Principais conceitos e técnicas

utilizados na microbiologia

Aluno: Ivson Cassiano de O. Santos

2012

LAQB

Laboratório de Analises

Químicas e Biológicas

INTRODUÇÃO

A Microbiologia é o ramo da biologia que estuda os

microrganismos, incluindo eucariontes unicelulares e

procariontes, que incluem Bactérias, Fungos, Vírus,

Protozoários, Algas unicelulares, Viróides e Prions.

A Bacteriologia é uma ciência, ramo da Biologia, que

estuda as bactérias e suas propriedades.

ambiente apropriado

instrumentais estéreis

luvas, máscaras e óculos protetores

Flambar as alças e agulhas e boca dos tubos.

limpar e desinfetar periodicamente a bancada.

Todas as operações envolvendo manipulação de culturas e

meios de cultura deverão ser efetuadas na área de proteção

conferida pela chama do bico de Bunsen.

CONDUTAS, BARREIRAS, EQUIPAMENTOS E

INSTRUMENTAIS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL E AMBIENTAL

ÁLCOOL 70%

Sua atividade ocorre pela desnaturação de proteínas e remoção de

lipídios, inclusive dos envelopes de alguns vírus. Para apresentar

sua atividade germicida máxima, o álcool deve ser diluído em

água, que possibilita a desnaturação das proteínas. A concentração

recomendada para atingir maior rapidez microbicida com o álcool

etílico é de 70% em peso e com o isopropílico, entre 60 e 95%.

Possuir fácil aplicabilidade, baixo custo e reduzida toxicidade.

Diluição correta e tempo de exposição

CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS

CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS

Fig.: Procedimento para remover bactérias de um caldo com a

alça de platina

CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS

Fig.: Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de

uma Placa de Petri

INOCULAÇÃO NA PLACA DE PETRI

Estrias múltiplas ou

esgotamento

Isolamento de colônias

bacterianas e obtenção

culturas puras.

DESCONTAMINAÇÃO

Um dos principais problemas nos laboratórios de microbiologia é a grande

quantidade de resíduos contendo microrganismos infecciosos.

Autoclaves

Desinfecção química

Os recipientes que acondicionam material com perigos microbiológicos

devem conter um desinfetante na diluição de uso apropriada.

Compostos à base de fenol 5% , hipocloritos (água sanitária a 2%) e

glutaraldeído 2%, formaldeído (solução alcoólica 8% e solução aquosa

10%).

BANCO DE DADOS

O nosso laboratório dispõe de uma tabela com as bactérias presentes

em estoque com suas devidas informações e observações.

Bactéria Cepa/numero Origem Espécie

Condições de crescimento Incubação Condições de estoque

Ultima data de estoque Observações

INTRODUÇÃO

Cepas bacterianas

Isto deriva dos fenômenos espontâneas ou

induzidos da natureza ou mesmo

artificialmente, chamado "Mutação Genética"

CEPAS PADRÃO

São cepas destinadas ao controle de qualidade

bacteriológico.

Apresentam resposta conhecida a uma série de

provas laboratoriais, entre as quais bioquimismo,

reação tintorial ao Gram, morfologia e resposta a

antibióticos.

ATCC AYE SDF

ACICU AB

CEPAS LAQB

Cepas ATCC - American Type Culture

Collection.

Escherichia coli ATCC 10536

ESCHERICHIA COLI ATCC 10536

Referencia para esta cepa :

Di Modugno E et al. 1994

Misiek et al. 1973.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 8096

PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 9027

MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240

ATCC 14452

MEIO DE CULTURA

Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada,

capazes de promover o crescimento bacteriano, em condições laboratoriais. Para isso um meio de cultura necessita conter características básicas, que incluem:

- Fonte de carbono e nitrogênio

- Fonte de energia

- Sais minerais

- Fatores de crescimento

- Condições físicas

- Esterilização

TIPOS DE MEIOS DE CULTURA

Meios de enriquecimentos

Caldo Brain Heart Infusion (BHI)

Caldo Tetrationato

Meios de transporte

Meio de Stuart

Meio de Cary-Blair

Caldo Tioglicolato

o Meio seletivo

Agar Manitol Salgado

Agar SS

TIPOS DE MEIOS DE CULTURA

Meio diferencial

Agar Eosin Meteiolene Blue (EMB)

Agar McConkey

Agar Hektoen.

Meio indicador

Agar Triple Sugar Iron (TSI)

Agar Citrato de simimons.

PROCEDIMENTOS E CUIDADOS NA PREPARAÇÃO

DE MEIOS DE CULTURA

Na preparação de um meio, deve-se adicionar uma pequena

quantidade de água até que o meio fique úmido e então completar

com o resto de água homogeneizando a solução.

O tempo de esterilização em autoclave é de 15 minutos á

temperatura de 121°C.

Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas,

para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos

tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.

Todos os meios confeccionados

devem ser devidamente

identificados com o nome do

meio e do responsável, data de

fabricação, data de validade e

tipo de armazenamento.

MANUTENÇÃO DE CULTURAS

A manutenção de culturas é realizada para que

se possa manter viável as cepas em estoque.

De acordo com a cepa a concentração de glicerol

pode variar.

Ex.: E. coli 50% glicerol e 50% Ágar Nutriente.

Prazo de validade: 3 meses á -20°C.

PLANO DE TRABALHO LAQB - 2012

Objetivo: Fazer o levantamento de cepas atualmente encontradas no

LAQB e preparar o mesmo para aquisição de outras.

Método:

1°- Inoculado as amostras em meio enriquecido para proporcionar o

crescimento das amostras. O meio de enriquecimento escolhido foi o

caldo BHI, após a semeadura , incubar por 24h á 37ºC.

Resultados: POSITIVO para turvação no meio.

NEGATIVO para coloração intacta do meio.

2° - De acordo com os resultados obtidos na etapa 1, será semeado as

amostras de acordo com o meio seletivo de cada espécie.

Staphylococcus aureus = manitol

E. coli = EMB

Pseudomonas areuginosa = agar Pseudomonas

Micrococcus luteus = MH

Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração)

Método:

O Manitol é fermentado pelo Staphylococcus Aureus,

mas não pela maioria dos Staphylococcus; o Sal inibe o

crescimento da maioria dos microrganismos, mas o

Staphylococcus Aureus.

Meio Manitol salgado para

Staphylococcus Aureus.

Meio EMB (Eosine Methylene

Blye) para E. coli

O meio EMB, o azul de Eosina e Metileno

inibem o crescimento de Gram positivas. E. coli

apresentam colônias escuras ou verde metalico,

fermentação da lactose e sacarose.

Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração)

Meio Agar Pseudomonas.

Permite a diferenciação de P. aeroginosa de outras

Pseudomonas. As P. aeroginosa apresentam

pigmento azul-verde escuro que se funde ao meio.

Micrococcus luteus em meio MH

M. luteus apresentam pigmentação amarela

tanto em meio AN, quanto em MH.

Método:

3° - Ressemear, por esgotamento, todas as amostras crescidas

e isoladas em meio agar nutriente 24h 37°C

Método:

Meio Agar Nutriente

4° - Teste bioquímico

A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de

Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou

espécies de bactérias

4° - Teste bioquímico

Meio TSI, meio SIM, meio citrato de Simons, Meio úreia.

5° - Preparo para estoque

Semear em placa, com swab, as amostras cultivadas no caldo

6° - Estoque

NEXT

Método:

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS – DISCIPLINA:

BACTERIOLOGIA. PROFESSOR ALOYSIO

CERQUEIRA, UFF.

Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos

Exames Microbiológicos – ANVISA.

Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da

Embrapa Agrobiologia, 1999.

Biossegurança em Laboratórios Biomédicos de

Microbiologia - 3.a edicao, 2006.