CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP) ?· Minicursos CRQ-IV - 2010 Validação e Protocolos…

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  • CONSELHO REGIONAL DEQUMICA - IV REGIO (SP)

    Ministrante: Leonardo Csar AmstaldenLaboratrio T&Analtica - Campinas/SPContatos: leonardo@teanalitica.com.br

    Ribeiro Preto, 22 de maio de 2010

    Validao e protocolosem anlises qumicas

    Apoio

    Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formatoPDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)

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    Validao e Protocolos em Anlises Qumicas

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    VALIDAOE PROTOCOLOS EM ANLISES QUMICAS

    Leonardo Csar AmstaldenGerente da Qualidade - Laboratrio T&E Analtica Campinas SP

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    Validao e Protocolos em Anlises Qumicas

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    Mtodos Qumicos: So procedimentos empregados para IDENTIFICAR(Anlise Qualitativa) e/ou QUANTIFICAR (Anlise Quantitativa) compostosqumicos:

    Anlise qualitativaA anlise qualitativa empregada quando se pretende determinar ouidentificar as espcies ou elementos qumicos presentes numa amostra,podendo ser eles atmicos ou moleculares.

    Anlise quantitativaA anlise quantitativa empregada para se determinar a quantidade deuma espcie ou elemento qumico numa amostra. Sendo utilizada para adeterminao de concentraes, volumes ou massa exata da substncia,atravs de tcnicas de: gravimetria, volumetria, instrumentais, entre outras expressa por resultados numricos dos componentes da amostra.

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    Mtodos Instrumentais em qumica analtica foram desenvolvidos a partirdo incio do sculo XX, baseados em propriedades como condutividadeeltrica, emisso ou absoro de luz dos analitos presentes em umcomposto.

    Tcnicas de separao, determinao e quantificao das espciesqumicas passaram a ser conhecidas como MTODOS DE ANLISEINSTRUMENTAL e foram favorecidas pelos dispositivos tecnolgicoseletrnicos e capacidade de processamento dos computadores.

    A maioria dos equipamentos analticos modernos possuem ou estoconectados a um ou mais dispositivos eletrnicos sofisticados capazes dedetectar e registrar dados relativos aos analitos

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    Um mtodo quantitativo baseado na resposta do sistema dedeteco do instrumento ao sinal gerado pela espcie qumica deinteresse presente na amostra em estudo, comparado com aquelegerado por um produto que tem esta mesma espcie qumica deinteresse presente em uma concentrao conhecida de declarada(Padro Analtico).

    A resposta geralmente um sinal eletrnico que gera um pico deintensidade, cuja rea calculada atravs de um software deaquisio de dados do instrumento, fornecendo um valornumrico aos sinais que representam a espcie.Assim so quantificados os sinais gerados pelas tcnicas deHPLC, CFG, AA, ICPlasma, dentre outras.

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    At as dcadas de 80 e 90, um laboratrio desenvolvia ummtodo analtico baseando-se principalmente na respostalinear do detector a diferentes concentraes do analito emuma faixa de interesse. Se fosse razovel, o mtodo eraaceito sem maiores questionamentos, muitas vezesdescrito apenas como uma receita de bolo. Porm algumasquestes comearam a ser levantadas, em especial duas:

    Como asseguro que o resultado obtido verdadeiro?

    Se outro laboratrio for utilizar meu mtodo, ser queconseguir reproduzir os resultados que obtive?

    Para responder essas questes preciso VALIDAR meumtodo

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    Definio: Validar um mtodo testar o seu desempenho, de acordo comcritrios estabelecidos, tendo como objetivo confirmar se ele apropriado para ouso pretendido.

    O laboratrio deve validar:

    Mtodos no normalizados

    Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio

    Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram criados

    Ampliaes ou modificaes em mtodos normalizados

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    Deve haver um procedimento que descreva oprocesso de validao e cada estudo deve serplanejado atravs de um Plano ou Protocolo deestudo. O laboratrio deve utilizar equipamentosadequados e calibrados ou qualificados, quandoaplicvel. O responsvel pelo estudo deve sercompetente na rea, sendo capaz de tomardecises apropriadas durante a realizao doestudo.

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    Documentos de referncia:

    INMETRO DOQ-CGCRE-008 R03 - Orientao Sobre Validao deMtodos Analticos, fev/2010

    ANVISA: RE 899 de 29 de maio de 2003 - GUIA PARA VALIDAODE MTODOS ANALTICOS E BIOANALTICOS

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    Os parmetros de validao devem estar claramentedeclarados no procedimento documentado e incluir, quandoaplicvel:

    Seletividade/Especificidade Linearidade Faixa de trabalho e Faixa linear Limite de deteco Limite de quantificao Tendncia/recuperao Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade) Robustez

    Como validar?

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    X XREPREPR

    PADRESINTERLABO

    EXATIDO

    A

    PRECISO

    Seletividade/Especificidade

    Linearidade efaixa linearLimites

    Robustez Recuperao

    Estabilidade

    ELEMENTOS DE UM ESTUDO DE VALIDAO

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    Figura 1 Parmetros de validao conforme o tipo de ensaio

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    (1) Dependendo da faixa de concentrao do analito pode no sernecessria a determinao dos limites de deteco e dequantificao, como por exemplo: determinao de sacarose embalas e determinao do teor de gordura em carnes, por exemplo,componentes maiores com concentrao entre 1 a 100%.

    (2) So considerados como de menor teor, concentraes entre 0,01 e1% e como traos, os elementos em concentrao abaixo de0,01%

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    A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho damedio. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeitotambm pode depender da concentrao.

    Assim, verifica-se se o mtodo seletivo ou especfico para o analito de interesse, ouseja, se a resposta do instrumento ao se aplicar o mtodo no sofre interferncia deoutros componentes da matriz.

    Como avaliar a seletividade?

    1) Analisar um branco de reagentes, analisar o padro, analisar a amostra com e sem oanalito de interesse (placebo). Caso o placebo no seja disponvel fazer acrscimocontrolado de padro sobre a amostra.

    2) Avaliar a amostra na presena de interferentes, ou seja, introduzir elementos queprovoquem stress

    SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE

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    Avaliao de Seletividade

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    Agente Condies

    LuzEx: Exposio da embalagem primria a Luz Fluorescente comume Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga por um perodode tempo definido

    Temperatura Ex: 60oC na embalagem primria por um perodo de tempo

    definido

    Umidade 30oC / 75% UR na embalagem primria por um perodo de tempo

    definido

    Agente Alcalino Adio soluo alcalina NaOH 0,1M por um perodo de tempodefinido

    Agente cido Adio soluo cida HCl 0,1M por um perodo de tempo definido

    Agente Oxidante Adio de soluo de H2O2 5% v/v por um perodo detempo definido.

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    SELETIVIDADEUm mtodo seletivo quando existe probabilidade acima 80% de ser a espcie pesquisada

    ESPECIFICIDADE

    Um mtodo especfico quanto ele consegue definir uma funo qumica especfica ou ainda uma nica espcie distinta em um nico sinal.Um mtodo especfico quando h uma boa (>95%) probabilidade de ser a espcie pesquisada

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    SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE

    1- Teor de LCOOIS = Seletivo

    2- Teor de BUTEN-2-OL-2 = EspecficoTeor de LCOOIS = Seletivo

    3- Teor de Trans- BUTEN-2-OL-2 = EspecficoTeor de BUTEN-2-OL-2 = SeletivoTeor de LCOOIS = Seletivo

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    INTEGRAONORMAL

    1e 2a derivada1e 2a derivada

    start do pico

    possvel pico

    pico confirmado

    Linha de Base possvelpico

    picoconfirmado

    INTEGRAO:CALDAS

    INTERFERNCIA

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    b1 b2

    Fator de Assimetria

    As = b1 / b2 O fator de assimetria, T tailing factor, uma

    medida de simetria de pico, sendo que valores deT=1,0 referem-se a picos perfeitamente simtricos.O valor de T pode variar aleatoriamentedependendo da assimetria do pico. Com valores deT < 1,0 observa-se que o pico apresenta umaassimetria frontal, e com valores de T > 1,0 umaassimetria distal. A variao da assimetria influi noreconhecimento instrumental do inicio e final dosinal cromatogrfico (derivada 1 e derivada 2),responsvel pela variabilidade da rea integrada.

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    R = 0 h total coeluio.

    R = 1,0 representa 94% da resoluo em linha de base.

    R = 1,5 representa 99,8% da resoluo em linha de base.

    Branco Adio de padro

    INTERFERNCIAS

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    BP PB

    P = Baseline Penetration

    BBBegins or ends onBaseline

    BVVB

    V= Valley

    Mesmo na integrao BB que fornece maiorpreciso haver variabilidade em funo da definio de primeira e segunda derivada

    INTEGRAO DE REA

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    LINEARIDADE - CURVAS

    CURVA PADRO: sucesso crescente ou decrescente de pontos obtidos da relao entre aconcentrao da espcie padro pela sua intensidade de sinal proveniente do sistema dedeteco

    CURVA DE CALIBRAO: utilizada com a finalidade de se obter o ajuste. Neste caso o padro definido pelo fabricante ou instituies que zelem pela qualidade.

    CURVA DE RESPOSTA: utilizada com a finalidade de se obter comparao analtica para aquantificao. Busca linearidade dinmica. Aplica-se na curva de resposta a relaosinal/concentrao a fim de verificar a linearidade (relao direta ou regresso linear)

    Na realidade o que se busca a RESPOSTA do sistema de deteco do sistema grandeza introduzida do analito.

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    x

    y

    Coeficiente Angular : expressa a inclinao da curva aos eixos

    Coeficiente Linear: expressa a interseco da curva aos eixos

    Coeficiente de Correlao: expressa a relao de x a y

    CURVA DE RESPOSTA

    LINEARIDADE

    y=ax + b

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    Fator de Resposta (FR) = relao sinal / concentrao

    sinal

    concentrao

    1

    2Variabilidade dos FR = Fator de Linearidade

    Fator de Linearidade a 2% , pode-se considerar a relao como sendo linear.

    Fator de Linearidade > que 2% , neste casodeve-se utilizar da regresso linear

    LINEARIDADE

    Coeficiente de Correlao (r): Pode-se estabelecer o nvel da relao entre duas variveis atravs do coeficiente de correlao o qual denotamos por r, que varia de -1 a 1.

    Coeficiente de Determinao (r2): Obtido elevando-se r ao quadrado e varia de 0 a 1.

    Assim se uma relao possui coeficiente de correlao 0,80 ento (0,80)2 = 0,64 que multiplicado por100% = (64%) indica que a variao dos ys so explicadas em 64% pela relao com x.Se r = 0,40 r2 = 0,16 ou 16%, ou seja, a variao dos ys explicada em 16% pela variao de x.

    Quanto mais prximo de 1 for o valor de r2, melhor ser a reta descrita pela regresso linear dos pontos.Normalmente procuram-se obter retas com r 0,99

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    A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixadinmica linear. necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa deconcentrao do analito coincide com a faixa dinmica linear e assegurarque nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na resposta.

    A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a respostamedida e a concentrao do analito. A linearidade obtida porpadronizao interna ou externa e formulada como expresso matemticausada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado naamostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis :

    y = ax+b

    LINEARIDADE

    sendo:y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);x = concentrao;a = inclinao da curva analtica = sensibilidade;b = interseo com o eixo y, quando x = 0.

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    O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentraoresultam em maior variao na resposta, ou seja, maior inclinao (a).Em geral, sero necessrios vrios nveis de concentrao, no mnimocinco, para construir a curva analtica. O nmero de replicatas em cadanvel de concentrao deve ser o mais prximo possvel daqueleempregado na rotina do laboratrio.

    A verificao da ausncia de valores discrepantes pode ser feita pelo testede Grubbs (ISO 5725-3,1994 e ISO 5725-2, 1994) ou de resduo Jacknife(SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) e a homocedasticidade, isto ,homogeneidade da varincia dos resduos pelo teste de Cochran(ISO 5725-3:1994) ou teste de Levene (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005) ou oteste de Brown-Forsythe (SOUZA; JUNQUEIRA, 2005).

    Alguns procedimentos analticos no demonstram linearidade mesmo apsqualquer transformao. Nesses casos, a resposta analtica pode ser descritapor uma funo que modela a concentrao do analito na amostra.

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    1- Por diluio da soluo -me- definir a concentrao estimada ou esperada.- preparar a soluo-me com o dobro da concentrao estimada ou esperada.- por diluio obter os pontos de acordo com a tabela que se segue:

    ponto ( eixo x ) concentrao5 soluo me4 80% da soluo me3 50% da soluo me2 30% da soluo me1 10% da soluo me

    2- Por preparao de cada pontoCada ponto da curva preparado individualmente. Neste caso evita-se o erro de obteno da soluo-me. Os valores podem ter como base a tabela acima.

    CURVA DE RESPOSTA - PREPARO

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    A - BRANCOSempre que possvel a amostra ou o branco desta amostra deve ser a base para os valores de uma curva, tanto para a adio como para a diluio. Obtido os pontos da curva de resposta, podem-se definir regras de qualidade para a curva.

    AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTA

    B - A CURVA

    1) A curva deve ter no mnimo 5 pontos, incluindo o menor valor (menor valor mensurvel ou o menor valor de interesse para a quantificao) e o maior valor.

    2) Podem-se excluir pontos da curva, mas deve-se manter 5 pontos. O menor e o maior devem permanecer.

    3) Deve-se evitar excluir dois pontos seqenciais.

    Nota: nesta situao para se ter 5 pontos, deve-se elaborar a curva com no mnimo 6 pontos, supondo-se a possibilidade de rejeitar um deles.

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    AVALIANDO A CURVA DE RESPOSTAC) EXCLUSO DE PONTOSUm ponto da curva pode ser excludo dependendo do estudo e caso seja previsto em protocolo (lembrando que o pontoexcludo pode ser o valor mais prximo do valor verdadeiro). Um dos motivos da excluso ou no excluso do ponto a suainfluncia sobre a concentrao a ser analisada. Algumas instituies definem valores numricos para a excluso, por exemplo:Variaes acima de 15% entre o valor da concentrao obtida para a concentrao de preparao (conc.=massa/volume dobalo volumtrico) seria um motivo de excluso. Exemplo:

    Pto. Conc.Terica (mg/L)

    Conc.Real(mg/L)

    Replicata 1(mg/L)

    Variao R1(%)

    Replicata 2(mg/L)

    Variao R2(%)

    1 0,50 0,52 0,75 144,2 0,44 84,6

    2 1,00 0,98 1,02 104,1 0,97 98,9

    3 1,50 1,53 1,48 96,7 1,55 101,3

    4 2,00 2,10 2,30 109,5 1,77 84,2

    5 2,50 2,45 2,38 97,1 2,65 108,1

    6 3,00 3,20 2,70 84,3 3,05 95,3

    7 3,50 3,60 3,50 97,2 3,68 102,2

    Concentrao Terica: a ideal planejadaConcentrao Real: a obtida pela relao massa pesada do padro/volume do balo volumtricoVariao: medida da relao entre o valor da replicata/concentrao real

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    TESTE DE GRUBBSRejeita valores em relao estimativa do desvio-padro. Este teste observavalores dispersos anmalos maiores ou menores que aparecem no grupo demedidas.

    Para aplicao do teste de Grubbs, utiliza-se a amplitude em relao mdia:1. Colocar os valores obtidos em ordem crescente2. Determinar a mdia aritmtica3. Determinar a amplitude do maior (maior valor - mdia)4. Testar o maior valor do conjunto segundo a equao:

    sxxG maior )(

    S = desvio padro

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    5. Testar o menor valor do conjunto segundo a equao:

    sxxG menor )(

    6. Comparar os valores de G com os valores crticos a 95% de confianaNmero de resultados (n) G (95%)

    3 1,155

    4 1,481

    5 1,715

    6 1,887

    7 2,020

    8 2,126

    9 2,215

    10 2,290

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    7. Se Gcalculado>Gtabelado o maior valor rejeitado e, se Gcalculado

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    A A(crescente) A B B(crescente) B

    7,08 7,07 Med:7,13 8,16 7,89 Med:8,18

    7,19 7,08 S=0,05 8,08 8,01 S=0,306

    7,12 7,09 8,29 8,03

    7,09 7,11 9,00 8,08

    7,16 7,12 8,03 8,10

    7,14 7,14 8,01 8,13

    7,07 7,14 8,13 8,13

    7,14 7,16 7,89 8,16

    7,23 7,19 8,13 8,29

    7,11 7,23 8,10 9,00

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    Produto A

    Analisando o maior:

    G=(7,23-7,13)/(0,05)=0,1/0,05=2,0 Gtabelado 95=2,290Maior aprovado

    G=(7,13-7,07)/(0,05)=0,06/0,05=1,2 Gtabelado 95=2,290Maior aprovado

    Analisando o menor:

    Exerccio: Fazer o mesmo para o produto B

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    Faixa de Trabalho e Faixa Linear

    Para qualquer mtodo quantitativo, existe uma faixa de concentraes doanalito ou valores da propriedade no qual o mtodo pode ser aplicado.

    Todo experimento de determinao da faixa de trabalho iniciado pelaescolha de uma faixa preliminar. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa deaplicao para a qual o ensaio vai ser usado e a concentrao maisesperada da amostra deve, sempre que possvel, se situar no centro dafaixa de trabalho.

    No limite inferior da faixa de concentrao, o fator limitante o valor do limitede quantificao. No limite superior, os fatores limitantes dependem dosistema de resposta do equipamento de medio.

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    Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear edentro desta, a resposta do sinal ter uma relao linear com o analito ouvalor da propriedade. A extenso dessa faixa pode ser estabelecidadurante a avaliao da faixa de trabalho.

    Concentrao

    rea

    Faixa de Trabalho e Faixa Linear

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    Faixa de Trabalho e Faixa Linear

    Como definir a faixa de trabalho?

    Depende dos objetivos do mtodo.

    Normalmente o mtodo indica o valor alvo de concentrao a serdeterminada. Este valor determinado como 100% (meio da curva) etrabalha-se com as solues mais concentradas e diludas para obter osoutros pontos.

    Faixas comuns:90% a 110%80% a 120%50% a 150%

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    Nmero de Replicatas Matriz Objetivos e Procedimentos

    Etapa 1: 7 Branco (gua reagente) com concentraes variadas do analito ou;Placebo da amostra com concentraes variadas do analito;Preparar diferentes concentraes de modo independente e no a partir de uma soluo me.

    Objetivo: Identificar a faixa linear aproximada e os limites superior e inferior da faixa de trabalho.Graficar colocando no eixo X as concentraes e no eixo y as respostas;Ir para a etapa 2

    Etapa 2: 7 Materiais de referncia de diferentesconcentraes na faixa linear ou;Placebo da amostra com concentraes variadas do analito na faixa linear

    Objetivo: Determinar a faixa de trabalho e confirmar a linearidade;Graficar colocando no eixo X as concentraes e no eixo y as respostas;Verificar visualmente a existncia de pontos dispersos que possam interferir na regresso;Calcular o coeficiente de regresso linear;Calcular e construir o grfico dos valores de resduos. A distribuio aleatria em torno da linha reta confirma a linearidade;Ir para a etapa 3

    Etapa 3: 7 Placebo da amostra com concentraes variada do analito, prximas ao LD

    Objetivo: Determinar o LQ (limite de quantificao), que efetivamente forma o limite mais baixo da faixa de trabalhoExpressar o LQ como a concentrao mais baixa do analito que pode ser determinada com um nvel aceitvel de incerteza.

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    DETECTABILIDADE

    A DETECTABILIDADE normalmente confundida em anlise instrumental com a SENSIBILIDADE

    DETECTABILIDADE1- o quanto o sistema de deteco do sistema analtico consegue enxergar2- a quantidade mnima da espcie qumica em massa que o sistema analtico consegue mensurar3-Um equipamento possui alta detectabilidade, quando consegue enxergar uma quantidade

    mnima da funo ou espcie em questo.

    A detectabilidade de um equipamento que mede: A__________________________________________B

    0,1 g possui menor detectabilidade que 0,01g

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    Exemplo de Detectabilidades de Instrumentos(considerao geral, pois depende da molcula e do meio)

    CFG/FID = 0,5 mg/litroCFG/ECD = 0,1 g/litroGC/MS/SIM = 5 g/litroLC/MSMS = 0,1 ng/mLICP = 1 g/litroHPLC = 0,1 mg/litro

    1- Qual a detectabilidade do tolueno quando h deteco na anlise de 0,2 microlitros de umasoluo aquosa a 0,5 mg/kg.0,5mg/kg=0,5mg/litro=0,5g/mL=0,5ng/L. Como a detectabilidade foi para 0,2 L

    0,5 ng 1Lx 0,2L x = 0,1 ng de detectabilidade

    DETECTABILIDADE

    2 - Se 0,5 L de amostra introduzida num GC/MS/SIM a massa detectada de 2,5 picogramas (pg)Se o split for 1:50 a massa ser 0,05 pg = 50 fentogramas

    Exemplos:

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    Limite de Deteco (LD)

    Quando so realizadas medidas em amostras com baixos nveis do analitoou de uma propriedade, como por exemplo, anlise de traos, importantesaber qual o menor valor de concentrao do analito ou da propriedade quepode ser detectado pelo mtodo.

    O limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em funodo tipo da amostra. fundamental assegurar-se de que todas as etapas deprocessamento do mtodo analtico sejam includas na determinao desselimite de deteco.Para a validao de um mtodo analtico, normalmente suficiente forneceruma indicao do nvel em que a deteco do analito pode ser distinguidado sinal do branco/rudo.

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    Determinao de Limite de Deteco (LD)Existem diversas formas de se calcular o limite de deteco. Abaixo so apresentadas algumasdestas metodologias.

    Matriz Clculos ObservaesBranco da amostra LD = X + t (n1) .s

    sendo:X = mdia dos valores dos brancos da amostra;t a distribuio de Student, dependente do tamanho da amostra e do grau de confiana e,s = desvio-padro amostral dosbrancos da amostra.

    A mdia e o desvio-padro amostraldos brancos da amostra sodependentes da Matriz. Vlidosomente quando os valores dosbrancos apresentarem um desviopadro amostral diferente de zero.

    Branco da amostra com a menor concentrao aceitvel de analito

    LD = 0 + t (n1) .ssendo:t = distribuio de Student, dependente do tamanho da amostra e do grau de confiana e,s = desvio-padro amostral dos brancos da amostra, com adio.

    A menor concentrao aceitvel aquela tida como a concentraomais baixa para a qual um grauaceitvel de incerteza pode seralcanado.

    Branco da amostra eBranco da amostra comdiferentes concentraes deanalito

    LD = 3 x relao sinal/rudo calculado como sendocorrespondente concentrao queproduziria um valor do sinal medido3 vezes maior do que o nvel derudo mdio medido com a soluodo branco.

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    No caso de mtodos instrumentais (HPLC, CG, absoro atmica), a estimativa dolimite de deteco pode ser feita com base na relao de 3 vezes o rudo da linha debase. Pode ser determinado pela equao,

    em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximas aosuposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido a partir dacurva de calibrao proveniente da anlise de um nmero apropriado de amostras dobranco; IC a inclinao da curva de calibrao.

    LD PARA A RE 899 - ANVISA

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    fundamental que avaliaes independentes sejam realizadas emamostras com concentrao igual ao limite de deteco determinado.

    O nmero de replicatas muito elevado pode superestimar o limite dedeteco, por isto, este nmero (n) deve expressar a rotina do laboratrio.

    recomendado um mnimo de 7 replicatas para a determinao do LD.

    Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 = 6 graus deliberdade de uma matriz de branco da amostra com adio da menorconcentrao aceitvel do analito. Para esses graus de liberdade, o valor det unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143 vezes odesvio padro amostral.

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    Valores de t

    Nveis de confiana

    Graus de Liberdade (n-1) 75% 80% 85% 90% 95% 97.5% 99% 99.5% 99.75% 99.9% 99.95%

    1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.71 31.82 63.66 127.3 318.3 636.6

    2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925 14.09 22.33 31.60

    3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841 7.453 10.21 12.92

    4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604 5.598 7.173 8.610

    5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032 4.773 5.893 6.869

    6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707 4.317 5.208 5.959

    7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499 4.029 4.785 5.408

    8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355 3.833 4.501 5.041

    9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250 3.690 4.297 4.781

    10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169 3.581 4.144 4.587

    DISTRIBUIO t DE STUDENT

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    Limite de QuantificaoAlgumas vezes tambm denominado Limite de Determinao. Na prtica,corresponde normalmente ao padro de calibrao de menor concentrao(excluindo o branco). Este limite, aps ter sido determinado, deve ser testadocom amostras independentes, para averiguar se a tendncia e a precisoconseguidas so satisfatrias.

    Matriz Determinao

    Branco da amostra LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10sonde:X = mdia dos valores dos brancoss = desvio-padro amostral dos brancos

    Branco com adio de concentraes variadas do analito, prximas ao LD

    - Medir, uma vez cada replicata independente, a cada nvel de concentrao.- Calcular o desvio-padro amostral s do valor do analito, para cada concentrao.- Fazer o grfico concentrao versus s, e atribuir um valor para o LQ, por inspeo.

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    O limite de quantificao estabelecido por meio da anlise de soluescontendo concentraes decrescentes do frmaco at o menor nveldeterminvel com preciso e exatido aceitveis. Pode ser expresso pelaequao:

    em que: DPa o desvio padro do intercepto com o eixo do Y de, no mnimo, 3curvas de calibrao construdas contendo concentraes do frmaco prximasao suposto limite de quantificao. Este desvio padro pode ainda ser obtido apartir da curva de calibrao proveniente da anlise de um apropriado nmerode amostras do branco; IC a inclinao da curva de calibrao.

    LQ PARA A RE 899 - ANVISA

    ICxDPLQ a 10

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    O mtodo analtico deve ser especificado e o LQ paracada analito deve ser expresso nas unidadesapropriadas, de acordo com o preconizado no mtodoanaltico. A matriz da amostra usada para determinar oLQ deve ser identificada.

    Para a anlise em nvel de traos, recomendado adotaro LQ como a concentrao mais baixa da curva analtica.

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    Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendncia de ummtodo so, entre outros:

    uso de materiais de referncia certificados (MRC);participao em comparaes interlaboratoriais;realizao de ensaios de recuperao.

    A tendncia, quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implicanuma combinao de componentes de erros aleatrios e sistemticos.A determinao da tendncia com relao aos valores de refernciaapropriados importante no estabelecimento da rastreabilidade aos padresreconhecidos.A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica, definida como:

    Tendncia/Recuperao

    %100xesperadovalor

    obtidovalor

    A exatido pode ser avaliada numericamente atravs da recuperao.

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    RECUPERAO

    A recuperao do analito pode ser estimada pela anlise de amostrasfortificadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike). As amostraspodem ser fortificadas com o analito em pelo menos trs diferentesconcentraes: baixa, mdia e alta, da faixa de uso do mtodo.

    A limitao deste procedimento a de que o analito adicionado no estnecessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presena deanalitos adicionados em uma forma mais facilmente detectvel podeocasionar avaliaes excessivamente otimistas da recuperao.

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    A recuperao calculada segundo:

    Sendo:C1 = concentrao do analito na amostra fortificada,C2 = concentrao do analito na amostra no fortificada,C3 = concentrao do analito adicionada amostra fortificada.

    %100 (%) oRecupera3

    21 xC

    CC

    Exemplo: Sobre uma amostra de bolacha adicionou-se 1000 UI de palmitato de retinol. Aps 5 anlises (extrao e quantificao) por HPLC encontrou-se a mdia de 800 UI. Qual foi a % de Recuperao?

    Recuperao =( 800/1000 ) x 100% = 80%

    Pode-se utilizar:1- Outra substncia para monitorar a extrao 2- Utilizar a tcnica de Padro Interno (relao de sinais) para minimizar o erro entre analistas ou variaes na injeo.

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    1- Monitor de extrao Neste caso instroduz-se uma substncia externa, com nica finalidade de acompanhar a extrao

    RECUPERAO

    2- Padro Interno ( relao de sinais)

    Monitormesmaquantidade

    analito

    Sinal 1000 5000

    Sinal 500 1000Rel= 1000/500=2= 2,5 mg do ativo

    Ativoextrado

    Sinal 500 2000

    Rel= 2000/500= 4 = 5 mg do ativo

    1 mg doPadro interno

    5 mg doativo

    Sinal 500 5000 Sinal 5000 5000

    1 mg doPadro interno

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    PRECISO

    PRECISO : a proximidade da concordncia (grau de espalhamento) entre uma srie de medidas obtidas de mltiplas amostragens de uma mesma amostra homognea dentro de condies determinadas.

    Qual a finalidade da Preciso?: garantir que as medidas noforam realizadas ao acaso, que ela possa ser repetida ereproduzida.

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    PRECISO

    A Preciso sempre ter distores de medida, pois envolver sempre uma variedade de fatores para gerar erros:

    - corrente eltrica- formao de base do analista na forma de operao e interpretao- reagentes de lotes ou fabricantes diferentes- estado emocional do analista- iluminao do ambiente de trabalho- variabilidade intrnseca do equipamento ( estabilidade ou tempo de estabilizao)- necessidade analtica para obter a destreza do primeiro resultado- diluies, derivaes, alquotas, temperatura ambiente e de armazenamento- transportes envolvidos at a realizao da amostra- limpeza do material analtico e de coleta- contaminaes alfa ( no reconhecidas pelo uso constante )- outras

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    Normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e astrs formas mais comuns de express-la so: por meio da repetitividade,preciso intermediria e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressaspelo desvio padro e coeficiente de variao.O coeficiente de variao (CV, usualmente expresso em %), tambmconhecido como desvio padro relativo (DPR), calculado da seguinteforma:

    Sendo:DP = desvio-padro;Cmdia = concentrao mdia determinada

    100(%) xCDPDRPCVmdia

    Preciso

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    Repetitividade

    As condies de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando: Mesmo procedimento de medio; Mesmo observador; Mesmo instrumento usado sob mesmas condies; Mesmo local, e Repeties no menor espao de tempo possvel.

    A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos dacaracterstica da disperso dos resultados e pode ser determinada por meioda anlise de padres, material de referncia ou adio do analito a brancoda amostra, em vrias concentraes na faixa de trabalho.

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    Preciso intermediria

    A preciso intermediria, de acordo com a ISO 5725-3, refere-se precisoavaliada sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizandoo mesmo mtodo, no mesmo laboratrio, mas definindo exatamente quaisas condies a variar (uma ou mais), tais como:

    Diferentes analistas; Diferentes equipamentos; Diferentes tempos.

    Esta medida de preciso representa a variabilidade dos resultados em umlaboratrio.Na maioria dos casos, o valor de preciso intermediria funo do nvel deconcentrao do ensaio e o seu clculo efetuado, preferencialmente, a partirdos resultados obtidos, aps eliminao dos resultados discrepantes. Avisualizao grfica dos valores tambm pode ser til para identific-los.

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    Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da precisointermediria, existem vrios mtodos para determinao e controle desseparmetro, tais como:Por meio de grfico de controle do desvio padro, que poder ser aplicadospara replicatas de amostras e para padres estveis ao longo do tempo;Por meio de expresses matemticas que apresentem resultados numricos ecritrios de aceitao definidos.

    Um mtodo simplificado para estimar a preciso intermediria baseia-se naexecuo de n medies (n 15), em condies pr-definidas, sobre: uma mesma amostra; amostras supostamente idnticas; padres

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    A estimativa da preciso intermediria Si ( ), neste caso, dada por:

    n

    kkkj yyn

    Si1

    2),( )(.1

    1

    em que Si (j,k) o desvio padro de preciso intermediria relativo aesse grupo, onde os smbolos relativos s condies intermedirias depreciso podem aparecer entre parntesis (Ex: Si (T.O) significa tempo eoperadores diferentes).

    Sendo:n = n de ensaios efetuados por amostra ou padro;yk = cada resultado obtido;y = representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido.

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    EXATIDO

    Na prtica, a Exatido tem por finalidade, garantir que o valor medido, esteja prximo do valor declarado. Na amostragem garantir que todo o ativo foi quantificado na extenso desejada.

    EXATIDO : qualidade que exprime compatibilidade de valor aceito com valor dereferncia.

    ACURCIA : o grau de proximidade de um determinado valor ao valor real ou conhecido nominal em condies determinadas. Pode ser medido em relao ao maior desvio.

    Valor nominal

    Espalhamento

    Valor MdioValor Distante

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    EXATIDO

    Garantir a Exatido envolve situaes, hoje dispendiosas em tempo de resposta e ou custo financeiro, como:

    - PADRES ANALTICOS DE REFERNCIA CONFIVEIS

    - ENSAIOS INTERLABORATORIAIS DA METODOLOGIA

    - COMPARAES EM ENSAIOS DE PROFICINCIA

    - RECONHECIMENTO POR ORGOS CONSIDERADOS COMOGUARDIES DA CONFIABILIDADE

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    Robustez

    A robustez de um mtodo analtico a medida de sua capacidade em resistira pequenas e deliberadas variaes dos parmetros analticos. Indica suaconfiana durante o uso normal.

    Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliaoda robustez. Constatando-se a susceptibilidade do mtodo variaes nascondies analticas, estas devero ser controladas e precaues devemser includas no procedimento.

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    Testes de Robustez de Acordo com a RE899 - ANVISA

    Preparo das Amostras Estabilidade das solues analticasTempo de extrao

    EspectrofotometriaVariao do pH da soluoTemperaturaDiferentes fabricantes de solventes

    Cromatografia Lquida

    Variao do pH da fase mvelVariao na composio da fase mvelDiferentes lotes ou fabricantes de colunasTemperaturaFluxo da fase mvel

    Cromatografia GasosaDiferentes lotes ou fabricantes de colunasTemperaturaVelocidade do gs de arraste

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    Definidos os Parmetros de Validao necessrio planejar o estudo de Validao de Metodologia Analtica.

    Um estudo dividido em 3 etapas:

    1. Plano ou Protocolo de Estudo2. Etapa Experimental3. Relatrio Final

    O contedo de um plano de estudo e relatrio final depende da finalidade ao qual o estudo se destina.

    Ex: Se for parte integrante de um estudo maior com finalidade de registro de um produto agro ao IBAMA, deve obedecer a norma BPL (Boas Prticas de Laboratrio). No Brasil regida pela NIT DICLA 035 do INMETRO.

    Se for parte de um estudo de Equivalncia Farmacutica para registro de um frmaco junto ANVISA, deve obedecer s normas e resolues dessa agncia.

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    PLANO OU PROTOCOLO DE ESTUDO

    Todo estudo deve ser planejado antes de seu incio e esseplanejamento deve ser descrito em POP (Procedimento OperacionalPadro), contendo todos os itens necessrios para a conduo daetapa experimental, orientando os analistas, e tambm para atender osrequerimentos dos organismos de avaliao dos registros.

    O plano de estudo deve ser aprovado atravs de assinatura datada doDiretor de Estudo e verificado quanto conformidade com as BPLs pelopessoal da Garantia da Qualidade

    a) Emendas ao plano de estudo devem ser justificadas e aprovadas porassinatura datada do Diretor de Estudo e mantida junto com o plano deestudo.b) Desvios ao plano de estudo devem ser descritos, explicados, dadacincia e datados prontamente pelo Diretor de Estudo e mantido com osdados brutos do estudo.

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    O plano de estudo deve conter, mas no estar limitado, s seguintesinformaes:1. Identificao do Estudo, da Substncia Teste e da Substncia deRefernciaa) Ttulo descritivo;b) Declarao da natureza e do propsito do estudo;c) Identificao da substnciateste por cdigo ou nome (IUPAC, nmerodo CAS, etc.);d) Substncia de referncia a ser utilizada.

    Contedo do Plano de Estudo

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    2 - Informaes referentes ao Patrocinador e Unidade Operacionala) Nome e endereo do patrocinador;b) Nome e endereo da(s) instalao(es) de teste(s) e unidade(s)teste(s)envolvida(s);c) Nome e endereo do Diretor de Estudo;

    3. Datasa) A data de aprovao do plano de estudo por assinatura doDiretor de Estudo. A data de aprovao do plano de estudo porassinatura da gerncia da instalao de teste e do patrocinador, serequerido pelo rgo regulador ou fiscalizador no pas onde oestudo est sendo conduzido.b) As datas propostas para incio e trmino do experimento.

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    4. MtodoReferncia ao mtodo na qual a vidao de baseia, se aplicvel.

    5. Outros aspectos (onde aplicveis)Informaes detalhadas do desenho experimental, incluindo umadescrio da cronologia do estudo, todos os mtodos, materiais econdies, tipo e freqncia de anlises, medidas, observaes eexames a serem realizados e mtodos estatsticos a serem utilizados(sehouver).

    6. RegistrosUma lista dos registros a serem arquivados, incluindo os dados brutosoriginais.

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    ANEXO 1 MODELO DE PLANO DE ESTUDO

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    ANEXO 2 MODELO DE RELATRIO FINAL

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    PADRES

    VALIDADE DO PADROAlguns fornecedores indicam a validade. Em alguns casos necessrio consultar.

    PADRO PRIMRIOObtidos a partir do melhor lote de fabricao.Comercializados por empresas respeitadas oureferenciadas. Rastreabilidade das anlises eprodutos de origem.

    PADRO SECUNDRIO Obtidos a partir do padro primrio

    1- PADRO DE ESPCIE MAJORITRIA 2- PADRO POR HISTRICO3- PADRO RASTREVEL (CERTIFICADO OU REFERENCIADO)

  • Minicursos CRQ-IV - 2010

    Validao e Protocolos em Anlises Qumicas

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    RASTREABILIDADERASTREABILIDADE

    a capacidade de reconstruir um estudo a qualquer tempo, apartir dos registros analticos (dados brutos, clculos), doscertificados de calibrao / qualificao dos instrumentosutilizados, dos registros de utilizao dos equipamentos, dosregistros de treinamento do pessoal envolvido, plano de estudo,relatrio final, desvios, emendas, anlise crtica, e demaisdocumentos que compe o trabalho.

  • Minicursos CRQ-IV - 2010

    Validao e Protocolos em Anlises Qumicas

    Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

    ARREDONDAMENTOS E ALGARISMOS SIGNIFICATIVOS

    Arredondamentos manuais

    Uso de planilhas eletrnicasPode haver diferenas

    Ex: Arredondar para 2 casas decimais:

    12,238 12,23312,235

  • Minicursos CRQ-IV 2010 Validao e protocolos em anlises qumicas

    Apoio Caixa Econmica Federal

    Exemplo de plano de estudo de validao de metodologia analtica por HPLC/UV em formulado farmacutico na forma de p estril injetvel pela tcnica de hplc/uv

    para o ativo dacarbazina

    ESTUDO / ATIVO

    Dacarbazina

    PATROCINADOR

    xxxxxxxxxxxxxxxxx

    RESPONSVEL

    xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

    ENDEREO

    xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

    CDIGO DO ESTUDO

    xxxx-R00

    REALIZAO (UNIDADE OPERACIONAL)

    Analtica Comrcio e Anlises Qumicas Ltda

    ENDEREO

    Rua Jos da Silva, 12 Pinheiros So Paulo/SP CEP 05409-011

    INCIO DO ESTUDO

    23/ 04/ 2010

    DATAS PREVISTAS

    INCIO DOS ENSAIOS 23/ 04/ 2010 TRMINO DOS ENSAIOS 24/ 04/ 2010 TRMINO DO ESTUDO

    26/ 04/ 2010

    DIRETOR DE ESTUDO

    xxxxxxxxxxxxx

    ENDEREO

    Rua Jos da Silva, 12 Pinheiros So Paulo/SP CEP 05409-011

    ANALISTA PRINCIPAL

    xxxxxxxxxxx

    GERENTE DA UNIDADE DA GARANTIA DA QUALIDADE

    xxxxxxxxxxxx

  • Minicursos CRQ-IV 2010 Validao e protocolos em anlises qumicas

    Apoio Caixa Econmica Federal

    1-Objetivo: Validao de metodologia analtica para a determinao de teor de Dacarbazina, pela tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) com deteco no ultravioleta (UV) em formulado farmacutico.

    2-Princpio do Mtodo: A amostra diluda e o ativo quantificado por HPLC em modo

    fase reversa e deteco na regio espectral do ultravioleta (UV).

    3-Identidade Qumica: Dacarbazina

    Frmula molecular: C6H10N6O Peso molecular: 182,18 g/mol

    4-Materiais: Balana analtica Pipetador automtico 1,0 mL e 5,0 mL Cmara de Luz Cmara de Fluxo Laminar Estufa pHmetro Banho ultra-snico Membrana de 0,45 micras Cromatgrafo Lquido Bales volumtricos 10 mL Bales volumtricos 25 mL Bales volumtricos 50 mL

    5-Reagentes: Acetonitrila

    Fosfato de Potssio Monobsico

    cido Fosfrico

    6-Solues Preparadas: Hidrxido de Sdio

    cido Clordrico

    Tampo Fosfato de Potssio Monobsico

    Perxido de Hidrognio

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    7-Padro de Referncia:

    Padro Fabricante Cdigo

    T&E Pureza Lote

    Validade

    (ms/ano)

    Dacarbazine USP G-3878 100 % H Corrente na abertura

    8- Amostra

    Amostra Fabricante Lote Fabricao

    (ms/ano)

    Validade

    (ms/ano)

    Dacarbazina 200 mg P Estril Injetvel xxxx xxxxx 10/2009 10/2011

    Receber, identificar e armazenar as substncias de acordo com os procedimentos TE TC AM 001, TE TC AM 002 e TE TC AM 003.

    Manusear as substncias com segurana. Em caso de dvida consultar a ficha de MSDS. Solicitar, ao patrocinador, caso esteja indisponvel. Manter o frasco sempre bem fechado.

    9-Condies Analticas:

    Coluna: CLV 09 Luna C-18 (2) 100A (250 X 4,6 mm) 5 m

    Fase Mvel: A Tampo pH 3,0 60 % B Acetonitrila grau HPLC 40 %

    Diluente: Tampo - Fase Mvel - A

    Vazo: 1,0 mL/min.

    Volume de injeo: 10 L

    Deteco: Ultravioleta a 323 nm

    Temperatura: 30 C

    Tempo de Reteno Aproximadamente 2,6 minutos

    Tempo de corrida 10 minutos

    Observao Durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz.

    10-Experimental:

    10.1 Preparo da soluo estoque

    a) Pesar aproximadamente 20 mg de padro de ativo em um balo de 50 mL; b) Adicionar ao balo volumtrico cerca de 20 mL do Diluente deixando em banho

    ultra-snico por dez minutos; c) Completar o volume com o diluente e homogeneizar.

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    10.2 Preparo das solues de trabalho Aliquotar as solues de trabalho em balo volumtrico de 10 mL para os pontos correspondentes da curva conforme tabela 01:

    Tabela 01: Preparo das solues de trabalho

    Padro Alquota (mL) Volume Final (mL) Concentrao (mg/mL)

    50 % 0,50 10 0,02 75 % 0,75 10 0,03 100 % 1,00 10 0,04 125 % 1,25 10 0,05 150 % 1,50 10 0,06

    10.3 Obteno da Curva de Resposta

    a) Filtrar e injetar as solues de trabalho em HPLC nas condies analticas descritas; b) Plotar a curva de resposta com a concentrao (mg/mL) versus rea do sinal analtico; c) Trabalhar com coeficiente de correlao (r) no inferior a 0,99.

    10.4 Preparo da Soluo Amostra

    a) Realizar o peso mdio da amostra; b) Pesar aproximadamente 0,24 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL; c) Adicionar cerca de 10 mL de diluente. Deixar em banho ultra-snico por dez minutos,

    completar o volume com Diluente e homogeneizar; d) Aliquotar desta soluo 0,5 mL e transferir para um balo volumtrico de 50 mL; e) Completar o volume com diluente, homogeneizar, filtrar e injetar.

    10.5 Clculos 10.5.1 Clculo da concentrao do ativo sobre soluo amostra (mg/mL) A concentrao do ativo sobre a soluo amostra foi calculada utilizando-se a equao da reta, obtida pela injeo de cinco padres (tabela 1), de acordo com a seguinte equao:

    abreaAtivoConc .

    Onde:

    Conc. Ativo = concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL); rea = rea correspondente ao ativo no cromatograma; b = coeficiente linear da curva de calibrao; a = coeficiente angular da curva de calibrao

    10.5.2 Clculo da concentrao final sobre a amostra (mg/Frasco) A concentrao final do ativo sobre a amostra foi calculada utilizando a equao:

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    MassaPMdilAtivoConcAmostraConc ..

    Onde: Conc. Amostra = concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco); Conc. Ativo = concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL); dil = Diluio da amostra (mL) PM = peso mdio da amostra (g) Massa = massa amostra pesada (g) Frasco = Frasco Ampola

    10.5.3 Clculo da porcentagem de teor A porcentagem de teor do ativo foi calculada utilizando-a equao:

    EspecAmostraConcTeor 100.(%)

    Onde: Conc. Amostra = concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco); Espec = especificao declarada de ativo na amostra (P estril injetvel - mg/Frasco) Teor (%) = % de ativo 11-Validao: Os conceitos de validao aqui aplicados expressam os seguintes valores:

    11.1 Especificidade/ Seletividade 11.2 Linearidade 11.3 Preciso

    11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida) 11.3.2 Intermediria (inter-corrida)

    11.4 Recuperao 11.5 Intervalo 11.6 Robustez 11.1 Especificidade/Seletividade

    A especificidade ser realizada atravs da anlise do padro 100 % de cada ativo, da fase mvel, do diluente, da amostra e pela recuperao do ativo em soluo composta de padro e amostra na proporo de 1:1. Esta soluo composta ser preparada adicionando-se soluo padro do ponto equivalente ao de 100% da curva da linearidade sobre soluo amostra. As amostras sero submetidas s condies de estresse para avaliao da especificidade / seletividade e sero apresentados os resultados em forma de tabelas, como o exemplo abaixo:

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    Tabela - Condies Estresse

    Agente Condies

    Hidrlise alcalina

    Adio de 0,1 mL de sol. de NaOH 0,1 M/mL de soluo de amostra na concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas

    Hidrlise cida Adio de 0,1 mL de soluo de HCl 0,1 M/mL de soluo de amostra de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas

    Oxidante Adio de 0,1 mL de soluo H2O2 0,75 % (v/v)/mL de soluo de amostra de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas

    Luz Exposio da embalagem primria Luz Fluorescente comum/24 horas e

    Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga-20W/24 horas (simultaneamente)

    Temperatura Exposio da embalagem primria 60 C/24 horas (estufa comum)

    A Especificidade/Seletividade ser adequada se no apresentar interferncias detectveis de outros compostos no tempo mdio de eluio do ativo nas amostras para o branco, placebo e aps a aplicao dos agentes de estresse.

    11.2 Linearidade

    Determinar a linearidade em duplicata pelo coeficiente de correlao linear, entre as reas do ativo nos padres e as concentraes correspondentes do composto na curva de resposta.

    O critrio de aceitao a ser considerado r 0,99.

    As faixas de linearidade a serem ensaiadas esto descritas no item 10.

    Utilizar a equao da reta do primeiro dia para o clculo da especificidade / seletividade, da preciso (repetibilidade) e da exatido.

    Para os clculos da preciso intermediria, robustez e teor, utilizar a equao da reta obtida por um segundo analista, em uma segunda ocasio.

    11.3 Preciso

    Avaliar a preciso atravs do coeficiente de variao, determinando a proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla (determinao de teor em seis preparaes de amostras, na concentrao 100 %), em duas ocasies.

    11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida) Obteno dos resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentao. Este analista prepara e ensaia seis solues de amostras na concentrao de 100 % da curva de calibrao e calcular o CV com os seis resultados obtidos. A preciso ser considerada adequada para repetibilidade (intra-corrida) da amostra se apresentar coeficiente de variao inferior a 5,0 % segundo RE 899/03 [2].

    11.3.2 Intermediria (inter-corridas)

    Concordncia entre os resultados obtidos com analistas diferentes para doze determinaes a 100 %, em duas diferentes ocasies. Um segundo analista prepara e ensaia mais seis solues de amostras na concentrao de 100 % da curva de calibrao no dia seguinte. Os clculos para obteno do CV (%) so realizados com os resultados dos doze ensaios combinados A preciso

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    Intermediria (inter-corrida) da amostra ser considerada adequada se apresentar coeficiente de variao inferior a 5,0 % segundo RE 899/03 [2].

    11.4 Recuperao

    Para avaliao deste parmetro, determinar os valores das recuperaes, verificados a partir de nove determinaes contemplando o intervalo linear do mtodo analtico, ou seja, trs concentraes: baixa (ponto inferior da curva), mdia (100 %) e alta (ponto superior da curva). Preparar solues em triplicata, a partir de soluo estoque da substncia referncia nas concentraes 50, 100 e 150 % sobre a soluo amostra nas mesmas concentraes respectivamente na proporo de 1:1. Para o clculo utilizar a seguinte equao:

    100oTericaConcentraoObtidaConcentraORECUPERA

    A recuperao ser considerada adequada se apresentar valores entre 90 e 110 %.

    11.5 Intervalo

    O intervalo ser definido pela faixa de linearidade determinada pelo mtodo e confirmado pela preciso e exatido. Caso os parmetros estejam aceitveis, reportar a faixa de linearidade como o intervalo estabelecido.

    11.6 Robustez

    Realizar alteraes em dois parmetros aplicveis ao mtodo.

    Nota: Os resultados de robustez no so avaliados como critrios para estabelecimento da validade de um mtodo analtico. Eles so apenas uma indicao de que o mtodo susceptvel ou no s modificaes introduzidas. Para este estudo os parmetros a serem alterados sero o fluxo da fase mvel de 1,0 mL/min. para 0,8 mL/min. e a temperatura, de 30C para 32C e para que o mtodo seja robusto os resultados de recuperao devero estar dentro da faixa estabelecida para a exatido do mtodo.

    12-Arquivamento: Folha de registro de amostras e anlises a efetuar;

    Cpia do oramento aprovado;

    Documentao de informaes do patrocinador;

    Dados brutos, inclusive cromatogramas e os registros necessrios para que se componha a rastreabilidade do estudo;

    Plano de estudo;

    Cpia do relatrio de estudo;

    Outros documentos que o D.E. julgar necessrios

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    13-Substituies:

    Nome Cargo / Funo Substituto

    Analista de Laboratrio

    Farmacutica Responsvel

    Gerente da Qualidade

    14-Etapas Crticas: 1) Preparo dos padres e amostras;

    2) Injees dos padres e amostras.

    Nota:

    necessrio que seja monitorada a temperatura do laboratrio de 25C 5C pela equipe responsvel e durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz, pois estas observaes se tratam de etapas crticas no estudo.

    15 - Referncias Bibliogrficas:

    [1] - Leite, Flvio; Validao em Anlise Qumica Editora tomo 4a edio. [2] - Resoluo RE 899, de 29 de maio de 2003, ANVISA. [3] - Merck Index - 13th Ed., 2001.

    16 Assinaturas

    _________________________ ___/___/____

    XXXXXXXXXXX Diretora de Estudo CRF/SP XXXXXXX

    _________________________ ___/___/____

    XXXXXXXXXXX Analista Principal CRQ/SP XXXXXXX

    _________________________ ___/___/___

    XXXXXXXXXXXX Gerente da Qualidade CREA/SP XXXXXXX

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    Exemplo de relatrio final de validao de metodologia analtica por HPLC/UV em formulado farmacutico na forma de p estril injetvel pela tcnica de hplc/uv para o ativo

    dacarbazina

    ESTUDO / ATIVO

    Dacarbazina

    PATROCINADOR

    xxxxxxxxxxxxxxxxx

    RESPONSVEL

    xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

    ENDEREO

    xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

    CDIGO DO ESTUDO

    xxxx-R00

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    Analtica Comrcio e Anlises Qumicas Ltda

    ENDEREO

    Rua Jos da Silva, 12 Pinheiros So Paulo/SP CEP 05409-011

    INCIO DO ESTUDO

    23/ 04/ 2010

    DATAS PREVISTAS

    INCIO DOS ENSAIOS 23/ 04/ 2010 TRMINO DOS ENSAIOS 27/ 04/ 2010 TRMINO DO ESTUDO

    28/ 04/ 2010

    DIRETOR DE ESTUDO

    xxxxxxxxxxxxx

    ENDEREO

    Rua Jos da Silva, 12 Pinheiros So Paulo/SP CEP 05409-011

    ANALISTA PRINCIPAL

    xxxxxxxxxxx

    GERENTE DA UNIDADE DA GARANTIA DA QUALIDADE

    xxxxxxxxxxxx

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  • Minicursos CRQ-IV 2010 Validao e protocolos em anlises qumicas

    Apoio Caixa Econmica Federal

    1-Objetivo: Validao de metodologia analtica para a determinao de teor de

    Dacarbazina, pela tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) com deteco no ultravioleta (UV) no formulado farmacutico Dacarzin 200 mg P Estril Injetvel.

    2-Princpio do Mtodo: A amostra diluda e o ativo quantificado por HPLC em modo fase reversa

    e deteco na regio espectral do ultravioleta (UV). 3-Identidade Qumica: Dacarbazina Frmula Molecular: C6H10N6O Peso Molecular: 182,18 g/mol 4-Materiais:

    Material Fabricante TAG Calibrao

    (ms/ano)

    Validade

    (ms/ano)

    Balana analtica Shimadzu BA-14 11/2009 11/2010

    Pipetador automtico Transferpette PP-VAL-01 06/2009 06/2010

    Pipetador automtico Transferpette PP-VAL-02 08/2009 08/2010

    Cmara de Luz T&E Analtica CDG-01 03/2010 03/2011

    Cmera de Fluxo Laminar Grupo Veco FXL 04 10/2009 04/2010

    pHmetro Digmed PH 04 07/2009 07/2010

    Estufa Faber-Primar ES-8 04/2009 04/2010

    Banho ultra-snico Sonitech US-04 N/A N/A

    Membrana de 0,45 micras Millipore N/A N/A N/A

    Cromatgrafo Lquido Shimadzu HPLC-23 05/2009 05/2010

    Bales volumtricos

    de 10 mL

    Laborglas F1604 08/12/09 08/12/10 Laborglas F1619 07/12/09 07/12/10 Laborglas E7520 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7021 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7008 14/12/09 14/12/10 Laborglas E7658 14/12/09 14/12/10 Laborglas F9240 14/12/09 14/12/10 Laborglas E7608 14/12/09 14/12/10 Laborglas F1568 17/07/09 17/07/10 Laborglas G7982 22/05/09 22/05/10 Laborglas E7440 14/12/09 14/12/10 Laborglas E7520 14/12/09 14/12/10 Laborglas E7457 14/12/09 14/12/10 Laborglas E0004 14/12/09 14/12/10 Laborglas E0030 14/12/09 14/12/10

    Laborglas F0645 14/12/09 14/12/10 Laborglas F0705 14/12/09 14/12/10

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    Bales volumtricos

    de 25 mL

    Laborglas F7094 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7195 14/12/09 14/12/10 Laborglas 1567 11/12/09 11/12/10 Laborglas L2524 14/12/09 14/12/10 Laborglas E6399 08/12/09 08/12/10 Laborglas G4446 05/11/09 05/11/10 Laborglas D5548 07/12/09 07/12/10 Laborglas D8332 04/09/09 04/09/10 Laborglas F7216 14/12/09 14/12/10 Laborglas F0705 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7216 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7248 14/12/09 14/12/10

    Masterlabor 5269 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7125 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7137 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7094 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7108 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7248 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7195 14/12/09 14/12/10 Laborglas F7171 14/12/09 14/12/10

    Bales volumtricos

    de 50 mL

    L. M. H1268 14/12/09 14/12/10 Laborglas H0399 19/05/09 19/05/10 Laborglas H0426 28/04/09 28/04/10 Laborglas H0376 28/04/09 28/04/10 Laborglas H0329 28/04/09 28/04/10 Laborglas H0364 28/04/09 28/04/10 Laborglas H0535 19/05/09 19/05/10 Laborglas H0412 28/04/09 28/04/10 Laborglas H0398 19/05/09 19/05/10 Laborglas H0410 28/04/09 28/04/10 Laborglas H0442 28/04/09 28/04/10 Laborglas H1268 21/05/09 21/05/10 Laborglas F5664 14/07/09 14/07/10 Laborglas H 1460 08/03/10 08/03/11 Laborglas H 1667 08/03/10 08/03/11 Laborglas H 8093 08/03/10 08/03/11 Laborglas F5605 14/07/09 14/07/10 Laborglas H1147 19/01/10 19/01/11 Laborglas H1241 22/07/09 22/07/10 Laborglas H1351 21/08/09 21/08/10 Laborglas H1266 21/08/09 21/08/10 Laborglas H1401 21/08/09 21/08/10 Laborglas H1280 21/08/09 21/08/10 Laborglas H1383 21/08/09 21/08/10

    Hexis Cientifica 62470 14/12/09 14/12/10 Hexis Cientfica 62478 02/12/09 02/12/10

    N/A = No se aplica 5-Reagentes:

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    Reagente Fabricante Cdigo

    T&E Lote

    Validade

    (ms/ano)

    Acetonitrila Tedia L 103 911288R 11/2014

    Fosfato de Potssio Monob. Ecibra L 72 18112 07/2012

    cido Fosfrico Ecibra L 54 18042 05/2012

    6-Solues Preparadas:

    Soluo Cdigo T&E

    Data de Preparo

    (ms/ano)

    Validade (ms/ano)

    Preparado por

    Hidrxido de Sdio 0,1 M EQ -1745 12/2009 08/2010 Patrcia

    cido Clordrico 0,1 M PE-2766 11/2009 05/2010 Priscila

    Tampo Fosf. Pot. Monob. 6,25 mM V-596 04/2010 05/2010 Vanessa

    Perxido de Hidrognio 0,75 % V-566 02/2010 08/2010 Vanessa

    7-Padro de referncia:

    Padro Fabricante Cdigo T&E

    Pureza Lote Validade (ms/ano)

    Dacarbazine USP G-3878 100 % H Corrente na abertura

    8-Identificao da Amostra:

    Amostra Fabricante Lote Fabricao (ms/ano)

    Validade (ms/ano)

    Dacarbazina 200 mg P Estril Injetvel xxxx xxxxx 10/2009 10/2011

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    9-Condies Analticas Cromatografia Lquida:

    Coluna: CLV 09 Luna C-18 (2) 100A (250 X 4,6 mm) 5 m

    Fase Mvel: A Tampo pH 3,0 60 % B Acetonitrila grau HPLC 40 %

    Diluente: Tampo - Fase Mvel - A

    Vazo: 1,0 mL/min.

    Volume de injeo: 10 L

    Deteco: Ultravioleta a 323 nm

    Temperatura: 30 C

    Tempo de Reteno Aproximadamente 2,6 minutos

    Tempo de corrida 10 minutos

    Observao Durante o preparo dos padres e amostras, evitar o contato com a luz.

    10-Procedimentos: 10.1 Preparo da soluo estoque

    a) Pesar aproximadamente 20 mg de padro de ativo em um balo de 50 mL; b) Adicionar ao balo volumtrico cerca de 20 mL do Diluente deixando em banho ultra-snico por

    dez minutos; c) Completar o volume com o diluente e homogeneizar.

    10.2 Preparo das solues de trabalho Aliquotar as solues de trabalho em balo volumtrico de 10 mL para os pontos correspondentes da curva.

    Tabela 01: Preparo das solues de trabalho

    Padro Alquota (mL) Volume Final (mL) Concentrao (mg/mL)

    50 % 0,50 10 0,02 75 % 0,75 10 0,03

    100 % 1,00 10 0,04 125 % 1,25 10 0,05 150 % 1,50 10 0,06

    10.3 Obteno da Curva de Resposta

    a) Filtrar e injetar as solues de trabalho em HPLC nas condies analticas descritas; b) Plotar a curva de resposta com a concentrao (mg/mL) versus rea do sinal analtico; c) Trabalhar com coeficiente de correlao (r) no inferior a 0,99.

    10.4 Preparo da Soluo Amostra

    a) Realizar o peso mdio da amostra; b) Pesar aproximadamente 0,24 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL;

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    c) Adicionar cerca de 10 mL de diluente. Deixar em banho ultra-snico por dez minutos, completar o volume com Diluente e homogeneizar;

    d) Aliquotar desta soluo 0,5 mL e transferir para um balo volumtrico de 50 mL; e) Completar o volume com diluente, homogeneizar, filtrar e injetar.

    10.5 Clculos 10.5.1 Clculo da concentrao do ativo sobre soluo amostra (mg/mL) A concentrao do ativo sobre a soluo amostra foi calculada utilizando-se a equao da reta, obtida pela injeo de cinco padres (tabela 1), de acordo com a seguinte equao:

    abreaAtivoConc .

    Onde: Conc. Ativo = concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL); rea = rea correspondente ao ativo no cromatograma; b = coeficiente linear da curva de calibrao; a = coeficiente angular da curva de calibrao 10.5.2 Clculo da concentrao final sobre a amostra (mg/Frasco) A concentrao final do ativo sobre a amostra foi calculada utilizando a equao:

    MassaPMdilAtivoConcAmostraConc ..

    Onde: Conc. Amostra = concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco);

    Conc. Ativo = concentrao do ativo na soluo amostra (mg/mL); dil = Diluio da amostra (mL) PM = peso mdio da amostra (g) Massa = massa amostra pesada (g) Frasco = Frasco Ampola 10.5.3 Clculo da porcentagem de teor A porcentagem de teor do ativo foi calculada utilizando-a equao:

    EspecAmostraConcTeor 100.(%)

    Onde: Conc. Amostra = concentrao do ativo na amostra (mg/Frasco); Espec = especificao declarada de ativo na amostra (P estril injetvel - mg/Frasco) Teor (%) = % de ativo 11-Validao: Os conceitos de validao aqui aplicados expressam os seguintes valores:

    11.1 Especificidade/ Seletividade 11.2 Linearidade 11.3 Preciso

    11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida)

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    11.3.2 Intermediria (inter-corrida) 11.4 Recuperao 11.5 Intervalo 11.6 Robustez 11.1 Especificidade/Seletividade A especificidade foi verificada atravs da anlise do padro 100% do ativo, da fase mvel, diluente, amostra e pela recuperao do ativo em soluo composta de padro e amostra. Esta soluo composta foi preparada na proporo de 1:1, adicionando-se soluo padro do ponto equivalente ao de 100% da curva da linearidade sobre soluo amostra. Tal adio resultou em um valor mdio de recuperao de 98,3%. Os cromatogramas obtidos pelas injees da fase mvel e diluente no mostraram sinais analticos no tempo de reteno referente ao pico do ativo. A amostra foi submetida as condies de estresse para avaliao da especificidade / seletividade e os resultados so apresentados na Tabela 02.

    Tabela 02: Resultados obtidos para os ensaios de estresse

    Agente Condies Diferena de quantificao

    (%) Hidrlise alcalina

    Adio de 0,1 mL de sol. de NaOH 0,1 M/mL de soluo de amostra na concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas -0,6

    Hidrlise cida Adio de 0,1 mL de soluo de HCl 0,1 M/mL de soluo de amostra de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas -1,1

    Oxidante Adio de 0,1 mL de soluo H2O2 0,75 % (v/v)/mL de soluo de amostra de concentrao 100 % da curva de resposta exposio 24 horas

    -1,1

    Luz Exposio da embalagem primria Luz Fluorescente comum/24 horas e Exposio Luz UV B-Fluorescente banda larga-20W/24 horas simultaneamente.

    -7,5

    Temperatura Exposio da embalagem primria 60 C/24 horas (estufa comum) -10,1

    A partir dos resultados para o ativo, conclui-se pela ausncia de interferncias detectveis de outros compostos no tempo mdio de eluio dos ativos aps a aplicao dos agentes de estresse. O que mais se pode concluir? 11.2 Linearidade A linearidade foi determinada em duplicata pelo coeficiente de correlao linear, entre as reas do ativo nos padres e as concentraes correspondentes do composto na curva de resposta, mostrados na Tabela 03 e na Figura 01. Para a elaborao da curva conjugada foram utilizadas as reas individuais de injees em duplicata. O critrio de aceitao considerado foi r 0,99, segundo RE 899/03 [2].

    Tabela 03: Resultados obtidos para linearidade 1 Analista

    Padro Conc. (mg/mL) rea

    50 % 0,02 1283116 1287473

    75 % 0,03 1897316 1897412

    100 % 0,04 2496944 2495128

    125 % 0,05 3080158 3076033

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    150 % 0,06 3628063 3628915

    Coeficiente de correlao (r) 0, 9998 Equao da Reta y = 58090301,98x + 130207,60

    Figura 01: Grfico da curva da Linearidade

    Linearidade 1 diay = 58090301,98x + 130207,60

    0

    2000000

    4000000

    0,015 0,025 0,035 0,045 0,055

    Concentrao

    re

    a

    O coeficiente de correlao obtido foi considerado adequado por apresentar R> 0,99. A equao da reta apresentada na Tabela 03 foi utilizada para o clculo da especificidade / seletividade, da preciso (repetibilidade) e da exatido. Para os clculos da preciso intermediria, estabilidade e estresse utilizaram-se a equao da reta obtida por um segundo analista, em uma segunda ocasio: Equao da reta obtida na segunda ocasio: y = 57832881,19x + 119107,0 Coeficiente de correlao obtido na segunda ocasio: (r) = 0, 9999 Concluso? 11.3 Preciso A preciso foi avaliada atravs do coeficiente de variao, determinando-se a proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla (determinao de teor em seis preparaes de amostras, na concentrao 100 %), em duas ocasies. 11.3.1 Repetibilidade (intra-corrida) - Obteno dos resultados dentro de um curto perodo de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentao.

    Tabela 04: Resultados obtidos para repetibilidade - 1 Analista

    Replicata rea Concentrao (mg/Frasco) % Teor CV (%)

    1 2545998 190,89 95,4

    2,1

    2 2550004 200,88 100,4 3 2546411 200,75 100,4 4 2542426 201,21 100,6 5 2545806 201,55 100,8 6 2539551 200,21 100,1

    Concluso?

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    11.3.2 Intermediria (inter-corridas) - Concordncia entre os resultados obtidos com analistas diferentes para doze determinaes a 100 %, em duas diferentes ocasies.

    Tabela 05: Resultados obtidos para preciso intermediria

    Replicata rea Concentrao (mg/Frasco) % Teor CV (%)

    1aAnalista

    1 2545998 190,89 95,4

    2,1

    2 2550004 200,88 100,4 3 2546411 200,75 100,4 4 2542426 201,21 100,6 5 2545806 201,55 100,8 6 2539551 200,21 100,1

    2 Analista

    1 2570259 203,82 101,9 2 2574695 204,85 102,4 3 2572018 205,04 102,5 4 2562369 204,89 102,4 5 2569479 206,07 103,0 6 2564940 206,19 103,1

    Concluso? 11.4 Recuperao Para avaliao deste parmetro, foram determinados os valores das recuperaes, verificados a partir de nove determinaes contemplando o intervalo linear do mtodo analtico, ou seja, trs concentraes: baixa (50 %), mdia (100 %) e alta (150 %). As recuperaes foram preparadas a partir de soluo estoque da substncia referncia nas concentraes 50, 100 e 150 % sobre a soluo amostra. Para o clculo foi utilizada a seguinte equao:

    100oTericaConcentraoObtidaConcentraORECUPERA

    Tabela 06: Resultados obtidos para exatido

    Nvel de Concentrao

    Concentrao Terica

    (mg/mL) rea

    Concentrao Obtida

    (mg/mL)

    Recuperao (%)

    Mdia das Recuperaes

    (%)

    Baixa 0,02 1268002 0,02 97,0

    97,2 1269094 0,02 97,1 1273525 0,02 97,4

    Mdia 0,04 2521473 0,04 101,9

    101,9 2523750 0,04 102,0 2520053 0,04 101,8

    Alta 0,06 3670360 0,06 100,6

    100,6 3667522 0,06 100,5 3672960 0,06 100,6

    Concluso?

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    11.5 Intervalo O intervalo foi estabelecido atravs da faixa de linearidade determinada pelo mtodo e confirmada pela preciso e recuperao, sendo de 0,02 a 0,06 mg/mL. 11.6 Robustez

    Para verificao da robustez, foram realizadas modificaes no fluxo da fase mvel de 1,0 mL/min. para 0,8 mL/min. e na temperatura, de 30C para 32C, com avaliao dos resultados obtidos para a amostra e padro nas concentraes de 100 %. Os resultados obtidos so apresentados na Tabela 07:

    Tabela 07: Resultados obtidos para robustez

    Alteraes Amostra Concentrao

    Terica (mg/Frasco)

    reas

    Concentrao Obtida (mg/Frasco)

    Recuperao (%)

    Fluxo 0,8 mL/min.

    1

    203,82

    3152871 191,48 93,9 2 3201222 194,42 95,4

    Temperatura 32 C

    1 2556107 193,07 94,7 2 2559015 193,29 94,8

    Aps a verificao das modificaes realizadas no mtodo analtico, Diminuindo o fluxo da fase mvel de 1,0 mL/min para 0,8 mL/min. e na temperatura, de 30C para 32C. Concluso?

    12-Sumrio dos parmetros de aceitao

    Parmetros Critrios de Aceitao Resultados para o Analito

    Especificidade

    Ausncia de interferncias detectveis no tempo de reteno

    para o analito na anlise cromatogrfica

    Ausncia de interferncias detectveis no tempo de reteno

    para o analito na anlise cromatogrfica

    Linearidade r 0,99 r = 0,9998 (1dia)

    r = 0,9999 (2dia)

    Preciso

    (Repetibilidade da amostra) CV < 5,0 % CV = 2,1 %

    Preciso Intermediria CV < 5,0 % CV = 2,1 %

    Recuperao Recuperao 90 % a 110 %

    Baixa: 97,2 % Mdia: 101,9 % Alta: 100,6 %

    13-Consideraes gerais:

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    Consideram-se os seguintes fatores para validao total ou parcial: a) Fatores que levam revalidao total:

    Uso desta condio analtica para outro analito ou outro frmaco de mesmas caractersticas com formulao indisponvel ou no conhecida.

    Uso desta condio analtica para analisar um novo analito introduzido na formulao. b) Fatores que levam revalidao parcial:

    Alteraes no sistema analtico 14-Concluso: Com os valores para os parmetros de validao determinados, a metodologia analtica est validada para a anlise de teor de Dacarbazina na amostra de Dacarbazin 200 mg P Estril Injetvel, no intervalo de 0,02 a 0,06 mg/mL para Dacarbazina. 15 - Referncias Bibliogrficas:

    [1] - Leite, Flvio; Validao em Anlise Qumica Editora tomo 4a edio. [2] - Resoluo RE 899, de 29 de maio de 2003, ANVISA. [3] - Merck Index - 13th Ed., 2001.

    16 - Assinaturas: _________________________ ___/___/____ XXXXXXXXXXXXX Diretora de Estudo CRF/SP XXXXXXXXX _________________________ ___/___/____ XXXXXXXXXXXXXXXX Analista Principal CRQ/SP XXXXXXXXXX _________________________ ___/___/___ XXXXXXXXXXXXXXXXX Gerente da Qualidade CREA/SP XXXXXXXXXXXXXXX

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