Construção de Bancos Genômicos e de cDNA

Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus

O quê é um banco genômico?

Qual a diferença para um banco de cDNA?

Quando escolher um ou outro?

Quais as vantagens/características de cada um deles?

Banco genômico : É um conjunto de vetores recombinantes, contendo parcial ou o totalmente, o genoma de um organismo.

Banco parcial também é denominado de sub-banco.

Banco de cDNA: É um conjunto de vetores recombinantes contendo seqüências de DNA obtidas a partir do mRNA de um organismo. (DNA complementar ao conjunto de mRNA de um determinado organismo, em um dado momento).

Conterá seqüências de DNA daquele organismo que foram transcritas nas condições do experimento.

Banco Genômico:

1 – trabalhar com procariotos

2 – em trabalhos envolvendo eucariotos no qual se deseja estudar as regiões regulatórias e/ou visualizar/caracterizar os íntrons

Banco de cDNA :

1- trabalhos envolvendo eucariotos no qual se pretende clonar algum gene

2 – estudar os genes transcritos em determinadas condições.

Banco Genômico:

1 – insertos são muito grandes (milhares de pares de bases)

2 – para se ter um banco representativo é necessário se ter muitos clones recombinantes independentes, carregando grandes insertos. Fórmula de Clark & Carbon (1976).

Banco de cDNA :

1 – ele só representa os transcritos naquelas condições.

2 – genes transcritos em poucas cópias em geral não são encontrados.

3 – tem que clonar o genômico para caracterizar/confirmar os resultados.

Vetores:

São moléculas de DNA que irão introduzir o DNA (cDNA) da célula hospedeira na célula receptora.

Principais tipos:

1 – Plasmídeos

2 – Fagos

3 – Cosmídeos

4 – BAC (cromossomo artificial de bactéria)

5 – YAC (cromossomo artificial de levedura)

Construção de um banco genômico

1 – escolha do vetor

2 – escolha do doador

3 – escolha do receptor

4 – extração do DNA do doador

5 – extração do DNA do vetor

6 – digestão dos DNAs obtidos com a mesma enzima de restrição

7 – produção de vetores recombinantes

8 – análise do banco produzido.

Construção de um banco cDNA

1 – escolha do vetor

2 – escolha do doador

3 – escolha do receptor

4 – extração do mRNA do doador

5 – produção do cDNA

6 – extração do DNA do vetor

7 – digestão dos DNAs obtidos com a mesma enzima de restrição

8 – produção de vetores recombinantes

9 – análise do banco produzido.

MM INT EcoRI

MM INT EcoRI

MM 1 2 3 4 5 6 7 8

LIGASE + - + - + - + -

Controle de ligação

Plasmídeo

Transformar célula hospedeira

Introduzir o DNA exógeno dentro da célula.

Diferentes plasmídeos recombinantes

Diferentes Bancos Genômicos Produzidos

Análise do tamanho dos insertos através de digestão com EcoRI

Alguns plasmídeos de clones isolados

Análise do tamanho dos insertos de plasmídeos isolados de diferentes clones, através de digestão com EcoRI/HindIII

Síntese de cDNA

Síntese de cDNA