonais em reconhecer tanto as proteínas recombinantes que os geraram como a proteína nativa de VFA, através de Western-blot

58

Figura 35 Análise da expressão das construções vacinais de NS1 e NS3 em células humanas, por Western-blot

59

Figura 36 Análise da localização intracelular das proteínas NS1 e NS3 expressas pelos vetores vacinais, por microscopia de fluorescência

61

Figura 37 Resposta imune celular de camundongos BALB/c contra pools de peptídeos da proteína NS1 do VFA

63

Figura 38 Epítopos imunogênicos, individuais, identificados em camundongos imunizados com as construções vacinais p43.2-NS1OPT/LAMP e p43.2-NS1OPT

64

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LLiissttaa ddee TTaabbeellaass"

Tabela 1 Proteínas do vírus da Febre Amarela e suas possíveis funções 26

Tabela 2 Matriz de peptídeos da proteína NS1 de VFA 45

Tabela 3 Escala de Hidrofilicidade dos aminoácidos segundo o perfil Kyte-Doolittle 50

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RReessuummoo

A vacinação com o vírus atenuado 17D/17DD é o principal método de prevenção da Febre Amarela. Apesar do sucesso desta vacina em todo o mundo, reações adversas, aumento da severidade dos sintomas e até casos fatais têm sido reportados, o que estimula o desenvolvimento de uma vacina de DNA codificando seqüências específicas do vírus da Febre Amarela (VFA). Entretanto antígenos codificados por vacinas de DNA são expressos intracelularmente e preferencialmente apresentados ao sistema imune através de moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I (MHCI). O aumento da eficiência destas vacinas é possível através da fusão de seus antígenos com a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana (hLAMP-1), direcionando-os para o compartimento do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II (MHCII). A via do MHCII é responsável pela ativação de linfócitos T CD4+, importantes para sustentar a resposta celular de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança de classe de anticorpos e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos. As quimeras antígeno/LAMP apresentam uma maior indução da resposta imune quando comparadas aos antígenos não-fusionados à LAMP. Neste trabalho, apresentamos a análise da expressão e localização intracelular das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do VFA, nas suas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. Para tanto, as seqüências de DNA das proteínas NS1 e NS3 foram selecionadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e otimizadas através do algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®), de acordo com parâmetros como codon usage, estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo GC, motivos repetitivos de DNA, sítios crípticos de splicing, dentre outros, com o intuito de aumentar a expressão antigênica. As seqüências de DNA otimizadas foram enviadas para síntese comercial (Geneart®) e clonadas em vetores de expressão eucarióticos, nas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. As construções vacinais obtidas foram enão utilizadas na transfecção de células eucarióticas cujos extratos foram analisados quanto à expressão protéica através de ensaios de Western-blot e imunofluorescência, utilizando anticorpos policlonais específicos produzidos através da imunização de coelhos com proteínas NS1 e NS3 recombinantes. Nestes ensaios, todas as construções vacinais apresentaram expressão eficiente e distribuição intracelular adequada. Enquanto as proteínas nativas apresentaram a distribuição reticular característica, os antígenos fusionados à LAMP apresentaram uma distribuição lisossomal típica do LAMP endógeno. As respostas imunes geradas contra as construções vacinais de NS1 foram avaliadas em camundongos BALB/c. Ambas as construções, fusionada e não-fusionada à LAMP, foram capazes de induzir uma forte resposta celular contra os mesmos epítopos induzidos pela vacina convencional 17DD. A resposta gerada pela construção fusionada a LAMP, entretanto, apresentou a melhor performance. Os resultados obtidos neste trabalho serão integrados a dados previamente obtidos em nosso laboratório em estudos com proteínas estruturais para o desenvolvimento de vacinas de DNA capazes de neutralizar infecções pelo VFA.

Palavras-chave: Febre Amarela; otimização gênica; LAMP

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AAbbssttrraacctt

The vaccination with Yellow Fever - YF 17D/17DD attenuated virus strain is the main strategy to prevent the YF disease. In spite of the success of this vaccine all over the world, adverse reactions, increased symptoms severity and fatal cases have been reported. Given this scenario, the development of a DNA-based vaccine encoding specific YF virus sequences has been considered. However, DNA encoded antigens are intracellularly expressed and consequently are mainly presented to the immune system by Major Histocompatibility Complex Class I (MHCI) molecules. A potential mean to improve genetic vaccines performance is expressing the desirable antigen within the human Lysosome-Associated Membrane Protein 1 (hLAMP-1) to target the vaccine antigen to the Major Histocompatibility Complex Class II (MHCII) compartment. MHCII via activates CD4+ cells that are important to support CD8+ responses, development of memory, antibody class switching and clonal expansion of antigen-specific B cells. LAMP/antigen chimeras have been shown to elicit enhanced immune responses, when compared to vaccines encoding unmodified native antigens. Here we described the expression and cellular traffic analysis of Yellow Fever (YF) non-structural proteins NS1 and NS3, both as wild type and as LAMP-fused proteins. Firstly, NS1 and NS3 DNA sequences were selected from National Center for Biotechnology Information (NCBI) public database and utilized as template to generate DNA codon-optimized sequences. Coding sequences were optimized, utilizing the genetic algorithm from LETO 1.0 software (Entelechon®), in terms of codon usage, message RNA (mRNA) secondary structure, GC distribution content, DNA repeat motifs, cryptic splice sites, etc. in order to improve antigens expression efficiency. Optimized DNA sequences were sent to commercial synthesis (Geneart®) and cloned into eukaryotic expression vector, both as wild type and as LAMP-fused antigens. Obtained constructs were utilized to transfect eukaryotic cells and transfected-cell extracts expression were analyzed by Western-blot and immunofluorescence assays utilizing specific polyclonal antibodies produced by rabbit immunization with NS1 and NS3 recombinant proteins. All optimized DNA constructs were considered well-expressed and presented the appropriated intracellular localization. While native proteins showed the characteristic membrane reticular distribution, LAMP/antigens showed the typical punctuated lysosomal-like distribution of endogenous LAMP. The immune response generated against the NS1 vaccine constructions were evaluated in BALB/c mice strain. Both constructions, with and without LAMP, were able to induce very strong T cell responses to the same epitopes that are induced by 17DD YF vaccine. The LAMP-fused formulation had the overall best performance. The results obtained here will be integrated to previously data generated in ours laboratory, concerning the study of YF structural proteins, in order to develop a DNA-based vaccine able to neutralize YF infection.

Key Words: Yellow Fever; gene optimization; LAMP

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IInnttrroodduuççããoo

A Febre Amarela é uma febre hemorrágica, muitas vezes letal, transmitida ao homem através da picada de insetos culicídeos, tendo como agente etiológico o vírus da Febre Amarela. Esta doença mantém-se endêmica na América do Sul e na África, provocando cerca de 200.000 casos e 30.000 mortes anuais. Atualmente não existe nenhuma droga contra esta virose e a vacinação, utilizando o vírus da Febre Amarela atenuado, é a forma mais efetiva de prevenção da doença. Apesar do sucesso desta vacina em todo o mundo, recentemente sua segurança vem sendo contestada devido à ocorrência de efeitos adversos graves, incluindo doença viscerotrópica e morte. Este cenário estimula o desenvolvimento de novas estratégias de vacinação, como vacinas de DNA codificando seqüências virais específicas, que podem conferir maior segurança quando comparadas à vacina convencional.

Um importante entrave em relação às vacinas de DNA, entretanto, é que seus antígenos são sintetizados endogenamente e apresentados ao sistema imune preferencialmente através do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) de classe I, gerando uma resposta imune ineficiente. Para o desenvolvimento de uma resposta imune satisfatória, com componentes humorais e celulares, além de memória imunológica, é crítico que os antígenos codificados pelas vacinas de DNA sejam apresentados aos linfócitos T CD4+ via MHC de classe II. O direcionamento dos antígenos vacinais para apresentação via MHCII é possível através da sua fusão com a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal (LAMP) cujo tráfego intracelular inclui os compartimentos onde ocorrem o processamento e a formação do complexo antígeno-MHCII.

Estudos relacionados ao desenvolvimento de vacinas contra flavivírus estão utilizando como antígenos as proteínas não-estruturais NS1 e NS3, uma vez que NS1 induz uma resposta imune bastante abrangente, conferindo proteção contra o vírus através de resposta celular citotóxica e lise de células infectadas pelo complemento dependente de anticorpo. Já a proteína NS3 é capaz de ativar majoritariamente a resposta celular citotóxica, embora diversos autores também reportem o desenvolvimento de resposta humoral contra esta proteína cujos anticorpos conferem proteção passiva contra a Febre Amarela. Neste trabalho, foram construídas seqüências sintéticas dos genes de NS1 e NS3 através da otimização por algoritmos genéticos e posterior síntese comercial. Estas seqüências otimizadas foram clonadas no vetor de expressão eucariótica p43.2, nas formas fusionadas e não fusionadas a LAMP, as quais foram avaliadas quanto aos níveis de expressão e ao tráfego intracelular, através de ensaios de Western-blot e Imunofluorescência.

Através da estratégia de otimização das seqüências gênicas, visamos obter uma eficiente expressão dos antígenos vacinais selecionados. A apresentação antigênica via MHCII, induzida pela fusão com LAMP, visa aumentar a eficiência dos vetores vacinais quanto à indução de uma resposta imune mais robusta e duradoura. Esta eficiência de indução da resposta imune foi avaliada em ensaios de imunização de camundongos com as construções vacinais produzidas. Em síntese, este estudo visa contribuir significativamente para o desenvolvimento de vacinas de DNA contra a Febre Amarela.

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11.. RReevviissããoo ddaa LLiitteerraattuurraa

1.1. Epidemiologia da Febre Amarela (FA)

A Febre Amarela (FA) é uma doença infecciosa não-contagiosa que se mantém endêmica ou enzoótica nas florestas tropicais da América e da África, causando periodicamente surtos isolados ou epidemias de maior ou menor impacto na saúde pública. Seu agente etiológico é um arbovírus (do inglês arthropod borne virus) protótipo da família Flaviviridae, pertencente ao gênero Flavivirus (WESTAWAY et al., 1985). Esta família apresenta mais de 70 membros, cuja maioria é responsável por doenças humanas, como Dengue, Encefalite Japonesa, Febre do Oeste do Nilo, etc. O Vírus da Febre Amarela (VFA) é transmitido ao homem mediante a picada de insetos hematófagos da família Culicidae, em especial dos gêneros Aedes e Haemagogus (MONATH, 2001; TESH et al., 2001).

Embora a FA seja uma doença antiga, com registros da primeira epidemia em 1648 na Península de Yucatán (STAPLES; MONATH, 2008), esta enfermidade continua sendo um importante problema de saúde pública, afetando mais de 200.000 pessoas em todo o mundo e ocasionando mais de 30.000 mortes anuais (BARRETT, 2007). Como a maioria das doenças transmitidas por mosquitos, a FA tem um impacto desproporcional sobre populações pobres de países em desenvolvimento, sendo a África responsável por mais de 90% dos casos, enquanto na América do Sul estima-se a ocorrência de 160 casos a cada ano (BARRETT, 2007). Além disso, mais de 600 milhões de pessoas vivem em áreas endêmicas para a FA (Figura 1) e o grande número de casos não notificados subestima a verdadeira incidência da doença (TOLLE, 2009).

Figura 1. Distribuição geográfica do vírus da Febre Amarela na África e na América do Sul. A FA é endêmica em ambos os lados do Oceano Atlântico. Nas Américas, encontra-se disseminada desde o norte daColômbia até o sul do Brasil, enquanto a zona enzoótica da África inclui 32 países da região central. Fonte:(BARRETT, 2007)

O VFA mantém-se em dois ciclos básicos de transmissão (Figura 2), um ciclo urbano simples do tipo homem-mosquito, no qual o Aedes aegypti é responsável pela disseminação

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da doença, e outro silvestre complexo, no qual várias espécies de mosquitos responsáveis pela transmissão diferem: na África, mosquitos Aedes e na América os mosquitos Haemagogus e Sabethes. Estes dois ciclos epidemiologicamente distintos são idênticos quanto à etiologia e às características clínicas da doença.

Figura 2. Ciclos de transmissão da Febre Amarela. A FA apresenta dois ciclos de transmissão: o ciclo silvestre e o ciclo urbano. No ciclo silvestre, a doença é transmitida por uma grande variedade de mosquitos, os quais são reservatórios do vírus. A transmissão ocorre primariamente entre macacos, podendo ser transmitida ao homem acidentalmente, quando este adentra às florestas. O homem infectado é o elo entre os ciclos silvestre e urbano, pois uma vez infectado nas matas, pode infectar mosquitos Ae. aegypti nas regiões urbanas. No ciclo urbano, o Ae. aegypti transmite a doença apenas ao homem, que atua como amplificador e disseminador do vírus. Fonte: Adaptado pela autora.

Na FA urbana, geralmente, o homem introduz o vírus numa área urbana e a transmissão é realizada pelo Aedes aegypti, mosquito altamente domesticado. A transmissão é feita diretamente ao homem sem necessitar da presença de hospedeiros amplificadores, pois o homem infectado apresenta altos níveis de viremia nos primeiros 3-5 dias da doença, podendo atuar como amplificador e disseminador do vírus na população. Assim, o ciclo se perpetua, até que se esgotem os susceptíveis ou se realize vacinação em massa da população para bloquear a transmissão (VASCONCELOS, 2000). Cumpre ressaltar que o ciclo urbano ocorre somente na África, pois com a intensa campanha de controle do Ae. aegypti realizada nas Américas no início do século XX, a FA urbana foi eliminada deste continente (BRYAN; MOSS; KAHN, 2004; STAPLES; MONATH, 2008). A última grande epidemia urbana em território brasileiro ocorreu em 1929 no Rio de Janeiro. Já os últimos casos urbanos reconhecidos foram reportados no Estado do Acre em 1942 (FRANCO, 1969). Nas Américas, os últimos casos ocorreram somente 12 anos mais tarde, em Trinidad, em 1954 (MONATH, 1988). Desde então, nenhum caso urbano foi diagnosticado ou oficialmente notificado, a despeito da intensa reinfestação do Ae. aegypti ocorrida na América do Sul (Figura 3) (MONATH, 1997; VASCONCELOS et al., 1999), o que representa um risco potencial para oretorno e disseminação da FA urbana neste continente.

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Figura 3. Distribuição geográfica do mosquito Aedes aegypti nas Américas em 1930, 1970 e 2004. No início do século XX, o mosquito Ae. aegypti encontrava-se disseminado em grande parte da América do Sul, sendo responsável pela alta incidência de FA neste continente. A partir da descoberta do seu papel na transmissão da virose, iniciou-se uma intensa campanha de controle do inseto, provocando sua erradicação em grande parte do território sul-americano (1970) e consequente eliminação dos casos de FA urbana. Porém devido à falta de contiguidade dos programas de controle, o Ae. aegypti voltou a se proliferar, estando atualmente intensamente disseminado pelo continente, o que representa risco potencial do retorno da FA urbana. Fonte: (GLUBER, 2004)

A FA silvestre é bastante complexa e persiste imperfeitamente compreendida, variando de acordo com a região onde ocorre. Este ciclo é zoonótico, transmitido entre hospedeiros primatas por diferentes espécies de mosquitos, sendo sua erradicação praticamente impossível. Os mosquitos além de serem transmissores são os reservatórios do vírus, pois uma vez infectados assim permanecem por toda a vida, além de transmitir o vírus via trasovariana (MARCHOUS; SIMOND, 1905; BEATY; TESH; AITKEN, 1980). Já os macacos atuam tão somente como hospedeiros amplificadores da virose, pois como o homem, ao se infectarem morrem ou curam-se, permanecendo imunes (VASCONCELOS, 2000). Suspeita-se que outros animais, como os marsupiais arboreais e preguiças, possam ter papel secundário no ciclo de manutenção viral, especialmente em áreas onde os macacos estejam ausentes ou já imunes ao vírus (VASCONCELOS, 2003). Neste ciclo, o vírus é transmitido acidentalmente ao homem quando o mesmo adentra as florestas durante atividades ocupacionais ou recreativas.

Na África, várias espécies de mosquitos do gênero Aedes são responsáveis pela transmissão, principalmente Ae. africanus, Ae. furcifer e Ae. simpsoni, os quais mantém altos índices da doença em áreas florestais e de savanas (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1985; ELLIS; BARRETT, 2008). Em áreas secas da África, carrapatos Amblyoma variegatum parecem desempenhar um papel secundário na transmissão desta doença (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1985). Nas Américas, os mosquitos dos gêneros Haemagogus (Haemagogus janthinomys, Haemagogus albomaculatus, Haemagogus leucocelaenus, etc) e Sabethes (Sabethes chloropterus, Sabethes soperi, Sabethes cyaneus,etc) constituem os vetores da FA (DÉGALLIER et al., 1992; VASCONCELOS et al., 2003). O principal transmissor no Brasil e em quase todos os países da América do Sul, no entanto, é o mosquito Haemagogus janthinomys (Figura 4), o qual apresenta maior distribuição geográfica e hábitos estritamente silvestres, picando o indivíduo que se expõe na mata (PINHEIRO; MORAES, 1983). Estes mosquitos são acrodendrófilos (habitam a copa das

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árvores), podendo descer esporadicamente ao solo na presença do homem. Têm atividade diurna e são primatófilos (alimentam-se preferencialmente em macacos, e secundariamente no homem). Embora seja estabelecida uma maior relação entre a FA silvestre e o H. janthinomys,o mosquito H. albomaculatus é considerado potencialmente mais perigoso por apresentar maior autonomia de vôo, o que lhe possibilita aproximar-se de áreas domiciliares (VASCONCELOS, 2003). Estudos ainda apontam para o Psorophora ferox como mais um mosquito potencialmente responsável pela manutenção da doença na América do Sul, sendo sua distribuição estendida por grande parte do território brasileiro (Dr. Renato Pereira de Souza – Comunicação pessoal, XIX Congresso Nacional de Virologia, 2008).

Figura 4. Mosquito Haemagogus janthinomys, principal transmissor da Febre Amarela na América do Sul. Fonte: (FIOCRUZ, 2009)"

Durante o período de 1970-2001, foram notificados 4.543 casos de FA silvestre na América do Sul. O Peru e a Bolívia são os dois países que mais reportaram casos, enquanto o Brasil ocupa o terceiro lugar, com 849 casos notificados no período (ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DE SAÚDE, 2002). A situação brasileira é preocupante, pois embora o número de casos raramente exceda 60 notificações anuais, a letalidade mostrou-se elevada e a tendência tem sido de aumento do número de ocorrências (VASCONCELOS, 2003). Apenas em 2007, 20 casos (50% letalidade) de FA foram confirmados nas áreas silvestres de Goiás, Mato Grosso do Sul e Distrito Federal (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008). Em 2009, ocorreram 22 casos (letalidade 40,9%) apenas no Estado de São Paulo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009a) e 18 casos (letalidade 38,8%) no Estado do Rio Grande do Sul (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009b). O período de maior número de infectados ocorre entre Dezembro e Maio, com pico durante os três primeiros meses do ano, durante a época chuvosa, quando a população de mosquitos é maior. A maioria dos casos se verifica entre adultos de 15 a 40 anos de idade, grande parte sendo homens, devido à maior exposição nas áreas endêmicas por lazer ou tarefas ocupacionais (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).

A FA exerce um grande impacto na saúde pública, pois apresenta um elevado potencial epidêmico e de disseminação além de ocorrência imprevisível. Seu padrão epizoótico-epidêmico emerge sem periodicidade definida, possivelmente, devido à densidade e mobilidade de primatas e de seres humanos virêmicos. Esse padrão ocorre em áreas antrópicas e sua dispersão não é previsível devido às limitações dos sistemas de informação atuais. Entretanto, os “rumores epizoóticos” podem apontar oportunidades para intervenção e prevenção da doença na coletividade. Deve-se ainda considerar o impacto econômico, visto

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que as hospitalizações dos enfermos requerem tratamento intensivo nas UTIs, significando alto custo ao governo. Além disso, o comércio, turismo e relações internacionais podem ser abalados pela ansiedade pública estabelecida em momentos de surtos.

1.2. Histórico da FA no Brasil

Recentes análises genotípicas sugerem que o VFA evoluiu a partir de outros arbovírus há 3.000 anos na África, onde certamente provocou inúmeras mortes (ZANOTTO et al.,1996). Provavelmente, o vírus foi introduzido na América em 1640 por mosquitos Ae. aegyptiinfectados, trazidos em navios negreiros (BRYAN; MOSS; KAHN, 2004). O primeiro caso de FA no Brasil ocorreu em 1685, na cidade de Recife. Desde então, a virose se tornou um grave problema de saúde pública devido ao alto índice de letalidade da doença e ao desconhecimento da sua profilaxia e tratamento. Ademais, as condições sanitárias das cidades brasileiras eram as mais precárias possíveis, permitindo a livre proliferação e disseminação do mosquito transmissor. Desta forma, a FA provocou milhares de mortes e dificultou o desenvolvimento do país, ao afugentar estrangeiros que aqui pretendiam trabalhar ou investir capitais (MINISTÉRIO DA SAÚDE: FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 1999).

A ignorância sobre o modo de transmissão do vírus perdurou por séculos, impedindo o desenvolvimento de campanhas eficientes de controle da doença. Através dos caminhos da navegação marítima e fluvial, o Ae. aegypti se propagou livremente pelo país, levando à ocorrência de epidemias em quase todas as províncias do Império, desde o Amazonas até o Rio Grande do Sul, em meados do século 19. No início do século XX, Carlos Finlay sugeriu que o mosquito Ae. aegypti (na época denominado Culex cubensis) seria o vetor da FA (FINLAY, 1881), teoria posteriormente comprovada pela comissão de Walter Reed (REED; CARROL; AGRAMONTE, 1901). Com o surgimento de novos surtos e baseados na teoria do mosquito vetor, Emílio Ribas inicia em São Paulo (1901) a primeira campanha contra a FA, adotando medidas específicas contra o Ae. aegypti. Em seguida, Oswaldo Cruz é nomeado Diretor-Geral de Saúde Pública e inicia a luta contra a doença, criando o Serviço de Profilaxia da Febre Amarela, o que resulta na eliminação da virose no Rio de Janeiro. Porém, em 1932 é identificada a primeira epidemia de FA silvestre, no Vale do Canaã, Espírito Santo, alarmando os serviços de saúde pública pela transmissão através de mosquitos silvestres. Com o advento da vacina contra a FA, e sua administração a partir de 1937, os surtos da doença foram enfim consideravelmente reduzidos (MINISTÉRIO DA SAÚDE: FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 1999).

Em 1950, a Organização Panamericana da Saúde (OPAS) recomendou aos países membros a erradicação continental do Ae. aegypti, estimulando o governo brasileiro a instituir a Agenda Sanitária Nacional. Seus principais objetivos eram disciplinar a ocupação do espaço urbano para garantir melhores condições sanitárias, além de controlar os indivíduos infectados. Após cinco anos, é eliminado o último foco do Ae. aegypti no território brasileiro e a Agenda é considerada como concluída. Contudo, a reinfestação pelo Ae. aegypti teve início em 1976, a partir de Salvador – BA, ressurgindo o antigo problema para a saúde pública brasileira. A partir de então, a Agenda fora reaberta e atualmente permanece em exercício, pois o mosquito faz-se presente em todos os Estados da Federação, significando risco de reaparecimento da FA urbana em todo o país (Figura 5) (MINISTÉRIO DA SAÚDE: FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 1999; GLUBER, 2004). A freqüente ocorrência de surtos de FA silvestre juntamente com o recente aumento do eco-turismo no Brasil

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potencializa este risco, visto que a infecção de indivíduos que adentram as matas brasileiras e retornam às cidades possibilita a disseminação do VFA para mosquitos Ae. aegypti. Além disso, as campanhas de imunização só ocorrem em áreas de FA silvestre, sendo a grande parte da população brasileira susceptível à infecção viral.

Figura 5. Histórico da Febre Amarela no Brasil. A história da FA no Brasil se inicia em 1685 com duas epidemias, uma na cidade do Recife, e outra no estado da Bahia (que atingiram 25 mil pessoas). Diante do pânico que se instalava no país, o médico João da Rosa implementou a primeira Campanha Sanitária de combate à doença (1691). Entretanto, a FA continuou a espalhar-se, ocasionando surtos nas 16 províncias do Império. Apenas em 1901, o inseto vetor foi descrito, trabalho realizado por uma equipe de militares americanos em Cuba (Comissão Reed). Alguns anos mais tarde (1932), o ciclo silvestre da FA foi comprovado no Vale do Canaã(ES). Com o início do desenvolvimento da vacina contra a FA no Brasil (1937) e os intensos esforços para controlar o inseto vetor, a FA urbana foi eliminada do território nacional em 1942. Em 1950, é aberta a Agenda Sanitária Nacional, cujos objetivos de conter a epidemia e organizar melhor o espaço urbano são eficientes na erradicação do vetor em 1955. Entretanto, em 1976, o Aedes aegypti iniciou o processo de reinfestação do território brasileiro, estando atualmente presente em todos os Estados do país. Fonte: (VIANA, 2009)

A notificação obrigatória dos casos de FA no Brasil é um grande aliado na luta contra a virose, visto que possibilita a análise da evolução da doença, permitindo a implementação de programas de prevenção e controle. As notificações compulsórias da doença tiveram início em 1975, através do Serviço Nacional de Vigilância Epidemiológica (SNVE – Lei N0 6.529). Em 1903, Oswaldo Cruz estabeleceu as “Instruções para o Serviço e Profilaxia de Febre Amarela” e em 1951, a Organização Mundial de Saúde instituiu a notificação imediata (até 24 horas) através do Regulamento Sanitário Internacional, o qual foi retificado em 2005, com a notificação devendo ser feita mediante a aplicação de instrumentos de decisão (Emergências de Saúde Pública de Importância Internacional - ESPII).

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De acordo com a análise da série histórica de incidência de FA silvestre, observou-se um perfil de sazonalidade, com oscilações periódicas e regulares. Ao final das temporadas de chuvas, denota-se um aumento do número de casos em função da maior densidade da população vetorial e da prática do desmatamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE: FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 1999). Uma série temporal, representativa dos casos de FA registrados no Brasil no período de 1982 a 2008, evidencia uma tendência cíclica da ocorrência da doença a cada cinco ou sete anos (Figura 6).

Figura 6. Série histórica de casos de Febre Amarela e taxas de letalidade entre os anos de 1982 e 2008. A FA apresenta uma dinâmica de ocorrência que segue ciclos de 5 a 7 anos. Essa tendência é verificada pelo registro dos maiores números de casos nos anos 1984, 1988, 1993, 2000, 2003 e 2008. Os elevados números de casos são seguidos por taxas de letalidade de até 100%. Fonte: SINAN/SVS/MS

No início do século XX, todo o território brasileiro era endêmico para a doença, dada a ampla distribuição vetorial. Com o advento da vacina e o combate ao vetor, a modalidade urbana da doença foi erradicada e hoje são apenas detectados os casos da forma silvestre. Assim sendo, foi criado um mapa representativo das áreas de risco no Brasil, dividindo-o em quatro partes: área enzoótica ou endêmica, área epizoótica ou de transição, área de risco potencial e área indene (Figura 7). Interessante é notar que a doença faz-se presente muito além dos limites da Amazônia, desmistificando a freqüente associação entre a arbovirose e as regiões de matas (Figura 8) (VASCONCELOS, 2003).

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Figura 7: Áreas de risco para FAmarela, conforme estabelecido pcirculação do vírus, os municípios fcircula entre os hospedeiros naturatransição (onde há transmissão inesporádico de casos na população hmomento, mas apresenta vulnerabilde transição e contigüidade geográamarílico). Fonte: (MINISTÉRIO D

Figura 8: Distribuição dos casos dnúmeros de casos e óbitos de algunsapresentaram a maior ocorrência daFonte: SINAN/SVS/MS – Dados at

Febre Amarela silvestre. Áreas segundo classificaçãpelo Ministério da Saúde em 2003. De acordo coforam distribuídos em 4 áreas: 1. Área enzoótica ou eais, e o homem é infectado de forma acidental); 2. ntensa do vírus entre os hospedeiros naturais, ocashumana); 3. Área de risco potencial (não apresenta cilidade para esta circulação, por exibir características fica com ecótopo semelhante); 4. Área indene (não

DA SAÚDE, 2008)

de Febre Amarela silvestre no Brasil de 1999 a 200s Estados do país. Em destaque as regiões de Goiás e a doença, embora estejam localizados fora da região té a Semana 45 do ano de 2008.

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ão de risco para Febre om a probabilidade de endêmica (onde o vírusÁrea epizoótica ou de

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A dinâmica de transmpara a doença no Brasil. A redde casos da doença, assim comdisso, é importante observar cnotificação de casos da doençvírus (corredores ecológicos, primatas não-humanos e vetVigilância em Saúde já estabeonde a vacina é recomendada

Figura 9: Mapa das áreas com recrisco para a FA no Brasil requereepizootias em primatas. Com base divisão em áreas com e sem recomeconsideradas áreas sentinela, ou sejonde foi relatado apenas um caso dáreas, apesar de serem receptivas paSECRETARIA DE VIGILÂNCIA E

1.3. Patogenia e quadro c

1.3.1. Patogenia

Os aspectos patogêniinformações acumuladas decamundongos e achados histinfecção desencadeia encefali

missão do vírus exige reavaliações periódicasdefinição das áreas de risco deve se basear n

mo nas epizootias confirmadas em primatas nom rigor as regiões de contigüidade geográfiça e aquelas áreas consideradas receptivas preserva ecológica ou de proteção ambienta

tores silvestres). Considerando tais critérioeleceu novo mapa dividindo o país em apenase outra onde não há esta recomendação (Figu

comendação de vacina contra Febre Amarela no Brem avaliações periódicas, baseadas na ocorrência d

nesses critérios, o SUS substituiu a divisão do paísendação da vacina. As regiões fora dos limites dessas a, antigas áreas de risco potencial contíguas às de rec

de FA em primata não-humano, sem outro achado deara a circulação do VFA, são áreas sem recomendaçãEM SAÚDE/MS

clínico da FA

icos da infecção pelo VFA são conheciderivam de estudos em primatas não-hutopatológicos em casos humanos fatais. Emite fatal (neurotropismo), enquanto no home

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das zonas de risco no histórico recente não-humanos. Além ca, aquelas onde há ara a circulação do

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infecções experimentais de macacos, o vírus apresenta viscerotropismo, tendo como órgão alvo o fígado (VASCONCELOS, 2003).

Na espécie humana, após a introdução do vírus amarílico na circulação pela picada do mosquito transmissor, o vírus atinge rapidamente os linfonodos regionais, realizando o ciclo replicativo. Posteriormente, com a liberação das partículas virais, estas são levadas pelos vasos linfáticos até a corrente sanguínea, iniciando o período de viremia e infectando outros tecidos (fígado, baço, rins, músculo cardíaco e esquelético e sistema nervoso central). Os tecidos linfóides sofrem profundas modificações durante a infecção pelo VFA, caracterizadas pelo aparecimento de grandes células mononucleares e histiócitos, distensão dos folículos e necrose dos centros germinativos de linfócitos B. Presume-se que a ativação de células nestes tecidos contribua para as implicações sistêmicas da FA terminal, caracterizada pela liberação de citocinas pró-inflamatórias (MONATH, 2008).

O fígado é o órgão mais afetado pela FA. As modificações patológicas incluem degenerações eosinofílicas dos hepatócitos e células de Kupffer, além de degeneração gordurosa (esteatose), mais especificamente nas áreas médio-zonais, decorrentes do intenso processo de apoptose desencadeado pela infecção (LEFEUVRE et al., 2006; QUARESMA et al., 2006). A infiltração de células inflamatórias é mínima e compreendida por células de Kupffer, células natural killers, células dendríticas, linfócitos T CD4+ e CD8+, dentre outras (QUARESMA et al., 2006; QUARESMA et al., 2007), acompanhadas pela liberação de citocinas, incluindo TNF-!, interferon-" e TGF-# (MONATH, 2008). A degeneração mais característica e dita como indicativa de FA, ainda que não patognomônica, é a degeneração hialina, acidófila dos hepatócitos, conhecida como corpúsculo de Councilman-Rocha Lima. Mais raramente, encontram-se os corpúsculos de Torres e Villela (em hepatócitos, células de Kupffer e macrófagos) (VASCONCELOS, 2003).

Os eventos terminais são caracterizados clinicamente por choque cardiovascular e falência múltipla dos órgãos. As características desta fase sugerem fortemente a mediação por uma cascata inflamatória. Em uma análise de doenças fatais e não-fatais, naturalmente adquiridas, citocinas pró- e antiinflamatórias (IL-6, IL-8, TNF-!, antagonista do receptor IL-1, IL-10) foram significativamente elevadas nos casos fatais (TER MEULEN et al., 2004). Uma importante característica da FA é a intensa leucocitose granulocítica observada nos estágios terminais da doença. Dados os elevados níveis séricos de IL-8 e TNF-!, parece que estes granulócitos são ativados, com conseqüente liberação do Fator de Ativação Plaquetário (PAF), elastase e outras proteases, além de leucotrienos, que podem modificar a integridade endotelial, principalmente na presença de citocinas pró-inflamatórias, causando danos capilares e hemorragias (TAKAHASHI et al., 2007). Várias observações em modelos animais e pacientes humanos sugerem que a resposta imune adaptativa também contribui na patogênese da FA, através do clearance por anticorpos (morte celular dependente de complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo) e linfócitos T citotóxicos (MONATH, 2008).

1.3.2. Quadro clínico

A resposta à infecção amarílica revela-se ampla e variável. A FA pode ser definida como uma doença infecciosa viral aguda de curta duração cuja gravidade varia, podendo ocorrer sob formas oligossintomáticas, até formas fulminantes, em que os sintomas clássicos

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de icterícia, albuminúria e hemorragias estão presentes. Mas também causa infecções assintomáticas ou sub-clínicas que, junto com as formas leves da doença, somente são diagnosticadas por exames laboratoriais específicos. Portanto, o conceito de que a FA constitui doença invariavelmente fatal não se justifica. Estima-se que pelo menos 90% dos casos de FA com expressão clínica sejam das formas classificadas como leve e oligossintomática, raramente diagnosticadas, e que somente 10% sejam das formas graves associadas com elevada letalidade (MONATH, 2005).

A sintomatologia observada nas formas leve e moderada revela-se extremamente ampla e confunde-se com a encontrada em outras doenças infecciosas comuns. Em geral, os sintomas da forma leve restringem-se à febrícula ou febre moderada de início súbito que pode ou não vir acompanhada de cefaléia discreta, astenia ou indisposição passageira e tontura. Esse quadro evolui por algumas horas até dois dias, findos os quais o paciente se recupera inteiramente sem seqüelas. Esta forma clínica acomete principalmente crianças de baixa idade que adquiriram anticorpos maternos, do tipo IgG, contra VFA. Na forma moderada, que acomete indivíduos com imunidade para outros Flavivirus (imunidade cruzada), o paciente refere início súbito com febre e cefaléia. Além desses sintomas, ele pode apresentar náuseas com ou sem vômitos, mialgias e artralgias. Nesta forma, pelo menos um dos sintomas clássicos da doença costuma acompanhar o curso clínico, como epistaxe, ligeira albuminúria e subicterícia. Às vezes, observa-se o sinal de Faget (ocorrência de bradicardia acompanhando a febre elevada) e o período de estado revela-se mais longo, durando em média de dois a três dias, com recuperação completa e sem seqüelas.

Na forma grave, o quadro clínico inicia-se abruptamente, com febre elevada e cefaléia intensa. Nesta forma, o sinal de Faget torna-se evidente, acompanhado de náuseas, vômitos, icterícia franca, albuminúria persistente e por vezes acompanhada de oligúria. Descrevem-se hemorragias, especialmente hematêmese e sangramento uterino. Esta forma cursa por até sete dias, usualmente por cinco, acometendo preferencialmente agricultores, pescadores, caçadores, lenhadores, turistas e outros susceptíveis com imunidade cruzada para Flavivirus.Já na forma clássica (maligna), que acomete indivíduos não-imunes, a FA caracteriza-se pelo início abrupto, com febre elevada, cefaléia intensa, dores musculares generalizadas, náuseas, vômitos, astenia, anorexia, prostração e tontura, o que corresponde à fase de viremia da enfermidade, que evolui de dois a três dias. Em seguida, pode haver um período de remissão dos sintomas por cerca de 24 horas, após o qual segue-se o período de intoxicação, em que o vírus deixa de circular no sangue sendo encontrado principalmente no fígado e baço, mas também no coração, linfonodos e outros órgãos. Neste período, o paciente apresenta hemorragias do tegumento, gengivas, ouvido e trato gastrointestinal, além de intensa icterícia. Após uma semana, instala-se insuficiência renal que pode chegar à anúria, com óbitos mais frequentes neste período. Outros pacientes morrem devido à falência hepato-renal, ou em decorrência de hemorragias incontroláveis. Os sobreviventes se recuperam de forma lenta, mas completamente e sem sequelas (MONATH, 2005).

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1.4. Diagnóstico e tratamento da FA

1.4.1. Diagnóstico

O diagnóstico definitivo da FA pode ser feito através de exames histopatológicos, métodos sorológicos, isolamento viral, identificação de antígenos virais e do RNA viral. Em biópsias de fígado, são analisadas as necroses coagulativas nas áreas médio-zonais, com comprometimento dos hepatócitos periportais e inflamação mínima (BROOM et al., 2004). O diagnóstico sorológico pode ser obtido pela demonstração de IgM específica através do Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) durante a fase aguda da doença, ou por técnicas padrão que demonstrem o aumento no título de IgM entre amostras da fase aguda e convalescente. Títulos de anticorpos aumentados quatro vezes ou mais na amostra convalescente em comparação aos títulos da amostra da fase aguda, indicam infecção recente pelo vírus amarílico (BROOM et al., 2004).

Como técnica virológica, pode ser realizado o isolamento viral em cultura de tecidos, identificando o vírus em testes de imunofluorescência indireta ou mediante testes de fixação do complemento (VASCONCELOS, 2003). Porém, atualmente a identificação viral tem contado com técnicas de PCR específicas para o VFA. Ademais, ensaios de transcrição reversa multiplex (RT-PCR) têm sido desenvolvidos para utilização laboratorial, a fim de se diagnosticar e diferenciar diversos flavivírus, (incluindo VFA, vírus da Encefalite Japonesa, vírus da Febre do Nilo, encefalite de St. Louis e os quatro sorotipos do Dengue) (CHAO; DAVIS; CHANG, 2007).

Novos métodos de diagnóstico molecular estão sob investigação, incluindo o uso de espectrometria de massa no desenvolvimento de uma plataforma universal para identificação e genotipagem dos flavivírus (JACKSON et al., 2008). Este método está sendo investigado para uso com espectrômetros de massa em miniatura, em desenvolvimento, que poderiam permitir a sua utilização em áreas rurais e remotas, promovendo respostas rápidas a surtos de aparentes flaviviroses (JACKSON et al., 2008). Recentemente, o nosso grupo de pesquisa emassociação com o “Instituto Nacional de Inovação em Diagnósticos para a Saúde Pública” (INDI-Saúde), coordenado pelo Dr. Samuel Goldenberg (Pesquisador Titular do Instituto Carlos Chagas- ICC/FIOCRUZ, Pesquisador 1-A CNPq), vem desenvolvendo kits de diagnóstico viral baseados na detecção de anticorpos específicos através de uma plataforma de microarranjos líquido (Luminex), utilizando antígenos sintéticos do VFA. O objetivo do INDI-Saúde é a nacionalização de insumos e sistemas de diagnóstico, reduzindo a dependência brasileira na área de desenvolvimento tecnológico.

1.4.2. Tratamento

Atualmente, não existem drogas antivirais para o tratamento da FA, sendo o tratamento medicamentoso apenas voltado à amenização dos sintomas e sinais manifestos da doença. Numerosos estudos têm sido conduzidos com a finalidade de explorar diferentes abordagens de tratamentos antivirais. Uma abordagem bastante promissora é a seleção de compostos químicos que interrompam a replicação viral, agindo como inibidores de enzimas

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virais específicas (MILANI et al., 2009). Recentemente, o Instituto Novartis para Doenças Tropicais iniciou um abrangente programa para identificar compostos que inibam a replicação dos quatro sorotipos do vírus da Dengue, focando nos conhecimentos estabelecidos sobre as enzimas virais. Como estas enzimas são altamente conservadas entre os flavivirus, é possível que os compostos com atividade contra o vírus da Dengue possam ser ativos contra o VFA (KELLER; CHEN; KNOX, 2006). Outra abordagem interessante na terapia antiviral é a inibição de vias específicas do hospedeiro que são críticas para a replicação do vírus. Esta vertente é baseada na premissa de que enzimas do hospedeiro, particularmente as quinases, são usurpadas pelos vírus em diversos passos da entrada e replicação viral. Como estas enzimas são redundantes, pode ser possível a inibição de vias críticas para a replicação viral sem induzir toxicidade (CHU; YANG, 2007).

Há também estratégias que almejam a modulação da resposta imune do hospedeiro, como o uso de imunomoduladores e Interferon-! assim como corticosteróides, cujos ensaios preliminares em modelos animais demonstraram supressão da viremia e diminuição da mortalidade (MONATH, 2008). O uso de anticorpos monoclonais neutralizantes, em imunoterapias passivas, está sendo avaliado quanto à sua aplicabilidade e ao potencial desenvolvimento de imunopatologias (MONATH, 2008). Como droga específica, experimentou-se a ribavirina, um nucleosídeo purínico que apresenta amplo espectro de atividade contra viroses de RNA e DNA. Embora ensaios em hamsters demonstrem alta eficiência desta droga no tratamento de FA, com redução de viremia e mortalidade, os ensaios iniciais em primatas não-humanos não têm se mostrado promissores. Além de requerer altas doses e causar anemia hemolítica como efeito colateral, a ribavirina não é transportada eficientemente para o Sistema Nervoso Central, não impedindo o desenvolvimento de encefalites pelo VFA (MONATH, 2008). Mais recentemente, foi avaliado o efeito inibidor de óleos essenciais obtidos das plantas Lippia alba, Lippia origanoides, Origanum vulgare e Artemisia vulgaris crescidas na Colômbia, sobre a infecção de células humanas in vitro.Nestes ensaios, os óleos essenciais reduziram a infectividade do VFA através da inativação direta do vírus, prevenindo a adsorção e subseqüente infecção celular. Mais estudos devem ser conduzidos a fim de explorar a atividade antiviral de cada composto presente nos óleos essenciais, além de determinar se o sinergismo entre eles é responsável por esta atividade (MENESES et al., 2009).

1.5. Prevenção da FA

Devido à inexistência de drogas para o tratamento da FA, faz-se necessária a utilização de métodos preventivos eficazes contra a disseminação da mesma. Dentre estes métodos, existem o controle do inseto vetor, medidas de proteção individual e vacinação, sendo esta última a estratégia que apresenta maior sucesso até o momento. O controle do inseto vetor é difícil, devido ao envolvimento de diversos mosquitos, sendo o combate aos vetores silvestres praticamente inviável. Já o combate ao vetor urbano, o Ae. aegypti, tem sido tentado desde o início do século passado com sucessos e fracassos. Hoje, com a complexidade das áreas urbanas, elevada concentração populacional e aumento da pobreza, bem como o agravamento do problema com o lixo urbano e a deficiência no fornecimento de água, o efetivo controle do Ae. aegypti é bastante difícil (GOULD; SOLOMON, 2008).

Tabachnick e colaboradores (TABACHNICK et al., 1982) sugeriram que como as populações de Ae. aegypti diferem em parâmetros de competência vetorial, seria possível

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concentrar as prioridades de controle em populações mais perigosas, e que “tentativas deveriam ser feitas para substituir as populações de Ae. aegypti altamente competentes por outras naturalmente menos competentes”. Com o desenvolvimento de novas técnicas moleculares e genéticas, cientistas poderiam eventualmente substituir as populações de mosquito competentes por mosquitos cuja competência tenha sido geneticamente manipulada em laboratório (HIGGS et al., 1998). Porém a implementação desta estratégia está distante de ocorrer. Muitas questões devem ser resolvidas, incluindo mecanismos que assegurem a manutenção dos transgenes, mecanismos que facilitem a substituição das populações e a estabilidade genética (JAMES, 2005) e é claro, as questões éticas pertinentes à liberação de vetores geneticamente alterados no ambiente. As medidas de proteção individual, como o uso de mosquiteiros e repelentes, carecem de importância pública, restando a vacinação como única estratégia realmente eficiente de prevenção da FA.

1.5.1. Vacina contra FA

Em 1930, duas vacinas de vírus atenuado da FA foram desenvolvidas através de passagens seriadas do VFA selvagem, derivado de infecções humanas, em linhagens de tecido: a Vacina Neurotrópica Francesa (VNF), obtida a partir de passagens em cérebro de camundongo, e a vacina 17D, cujas passagens foram realizadas em tecido embrionário de galinha (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1993). A VNF foi administrada para aproximadamente 40 milhões de pessoas no Oeste da África, entre 1939 e 1952, o que resultou na diminuição da incidência da FA nesta região (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1993). Entretanto, observou-se que a VNF estava associada a muitos casos de encefalite em crianças, levando à descontinuidade da sua produção em 1980 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1993).

A vacina 17D, por sua vez, está sendo usada desde seu desenvolvimento (1936) e mais de 400 milhões de doses já foram administradas (MONATH, 2007). A linhagem original desta vacina foi desenvolvida após 176 passagens da linhagem selvagem, Asibi, em tecidos de camundongo e galinha. Esta linhagem originou duas sublinhagens que são utilizadas como vacina atualmente, a 17D-204 e a 17DD (passagens 235-240 e 287-289, respectivamente). Com a conclusão dos genomas das linhagens vacinais e da linhagem Asibi selvagem, observou-se que as duas seqüências vacinais compartilham 99,9% de homologia (MONATH, 2004) e que ambas diferem do vírus selvagem em 48 nucleotídeos que codificam 20 substituições de aminoácidos (BARRETT; TEUWEN, 2009). A vacina 17D-204 é produzida nos Estados Unidos, Europa e Austrália, sendo utilizada nestes países e na Nova Zelândia. A vacina 17DD é produzida no Brasil, na FIOCRUZ do Rio de Janeiro, e utilizada em toda América do Sul (MARFIN et al., 2005).

A vacina da FA induz uma resposta imune rápida e específica e embora as Normas de Saúde Internacionais (IHR – International Health Regulations) publicadas pela Organização Mundial de Saúde requeiram revacinação a cada 10 anos (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2010), diversos estudos têm demonstrado a manutenção de anticorpos neutralizantes em pessoas imunizadas por períodos mais longos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1993). Até 2001, acreditava-se que a vacina da FA fosse extremamente segura, sendo amplamente utilizada, mas esta visão foi alterada pelo reconhecimento da doença viscerotrópica associada à vacinação, uma infecção extensa dos órgãos vitais pelo vírus atenuado que é indistinguível da FA causada pelo vírus selvagem,

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ocasionando o óbito de 60% dos indivíduos que desenvolvem a doença. Fatores genéticos do hospedeiro (possivelmente genes envolvidos na resposta por interferon) e fatores adquiridos (idade avançada e timectomia) parecem ser os responsáveis pela susceptibilidade a esta condição (MONATH, 2007). Estima-se que o risco de se desenvolver doença visceral após vacinação é de 0.4 a cada 100.000 doses administradas, sendo o risco aumentado para 1.8 por 100.000 doses para indivíduos com mais de 60 anos (LINDSEY et al., 2008). Desta forma, atualmente as vacinas 17D e 17DD são consideradas as menos seguras dentre as vacinas em uso. Ademais, efeitos adversos neurotrópicos (principalmente encefalites causadas pela invasão do vírus vacinal no cérebro) apresentam uma incidência mais elevada (0.8 por 100.000 doses), porém com uma taxa de mortalidade bem mais baixa (aproximadamente 6%) (MONATH, 2007).

O primeiro caso de doença viscerotrópica foi reportado pela literatura em 2001, e inicialmente foi considerado um fenômeno recente, até que Engel e colaboradores (ENGEL et al., 2006) reportaram um caso ocorrido com uma mulher brasileira, vacinada em 1975. Após 12 notificações apenas em 2001, mais 39 casos foram identificados em todo o mundo até maio de 2009, totalizando 51 casos até então (HAYES, 2007; LINDSEY et al., 2008). Os casos mais recentes são de um grupo de cinco pacientes com doença viscerotrópica, que resultaram em quatro mortes, durante uma campanha de vacinação em massa no Peru (WHITTEMBURY et al., 2009). Além dos efeitos mais graves, a vacinação está comumente associada a eventos mais amenos e limitados, como febre, dor, prurido, dor de cabeça, eritema no local de injeção, urticária e brotoeja, podendo também acarretar reações anafiláticas em pessoas que apresentem alergia aos constituintes da vacina, como a proteínas do ovo (LINDSEY et al., 2008).

A indicação da necessidade de vacinação é uma tarefa difícil, dado que a incidência de FA reportada entre viajantes não-vacinados é mais baixa que a incidência dos efeitos adversos graves. O risco de um viajante adquirir FA depende de vários fatores incluindo destino, estação, local de atividade do vírus e atividades ocupacionais e recreativas durante a viagem. O risco de FA em um turista não-vacinado em áreas endêmicas do Oeste da África durante a estação de maior risco tem sido estimado em 50 por 100.000, numa estadia de duas semanas, risco 10 vezes superior ao da América do Sul (5 por 100.000) (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2010). Desta forma, para qualquer turista, o risco de desenvolver eventos adversos severos após a vacinação deve ser comparado ao risco de se adquirir FA. A vacinação deve ser limitada aos turistas com itinerários que apresentem um risco de Febre Amarela razoavelmente superior ao risco de efeitos adversos severos devido à vacinação, ou quando a vacinação é requerida para prevenir a introdução de FA em um país. Os turistas com mais de 60 anos devem discutir com seus médicos os riscos e benefícios da vacinação, no contexto do risco específico do seu destino para exposição à FA.

A vacina de vírus atenuado também apresenta algumas desvantagens referentes ao seu modo de produção e a contra-indicações, o que limita ainda mais sua utilização. Primeiramente, esta vacina é produzida em ovos embrionados de galinha, utilizando uma metodologia pouco alterada nos últimos 60 anos. Como tal, esta tecnologia limita a capacidade de produzir grandes quantidades de vacina em um curto espaço de tempo, dificultando a resposta imediata a surtos (BARRETT, 2007). Além disso, deve ser armazenada entre 2-9ºC, o que dificulta seu transporte e estocagem (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2002). As vacinas contra FA não são recomendadas para crianças menores de 9 meses, devido ao risco elevado de encefalite. Também são contra-indicadas para indivíduos com qualquer histórico de hipersensibilidade aos constituintes da vacina (especialmente a gelatina e a proteínas do ovo), indivíduos com

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condições imunossupressoras, incluindo infecções por HIV sintomáticas, doenças no timo, timectomia ou aqueles fazendo uso de terapia imunossupressora (por exemplo, corticosteróides, agentes alcalinos e antimetabólitos) ou radioterapia. Deve-se evitar vacinação em mulheres grávidas e que estejam amamentando e em idosos acima de 60 anos de idade (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2010).

Hoje, em decorrência das limitações da vacina de vírus atenuado, existem dúvidas quanto ao uso da mesma em programas de vacinação em massa. Caso houvesse uma vacina mais segura e de menor custo, seria possível a implementação de um programa de imunização expandido em países onde a FA é endêmica, o que possibilitaria a erradicação da doença (GOULD; SOLOMON, 2008). Diante deste cenário, o desenvolvimento de novas estratégias de vacinação, baseadas no conhecimento gerado sobre a biologia viral e em técnicas de DNA recombinante, como vacinas de DNA codificando seqüências virais específicas (SCHULTZ; DOLLENMAIER; MOLLING, 2000), é de fundamental importância e urgência.

1.6. O Vírus da Febre Amarela (VFA)

1.6.1. Características gerais

O Vírus da Febre Amarela (VFA) é membro da família Flaviviridae (do latim flavus = amarelo), a qual engloba três gêneros: flavivírus, pestevírus (do latim pestis = praga) e hepacivírus (do grego hepar = hepatos) (WESTAWAY et al., 1985). O gênero Flavivírus é constituído por mais de 70 vírus, dos quais grande parte são patógenos transmitidos aos hospedeiros vertebrados através da picada de mosquitos ou carrapatos infectados. Também fazem parte deste gênero os vírus reemergentes causadores da Encefalite Japonesa, da Febre do Oeste do Nilo e da Dengue (GLUBER; MELTZER, 1999; ROTHMAN; ENNIS, 1999).

De acordo com análises filogenéticas das diferentes linhagens de VFA encontradas na África e na América do Sul, acredita-se que o vírus tenha surgido nas regiões Leste e Central da África, disseminando-se para o Oeste africano, a partir do qual foi transportado para a América do Sul (Figura 10) (BARRETT, 2007). A utilização de técnicas moleculares revelou variações genéticas entre as linhagens de VFA associadas a diferentes regiões geográficas. Tais estudos identificaram 7 genótipos, baseados numa variação nucleotídica $9%, dos quais 5 circulam na África, cada genótipo circulando em diferentes regiões geográficas deste continente (CHANG et al., 1995; WANG et al., 1996; MUTEBI et al., 2001). Entre os dois genótipos identificados na América do Sul, o mais disseminado é o genótipo I, encontrado no Brasil, Panamá, Colômbia, Equador, Venezuela e Trinidad, enquanto o genótipo II é predominantemente encontrado no Peru, com alguns isolados no Brasil e Trinidad (BRYANT; BARRETT, 2003). Todos os genótipos constituem apenas um sorotipo e são capazes de rápida amplificação, de ocasionar surtos epidêmicos, de induzir infecções altamente letais em humanos e são dotados da capacidade de passar do ciclo silvestre para o urbano, por intermédio do vetor Aedes aegypti.

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Figura 10. Árvore filogenética rseqüências nucleotídicas da regiãoregiões Central e Leste apresentam vírus nestas regiões, com posterior Sul são filogeneticamente mais próxdesta região para as Américas. Font

O VFA é um pequencentro eletricamente denso colipídica (Figuras 11 e 12). Osimples de polaridade positivauma estrutura Cap 5’ e uma contém uma única Open Read

representando as linhagens dos sete genótipos do gênica prM/E. O VFA é mais heterogêneo geneticamais divergência genética que a região Oeste, o que disseminação para a região Oeste. Além disso, as lin

ximas das linhagens do Oeste africano, sugerindo a mite: (BARRETT, 2007)

o vírus icosaédrico, com 40-60nm de diâmom cerca de 30nm de diâmetro circundado

O genoma do VFA é organizado numa mola, com 10.862 nucleotídeos (nt) de comprime

alça não-poliadenilada 3’ (LINDENBACHding Frame - ORF (PUGACHEV et al., 20

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do VFA, baseada nas amente na África, cujas indica o surgimento do

nhagens da América do igração do vírus a partir

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H, 2003). Seu RNA 004) flanqueada por

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duas regiões não-codificantes (Untranslated Region – UTR) a 3’ e 5’, com cerca de 100 e 400-700 nt, respectivamente. As UTRs contêm seqüências conservadas que direcionam os processos de amplificação genômica, tradução e empacotamento viral (PROUTSKI et al.,1997).

Figura 11. Representação do Vírus da Febre Amarela. O envelope viral é composto pela associação das proteínas M e E, as quais envolvem o nucleocapsídeo. Este é formado pela proteína C interagindo com RNAgenômico. Fonte: (VIANA, 2009)

Figura 12. Eletromicrografia do Vírus da Febre Amarela. O vírus apresenta uma simetria icosaédrica, característica comum aos membros da famíla Flaviviridae. Fonte: (SLAvirusportfolio, 2009)

A sua única ORF codifica uma poliproteína que é processada em 10 unidades protéicas, através da clivagem mediada por proteases virais e celulares, como a signalase celular. Dentre as proteínas virais maduras, 3 são proteínas estruturais (Capsídeo – C, Membrana – M e Envelope – E) e 7 são proteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (Figura 13). As proteínas estruturais constituem a partícula viral, enquanto as proteínas não-estruturais são responsáveis pelas atividades reguladoras e de expressão do vírus incluindo replicação, virulência e patogenicidade, sendo encontradas apenas nas células infectadas (CHAMBERS et al, 1990). As propriedades físico-químicas e funções biológicas de cada proteína do VFA encontram-se resumidos na Tabela 1.

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Figura 13. Organização da ORF do Vírus da Febre Amarela. A única ORF do VFA codifica as 10 proteínas virais organizadas in frame, que são traduzidas monocistronicamente como uma única poliproteína. A maturação das proteínas ocorre co- e pós-traducionalmente através da ação de proteases virais (complexo NS2B/NS3 – setas verdes) e da célula hospedeira (signalases – setas azuis), gerando as proteínas estruturais (C, M e E) e as proteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A e NS4B, NS5). Fonte: (VIANA, 2009)

Tabela 1. Proteínas do vírus da Febre Amarela e suas possíveis funções

Proteína Descrição da proteína Possíveis funções C Proteína do nucleocapsídeo viral. Formação do precursor do nucleocapsídeo;

ligação do RNA; medeia a translocação da poliproteína para o lúmen do retículo endoplasmático; induz formação de anticorpos protetores (neutralizantes).

prM Proteína transmembrana viral associada à célula de origem; precursor da proteína M.

Morfogênese viral; maturação da proteína M.

M Proteína de membrana de partículas virais maduras.

Componente associado à ligação e introdução do vírus na célula.

E Maior proteína do envelope. Muito conservada. É o antígeno inibidor da hemaglutinação.

Montagem viral; receptor de ligação; fusão com membrana celular; maior antígeno viral (aglutinina); induz formação de anticorpos inibidores de hemaglutinação; induz formação de anticorpos protetores (neutralizantes).

NS1 Associada à membrana e secretada. Forma dímeros. Corresponde ao antígeno fixador do complemento.

Replicação do genoma viral; maturação da partícula viral; participa na indução de anticorpos protetores.

NS2A Hidrofóbica. Pouco conservada. Provavelmente associada à maturação de NS1.

NS2B Hidrofóbica. Pouco conservada. Componente da protease/replicase; forma componentes do capsídeo durante a replicação viral.

NS3 Altamente conservada. Multifuncional; processa a poliproteína; participa da replicação do RNA; helicase.

NS4A Hidrofóbica. Pouco conservada. Componente da replicase; associada à membrana.

NS4B Hidrofóbica. Pouco conservada. Componente da replicase; associada à membrana.

NS5 Altamente conservada. Polimerase viral; metiltransferase (formação do Cap 5’); associada ao RNA viral; participa da replicação viral.

Fonte: Adaptado de (VASCONCELOS et al., 2003)

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1.6.2. Ciclo replicativo

O processo de replicação do VFA se dá após a fusão do seu envelope com a membrana celular, mediada pela maquinaria de fusão mais rápida e mais eficaz dentre todos os vírus envelopados estudados até o presente momento (STIASNY; HEINZ, 2006). A entrada do vírus na célula tem início com a interação da proteína E, do envelope viral, com receptores específicos na superfície celular. Esta interação promove a internalização da partícula viral através de endocitose, formando compartimentos endocíticos pré-lisossomais, onde o pH ácido induz a dissociação dos dímeros de proteína E em monômeros, os quais se reassociam em trímeros. Esta conformação expõe um peptídeo da proteína E que medeia a fusão entre as membranas viral e do endossoma, permitindo a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma. Devido à natureza fluida do nucleocapsídeo, o genoma viral é rapidamente acessado para tradução.

A tradução ocorre de maneira cap-dependente e inicia-se por escaneamento do ribossomo até o primeiro AUG, gerando a poliproteína. Na região carboxi-terminal do capsídeo, encontra-se um peptídeo sinal que direciona a translocação co-traducional da poliproteína pra o lúmen do Retículo Endoplasmático Rugoso (RER), onde ocorre a clivagem da mesma e glicosilação protéica. Ao final da maturação, as proteínas estruturais permanecem associadas à membrana do RER, com o capsídeo no lado citoplasmático e a prM-E no lado luminal. As proteínas prM-E permanecem associadas como heterodímeros e ligam-se à membrana reticular através de âncoras trans-membrana. As demais proteínas não-estruturais inciam a replicação do RNA viral. Neste processo, o RNA de polaridade positiva é transcrito em um RNA de polaridade negativa, o qual serve de molde para a síntese de várias moléculas de polaridade positiva. As novas fitas de RNA interagem com proteínas do capsídeo, retidas no RER, formando novos nucleocapsídeos, que internalizam-se no RER, dando origem aos vírions imaturos não-infecciosos.

Estes vírions imaturos são transportados para o complexo de Golgi, onde o baixo pH induz mudanças conformacionais irreversíveis no heterodímero prM-E, o que expõe um sítio de clivagem da protease furina na proteína prM. Com a formação da proteína M madura, ocorre um rearranjo das proteínas E, que então formam os dímeros das partículas virais maduras e infecciosas. Esta clivagem tardia da proteína prM é importante pois a proteína prM previne a exposição do peptídeo de fusão da proteína E, evitando a fusão precoce do vírion com a membrana do complexo de Golgi. Após sua maturação, o vírus infeccioso é secretado da célula através da exocitose (Figura 14) (STIASNY; HEINZ, 2006).

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Figura 14. Representação esquemática do ciclo de vida do vírus da Febre Amarela. (A) Ligação do vírus à célula hospedeira através da interação entre a proteína E e receptores celulares de superfície. (B) Após a ligação, o vírus é endocitado. (C) A acidez da vesícula endossômica induz a mudança conformacional da proteína E, que passa da forma dimérica para a forma trimérica. (D) Com a mudança de conformação da proteína E ocorre afusão das membranas do vírus e do endossomo, e o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma. Em seguida, onucleocapsídeo é aberto e o RNA viral é liberado. (E-G) O RNA viral inicia a sua tradução no citoplasma até a síntese da região carboxi-terminal do capsídeo. Após a síntese deste peptídeo sinal, o RNA é direcionado para o retículo endoplasmático rugoso (RER), onde o restante da poliproteína é sintetizada. (H) A replicação do RNA viral começa em membranas próximas ao núcleo. O RNA de polaridade positiva é transcrito em um RNA intermediário de polaridade negativa (fita em vermelho) o qual atua como molde para produção de múltiplas moléculas de RNA de polaridade positiva. (I-L) O novo RNA viral interage com proteínas do capsídeo, retidas na membrana do RER, para formar novos nucleocapsídeos. O nucleocapsídeo é envelopado nesta membrana, que também contêm proteínas E e prM imobilizadas, e forma um vírus imaturo dentro de vesículas citoplasmáticas. (M-O) As proteínas E e prM sofrem rearranjos, permitindo a saída do vírus imaturo do RER e sua entrada no complexo de Golgi. (P) Dentro de Golgi, a proteína prM é clivada, formando a proteína M e permitindo a maturação correta da proteína E, que por sua vez volta a forma dimérica. (Q) O vírus maduro é transportado pelo Golgi, através de vesículas secretoras, sendo liberado da célula por exocitose. Fonte:ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2008.

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1.6.3. Proteínas não-estruturais NS1 e NS3

Entre as proteínas não-estruturais de flavivírus, a glicoproteína NS1 é a mais versátil, estando envolvida tanto em processos vitais para o vírus, como em múltiplas interações com o hospedeiro. Esta proteína de aproximadamente 48 kDa, é sintetizada inicialmente como porção da poliproteína, sendo translocada para o lúmen do RER durante sua tradução através de um peptídeo sinal localizado na região carboxi-terminal da proteína E (FALGOUT; CHANOCK; LAI, 1989). No lúmen do RER, ocorrem clivagens nas suas regiões N e C-terminais via signalases do hospedeiro e por uma enzima do RER desconhecida, respectivamente, gerando a molécula de NS1 monomérica. Neste processo, uma seqüência de oito aminoácidos localizada na região C-terminal de NS1 é requerida para a clivagem eficiente da junção NS1-NS2A (FALGOUT; CHANOCK; LAI, 1989; HORI; LAI, 1990; FALGOUT; MARKOFF, 1995). Ainda no RER, os monômeros de NS1 sofrem glicosilação, seguida de rápida dimerização (WINKLER et al., 1988; PRYOR; WRIGHT, 1993). Glicosilações adicionais no dímero ocorrem durante sua passagem pelo complexo de Golgi, a partir do qual é transportado para a superfície celular e secretado. As moléculas de NS1 extracelulares são encontradas em altos níveis no soro de pacientes infectados, sob a forma de hexâmeros solúveis (FLAMAND et al., 1999). Os dímeros de NS1 também permanecem no citoplasma das células infectadas, onde se associam a membranas organelares. Interessantemente, esta interação de NS1 com membranas celulares, inclusive a membrana extracelular, ocorre na ausência de domínios hidrofóbicos de ancoragem, sendo o mecanismo desta interação desconhecido.

O papel da proteína NS1 durante a replicação dos flavivírus não está claramente elucidado. Diversas evidências sugerem que esta proteína está envolvida na replicação do RNA, na montagem e na maturação viral (MACKENZIE; JONES; YOUNG, 1996; MUYLAERT et al., 1996; LINDENBACH; RICE, 1997; MUYLAERT; GALLER; RICE, 1997; LINDENBACH; RICE, 1999). Já as interações de NS1 com o hospedeiro são intensamente estudadas em diferentes flavivírus, e indicam sua atuação na patogênese, na imunomodulação e proteção. Diversos estudos apontam a proteína NS1 como diretamente relacionada à patogênese da Dengue. Esta proteína tem a capacidade de interagir com o sistema complemento do hospedeiro (CARDIFF et al., 1970; SMITH et al., 1970), e seus níveis séricos em pacientes com o vírus da Dengue (DENV) e da Febre do Oeste do Nilo correlacionam-se diretamente com a severidade da doença (ALCON et al., 2002; LIBRATYet al., 2002; MACDONALD et al., 2005). A indução da formação de complexos imunes (YOUNG et al., 2000), o estímulo de auto-anticorpos com reatividade contra plaquetas e matriz extracelular (CHANG et al., 2002), e o dano infligido sobre as células endoteliais (LINet al., 2002) são alguns dos mecanismos propostos para explicar a patogênese mediada pela NS1 de DENV. Neste vírus, a proteína NS1 liga-se à superfície de células não-infectadas via heparan sulfato e sulfato de condroitina E (AVIRUTNAN et al., 2007), contribuindo para o risco de destruição de células não-infectadas através de anticorpos. Esta atividade de NS1 ainda não foi demonstrada em outros flavivírus, destacando a impressionante divergência entre estes vírus quanto ao uso da proteína NS1 como mediadora de manifestações patológicas. Um exemplo disso é que recentemente foi demonstrada a habilidade de NS1 do vírus da Febre do Nilo em interagir com o fator H do complemento humano, e com o Toll-like receptor 3 (TLR3), o que sugere sua atuação na redução da habilidade do hospedeiro em controlar a replicação viral através do sistema complemento e da imunidade inata (CHUNG et al., 2006; WILSON et al., 2008). Até o momento não foram demonstrados estudos sobre o impacto de NS1 em indivíduos infectados com o vírus da Encefalite Japonesa e com VFA.

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Paradoxalmente, diversos estudos têm apontado para uma função protetora das respostas imunes contra NS1 de flavivírus. Ensaios de imunização passiva utilizando anticorpos monoclonais (HENCHAL; HENCHAL; SCHLESINGER, 1988; KIMURA-KURODA; YASUI, 1988; ZHANG et al., 1989), assim como imunização de camundongos com construções de DNA expressando NS1(LIN et al., 1998; MELLADO-SANCHEZ et al.,2005), revelaram que anticorpos dirigidos contra NS1 dos vírus da Dengue e da Encefalite Japonesa são protetores. Estudos de diferentes grupos de pesquisa têm demonstrado que a imunização ativa com NS1 purificado de diferentes flavivírus, ou a imunização passiva com anticorpos monoclonais contra NS1 de VFA e DENV, promovem proteção contra desafios virais letais, mesmo na ausência de anticorpos neutralizantes (SCHLESINGER et al., 1986; HENCHAL; HENCHAL; SCHLESINGER, 1988; SCHLESINGER; FOLTZER; CHAPMAN, 1993; VOLPINA et al., 2005; LIN et al., 2008). Um painel de anticorpos monoclonais contra NS1 do vírus da Febre do Oeste do Nilo revelou múltiplos mecanismos de proteção mediados por anticorpos, alguns através do sistema complemento e outros através do receptor Fc (CHUNG et al., 2006). Em infecções por VFA, anticorpos monoclonais anti-NS1 também previnem a infecção através de uma via independente do sistema complemento, porém dependente de receptor Fc (SCHLESINGER; FOLTZER; CHAPMAN, 1993).

Estudos anteriores ainda apontam para um potencial citolítico dos anticorpos anti-NS1, uma propriedade que deve contribuir significativamente na sua habilidade protetora. Experimentos de imunização passiva, in vitro, utilizando um painel de anticorpos monoclonais anti-NS1 de VFA, mostraram uma correlação entre proteção e citólise de células infectadas por VFA, mediada pelo complemento (SCHLESINGER; BRANDRISS; WALSH, 1985). Anticorpos anti-NS1 de pacientes com Encefalite Japonesa induzem citólise (mediada pelo complemento) de células expressando NS1 em sua superfície, impedindo a replicação viral nestas células (KRISHNA; RANGAPPA; SATCHIDANANDAM, 2009). Além disso, a imunização de camundongos com construções de vacina de DNA codificando NS1 do vírus da Encefalite Japonesa induziu uma forte resposta humoral, exibindo citólise de células infectadas mediada pelo complemento (LIN et al., 1998; XU et al., 2004), mas sem atividade neutralizante, o que resultou em proteção contra desafio viral. A imunidade celular dirigida contra NS1 do vírus da Encefalite Japonesa também tem sido reportada, causando a morte de células de camundongo infectadas através de linfócitos T citotóxicos (MURALI-KRISHNA et al., 1995). A imunização de camundongos com NS1 deste mesmo vírus, sintetizada em E. coli, induziu uma resposta do tipo Th2, a qual medeia a imunidade contra patógenos extracelulares e induz altos níveis de anticorpos (LIN et al., 2008). Assim, NS1 parece contribuir na proteção, em modelos murinos, pela indução da resposta imune tanto humoral quanto celular.

Devido à ampla e eficiente resposta imune protetora induzida por NS1, esta proteína tornou-se um importante alvo para desenvolvimento de vacinas contra as infecções por flavivírus (GAO et al., 2008; LIN et al., 2008). Esta linha de pesquisa vem sendo reforçada a partir da identificação de epítopos de NS1, o que permitirá uma melhor compreensão dos seus mecanismos de proteção. Em humanos, já foram identificados epítopos de linfócitos B na proteína NS1 de DENV, a partir de amostras clínicas (HUANG et al., 1999; WU et al., 2001; FALCONAR, 2007). Porém, até o momento, nenhum epítopo de linfócito T foi identificado nesta proteína. Em camundongos, foi identificado um epítopo imunodominante restrito a linfócitos T CD8+, na NS1 de DENV 2, o qual induz atividade citotóxica de linfócitos T, causando lise eficiente de células infectadas (GAO et al., 2008). Além do seu potencial imunogênico, a proteína NS1 está sendo bastante utilizada no desenvolvimento de métodos diagnósticos de flaviviroses (CHUNG; DIAMOND, 2008; LAZARO-OLAN et al., 2008; WANG et al., 2009), pois a detecção do antígeno ou anticorpos nos soros de pacientes

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permitem o diagnóstico rápido e precoce, visto que NS1 pode ser detectada no sangue 12 horas após a infecção (LINDENBACH; RICE, 2001; BRINTON, 2002). Até o momento, já existem dois kits de diagnóstico comerciais disponíveis para Dengue, ambos baseados na detecção de NS1 no sangue a partir de anticorpos específicos (MCBRIDE, 2009).

A NS3, por sua vez, é uma proteína de aproximadamente 70kDa, altamente conservada, que executa diversas funções críticas para a replicação viral. Esta proteína apresenta três atividades enzimáticas distintas: protease viral, requerida para processamento da poliproteína; helicase/NTPase, requerida para separação das fitas duplas intermediárias da replicação do RNA; RNA trifosfatase, requerida para adição do cap nos RNAs virais nascentes (FALGOUT et al., 1991; ZHANG et al., 1992; ARIAS; PREUGSCHAT; STRAUSS, 1993; LI et al., 1999; BENARROCH et al., 2004). Estudos mais recentes demonstram ainda outras funções para NS3. Em VFA, esta proteína, juntamente com NS2A, parece estar envolvida na morfogênese e liberação viral (KUMMERER; RICE, 2002; PATKAR; KUHN, 2008), enquanto no vírus Kunjin, é requerida para eficiente encapsidação do RNA viral (PIJLMAN; KONDRATIEVA; KHROMYKH, 2006). Alterações ou inibições de qualquer uma dessas atividades impedem a replicação do vírus, o que torna a NS3 um alvo bastante promissor para desenvolvimento de drogas anti-flavivírus (LEUNG et al., 2001; NALL et al., 2004; GANESH et al., 2005; LI et al., 2005; ERBEL et al., 2006; KNOX et al.,2006; YIN Z.;PATEL et al., 2006; LOHR et al., 2007).

A atividade de protease da NS3 é crucial para o ciclo replicativo, sendo extensamente estudada (RYAN; MONAGHAN; FLINT, 1998). Esta atividade é dependente do cofator NS2B, e o complexo NS2B-NS3, também conhecido como “flavivirina” (RAWLINGS; BARRETT, 1993), desempenha uma função chave no processamento co- e pós-traducional da poliproteína viral, mediando diversas clivagens (CHAMBERS T et al., 1990; BERA; KUHN; SMITH, 2007). Este complexo reconhece a seqüência de clivagem G/ARR%S/G, com resíduos consensos dibásicos nas posições P1 e P2, gerando o N-terminal de NS2B, NS3, NS4A e NS5, e clivando adicionalmente sítios internos de C, NS2A e NS4A (CHAMBERS; GRAKOUI; RICE, 1991; CHAMBERS et al., 1993; CHAMBERS; NESTOROWICZ; RICE, 1995; DROLL; MURTHY; CHAMBERS, 2000; CHAMBERS et al., 2005). Através de alinhamentos de seqüências, identificou-se que a região com atividade de protease de NS3 está localizada entre os 180 aminoácidos N-terminais da proteína, os quais apresentam um domínio de serina protease semelhante à tripsina, com os resíduos catalíticos His51-Asp75-Ser135 (BAZAN; FLETTERICK, 1989; GORBALENYA et al., 1989). Estudos com o vírus da Febre do Nilo reveleram que a atividade de protease do complexo NS2B-NS3 não requer a clivagem entre estas duas proteínas (LEUNG et al., 2001; BERA; KUHN; SMITH, 2007) e estudos computacionais e biofuncionais mais recentes com o DENV indicaram que a proteína NS2B é necessária para a atividade de protease, pois possibilita a formação de um estado conformacional cataliticamente ativo e fornece sítios adicionais de interação com o substrato (ZUO et al., 2009).

Funcionalmente, as atividades enzimáticas de helicase/NTPase têm sido confirmadas nas proteínas NS3 de diversos membros da família Flaviviridae, incluindo os vírus do gênero Flavivirus, como o vírus da Encefalite Japonesa, DENV, VFA, e do gênero Hepacivirus,como o vírus da Hepatite C (WENGLER, 1991; WARRENER; TAMURA; COLLETT, 1993; KUO et al., 1996; CUI et al., 1998). Estudos mutacionais com NS3 de DENV sugerem que a atividade de helicase/NTPase seja essencial para o ciclo de vida viral, visto que mutações que bloqueiam tais atividades impedem a replicação (MATUSAN et al., 2001). A estrutura cristalina de diversas NS3 helicases já foi demonstrada, incluindo as de DENV, VFA, vírus da Encefalite Japonesa e da Hepatite C (YAO et al., 1997; XU et al., 2004; WU et al., 2005;

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LUO et al., 2008; YAMASHITA et al., 2008). O domínio da RNA helicase dos flavivírus está localizado após o domínio protease, na região C-terminal de NS3. Este domínio contém sete motivos conservados associados com a classe da Super-Família 2 (SF2) de NTPases e RNA helicases (LESCAR et al., 2008). Parece que a NS3 helicase é requerida para desfazer estruturas secundárias do RNA (facilitando a montagem do complexo de replicação viral), para separar intermediários de RNA fita dupla formados durante a síntese de RNA, além de promover a remoção de proteínas ligadas ao RNA viral. Análises da NS3 helicase de DENV in vitro indicaram que esta atividade enzimática apresenta processividade baixa, ligando-se ao RNA de maneira independente de seqüência e seguindo uma polaridade 3’-5’ (WANG et al.,2009). A NS3 se associa in vitro com a proteína NS4B, que atua dissociando as fitas simples de RNA da NS3 helicase, aumentando assim a sua atividade (UMAREDDY et al., 2006).

A separação de fitas é uma reação dependente de energia, dirigida pela hidrólise de ATP. Assim, todas as RNA helicases apresentam atividade de ATPase. Nos flavivírus, a obtenção de energia para a atividade de helicase pode ser realizada através da hidrólise de qualquer trifosfato de nucleosídeo pela NTPase. Esta atividade é estimulada pela adição de poliribonucleotídeos fita simples (SUZICH et al., 1993; TAMURA; WARRENER; COLLETT, 1993; WARRENER; TAMURA; COLLETT, 1993; LI et al., 1999). A NTPase da proteína NS3 compartilha seu sítio ativo com uma atividade de RTPase (WANG et al.,2009), que atua na primeira etapa de adição do cap aos RNAs nascentes. A atividade de RTPase catalisa a desfosforilação da extremidade 5’ trifosforilada, permitindo a metilação da mesma pela metil-transferase de NS5 (BENARROCH et al., 2004; YON et al., 2005; SAMPATH et al., 2006). As proteínas NS3 e NS5 formam um complexo em células infectadas por DENV, sendo as atividades de NTPase e RTPase estimuladas pela polimerase viral (YON et al., 2005).

A proteína NS3 também é capaz de elicitar uma resposta imune protetora contra diversos flavivírus. Diferentemente da proteína NS1, que estimula uma resposta imune bastante diferenciada, a proteína NS3 ativa majoritariamente a resposta imune celular citotóxica. Em camundongos, esta resposta já está bem caracterizada para DENV, com a identificação de diversos epítopos de linfócitos T CD8+, inclusive epítopos imunodominantes (ROTHMAN; KURANE; ENNIS, 1996; SPAULDING et al., 1999). A imunização com tais epítopos sintéticos, ou com vacinas expressando-os, induz uma forte resposta proliferativa de linfócitos T citotóxicos que podem apresentar resposta específica para cada sorotipo ou cruzada para os quatro sorotipos da Dengue e para NS3 de outros flavivírus, dependendo do epítopo utilizado (SPAULDING et al., 1999; LURIA-PEREZ et al., 2007; MASAKI et al.,2009). Em humanos, a proteína NS3 também é o principal alvo para a resposta citotóxica, com epítopos de linfócitos T CD8+ identificados em DENV, VFA e no vírus da Febre do Oeste do Nilo (LIVINGSTON et al., 1995; MATHEW et al., 1998; MONGKOLSAPAYA et al., 2003; SIMMONS et al., 2005; GUY et al., 2008; MCMURTREY et al., 2008). A imunização com vacina de FA e vacinas experimentais de DENV, ou até mesmo a infecção por DENV, desperta uma resposta imune significativa de linfócitos T CD8+, com ausência de reação cruzada entre VFA e DENV, porém com reconhecimento de todos os sorotipos da DENV (SIMMONS et al., 2005; APPANNA et al., 2007; GUY et al., 2008). Ainda em DENV, parece que a exposição primária ao vírus desenvolve memória imunológica contra NS3, induzindo uma resposta mais forte durante as infecções subseqüentes (APPANNA et al.,2007). Interessantemente, diversos autores também têm reportado uma resposta humoral significativa contra NS3 em indivíduos infectados pelo vírus da Hepatite C e pelo DENV (CHURDBOONCHART et al., 1991; CHEN et al., 1999; VALDES et al., 2000; CORTES et al., 2003; LAZARO-OLAN et al., 2008; SILLANPAA et al., 2009). Durante a infecção crônica pelo vírus da Hepatite C, há a indução de altos títulos de anticorpos contra NS3

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(CHEN et al., 1999; SILLANPAA et al., 2009) e a proteção passiva contra DENV é conferidaatravés de anticorpos monoclonais anti-NS3 (TAN; YAP; SINGH, 1990). Ademais, epítopos imunodominantes de linfócitos T CD4+ de humanos foram identificados na proteína NS3 de DENV, os quais estimulam a secreção de IFN-" (KURANE et al., 1995; GAGNON et al.,1996; KURANE et al., 1998; MANGADA; ENNIS; ROTHMAN, 2004; WEN et al., 2008). Devido à imunogenicidade induzida por NS3, esta proteína também vem sendo utilizada no desenvolvimento de vacinas contra flavivírus (LURIA-PEREZ et al., 2007; MASAKI et al.,2009).

1.7. Desenvolvimento e avaliação de vacinas de DNA contra os flavivírus

A vacinação é a estratégia mais prática e de menor custo para prevenção da maioria dos flavivírus. Entretanto, vacinas baseadas em vírus atenuados apresentam o potencial de promover efeitos colaterais e até mesmo casos mais raros de reações fatais, o que estimula o desenvolvimento de estratégias de vacinação alternativas, como vacinas de DNA codificando seqüências específicas de flavivírus. As vacinas de DNA, além de mais seguras, apresentam algumas vantagens em relação às vacinas convencionais: a tecnologia de DNA recombinante permite a incorporação de sinais ativadores do sistema imune nas construções vacinais; a vacina pode ser combinada com citocinas e administrada por diferentes vias, o que permite a modulação da resposta imune; o DNA apresenta motivos CpG que funcionam como ativadores de receptores Toll-like; é produzida na ausência de produtos animais e facilmente purificada; e apresenta estabilidade à temperatura ambiente, o que facilita seu transporte e estocagem (DHALIA et al, 2009).

Entre as vacinas de DNA desenvolvidas contra flavivírus, grande parte utiliza como estratégia vacinal a co-expressão das proteínas estruturais PreM-E, a qual é capaz de induzir a produção de anticorpos neutralizantes contra os vírus da Encefalite Japonesa e da Dengue (KONISH et al., 1998; KONISH et al., 2000; KONISH; TERAZAWA; IMOTO, 2003). Entretanto, estas vacinas não são capazes de induzir resposta duradoura com títulos apropriados de anticorpos neutralizantes (DONNELLY; BERRY; ULMER, 2003). A ineficiência destas formulações está provavelmente relacionada ao mecanismo de apresentação destes antígenos ao sistema imune dos hospedeiros. Antígenos endógenos citoplasmáticos, típicos de antígenos codificados por vacinas de DNA, são majoritariamente apresentados ao sistema imune através de moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) de classe I, o qual é predominantemente associado a uma resposta celular citotóxica. Tal resposta geralmente não estimula uma resposta humoral satisfatória, o que é essencial para uma neutralização viral eficiente. Tem sido postulado que a imunogenicidade de um antígeno protéico pode ser exacerbada através da sua apresentação por moléculas do MHC de classe II, responsáveis pela ativação de linfócitos T CD4+

(RAVIPRAKASH et al., 2001; DONNELLY; BERRY; ULMER, 2003). De fato, a ativação de linfócitos T CD4+ é importante para sustentar a resposta celular de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança da classe de anticorpos e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos (ROCHA; TANCHOT, 2004) (Figura 15).

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Figura 15. Apresentação antigênica pela via MHCII, mediada pela Proteína de Associação à Membrana Lisossomal – LAMP. Antígenos endógenos, característicos das vacinas de DNA, são preferencialmente apresentados ao sistema imune pela via MHCI para linfócitos T CD8+. Antígenos fusionados à LAMP, apesar de serem expressos endogenamente, são direcionados para compartimentos precursores do lisossomo diretamente associados à apresentação antigênica via MHCII. Estes antígenos quiméricos são majoritariamente apresentados para linfócitos T CD4+, que por sua vez estimulam a produção clonal de linfócitos T CD8+ e linfócitos B, assim como formação de células de memória. Fonte: Adaptado pela autora.

A possibilidade de direcionamento dos antígenos codificados por vacinas de DNA para o processamento via MHCII foi firmemente reforçada após o descobrimento de uma proteína trans-membrana do tipo I, denominada Proteína de Associação à Membrana Lisossomal (Lysosome-associated membrane protein – LAMP). Esta proteína liga-se à membrana externa dos lisossomos através de uma seqüência carboxi-terminal YXXØ (onde Y representa o aminoácido tirosina, X representa qualquer aminoácido e Ø representa qualquer aminoácido hidrofóbico), presente numa cauda citoplasmática de 11 aminoácidos (GUARNIERI et al., 1993; ROHRER et al., 1996; OBERMULLER et al., 2002). O tráfego intracelular de LAMP inclui compartimentos multilaminares especializados de Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) imaturas, chamados MIIC e CIIV, onde ocorrem o processamento e formação dos complexos peptídeos antigênicos-MHCII (PETERS et al.,1991; KLEIJMEER et al., 1997; GEUZE, 1998; DRAKE et al., 1999; TURLEY et al., 2000). Portanto, a fusão de antígenos vacinais com LAMP permite o direcionamento do antígeno quimérico para o compartimento MIIC e conseqüentemente sua apresentação antigênica via MHCII.

Diversos laboratórios de pesquisa têm reportado que a fusão com LAMP aumenta a resposta imunológica contra uma grande variedade de antígenos, incluindo as proteínas E6 e E7 de HPV-16; a telomerase humana; as proteínas preM-E dos vírus da Febre do Nilo e do Dengue 2; o receptor hormonal da tireóide; as proteínas Gag, Env gp120, Env gp160 e Nef de HIV-1; o antígeno do melanossoma humano (MAGE-3); a listeriolisina O e a proteína N do coronavírus SARS (ROWEL et al., 1995; WU et al., 1995; RUFF et al., 1997; NAIR et al.,1998; BONINI et al., 2001; RAVIPRAKASH et al., 2001; SU et al., 2002; LU et al., 2003; MARQUES et al., 2003; CHIKHLIKAR et al., 2004; DE ARRUDA et al., 2004; ANWAR et

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al., 2005; ARRUDA et al., 2006; GUPTA et al., 2006). Várias metodologias estão sendo utilizadas no desenvolvimento de vacinas de DNA codificando quimeras LAMP/antígeno. Uma construção freqüentemente utilizada contém os domínios transmembrana e citoplasmático de LAMP, adicionados ao C-terminal do antígeno protéico. Mais recentemente, foi identificado que alguns antígenos devem ser inseridos dentro da molécula de LAMP completa, afim de aumentar a expressão antigênica e o tráfego para o compartimento lisossomal. Diversas quimeras LAMP/antígeno, incluindo proteínas dos vírus da Febre do Nilo, Dengue, SARS, HPV e HIV-1 apresentaram co-localização in vitro com MHCII, LAMP-1 e LAMP-2 em diferentes tipos celulares, detectados por ensaios de microscopia confocal e/ou eletrônica (LU et al., 2003; MARQUES et al., 2003; CHIKHLIKAR et al., 2004; DE ARRUDA et al., 2004; ANWAR et al., 2005; ARRUDA et al., 2006; GUPTA et al., 2006), comprovando o direcionamento dos antígenos para os compartimentos MIIC.

Com relação à indução da resposta imunológica, os benefícios das quimeras LAMP/antígeno foram demonstrados em diversas linhagens de camundongos, em macacos rhesus e também em humanos (SU et al., 2005; CHIKHLIKAR et al., 2006; KAVANAGH et al., 2006). As quimeras induzem um aumento na resposta de linfócitos T CD4+, na secreção das citocinas IL-2, IL-4, IL-5 e IFN-", nas respostas proliferativas, na avidez funcional e no repertório da resposta imune (ROWEL et al., 1995; WU et al., 1995; RUFF et al., 1997; NAIR et al., 1998; BONINI et al., 2001; RAVIPRAKASH et al., 2001; SU et al., 2002; LU et al., 2003; MARQUES et al., 2003; CHIKHLIKAR et al., 2004; DE ARRUDA et al., 2004; ANWAR et al., 2005; ARRUDA et al., 2006; GUPTA et al., 2006). O aumento da resposta mediada por linfócitos T CD4+, produzida pelas quimeras, parece desempenhar um papel importante na modulação de linfócitos B, respostas de linfócitos T CD8+ e no desenvolvimento de memória imunológica. Quando comparado com moléculas não-fusionadas a LAMP, as quimeras aumentam o título de anticorpo, a neutralização viral, a afinidade do anticorpo e o número de epítopos reconhecidos pelos linfócitos B. A resposta CD8+ também foi aumentada em diversos sistemas quiméricos LAMP/antígeno, assim como a avidez funcional e o repertório da resposta. Além disso, a longevidade da memória imunológica de linfócitos B e CD8+ foi prolongada em animais imunizados com quimeras (ROWEL et al., 1995; WU et al., 1995; RUFF et al., 1997; NAIR et al., 1998; BONINI et al.,2001; RAVIPRAKASH et al., 2001; SU et al., 2002; LU et al., 2003; MARQUES et al.,2003; CHIKHLIKAR et al., 2004; DE ARRUDA et al., 2004; ANWAR et al., 2005; ARRUDA et al., 2006; GUPTA et al., 2006).

Nosso grupo de pesquisas, do Laboratório de Virologia e Terapia Experimental – LaViTE / Centro de Pequisas Aggeu Magalhães / FIOCRUZ, vem utilizando a tecnologia de antígenos fusionados a LAMP com o objetivo de desenvolver vacinas de DNA contra o vírus da Febre Amarela. Recentemente, produzimos uma construção de DNA expressando o envelope de VFA, fusionado à LAMP, que foi utilizada em experimentos de imunização de camundongos. Tal ensaio demonstrou a produção de altos títulos de anticorpos neutralizantes, capazes de conferir proteção total contra desafio letal. Além disso, quando comparado à imunização com vacina de vírus atenuado 17DD, a expressão da proteína E/LAMP pela construção vacinal foi capaz de induzir respostas de linfócitos T CD4+ e CD8+ similares, qualitativamente e quantitativamente (DHALIA et al., 2009). Baseado no sucesso da construção vacinal com a proteína envelope de VFA, neste trabalho foi realizada a construção de vetores de transfecção codificando genes sintéticos das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 de VFA, nas formas fusionadas e não-fusionadas a LAMP. Estes vetores foram analisados quanto à expressão e ao tráfego intracelular, assim como quanto à capacidade de indução da resposta imune em camundongos. A construção de vetores de transfecção, capazes

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de direcionar o tráfego celular de proteínas virais para a apresentação antigênica via MHCII, é o principal objetivo deste trabalho, visando o aprimoramento das vacinas de DNA atuais e futuras.

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22.. OObbjjeettiivvooss

2.1. Objetivo Geral

Construir vetores de transfecção codificando genes sintéticos das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do vírus da Febre Amarela, capazes de direcionar o tráfego celular para compartimentos lisossomais.

2.1. Objetivos Específicos

1. Selecionar e otimizar as seqüências vacinais dos genes NS1 e NS3 do vírus da Febre Amarela;

2. Construir vetores de transfecção para a expressão dos genes sintéticos, fusionados e não-fusionados a LAMP, em células eucarióticas;

3. Produzir anticorpos policlonais contra NS1 e NS3; 4. Analisar a expressão das proteínas codificadas, pelas construções vacinais, através de

ensaios de Western-blot;5. Analisar o tráfego celular destas proteínas, através da técnica de Imunofluorescência; 6. Avaliar a resposta celular de camundongos, imunizados com as vacinas de DNA

produzidas, através da técnica de Enzyme-linked ImmunoSpot Assay - ELISPOT.

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33.. MMaatteerriiaaiiss ee MMééttooddooss

3.1. Otimização e síntese de seqüências para expressão em células eucarióticas

As seqüências codificantes das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 foram identificadas no banco de dados National Center of Biotechnology Information - NCBI (número de acesso NC 002031) e otimizadas, para expressão em células eucarióticas, através do algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®). Utilizando este algoritmo, é possível desenhar seqüências sintéticas de DNA para cada proteína, com o intuito de melhorar sua expressão no organismo alvo, levando-se em consideração diversos parâmetros biológicos simultaneamente. As discrepâncias entre os codon usages do vírus e das células eucarióticas são minimizadas, através de mutações silenciosas pontuais, capazes de alterar os códons sem alterar a seqüência final de aminoácidos. Desta forma, as seqüências sintéticas de DNA são compostas pelos códons preferencialmente utilizados pelo organismo alvo (células eucarióticas). Outros parâmetros como estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo GC, seqüências longas repetitivas de DNA, motivos repetitivos de DNA, sítios de restrição e sítios crípticos de splicing, também foram ajustados para permitir um aumento significativo nos níveis de expressão das proteínas virais em células eucarióticas.

As seqüências otimizadas de NS1 e NS3 foram então fusionadas a dois sítios múltiplos de clonagem: 5’(Sal I, NheI, XhoI e XbaI) e 3’(EcoRI, KpnI e HindIII), que permitiram a construção de vetores através de estratégias de subclonagem (sem a necessidade de amplificação por PCR). As seqüências dos genes otimizados, flanqueadas pelos sítios múltiplos de clonagem, foram enviadas para a síntese comercial (Geneart®) e em seguida subclonadas no vetor de expressão p43.2 (gentilmente cedido pelo Dr. George Pavlakis, National Cancer Institute, USA), originando as construções p43.2-NS1OPT e p43.2-NS3OPT.As construções quiméricas, p43.2-NS1OPT/LAMP e p43.2-NS3OPT/LAMP, foram obtidas pela inserção de NS1OPT e NS3OPT entre os domínios N-terminal e C-terminal de LAMP-1 humano (GUARNIERI et al., 1993).

3.2. Otimização e síntese de seqüências para expressão em bactérias

As seqüências codificantes das proteínas NS1 e NS3, obtidas no GenBank NCBI, foram analisadas quanto ao perfil de hidrofilicidade (Kyte-Doolitle), com o objetivo de identificar as suas regiões mais hidrofílicas (mais prováveis epítopos de células B). Duas regiões hidrofílicas de cada proteína foram selecionadas e intercaladas por uma seqüência espaçadora de DNA (GGACCCGGGCCTGGG – (LIVINGSTON et al., 2002)) com a finalidade de evitar a formação de neoepítopos imunogênicos inespecíficos, a partir da fusão das regiões selecionadas. Em seguida, as seqüências obtidas foram otimizadas para expressão em Escherichia coli através do programa LETO 1.0, utilizando os parâmetros supracitados, com exceção dos sítios crípticos de splicing.

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As seqüências otimizadas também foram fusionadas aos dois sítios múltiplos de clonagem: 5’(Sal I, NheI, XhoI e XbaI) e 3’(EcoRI, KpnI e HindIII) e enviadas para a síntese comercial (Geneart®), sendo em seguida subclonadas no vetor pMAL-c4X [Figura 13 (New England Biolabs®)]. Este vetor possui o gene malE de E. coli, que codifica uma proteína de ligação à maltose (Maltose Binding Protein – MBP), fusionado à seqüência do gene LacZ’, o qual codifica a !-complementação da enzima #-galactosidase. O gene clonado foi inserido posteriormente ao gene malE permitindo a expressão das proteínas de fusão MBP-NS1OPT e MBP-NS3OPT.

Figura 16. Esquema representativo do vetor pMAL-c4X. Com a finalidade de proporcionar altos níveis de expressão das seqüências clonadas, o vetor apresenta o promotor forte “Tac” e sinais de iniciação da tradução de malE. O vetor expressa o gene malE fusionado ao gene LacZ’. O “polylinker” se situa entre estes dois genes, onde a inserção da seqüência de interesse inativa o fragmento ! da #-galactosidade. O vetor carreia ainda o gene Laclq, que codifica para o repressor de “Tac”, mantendo baixa a expressão de Ptac na ausência de indução por IPTG. Fonte: Adaptado pela autora.

3.3. Expressão e purificação das proteínas MBP-NS1 e MBP-NS3

Os vetores pMAL-NS1OPT e pMAL-NS3OPT foram utilizados para a transformação de bactérias E. coli competentes (K12TB1 – New England Biolabs®). As bactérias foram transformadas por choque térmico e selecionadas em meio seletivo contendo ampicilina. As colônias isoladas de cada construção foram inoculadas em 5mL de meio Luria-Bertani - LB líquido, suplementado com 50mg/mL de ampicilina (LB/AMP), e incubadas a 37ºC por 16 horas. Estes pré-inóculos foram transferidos para 1 litro de LB/AMP e incubados a 37ºC, sob agitação (180 Rotações Por Minuto - RPM), até ser atingida uma densidade óptica de 0.5, no comprimento de onda de 600nm. A expressão das proteínas recombinantes foi induzida com 0.5mM de IsoPropil-beta-D-TioGalactopiranosídeo – IPTG, durante 4 horas a 37ºC, e as bactérias expressando as proteínas foram coletadas por centrifugação a 5.000 RPM, à 4ºC por

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20 minutos. Os sedimentos bacterianos foram ressuspendidos em tampão apropriado (Tampão A) contendo: 20mM Tris-HCl pH 7.4, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM β-mercaptoetanol, suplementado com inibidor de protease (Roche®) e as bactérias foram lisadas através de ultrasonicação, com 4 pulsos de 30 segundos e amplitude 50. Em seguida, os extratos bacterianos foram centrifugados a 10.000 RPM, a 4ºC por 30 minutos, e os sobrenadantes, contendo o extrato protéico total, foram submetidos à purificação.

As proteínas induzidas foram purificadas através de um único passo de cromatografia de afinidade, no qual os extratos protéicos totais foram incubados com uma coluna contendo matriz de amilose (New England Biolabs®) que liga-se especificamente à MBP das proteínas recombinantes. Após diversas lavagens com o Tampão A, as proteínas foram eluídas da coluna com Tampão A contendo 10mM de maltose livre (Tampão B). As análises quantitativas foram realizadas através do método de Bradford, utilizando-se como padrão uma curva de BSA com concentrações previamente estabelecidas. As reações de Bradford foram quantificadas através do leitor de ELISA (BioRad 2550 Reader EIA®)

3.4. Imunização de coelhos para obtenção de anticorpos específicos contra NS1 e NS3

Para a produção dos anticorpos policlonais específicos contra as proteínas não-estruturais de VFA, foram utilizados coelhos brancos sadios, com cerca de três meses de idade, mantidos no biotério central do CPqAM/FIOCRUZ. Para a primeira imunização, aproximadamente 100μg das proteínas MBP-NS1 e MBP-NS3 foram fracionadas por eletroforese em gel 12.5% de poliacrilamida. Após a migração eletroforética, o gel foi corado com Azul de Coomassie (Sigma®) e descorado para posterior excisão das bandas correspondentes às proteínas recombinantes, com bisturi estéril. Os fragmentos protéicos foram macerados em 600μL de tampão PBS (0.15M Tampão salina fosfato pH 7.2) e 300μLde adjuvante de Freud completo (Sigma®). Os macerados foram injetados nos coelhos, via subcutânea, em quatro ou mais pontos. A segunda, terceira e quarta imunizações foram realizadas 15, 30 e 45 dias, respectivamente, após a primeira imunização seguindo o mesmo protocolo da primeira, com exceção do adjuvante de Freud que, nessas imunizações, foi utilizado na sua forma incompleta (Sigma®). Sete dias após a quarta imunização, os coelhos foram sacrificados através de punção cardíaca. O sangue coletado foi mantido à temperatura ambiente por 1 hora e, posteriormente, em geladeira por mais 16 horas. Em seguida, esse sangue foi centrifugado a 3.000 RPM por 10 minutos, e os soros obtidos foram aliquotados e mantidos à -80ºC. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as exigências do Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA) da Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, de acordo com o protocolo P-0259/05 (aprovado por esta comissão).

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3.5. Imunoadsorção dos anticorpos produzidos contra as proteínas recombinantes NS1 e NS3

Com o objetivo de aumentar a especificidade dos soros, os anticorpos contra as proteínas MBP-NS1 e MBP-NS3 foram purificados por imunoadsorção. Para tal, 20μg das respectivas proteínas foram fracionados individualmente, por eletroforese em gel SDS-PAGE 10%, para posterior transferência para membrana de nitrocelulose (Immobilon-P Millipore®). Em seguida, a membrana foi corada com 0.2% Rouge Ponceau / 1% TCA, para a visualização das bandas referentes às proteínas em questão. A região da banda foi excisada da membrana e fragmentada. Após 3 lavagens de 10 minutos com PBS, os fragmentos foram incubados durante 30 minutos a 4ºC com solução 5% leite / 0.05% Tween-20 em PBS, para saturação da membrana. Em seguida, os fragmentos foram incubados, sob agitação, com os respectivos soros policlonais obtidos previamente, por um período de 16h a 4ºC. Após esta etapa, foram realizadas 3 lavagens de 10 minutos com PBS e posterior tratamento com solução 0.1M Glicina-HCl pH 2.5, para a eluição dos anticorpos específicos. A solução foi então separada dos fragmentos da membrana e neutralizada com 20μL de 1M Tris-HCl pH 8.0 e 220μL de PBS duas vezes concentrado. Os anticorpos purificados foram armazenados a -80 ºC.

3.6. Avaliação da produção de anticorpos específicos contra as proteínas NS1 e NS3 de VFA, através da técnica de Western-blot

A eficiência dos anticorpos anti-NS1 e anti-NS3, imunoadsorvidos, foi avaliada através de ensaios de Western-blot contra as respectivas proteínas recombinantes purificadas, que induziram sua produção. Como controle positivo da reação, foram utilizados extratos de células humanas infectadas com VFA. Os extratos celulares foram ressuspendidos em tampão 2X Laemmli desnaturante, fracionados em gel 12.5% de poliacrilamida e transferidos para membrana de nitrocelulose. Após o bloqueio das membranas em solução 5% leite em PBS-0.1%Tween, as mesmas foram incubadas com os anticorpos policlonais obtidos (1:500) em solução 1% leite em PBS / 0.1% Tween, 1 hora sob agitação, e lavadas 3X (10 minutos cada) em PBS / 0.1% Tween. Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário (1:5.000) anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase (Jackson ImmunoResearch®), 1 hora sob agitação, lavadas 3 vezes e reveladas por quimiluminescência utilizando kit de ECL (Amersham®).

3.7. Cultivo, infecção e transfecção de células eucarióticas

Células humanas 293 e de hamster BHK-21, obtidas da ATCC (Rockville, MD), foram cultivadas de acordo com as especificações do fabricante em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM - Invitrogen®) contendo 10% soro fetal bovino (Gibco®), 1% penicilina/streptomicina (Gibco®) e 1% L-glutamina (Sigma®). Estas células foram utilizadas tanto para ensaios de infecção viral, como para os experimentos de transfecção com as vacinas de DNA. Após atingirem uma confluência de aproximadamente 60%, as células

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foram infectadas com um extrato viral de VFA na concentração de 0.36 x 106 Unidades Formadoras de Placa - PFU (gentilmente cedido pela Dra. Marli Tenório, pesquisadora do LaViTE). Para a infecção, as células foram inicialmente incubadas com o extrato de VFA puro (1 hora / 37ºC /5% de CO2), sendo acrescido em seguida meio DMEM completo para a manutenção celular. As células infectadas permaneceram nas mesmas condições de incubação (37ºC / 5% de CO2) durante 48 horas, até apresentarem os efeitos citopatológicos provocados pelo vírus.

Para os ensaios de transfecção, as células foram cultivadas nas mesmas condições supracitadas. Em seguida, foram incubadas com 5-8μg dos vetores p43.2-NS1OPT, p43.1-NS3OPT, p43.2-NS1OPT/LAMP e p43.2-NS3OPT/LAMP e submetidas à reação de transfecção utilizando o kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen®) para 293, e o kit Superfect Transfection Reagent (Qiagen®) para BHK-21, ambos de acordo com as instruções dos fabricantes. As células também foram transfectadas com a mesma quantidade de DNA, utilizando o plasmídeo p43.2 vazio, como controle negativo, e como controle da transfecção, o gene repórter da #-galactosidase.

3.8. Análise da expressão das células transfectadas, através da técnica de Western-blot

Para avaliar a eficiência de transfecção, assim como a eficiência de expressão das construções vacinais de VFA em células eucarióticas 293, foram realizados ensaios de Western-blot. Como controles, foram utilizadas células transfectadas com o vetor p43.2 vazio (negativo) e células infectadas com o VFA (positivo). As células transfectadas/infectadas foram ressuspendidas em 250μl de tampão de amostra (48 horas após a transfecção/infecção viral) e lisadas mecanicamente, sendo os extratos aquecidos a 95ºC durante 5 minutos. Com o intuito de normalizar a quantidade dos diferentes extratos utilizados no ensaio, a concentração protéica total de cada extrato foi determinada através do método de Bradford, utilizando-se como padrão uma curva de BSA com concentrações previamente estabelecidas. Em seguida, a mesma quantidade de proteína total de cada extrato celular foi fracionada em gel SDS-PAGE 10% e transferida para membranas de nitrocelulose, em sistema semi-seco de transferência (Bio-Rad®). Os soros policlonais imunoadsorvidos, descritos anteriormente, foram utilizados na diluição inicial de 1:250 para a detecção das respectivas proteínas. Como segundo anticorpo foi utilizado anti-coelho IgG, produzido em asinos, conjugado a peroxidase [diluição 1:5.000 (Jackson Immunoresearch®)]. Em paralelo, como segundo controle da normalização dos extratos celulares, os mesmos extratos protéicos foram incubados com o anticorpo monoclonal anti-#-actina, produzido em camundongos [diluição 1:50.000(Sigma®)] seguido da incubação com o anticorpo secundário anti-camundongo IgG, produzido em asinos, conjugado a peroxidase [diluição 1:5.000 (Jackson Immunoresearch®)]. As bandas protéicas reativas foram detectadas pelo kit ECL de quimioluminescência (Amersham®).

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3.9. Análise da expressão das células transfectadas, através de Microscopia de Fluorescência

Células BHK-21 foram transfectadas/infectadas em lamínulas, em placas de 24 poços, sendo processadas 48 horas após a transfecção/infecção viral. As células foram lavadas com tampão PBS, fixadas em 100% metanol a -20ºC (por 5 minutos) e bloqueadas em solução 1% BSA/PBS por 30 minutos. A detecção protéica foi realizada com os respectivos soros policlonais imunoadsorvidos (diluição 1:10) e anticorpo monoclonal anti-hLAMP (diluição 1:50), utilizando como anticorpos secundários os anti-IgG de coelho conjugado ao fluorocromo Alexa 488 e anti-IgG de camundongo conjugado ao mesmo fluorocromo, ambos produzidos em porco (Molecular Probes®), na diluição de 1:500. As lamínulas foram em seguida montadas com ProLong (Molecular Probes®) em lâminas de vidro e analisadas através de microscopia de fluorescência. As imagens foram adquiridas com o microscópio Leica DMI 4000 B (Leica Microsystem®), utilizando a objetiva 100X NA 1.3 mergulhada em óleo de imersão. O fluorocromo Alexa 488 foi excitado no comprimento de onda de 488nm e a imagem digital capturada utilizando o software Leica. Os campos de captura foram escolhidos de acordo com a dispersão e morfologia das células.

3.10. Avaliação da resposta imune induzida em camundongos imunizados com as construções p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT/LAMP

3.10.1. Obtenção dos vetores vacinais em larga escala

As construções codificando as proteínas virais otimizadas NS1 (p43.2-NS1OPT) e NS1 fusionada à LAMP (p43.2-NS1OPT/LAMP), assim como o vetor p43.2 vazio, foram submetidas à preparação de DNA plasmidial em larga escala. Alíquotas de cada DNA foram utilizadas para transformar células competentes e as colônias isoladas foram escolhidas para serem inoculadas em 12mL de meio LB/AMP, crescidas por aproximadamente 8 horas a 37ºC, sob vigorosa agitação. Cada cultura foi inoculada em 2.5 litros de meio LB/AMP líquido e crescida a 37ºC por 16 horas, sob vigorosa agitação. Em seguida, as culturas foram centrifugadas (8.000 RPM/15 minutos) para a obtenção dos sedimentos bacterianos, a partir do qual foi realizada a extração do DNA plasmidial (em condições livre de endotoxinas) utilizando o kit comercial Endofree Plasmid Giga Kit (Qiagen®), de acordo com as recomendações do fabricante. Os DNAs plasmidiais foram submetidos a provas de digestão em um volume final de 10μL contendo: 1X tampão de digestão, 1μL de cada DNA plasmidial e enzimas de restrição específicas. As digestões foram realizadas a 37ºC, durante aproximadamente 4 horas.

3.10.2. Animais e protocolos de imunização

Camundongos fêmeas BALB/c com 4-6 semanas de vida foram utilizados nos testes

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experimentais de imunização. Grupos de seis animais foram imunizados na base da cauda com a vacina do vírus atenuado 17DD na concentração de 104 PFU/50μL (controle positivo), vacinas de DNA p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT/LAMP (ambas na concentração de 50μg/50μL), vetor p43.2 vazio e PBS (controles negativos). Os animais foram imunizados nos dias 0, 30, 45 e 60, acompanhado de coleta de amostras sanguíneas 15 dias após cada imunização, com sangria total e coleta do baço no dia 75. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as exigências do Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA), de acordo com o protocolo P-0259-05 aprovado por esta comissão. Os soros coletados serão utilizados em ensaios futuros de Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) e de redução de placas por neutralização (Plaque Reduction Neutralization Test – PRNT).

3.10.3. Obtenção de células esplênicas

Os baços dos camundongos, obtidos assepticamente, foram macerados em peneiras de nylon de 0.4μm (BD&Pharmingen®) sob uma placa de Petri contendo meio de cultura RPMI 1640. As suspensões de células mononucleares foram então obtidas através da centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque, densidade de 1096. As suspensões de células foram lavadas duas vezes em meio de cultura RPMI 1640 e a concentração celular foi determinada no contador automático Cell Dyn 1400 (Abbott®), para posterior ajuste de acordo com o ensaio a ser realizado. A viabilidade celular foi determinada por testes de exclusão com o corante Azul de Tripan (Sigma®). As células mononucleares foram em seguida utilizadas nos ensaios de resposta imune celular.

3.10.4. Obtenção de peptídeos sintéticos da proteína NS1

Para avaliar a amplitude e magnitude da resposta de linfócitos T induzida pelas construções vacinais p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT/LAMP em camundongos, foram produzidos 46 peptídeos (Schafer®) a partir da seqüência de 352 aminoácidos (aa) da glicoproteína NS1 do vírus vacinal 17DD da Febre Amarela. Os peptídeos foram arranjados numa extensão de 15aa, com uma sobreposição de 11aa, o que representa um bom estímulo para os linfócitos T CD4+ e CD8+, considerando que o número de aminoácidos de cada peptídeo seja suficiente para preencher as fendas de HLA de classe I (8-9 mers) e II (11-15 mers) (KIECKER et al., 2004). Estes peptídeos não correspondem à extensão completa da proteína NS1, pois alguns peptídeos não foram sintetizados com sucesso. Os mesmos foram organizados em uma matriz (7x7) de 14 pools para garantir que cada peptídeo esteja presente em dois pools diferentes, o que permite a dedução dos prováveis peptídeos mais imunogênicos (Tabela 2). As soluções estoque de cada peptídeo foram preparadas através da diluição em 10% dimetilsufóxido (DMSO, Pierce®) / 90% água deionizada, numa concentração final de 2mg/mL e armazenadas a -20ºC.

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Tabela 2. Matriz de peptídeos da proteína NS1 de VFA

Pool 1 Pool 2 Pool 3 Pool 4 Pool 5 Pool 6 Pool 7Pool 8 1_15 21-35 25-39 29-43 33-47 37-51 49-63

Pool 9 57-71 61-75 69-83 X 77-91 85-99 89-103

Pool 10 93-107 97-111 105-119 109-123 117-131 121-135 129-143

Pool 11 133-147 141-155 181-195 185-199 193-207 205-219 213-227

Pool 12 217-231 221-235 237-251 245-259 249-263 253-267 265-279

Pool 13 269-283 273-287 281-295 293-307 333-347 337-351 341-355

Pool 14 361-375 385-399 389-403 393-407 397-409 X X

NS1

"

""""""""* X representa ausência de peptídeos

3.10.4. Ensaios de Enzyme-linked ImmunoSpot Assay (ELISPOT)

No intuito de analisar a resposta imune celular induzida pelas construções vacinais da proteína NS1, e de identificar os epítopos de células T mais imunogênicos desta proteína em camundongos, foram realizados ensaios de Enzyme-linked ImmunoSpot Assay (ELISPOT) para IFN-", de acordo com as recomendações do kit comercial ELISPOT IFN-" camundongo (BD Bioscience®). As placas de ELISPOT foram incubadas por cerca de 16h a 4ºC, contendo 100μl/poço de anticorpo de captura anti-IFN-" de camundongo (5μg/mL) diluído de 1:200, em PBS pH 7.2 estéril e filtrado. Em seguida, as placas foram lavadas com 200μl/poço de solução de bloqueio RPMI-10 [RPMI medium 1640 (Gibco®) com 10% de soro bovino fetal (Hyclone®) inativado por 1 hora a 56ºC; 1% de Penicilina/Estreptomicina; 1% de L-Glutamina 2mM]. Após incubação por 2h a temperatura ambiente, a solução de bloqueio (RPMI-10) foi descartada e os pools de peptídeos foram adicionados às placas, na concentração final de 10μg/mL de cada peptídeo, e 100μl/poço de esplenócitos dos camundongos foram adicionados numa concentração final de 2-15x105 células/poço, em duplicata. Foram adicionados como controle positivo, diluídos em 100μl de células, 100μl de acetato de forbol miristato (PMA – 2.5 μg/ml – Sigma®) e ionomicina (250 μg/ml - Sigma®). Como controle negativo, foi utilizado 100μl de meio RPMI diluído em 100μl de esplenócitos. Em seguida, as placas foram incubadas em estufa contendo 5% CO2 a 37ºC, por 16h. Após esta etapa, as células e os antígenos foram desprezados por inversão e as placas foram lavadas 2 vezes com 200μl/poço de água filtrada e estéril, por 5 minutos, e mais 4 vezes com 200μl/poço de PBS-T pH 7.2 (PBS contendo 0.05% Tween 20). O anticorpo de detecção anti-IFN-" de camundongo biotinilado (1:250), diluído em PBS-10 (PBS contendo 10% de soro bovino fetal – Hyclone® inativado por 1 hora a 56ºC), foi adicionado às placas e incubado por 2h a temperatura ambiente. A solução de anticorpo biotinilado foi então descartada, por inversão, e as placas foram lavadas 4 vezes com 200μl /poço de PBS-T. Em seguida as placas foram incubadas com 100μl/poço da enzima peroxidase conjugada à avidina (1:100), diluída em PBS-10, durante 1 hora em temperatura ambiente. Após o descarte da enzima conjugada, as placas foram lavadas 5 vezes com 100μl/poço de PBS-T e 3 vezes com 100μl/poço de PBS pH 7.2, seguido da adição de 100μl/poço de solução de substrato 3-amino-9-etil-carbazole (AEC). Após 15-40 minutos de revelação, para possibilitar a formação dos spots (pontos de liberação de IFN-"), a reação foi bloqueada lavando-se as placas 2 vezes com 200μl/poço de água filtrada e estéril. Após secagem por 16 horas, as placas foram analisadas e os spots contados, utilizando-se o programa Image Acquisition do equipamento CTL-Immunospot (BD Biosciences®), próprio para leitura de spots.

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44.. RReessuullttaaddooss

4.1. Construção de genes sintéticos

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4.1.1. Otimização para expressão em células eucarióticas

Inicialmente, as seqüências selvagens de NS1 e NS3 do VFA, obtidas no GenBank, foram flanqueadas por dois sítios múltiplos de clonagem (5’ - SalI, NheI, XhoI e 3’ – EcoRI, KpnI, HindIII), afim de permitir a posterior construção dos vetores de expressão através de estratégias de subclonagem. Uma seqüência Kozak contendo o códon de iniciação da tradução (ATG) foi inserida entre os sítios de NheI e XhoI, enquanto dois stop códons foram inseridos entre os sítios de restrição de EcoRI e KpnI (Figura 17).

Figura 17. Esquema representativo das construções gênicas. Sítios de restrição específicos foram inseridos, flanqueando os genes de interesse (NS1 ou NS3), para permitir a construção de proteínas selvagens e fusionadas à LAMP. A seqüência Kozak foi inserida para aumentar a eficiência da tradução, enquanto dois stop códons foram adicionados a fim de permitir a finalização da tradução das proteínas selvagens. Fonte: Adaptado pela autora.

Estas seqüências foram otimizadas, utilizando o algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®), com o objetivo de propiciar uma maior expressão de NS1 e NS3 em células eucarióticas humanas. Parâmetros como codon usage, estrutura secundária do mRNA, distribuição e conteúdo de GC, motivos repetitivos de DNA, sítios crípticos de splicing, sítios internos de restrição entre outros, foram modificados e/ou removidos das seqüências nativas através de mutações pontuais silenciosas (Figuras 18 a 22). As seqüências flanqueadoras foram bloqueadas, antes do processo de otimização, para preservar as seqüências dos sítios de restrição desejáveis para as estratégias de clonagem.

Através do algoritmo genético, observou-se uma significante discrepância entre a freqüência de códons utilizados por VFA em relação aos utilizados por células eucarióticas humanas, para expressar suas proteínas. A figura 18 ilustra o processo de otimização do codon usage da proteína viral NS3 para expressão em células humanas, exemplificando a alteração de códons utilizados para expressar o aminoácido lisina (o mesmo processo foi realizado para todos os aminoácidos). Dos dois códons possíveis para expressar a lisina (AAA

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e AAG), o VFA utiliza predominantemente o códon AAG (“original” – 70%). Note que em células humanas (“target”), os dois códons são utilizados com freqüências similares (43 e 57%). Desta forma, a freqüência dos códons utilizados por VFA para expressar a lisina foi substituída na seqüência otimizada (“optimized”) por freqüências similares às utilizadas em células humanas. A barra azul, indicada no gráfico, representa a comparação entre os códons utilizados pelo vírus para expressar a lisina, em relação aos possíveis códons utilizados para expressar o mesmo aminoácido em células humanas. Quanto maior for a barra, maior é a discrepância entre os codon usages das espécies comparadas. Observe que após o processo de otimização, ou seja, após a melhor distribuição dos códons para facilitar a expressão em eucariotos, a barra é significativamente reduzida na seqüência otimizada (barra verde).

Figura 18. Otimização de codon usage, para o aminoácido lisina, visando melhorar a eficiência de expressão da proteína NS3 de VFA em células eucarióticas humanas. A seqüência da proteína NS3 de VFA está representada como “original”, onde o códon AAG é utilizado predominantemente (70%) para expressar o aminoácido lisina. Por outro lado, o organismo alvo (células humanas – “target”) utiliza os dois códons em freqüências similares para expressar a lisina, com as proporções de 43 e 57%. A seqüência otimizada (“optimized”) apresenta um maior equilíbrio entre os dois códons, permitindo que as células humanas aproveitem melhor seus dois tRNAs disponíveis para a tradução do referido aminoácido, o que leva a uma maior eficiência de expressão. As barras indicam a discrepância entre os codon usages das seqüências original e alvo (azul – antes da otimização; verde – após a otimização). A redução do tamanho da barra, e conseqüentemente da discrepância entre os codon usages das duas espécies, ilustra bem o processo de otimização. Fonte: Dados da autora.

Embora o tamanho e a quantidade de estruturas secundárias, ao nível de mRNA, não possam ser diretamente relacionados com uma baixa eficiência de tradução, de um modo geral estas estruturas podem causar um efeito negativo na tradução dos mRNAs. Sua presença pode interferir no processo traducional prejudicando tanto o deslizamento dos ribossomos ao longo do mRNA, como também o acesso dos anti-códons dos tRNAs aos seus respectivos códons. Baseado nesta informação, o processo de otimização também pode contribuir para a redução do número e do comprimento destas estruturas hairpin like, visando aumentar a eficiência da síntese protéica. As seqüências foram ainda avaliadas quanto à distribuição do conteúdo GC, visando a obtenção de estruturas mais estáveis (Figuras 19 e 20), e quanto à presença de sítios crípticos de splicing além de sítios internos de restrição (Figuras 21 e 22). Os processos completos de otimização das proteínas NS1 e NS3 foram realizados pelo Dr. Rafael Dhalia e encontram-se anexados a esta dissertação (ver anexos). As seqüências otimizadas de NS1 e NS3 foram então enviadas para síntese comercial (Geneart®).

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Figura 19. Estruturas secundáriassecundárias da seqüência de mRNAum comprimento médio de 6.37, Estruturas secundárias da seqüêncireduzido para 22, acompanhado tconteúdo de GC das seqüências dosjanela de 31 nt, foi detectado comoconseqüente taxa de expressão. Font

Figura 20. Estruturas secundáriassecundárias da seqüência de mRNAum comprimento médio de 6.13, Estruturas secundárias da seqüêncireduzido para 36, acompanhado taconteúdo de GC das seqüências dosjanela de 31 nt, foi detectado como conseqüente taxa de expressão. Font

s e distribuição do conteúdo de GC da sequência dA, original de VFA, que codifica a proteína NS1. Um t

foram detectadas na estrutura secundária predita doia otimizada do mRNA que codifica NS1. O númetambém pela redução do comprimento médio (5.5)s mRNAs de NS1 original e otimizado. O conteúdo d 47.6% e foi otimizado para 52.74%, visando aumente: Dados da autora

s e distribuição do conteúdo de GC da sequência d, original de VFA, que codifica a proteína NS3. Um tforam detectadas na estrutura secundária predita doia otimizada do mRNA que codifica NS3. O númeambém pela redução do comprimento médio (5.53s mRNAs de NS3 original e otimizado. O conteúdo d50.69% e foi otimizado para 55.80%, visando aumente: Dados da autora.

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de NS1. (A) Estruturas total de 35 hélices, com o mRNA de NS1. (B) ero total de hélices foi ). (C) Distribuição do e GC do mRNA, numa

ntar a sua estabilidade e

de NS3. (A) Estruturas total de 53 hélices, com o mRNA de NS3. (B) ero total de hélices foi ). (C) Distribuição do e GC do mRNA, numa

ntar a sua estabilidade e

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Figura 21. Sítios crípticos de splicing e sítios internos de restrição da seqüência de DNA que codifica NS1.(A) Sítios preditos de splicing na seqüência de NS1 original. Um total de 5 possíveis sítios crípticos de splicing foram detectados ao longo do mRNA de NS1, onde 1 foi considerado aceptor e 4 doadores. (B) Sítios de splicingna seqüência de NS1 otimizada. O número de sítios crípticos de splicing foi reduzido para 1 doador. (C) Sítios de restrição nas seqüências original e otimizada de NS1. Sítios desejáveis foram preservados e os indesejáveis removidos manualmente na seqüência de DNA otimizada de NS1. Fonte: Dados da autora.

Figura 22. Sítios crípticos de splicing e sítios internos de restrição da seqüência de DNA que codifica NS3.(A) Sítios de splicing na seqüência de NS3 original. Um total de 12 prováveis sítios crípticos de splicing foram detectados ao longo do mRNA de NS3, onde 10 foram considerados aceptores e 2 doadores. (B) Sítios de splicing na seqüência de NS3 otimizada. O número de sítios crípticos de splicing foi reduzido para 3 doadores. (C) Sítios de restrição nas seqüências original e otimizada de NS3. Sítios desejáveis foram preservados e os indesejáveis removidos manualmente na seqüência de DNA otimizada de NS3. Fonte: Dados da autora.

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4.1.2. Otimização para expressão em bactérias

As seqüências que codificam as proteínas NS1 e NS3 foram submetidas à análise quanto ao perfil de hidrofilicidade (Kyte-Doolittle), visando à seleção das duas regiões mais hidrofílicas de cada proteína. Segundo o perfil Kyte-Doolittle, cada aminoácido possui um grau na escala de hidrofilicidade entre 4.5 (mais hidrofóbico) e -4.5 (mais hidrofílico) (Tabela 3). A análise de cada seqüência foi realizada dividindo-a em janelas de leitura (número de aminoácidos examinados) de 21 aminoácidos. O grau de hidrofilicidade correspondente à janela de leitura foi plotado em um gráfico, no qual o eixo das ordenadas representa a hidrofilicidade/hidrofobicidade, e o eixo das abscissas, o número de aminoácidos (Figura 23).

Tabela 3. Escala de Hidrofilicidade dos aminoácidos segundo o perfil Kyte-Doolittle

Aminoácido Grau de hidrofilicidade Alanina 1.8Arginina -4.5

Asparagina -3.5 Ácido Aspártico -3.5

Cisteína 2.5Glutamina -3.5

Ácido Glutâmico -3.5 Glicina -0.4

Histidina -3.2 Isoleucina 4.5 Leucina 3.8Lisina -3.9

Metionina 1.9Fenilalanina 2.8

Prolina -1.6 Serina -0.8

Treonina -0.7 Triptófano -0.9 Tirosina -1.3 Valina 4.2

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Figura 23. Domínios hidrofílicos das proteínas NS1 e NS3 selecionados pelo perfil de hidrofilicidade Kyte-Doolittle. As proteínas NS1 e NS3 de VFA foram submetidas à análise de hidrofilicidade afim de se identificar as regiões mais hidrofílicas de cada proteína. As duas regiões hidrofílicas selecionadas, de cada proteína, estão representadas pelas áreas sombreadas. Dos 352 aminoácidos (aa) da proteína NS1, foram selecionadas as regiões compreendidas entre os aminoácidos 40-160 (120aa) e 300-360 (60aa). Dos 623aa da proteína NS3, foram selecionadas as regiões entre os aminoácidos 335-475 (140aa) e 525-625 (100aa). Estas regiões selecionadas, de cada proteína, foram intercaladas por uma seqüência de aminoácidos não-imunogênica (GPGPG), antes de serem submetidas ao processo de otimização. Fonte: Adaptado pela autora.

Em seguida, os dois motivos mais hidrofílicos de cada proteína foram selecionados e intercalados por uma seqüência curta de DNA espaçador. Esta seqüência curta é traduzida em aminoácidos não-imunogênicos (GPGPG), e sua finalidade é evitar a fusão das duas regiões hidrofílicas e conseqüente formação de possíveis neo-epítopos imunogênicos. Uma vez intercaladas pelo DNA espaçador, todas as seqüências foram fusionadas aos dois sítios múltiplos de clonagem (5’ - SalI, NheI, XhoI e 3’ – EcoRI, KpnI, HindIII), para permitir a posterior construção dos vetores de expressão através da estratégia de subclonagem (Figura 24).

Figura 24. Esquema representativo das construções gênicas. Os dois motivos mais hidrofílicos das proteínas NS1 e NS3 foram intercalados por uma seqüência de DNA espaçador, afim de evitar a formação de neoepítopos imunogênicos inespecíficos. Em seguida, as construções foram flanqueadas por dois sítios múltiplos de clonagem, visando à clonagem desses fragmentos no vetor de expressão pMAL-c4X. Fonte: Adaptado pela autora.

As seqüências de DNA construídas para as proteínas NS1 e NS3 foram então otimizadas utilizando o programa LETO 1.0 (Entelechon®), visando aumentar a eficiência de

"

expressão protéica em E. colibacteriana foram realizados pcélulas humanas, e tambéflanqueadoras também foramforam enviadas para síntese co

Figura 25. Estruturas secundáriassecundárias da seqüência de mRNAcom um comprimento médio de 6.1Estruturas secundárias da seqüêncireduzido para 11, acompanhado taconteúdo de GC das seqüências do janela de 31 nt, foi detectado comoalteração. Fonte: Dados da autora.

Figura 26. Estruturas secundáriassecundárias da seqüência de mRNAum comprimento médio de 6.29, Estruturas secundárias da seqüêncireduzido para 16, acompanhado taconteúdo de GC das seqüências dojanela de 31 nt, foi detectado comoalteração. Fonte: Dados da autora.

i (Figuras 25 a 28). Os processos de otimizapelo Dr. Rafael Dhalia de maneira similar aoém encontram-se anexados à dissertação

m bloqueadas, antes da otimização, e as seqomercial (Geneart®).

s e distribuição do conteúdo de GC da seqüência dA, original de VFA, que codificam a proteína NS1. U12, foram detectadas na estrutura secundária predita dia otimizada do mRNA que codifica NS1. O númeambém pela redução do comprimento médio (5.55mRNA de NS1 original e otimizada. O conteúdo de

o 49.57% e foi otimizado para 49.22%, não sofrendo

s e distribuição do conteúdo de GC da seqüência dA, original de VFA, que codifica a proteína NS3. Um t

foram detectadas na estrutura secundária predita doia otimizada do mRNA que codifica NS3. O númeambém pela redução do comprimento médio (5.19

os mRNAs de NS3 original e otimizada. O conteúdoo 52.57% e foi otimizado para 51.91%, não sofrendo

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ação para expressão o demonstrado para o. As seqüências

qüências otimizadas

de NS1. (A) Estruturas Um total de 16 hélices, do mRNA de NS1. (B)ero total de hélices foi ). (C) Distribuição do e GC do mRNA, numa praticamente nenhuma

de NS3. (A) Estruturas total de 17 hélices, com o mRNA de NS3. (B) ero total de hélices foi 9). (C) Distribuição do o GC do mRNA, numa

praticamente nenhuma

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Figura 27. Sítios internos de restride HindIII e KpnI, presentes na seremovidos após o processo de otimencontram dentro da ORF e fazem pda autora.

Figura 28. Sítios internos de restrde EcoRI, presente na seqüência oriotimização. Os demais sítios presenda ORF e fazem parte do polylinker

4.2. Construção dos veto

4.2.1. Vetores de expressão em c

As seqüências de NSenviadas para a síntese comcomerciais. Estas seqüências seqüência completa da seqüênvetores comerciais e o p43.2 ffragmentos liberados permitiu(sem fusão com LAMP) (Fivetores foram digeridos com anas construções p43.2-NS1OPT

ição da seqüência de DNA que codifica NS1. Os sítiqüência original do gene que codifica a proteína NS

mização. Os sítios de EcoRI, XbaI e XhoI permanecparte do polylinker necessário para as estratégias de cl

rição da seqüência de DNA que codifica NS3. Um iginal do gene que codifica a proteína NS3, foi removntes na seqüência original permaneceram, uma vez qunecessário para as estratégias de clonagem. Fonte: Da

ores de expressão

células eucarióticas

S1 e NS3 otimizadas para expressão em mercial (Geneart®), foram recebidas já clo

foram subclonadas no vetor vacinal p43.2ncia que codifica o LAMP-1 humano (hLAMforam digeridos com as enzimas NheI e Kpnu a produção das construções p43.2-NS1O

gura 29). Para obter as construções fusionas enzimas XhoI e EcoRI, cuja ligação dos fT-LAMP e p43.2-NS3OPT-LAMP (Figura 30

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ios internos indesejados S1, foram naturalmente ceram, uma vez que se lonagem. Fonte: Dados

sítio interno indesejado vido após o processo de ue se encontram dentro ados da autora.

células humanas e onadas em vetores 2, o qual contém a

MP-1). Para tanto, os nI, cuja ligação dos PT e p43.2-NS3OPT

nadas à LAMP, os fragmentos resultou 0). Tais construções

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foram preparadas em larga escala, livre de endotoxinas, e armazenadas para ensaios posteriores.

Figura 29. Esquema de subclonagem das seqüências otimizadas de NS1 e NS3 no vetor p43.2, sem fusão com LAMP. Após a digestão da seqüência otimizada a partir do vetor comercial, utilizando as enzimas NheI e KpnI que flaqueiam o inserto, este fragmento foi purificado para posterior clonagem no vetor p43.2. Para tal, o vetor p43.2 também foi clivado com as respectivas enzimas (liberando LAMP), purificados e quantificados. Em seguida, o vetor p43.2 clivado foi utilizado para a ligação dos fragmentos de NS1 e NS3 otimizados (NheI e KpnI), gerando as construções p43.2-NS1OPT e p43.2-NS3 OPT. Fonte: Adaptado pela autora.

Figura 30. Esquema de subclonagem das seqüências otimizadas de NS1 e NS3 no vetor p43.2, fusionadas à LAMP. Após a digestão da seqüência otimizada a partir do vetor comercial, utilizando as enzimas XhoI e EcoRIque flaqueiam o inserto, este fragmento foi purificado para posterior clonagem no vetor p43.2. Para tal, o vetor p43.2 também foi clivado com as respectivas enzimas, purificados e quantificados. Em seguida, o vetor p43.2 clivado foi utilizado para a ligação dos fragmentos de NS1 e NS3 otimizados (XhoI e EcoRI), gerando asconstruções p43.2-NS1OPT-LAMP e p43.2-NS3OPT-LAMP, com os insertos localizados entre as regiões N e C-terminais de LAMP. Fonte: Adaptado pela autora.

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4.2.2. Vetores de expressão em bactérias

As seqüências otimizadas para expressão em E. coli, e sintetizadas pela Geneart®, também foram recebidas clonadas em vetores comerciais. Estas seqüências foram subclonadas no vetor pMAL-c4X através da digestão com as enzimas XbaI e HindIII, cuja ligação dos fragmentos apropriados resultou na produção das construções pMAL-NS1OPT e pMAL-NS3OPT (Figura 31). Os ensaios realizados com estas construções, desde a expressão protéica à produção e validação de anticorpos policlonais, foram realizados em colaboração com Isabelle Tabosa Viana (VIANA, 2009).

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Figura 31. Esquema de subclonagem das seqüências otimizadas de NS1 e NS3 no vetor pMAL-c4X. Após a digestão da seqüência otimizada a partir do vetor comercial, utilizando as enzimas XbaI e HindIII que flaqueiam o inserto, este fragmento foi purificado para posterior clonagem no vetor pMAL-c4X. Para tal, o vetor pMAL-c4X também foi clivado com as respectivas enzimas, purificados e quantificados. Em seguida, o vetor pMAL-c4X clivado foi utilizado para a ligação dos fragmentos de NS1 e NS3 otimizados (XbaI e HindIII), gerando as construções pMAL-c4X-NS1OPT e pMAL-c4X-NS3OPT, com os insertos fusionados à seqüência malE que codifica a proteína MBP. Fonte: Adaptado pela autora.

4.3. Expressão das proteínas recombinantes MBP-NS1 e MBP-NS3

As construções pMAL-NS1OPT e pMAL-NS3OPT foram utilizadas para transformar bactérias competentes, para posterior expressão das respectivas proteínas de fusão com IPTG. Amostras referentes aos tempos imediatamente antes da adição do indutor e 4 horas após a indução foram coletadas, migradas em gel de poliacrilamida e visualizadas por coloração de azul de Coomassie (Figura 32). Em paralelo, as culturas foram ressuspendidas em Tampão A, sonicadas (para liberação das proteínas citoplasmáticas), e o sobrenadante contendo o extrato protéico total foi utilizado na purificação protéica.

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Figura 32. Expressão das proteínas recombinantes MBP-NS1 e MBP-NS3. As construções pMAL-NS1OPT epMAL-NS3OPT foram utilizadas para transformar bactérias competentes, E. coli K12TB1. As bactérias transformadas foram crescidas em meio de cultura e induzidas para expressar as respectivas proteínas recombinantes, através de IPTG. Alíquotas foram coletadas antes da adição do indutor (T0) e 4 horas após sua adição (T4). Os extratos bacterianos foram fracionados em gel 12.5% de poliacrilamida e visualizados por coloração de azul de Coomassie. As bandas circuladas correspondem às proteínas recombinantes MBP-NS1 (64kDa) e MBP-NS3 (71kDa). Fonte: Dados da autora.

4.4. Purificação das proteínas de fusão MBP-NS1 e MBP- NS3

As suspensões bacterianas, contendo as proteínas de fusão otimizadas de VFA, foram aplicadas em coluna de amilose e após sucessivas lavagens com Tampão A, as proteínas recombinantes foram eluídas com o Tampão A acrescido de maltose livre (Tampão B). As amostras eluídas, coletadas, foram submetidas à migração em gel 12,5% de poliacrilamida e visualizadas com azul de Coomassie (Figura 33).

Após a purificação por cromatografia de afinidade, as proteínas recombinantes foram quantificadas a partir da comparação com uma curva de diluição padrão de Albumina Sérica Bovina – BSA. O BSA foi diluído numa escala de 1:1 de 2.0 a 0.125μg/μL. Em seguida, uma quantidade fixa de Reagente de Bradford foi adicionada a cada poço da microplaca contendo tanto as curvas de diluição do BSA, como das amostras. As amostras foram quantificadas pela comparação das absorbâncias da curva de diluição de BSA e das curvas de diluição das proteínas de interesse. Desta forma, foi determinada a concentração das proteínas MBP-NS1 e MBP- NS3, ambas com 1.0μg/μL.

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Figura 33. Purificação das proteínas de fusão MBP-NS1 e MBP-NS3. Os sedimentos bacterianos expressando as proteínas de fusão foram ressuspendidos em Tampão A, sonicados e os sobrenadantes aplicados em coluna de amilose. As proteínas recombinantes foram deslocadas da resina com Tampão A acrescido de maltose livre. Os eluatos foram coletados e migrados em gel 12.5% de poliacrilamida, sendo visualizados através de coloração com solução azul de Coomassie. As proteínas MBP-NS1 (64kDa) e MBP-NS3 (71kDa) aparecem no gel fragmentadas em quatro bandas (*), indicando que houve degradação. Ambas as proteínas foram bemexpressas, com a concentração de 1.0μg/μL. Fonte: Dados da autora.

4.5. Imunização de coelhos e avaliação da produção de anticorpos específicos contra as proteínas NS1 e NS3 de VFA, por Western-blot

As proteínas purificadas foram utilizadas para imunizar coelhos sadios em um protocolo que segue quatro pulsos de imunização, com intervalos de 15 dias entre cada pulso. Foram inoculados 100μg/pulso de cada proteína recombinante e após quatro pulsos, os coelhos foram sacrificados e os soros policlonais foram obtidos por punção cardíaca. Com a finalidade de melhorar a especificidade dos anticorpos obtidos, estes foram imunoadsorvidos, primeiramente contra a proteína MBP (para retirar os anticorpos anti-MBP), e os sobrenadantes desta adsorção foram em seguida incubados com as respectivas proteínas recombinantes que os geraram. Os anticorpos ligados às proteínas foram eluídos e titulados através de Western-blot (Figura 34). Neste ensaio, os anticorpos produzidos contra MBP-NS1 e MBP-NS3 foram capazes de reconhecer as respectivas proteínas NS1 e NS3, tanto recombinantes como nativas de VFA.

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Figura 34. Análise da sensibilidade/especificidade dos anticorpos policlonais em reconhecer tanto as proteínas recombinantes que os geraram como a proteína nativa de VFA, através de Western-blot. As proteínas recombinantes MBP-NS1 e MBP-NS3 foram diluídas para as concentrações finais de 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.5 e 0.78ng, e extratos de células 293 infectadas com VFA (Extrato Viral) foram utilizados como controle positivo. As amostras foram fracionadas por eletroforese em gel 15% de poliacrilamida, e transferidas para uma membrana de nitrocelulose para a revelação por Western-blot. Os anticorpos policlonais anti-NS1 e anti-NS3 foram utilizados na diluição de 1:500, sendo o anti-NS1 capaz de detectar a proteína recombinante que o gerou até 6.25ng, enquanto o anti-NS3 apresentou um título maior, detectando a proteína recombinante até 1.5ng. Além disso, ambos os anticorpos policlonais foram eficientes na detecção específica das respectivas proteínas nativas, presentes nos extratos virais. Fonte: Dados da autora.

4.6. Análise da expressão das construções vacinais de NS1 e NS3 em células eucarióticas

Com o intuito de avaliar a eficiência de expressão das construções p43.2-NS1OPT,p43.2-NS1OPT-LAMP, p43.2-NS3OPT e p43.2-NS3OPT-LAMP em células eucarióticas, foram realizados ensaios de Western-blot com extratos de células humanas 293, processodos 48horas após a transfecção com as referidas construções. A detecção protéica foi realizada utilizando os respectivos anticorpos policlonais. Nestes ensaios, foram utilizados extratos de células 293 transfectadas com o vetor p43.2 vazio, como controle negativo, além de extratos de 293 infectadas com VFA, como controle positivo. Os extratos protéicos foram quantificados quanto à concentração total de proteína, fracionados em gel SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose para posterior detecção protéica. Como esperado, a expressão das proteínas NS1 e NS3, nas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP, foi detectada, assim como a expressão das proteínas nativas do extrato viral. Vale ressaltar que a proteína NS3-LAMP foi expressa intensamente, em níveis similares à NS3 nativa (Figura 35).

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Figura 35. Análise da expressão das construções vacinais de NS1 e NS3 em células humanas, por Western-blot. Células 293 humanas foram transfectadas com os vetores vacinais codificando as proteínas NS1 e NS3 de VFA, afim de se avaliar a expressão protéica. Como controles, foram utilizadas células 293 transfectadas com p43.2 vazio e infectadas com VFA. Extratos protéicos, processados 48 horas após a transfecção/infecção, foram fracionados em gel 10% de poliacrilamida e transferidos para membrana de nitrocelulose para revelação por Western-blot. Os anticorpos anti-NS1 (diluição 1:250) e anti-NS3 (diluição 1:100) foram capazes de detectar as respectivas proteínas codificadas pelas construções vacinais, nas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP, assim como as proteínas nativas dos vírus. Os anticorpos policlonais também detectaram uma proteína inespecífica de aproximadamente 50kDa (*). Como controle da quantidade de extrato total, foram realizados ensaios com anti-#-actina, os quais demonstraram quantidades equivalentes dos extratos utilizados. Nos ensaios com a proteína NS1, o extrato viral foi utilizado numa concentração 5 vezes menor com relação aos demais (para evitar background), não sendo detectado no teste da actina. O marcador de peso molecular utilizado foi o MagicMark (Invitrogen®). Fonte: Dados da autora.

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4.7. Análise da localização celular das proteínas NS1 e NS3 em células eucarióticas, através de microscopia de fluorescência

A análise da expressão, e do transporte intracelular, das proteínas expressas pelas construções vacinais foi realizada através de ensaios de imunofluorescência. Células humanas 293 foram transfectadas com p43.2-NS1OPT, p43.2-NS1OPT-LAMP, p43.2-NS3OPT, p43.2-NS3OPT-LAMP e p43.2 vazio, e infectadas com VFA, sendo incubadas com os respectivos anticorpos policlonais, 48 horas após transfecção, para detecção protéica. Em ensaios prévios, observou-se que os anticorpos policlonais produzidos não detectavam eficientemente epítopos conformacionais, presentes nas células fixadas para os ensaios de imunofluorescência, apesar de detectarem bem epítopos lineares, como demonstrado por ensaios de Western-blot. Desta forma, nos ensaios de imunofluorescência, as proteínas expressas pelas construções vacinais não foram detectadas, impossibilitando a análise do tráfego intracelular das mesmas (dados não mostrados). Interessantemente, as proteínas nativas, expressas em células infectadas pelo VFA, foram detectadas pelos respectivos anticorpos, indicando que os mesmos necessitam de uma concentração protéica elevada para detecção.

Devido à impossibilidade de detecção das proteínas expressas pelos vetores vacinais, através dos anticorpos produzidos, a análise do tráfego intracelular das proteínas fusionadas à LAMP foi realizada utilizando anticorpo monoclonal anti-hLAMP. Como este anticorpo foi produzido contra o LAMP humano, optamos por utilizar células de hamster BHK-21, afim de evitar a detecção inespecífica do LAMP endógeno de células humanas. Desta forma, células BHK-21 foram transfectadas com as construções vacinais e p43.2 vazio, e infectadas com VFA. As células transfectadas/infectadas foram incubadas com anti-hLAMP, assim como com os respectivos anticorpos policlonais, utilizados como controles. Nestes ensaios, as proteínas nativas foram detectadas pelos anticorpos policlonais, as quais apresentaram uma distribuição reticular característica, enquanto as proteínas fusionadas à LAMP, detectadas pelo anti-hLAMP, apresentaram a distribuição lisossomal esperada. Esta distribuição é característica da proteína LAMP, o que demostra que o tráfego intracelular dirigido por LAMP está ocorrendo corretamente (Figura 36).

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4.8. Avaliação da resposta imune celular, induzida em camundongos imunizados com as construções p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP

Para os ensaios de imunização, as construções vacinais p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP, além do p43.2 vazio, foram preparadas em larga escala, livres de endotoxinas. As preparações obtidas foram submetidas a provas de digestão, com enzimas específicas, afim de certificar a qualidade/identidade dos vetores. Todas as digestões liberaram fragmentos de DNA no tamanho esperado (resultados não mostrados). Em seguida, as construções foram enviadas para o Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo – USP, onde foram utilizadas em testes experimentais de imunização em camundongos, realizados pelas colaboradoras Andrea Barbosa de Melo e Paula Ordonhez Rigato.

Os plasmídeos p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP foram então inoculados em camundongos BALB/c, utilizando como controle positivo a vacina de Febre Amarela 17DD e controles negativos PBS estéril e vetor p43.2 vazio. As repostas imunes, induzidas por cada construção, foram analisadas em termos de resposta celular através de ensaios de ELISPOT. Nestas análises, os esplenócitos obtidos 15 dias após as quatro imunizações foram avaliados ex vivo quanto à capacidade de produzir IFN-!, quando expostos a 14 pools de peptídeos da proteína NS1. As análises dos pools reativos foram realizadas entre os camundongos de acordo com o seguinte parâmetro: pool reativo maior que 10 Células Formadoras de Spot - SFC e maior que a média do branco + 3 vezes DesPadBranco. Para identificar os peptídeos imunogênicos individuais de NS1, os pools que apresentaram resposta nos grupos imunizados, com p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP, foram cruzados através de uma matriz para a identificação dos peptídeos mais imunogênicos. As construções vacinais p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP induziram resposta celular em 5 dos 6 camundongos BALB/c, testados em cada grupo. Através dos cruzamentos dos pools positivos, foi possível a identificação de 8 epítopos mais imunogênicos (NS193-107, NS1129-143, NS1133-147, NS1213-227,NS1217-231, NS1265-279, NS1269-283, NS1341-355) para a construção p43.2-NS1OPT e 6 epítopos (NS193-107, NS1129-143, NS1133-147, NS1213-227, NS1217-231, NS1265-279) para a construção p43.2-NS1OPT-LAMP. Apesar de uma resposta celular mais baixa, a vacina de Febre Amarela 17DD identificou 4 epítopos mais imunogênicos (NS193-107, NS1129-143, NS1133-147, NS1213-227) e induziu resposta em todos os 6 camundongos testados. Estes epítopos foram responsivos em mais de 65% dos camundongos. Os controles negativos não induziram produção significativa de IFN-! dos esplenócitos analisados (resultados não mostrados). É importante ressaltar que a resposta gerada por p43.2-NS1OPT-LAMP foi mais robusta, especialmente para os pools 7 e 12, que elicitaram uma resposta mais intensa em relação às respostas geradas pela vacina convencional e por p43.2-NS1OPT (Figura 37). Interessantemente, a imunização com p43.2-NS1OPT respondeu a um número maior de peptídeos que a imunização com p43.2-NS1OPT-LAMP, apesar da intensidade da resposta imune gerada por LAMP ter sido consideravelmente maior (Figura 38).

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Figura 37. Resposta imune celular de camundongos BALB/c contra pools de peptídeos da proteína NS1 do VFA. Camundongos BALB/c foram imunizados, via subcutânea, com o vetor p43.2 vazio e PBS (controles negativos), com a vacina de vírus atenuado 17DD (controle positivo – A) e com as construções vacinais p43.2- p43.2-NS1OPT (B) e NS1OPT-LAMP (C). A produção de IFN-! estimulada pelos pools de peptídeos da proteína NS1 foi analisada através de ensaios de ELISPOT, os quais demonstraram que as construções vacinais sãocapazes de induzir resposta celular contra os mesmos epítopos da vacina 17DD. Além disso, a resposta dirigida por LAMP foi cerca de 3 vezes mais robusta para os pools 7 e 12, quando comparada com as respostas geradas contra os mesmos pools pela vacina convencional e pela construção vacinal sem a fusão com LAMP. Fonte: Dados da autora.

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Figura 38. Epítopos imunogênicos, individuais, identificados em camundongos imunizados com as construções vacinais p43.2-NS1OPT-LAMP e p43.2-NS1OPT. Os epítopos individuais considerados imunogênicos, utilizando a matriz de pools, elicitaram uma resposta imune em mais de 65% dos camundongos imunizados. A imunização com a vacina convencional 17DD (A) identificou 4 epítopos mais imunogênicos (NS193-107, NS1129-143, NS1133-147, NS1213-227), os quais induziram resposta celular em 100% dos camundongos. A imunização com a construção vacinal p43.2-NS1OPT identificou 8 epítopos mais imunogênicos (NS193-107,NS1129-143, NS1133-147, NS1213-227, NS1217-231, NS1265-279, NS1269-283, NS1341-355), enquanto a construção p43.2-NS1OPT-LAMP identificou 6 epítopos (NS193-107, NS1129-143, NS1133-147, NS1213-227, NS1217-231, NS1265-279). Fonte: Dados da autora.

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O desenvolvimento de vacinas genéticas contra VFA faz parte de uma linha de pesquisa iniciada em 2005 no nosso laboratório (Departamento de Virologia/Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – CPqAM). Até o momento, uma formulação plasmidial codificando proteínas estruturais do VFA, fusionadas à Proteína de Associação à Membrana Lisossomal - LAMP, vem mostrando resultados bastante promissores. Esta construção vacinal foi capaz de induzir uma resposta muito intensa de linfócitos T, contra os mesmos epítopos induzidos pela vacina 17DD, porém com melhor eficiência. Também foi capaz de induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes, protegendo em 100% camundongos desafiados (intracerebralmente) com o vírus vacinal 17DD (CRUZ, 2008). No presente trabalho, propomos o desenvolvimento de vacinas de DNA codificando as proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do VFA, também fusionadas à LAMP, visando o rastreamento de construções capazes de induzir resposta imune protetora. A combinação entre a vacina de DNA baseada nas proteínas estruturais, com vacinas baseadas nas proteínas não-estruturais, provavelmente pode gerar uma formulação ainda mais robusta, a ser testada inicialmente em primatas não-humanos.

A primeira etapa de avaliação das vacinas de DNA consiste na análise da eficiência de expressão dos antígenos codificados pelas mesmas. Um grande entrave, que dificulta a análise da expressão destas vacinas, é a escassez de anticorpos comerciais contra VFA, principalmente contra as proteínas não-estruturais, pois naturalmente (com exceção de NS1) não são capazes de induzir uma produção robusta de anticorpos policlonais específicos. Desta forma, anticorpos policlonais foram produzidos (em nosso laboratório) contra as proteínas NS1 e NS3, através da expressão de seqüências hidrofílicas específicas das respectivas proteínas em E. coli, as quais foram inoculadas em coelhos para obtenção de soros policlonais, que deram suporte ao processo de validação das vacinas de DNA aqui desenvolvidas.

Embora o sistema de expressão bacteriano seja bem estabelecido e comumente utilizado para a obtenção das mais diversas proteínas de diferentes organismos, a expressão de antígenos virais em bactérias pode ser uma tarefa bastante árdua, especialmente pelo fato destes organismos utilizarem codon usages bastante divergentes (AUEWARAKUL, 2005a). Neste caso, a concentração dos tRNAs correspondentes aos códons menos utilizados por E. coli é insuficiente para a tradução eficiente do mRNA heterólogo. A presença de códons raramente utilizados por E. coli no mRNA viral resulta em interrupção prematura da tradução, mudanças no quadro de leitura do mRNA e incorporação incorreta de aminoácidos na proteína produzida (KURLAND; GALLANT, 1996). Vários grupos já vêm tentando, sem muito sucesso, expressar proteínas virais em bactérias. A expressão da ORF 2 do Circuvírus Suíno 2 em E. coli resultou em terminação prematura da cadeia polipeptídica nascente (TRUNDOVA; CELER, 2007; WU et al., 2008) e a tradução do gene preC do vírus da Hepatite B nesta bactéria está associada a mudanças para os quadros de leitura -1 e +1, com produção de quatro polipeptídeos diferentes (LAINÉ et al., 2008). Choi e colaboradores expressaram a proteína VP6 de rotavírus principalmente sob a forma de polipeptídeos truncados, com deleções em várias porções da região N-terminal (CHOI et al., 2004). Khromykh e colaboradores expressaram em E. coli as sete proteínas não-estruturais (NS1-NS5) do flavivírus Kunjin, cujos níveis de expressão foram considerados bastante baixos e apenas a proteína NS3 foi obtida com sucesso (KHROMYKH; WESTAWAY, 1997).

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O problema da divergência entre os codon usages, viral e bacteriano, pode ser suplantado através da co-expressão de genes que codificam para tRNAs raros em E. coli(KERRIGAN et al., 2008) ou pela utilização de linhagens bacterianas manipuladas geneticamente, contendo cópias extras dos genes de tRNAs raros (CARSTENS; WAESCHE, 1999). Em tais linhagens, é possível alcançar altos níveis de expressão de proteínas afetadas pelo codon usage, comparado às linhagens de E. coli não modificadas (JANKE T; BECKER, 2000; HUSSAIN; WARD, 2003; KIM; LEE, 2006; TRUNDOVA; CELER, 2007). Estas estratégias são econômicas e provavelmente mais indicadas, quando uma grande variedade de genes é expressa. Porém, a expressão protéica torna-se muito mais eficiente através da utilização de algoritmos genéticos para a síntese de seqüências compostas apenas pelos códons mais freqüentemente utilizados pela bactéria, que codificam para a mesma cadeia polipeptídica selvagem. Burgess-Brown e colaboradores compararam a expressão de 30 genes humanos de desidrogenases/redutases de cadeia curta (SDRs), selvagens e otimizados em termos de codon usage, em linhagens de E. coli comumente utilizada ou suplementada com tRNAs raros. Nesta análise, foi concluído que a otimização de códons afeta uma maior proporção de genes que a suplementação de tRNAs, além de proporcionar uma expressão mais eficiente (BURGESS-BROWN et al., 2008). Chuan e colaboradores otimizaram a proteína estrutural VP1 do poliomavírus murino, tanto em termos de codon usage como em termos de distribuição do conteúdo de GC, para expressão em E. coli. VP1 é muito pobremente expressa em sistemas procarióticos (representando 2-3% das proteínas expressas) por possuir em sua seqüência de DNA 123 dos 385 códons considerados raros em E. coli.Após a otimização, o nível de expressão desta proteína foi intensamente elevado para 180mg/litro de cultura (CHUAN; LUA; MIDDELBERG, 2008).

Grande parte dos programas disponíveis para otimização de seqüências é baseada em algoritmos genéticos desenvolvidos para aumentar a expressão protéica, apenas através da alteração de códons. Entretanto, já está bem estabelecido que outros parâmetros podem afetar a síntese protéica heteróloga, como estrutura secundária de mRNA, regiões ricas em conteúdo GC, regiões repetitivas de DNA, sítios crípticos de splicing, entre outros (GRISWOLD et al.,2003; ZHANG et al., 2006; NGUMBELA et al., 2008). Considerando a influência destes parâmetros, decidimos utilizar o algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®) na otimização de nossas seqüências virais, no qual todos os parâmetros supracitados são considerados, simultaneamente, e o balanceamento perfeito entre os mesmos permite a obtenção de altos níveis de expressão protéica.

O algoritmo genético do programa LETO 1.0 foi desenvolvido baseado nos seguintes parâmetros/publicações: codon usage (IKEMURA, 1981; ADANG et al., 1993; GOLDMANet al., 1995; KANE, 1995; DONG; NILSSON; KURLAND, 1996; HAAS; PARK; SEED, 1996; KIM; OH; LEE, 1997; ROUWENDAL et al., 1997; KOMAR et al., 1998; FUHRMANN; OERTEL; HEGEMANN, 1999; KANAYA et al., 1999; ZHOU et al., 1999; BATEMAN; PURTON, 2000; DURET, 2000; KOTSOPOULOU et al., 2000; VERVOORTet al., 2000; SLIMKO; LESTER, 2003); estrutura secundária do mRNA (LEE et al., 1987; PARKIN; CHAMORRO; VARMUS, 1992; DALLMANN; DUNN, 1994); distribuição do conteúdo GC (GALTIER et al., 2001; AUEWARAKUL, 2005b; SEMON; MOUCHIROUD; DURET, 2005; VINOGRADOV, 2005; NAVARRE et al., 2006); seqüências longas repetitivas e motivos repetitivos de DNA (OXENDER; ZURAWSKI; YANOFSKY, 1979; WEISS, 1991; DEL TITO et al., 1995; GURVICH et al., 2005); sítios crípticos de splicing(SALZBERG et al., 1999; MAJOROS et al., 2003).

É importante salientar que a maioria dos algoritmos genéticos desenvolvidos utiliza apenas o códon mais freqüentemente utilizado pelo hospedeiro, para substituir os códons raros

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na seqüência de DNA. Como exemplo, durante a otimização para expressão em E. coli, todos os códons de alanina presentes na seqüência a ser expressa são substituídos apenas pelo códon GCG, preferencialmente utilizado pela bactéria (31%). Porém, a utilização exclusiva deste códon pode, além de ocasionar o esgotamento/depleção da população de tRNAs que possuem o respectivo anticódon para GCG, subutilizar os demais tRNAs disponíveis na maquinaria de expressão de E. coli (para GCU, GCC e GCA – totalizando 69% dos tRNAs disponíveis para alanina). Para evitar a terminação precoce na expressão de uma determinada proteína, devido à escolha do códon mais freqüentemente utilizado e conseqüente depleção do respectivo tRNA durante a síntese protéica, o algoritmo do programa LETO 1.0 utiliza dois ou mais códons freqüentes, evitando apenas os códons raros. Este programa também detecta sítios crípticos de splicing, mas este parâmetro não é utilizado na expressão em bactérias, visto que as mesmas não possuem a maquinaria necessária para realizar splicing. Por outro lado, esta ferramenta é de fundamental importância para a otimização de seqüências para expressão em sistemas eucarióticos, como em células humanas, por exemplo.

As seqüências selecionadas para expressão em E. coli correspondem às duas regiões mais hidrofílicas das proteínas NS1 e NS3, intercaladas por uma seqüência de DNA espaçadora e flanqueadas por dois sítios múltiplos de clonagem. Após a otimização através do programa LETO 1.0 e síntese comercial (Geneart®), as mesmas foram subclonadas no vetor pMAL-c4X (New England Biolabs®) e os vetores obtidos foram utilizados na transformação de E. coli para posterior indução da expressão das respectivas proteínas de fusão com Maltose Binding Protein – MBP. As proteínas induzidas apresentaram altos níveis de expressão, com rendimento em torno de 100mg/litro de cultura para cada proteína. Apesar de Chuan e colaboradores terem alcançado um rendimento maior, 180mg/litro da proteína VP1 otimizada do poliomavírus murino (CHUAN; LUA; MIDDELBERG, 2008), o nosso rendimento (100mg/litro) foi considerado significativamente maior do que os obtidos por Oliveira e colaboradores para a expressão das proteínas otimizadas de Dengue: NS1 (42mg/litro), DENV1 (6.6mg/litro), DENV2 (21.5mg/litro), DENV3 (15mg/litro) e DENV4 (2.5mg/litro) [dados não publicados – apresentados no XIX Congresso Nacional de Virologia - 2008].

Para obtenção dos anticorpos policlonais específicos, as proteínas MBP-NS1OPT e MBP-NS3OPT foram purificadas por cromatografia de afinidade e inoculadas em coelhos. Os soros policlonais obtidos foram avaliados, quanto à sensibilidade e especificidade, em ensaios de Western-blot, onde os anticorpos foram capazes de reconhecer as proteínas recombinantes utilizadas para induzir a sua produção, assim como as respectivas proteínas nativas, expressas pelo VFA em células humanas. Nestes ensaios, o anticorpo anti-NS3 apresentou um título maior que o anti-NS1, com limite de detecção até 1,5ng da proteína recombinante (anti-NS1 reconheceu até 6,25ng da proteína). Os anticorpos produzidos foram de fundamental importância para a validação das vacinas de DNA propostas neste trabalho, sendo utilizados em ensaios de Western-blot e imunofluorescência. Os antígenos e soros gerados neste trabalho, referentes às proteínas NS1 e NS3 de VFA, estão sendo utilizados no desenvolvimento de kits de diagnóstico nacionais, baseados em ensaios de microaranjos líquidos, como parte da dissertação de Mestrado de Isabelle Freire Tabosa Viana, vinculada ao “Instituto Nacional de Inovação em Diagnósticos para a Saúde Pública – INDI/Saúde”, recentemente aprovado pelo CNPq e coordenado pelo Dr. Samuel Goldenberg.

Semelhante ao que ocorre em sistemas bacterianos, a expressão de antígenos virais em células eucarióticas também pode ser ineficiente. Esta ineficácia pode estar relacionada, em grande parte, à ineficiência de tradução devido aos parâmetros supracitados, como diferenças

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no conteúdo GC, sítios crípticos de splicing, estruturas secundárias do mRNA e, especialmente, à divergências no codon usage. No contexto das vacinas de DNA, os níveis de expressão antigênica influenciam a imunogenicidade vacinal (MEGATI et al., 2008). A literatura contém diversos exemplos de antígenos derivados de organismos variados, que estimulam a resposta imune em diferentes modelos animais, porém geralmente são incapazes de induzir uma resposta imune robusta (DEML et al., 2001; NARUM et al., 2001; STRATFORD et al., 2001; ARREGUI; JUÁREZ; HAUSEN, 2003). De fato, até em modelos murinos, tem sido sugerido que a quantidade de proteína expressa pelas construções vacinais é um limitante da resposta imune (MEGATI et al., 2008). Conseqüentemente, a maximização da expressão antigênica através da otimização de seqüências é uma estratégia promissora para a melhora das respostas imunes induzidas pelas vacinas de DNA.

Vários estudos têm demonstrado que a otimização das vacinas de DNA, apenas com relação ao codon usage, resulta em aumento da eficácia vacinal. Como exemplos, a otimização dos genes codificantes para o antígeno Ag85B de micobactérias (KO et al., 2005), gag-pol e gp160 de HIV (KOTSOPOULOU et al., 2000; MEGATI et al., 2008) e capsídeo e envelope do vírus Chikungunya (MUTHUMANI et al., 2008) resultou em aumento substancial da expressão protéica por células eucarióticas e indução de respostas imunes celular e humoral mais robustas em camundongos, comparadas às respostas geradas pelas construções vacinais não-otimizadas. Além disso, sugere-se que o conteúdo GC maior, obtido através da otimização de codon usage de acordo com células humanas, pode apresentar um efeito adjuvante, contribuindo para uma maior resposta imune (ANDRE et al., 1998; QIU et al., 1999).

A utilização de antígenos quiméricos, fusionados à LAMP, faz parte de mais uma estratégia para incrementar a imunogenicidade das vacinas de DNA in vivo. Existem diversos meios de promover uma melhor resposta imune de vacinas genéticas, através da manipulação ou alteração da localização intracelular dos seus antígenos. Alguns estudos indicam que o direcionamento do antígeno vacinal para a secreção extracelular, ou sua inserção na membrana citoplasmática, pode aumentar o cross-priming (SHEN; ROCK, 2004; ESPINO et al., 2005). Por outro lado, o direcionamento do antígeno diretamente para a via de processamento do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) de classe I, visando aumentar a apresentação dos epítopos imunogênicos na superfície celular em associação com o MHCI, está sendo avaliado quanto à capacidade de induzir uma maior resposta imune celular (LEACHMAN et al., 2002; WONG et al., 2004; BINS et al., 2007). Porém, o direcionamento dos antígenos para compartimentos endossomais/lisossomais via LAMP, aumentando a apresentação dos epítopos imunogênicos pelo MHC de classe II, parece ser a estratégia mais promissora, visto que estas moléculas são responsáveis pela ativação de linfócitos T CD4+ (RAVIPRAKASH et al., 2001; DONNELLY; BERRY; ULMER, 2003). Estes linfócitos, por sua vez, são importantes para sustentar a resposta celular de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança de classe de anticorpos e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos, o que torna a resposta imune induzida por antígenos fusionados a LAMP mais abrangente e eficaz (ROCHA; TANCHOT, 2004).

Como parte do processo de validação das construções vacinais contendo as seqüências otimizadas de NS1 e NS3, fusionadas e não-fusionadas à LAMP, a eficiência de expressão das respectivas proteínas em células eucarióticas foi analisada. Para tanto, as construções p43.2-NS1OPT, p43.2-NS1OPT-LAMP, p43.2-NS3OPT e p43.2-NS3OPT-LAMP foram utilizadas na transfecção de células humanas e submetidas a ensaios de Western-blot, utilizando os anticorpos policlonais previamente produzidos. Nestes ensaios, os anticorpos contra NS1 e

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NS3 detectaram a expressão eficiente dos antígenos vacinais, embora NS3-LAMP tenha sido expressa com uma eficiência significativamente melhor que NS1-LAMP. Resultados adicionais obtidos em nosso laboratório, referentes à expressão de genes otimizados de outros vírus como Febre do Oeste do Nilo e HIV, indicam que estas divergências quanto ao nível de expressão parecem estar relacionadas à própria seqüência de DNA a ser otimizada. Infelizmente, ambos os anticorpos policlonais produzidos detectaram uma mesma proteína inespecífica de aproximadamente 50kDa, em extratos de células 293 humanas. Curiosamente, Krishna e colaboradores produziram anticorpos policlonais contra a proteína NS1 do vírus da Encefalite Japonesa, através da imunização de coelhos com a proteína expressa em E. coli, e semelhantemente aos nossos resultados este anticorpo detectou uma proteína inespecífica, de aproximadamente 68kDa, em ensaios de Western-blot com extratos de células 293, BHK-21, Vero e CV-1 (KRISHNA; RANGAPPA; SATCHIDANANDAM, 2009). A detecção de uma banda inespecífica, pelos anticorpos policlonais contra as proteínas não-estruturais, indica a presença de alguma(s) proteína(s) presente(s) nas células eucarióticas, cuja estrutura apresente um grau de similaridade significativo em relação às proteínas virais não-estruturais.

Confirmada a expressão das proteínas codificadas pelas construções vacinais, partimos para a análise do transporte intracelular mediado por LAMP. Diversos autores que trabalham com vacinas de DNA contra flavivírus, utilizando a estratégia de co-expressão das proteínas membrana (M) e envelope (E) fusionadas à LAMP, já demonstraram o eficiente tráfego intracelular de seus antígenos. Raviprakash e colaboradores (RAVIPRAKASH et al., 2001) foram os primeiros a avaliar esta estratégia em termos de localização, utilizando o sorotipo 2 de Dengue como modelo. A expressão e a localização intracelular dos antígenos E e E/LAMP de Dengue foram comparados com a do LAMP endógeno, através de microscopia de fluorescência e confocal. As imagens obtidas demonstraram a co-localização dos antígenos E/LAMP com a membrana lisossomal em células NIH3T3 transfectadas, as quais apresentaram uma distribuição protéica pontuada, correspondente aos corpúsculos lisossomais. Em seguida, Lu e colaboradores (LU et al., 2003) confirmaram a distribuição lisossomal de E/LAMP e demonstraram sua co-localização de MHCII e moléculas de LAMP, também através de microscopia de fluorescência e confocal. Anwars e colaboradores (ANWAR et al., 2005) utilizaram a estratégia de co-expressão M-E/LAMP para desenvolver uma vacina de DNA contra o vírus da Febre do Oeste do Nilo. Assim como os trabalhos prévios, os ensaios de microscopia confocal demonstraram a co-localização intracelular de E/LAMP com LAMP endógeno, MHCII e moléculas H-2M, sendo estas últimas intimamente relacionadas com a apresentação antigênica. A construção vacinal produzida pelo nosso grupo de pesquisa, que também utiliza a co-expressão M-E do VFA fusionada à LAMP, foi detectada em corpúsculos lisossomais por ensaios de imunofluorescência. Em contrapartida, a construção M-E, sem fusão com LAMP, foi detectada ao longo da membrana reticular (CRUZ, 2008).

Neste trabalho, não foi possível demonstrar a diferença do tráfego intracelular entre as proteínas fusionadas e não-fusionadas a LAMP, visto que as proteínas NS1 e NS3 sem fusão com LAMP não foram detectadas nos ensaios de imunofluorescência pelos respectivos anticorpos policlonais. Por outro lado, a comparação entre as localizações das proteínas nativas (expressas pelo VFA) e fusionadas à LAMP (codificadas pelas construções vacinais) permitiu a demonstração do eficiente tráfego intracelular, com ambas as proteínas localizadas em compartimentos celulares característicos: NS1 e NS3 nativas ao longo da membrana reticular, NS1-LAMP e NS3-LAMP associadas a corpúsculos lisossomais. A ineficiência dos anticorpos policlonais produzidos contra NS1 e NS3 em detectar as respectivas proteínas codificadas pelas construções vacinais, nos ensaios de imunofluorescência, parece ser

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conseqüência do próprio processo de produção dos anticorpos. É provável que a imunização de coelhos com proteínas desnaturadas tenha induzido prioritariamente anticorpos contra epítopos lineares, como demonstrado pela eficiente detecção protéica nos ensaios de Western-blot. Por outro lado, apesar da ineficiência dos anticorpos policlonais quanto ao reconhecimento de epítopos conformacionais, os mesmos podem ser detectados em altas concentrações protéicas, como nas células infectadas com VFA. Desta forma, a imunização de coelhos com proteínas não-desnaturadas pode ser uma alternativa para a obtenção de anticorpos capazes de reconhecer epítopos conformacionais com uma maior sensibilidade, podendo ser utilizados em ensaios de imunofluorescência.

As análises de expressão e transporte validaram a funcionalidade das construções vacinais obtidas neste trabalho. Com o intuito de validar a imunogenicidade in vivo destas construções, os vetores p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP foram enviados para o Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo – USP, para a imunização de camundongos BALB/c. Através da técnica de ELISPOT, foram mapeados os epítopos de linfócitos T induzidos pelas vacinas de DNA, comparando com os epítopos de linfócitos T induzidos pela vacina 17DD. Surpreendentemente, as vacinas de DNA contra NS1 são capazes de induzir resposta celular contra o mesmo repertório de epítopos induzidos pela vacina 17DD, com uma resposta imune de maior intensidade para a vacina p43.2-NS1OPT-LAMP. O mesmo padrão de resposta celular foi encontrado para a vacina de DNA codificando prM/M-E do VFA (CRUZ, 2008), o que corrobora com diversos trabalhos de desenvolvimento de vacinas de DNA que utilizam antígenos fusionados a LAMP como estratégia para aumentar a imunogenicidade vacinal (RAVIPRAKASH et al., 2001; SU et al.,2002; LU et al., 2003; MARQUES et al., 2003; CHIKHLIKAR et al., 2004; DE ARRUDA et al., 2004; ANWAR et al., 2005; ARRUDA et al., 2006; CHIKHLIKAR et al., 2006; GUPTAet al., 2006; VALENTIN et al., 2009). Nos ensaios de ELISPOT, observamos que dentre os epítopos induzidos pelas construções vacinais, o epítopo NS1265-279 [correspondente ao epítopo imunodominante de linfócitos T CD8+ (NS1265-273) induzido em camundongos, após imunização com vacina de DNA codificando NS1 do vírus da Dengue (GAO G. et al., 2008)] presente nos pools 7 e 12 apresentou a maior resposta celular induzida tanto pelas construções vacinais quanto pela vacina convencional. Portanto, baseando-se nestes dados, a resposta imune celular dirigida contra a proteína NS1 parece ser conservada nos flavivírus.

Ainda com relação à imunogenicidade das vacinas de DNA, estudos relacionados a imunizações de camundongos com construções vacinais codificando antígenos de flavivírus fusionados à LAMP, demonstraram uma forte indução de resposta imune humoral, com produção de anticorpos neutralizantes e memória imunológica (RAVIPRAKASH et al., 2001; LU et al., 2003; ANWAR et al., 2005). Da mesma forma, a construção vacinal (previamente produzida pelo nosso grupo) codificando M-E fusionada à LAMP, induziu altos títulos de anticorpos neutralizantes, que conferiram proteção a 100% dos camundongos desafiados intracerebralmente com o vírus 17DD (CRUZ, 2008). A resposta imune humoral desenvolvida nos camundongos imunizados com as construções vacinais p43.2-NS1OPT e p43.2-NS1OPT-LAMP, será ainda avaliada quanto a presença de anticorpos neutralizantes, através de testes de neutralização e redução de placas (PRNT) utilizando os soros coletados ao longo do processo de imunização. Estes soros também serão avaliados através de ensaios de monocamada, no intuito de avaliar a capacidade dos anticorpos induzidos pelas construções vacinais em reduzir a proliferação viral por meio da lise de células infectadas, atividade demonstrada por Krishna e colaboradores em anticorpos produzidos contra NS1 de pacientes infectados com o vírus da Encefalite Japonesa (KRISHNA; RANGAPPA; SATCHIDANANDAM, 2009). Além disso, testes experimentais de imunização de

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camundongos também serão realizados com as construções vacinais da proteína NS3, cuja resposta imunológica será avaliada através dos mesmos ensaios supracitados.

Neste trabalho nós descrevemos a utilização simultânea das estratégias de otimização gênica e direcionamento antigênico para o MHCII como formulação de vacinas de DNA, visando o aumento de sua atividade imunogênica. Os resultados obtidos revelaram a funcionalidade desta formulação in vivo, indicando este protótipo vacinal como modelo complementar para elaboração de vacinas genéticas contra outros flavivírus de importância médica, como os vírus causadores da Encefalite Japonesa, Febre do Oeste do Nilo e Dengue. Caso os ensaios futuros revelem uma eficiente indução da resposta imune celular da construção p43.2-NS3OPT-LAMP, assim como o desenvolvimento de resposta humoral adequada contra p43.2-NS1OPT-LAMP e p43.2-NS3OPT-LAMP, estes resultados serão compilados aos obtidos previamente pelas construções codificando proteínas estruturais, com o intuito de formular uma vacina de DNA quimérica capaz de neutralizar ainda mais eficientemente a infecção em primatas por VFA.

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66.. CCoonncclluussõõeess

Os antígenos fusionados a LAMP, codificados pelas construções vacinais obtidas neste trabalho, apresentaram eficiente expressão em células eucarióticas e tráfego intracelular apropriado, com direcionamento para compartimentos celulares associados ao processamento antigênico via MHCII. Como esperado, a imunização de camundongos com a construção p43.2-NS1OPT-LAMP desenvolveu uma resposta celular mais robusta, quando comparada a imunizações com a construção p43.2-NS1OPT e com a vacina convencional 17DD. Portanto, as tecnologias utilizadas para otimizar a expressão antigênica e induzir sua apresentação pela via MHCII, utilizando LAMP como proteína de fusão foram eficientes no aumento da imunogenicidade de vacinas de DNA, podendo contribuir para o aprimoramento de todas as vacinas de DNA em desenvolvimento.

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88.. AAnneexxooss

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!

8.1. Relatório da otimização do gene NS1 para expressão em células humanas

Page 1

Optimization report

Optimization reportCreated with Leto 1.0

1 General Information:

1.1 Sequence

Below the original sequence and optimized sequence are listed, labelled with 'Org:' and 'Opt:' respectively.

Where both are identical, the original sequence contains dots instead of nucleotides ('.'). Where the original

sequence was locked against editing, it contains underscores ('_'). The names of the restriction enzymes start

at the first nucleotide after the restriction cut in the forward strand.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

ORF: M S R L E V F L S L G

Org: _____ _____ _____ __ ___ ___ ___ ___ ___ ..G ..T T.. TCT ..A ..A

Opt: GTCGA CGCTA GCAAG AA ATG TCT AGA CTC GAG GTC TTC CTG AGC CTC GGG

SalI NheI XbaI XhoI

55 60 65 70 75 80 85 90 95

ORF: V G A D Q G C A I N F G K R E L

Org: ..T ..G ... ..T ..A ..A ..C ... ... ... ... ..C ..G A.A ..G C.C

Opt: GTG GGT GCG GAC CAG GGG TGT GCC ATC AAC TTT GGG AAA CGG GAA TTG

100 105 110 115 120 125 130 135 140 145

ORF: K C G D G I F I F R D S D D W L

Org: ... ..C ..A ..T ..T ... ... ... ..T ..A ... TCT ..T ..C ... ..G

Opt: AAG TGT GGC GAC GGC ATC TTC ATA TTC AGG GAC AGC GAC GAT TGG CTT

Gene: YF_NS1Optimization requested by: With restriction sites included

Date: Sep 25, 2007Operator: Dhalia

Target organism: Homo sapiens_Cut_off_50%Optimization iteration: 1

Length: 1238 bp

Page 2

Optimization report

150 155 160 165 170 175 180 185 190

ORF: N K Y S Y Y P E D P V K L A S I

Org: ... ... ..C TCA ... ... ..A ... ..T ... ..G ... ..T ..A ..A ..A

Opt: AAC AAG TAT AGC TAC TAT CCG GAA GAC CCT GTC AAG CTG GCT TCT ATT

BspEI

195 200 205 210 215 220 225 230 235 240

ORF: V K A S F E E G K C G L N S V D

Org: ..G ..A ..C TC. ..T ..A ..A ..G ... ..T ..C ..A ..T ... ..T ...

Opt: GTT AAG GCA AGT TTC GAG GAG GGC AAG TGC GGT CTG AAC TCA GTG GAC

245 250 255 260 265 270 275 280 285 290

ORF: S L E H E M W R S R A D E I N A

Org: ... ..T ... ..T ..G ... ... ... AG. ... ..A ..T ... ... ..T ...

Opt: TCC CTG GAG CAC GAA ATG TGG AGA TCC AGG GCT GAC GAG ATC AAC GCC

295 300 305 310 315 320 325 330 335

ORF: I F E E N E V D I S V V V Q D P

Org: ..T ... ..G ... ... ... ..G ... ..T ..T ... ..C ... ... ..T ...

Opt: ATC TTT GAA GAA AAC GAG GTT GAC ATA TCA GTT GTG GTG CAG GAC CCA

340 345 350 355 360 365 370 375 380 385

ORF: K N V Y Q R G T H P F S R I R D

Org: ... ..T ..T ..C ..G ... ..A ..T ..T ..A ..T ... ... ..T C.. ...

Opt: AAG AAC GTG TAT CAA AGA GGG ACC CAC CCG TTC TCC AGA ATC AGG GAT

390 395 400 405 410 415 420 425 430

ORF: G L Q Y G W K T W G K N L V F S

Org: ..T ... ... ..T ... ... ..G ..T ... ..T ... ... ..T ... ..C ..C

Opt: GGG CTG CAG TAC GGT TGG AAA ACC TGG GGA AAG AAC CTG GTG TTT TCT

PstI

435 440 445 450 455 460 465 470 475 480

ORF: P G R K N G S F I I D G K S R K

Org: ..A ..G ... ... ..T ... ..C ... ..C ..A ..T ... ... TCC A.G ...

Opt: CCT GGC AGG AAG AAC GGA AGT TTC ATT ATC GAC GGA AAG AGT CGA AAA

485 490 495 500 505 510 515 520 525 530

ORF: E C P F S N R V W N S F Q I E E

Org: ..A ..C ..G ... TCA ..C C.G ..C ... ... TC. ... ... ..A ... ...

Opt: GAG TGT CCC TTT AGC AAT AGA GTT TGG AAT AGT TTC CAG ATC GAG GAG

Page 3

Optimization report

535 540 545 550 555 560 565 570 575

ORF: F G T G V F T T R V Y M D A V F

Org: ..T ..G ..G ..A ... ..C ..C ..A ..C ... ... ... ..C ... ..C ...

Opt: TTC GGA ACC GGG GTG TTT ACT ACC CGT GTG TAC ATG GAT GCA GTG TTT

BsrGI

580 585 590 595 600 605 610 615 620 625

ORF: E Y T I D C D G S I L G A A V N

Org: ... ... ..C ... ..C ..C ..T ..A ..T ..C T.. ..T ... ..G ..G ..C

Opt: GAA TAC ACA ATA GAT TGT GAC GGC TCA ATA CTG GGC GCA GCC GTC AAT

630 635 640 645 650 655 660 665 670

ORF: G K K S A H G S P T F W M G S H

Org: ... ..A ..G AGT ..C ..T ... ..T ..A ..A ..T ... ... ..A AGT ..T

Opt: GGA AAG AAA TCC GCA CAC GGC TCC CCG ACT TTC TGG ATG GGG TCC CAC

675 680 685 690 695 700 705 710 715 720

ORF: E V N G T W M I H T L E A L D Y

Org: ... ..A ... ..G ..A ... ... ..C ... ..C T.. ... ..A T.A ... ...

Opt: GAA GTC AAT GGT ACT TGG ATG ATA CAC ACA CTG GAG GCC CTC GAT TAC

725 730 735 740 745 750 755 760 765 770

ORF: K E C E W P L T H T I G T S V E

Org: ..G ... ..T ... ... ..A ... ..A ..T ..G ... ..A ..A TCA ..T ...

Opt: AAA GAG TGC GAG TGG CCT CTG ACT CAC ACA ATT GGC ACG AGC GTG GAA

MfeI BssSI

775 780 785 790 795 800 805 810 815

ORF: E S E M F M P R S I G G P V S S

Org: ..G AGT ..A ... ... ... ..G A.. TCA ... ..A ..C ... ..T ... ..T

Opt: GAA TCA GAG ATG TTC ATG CCT CGA AGT ATC GGC GGG CCA GTG AGC TCC

SacI

820 825 830 835 840 845 850 855 860 865

ORF: H N H I P G Y K V Q T N G P W M

Org: ... ... ..T ..C ..T ..A ... ..G ..T ... ..G ... ..A ... ... ...

Opt: CAC AAT CAC ATT CCA GGC TAC AAA GTG CAG ACT AAC GGC CCT TGG ATG

870 875 880 885 890 895 900 905 910

ORF: Q V P L E V K R E A C P G T S V

Org: ... ..A ..A ..A ... ... ..G A.A ..A ... ... ..A ..G ..T AG. ...

Opt: CAG GTC CCC CTG GAA GTG AAA CGG GAG GCT TGC CCC GGA ACG TCC GTG

BclI

Page 4

Optimization report

915 920 925 930 935 940 945 950 955 960

ORF: I I D G N C D G R G K S T R S T

Org: ... ... ..T ..C ... ..T ..T ..A C.. ... ..A TCA ... ..A TCC ..C

Opt: ATC ATT GAC GGA AAC TGC GAC GGG AGG GGA AAG AGC ACC AGG AGT ACA

965 970 975 980 985 990 995 1000 1005 1010

ORF: T D S G K V I P E W C C R S C T

Org: ..G ... AGC ..G ..A ... ... ..T ..A ... ... ... ..C TCC ... ..A

Opt: ACC GAT TCT GGT AAG GTT ATT CCC GAG TGG TGT TGC CGA AGT TGC ACG

1015 1020 1025 1030 1035 1040 1045 1050 1055

ORF: M P P V S F H G S D G C W Y P M

Org: ... ..G ..T ..G ... ..C ..T ..T ..T ..T ..G ..T ... ... ..C ...

Opt: ATG CCA CCA GTT AGC TTT CAC GGC AGC GAC GGC TGC TGG TAT CCT ATG

1060 1065 1070 1075 1080 1085 1090 1095 1100 1105

ORF: E I R P R K T H E S H L V R S W

Org: ..A ..T ... ... A.G ... ..G ..T ..A AGC ..T ..G ... C.C ..C ...

Opt: GAG ATC AGG CCA CGC AAA ACA CAC GAG TCA CAC CTT GTG AGG TCT TGG

BssSI

1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145 1150

ORF: V T A G E I H A V P F G L V S M

Org: ... ..A ..T ..A ..A ... ..T ..T ..C ..T ... ..T T.G ... ... ...

Opt: GTT ACC GCC GGG GAG ATA CAC GCA GTG CCC TTT GGA CTC GTG AGC ATG

BssSI

1155 1160 1165 1170 1175 1180 1185 1190 1195 1200

ORF: M I A M E V V L R K R Q G P K Q

Org: ... ..A ..A ... ... ..G ..C ..A A.. ..A A.A ... ... ..A ..G ...

Opt: ATG ATT GCC ATG GAA GTC GTG CTG CGG AAG CGT CAG GGA CCC AAA CAA

NcoI

1205 1210 1215 1220 1225 1230 1235

ORF: M L V G E F !

Org: ... C.. ..T ..A ___ ___ ___ _____ _____ _____

Opt: ATG TTG GTC GGT GAA TTC TGA TAAGG TACCA AGCTT

EcoRI KpnI HindIII

Acc65I

Page 5

Optimization report

1.1.1 Restriction table

1.1.2 Enzymes that cut five or fewer times

1.1.3 Enzymes that do not cut

AatII, AclI, AfeI, AflII, AgeI, ApaI, ApaLI, AscI, AseI, AsiSI, AvrII, BamHI, BbeI, BbvCI, BfrBI, BglII, BsiWI,

BspHI, BsrBI, BssHII, BstBI, BstZ17I, ClaI, DraI, EagI, EcoRV, FseI, FspI, HpaI, KasI, MluI, MscI, NaeI, NarI,

NdeI, NgoMIV, NotI, NruI, NsiI, PacI, PciI, PmeI, PmlI, PsiI, PspOMI, PvuI, PvuII, SacII, SbfI, ScaI, SfoI, SmaI,

SnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, StuI, SwaI, XmaI, ZraI

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 1226BclI t'gatc_a 1 912BspEI t'ccgg_a 1 163BsrGI t'gtac_a 1 558BssSI c'acga_g 3 757, 1079, 1142EcoRI g'aatt_c 1 1214HindIII a'agct_t 1 1232KpnI g_gtac'c 1 1226MfeI c'aatt_g 1 750NcoI c'catg_g 1 1161NheI g'ctag_c 1 6PstI c_tgca'g 1 389SacI g_agct'c 1 811SalI g'tcga_c 1 0XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 1226BclI t'gatc_a 1 912BspEI t'ccgg_a 1 163BsrGI t'gtac_a 1 558BssSI c'acga_g 3 757, 1079, 1142EcoRI g'aatt_c 1 1214HindIII a'agct_t 1 1232KpnI g_gtac'c 1 1226MfeI c'aatt_g 1 750NcoI c'catg_g 1 1161NheI g'ctag_c 1 6PstI c_tgca'g 1 389SacI g_agct'c 1 811SalI g'tcga_c 1 0XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26

Page 6

Optimization report

1.2 Dotplot

1.3 ORFs

The gene was optimized using the following ORF(s). Please note that sequence positions are given relative to

the continuous DNA sequence defined by all ORFs:

ORF: 18-1223

2 Optimized parameters

2.1 Codon tandem repeats

Number of codon tandem repeats:

Original sequence: 3

Optimized sequence: 7

Position Number of repeats[192] 2[279] 2[306] 2[507] 2[750] 2[996] 2[1134] 2

Page 7

Optimization report

2.2 Codon Usage

This is a comparison of the codon frequency of the original sequence vs. the optimized sequence. As a

reference, the codon usage of the target organism is included. The charts indicate the sum of the deviation

from the target codon usage, for the original and the optimized sequence. Lower bars indicate a better match

with the target codon usage.

2.2.1 A - Alanine:

2.2.2 C - Cysteine:

2.2.3 D - Aspartic acid:

2.2.4 E - Glutamic acid:

2.2.5 F - Phenylalanine:

CodonGCUGCCGCAGCG

Original20.0 %26.7 %40.0 %13.3 %

Target26.0 %40.0 %22.0 %12.0 %

Optimized20.0 %40.0 %33.3 %6.7 %

0

50

100

CodonUGUUGC

Original41.7 %58.3 %

Target45.0 %55.0 %

Optimized41.7 %58.3 %

0

50

100

CodonGAUGAC

Original70.0 %30.0 %

Target46.0 %54.0 %

Optimized30.0 %70.0 %

0

50

100

CodonGAAGAG

Original56.7 %43.3 %

Target42.0 %58.0 %

Optimized40.0 %60.0 %

0

50

100

CodonUUUUUC

Original57.9 %42.1 %

Target46.0 %54.0 %

Optimized42.1 %57.9 %

0

50

100

Page 8

Optimization report

2.2.6 G - Glycine:

2.2.7 H - Histidine:

2.2.8 I - Isoleucine:

2.2.9 K - Lysine:

2.2.10 L - Leucine:

2.2.11 M - Methionine:

CodonGGUGGCGGAGGG

Original17.9 %12.8 %48.7 %20.5 %

Target16.0 %33.0 %25.0 %26.0 %

Optimized15.4 %33.3 %25.6 %25.6 %

0

50

100

CodonCAUCAC

Original83.3 %16.7 %

Target41.0 %59.0 %

Optimized0.0 %

100.0 %

0

50

100

CodonAUUAUCAUA

Original30.4 %39.1 %30.4 %

Target35.0 %47.0 %18.0 %

Optimized30.4 %43.5 %26.1 %

0

50

100

CodonAAAAAG

Original31.8 %68.2 %

Target43.0 %57.0 %

Optimized40.9 %59.1 %

0

50

100

CodonUUAUUGCUUCUCCUACUG

Original5.3 %

21.1 %15.8 %10.5 %21.1 %26.3 %

Target0.0 %

12.0 %13.0 %19.0 %0.0 %

56.0 %

Optimized0.0 %

10.5 %10.5 %21.1 %0.0 %

57.9 % 0

50

100

CodonAUG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

Page 9

Optimization report

2.2.12 N - Asparagine:

2.2.13 P - Proline:

2.2.14 Q - Glutamine:

2.2.15 R - Arginine:

2.2.16 S - Serine:

2.2.17 T - Threonine:

CodonAAUAAC

Original46.7 %53.3 %

Target46.0 %54.0 %

Optimized33.3 %66.7 %

0

50

100

CodonCCUCCCCCACCG

Original28.6 %4.8 %

52.4 %14.3 %

Target28.0 %32.0 %27.0 %13.0 %

Optimized28.6 %28.6 %28.6 %14.3 %

0

50

100

CodonCAACAG

Original22.2 %77.8 %

Target26.0 %74.0 %

Optimized22.2 %77.8 %

0

50

100

CodonCGUCGCCGACGGAGAAGG

Original0.0 %

13.6 %0.0 %

13.6 %45.5 %27.3 %

Target8.0 %

18.0 %10.0 %20.0 %21.0 %23.0 %

Optimized9.1 %4.5 %

13.6 %13.6 %22.7 %36.4 % 0

50

100

CodonUCUUCCUCAUCGAGUAGC

Original25.7 %20.0 %20.0 %0.0 %

11.4 %22.9 %

Target18.0 %21.0 %15.0 %0.0 %

14.0 %32.0 %

Optimized14.3 %22.9 %14.3 %0.0 %

20.0 %28.6 % 0

50

100

CodonACUACCACAACG

Original15.0 %25.0 %35.0 %25.0 %

Target24.0 %35.0 %28.0 %13.0 %

Optimized25.0 %35.0 %25.0 %15.0 %

0

50

100

Page 10

Optimization report

2.2.18 V - Valine:

2.2.19 W - Tryptophan:

2.2.20 Y - Tyrosine:

2.2.21 ! - Stop:

2.3 Secondary structure

In general, an extended secondary structure of the mRNA can interfere with the translation process.

Therefore, the gene optimization tries to reduce the number and length of potential hairpin loops.

2.3.1 Original sequence

CodonGUUGUCGUAGUG

Original31.2 %15.6 %6.2 %

46.9 %

Target18.0 %23.0 %0.0 %

59.0 %

Optimized21.9 %21.9 %0.0 %

56.2 %

0

50

100

CodonUGG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

CodonUAUUAC

Original30.0 %70.0 %

Target44.0 %56.0 %

Optimized40.0 %60.0 %

0

50

100

CodonUAAUGAUAG

Original0.0 %

100.0 %0.0 %

Target30.0 %45.0 %25.0 %

Optimized0.0 %

100.0 %0.0 %

0

50

100

Number of helices 35Average helix length 6.37Maximum helix length 12Average helix score 7.23

0 250 500 750 1,000 1,250

Position in sequence

0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

Sco

re

0 250 500 750 1,000 1,250

Position in sequence

0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

Sco

re

Page 11

Optimization report

2.3.2 Optimized sequenceNumber of helices 27Average helix length 6.33Maximum helix length 11Average helix score 6.59

Original sequence Optimized sequence

........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Sequence position

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GC

rat

io o

ver

a w

indo

w o

f 31

nt (

%)

Page 12

Optimization report

2.4 GC distribution

GC ratio over a window of 31 nt:

Original sequence: 47.60% (32.26% - 64.52%)

Optimized sequence: 52.74% (32.26% - 77.42%)

The number indicate the average GC content. The values in brackets indicate the interval containing 95% of

all nucleotides if the GC content is averaged over a window of 11 nucleotides.

2.5 Long range repeats

2.5.1 Original sequence

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

Repeat length

0

25

50

75

100

125

150

175

Fre

quen

cy

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

Repeat length

0

25

50

75

100

125

150

175

Fre

quen

cy

Page 13

Optimization report

Number of repeats: 214

Longest repetitive sequence: 6 bases

2.5.2 Optimized sequence

Number of repeats: 207

Longest repetitive sequence: 7 bases

Page 14

Optimization report

2.6 Secondary ORFs

During the optimization, secondary ORFs were removed. These are ORFs in the second or third frame or on

the opposite strand. The removal was done by inserting stop codons by silent mutagenesis, or by changing

start codons. The optimization tries to avoid secondary ORFs with more than 50 nucleotides.

2.6.1 Original sequence:

2.6.2 Optimized sequence:

2.7 Restriction sites

The table lists the unwanted restriction sites contained in the sequence, as well as their positions.

2.8 Cryptic splice sites

The following table shows possible splice sites in the specified sequence. The score is relative to the range

between the best-scoring and worst-scoring splice sites in the training set.

2.8.1 Splice sites in original sequence

Number of secondary ORFs: 53Total length of sec. ORFs: 1732

Number of ORFs with >50nt: 12

Number of secondary ORFs: 16Total length of sec. ORFs: 531

Number of ORFs with >50nt: 3

Enzyme Positions in originalsequence

Positions in optimizedsequence

EcoRI 3 1HindIII 3 0KpnI 1 0NheI 0 0SalI 0 0XbaI 1 1XhoI 1 1

Type Position RelevanceAcceptor 829 PossibleDonor 792 PossibleDonor 852 LikelyDonor 1002 PossibleDonor 1077 Possible

Page 15

Optimization report

2.8.2 Splice sites in optimized sequence

2.9 AT/GC stretch restrictor

2.9.1 Original sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 21

Average AT/GC stretch length: 5.43

2.9.2 Optimized sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 13

Average AT/GC stretch length: 6.00

3 Optimized sequence

This is the optimized sequence, ready for copying and pasting into other applications.

GTCGA CGCTA GCAAG AAATG TCTAG ACTCG AGGTC TTCCT GAGCC TCGGG

GTGGG TGCGG ACCAG GGGTG TGCCA TCAAC TTTGG GAAAC GGGAA TTGAA

GTGTG GCGAC GGCAT CTTCA TATTC AGGGA CAGCG ACGAT TGGCT TAACA

AGTAT AGCTA CTATC CGGAA GACCC TGTCA AGCTG GCTTC TATTG TTAAG

GCAAG TTTCG AGGAG GGCAA GTGCG GTCTG AACTC AGTGG ACTCC CTGGA

GCACG AAATG TGGAG ATCCA GGGCT GACGA GATCA ACGCC ATCTT TGAAG

AAAAC GAGGT TGACA TATCA GTTGT GGTGC AGGAC CCAAA GAACG TGTAT

CAAAG AGGGA CCCAC CCGTT CTCCA GAATC AGGGA TGGGC TGCAG TACGG

TTGGA AAACC TGGGG AAAGA ACCTG GTGTT TTCTC CTGGC AGGAA GAACG

GAAGT TTCAT TATCG ACGGA AAGAG TCGAA AAGAG TGTCC CTTTA GCAAT

AGAGT TTGGA ATAGT TTCCA GATCG AGGAG TTCGG AACCG GGGTG TTTAC

TACCC GTGTG TACAT GGATG CAGTG TTTGA ATACA CAATA GATTG TGACG

GCTCA ATACT GGGCG CAGCC GTCAA TGGAA AGAAA TCCGC ACACG GCTCC

CCGAC TTTCT GGATG GGGTC CCACG AAGTC AATGG TACTT GGATG ATACA

CACAC TGGAG GCCCT CGATT ACAAA GAGTG CGAGT GGCCT CTGAC TCACA

CAATT GGCAC GAGCG TGGAA GAATC AGAGA TGTTC ATGCC TCGAA GTATC

GGCGG GCCAG TGAGC TCCCA CAATC ACATT CCAGG CTACA AAGTG CAGAC

TAACG GCCCT TGGAT GCAGG TCCCC CTGGA AGTGA AACGG GAGGC TTGCC

CCGGA ACGTC CGTGA TCATT GACGG AAACT GCGAC GGGAG GGGAA AGAGC

ACCAG GAGTA CAACC GATTC TGGTA AGGTT ATTCC CGAGT GGTGT TGCCG

AAGTT GCACG ATGCC ACCAG TTAGC TTTCA CGGCA GCGAC GGCTG CTGGT

ATCCT ATGGA GATCA GGCCA CGCAA AACAC ACGAG TCACA CCTTG TGAGG

TCTTG GGTTA CCGCC GGGGA GATAC ACGCA GTGCC CTTTG GACTC GTGAG

CATGA TGATT GCCAT GGAAG TCGTG CTGCG GAAGC GTCAG GGACC CAAAC

Type Position RelevanceDonor 825 Possible

Page 16

Optimization report

AAATG TTGGT CGGTG AATTC TGATA AGGTA CCAAG CTT

8.2. Relatório da otimização do gene NS3 para expressão em células humanas

!

Page 1

Optimization report

Optimization reportCreated with Leto 1.0

1 General Information:

1.1 Sequence

Below the original sequence and optimized sequence are listed, labelled with 'Org:' and 'Opt:' respectively.

Where both are identical, the original sequence contains dots instead of nucleotides ('.'). Where the original

sequence was locked against editing, it contains underscores ('_'). The names of the restriction enzymes start

at the first nucleotide after the restriction cut in the forward strand.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

ORF: M S R L E G S G D V L

Org: _____ _____ _____ __ ___ ___ ___ ___ ___ ..A ... ..G ..T ..C T..

Opt: GTCGA CGCTA GCAAG AA ATG TCT AGA CTC GAG GGT AGT GGC GAC GTG CTG

SalI NheI XbaI XhoI

55 60 65 70 75 80 85 90 95

ORF: W D I P T P K I I E E C E H L E

Org: ... ... ..T ..C ..T ..T ... ... ..T ..G ..A ..T ... ..T ... ...

Opt: TGG GAT ATC CCT ACA CCA AAG ATC ATC GAA GAG TGC GAA CAC CTG GAG

EcoRV

100 105 110 115 120 125 130 135 140 145

ORF: D G I Y G I F Q S T F L G A S Q

Org: ..T ..G ..T ..T ..C ..A ..C ..G TCA ... ... T.. ..G ... ... ..G

Opt: GAC GGC ATC TAC GGG ATC TTT CAA AGC ACC TTC CTG GGT GCC TCC CAA

Gene: YF_NS3Optimization requested by: With restriction sites included

Date: Sep 26, 2007Operator: Dhalia

Target organism: Homo sapiens_Cut_off_50%Optimization iteration: 1

Length: 1928 bp

Page 2

Optimization report

150 155 160 165 170 175 180 185 190

ORF: R G V G V A Q G G V F H T M W H

Org: ..A ..A ... ..A ... ..A ... ..A ..G ... ..C ... ..A ... ... ..T

Opt: CGT GGT GTG GGC GTG GCG CAG GGC GGT GTG TTT CAC ACG ATG TGG CAC

195 200 205 210 215 220 225 230 235 240

ORF: V T R G A F L V R N G K K L I P

Org: ... ... ... ... ..T ... ..T ... ..G ..T ... ... ..G T.. ..T ..A

Opt: GTC ACA AGA GGA GCC TTC CTG GTC AGA AAC GGC AAG AAA CTG ATA CCT

245 250 255 260 265 270 275 280 285 290

ORF: S W A S V K E D L V A Y G G S W

Org: ..T ... ..T TCA ..A ... ... ..C ..T ..C ... ..T ..T ..C TCA ...

Opt: TCC TGG GCA AGC GTC AAG GAA GAT CTC GTG GCC TAC GGA GGA AGC TGG

BglII BssSI

295 300 305 310 315 320 325 330 335

ORF: K L E G R W D G E E E V Q L I A

Org: ..G T.. ... ... ..A ... ... ..A ... ..A ... ..C ... T.. ... ..T

Opt: AAA CTG GAA GGC AGG TGG GAT GGC GAG GAG GAG GTG CAG CTG ATC GCC

PvuII

340 345 350 355 360 365 370 375 380 385

ORF: A V P G K N V V N V Q T K P S L

Org: ..T ..T ..A ..A ... ..C ... ..C ... ... ... ..A ... ..G ... T..

Opt: GCC GTC CCT GGC AAG AAT GTG GTG AAC GTC CAG ACC AAA CCC AGC CTG

390 395 400 405 410 415 420 425 430

ORF: F K V R N G G E I G A V A L D Y

Org: ... ..A ... ... ..T ..G ... ... ..C ..G ..T ..T ..T ..T ... ...

Opt: TTC AAG GTG AGG AAC GGA GGG GAA ATT GGC GCC GTG GCC CTG GAC TAT

SfoI

NarI

KasI

BbeI

435 440 445 450 455 460 465 470 475 480

ORF: P S G T S G S P I V N R N G E V

Org: ... ... ..C ..T TCA ..A TCT ..T ..T ..T ..C ... ... ..A ... ...

Opt: CCA AGT GGG ACC AGC GGC AGC CCC ATC GTC AAT AGG AAC GGC GAG GTG

Page 3

Optimization report

485 490 495 500 505 510 515 520 525 530

ORF: I G L Y G N G I L V G D N S F V

Org: ..T ..G ..G ..C ..C ..T ... ..C ..T ..C ..T ... ..C ... ..C ...

Opt: ATC GGA CTC TAT GGG AAC GGC ATA CTG GTG GGC GAC AAT TCC TTT GTG

535 540 545 550 555 560 565 570 575

ORF: S A I S Q T E V K E E G K E E L

Org: TC. ..C ..A TCC ... ..T ... ... ..G ..A ... ..A ... ... ... ...

Opt: AGC GCT ATC AGT CAG ACC GAG GTG AAA GAG GAA GGC AAG GAG GAG CTC

AfeI SacI

580 585 590 595 600 605 610 615 620 625

ORF: R E I P T M L K K G M T T I L D

Org: ... ... ..C ..G ..A ... ..A ... ..A ..A ... ..A ..T ..C ..T ..T

Opt: CGA GAG ATA CCC ACC ATG CTT AAG AAG GGC ATG ACT ACG ATT CTC GAC

AflII

630 635 640 645 650 655 660 665 670

ORF: F H P G A G K T R R F L P Q I L

Org: ... ..T ... ..A ... ..G ... ..A ... ..T ... ..C ..A ... ... T..

Opt: TTT CAC CCT GGG GCT GGC AAG ACT AGA CGG TTC CTG CCT CAG ATC CTG

675 680 685 690 695 700 705 710 715 720

ORF: A E C A R R R L R T L V L A P T

Org: ..C ... ... ... C.. C.A C.C ... ..C ..T ..T ... T.. ..C ... ..C

Opt: GCT GAG TGC GCA AGG AGG AGG TTG CGG ACG CTG GTG CTG GCA CCC ACA

FspI

725 730 735 740 745 750 755 760 765 770

ORF: R V V L S E M K E A F H G L D V

Org: A.. ... ..T C.T ..T ... ... ..G ..G ..T ... ... ..C ..G ... ...

Opt: CGG GTT GTC TTG TCA GAA ATG AAA GAA GCC TTT CAC GGA CTT GAC GTG

775 780 785 790 795 800 805 810 815

ORF: K F H T Q A F S A H G S G R E V

Org: ..A ... ..C ..A ... ..T ... TC. ..T ..C ..C ... ..G ..A ... ..C

Opt: AAG TTC CAT ACC CAG GCC TTT AGC GCA CAT GGA AGC GGA AGG GAA GTG

StuI

820 825 830 835 840 845 850 855 860 865

ORF: I D A M C H A T L T Y R M L E P

Org: ... ..T ..A ... ..C ... ..C ... ..A ... ... ..G ... T.. ..A ..A

Opt: ATT GAC GCC ATG TGT CAT GCG ACC CTT ACT TAC AGA ATG CTG GAG CCT

Page 4

Optimization report

870 875 880 885 890 895 900 905 910

ORF: T R V V N W E V I I M D E A H F

Org: ..T ... ..T ..T ..C ... ... ... ..C ... ... ..T ... ..C ..T ..T

Opt: ACC AGG GTG GTG AAT TGG GAA GTG ATA ATT ATG GAC GAA GCA CAC TTC

915 920 925 930 935 940 945 950 955 960

ORF: L D P A S I A A R G W A A H R A

Org: T.. ... ..A ..T ... ... ..C ..T A.. ..T ... ..A ..G ... A.A ..T

Opt: CTG GAT CCC GCA AGC ATA GCA GCC CGA GGC TGG GCT GCT CAC CGT GCA

BamHI ApaLI

965 970 975 980 985 990 995 1000 1005 1010

ORF: R A N E S A T I L M T A T P P G

Org: A.G ... ... ... ..T ..A ... ..C T.G ... ..A ... ..A ..G ..T ..G

Opt: CGC GCA AAT GAA AGC GCC ACA ATA CTT ATG ACT GCC ACT CCA CCC GGC

1015 1020 1025 1030 1035 1040 1045 1050 1055

ORF: T S D E F P H S N G E I E D V Q

Org: ..T ..T ..T ..A ... ..A ..T ... ..T ..T ..A ..A ..A ..T ..T ..A

Opt: ACC AGC GAC GAG TTT CCC CAC TCA AAC GGC GAG ATC GAG GAC GTG CAG

1060 1065 1070 1075 1080 1085 1090 1095 1100 1105

ORF: T D I P S E P W N T G H D W I L

Org: ..G ... ..A ..C ..T ... ... ... ..C ..A ..G ..T ... ... ... ..G

Opt: ACC GAC ATT CCG AGC GAG CCC TGG AAT ACT GGA CAC GAC TGG ATC CTT

BamHI

1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145 1150

ORF: A D K R P T A W F L P S I R A A

Org: ..T ... ... ... ..C ..G ..A ... ... ..T ... TC. ... ..A ..T ...

Opt: GCC GAC AAA AGG CCG ACT GCC TGG TTC CTC CCA AGC ATC AGG GCG GCA

1155 1160 1165 1170 1175 1180 1185 1190 1195 1200

ORF: N V M A A S L R K A G K S V V V

Org: ..T ..C ... ..T ..C ... T.. C.T ... ... ..A ..G ... ... ... ..C

Opt: AAC GTT ATG GCA GCT TCT CTG AGG AAG GCT GGC AAA AGT GTG GTG GTG

AclI

1205 1210 1215 1220 1225 1230 1235 1240 1245 1250

ORF: L N R K T F E R E Y P T I K Q K

Org: ... ..C A.. ..A ... ... ... A.. ..A ..C ..C ..G ..A ..G ... ...

Opt: CTG AAT CGG AAG ACC TTT GAG CGA GAG TAT CCA ACT ATC AAA CAG AAG

Page 5

Optimization report

1255 1260 1265 1270 1275 1280 1285 1290 1295

ORF: K P D F I L A T D I A E M G A N

Org: ... ..T ... ..T ..A T.G ..C ..T ..C ..A ..T ..A ... ... ... ...

Opt: AAA CCC GAC TTC ATT CTC GCG ACC GAT ATT GCC GAG ATG GGA GCC AAC

NruI

1300 1305 1310 1315 1320 1325 1330 1335 1340 1345

ORF: L C V E R V L D C R T A F K P V

Org: ..T ..C ... ... ..A ... ..G ..T ... ... ..G ..T ..T ..G ..T ..G

Opt: CTG TGT GTG GAG CGT GTG CTT GAC TGC AGG ACA GCC TTC AAA CCC GTC

PstI

1350 1355 1360 1365 1370 1375 1380 1385 1390

ORF: L V D E G R K V A I K G P L R I

Org: ..T ... ... ..A ..G ..G ..G ..G ..A ..A ... ..G ..A C.T C.T ..C

Opt: CTG GTG GAT GAG GGC AGA AAA GTT GCC ATC AAA GGA CCT TTG AGG ATT

1395 1400 1405 1410 1415 1420 1425 1430 1435 1440

ORF: S A S S A A Q R R G R I G R N P

Org: TC. ... TC. TCT ..T ..T ... A.G A.G ... C.C ..T ..G ... ... ...

Opt: AGC GCA AGC AGC GCC GCC CAA CGT CGA GGG AGG ATC GGC AGA AAT CCC

1445 1450 1455 1460 1465 1470 1475 1480 1485 1490

ORF: N R D G D S Y Y Y S E P T S E N

Org: ..C ..A ..T ..A ..C TCA ... ... ... TCT ... ..T ... ... ..A ..T

Opt: AAT AGG GAC GGT GAT AGC TAC TAC TAT AGC GAG CCA ACA AGT GAG AAC

1495 1500 1505 1510 1515 1520 1525 1530 1535

ORF: N A H H V C W L E A S M L L D N

Org: ..T ... ... ... ..C ... ... T.. ..G ... ..A ... ..C T.G ... ...

Opt: AAC GCC CAC CAC GTG TGC TGG CTG GAA GCC TCT ATG CTG CTC GAT AAC

PmlI

1540 1545 1550 1555 1560 1565 1570 1575 1580 1585

ORF: M E V R G G M V A P L Y G V E G

Org: ... ..G ... A.G ..T ..A ... ..C ..C ..A ..C ..T ..C ..T ..A ..A

Opt: ATG GAA GTG CGA GGC GGT ATG GTG GCA CCT CTG TAC GGT GTG GAG GGG

1590 1595 1600 1605 1610 1615 1620 1625 1630

ORF: T K T P V S P G E M R L R D D Q

Org: ..T ... ... ... ..T TC. ..T ... ... ... ... ... ... ..T ... ...

Opt: ACG AAA ACA CCA GTG AGC CCG GGT GAA ATG AGA CTG AGG GAC GAC CAG

XmaI

SmaI

Page 6

Optimization report

1635 1640 1645 1650 1655 1660 1665 1670 1675 1680

ORF: R K V F R E L V R N C D L P V W

Org: ..G ... ..C ..C A.A ... ..A ..G ... ... ... ... ... ..C ..T ...

Opt: AGA AAA GTG TTT CGC GAA CTG GTC AGG AAT TGT GAC CTG CCA GTG TGG

NruI

1685 1690 1695 1700 1705 1710 1715 1720 1725 1730

ORF: L S W Q V A K A G L K T N D R K

Org: ... ..G ... ... ..G ..C ... ..T ... T.. ... ..G ..T ... C.T ...

Opt: CTT TCT TGG CAA GTT GCT AAG GCG GGT CTG AAG ACA AAC GAT AGG AAG

1735 1740 1745 1750 1755 1760 1765 1770 1775

ORF: W C F E G P E E H E I L N D S G

Org: ... ..T ..T ... ... ..T ..G ..A ..T ..G ... ... ..T ..C ... ..T

Opt: TGG TGC TTC GAA GGC CCA GAA GAG CAC GAA ATC TTG AAC GAT AGC GGA

BstBI

1780 1785 1790 1795 1800 1805 1810 1815 1820 1825

ORF: E T V K C R A P G G A K K P L R

Org: ..A ... ... ... ... A.G ... ..T ... ..A ..A ... ..G ..T C.. C.C

Opt: GAG ACA GTG AAG TGC CGT GCT CCA GGA GGC GCC AAG AAA CCC TTG AGG

SfoI

NarI

KasI

BbeI

1830 1835 1840 1845 1850 1855 1860 1865 1870

ORF: P R W C D E R V S S D Q S A L S

Org: ..A ... ... ... ..T ..A ... ... TCA TC. ..C ... AGT ..G ... TCT

Opt: CCG AGG TGG TGT GAC GAG AGG GTG AGC AGT GAT CAG TCA GCA CTG AGC

BclI

1875 1880 1885 1890 1895 1900 1905 1910 1915 1920

ORF: E F I K F A E G R R E F !

Org: ..A ..T ... ... ... ..T ..A ..T ..G ... ___ ___ ___ _____ _____

Opt: GAG TTC ATT AAG TTT GCC GAG GGA AGA AGG GAA TTC TGA TAAGG TACCA

EcoRI KpnI HindIII

Acc65I

1925

Org: _____

Opt: AGCTT

Page 7

Optimization report

1.1.1 Restriction table

1.1.2 Enzymes that cut five or fewer times

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 1916AclI aa'cg_tt 1 1154AfeI agc'_gct 1 530AflII c'ttaa_g 1 596ApaLI g'tgca_c 1 957BamHI g'gatc_c 2 916, 1098BbeI g_gcgc'c 2 413, 1805BclI t'gatc_a 1 1855BglII a'gatc_t 1 262BssSI c'acga_g 1 266BstBI tt'cg_aa 1 1736EcoRI g'aatt_c 1 1904EcoRV gat'_atc 1 53FspI tgc'_gca 1 680HindIII a'agct_t 1 1922KasI g'gcgc_c 2 413, 1805KpnI g_gtac'c 1 1916NarI gg'cg_cc 2 413, 1805NheI g'ctag_c 1 6NruI tcg'_cga 2 1266, 1645PmlI cac'_gtg 1 1499PstI c_tgca'g 1 1321PvuII cag'_ctg 1 326SacI g_agct'c 1 572SalI g'tcga_c 1 0SfoI ggc'_gcc 2 413, 1805SmaI ccc'_ggg 1 1603StuI agg'_cct 1 783XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26XmaI c'ccgg_g 1 1603

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 1916AclI aa'cg_tt 1 1154AfeI agc'_gct 1 530AflII c'ttaa_g 1 596ApaLI g'tgca_c 1 957BamHI g'gatc_c 2 916, 1098BbeI g_gcgc'c 2 413, 1805BclI t'gatc_a 1 1855BglII a'gatc_t 1 262BssSI c'acga_g 1 266BstBI tt'cg_aa 1 1736EcoRI g'aatt_c 1 1904EcoRV gat'_atc 1 53FspI tgc'_gca 1 680

Page 8

Optimization report

1.1.3 Enzymes that do not cut

AatII, AgeI, ApaI, AscI, AseI, AsiSI, AvrII, BbvCI, BfrBI, BsiWI, BspEI, BspHI, BsrBI, BsrGI, BssHII, BstZ17I,

ClaI, DraI, EagI, FseI, HpaI, MfeI, MluI, MscI, NaeI, NcoI, NdeI, NgoMIV, NotI, NsiI, PacI, PciI, PmeI, PsiI,

PspOMI, PvuI, SacII, SbfI, ScaI, SnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, SwaI, ZraI

1.2 Dotplot

HindIII a'agct_t 1 1922KasI g'gcgc_c 2 413, 1805KpnI g_gtac'c 1 1916NarI gg'cg_cc 2 413, 1805NheI g'ctag_c 1 6NruI tcg'_cga 2 1266, 1645PmlI cac'_gtg 1 1499PstI c_tgca'g 1 1321PvuII cag'_ctg 1 326SacI g_agct'c 1 572SalI g'tcga_c 1 0SfoI ggc'_gcc 2 413, 1805SmaI ccc'_ggg 1 1603StuI agg'_cct 1 783XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26XmaI c'ccgg_g 1 1603

Page 9

Optimization report

1.3 ORFs

The gene was optimized using the following ORF(s). Please note that sequence positions are given relative to

the continuous DNA sequence defined by all ORFs:

ORF: 18-1913

2 Optimized parameters

2.1 Codon Usage

This is a comparison of the codon frequency of the original sequence vs. the optimized sequence. As a

reference, the codon usage of the target organism is included. The charts indicate the sum of the deviation

from the target codon usage, for the original and the optimized sequence. Lower bars indicate a better match

with the target codon usage.

2.1.1 A - Alanine:

2.1.2 C - Cysteine:

2.1.3 D - Aspartic acid:

2.1.4 E - Glutamic acid:

CodonGCUGCCGCAGCG

Original45.3 %30.2 %20.8 %3.8 %

Target26.0 %40.0 %22.0 %12.0 %

Optimized17.0 %47.2 %26.4 %9.4 %

0

50

100

CodonUGUUGC

Original40.0 %60.0 %

Target45.0 %55.0 %

Optimized40.0 %60.0 %

0

50

100

CodonGAUGAC

Original54.8 %45.2 %

Target46.0 %54.0 %

Optimized35.5 %64.5 %

0

50

100

CodonGAAGAG

Original60.8 %39.2 %

Target42.0 %58.0 %

Optimized39.2 %60.8 %

0

50

100

Page 10

Optimization report

2.1.5 F - Phenylalanine:

2.1.6 G - Glycine:

2.1.7 H - Histidine:

2.1.8 I - Isoleucine:

2.1.9 K - Lysine:

2.1.10 L - Leucine:

CodonUUUUUC

Original50.0 %50.0 %

Target46.0 %54.0 %

Optimized45.5 %54.5 %

0

50

100

CodonGGUGGCGGAGGG

Original16.4 %20.0 %34.5 %29.1 %

Target16.0 %33.0 %25.0 %26.0 %

Optimized16.4 %45.5 %25.5 %12.7 %

0

50

100

CodonCAUCAC

Original53.3 %46.7 %

Target41.0 %59.0 %

Optimized20.0 %80.0 %

0

50

100

CodonAUUAUCAUA

Original31.2 %40.6 %28.1 %

Target35.0 %47.0 %18.0 %

Optimized28.1 %53.1 %18.8 %

0

50

100

CodonAAAAAG

Original29.4 %70.6 %

Target43.0 %57.0 %

Optimized44.1 %55.9 %

0

50

100

CodonUUAUUGCUUCUCCUACUG

Original0.0 %

37.5 %25.0 %10.4 %6.2 %

20.8 %

Target0.0 %

12.0 %13.0 %19.0 %0.0 %

56.0 %

Optimized0.0 %

10.4 %14.6 %16.7 %0.0 %

58.3 % 0

50

100

Page 11

Optimization report

2.1.11 M - Methionine:

2.1.12 N - Asparagine:

2.1.13 P - Proline:

2.1.14 Q - Glutamine:

2.1.15 R - Arginine:

2.1.16 S - Serine:

CodonAUG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

CodonAAUAAC

Original52.2 %47.8 %

Target46.0 %54.0 %

Optimized43.5 %56.5 %

0

50

100

CodonCCUCCCCCACCG

Original32.4 %23.5 %35.3 %8.8 %

Target28.0 %32.0 %27.0 %13.0 %

Optimized23.5 %35.3 %29.4 %11.8 %

0

50

100

CodonCAACAG

Original21.4 %78.6 %

Target26.0 %74.0 %

Optimized28.6 %71.4 %

0

50

100

CodonCGUCGCCGACGGAGAAGG

Original8.3 %8.3 %8.3 %2.1 %

27.1 %45.8 %

Target8.0 %

18.0 %10.0 %20.0 %21.0 %23.0 %

Optimized10.4 %4.2 %

10.4 %8.3 %

20.8 %45.8 % 0

50

100

CodonUCUUCCUCAUCGAGUAGC

Original23.1 %23.1 %20.5 %2.6 %

20.5 %10.3 %

Target18.0 %21.0 %15.0 %0.0 %

14.0 %32.0 %

Optimized10.3 %7.7 %7.7 %0.0 %

15.4 %59.0 % 0

50

100

Page 12

Optimization report

2.1.17 T - Threonine:

2.1.18 V - Valine:

2.1.19 W - Tryptophan:

2.1.20 Y - Tyrosine:

2.1.21 ! - Stop:

2.2 Secondary structure

In general, an extended secondary structure of the mRNA can interfere with the translation process.

Therefore, the gene optimization tries to reduce the number and length of potential hairpin loops.

CodonACUACCACAACG

Original30.3 %12.1 %42.4 %15.2 %

Target24.0 %35.0 %28.0 %13.0 %

Optimized24.2 %36.4 %27.3 %12.1 %

0

50

100

CodonGUUGUCGUAGUG

Original22.4 %28.6 %2.0 %

46.9 %

Target18.0 %23.0 %0.0 %

59.0 %

Optimized8.2 %

18.4 %0.0 %

73.5 %

0

50

100

CodonUGG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

CodonUAUUAC

Original50.0 %50.0 %

Target44.0 %56.0 %

Optimized40.0 %60.0 %

0

50

100

CodonUAAUGAUAG

Original0.0 %

100.0 %0.0 %

Target30.0 %45.0 %25.0 %

Optimized0.0 %

100.0 %0.0 %

0

50

100

0 250 500 750 1,000 1,250 1,500 1,750

Position in sequence

0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

15.00S

core

0 250 500 750 1,000 1,250 1,500 1,750

Position in sequence

0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

15.00

Sco

re

Page 13

Optimization report

2.2.1 Original sequence

2.2.2 Optimized sequence

Number of helices 53Average helix length 6.13Maximum helix length 11Average helix score 6.62

Number of helices 44Average helix length 5.98Maximum helix length 10Average helix score 6.00

Page 14

Optimization report

2.3 Secondary ORFs

During the optimization, secondary ORFs were removed. These are ORFs in the second or third frame or on

the opposite strand. The removal was done by inserting stop codons by silent mutagenesis, or by changing

start codons. The optimization tries to avoid secondary ORFs with more than 50 nucleotides.

2.3.1 Original sequence:

2.3.2 Optimized sequence:

2.4 Cryptic splice sites

The following table shows possible splice sites in the specified sequence. The score is relative to the range

between the best-scoring and worst-scoring splice sites in the training set.

2.4.1 Splice sites in original sequence

2.4.2 Splice sites in optimized sequence

Number of secondary ORFs: 59Total length of sec. ORFs: 1491

Number of ORFs with >50nt: 6

Number of secondary ORFs: 24Total length of sec. ORFs: 676

Number of ORFs with >50nt: 3

Type Position RelevanceAcceptor 329 LikelyAcceptor 450 PossibleAcceptor 705 PossibleAcceptor 727 PossibleAcceptor 730 PossibleAcceptor 834 PossibleAcceptor 1228 PossibleAcceptor 1456 LikelyAcceptor 1615 PossibleAcceptor 1843 PossibleDonor 1159 LikelyDonor 1372 PossibleDonor 1527 Likely

Type Position RelevanceDonor 1638 Possible

Page 15

Optimization report

2.5 AT/GC stretch restrictor

2.5.1 Original sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 35

Average AT/GC stretch length: 5.83

2.5.2 Optimized sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 31

Average AT/GC stretch length: 5.65

3 Optimized sequence

This is the optimized sequence, ready for copying and pasting into other applications.

GTCGA CGCTA GCAAG AAATG TCTAG ACTCG AGGGT AGTGG CGACG TGCTG

TGGGA TATCC CTACA CCAAA GATCA TCGAA GAGTG CGAAC ACCTG GAGGA

CGGCA TCTAC GGGAT CTTTC AAAGC ACCTT CCTGG GTGCC TCCCA ACGTG

GTGTG GGCGT GGCGC AGGGC GGTGT GTTTC ACACG ATGTG GCACG TCACA

AGAGG AGCCT TCCTG GTCAG AAACG GCAAG AAACT GATAC CTTCC TGGGC

AAGCG TCAAG GAAGA TCTCG TGGCC TACGG AGGAA GCTGG AAACT GGAAG

GCAGG TGGGA TGGCG AGGAG GAGGT GCAGC TGATC GCCGC CGTCC CTGGC

AAGAA TGTGG TGAAC GTCCA GACCA AACCC AGCCT GTTCA AGGTG AGGAA

CGGAG GGGAA ATTGG CGCCG TGGCC CTGGA CTATC CAAGT GGGAC CAGCG

GCAGC CCCAT CGTCA ATAGG AACGG CGAGG TGATC GGACT CTATG GGAAC

GGCAT ACTGG TGGGC GACAA TTCCT TTGTG AGCGC TATCA GTCAG ACCGA

GGTGA AAGAG GAAGG CAAGG AGGAG CTCCG AGAGA TACCC ACCAT GCTTA

AGAAG GGCAT GACTA CGATT CTCGA CTTTC ACCCT GGGGC TGGCA AGACT

AGACG GTTCC TGCCT CAGAT CCTGG CTGAG TGCGC AAGGA GGAGG TTGCG

GACGC TGGTG CTGGC ACCCA CACGG GTTGT CTTGT CAGAA ATGAA AGAAG

CCTTT CACGG ACTTG ACGTG AAGTT CCATA CCCAG GCCTT TAGCG CACAT

GGAAG CGGAA GGGAA GTGAT TGACG CCATG TGTCA TGCGA CCCTT ACTTA

CAGAA TGCTG GAGCC TACCA GGGTG GTGAA TTGGG AAGTG ATAAT TATGG

ACGAA GCACA CTTCC TGGAT CCCGC AAGCA TAGCA GCCCG AGGCT GGGCT

GCTCA CCGTG CACGC GCAAA TGAAA GCGCC ACAAT ACTTA TGACT GCCAC

TCCAC CCGGC ACCAG CGACG AGTTT CCCCA CTCAA ACGGC GAGAT CGAGG

ACGTG CAGAC CGACA TTCCG AGCGA GCCCT GGAAT ACTGG ACACG ACTGG

ATCCT TGCCG ACAAA AGGCC GACTG CCTGG TTCCT CCCAA GCATC AGGGC

GGCAA ACGTT ATGGC AGCTT CTCTG AGGAA GGCTG GCAAA AGTGT GGTGG

TGCTG AATCG GAAGA CCTTT GAGCG AGAGT ATCCA ACTAT CAAAC AGAAG

AAACC CGACT TCATT CTCGC GACCG ATATT GCCGA GATGG GAGCC AACCT

GTGTG TGGAG CGTGT GCTTG ACTGC AGGAC AGCCT TCAAA CCCGT CCTGG

TGGAT GAGGG CAGAA AAGTT GCCAT CAAAG GACCT TTGAG GATTA GCGCA

Page 16

Optimization report

AGCAG CGCCG CCCAA CGTCG AGGGA GGATC GGCAG AAATC CCAAT AGGGA

CGGTG ATAGC TACTA CTATA GCGAG CCAAC AAGTG AGAAC AACGC CCACC

ACGTG TGCTG GCTGG AAGCC TCTAT GCTGC TCGAT AACAT GGAAG TGCGA

GGCGG TATGG TGGCA CCTCT GTACG GTGTG GAGGG GACGA AAACA CCAGT

GAGCC CGGGT GAAAT GAGAC TGAGG GACGA CCAGA GAAAA GTGTT TCGCG

AACTG GTCAG GAATT GTGAC CTGCC AGTGT GGCTT TCTTG GCAAG TTGCT

AAGGC GGGTC TGAAG ACAAA CGATA GGAAG TGGTG CTTCG AAGGC CCAGA

AGAGC ACGAA ATCTT GAACG ATAGC GGAGA GACAG TGAAG TGCCG TGCTC

CAGGA GGCGC CAAGA AACCC TTGAG GCCGA GGTGG TGTGA CGAGA GGGTG

AGCAG TGATC AGTCA GCACT GAGCG AGTTC ATTAA GTTTG CCGAG GGAAG

AAGGG AATTC TGATA AGGTA CCAAG CTT

8.3. Relatório da otimização do gene NS1 para expressão em E. coli

!

Page 1

Optimization report

Optimization reportCreated with Leto 1.0

1 General Information:

1.1 Sequence

Below the original sequence and optimized sequence are listed, labelled with 'Org:' and 'Opt:' respectively.

Where both are identical, the original sequence contains dots instead of nucleotides ('.'). Where the original

sequence was locked against editing, it contains underscores ('_'). The names of the restriction enzymes start

at the first nucleotide after the restriction cut in the forward strand.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

ORF: M S R L E N K Y S Y Y

Org: _____ _____ _____ __ ___ ___ ___ ___ ___ ... ..A ..C TCT ..C ..C

Opt: GTCGA CGCTA GCAAG AA ATG TCT AGA CTC GAG AAC AAG TAT AGC TAT TAT

SalI NheI XbaI XhoI BspEI

55 60 65 70 75 80 85 90 95

ORF: P E D P V K L A S I V K A S F E

Org: ... ... ..C ... ..T ... ... ..T ..T ..C ..T ... ..T ..T ... ...

Opt: CCG GAA GAT CCG GTC AAA CTG GCC TCA ATT GTG AAA GCG TCC TTC GAA

MfeI BstBI

100 105 110 115 120 125 130 135 140 145

ORF: E G K C G L N S V D S L E H E M

Org: ... ..T ... ... ... C.. ..C TCT ..T ..C ... ..G ... ... ..A ...

Opt: GAA GGC AAA TGC GGT TTG AAT AGC GTA GAT TCT CTT GAA CAC GAG ATG

BssSI

Gene: YF_NS1_BacOptimization requested by: With restriction sites included

Date: Sep 26, 2007Operator: Dhalia

Target organism: Escherichia coli_Cut_off_50%Optimization iteration: 1

Length: 611 bp

Page 2

Optimization report

150 155 160 165 170 175 180 185 190

ORF: W R S R A D E I N A I F E E N E

Org: ... C.T ..T C.T ..T ... ..A ... ..C ..T ..C ..C ... ..A ... ..A

Opt: TGG AGA TCG AGG GCA GAC GAG ATC AAT GCG ATA TTT GAA GAG AAC GAG

195 200 205 210 215 220 225 230 235 240

ORF: V D I S V V V Q D P K N V Y Q R

Org: ..T ..C ..C ..T ..T ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ...

Opt: GTC GAT ATA TCC GTC GTT GTT CAG GAT CCG AAA AAC GTT TAC CAG CGT

BamHI AclI

245 250 255 260 265 270 275 280 285 290

ORF: G T H P F S R I R D G L Q Y G W

Org: ... ..C ..C ..G ... ..T ... ... C.T ..C ... C.G ..G ... ..T ...

Opt: GGT ACG CAT CCC TTC TCG CGT ATC AGG GAT GGT TTA CAA TAC GGG TGG

295 300 305 310 315 320 325 330 335

ORF: K T W G K N L V F S P G R K N G

Org: ..A ..C ... ..T ... ..C ... ..T ..C ... ..G ... ..T ..A ... ..T

Opt: AAG ACG TGG GGA AAA AAT CTG GTG TTT TCT CCT GGT CGC AAG AAC GGC

340 345 350 355 360 365 370 375 380 385

ORF: S F I I D G K S R K E C P F S N

Org: TCT ..C ..C ..C ... ..T ... ..T ..T ..A ... ..C ... ..C TC. ..C

Opt: AGC TTT ATT ATT GAC GGG AAA TCA CGC AAG GAA TGT CCG TTT AGT AAT

390 395 400 405 410 415 420 425 430

ORF: R V G P G P G C D G R G K S T R

Org: ... ..T ..T ..G ..T ..G ..T ... ... ... ... ..T ... ..T ... ...

Opt: CGT GTG GGA CCT GGA CCA GGC TGC GAC GGT CGT GGC AAA TCC ACC CGT

435 440 445 450 455 460 465 470 475 480

ORF: S T T D S G K V I P E W C C R S

Org: TC. ..C ... ..C TCT ... ... ..T ..C ..G ... ... ... ..C ..T TCT

Opt: AGT ACA ACC GAT AGC GGT AAA GTG ATT CCC GAA TGG TGC TGT CGC AGC

PvuII

485 490 495 500 505 510 515 520 525 530

ORF: C T M P P V S F H G S D G C W Y

Org: ... ..C ... ..G ... ..T TC. ..C ..C ..T TC. ... ... ..C ... ..C

Opt: TGC ACT ATG CCA CCG GTG AGT TTT CAT GGC AGT GAC GGT TGT TGG TAT

AgeI

Page 3

Optimization report

535 540 545 550 555 560 565 570 575

ORF: P M E I R P R K T H E S H L V R

Org: ... ... ... ... ... ..G ..T ... ... ..C ... ..T ... ... ... ..T

Opt: CCG ATG GAA ATC CGT CCA CGC AAA ACC CAT GAA TCA CAC CTG GTT CGG

580 585 590 595 600 605 610

ORF: S W V E F !

Org: TCT ... ..T ___ ___ ___ _____ _____ _____

Opt: AGC TGG GTA GAA TTC TGA TAAGG TACCA AGCTT

EcoRI KpnI HindIII

Acc65I

1.1.1 Restriction table

1.1.2 Enzymes that cut five or fewer times

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 599AclI aa'cg_tt 1 227AgeI a'ccgg_t 1 493BamHI g'gatc_c 1 217BspEI t'ccgg_a 1 49BssSI c'acga_g 1 137BstBI tt'cg_aa 1 92EcoRI g'aatt_c 1 587HindIII a'agct_t 1 605KpnI g_gtac'c 1 599MfeI c'aatt_g 1 75NheI g'ctag_c 1 6PvuII cag'_ctg 1 478SalI g'tcga_c 1 0XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 599AclI aa'cg_tt 1 227AgeI a'ccgg_t 1 493BamHI g'gatc_c 1 217BspEI t'ccgg_a 1 49BssSI c'acga_g 1 137BstBI tt'cg_aa 1 92EcoRI g'aatt_c 1 587HindIII a'agct_t 1 605KpnI g_gtac'c 1 599MfeI c'aatt_g 1 75NheI g'ctag_c 1 6PvuII cag'_ctg 1 478

Page 4

Optimization report

1.1.3 Enzymes that do not cut

AatII, AfeI, AflII, ApaI, ApaLI, AscI, AseI, AsiSI, AvrII, BbeI, BbvCI, BclI, BfrBI, BglII, BsiWI, BspHI, BsrBI,

BsrGI, BssHII, BstZ17I, ClaI, DraI, EagI, EcoRV, FseI, FspI, HpaI, KasI, MluI, MscI, NaeI, NarI, NcoI, NdeI,

NgoMIV, NotI, NruI, NsiI, PacI, PciI, PmeI, PmlI, PsiI, PspOMI, PstI, PvuI, SacI, SacII, SbfI, ScaI, SfoI, SmaI,

SnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, StuI, SwaI, XmaI, ZraI

1.2 Dotplot

1.3 ORFs

The gene was optimized using the following ORF(s). Please note that sequence positions are given relative to

the continuous DNA sequence defined by all ORFs:

ORF: 18-596

SalI g'tcga_c 1 0XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26

Page 5

Optimization report

2 Optimized parameters

2.1 Codon tandem repeats

Number of codon tandem repeats:

Original sequence: 8

Optimized sequence: 4

2.2 Codon Usage

This is a comparison of the codon frequency of the original sequence vs. the optimized sequence. As a

reference, the codon usage of the target organism is included. The charts indicate the sum of the deviation

from the target codon usage, for the original and the optimized sequence. Lower bars indicate a better match

with the target codon usage.

2.2.1 A - Alanine:

2.2.2 C - Cysteine:

2.2.3 D - Aspartic acid:

Position Number of repeats[27] 2[78] 2[192] 2[327] 2

CodonGCUGCCGCAGCG

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %

Target19.0 %26.0 %24.0 %31.0 %

Optimized0.0 %

25.0 %25.0 %50.0 %

0

50

100

150

CodonUGUUGC

Original0.0 %

100.0 %

Target48.0 %52.0 %

Optimized42.9 %57.1 %

0

50

100

150

CodonGAUGAC

Original0.0 %

100.0 %

Target63.0 %37.0 %

Optimized60.0 %40.0 %

0

50

100

150

Page 6

Optimization report

2.2.4 E - Glutamic acid:

2.2.5 F - Phenylalanine:

2.2.6 G - Glycine:

2.2.7 H - Histidine:

2.2.8 I - Isoleucine:

2.2.9 K - Lysine:

CodonGAAGAG

Original93.3 %6.7 %

Target65.0 %35.0 %

Optimized66.7 %33.3 %

0

50

100

150

CodonUUUUUC

Original0.0 %

100.0 %

Target59.0 %41.0 %

Optimized62.5 %37.5 %

0

50

100

150

CodonGGUGGCGGAGGG

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %

Target33.0 %33.0 %15.0 %19.0 %

Optimized41.2 %29.4 %17.6 %11.8 %

0

50

100

150

CodonCAUCAC

Original0.0 %

100.0 %

Target59.0 %41.0 %

Optimized60.0 %40.0 %

0

50

100

150

CodonAUUAUCAUA

Original0.0 %

100.0 %0.0 %

Target48.0 %36.0 %16.0 %

Optimized44.4 %33.3 %22.2 %

0

50

100

150

CodonAAAAAG

Original100.0 %

0.0 %

Target72.0 %28.0 %

Optimized69.2 %30.8 %

0

50

100

150

Page 7

Optimization report

2.2.10 L - Leucine:

2.2.11 M - Methionine:

2.2.12 N - Asparagine:

2.2.13 P - Proline:

2.2.14 Q - Glutamine:

2.2.15 R - Arginine:

CodonUUAUUGCUUCUCCUACUG

Original0.0 %0.0 %0.0 %

14.3 %0.0 %

85.7 %

Target15.0 %12.0 %13.0 %10.0 %0.0 %

50.0 %

Optimized14.3 %14.3 %14.3 %14.3 %0.0 %

42.9 % 0

50

100

150

CodonAUG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

150

CodonAAUAAC

Original0.0 %

100.0 %

Target53.0 %47.0 %

Optimized50.0 %50.0 %

0

50

100

150

CodonCCUCCCCCACCG

Original0.0 %0.0 %0.0 %

100.0 %

Target20.0 %14.0 %21.0 %45.0 %

Optimized15.4 %15.4 %23.1 %46.2 %

0

50

100

150

CodonCAACAG

Original0.0 %

100.0 %

Target33.0 %67.0 %

Optimized33.3 %66.7 %

0

50

100

150

CodonCGUCGCCGACGGAGAAGG

Original93.3 %0.0 %0.0 %0.0 %6.7 %0.0 %

Target39.0 %31.0 %0.0 %

12.0 %9.0 %9.0 %

Optimized40.0 %26.7 %0.0 %6.7 %

13.3 %13.3 % 0

50

100

150

Page 8

Optimization report

2.2.16 S - Serine:

2.2.17 T - Threonine:

2.2.18 V - Valine:

2.2.19 W - Tryptophan:

2.2.20 Y - Tyrosine:

2.2.21 ! - Stop:

CodonUCUUCCUCAUCGAGUAGC

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %0.0 %0.0 %

Target17.0 %14.0 %16.0 %12.0 %17.0 %24.0 %

Optimized14.3 %14.3 %14.3 %9.5 %

19.0 %28.6 % 0

50

100

150

CodonACUACCACAACG

Original0.0 %

100.0 %0.0 %0.0 %

Target19.0 %35.0 %20.0 %26.0 %

Optimized14.3 %42.9 %14.3 %28.6 %

0

50

100

150

CodonGUUGUCGUAGUG

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %

Target28.0 %20.0 %17.0 %35.0 %

Optimized28.6 %21.4 %14.3 %35.7 %

0

50

100

150

CodonUGG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

150

CodonUAUUAC

Original0.0 %

100.0 %

Target60.0 %40.0 %

Optimized66.7 %33.3 %

0

50

100

150

CodonUAAUGAUAG

Original0.0 %

100.0 %0.0 %

Target68.0 %32.0 %0.0 %

Optimized0.0 %

100.0 %0.0 %

0

50

100

150

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

Position in sequence

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

Sco

re

Page 9

Optimization report

2.3 Secondary structure

In general, an extended secondary structure of the mRNA can interfere with the translation process.

Therefore, the gene optimization tries to reduce the number and length of potential hairpin loops.

2.3.1 Original sequence

2.3.2 Optimized sequence

Number of helices 16Average helix length 6.12Maximum helix length 8Average helix score 6.00

Number of helices 11Average helix length 5.55Maximum helix length 7Average helix score 4.45

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

Position in sequence

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

Sco

re

Original sequence Optimized sequence

...............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Sequence position

0

10

20

30

40

50

60

70

GC

rat

io o

ver

a w

indo

w o

f 31

nt (

%)

Page 10

Optimization report

2.4 GC distribution

GC ratio over a window of 31 nt:

Original sequence: 49.57% (32.26% - 70.97%)

Optimized sequence: 49.22% (35.48% - 74.19%)

The number indicate the average GC content. The values in brackets indicate the interval containing 95% of

all nucleotides if the GC content is averaged over a window of 11 nucleotides.

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5

Repeat length

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Fre

quen

cy

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5

Repeat length

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Fre

quen

cy

Page 11

Optimization report

2.5 Long range repeats

2.5.1 Original sequence

Number of repeats: 91

Longest repetitive sequence: 9 bases

2.5.2 Optimized sequence

Page 12

Optimization report

Number of repeats: 87

Longest repetitive sequence: 6 bases

2.6 Secondary ORFs

During the optimization, secondary ORFs were removed. These are ORFs in the second or third frame or on

the opposite strand. The removal was done by inserting stop codons by silent mutagenesis, or by changing

start codons. The optimization tries to avoid secondary ORFs with more than 50 nucleotides.

2.6.1 Original sequence:

2.6.2 Optimized sequence:

2.7 Restriction sites

The table lists the unwanted restriction sites contained in the sequence, as well as their positions.

2.8 AT/GC stretch restrictor

2.8.1 Original sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 19

Average AT/GC stretch length: 5.26

Number of secondary ORFs: 7Total length of sec. ORFs: 244

Number of ORFs with >50nt: 2

Number of secondary ORFs: 10Total length of sec. ORFs: 398

Number of ORFs with >50nt: 5

Enzyme Positions in originalsequence

Positions in optimizedsequence

EcoRI 1 1HindIII 1 0KpnI 2 0NheI 0 0SalI 0 0XbaI 1 1XhoI 1 1

Page 13

Optimization report

2.8.2 Optimized sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 6

Average AT/GC stretch length: 6.50

3 Optimized sequence

This is the optimized sequence, ready for copying and pasting into other applications.

GTCGA CGCTA GCAAG AAATG TCTAG ACTCG AGAAC AAGTA TAGCT ATTAT

CCGGA AGATC CGGTC AAACT GGCCT CAATT GTGAA AGCGT CCTTC GAAGA

AGGCA AATGC GGTTT GAATA GCGTA GATTC TCTTG AACAC GAGAT GTGGA

GATCG AGGGC AGACG AGATC AATGC GATAT TTGAA GAGAA CGAGG TCGAT

ATATC CGTCG TTGTT CAGGA TCCGA AAAAC GTTTA CCAGC GTGGT ACGCA

TCCCT TCTCG CGTAT CAGGG ATGGT TTACA ATACG GGTGG AAGAC GTGGG

GAAAA AATCT GGTGT TTTCT CCTGG TCGCA AGAAC GGCAG CTTTA TTATT

GACGG GAAAT CACGC AAGGA ATGTC CGTTT AGTAA TCGTG TGGGA CCTGG

ACCAG GCTGC GACGG TCGTG GCAAA TCCAC CCGTA GTACA ACCGA TAGCG

GTAAA GTGAT TCCCG AATGG TGCTG TCGCA GCTGC ACTAT GCCAC CGGTG

AGTTT TCATG GCAGT GACGG TTGTT GGTAT CCGAT GGAAA TCCGT CCACG

CAAAA CCCAT GAATC ACACC TGGTT CGGAG CTGGG TAGAA TTCTG ATAAG

GTACC AAGCT T

8.4. Relatório da otimização do gene NS3 para expressão em E. coli

!

Page 1

Optimization report

Optimization reportCreated with Leto 1.0

1 General Information:

1.1 Sequence

Below the original sequence and optimized sequence are listed, labelled with 'Org:' and 'Opt:' respectively.

Where both are identical, the original sequence contains dots instead of nucleotides ('.'). Where the original

sequence was locked against editing, it contains underscores ('_'). The names of the restriction enzymes start

at the first nucleotide after the restriction cut in the forward strand.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

ORF: M S R L E S N G E I E

Org: _____ _____ _____ __ ___ ___ ___ ___ ___ ..T ..C ..T ..A ..C ...

Opt: GTCGA CGCTA GCAAG AA ATG TCT AGA CTC GAG TCC AAT GGC GAG ATT GAA

SalI NheI XbaI XhoI

55 60 65 70 75 80 85 90 95

ORF: D V Q T D I P S E P W N T G H D

Org: ..C ..T ... ... ..C ..C ..G ..T ... ..G ... ... ... ... ..C ..C

Opt: GAT GTA CAG ACC GAT ATT CCC TCA GAA CCT TGG AAC ACC GGT CAT GAT

BsrGI AgeI BspHI

100 105 110 115 120 125 130 135 140 145

ORF: W I L A D K R P T A W F L P S I

Org: ... ... C.G ..T ... ... ... ... ..C ..T ... ... ... ... ... ..C

Opt: TGG ATC TTA GCG GAC AAA CGT CCG ACT GCG TGG TTC CTG CCG TCT ATT

Gene: YF_NS3_BacOptimization requested by: With restriction sites included

Date: Sep 26, 2007Operator: Dhalia

Target organism: Escherichia coli_Cut_off_50%Optimization iteration: 1

Length: 791 bp

Page 2

Optimization report

150 155 160 165 170 175 180 185 190

ORF: R A A N V M A A S L R K A G K S

Org: ... ..T ..T ..C ..T ... ..T ..T TCT ... ..T ... ..T ... ..A TCT

Opt: CGT GCA GCC AAT GTG ATG GCA GCC AGC CTG CGC AAA GCC GGT AAG AGC

FspI

195 200 205 210 215 220 225 230 235 240

ORF: V V V L N R K T F E R E Y P T I

Org: ..T ..T ..T ... ... ..T ... ..C ... ... ..T ... ..C ... ..C ...

Opt: GTG GTC GTG CTG AAC CGC AAA ACT TTC GAA CGC GAA TAT CCG ACA ATC

BstBI

245 250 255 260 265 270 275 280 285 290

ORF: K Q K K P D F I L A T D I A E M

Org: ... ... ..A ... ..G ..C ..C ..C ... ..T ..C ... ..C ... ... ...

Opt: AAA CAG AAG AAA CCT GAT TTT ATT CTG GCG ACG GAC ATA GCT GAA ATG

295 300 305 310 315 320 325 330 335

ORF: G A N L C V E R V L D C R T A F

Org: ..T ..T ..C ..G ... ... ... ..T ... C.. ..C ..C ... ... ..T ...

Opt: GGA GCG AAT CTT TGC GTT GAA CGG GTT TTG GAT TGT CGT ACC GCG TTC

340 345 350 355 360 365 370 375 380 385

ORF: K P V L V D E G R K V A I K G P

Org: ... ... ..T C.. ..T ..C ... ... ..T ... ... ..T ..C ... ..T ..G

Opt: AAA CCG GTA TTG GTC GAT GAA GGT CGC AAA GTT GCA ATT AAA GGA CCA

AgeI

390 395 400 405 410 415 420 425 430

ORF: L R I S A S S A A Q R R G R I G

Org: ... C.T ... ..T ..T ..T TC. ... ..T ..G ... ... ..T C.T ..C ..T

Opt: CTG AGA ATC TCA GCC TCC AGT GCT GCA CAA CGT CGT GGG AGA ATT GGA

435 440 445 450 455 460 465 470 475 480

ORF: R N P N R D G P G P G P G E M R

Org: ..T ..C ... ..C C.T ... ... ..G ... ..G ... ..G ... ... ... C.T

Opt: CGG AAT CCG AAT AGG GAC GGT CCA GGT CCA GGT CCC GGT GAA ATG AGG

485 490 495 500 505 510 515 520 525 530

ORF: L R D D Q R K V F R E L V R N C

Org: ... ... ..C ..C ... ..T ... ..T ..C ..T ..A ..G ..T ..T ... ..C

Opt: CTG CGT GAT GAT CAG CGC AAA GTC TTT CGC GAG CTC GTG CGC AAC TGT

BclI NruI SacIBssSIFspI

Page 3

Optimization report

535 540 545 550 555 560 565 570 575

ORF: D L P V W L S W Q V A K A G L K

Org: ... C.G ... ..T ... C.G TC. ... ..G ..T ..T ... ..T ..T ..G ..A

Opt: GAC TTA CCG GTG TGG TTA AGT TGG CAA GTA GCC AAA GCG GGA CTT AAG

AgeI AflII

580 585 590 595 600 605 610 615 620 625

ORF: T N D R K W C F E G P E E H E I

Org: ..C ... ..C ..T ... ... ... ..C ..A ... ..G ... ... ... ..A ..C

Opt: ACG AAC GAT CGG AAA TGG TGC TTT GAG GGT CCA GAA GAA CAC GAG ATA

PvuI BssSI

630 635 640 645 650 655 660 665 670

ORF: L N D S G E T V K C R A P G G A

Org: ... ... ... ..T ... ... ..C ..T ... ... ... ... ... ... ... ...

Opt: CTG AAC GAC TCG GGT GAA ACA GTG AAA TGC CGT GCT CCG GGT GGT GCT

675 680 685 690 695 700 705 710 715 720

ORF: K K P L R P R W C D E R V S S D

Org: ..A ... ..G ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... TCT TC. ..C

Opt: AAG AAA CCT CTG CGT CCG CGT TGG TGT GAC GAA CGT GTT AGC AGT GAT

BclI

725 730 735 740 745 750 755 760 765 770

ORF: Q S A L S E F I K F A E G R R E

Org: ... TCT ..T ... ..T ..A ..C ... ..A ..C ..T ..A ... ... ..T ___

Opt: CAG AGC GCA CTG TCG GAG TTT ATC AAG TTT GCG GAG GGT CGT CGC GAA

NruI EcoRI

775 780 785 790

ORF: F !

Org: ___ ___ _____ _____ _____

Opt: TTC TGA TAAGG TACCA AGCTT

KpnI HindIII

Acc65I

Page 4

Optimization report

1.1.1 Restriction table

1.1.2 Enzymes that cut five or fewer times

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 779AflII c'ttaa_g 1 572AgeI a'ccgg_t 3 86, 340, 535BclI t'gatc_a 2 490, 718BspHI t'catg_a 1 91BsrGI t'gtac_a 1 52BssSI c'acga_g 2 617, 515BstBI tt'cg_aa 1 218EcoRI g'aatt_c 1 767FspI tgc'_gca 2 174, 519HindIII a'agct_t 1 785KpnI g_gtac'c 1 779NheI g'ctag_c 1 6NruI tcg'_cga 2 508, 763PvuI cg_at'cg 1 583SacI g_agct'c 1 512SalI g'tcga_c 1 0XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26

Enzyme Recognition Frequency PositionsAcc65I g'gtac_c 1 779AflII c'ttaa_g 1 572AgeI a'ccgg_t 3 86, 340, 535BclI t'gatc_a 2 490, 718BspHI t'catg_a 1 91BsrGI t'gtac_a 1 52BssSI c'acga_g 2 617, 515BstBI tt'cg_aa 1 218EcoRI g'aatt_c 1 767FspI tgc'_gca 2 174, 519HindIII a'agct_t 1 785KpnI g_gtac'c 1 779NheI g'ctag_c 1 6NruI tcg'_cga 2 508, 763PvuI cg_at'cg 1 583SacI g_agct'c 1 512SalI g'tcga_c 1 0XbaI t'ctag_a 1 20XhoI c'tcga_g 1 26

Page 5

Optimization report

1.1.3 Enzymes that do not cut

AatII, AclI, AfeI, ApaI, ApaLI, AscI, AseI, AsiSI, AvrII, BamHI, BbeI, BbvCI, BfrBI, BglII, BsiWI, BspEI, BsrBI,

BssHII, BstZ17I, ClaI, DraI, EagI, EcoRV, FseI, HpaI, KasI, MfeI, MluI, MscI, NaeI, NarI, NcoI, NdeI, NgoMIV,

NotI, NsiI, PacI, PciI, PmeI, PmlI, PsiI, PspOMI, PstI, PvuII, SacII, SbfI, ScaI, SfoI, SmaI, SnaBI, SpeI, SphI,

SrfI, SspI, StuI, SwaI, XmaI, ZraI

1.2 Dotplot

1.3 ORFs

The gene was optimized using the following ORF(s). Please note that sequence positions are given relative to

the continuous DNA sequence defined by all ORFs:

ORF: 18-776

2 Optimized parameters

Page 6

Optimization report

2.1 Codon tandem repeats

Number of codon tandem repeats:

Original sequence: 13

Optimized sequence: 4

2.2 Codon Usage

This is a comparison of the codon frequency of the original sequence vs. the optimized sequence. As a

reference, the codon usage of the target organism is included. The charts indicate the sum of the deviation

from the target codon usage, for the original and the optimized sequence. Lower bars indicate a better match

with the target codon usage.

2.2.1 A - Alanine:

2.2.2 C - Cysteine:

2.2.3 D - Aspartic acid:

Position Number of repeats[399] 2[471] 2[594] 2[648] 2

CodonGCUGCCGCAGCG

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %

Target19.0 %26.0 %24.0 %31.0 %

Optimized19.0 %23.8 %23.8 %33.3 %

0

50

100

150

CodonUGUUGC

Original0.0 %

100.0 %

Target48.0 %52.0 %

Optimized50.0 %50.0 %

0

50

100

150

CodonGAUGAC

Original0.0 %

100.0 %

Target63.0 %37.0 %

Optimized62.5 %37.5 %

0

50

100

150

Page 7

Optimization report

2.2.4 E - Glutamic acid:

2.2.5 F - Phenylalanine:

2.2.6 G - Glycine:

2.2.7 H - Histidine:

2.2.8 I - Isoleucine:

2.2.9 K - Lysine:

CodonGAAGAG

Original95.0 %5.0 %

Target65.0 %35.0 %

Optimized65.0 %35.0 %

0

50

100

150

CodonUUUUUC

Original0.0 %

100.0 %

Target59.0 %41.0 %

Optimized55.6 %44.4 %

0

50

100

150

CodonGGUGGCGGAGGG

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %

Target33.0 %33.0 %15.0 %19.0 %

Optimized66.7 %5.6 %

22.2 %5.6 %

0

50

100

150

CodonCAUCAC

Original0.0 %

100.0 %

Target59.0 %41.0 %

Optimized50.0 %50.0 %

0

50

100

150

CodonAUUAUCAUA

Original0.0 %

100.0 %0.0 %

Target48.0 %36.0 %16.0 %

Optimized50.0 %33.3 %16.7 %

0

50

100

150

CodonAAAAAG

Original100.0 %

0.0 %

Target72.0 %28.0 %

Optimized72.2 %27.8 %

0

50

100

150

Page 8

Optimization report

2.2.10 L - Leucine:

2.2.11 M - Methionine:

2.2.12 N - Asparagine:

2.2.13 P - Proline:

2.2.14 Q - Glutamine:

2.2.15 R - Arginine:

CodonUUAUUGCUUCUCCUACUG

Original0.0 %0.0 %0.0 %5.6 %0.0 %

94.4 %

Target15.0 %12.0 %13.0 %10.0 %0.0 %

50.0 %

Optimized16.7 %11.1 %11.1 %11.1 %0.0 %

50.0 % 0

50

100

150

CodonAUG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

150

CodonAAUAAC

Original0.0 %

100.0 %

Target53.0 %47.0 %

Optimized50.0 %50.0 %

0

50

100

150

CodonCCUCCCCCACCG

Original0.0 %0.0 %0.0 %

100.0 %

Target20.0 %14.0 %21.0 %45.0 %

Optimized17.6 %11.8 %23.5 %47.1 %

0

50

100

150

CodonCAACAG

Original0.0 %

100.0 %

Target33.0 %67.0 %

Optimized33.3 %66.7 %

0

50

100

150

CodonCGUCGCCGACGGAGAAGG

Original96.3 %0.0 %0.0 %0.0 %3.7 %0.0 %

Target39.0 %31.0 %0.0 %

12.0 %9.0 %9.0 %

Optimized40.7 %29.6 %0.0 %

11.1 %11.1 %7.4 % 0

50

100

150

Page 9

Optimization report

2.2.16 S - Serine:

2.2.17 T - Threonine:

2.2.18 V - Valine:

2.2.19 W - Tryptophan:

2.2.20 Y - Tyrosine:

2.2.21 ! - Stop:

CodonUCUUCCUCAUCGAGUAGC

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %0.0 %0.0 %

Target17.0 %14.0 %16.0 %12.0 %17.0 %24.0 %

Optimized13.3 %13.3 %13.3 %13.3 %20.0 %26.7 % 0

50

100

150

CodonACUACCACAACG

Original0.0 %

100.0 %0.0 %0.0 %

Target19.0 %35.0 %20.0 %26.0 %

Optimized22.2 %33.3 %22.2 %22.2 %

0

50

100

150

CodonGUUGUCGUAGUG

Original100.0 %

0.0 %0.0 %0.0 %

Target28.0 %20.0 %17.0 %35.0 %

Optimized25.0 %18.8 %18.8 %37.5 %

0

50

100

150

CodonUGG

Original100.0 %

Target100.0 %

Optimized100.0 %

0

50

100

150

CodonUAUUAC

Original0.0 %

100.0 %

Target60.0 %40.0 %

Optimized100.0 %

0.0 %

0

50

100

150

CodonUAAUGAUAG

Original0.0 %

100.0 %0.0 %

Target68.0 %32.0 %0.0 %

Optimized0.0 %

100.0 %0.0 %

0

50

100

150

0 100 200 300 400 500 600 700

Position in sequence

0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

Sco

re

Page 10

Optimization report

2.3 Secondary structure

In general, an extended secondary structure of the mRNA can interfere with the translation process.

Therefore, the gene optimization tries to reduce the number and length of potential hairpin loops.

2.3.1 Original sequence

2.3.2 Optimized sequence

Number of helices 17Average helix length 6.29Maximum helix length 10Average helix score 7.06

Number of helices 16Average helix length 5.19Maximum helix length 6Average helix score 3.94

0 100 200 300 400 500 600 700

Position in sequence

0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

Sco

re

Original sequence Optimized sequence

...........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Sequence position

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GC

rat

io o

ver

a w

indo

w o

f 31

nt (

%)

Page 11

Optimization report

2.4 GC distribution

GC ratio over a window of 31 nt:

Original sequence: 52.57% (35.48% - 77.42%)

Optimized sequence: 51.91% (29.03% - 67.74%)

The number indicate the average GC content. The values in brackets indicate the interval containing 95% of

all nucleotides if the GC content is averaged over a window of 11 nucleotides.

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Repeat length

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Fre

quen

cy

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Repeat length

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Fre

quen

cy

Page 12

Optimization report

2.5 Long range repeats

2.5.1 Original sequence

Number of repeats: 133

Longest repetitive sequence: 15 bases

2.5.2 Optimized sequence

Page 13

Optimization report

Number of repeats: 126

Longest repetitive sequence: 11 bases

2.6 Secondary ORFs

During the optimization, secondary ORFs were removed. These are ORFs in the second or third frame or on

the opposite strand. The removal was done by inserting stop codons by silent mutagenesis, or by changing

start codons. The optimization tries to avoid secondary ORFs with more than 50 nucleotides.

2.6.1 Original sequence:

2.6.2 Optimized sequence:

2.7 Restriction sites

The table lists the unwanted restriction sites contained in the sequence, as well as their positions.

2.8 AT/GC stretch restrictor

2.8.1 Original sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 13

Average AT/GC stretch length: 5.31

Number of secondary ORFs: 7Total length of sec. ORFs: 311

Number of ORFs with >50nt: 4

Number of secondary ORFs: 10Total length of sec. ORFs: 165

Number of ORFs with >50nt: 1

Enzyme Positions in originalsequence

Positions in optimizedsequence

EcoRI 2 1HindIII 0 0KpnI 0 0NheI 0 0SalI 0 0XbaI 1 1XhoI 1 1

Page 14

Optimization report

2.8.2 Optimized sequence

Number of stretches longer than 4 nt: 11

Average AT/GC stretch length: 5.45

3 Optimized sequence

This is the optimized sequence, ready for copying and pasting into other applications.

GTCGA CGCTA GCAAG AAATG TCTAG ACTCG AGTCC AATGG CGAGA TTGAA

GATGT ACAGA CCGAT ATTCC CTCAG AACCT TGGAA CACCG GTCAT GATTG

GATCT TAGCG GACAA ACGTC CGACT GCGTG GTTCC TGCCG TCTAT TCGTG

CAGCC AATGT GATGG CAGCC AGCCT GCGCA AAGCC GGTAA GAGCG TGGTC

GTGCT GAACC GCAAA ACTTT CGAAC GCGAA TATCC GACAA TCAAA CAGAA

GAAAC CTGAT TTTAT TCTGG CGACG GACAT AGCTG AAATG GGAGC GAATC

TTTGC GTTGA ACGGG TTTTG GATTG TCGTA CCGCG TTCAA ACCGG TATTG

GTCGA TGAAG GTCGC AAAGT TGCAA TTAAA GGACC ACTGA GAATC TCAGC

CTCCA GTGCT GCACA ACGTC GTGGG AGAAT TGGAC GGAAT CCGAA TAGGG

ACGGT CCAGG TCCAG GTCCC GGTGA AATGA GGCTG CGTGA TGATC AGCGC

AAAGT CTTTC GCGAG CTCGT GCGCA ACTGT GACTT ACCGG TGTGG TTAAG

TTGGC AAGTA GCCAA AGCGG GACTT AAGAC GAACG ATCGG AAATG GTGCT

TTGAG GGTCC AGAAG AACAC GAGAT ACTGA ACGAC TCGGG TGAAA CAGTG

AAATG CCGTG CTCCG GGTGG TGCTA AGAAA CCTCT GCGTC CGCGT TGGTG

TGACG AACGT GTTAG CAGTG ATCAG AGCGC ACTGT CGGAG TTTAT CAAGT

TTGCG GAGGG TCGTC GCGAA TTCTG ATAAG GTACC AAGCT T

!

8.5. Publicações em congressos

1. PALMA, M. L., VIANA, I.F.T., CRUZ, F.S.P., DHALIA, R., MARQUES, E.T.A. Expression analysis of DNA constructs coding for NS1 and NS3 Yellow Fever proteins: cellular traffic analyses of wild type and lysossome associated membrane protein (LAMP) fused proteins In: XXXIV Congresso da Sociedade Brasileira de Imunologia, 2009, Salvador.

2. VIANA, I.F.T., PALMA, M. L., CRUZ, F.S.P., CALZAVARA, C.E., CORDEIRO, M.T., DHALIA, R., MARQUES, E.T.A. Production of polyclonal antibodies against Yellow Fever Virus proteins: an important tool to evaluate DNA vaccines expression and to develop diagnostic kits In: XXXIV Congresso da Sociedade Brasileira de Imunologia, 2009, Salvador.

3. PALMA, M. L., MELO NETO, O. P. Análise da expressão de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp In: XII Jornada de Iniciação Científica FACEPE, 2008, Recife.

4. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp In: 54º Congresso Brasileiro de Genética, 2008, Salvador.

5. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp In: Jornada de Iniciação Científica do CPqAM, 2008, Recife.

6. VIANA, I.F.T., PALMA, M. L., CRUZ, F.S.P., CALZAVARA, C.E., DHALIA, R., MARQUES, E.T.A. Optimization of Yellow Fever Virus proteins for bacterial expression and policlonal antibodies production: a powerful tool to evaluate viral DNA-based vaccine expression In: XIX National Meeting of Virology, 2008, Caxambu.

7. VIANA, I.F.T., CALZAVARA, C.E., CRUZ, F.S.P., PALMA, M. L., MAIA, R.C.C., BRESSAN, R.F.C., AUGUST, T., DHALIA, R., MARQUES, E.T.A. Production of Policlonal Antibodies Against Yellow Fever Proteins: DNA Vaccine Expression Evaluation. In: First Pan-American Dengue Research Network Meeting, 2008, Recife.

8. PALMA, M. L., VIANA, I.F.T., CRUZ, F.S.P., DHALIA, R., MARQUES, E.T.A. Yellow Fever non-structural proteins expression and cellular traffic analysis: utilization of the lysosome-associated membrane protein (LAMP) signal to target antigens to the major histocompatibility class II compartment In: XIX National Meeting of Virology, 2008, Caxambu.

9. PALMA, M. L., CHAGAS, M.M.S.C, DA COSTA LIMA, T. D.C., ROCHA, P. O., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão e localização subcelular de dois homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp.In: 53° Congresso Brasileiro de Genética, 2007, Águas de Lindóia.

10. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão e localização subcelular de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp In: Jornada de Iniciação Científica do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães -

!

CPqAM/FIOCRUZ, 2007, Recife.

11. PALMA, M. L., MELO NETO, O. P. Análise da expressão e localização subcelular de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania spIn: 11° Jornada de Iniciação Científica, 2007, Recife.

12. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão de dois homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania major In: XVII Encontro Nacional de Genética do Nordeste, 2006, Recife.

13. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp In: X Jornada de Iniciação Científica da FACEPE/CNPq, 2006, Recife.

14. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Análise da expressão de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania sp In: 10º Jornada de Iniciação Científica PIBIC Fiocruz/CNPq, 2006, Recife.

15. ROCHA, P. O., DA COSTA LIMA, T. D.C., CHAGAS, M.M.S.C, PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Expression analysis of proteins involved in translation initiation during life cycle of representative species of Leishmania In: XXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Protozoologia/ XXXIII Reunão Anual sobre Pesquisa Básica em Doença de Chagas, 2006, Caxambu.

16. PALMA, M. L., REIS, C. R. S., MELO NETO, O. P. Iniciação da síntese protéica em Leishmania sp: análise da expressão de cinco homólogos ao fator eIF4G In: XIV Congresso de Iniciação Científica da UFPE, 2006, Recife.

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Nome: Mariana de Lucena Palma Data de Nascimento: 10 de Abril de 1986 e-mail: marianalp@cpqam.fiocruz.brCurso de Graduação: Bacharelado em Biomedicina Data de Colação de Grau: 11 de Março de 2008

Iniciação Científica: Projeto: Análise da expressão de homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G durante o ciclo de vida de Leishmania SP.Orientador: Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto Co-orientador: Christian Robson de Souza Reis

Artigo publicado:

Dhalia, R., et al, Membrane and envelope virus proteins co-expressed as lysosome associated membrane protein (LAMP) fused antigens: a potential tool to develop DNA vaccines against flaviviruses. An Acad Bras Cienc, 2009. 81(4): p. 663-9

Artigo em desenvolvimento:

Palma, M.L. e Viana, I.T.V., et al, Construction of Yellow Fever antigens optimized for bacterial expression aiming to obtain highly specific and sensitive polyclonal antibodies: tools to develop diagnostic kits and to evaluate viral DNA vaccine expression.

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