CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP) ?· Minicursos CRQ-IV - 2010 Validação e Protocolos…

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<ul><li><p>CONSELHO REGIONAL DEQUMICA - IV REGIO (SP)</p><p>Ministrante: Leonardo Csar AmstaldenLaboratrio T&amp;Analtica - Campinas/SPContatos: leonardo@teanalitica.com.br</p><p>Ribeiro Preto, 22 de maio de 2010</p><p>Validao e protocolosem anlises qumicas</p><p>Apoio</p><p>Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formatoPDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>VALIDAOE PROTOCOLOS EM ANLISES QUMICAS</p><p>Leonardo Csar AmstaldenGerente da Qualidade - Laboratrio T&amp;E Analtica Campinas SP</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Mtodos Qumicos: So procedimentos empregados para IDENTIFICAR(Anlise Qualitativa) e/ou QUANTIFICAR (Anlise Quantitativa) compostosqumicos:</p><p>Anlise qualitativaA anlise qualitativa empregada quando se pretende determinar ouidentificar as espcies ou elementos qumicos presentes numa amostra,podendo ser eles atmicos ou moleculares.</p><p>Anlise quantitativaA anlise quantitativa empregada para se determinar a quantidade deuma espcie ou elemento qumico numa amostra. Sendo utilizada para adeterminao de concentraes, volumes ou massa exata da substncia,atravs de tcnicas de: gravimetria, volumetria, instrumentais, entre outras expressa por resultados numricos dos componentes da amostra.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Mtodos Instrumentais em qumica analtica foram desenvolvidos a partirdo incio do sculo XX, baseados em propriedades como condutividadeeltrica, emisso ou absoro de luz dos analitos presentes em umcomposto.</p><p>Tcnicas de separao, determinao e quantificao das espciesqumicas passaram a ser conhecidas como MTODOS DE ANLISEINSTRUMENTAL e foram favorecidas pelos dispositivos tecnolgicoseletrnicos e capacidade de processamento dos computadores.</p><p>A maioria dos equipamentos analticos modernos possuem ou estoconectados a um ou mais dispositivos eletrnicos sofisticados capazes dedetectar e registrar dados relativos aos analitos</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Um mtodo quantitativo baseado na resposta do sistema dedeteco do instrumento ao sinal gerado pela espcie qumica deinteresse presente na amostra em estudo, comparado com aquelegerado por um produto que tem esta mesma espcie qumica deinteresse presente em uma concentrao conhecida de declarada(Padro Analtico).</p><p>A resposta geralmente um sinal eletrnico que gera um pico deintensidade, cuja rea calculada atravs de um software deaquisio de dados do instrumento, fornecendo um valornumrico aos sinais que representam a espcie.Assim so quantificados os sinais gerados pelas tcnicas deHPLC, CFG, AA, ICPlasma, dentre outras.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>At as dcadas de 80 e 90, um laboratrio desenvolvia ummtodo analtico baseando-se principalmente na respostalinear do detector a diferentes concentraes do analito emuma faixa de interesse. Se fosse razovel, o mtodo eraaceito sem maiores questionamentos, muitas vezesdescrito apenas como uma receita de bolo. Porm algumasquestes comearam a ser levantadas, em especial duas:</p><p> Como asseguro que o resultado obtido verdadeiro?</p><p> Se outro laboratrio for utilizar meu mtodo, ser queconseguir reproduzir os resultados que obtive?</p><p>Para responder essas questes preciso VALIDAR meumtodo</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Definio: Validar um mtodo testar o seu desempenho, de acordo comcritrios estabelecidos, tendo como objetivo confirmar se ele apropriado para ouso pretendido.</p><p>O laboratrio deve validar:</p><p>Mtodos no normalizados</p><p>Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio</p><p>Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram criados</p><p>Ampliaes ou modificaes em mtodos normalizados</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p> Deve haver um procedimento que descreva oprocesso de validao e cada estudo deve serplanejado atravs de um Plano ou Protocolo deestudo. O laboratrio deve utilizar equipamentosadequados e calibrados ou qualificados, quandoaplicvel. O responsvel pelo estudo deve sercompetente na rea, sendo capaz de tomardecises apropriadas durante a realizao doestudo.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Documentos de referncia:</p><p> INMETRO DOQ-CGCRE-008 R03 - Orientao Sobre Validao deMtodos Analticos, fev/2010</p><p> ANVISA: RE 899 de 29 de maio de 2003 - GUIA PARA VALIDAODE MTODOS ANALTICOS E BIOANALTICOS</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Os parmetros de validao devem estar claramentedeclarados no procedimento documentado e incluir, quandoaplicvel:</p><p> Seletividade/Especificidade Linearidade Faixa de trabalho e Faixa linear Limite de deteco Limite de quantificao Tendncia/recuperao Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade) Robustez</p><p>Como validar?</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>X XREPREPR</p><p>PADRESINTERLABO</p><p>EXATIDO</p><p>A</p><p>PRECISO</p><p>Seletividade/Especificidade</p><p>Linearidade efaixa linearLimites</p><p>Robustez Recuperao</p><p>Estabilidade</p><p>ELEMENTOS DE UM ESTUDO DE VALIDAO</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Figura 1 Parmetros de validao conforme o tipo de ensaio</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>(1) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no sernecessria a determinao dos limites de deteco e dequantificao, como por exemplo: determinao de sacarose embalas e determinao do teor de gordura em carnes, por exemplo,componentes maiores com concentrao entre 1 a 100%.</p><p>(2) So considerados como de menor teor, concentraes entre 0,01 e1% e como traos, os elementos em concentrao abaixo de0,01%</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho damedio. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeitotambm pode depender da concentrao.</p><p>Assim, verifica-se se o mtodo seletivo ou especfico para o analito de interesse, ouseja, se a resposta do instrumento ao se aplicar o mtodo no sofre interferncia deoutros componentes da matriz.</p><p>Como avaliar a seletividade?</p><p>1) Analisar um branco de reagentes, analisar o padro, analisar a amostra com e sem oanalito de interesse (placebo). Caso o placebo no seja disponvel fazer acrscimocontrolado de padro sobre a amostra.</p><p>2) Avaliar a amostra na presena de interferentes, ou seja, introduzir elementos queprovoquem stress</p><p>SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Avaliao de Seletividade</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Agente Condies</p><p>LuzEx: Exposio da embalagem primria a Luz Fluorescente comume Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga por um perodode tempo definido</p><p>Temperatura Ex: 60oC na embalagem primria por um perodo de tempo</p><p>definido</p><p>Umidade 30oC / 75% UR na embalagem primria por um perodo de tempo</p><p>definido</p><p>Agente Alcalino Adio soluo alcalina NaOH 0,1M por um perodo de tempodefinido</p><p>Agente cido Adio soluo cida HCl 0,1M por um perodo de tempo definido</p><p>Agente Oxidante Adio de soluo de H2O2 5% v/v por um perodo detempo definido.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>SELETIVIDADEUm mtodo seletivo quando existe probabilidade acima 80% de ser a espcie pesquisada</p><p>ESPECIFICIDADE</p><p>Um mtodo especfico quanto ele consegue definir uma funo qumica especfica ou ainda uma nica espcie distinta em um nico sinal.Um mtodo especfico quando h uma boa (&gt;95%) probabilidade de ser a espcie pesquisada</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE</p><p>1- Teor de LCOOIS = Seletivo</p><p>2- Teor de BUTEN-2-OL-2 = EspecficoTeor de LCOOIS = Seletivo </p><p>3- Teor de Trans- BUTEN-2-OL-2 = EspecficoTeor de BUTEN-2-OL-2 = SeletivoTeor de LCOOIS = Seletivo </p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>INTEGRAONORMAL</p><p>1e 2a derivada1e 2a derivada</p><p>start do pico</p><p>possvel pico</p><p>pico confirmado</p><p>Linha de Base possvelpico</p><p>picoconfirmado</p><p>INTEGRAO:CALDAS</p><p>INTERFERNCIA </p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>b1 b2</p><p>Fator de Assimetria</p><p>As = b1 / b2 O fator de assimetria, T tailing factor, uma</p><p>medida de simetria de pico, sendo que valores deT=1,0 referem-se a picos perfeitamente simtricos.O valor de T pode variar aleatoriamentedependendo da assimetria do pico. Com valores deT &lt; 1,0 observa-se que o pico apresenta umaassimetria frontal, e com valores de T &gt; 1,0 umaassimetria distal. A variao da assimetria influi noreconhecimento instrumental do inicio e final dosinal cromatogrfico (derivada 1 e derivada 2),responsvel pela variabilidade da rea integrada.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>R = 0 h total coeluio.</p><p>R = 1,0 representa 94% da resoluo em linha de base.</p><p>R = 1,5 representa 99,8% da resoluo em linha de base. </p><p>Branco Adio de padro</p><p>INTERFERNCIAS</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>BP PB</p><p>P = Baseline Penetration</p><p>BBBegins or ends onBaseline</p><p>BVVB</p><p>V= Valley</p><p>Mesmo na integrao BB que fornece maiorpreciso haver variabilidade em funo da definio de primeira e segunda derivada </p><p>INTEGRAO DE REA</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>LINEARIDADE - CURVAS</p><p>CURVA PADRO: sucesso crescente ou decrescente de pontos obtidos da relao entre aconcentrao da espcie padro pela sua intensidade de sinal proveniente do sistema dedeteco</p><p>CURVA DE CALIBRAO: utilizada com a finalidade de se obter o ajuste. Neste caso o padro definido pelo fabricante ou instituies que zelem pela qualidade.</p><p>CURVA DE RESPOSTA: utilizada com a finalidade de se obter comparao analtica para aquantificao. Busca linearidade dinmica. Aplica-se na curva de resposta a relaosinal/concentrao a fim de verificar a linearidade (relao direta ou regresso linear)</p><p>Na realidade o que se busca a RESPOSTA do sistema de deteco do sistema grandeza introduzida do analito. </p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>x</p><p>y</p><p>Coeficiente Angular : expressa a inclinao da curva aos eixos</p><p>Coeficiente Linear: expressa a interseco da curva aos eixos</p><p>Coeficiente de Correlao: expressa a relao de x a y </p><p>CURVA DE RESPOSTA</p><p>LINEARIDADE</p><p>y=ax + b</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>Fator de Resposta (FR) = relao sinal / concentrao</p><p>sinal</p><p>concentrao</p><p>1</p><p>2Variabilidade dos FR = Fator de Linearidade</p><p>Fator de Linearidade a 2% , pode-se considerar a relao como sendo linear.</p><p>Fator de Linearidade &gt; que 2% , neste casodeve-se utilizar da regresso linear</p><p>LINEARIDADE</p><p>Coeficiente de Correlao (r): Pode-se estabelecer o nvel da relao entre duas variveis atravs do coeficiente de correlao o qual denotamos por r, que varia de -1 a 1. </p><p>Coeficiente de Determinao (r2): Obtido elevando-se r ao quadrado e varia de 0 a 1.</p><p>Assim se uma relao possui coeficiente de correlao 0,80 ento (0,80)2 = 0,64 que multiplicado por100% = (64%) indica que a variao dos ys so explicadas em 64% pela relao com x.Se r = 0,40 r2 = 0,16 ou 16%, ou seja, a variao dos ys explicada em 16% pela variao de x.</p><p>Quanto mais prximo de 1 for o valor de r2, melhor ser a reta descrita pela regresso linear dos pontos.Normalmente procuram-se obter retas com r 0,99</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixadinmica linear. necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa deconcentrao do analito coincide com a faixa dinmica linear e assegurarque nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na resposta.</p><p>A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a respostamedida e a concentrao do analito. A linearidade obtida porpadronizao interna ou externa e formulada como expresso matemticausada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado naamostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis :</p><p>y = ax+b</p><p>LINEARIDADE</p><p>sendo:y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);x = concentrao;a = inclinao da curva analtica = sensibilidade;b = interseo com o eixo y, quando x = 0.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentraoresultam em maior variao na resposta, ou seja, maior inclinao (a).Em geral, sero necessrios vrios nveis de concentrao, no mnimocinco, para construir a curva analtica. O nmero de replicatas em cadanvel de concentrao deve ser o mais prximo possvel daqueleempregado na rotina do laboratrio.</p><p>A verificao da ausncia de valores discrepantes pode ser feita pelo testede Grubbs (ISO 5725-3,1994 e ISO 5725-2, 1994) ou de resduo Jacknife(SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) e a homocedasticidade, isto ,homogeneidade da varincia dos resduos pelo teste de Cochran(ISO 5725-3:1994) ou teste de Levene (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) ou oteste de Brown-Forsythe (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005).</p><p>Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo apsqualquer transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descritapor uma funo que modela a concentrao do analito na amostra.</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>1- Por diluio da soluo -me- definir a concentrao estimada ou esperada.- preparar a soluo-me com o dobro da concentrao estimada ou esperada.- por diluio obter os pontos de acordo com a tabela que se segue:</p><p>ponto ( eixo x ) concentrao5 soluo me4 80% da soluo me3 50% da soluo me2 30% da soluo me1 10% da soluo me</p><p>2- Por preparao de cada pontoCada ponto da curva preparado individualmente. Neste caso evita-se o erro de obteno da soluo-me. Os valores podem ter como base a tabela acima.</p><p>CURVA DE RESPOSTA - PREPARO</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>A - BRANCOSempre que possvel a amostra ou o branco desta amostra deve ser a base para os valores de uma curva, tanto para a adio como para a diluio. Obtido os pontos da curva de resposta, podem-se definir regras de qualidade para a curva. </p><p>AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTA</p><p>B - A CURVA</p><p>1) A curva deve ter no mnimo 5 pontos, incluindo o menor valor (menor valor mensurvel ou o menor valor de interesse para a quantificao) e o maior valor.</p><p>2) Podem-se excluir pontos da curva, mas deve-se manter 5 pontos. O menor e o maior devem permanecer.</p><p>3) Deve-se evitar excluir dois pontos seqenciais.</p><p>Nota: nesta situao para se ter 5 pontos, deve-se elaborar a curva com no mnimo 6 pontos, supondo-se a possibilidade de rejeitar um deles. </p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTAC) EXCLUSO DE PONTOSUm ponto da curva pode ser excludo dependendo do estudo e caso seja previsto em protocolo (lembrando que o pontoexcludo pode ser o valor mais prximo do valor verdadeiro). Um dos motivos da excluso ou no excluso do ponto a suainfluncia sobre a concentrao a ser analisada. Algumas instituies definem valores numricos para a excluso, por exemplo:Variaes acima de 15% entre o valor da concentrao obtida para a concentrao de preparao (conc.=massa/volume dobalo volumtrico) seria um motivo de excluso. Exemplo:</p><p>Pto. Conc.Terica (mg/L)</p><p>Conc.Real(mg/L)</p><p>Replicata 1(mg/L)</p><p>Variao R1(%)</p><p>Replicata 2(mg/L)</p><p>Variao R2(%)</p><p>1 0,50 0,52 0,75 144,2 0,44 84,6</p><p>2 1,00 0,98 1,02 104,1 0,97 98,9</p><p>3 1,50 1,53 1,48 96,7 1,55 101,3</p><p>4 2,00 2,10 2,30 109,5 1,77 84,2</p><p>5 2,50 2,45 2,38 97,1 2,65 108,1</p><p>6 3,00 3,20 2,70 84,3 3,05 95,3</p><p>7 3,50 3,60 3,50 97,2 3,68 102,2</p><p>Concentrao Terica: a ideal planejadaConcentrao Real: a obtida pela relao massa pesada do padro/volume do balo volumtricoVariao: medida da relao entre o valor da replicata/concentrao real</p></li><li><p>Minicursos CRQ-IV - 2010</p><p>Validao e Protocolos em Anlises Qumicas</p><p>Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal</p><p>TESTE DE GRUBBSRejeita valores em relao estimativa do desvio-padro. Este teste observavalores dispersos anmalos maiores ou menores que aparecem no grupo demedidas.</p><p>Para aplicao do teste de Grubbs, utiliza-se a amplitude em relao mdia:1. Colocar os valores obtidos em ordem crescente2. Determinar a mdia aritmtica3. Determinar a amplitude do ma

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