BIOFÍSICA: Um conceito Biofísica (Física Biológica) é o estudo do caráter físico dos fenômenos biológicos (vitais), estudados em todos os níveis, começando pelas moléculas e as células, e terminando pela biosfera em seu conjunto. As investigações biológicas começam com o mapeamento físico do problema relacionado com a natureza viva. Isto significa que tal questão se formula a partir das leis gerais da Física e da estrutura atômica e molecular da matéria. Nesta investigação a Biofísica utiliza metodologia, conhecimentos e tecnologias da Física, Química e Matemática, guiada por uma filosofia, uma disposição final, com o objetivo de descobrir, aprofundar e dominar os fenômenos biológicos. Devemos observar que o conteúdo da Biofísica não está obrigatoriamente ligado à utilização dos equipamentos físicos, porém os médicos ou biólogos que utilizam estes aparelhos em geral não se ocupam da Biofísica, embora possam estar envolvidos fenômenos Biofísicos nos eventos estudados com estes aparelhos.

Objetivos da Biofísica O enorme campo de atividade da Biofísica, ao lado de sua complexa estrutura, não lhe permite um simples e único objetivo. Em síntese podem ser enumerados: 1- Estudar os fenômenos biológicos através das leis e princípios da Física 2- Adaptar ao estudo da Biologia a tecnologia e métodos da Física. 3- Estudar os efeitos dos agentes físicos sobre os seres vivos e particularmente, sobre suas ultra-estruturas

e seus funcionamentos. 4- Construir modelos físicos e matemáticos dos sistemas vivos. Métodos de Estudo da Biofísica A Biofísica utiliza para investigação os mesmos métodos da Física, isto é, a observação, a experimentação, a indução e a dedução. A seqüência de uma metodologia caracteriza um estudo científico. Cada um dos métodos exige do pesquisador correta atitude que se expressa através da honestidade, imparcialidade, precisa tecnologia e extremada atenção ao trabalho.

Partes da Biofísica Condicionalmente a Biofísica se divide em cinco partes. Esta divisão em áreas de concentração do conhecimento surgiu naturalmente com o desenvolvimento da Biofísica, pois sua vasta abrangência fez com que houvesse necessidade de formação de grupos especializados em áreas definidas dos diversos campos da Biofísica. Então, seguindo a natureza viva que se nos apresenta em vários níveis de complexidade: as moléculas, as organelas celulares, células, tecidos, organismos, biosfera, temos os diversos níveis de que si ocupa a Biofísica. Que são:

1- Biofísica Molecular 2- Biofísica celular: bioenergética e bioeletrogênese 3- Biofísica dos Sistemas Fisiológicos 4- Radiobiologia 5- Métodos e Recursos de Investigação e Análise utilizados na Biofísica.

A Biofísica Molecular estuda a estrutura e as propriedades físico-químicas das moléculas biologicamente funcionais, sobretudo os biopolímeros, ou seja, as proteínas e os ácidos nucléicos. A tarefa da Biofísica Molecular consiste em descobrir os mecanismos físicos, responsáveis pela funcionalidade biológica das moléculas, por exemplo, da atividade catalítica das enzimas e distribuição dos gens nos cromossomos. A Biofísica Celular estuda a estrutura e função dos sistemas celulares e de tecidos. Este domínio da Biofísica é considerado o mais velho e tradicional. Suas tarefas fundamentais hoje estão ligadas com o estudo da física das membranas biológicas e dos processos bioenergéticos (Bioenergética). A biofísica da célula inclue o estudo da gênese e transmissão do impulso nervoso (Bioeletrogênese), o estudo dos processos mecanoquímicos (em particular a contração muscular), o estudo dos fenômenos fotobiológicos (fotossíntese e visão). A Biofísica dos Sistemas Fisiológicos estuda todos os aspectos físicos e funções dos sistemas fisiológicos. Que são: Respiração, Circulação, Função Renal, Audição, Visão e a Biomecânica dos músculos e esqueletos. Radiobiologia estuda os efeitos das radiações sobre os seres vivos, desenvolvendo sua metodologia. Dentro deste campo destacam-se duas sub-áreas a das radiações ionizantes e a das radiações excitantes (fotobiologia).

Métodos e Recursos de Investigação e Análise utilizados na Biofísica. O desenvolvimento de uma série de métodos e técnicas de análise com aplicação na investigação dos fenômenos Biofísicos deu origem a um campo da Biofísica que se dedica a elaboração de técnicas que dão suporte a investigação Biofísica. Segundo a característica física ou fenômeno em que se baseiam podemos classificar estes métodos em:

a) Métodos de investigação baseados nas características físicas (massa molecular, dimensões e formas): - Sedimentação - Ultrafiltração

1

- Dispersão da luz - Dispersão dos Raios X - Cromatografia - Eletroforese.

b) Métodos de investigação baseados na interação das substâncias com a radiação (dos raios X à radiofrequência):

- Espectrofotometria de Absorção: infravermelho, visível, ultravioleta. - Espectrofotometria de Emissão: fluorescência, absorção atômica - Dicroismo Circular - Dispersão Ótica-rotatória - Difração de Raios X - Espectroscopia de Ressonância Gama (efeito Mossbauer) - Ressonância Paramagnética Nuclear(NPR) - Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) - Ressonância Magnética Nuclear (NMR) - Microscopia Ótica - Microscopia Eletrônica - Radiografia - Tomografia Computadorizada - Ultrassonografia

c) Métodos de investigação baseados na emissão de radiação por substâncias radioativas incorporadas aos sistemas biológicos (biomoléculas, células, tecidos, órgãos). São técnicas radioscópicas que utilizam os traçadores radioativos em pesquisa biológica, por exemplo:

- Auto-radiografia - Radioimunoensaio - Marcação radioisotópica - Cintilografia.

2

Soluções

l - INTRODUÇÃO

Todos os seres vivos, do ponto de vista biofísico, constituem-se de uma porção (ou porções) de solução cujo volume é determinado por meio de membranas biológicas. Sob este ponto de vista uma ameba ou um animal pluricelular podem ser considerados como uma solução ou um conjunto de soluções, embora altamente complexas e heterogêneas. A composição química de uma célula depende do tipo de célula, da região que se está examinando e varia continuamente com o tempo. Diz-se que a vida começou nos oceanos primitivos, portanto, em uma solução aquosa. Todos os animais, aquáticos ou não, procuram conservar-se com uma composição dentro de determinados limites, característicos da sua espécie. Qualquer variação, se não corrigida, pode levar a alterações fisiológicas que terminam resultando na morte do animal. Na espécie humana, por exemplo, a concentração extracelular de K

+ deve permancecer nos limites de 4,5 a 5,5 mEq/l. Alterações para cima ou

para baixo desses limites podem levar à morte por parada cardíaca. Qualquer pesquisa na área biológica faz uso de reagentes na forma de solução. A maior parte dos medicamentos empregados na área biomédica é apresentada sob a forma de solução: antibióticos, anestésicos, vitaminas, minerais, antitérmicos, analgésicos, vacinas. Na recuperação de pacientes desidratados ou para a manutenção do volume hídrico durante uma cirurgia ou no pós-operatório, faz-se uso de soluções cujo volume, composição e velocidade de administração devem ser estritamente controlados e são calculados com base no peso do paciente, no grau de desidratação e outros parâmetros clínicos.

ll - COMPOSIÇÃO

Qualquer solução é constituída basicamente por, no mínimo, dois componentes: o soluto e o solvente. O plasma sanguíneo, por exemplo, é uma solução constituída de grande quantidade de água, que é o solvente, na qual estão dispersos vários solutos, tais como: proteínas, sais minerais, aminoácidos, açúcares, vitamins, hormônios e outros. Tratando-se de líquidos biológicos, teremos sempre a água como solvente e a maior parte dos solutos na forma sólida. Uma exceção importante consiste na dissolução dos gases envolvidos na respiração celular nos líquidos biológicos.

Ill - CONCENTRAÇÃO

Caracteriza-se qualitativamente uma solução identificando-se quimicamente o seu solvente e o seu soluto, ou seus solutos por exemplo: solução aquosa de NaCl. Quando não se especifica o solvente, subentende-se que seja a água.

A caracterização quantitativa de uma solução é feita por dois parâmetros: a sua concentração ( C ) e o seu volume (V). Como existe uma relação matemática entre esses dois parâmetros e, além disso, é possível ter-se vários volumes de uma solução com a mesma concentração, a caracterização quantitativa das soluções é feita comumente apenas pela sua concentração.

Por definição a concentração C de uma solução é a relação entre a quantidade de soluto (Q) e o volume da solução (V) : Q Q C = ----- ==> Q = C . V ==> V = ----- V C Dessa definição, deduz-se que a quantidade de soluto (Q) presente em uma solução é sempre igual ao produto da concentração (C) pelo volume da solução (V).

IV-UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO

Da definição de concentração conclui-se que as unidades de concentração dependem das unidades de medidas ou de expressão da quantidade de soluto e do volume da solução.

Por exemplo : se a quantidade de soluto for expressa em grama (g) e o volume da solução em litro (l) a concentração será em g/l.

Na área biomédica as unidades de concentração mais utilizadas são as seguintes:

mg/ml............................................indica a quantidade de miligrama de soluto existente em cada um mililitro de solução. mg%..............................................indica a quantidade de miligrama de soluto existente em cada cem mililitros de solução. g/ml(g/cm

3)....................................indica a quantidade de grama de soluto existente em cada um mililitro de

solução. g%.................................................indica a quantidade de grama de soluto existente em cada cem mililitros de solução.

3

M ou mol / l...................................indica o número de moles de soluto existente em cada um litro de solução.

mM ou mmol/l...............................indica o número de milimoles de soluto existente em cada litro de solução.

N ou Eq/l................................ indica o número de equivalentes-grama de soluto (em relação a uma determinada função) existente em cada um litro de solução.

mEq/l.............................................indica o número de miliequivalentes-grama de soluto(em relação a uma determinada função) existente em cada um litro de solução. Osm ou osmol/l..............................indica o número de moles de partículas de soluto, ou seja, o número de osmoles existente em cada um litro de solução. mOsm ou mosmol/l.........................indica o número de milimoles de partículas de soluto existente em cada um litro de solução

A conversão de uma unidade de medida em outra pode ser feita facilmente através de fatores de conversão ou de proporcionalidade. Por exemplo: a conversão de g/l para mol/l é feita utilizando-se a massa molecular como fator de conversão. Para transformar concentrações de mol/l para osmol/l, utiliza-se o fator de Van`t Hoff (i). As conversões de g para mg ou l para ml não necessitam comentários.

V - REGRAS DE DILUIÇÃO

A concentração de uma solução pode ser modificada por meio de três processos.

1 - Acrescentando-se ou retirando-se solvente (±V)

2 - Acrescentando-se ou retirando-se soluto (±Q)

3 -Acrescentando-se ou retirando-se soluto(±Q) e solvente (±V) na forma de solução a uma concentração diferente.

Se a concentração final (Cf) for menor que a inicial (Ci) dizemos que a solução foi diluída, ao contrário, que foi concentrada. Em qualquer caso, porém, o Princípio da Diluição estabelece que a quantidade final de soluto (Qf) será obrigatoriamente igual à quantidade inicial (Qi) somada à quantidade acarescentada (+Qa) ou retirada (-Qa).

Qf = Qi ± Qa sendo: Qf = Cf . Vf

Qi = Ci . Vi e Vf = Vi ± Va

Qa = Ca . Va

Como, em qualquer solução, a quantidade de soluto é sempre igual ao produto da concentração pelo volume, podemos substituir na equação anterior e obter uma nova equação com a qual podemos calcular a concentração da solução modificada (Cf).

Cf . Vf = Ci . Vi _ ± Ca . Va

Qf = Qi ± Qa

Quando ocorrer alterações apenas no volume da solução (processo 1) quantidade final (Qf) de soluto permancecerá igual à inicial (Qi). As equações anteriores serão simplificadas pois o último termo (Qa) é nulo:

Qf = Qi e Cf . Vf = Ci . Vi sendo Vf = Vi ± Va

Devemos chamar a atenção para o uso de unidades COERENTES nessas equações. Multiplicar C em moles/l por V em ml ou querer obter Cf em moles/l expressando Ci em g / l é absurdo ! Na área biomédica, muitas substâncias são prescritas e administradas com base no peso corporal do paciente e divididas em mais de uma tomada por dia. As doses diárias ou fracionadas (de 12/12 hs, de 8/8 hs, etc.) podem ser facilmente obtidas por simples regras de proporcionalidade, sabendo-se o peso corporal do paciente. Se, por exemplo, um medicamento apresentado na forma de suspensão a 100mg/ml, deve ser administrado na dose de 40mg/kg . dia (40 mg por kg de peso por dia) dividido em quatro tomadas, como deveria ser a prescrição desse medicamento para um indivíduo de 50 kg de peso corporal ? 1 kg..........40 mg 50 kg.......... x mg x (dose diária) = 2000 mg 2000 mg..........1 dia (24 hs) Y mg..........1/4 dia (6 hs) Y (dose fracionada) = 500 mg 100 mg..........1 ml

4

500 mg..........Z ml Z (volume da suspensão) = 5 ml Prescrição: Tomar 5ml da suspensão (que contém 500mg do medicamento) de 6 em 6 horas (quatro vezes por dia).

5

Composição e propriedades físico-químicas Dos compartimentos dos organismos superiores

I- INTRODUÇÃO Os animais unicelulares ou de pequeníssimo porte captam diretamente do ambiente o oxigênio e as substâncias nutritivas necessárias à sua sobrevivência e lançam, também diretamente no meio ambiente, os produtos resultantes do seu metabolismo. São portanto bastante suscetíveis a variações do meio e, se não dispõem de meios de locomoção ativa ou passiva, morrem após um certo tempo porque consomem todos os nutrientes disponíveis. Os animais multicelulares, como o homem por exemplo, não podem, evidentemente, depender da captação DIRETA de oxigênio e nutrientes, e nem da eliminação DIRETA de catabólitos no meio ambiente. Se assim fosse, apenas as células superficiais sobreviveriam e, além disso, o animal teria que viver num meio aquoso (mergulhado em uma “salmoura”). Para solucionar esse problema, a “natureza” (?) desenvolveu, nos animais superiores, sistemas especializados em determinadas funções. Cada sistema é constituído por órgãos, que por sua vez são constituídos por tecidos e estes por células. Assim: - separando o animal do ambiente externo e desempenhando um papel de proteção, temos o sistema tegumentar. Essa proteção inclue a defesa contra agentes biológicos nocivos ou contra a perda de água, eletrólitos ou calor pelo organismo. - para a captação do oxigênio e eliminação do gás carbônico temos o sistema respiratório. - para a digestão dos alimentos, absorção dos nutrientes e da água e eliminação dos resíduos temos o sistema digestório. - para a distribuição do oxigênio e dos nutrientes a todas as células do organismo e para a coleta do gás carbônico e dos catabólitos por elas produzidos temos o sistema circulatório ou cardiovascular. - para a depuração do sangue, eliminação de substâncias tóxicas não voláteis como a uréia, controle e manutenção do volume hídrico, do pH e da osmolaridade do organismo temos o sistema urinário. - para a locomoção em busca de alimento ou para a defesa do animal temos o sistema “ósteo-muscular”. - para a determinação das características sexuais e para a perpetuação da espécie temos o sistema reprodutor. - por fim, para possibilitar o funcionamento harmônico dos sistemas anteriores, controlando o organismo como um todo, temos o sistema neuro-hormonal que, além disso, permite ao animal especialmente ao homem o relacionamento social e a execução de atividades intelectuais. Nos animais unicelulares basta a membrana citoplasmática para separar o meio intracelular do meio ambiente. Além dessa função de compartimentalização a membrana celular também controla o intercâmbio entre os meios intra e extracelular. Os animais multicelulares, com o grande número e a variedade de células individuais que possuem, necessitam de sistemas especiais de controle de intercâmbio. Como são constituídos por diversos sistemas cuja células nem sempre estão em contato direto com o ambiente, têm que desenvolver para si um “meio ambiente interno” que possibilite o intercâmbio entre todas as células, através do sistema circulatório, e também o intercâmbio com o meio ambiente externo através do sistema tegumentar, respiratório e urinário. O controle qualitativo e quantitativo desse “meio ambiente interno” é de suma importância para a sobrevivência do animal. Do ponto de vista físico-químico um animal nada mais é do que uma solução aquosa, pois cerca de 65% de seu peso é água. O restante é constituído pelos diversos solutos existentes nos seres vivos como os pequenos compostos orgânicos e inorgânicos e as macromoléculas.

II-PROPRIEDADES FÍSICAS DA ÁGUA As propriedades físicas da água demonstram porque a natureza a elegeu espontaneamente o maior componente da matéria viva. A água constitui cerca de 60 a 70% do peso corporal dos animais superiores. Além do seu admirável poder solvente, que suplanta o dos demais líquidos, outras propriedades comprovam a necessidade vital da água.

II.1-Estrutura da água A molécula de água consiste de dois átomos de hidrogênio (H) ligados por ligação covalente a um átomo de oxigênio (O). Várias experiências comprovam que a molécula de água não é linear, isto é, os seus átomos não estão em linha reta, mas sim formando uma cadeia dobrada segundo um ângulo de 105 graus. A estrutura molecular da água está representada na figura abaixo: H / (-) O (+) 105 graus \ H Trata-se de uma molécula dissimétrica; os dois átomos de hidrogênio estão do mesmo lado em relação ao oxigênio. Esta configuração confere à molécula de água as propriedades de um dipolo pois, sendo o oxigênio mais eletronegativo, atrai com mais força os elétrons das ligações com os dois átomos de hidrogênio. Forma-se assim uma região negativa em torno do átomo de oxigênio e uma região positiva em

6

torno dos átomos de hidrogênio. Por isso, a água é, entre todos os solventes, o mais ionizante e também aquele que, para os eletrólitos, tem o maior poder de dissociação. Ainda pela mesma razão, as moléculas de água são unidas por pontes de hidrogênio, como mostra a figura:

H H H H \ / \ / O .....H -- O H H.......O / \ / H O

: H H \ / O As linhas cheias representam ligações covalentes e as linhas interrompidas, ligações secundárias chamadas ligações por pontes de hidrogênio ou pontes de hidrogênio. No espaço, a estrutura é tetraédrica. A ligação por pontes de hidroênio é a causa de algumas propriedades especiais da água. É uma ligação que pode ser classificada como ligação química, mas que excepcionalmente, é de fraca energia (~- 5 Kcal/mol). A ligação por pontes de hidrogênio ocorre em virtude da atração de um próton ou um íon hidrogênio por dois átomos fortemente eletronegativos pertencentes a duas moléculas ou grupamentos atômicos distintos. Seu interesse é grande porque: - é encontrada na água, no ponto em que une as moléculas (de modo que poderia ser qualificada como ligação física) em muitos constituintes do organismo. É encontrada também em macromoléculas como as proteínas e os ácidos nucleicos, nas quais muito contribui para a manutenção da estrutura espacial dessas moléculas. - tem fraca energia, o que permite o seu fácil rompimento. Quanto maior a temperatura de um sistema, menor a quantidade de pontes de hidrogênio existente. As pontes de hidrogênio implicam numa forte associação das moléculas isto é, numa forte coesão. Isso explica a forte tensão superficial e o ponto de ebulição elevado para uma molécula tão leve como a água. No estado gasoso, a água se apresenta sob a forma de mono-hidrol (H-O-H), de peso molecular igual a 18g/mol. No estado líquido, porém, a polaridade da água permite a associação de moléculas entre sí, através de pontes de hidrogênio, com a formação de di-hidrol (H-O-H)2 ou tri-hidrol (H-O-H)3 em diferentes proporções dependendo da temperatura. O gelo, ou seja, a água no estado sólido, parece que está unicamente na forma de tri-hidrol.

II. 2-Calor específico ( c = Q / m . t )

Calor específico de uma substância corresponde à quantidade de calor necessária para variar de 1 grau Celsius a temperatura de 1 g dessa substância. Quanto maior o calor específico de uma substância, maior sua capacidade de absorver, armazenar ou ceder grandes quantidades de calor sem sofrer grandes variações de temperatura. Em condições ordinárias de temperatura e pressão a água, entre todos os líquidos, é o que tem maior calor específico: 1 cal/g.ºC. Significa que deve-se retirar ou acrescentar 1 cal a cada 1 g de água para que haja uma variação de temperatura de 1ºC ou ou 100 cal para cada 100 g para variar a temperatura de 1ºC. Esta propriedade física da água é de grande importância para os seres vivos pois permite que ela se comporte como um tampão ou amortecedor térmico, impedindo que ocorram grandes variações da temperatura celular em decorrêcia do calor liberado durante as reações biológicas. Nos animais superiores, a contínua movimentação da água através do sistema circulatório facilita a distribuição do calor por todas as partes do organismo e o intercâmbio com o meio ambiente. Para ilustrar, admitamos a existência hipotética de dois animais A e B, sendo o animal A composto de 200 g de água e o animal B de 200 g de uma substância cujo calor específico é igual a 0,2 cal/g.oC. Suponhamos que esses animais estejam a uma temperatura de 37oC e efetuem uma mesma reação biológica com a liberação de 100 cal. Supondo ainda que todo o calor liberado permaneça nos animais, quais serão suas temperaturas após as reações?

Animal A Animal B m = 200 g m = 200 g c = 1 cal / g.ºC c = 0,2 cal / g.ºC Q = 100 cal Q = 100 cal ti = 37 ºC ti = 37 ºC

t = ? t = ?

tf = ti + t = ? tf = ti + t = ?

--------------------------------------------------------------------------------------------------

c = Q / m . t donde t = Q / m . c

7

-------------------------------------------------------------------------------------------------- 100 cal 100 cal

t = ---------------------------- t = ---------------------------- 200 g . 1 cal / g . ºC 200 g . 0,2 cal / g . ºC

t = 0,5 ºC t = 2,5 ºC tf = 37 ºC + 0,5 ºC = 37,5 ºC tf = 37 ºC + 2,5 ºC = 39,5 ºC --------------------------------------------------------------------------------------------------

O animal A, composto de água, sofreu apenas uma variação de temperatura de meio grau Celsius, enquanto o animal B sofreu uma variação de temperatura cinco vezes maior. Com mais 100 cal, a temperatura do animal A elevar-se-ia para 38 ºC, ao passo que a do animal B atingiria 42 ºC. II.3-Calor latente de mudança de estado(L= Q/m) Denomina-se calor latente de uma substância a quantidade de calor necessária para mudar 1g dessa substância de um estado físico para outro. Assim, podemos ter calor latente de fusão, solidificação, evaporação, condensação, sublimação, etc. Nas temperaturas usuais suportadas pelos seres vivos, as mudanças de estado que podem ocorrer com a água são a passagem de sólido para líquido (fusão), ou o inverso (solidificação) e a passagem de líquido para vapor (evaporação), ou o inverso (condensação). O calor latente de fusão/solidificação da água é de 80 cal/g e o de evaporação/condensação de 540 cal/g. Quer dizer, para se congelar um grama de água é necessário retirar da mesma 80 calorias, enquanto que para evaporar um grama de água é preciso ceder-lhe 540 calorias. Sendo relativamente grande, o calor latente de solidificação da água dificulta o seu congelamento; o que seria desastroso para os seres vivos. O elevado calor latente de evaporação da água é uma propriedade física de grande importância na regulação da temperatura corporal porque permite que o organismo libere grandes quantidades de calor, por meio da evaporação, sem perder grandes quantidades de água. A evaporação da água ao nível da pele e das vias respiratórias se faz às custas do calor interno do organismo, isto é, a água ao evaporar-se retira calor do corpo. Este é um importante mecanismo de regulação da temperatura corporal, mas seria extremamente prejudicial se o calor latente de evaporação da água fosse pequeno pois, para eliminar uma determinada quantidade de calor o organismo teria que perder uma grande quantidade água, o que poderia levá-lo rapidamente a uma desidratação e à morte. Imaginemos novamente a existência de dois animais A e B, sendo A composto de 200 g de água e B de 200 g de uma substância líquida cujo calor latente de evaporação vale 108 cal/g. Suponhamos que esses animais necessitam perder, por evaporação, 1080 calorias. Quais as quantidades de líquidos que deveriam evaporar?

Animal A Animal B Q = 1080 cal Q = 1080 cal L = 540 cal/g L = 108 cal/g m = ? m = ?

m = Q = 1080cal = 2g m = Q = 1080cal = 10g L 540 cal/g L 108 cal/g

O animal A perderia apenas 1% da sua massa enquanto o animal B perderia 5% para eliminar a mesma quantidade de calor. II.4 - Tensão superficial A tensão superficial da água é maior do que a de qualquer outro líquido, com exceção do mercúrio. Esta propriedade é de grande importância no estudo físico-químico dos fenômenos de superfície, como os que se observam nos colóides. ---------------------------------------------------------------------------- Tensão superficial (20ºC ) ---------------------------------------------------------------------------- Água 72,7 dina/cm Glicerina 65,2 dina/cm Benzeno 27,9 dina/cm Acetato de etila 23,3 dina/cm ------------------------------------------------------------------------- II.5 - Constante dielétrica A água possui uma constante dielétrica elevada em virtude da polarização existente nas suas moléculas. Esta propriedade lhe permite separar e manter partículas de carga oposta sob a forma dissociada ou mesmo ionizar substâncias moleculares:

8

NaCl + H2O ----------------> Na

+ aq + Cl

-aq

H2O + HCl -----------------> H2OH

+ + Cl

-

H2O + NH3 -----------------> HO

- + NH3

+

Por fim, a polaridade da água induz até reações, embora fracas, entre duas moléculas de água:

H H H \ \ \

O + O OH+ + O

-

/ / / / H H H H -------------------------------------------------------------- Constantes dielétricas -------------------------------------------------------------- Ácido cianídrico 95 Água oxigenada 93 Formamida 84 Água 82 Ácido fórmico 62 Etanol 26 --------------------------------------------------------------

A água se apresenta “livre” ou “ligada” a certas partículas coloidais, formando a chamada bainha de hidratação. É a água ”ligada” aos emulsóides do plasma, isto é, as proteínas, que vai influir na pressão osmótica do plasma, a qual se denomina pressão oncótica ou coloidosmótica. III-DISTRIBUIÇÃO DE ÁGUA E SOLUTOS NOS ORGANISMOS SUPERIORES. Dissemos anteriormente que os seres vivos nada mais são que soluções aquosas. Não se trata, porém, de uma solução única e homogênea pois a existência de diversas membranas possibilita o fracionamento da solução total em compartimentos que apresentam composição e propriedades, às vezes, bastante diferentes. Essas diferenças de concentração e de propriedades entre dois ou mais compartimentos decorrem obviamente das propriedades das membranas que os separam como por exemplo permeabilidade e capacidade de transporte ativo. Esquematicamente podemos dividir um animal superior em dois grandes compartimentos ou “líquidos”: o líquido intracelular (LIC) e o líquido extracelular (LEC). O LIC seria o conjunto de todas as células do organismo e corresponde a cerca de 40% de peso corporal. É lógico que se trata de uma abstração pois cada célula indivídual tem seu LIC particular. O LEC seria um “meio ambiente interno”, ou seja, o líquido através do qual se realiza o intercâmbio entre as diversas células e sistemas do organismo e entre o organismo e o meio ambiente externo. Corresponde a cerca de 20% do peso corporal e subdividi-se em dois compartimentos: o líquido intravascular (LIV) ou plasma e o líquido intersticial (LIT). Este último corresponde a 15% do peso corporal e compreende o líquido existente entre as células e o compartimento intravascular. O LIT está separado do compartimento intravascular, ou seja, do sistema circulatório pela parede dos vasos sanguíneos, mais especificamente, pela membrana dos capilares que é onde verdadeiramente ocorre o intercâmbio entre esses dois compartimentos. O líquido intersticial (LIT) funciona como um “tampão” protetor para as células, amortecendo variações de concentração, de osmolaridade, de pH ou até mesmo de temperatura que ocorram bruscamente no compartimento intravascular (sangue).

------------------------------------------------------------------------------------------------- Distribuição da água nos organismos superiores *

-------------------------------------------------------------------------------------------------- Volume líquido total (VT) 60% Líquido intracelular (LIC) 40% Líquido extracelular (LEC) 20%

Líquido intersticial (LIT) 15% Líquido intravascular (LIV) 5% -------------------------------------------------------------------------------------------------- * Porcentagem média (v / p) em relação ao peso corporal --------------------------------------------------------------------------------------------------

A osmolaridade normal dos líquidos corporais, no homem, é de 0,3 Osm (0,3 osmol/l). Conhecendo-se o peso corporal de um animal pode-se determinar o volume (V) e a quantidade de soluto (Q) em cada compartimento. Assim, para um homem de 80kg teríamos os seguintes valores:

--------------------------------------------------------------------------------------------------

9

VT = 48 l C = 0,3 osmol/l Qt = 14,4 osmol -------------------------------------------------------------------------------------------------- LIC | LEC | V = 16 l C = 0,3 osmol/l Q = 4,8 osmol |--------------------------------------------------------------------- | LIT | LIV V = 32 l | V = 12 l | V = 4 l C = 0,3 osmol/l | C = 0,3 osmol/l | C = 0,3 osmol/l Q = 9,6 osmol| Q = 3,6 osmol | Q = 1,2 osmol -------------------------------------------------------------------------------------------------- Observe-se que a osmolaridade dos três compartimentos é a mesma. Isto ocorre em virtude das membranas celular e capilar serem totalmente permeáveis à água . Havendo alteração da osmolaridade em um até que um novo equilíbrio seja alcançado. O conteúdo líquido dos animais varia com a idade e com o sexo. Além disso, cada tecido possue compartimento, a água se desloca por osmose do compartimento menos concentrado para o mais concentrado uma concentração própria de água: -------------------------------------------------------------------------------------------------- Músculos 75-80% Tecido nervoso 70-85% Tecido conjuntivo 60% Hemácias 60% Tecido ósseo 25% Tecido adiposo 20% -------------------------------------------------------------------------------------------------- IV-DISTRIBUIÇÃO DOS SAIS Nos líquidos corporais, quase todos os ácidos, bases e sais se apresentam como partículas carregadas de eletricidade, os íons, em virtude da elevada constante dielétrica da água. Os compostos que formam íons em solução são chamados eletrólitos. Existem eletrólitos fortes , que se apresentam totalmente ou quase totalmente sob a forma dissociada ou ionizada, como o cloreto de sódio, o ácido clorídrico, ou o bicarbonato de sódio; e outros, os eletrólitos fracos, que se encontram parcialmente dissociados ou ionizados, como o ácido acético ou o ácido carbônico . Os íons carregados positivamente são os cátions, e os carregados negativamente são os ânions. Os íons de importância fisiológica são: Cátions: H

+, Na

+, K

+, Ca

++, Mg

++, NH

+

Ânions : OH-, HCO3

-, Cl

-, H2 PO4

-,HPO4

=, proteinatos(prot

-)

e SO4= .

No organismo como um todo, o número de íons carregados positivamente deve ser equilibrado por igual número de cargas negativas. Deste modo, é necessário que os cátions e ânions existentes nos líquidos corporais, embora possuam molaridade diferentes, tenham a mesma equivalência eletroquímica. A equivalência elétrica, porém, não é necessariamente igual a equivalência osmótica. Um mol de Ca

++ equivale osmoticamente a um mol de Cl

-, mas os dois não se equivalem eletricamente.

-------------------------------------------------------------------------------------------------- COMPOSIÇÃO DOS LÍQUIDOS DOS COMPARTIMENTOS DOS ANIMAIS SUPERIORES * -------------------------------------------------------------------------------------------------- Líquido Extracelular (LEC) ( LIC ) L . Intracelular --------------------------------------------------------------- Plasma (P) L. Intersticial -------------------------------------------------------------------------------------------------- Na+ 142 Na+ 143 K+ 157 K+ 5 K+ 4 Na+ 14 Ca++ 5 Ca++ 5 Mg++ 26 Mg++ 3 Mg++ 3 Ca++ -- ------------------ -------- ------------------------- ------------------ ----- 155 155 197 HCO3- 27 HCO3- 27 HCO3- 10 Cl- 103 Cl- 117 HPO4-- 2 HPO4-- 2 HPO4-- 117 SO4-- 1 SO4-- 1 SO4-- -- ác. Org. 6 ác. Org. 6 ác. Org. 6 prot- 16 prot- 2 prot- 70 -------------------------- -------------------------- ------------------------- 155 155 197 -------------------------------------------------------------------------------------------------- * As concentrações são expressas em mEq / l

10

Vê-se, pelo quadro acima, que há marcantes diferenças entre a composição do líquido intracelular (LIC) em relação ao extracelular (LEC) principalmente no que diz respeito ao Na

+ e ao K

+, sendo

o Na+ o cátion predominante do LEC e o K

+ do LIC. Com relação aos ânions, o Cl

- do LEC é substituído pelo

HPO4= no LIC.

Entre o plasma e o líquido intersticial, a principal diferença é a presença de uma maior concentração de macromoléculas (proteínas) no primeiro. Essas partículas desempenham importante papel na manutenção da tonicidade do compartimento intravascular e no intercâmbio de líquidos através dos capilares. As diferenças de concentração dos cátions Na

+ e k

+ entre o lado interno e externo das

células não são obtidas por simples difusão, mas po um processo metabólico complexo, que constitue o chamado “transporte ativo”associado a propriedades passivas da membrana celular como a permeabilidade seletiva. V- MECANISMOS DE TROCA DE SUBSTÂNCIAS ENTRE OS COMPARTIMENTOS. As forças que promovem o movimento de água e de pequenas moléculas através das membranas dos compartimentos são: difusão, filtração, osmose e transporte ativo. A DIFUSÃO consiste no espalhamento de uma substância devido simplesmente ao movimento aleatório de suas moléculas ou partículas constituintes. Pode ser difusão simples, quando ocorre num meio homogêneo, ou difusão através de uma membrana. Existindo a substância nos dois lados da membrana, a difusão se faz nos dois sentidos. No cômputo geral, porém, o transporte efetivo se faz da região de maior concentração para a de menor concentração. Denomina-se FILTRAÇÃO o processo de transferência de substâncias através de uma membrana por mieo de um gradiente de pressão hidrostática. A natureza da membrana, ou seja, o diâmetro dos seus poros, é quem determina quais as partículas que poderão ou não atravessá-las. A filtração constitue um importante mecanismo de troca de substâncias entre os compartimentos intravascular e intesticial através das paredes dos capilares. Normalmente, a membrana dos capilares é amplamente permeável à água e pequenas moléculas e impermeável às macromoléculas como as proteínas e os polissacarídeos. A OSMOSE consiste na transferência efetiva de solvente de uma solução menos concentrada para outra mais concentrada através de uma membrana quando esta é permeável apenas ao solvente. Dependendo do diâmentro dos poros, durante o fenômeno da osmose, além do solvente podem ser transportadas também pequenas moléculas ou partículas nele dissolvidas. Todos os processos vistos anteriormente são classificados como TRANSPORTE PASSIVO porque a transferência de substâncias se faz às custas da energia dos gradientes já existentes no sistema. A membrana não necessita realizar nenhum travalho para que o processo ocorra: existindo um gradiente (de concentração, elétrico, de pressão hidrostática ou osmótica) e sendo a membrana permeável, o transporte se efetua PASSIVAMENTE, ESPONTANEAMENTE. Considerando-se TRANSPORTE ATIVO, a transferência UNIDIRECIONAL de uma substância através de uma membrana INDEPENDETEMENTE ou até mesmo CONTRA um gradiente qualquer. Esse processo necessita de uma fonte externa de energia pois, de outro modo não poderia manter o transporte em uma única direção nem vencer um gradiente contrário que mesmo não existindo de início, apareceria logo que fosse iniciado o processo. Normalmente, as membranas biológicas obtêm na hidrólise do ATP a energia necessária para executar seus transportes ativos. As membranas podem ser estudadas quanto à permeabilidade a uma substância, ou seja, a um soluto, ou a uma solução. Quanto à permeabilidade a uma solução as membranas podem ser classificadas como PERMEÁVEIS, POUCO PERMEÁVEIS, ou IMPERMEÁVEIS, conforme o grau de facilidade com que se deixam atravessar pela referida substância. Quanto à permeabilidade a uma solução as membranas podem ser classificadas como PERMEÁVEIS, quando se deixam atravessar pelo soluto e pelo solvente; SEMI-PERMEÁVEIS, quando se deixam atravessar apenas pelo solvente e IMPERMEÁVEIS, quando não se deixam atravessar nem pelo solvente nem pelo soluto. É claro que uma mesma membrana pode ser permeável a uma solução e semi-permeável a outra. A última classe de membranas (impermeáveis) poderia ser associada a estruturas qeratinóides nos seres vivos.

VI - OSMOSE, OSMOLARIDADE, PRESSÃO OSMÓTICA E TONICIDADE Denomina-se OSMOSE, a transferência efetiva de solvente através de uma membrana semi-permeável, como decorrência de um gradiente de concetração do soluto entre os dois compartimentos separados pela membrana. Na realidade, a osmose é uma caso particular de difusão através de uma membrana. A B A B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M . . . . . . . . . . . . . M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

(Início) (Equilíbrio) Consideremos o esquema acima constituído por dois compartimentos A e B, separados por uma membrana M, permeável apenas à água. Coloquemos no compartimento A 2 litros e no compartimento B 1 litro de água pura. Sendo a membrana permeável, haverá um fluxo contínuo de água de A para B e de B para A, devido ao movimento aleatório das moléculas que resulta em choque das mesma entre si e com as paredes do recipiente, e portanto, com a superfície da membrana. Como, porém, as moléculas no lado A estão submetidas a uma pressão hidrostática maior que no lado B, o fluxo de A para B será maior que de B para A. Teremos então uma transferência efetiva de água de A para B até que as duas pressões se igualem. Nesse ponto o sistema atingiu um estado de equilíbrio dinâmico em que os fluxos de A para B e de B para A continuam existindo, porém, com a mesma intensidade. É importante frisar que o processo de transporte efetivo da água de A para B se efetuou em decorrência de um gradiente de pressão hidrostática: não tem nada a ver com osmose. Estando o sistema em equilíbrio hidrostático, coloquemos no lado A 0,15 mol de glicose (G). Teremos então uma solução 0,1 M no lado A e solvente puro no lado B. A B . . . . . . . 0,1 M . . . . . . .. M Água (G) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Com relação às pressões hidrostáticas, o sistema continua em equilíbrio. Teremos agora, no

entanto, um desequilíbrio de concentração. Como a membrana é impermeável à glicose, se poderá supor que nada mais aconteceria ao sistema pois, apesar de estar submetida a um gradiente de concentração, a glicose não pode passar para o lado B e atingir assim um equilíbrio de concentração. Infelizmente, a solução não é tão simples assim: o sistema está desequilibrado e, como tudo no universo, tende espontaneamente para um estado de equilíbrio. O desequilíbrio foi estudado com relação à glicose mas, ele existe também com relação à água. A presença do soluto no lado A diminue a energia cinética média das moléculas do solvente nesse compartimento. Isto é, a energia cinética média das moléculas de água no lado B (solvente puro) é maior que no lado A (solução), pois, nesta parte da energia cinética das moléculas da água é transferida para as partículas do soluto. Disso resulta que a energia cinética média (a “pressão”) com que as moléculas de água se chocam no lado A da membrana é menor que no lado B. Além disso, as partículas do soluto no lado A também se movem aleatoriamente e se chocam com a superfície da membrana. Os choques do soluto, porém, são ineficazes e apenas tomam o lugar de um choque que poderia ser de uma molécula de água. Esses dois fatores em conjunto, ou seja, a diminuição da energia cinética média e a diminuição do número de choques do solvente no lado A fazem com que o fluxo de água de A para B seja menor que de B para A. Haverá então um fluxo efetivo do solvente do lado B (solvente puro) para o lado A (solução), o que constitue o fenômeno da OSMOSE. A B A B 0,1 M (G) Água .. . . . . . . . . M . . . . . M . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . (início) (equilíbrio) A passagem do solvente de B para A gera um gradiente de pressão hidrostática e vai diminuindo a concentração do soluto no lado A. Esses dois fatores promovem um aumento da energia cinética e do numero de choques do solvente no lado A, o que resulta em aumento do fluxo de A para B. Por outro lado, a diminuição da pressão hidrostática no compartimento B leva a uma diminuição da “pressão”de choque das moléculas na membrana, o que resulta numa diminuição do fluxo de B para A. Assim, a passagem do solvente por osmose cria um gradiente de pressão hidrostática que dificulta a continuação do processo e facilita o fluxo em direção inversa. O sistema atingirá o equilíbrio quando os dois fluxos, de A para B e de B para A, novamente se igualarem.

12

Observe-se que o sistema está em equilíbrio como um todo, apesar de não estar em equilíbrio hidrostático. Esse desequilíbrio hidrostático existe justamente para contrabalançar o desequilíbrio osmótico. O gradiente hidrostático tem um sentido inverso ao gradiente osmótico. A pressão com que o solvente é transferido para a solução é chamada PRESSÃO OSMÓTICA e pode ser medida indiretamente pela pressão que se deveria exercer sobre a solução para impedir a passagem do solvente. . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . M . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. A pressão osmótica total e permanente de uma solução só é evidenciada quando a soluçào é separada do seu solvente puro por uma membrana estritamente SEMI-PERMEÁVEL. Estudando o fenômeno da osmose, Pfeffer demostrou experimentalmente que: 1 - Mantendo-se constante a temperatura, a pressão osmótica (PO) é diretamente proporcional à OSMOLARIDADE da solução, ou seja, à concentração de partículas de soluto. 2 - Mantendo-se constante a osmolaridade, a pressão osmótica é diretamente proporcional à TEMPERATURA ABSOLUTA da solução. Essas relações, em conjunto, são representadas pela equação abaixo, onde K é uma constante de proporcionalidade que independente do tipo, ou seja, da natureza química do soluto. PO = K . Osm . T Van’t Hoff, analisando a equação derivada dos estudos de Pfeffer, notou que a osmolaridade corresponde à relação entre o número de moles de partículas; ou seja, o número de osmoles (n) e o volume da soluçào (v).. (Osm = n/V). Substituindo e fazendo um rearranjo, obteve a equação ..... PO . V = n . K . T que é idêntica à equação de Clapeyron, para o comportamento dos gases perfeitos : P . V = n . R . T Experimentalmente demonstrou-se que o valor de K na equação de Van’t Hoff é igual ao valor de R (constante dos gases perfeitos) na equação de Clapeyron, o que leva à suposição de que, idealmente, as partículas de um soluto se comportam como as moléculas de um gás ocupando o mesmo volume da solução. Porém, do mesmo modo como os gases reais só obedecem à equação de Clapeyron quando estão submetidos a baixas pressões, as soluções reais só obedecem a equação de Van’t Hoff quando estão em baixas concentrações, isto é, quando estão muito diluídas. No cálculo da pressão osmótica de uma solução é mais conveniente utilizar a equação de Pfeffer: PO = K . Osm . T onde K = 0,082 atm . l / osmol . T Tratando-se de soluções de eletrólitos, a osmolaridade é igual à molaridade multiplicada pelo fator de Van’t Hoff (i) da substância (Osm = M . i). No caso de soluções moleculares, ou seja, que não se ionizam nem se dissociam, o fator de Van’t Hoff é igual a 1 (um) e a osmolaridade torna-se numericamente igual a molaridade. Quando se estudam os fenômenos de osmose, é aconselhável expressar sempre a concentração em OSMOLARIDADE (Osm ou Osm/l). A osmolaridade é usada ainda para se classificar uma solução em relação a outra. Se as duas soluções têm a mesma osmolaridade, são classificadas como ISOSMOLARES. Se uma têm uma osmolaridade maior que a outra, a primeira é classificada como HIPEROSMOLAR em relação à segunda e a segunda é classificada comoHIPOSMOLAR em relação à primeira. Nota-se que, para classificar duas ou mais soluções quanto à osmolaridade, não é necessário colocá-las em contato através de uma membrana. Pode uma solução estar aqui e a outra em Belo Horizonte. Basta telefonar à “daqui”, as soluções são isosmolares ; se a de “lá” for maior que a “daqui”, a “de lá” é hiperosmolar em relação à “daqui”. Soluções isosmolares desenvolvem a mesma pressão osmótica quando são separadas do solvente por membranas SEMI-PERMEÁVEIS. Quais seriam, por exemplo, as pressões osmóticas a 27ºC de uma solução de glicose a 36

g/l e de uma solução de cloreto de sódio a 5,85 g/l, quando as mesmas forem separadas dos seus solventes puros por membranas semi-permeáveis? (Considere-se o NaCl 100% dissociado)

DADOS: Glicose: NaCl: T = 27 + 273 = 300 K T = 27 + 273 = 300 K i = 1 osmol / mol i = 2 osmol / mol C = 36 g / l C = 5,85 g / l M = 36 g / l = 0,2 mol / l M = 5,85 g / l = 0,1mol/l 180 g / mol 58,5 g / mol Osm = 0,2 mol/l . 1 osmol/mol Osm = 0,1 mol/l . 2 osmol/mol

13

Osm = 0,2 osmol / l Osm = 0,2 osmol / l PO = K . Osm . T PO = 0,082 atm.l/osmol.K . 0,2 osmol/ l . 300 K = 4,92 atm Embora as soluções tenham diferentes concentrações em g/l e mol/l apresentam a mesma pressão osmótica. Isto ocorre porque as duas soluções têm a mesma osmolaridade e estão em contato com membranas semi-permeáveis. Esquematicamente, teríamos estados de equilíbrios exatamente iguais quando colocassémos as duas soluções em contato com solventes puros: A B A B x x o x o x o o (equilíbrio) (equilíbrio) ( x ) NaCl ( o ) Glicose Podemos observar que cada solução aumenta de volume às custas de solvente que é retirado do outro compartimento. Poderíamos definir o POTENCIAL OSMÓTICO de uma solução como sendo a sua capacidade de ganhar ou “absorver” solvente, por osmose, quando está separado do mesmo por uma membrana SEMI-PERMEÁVEL. O potencial osmótico é uma decorrêcia da pressão osmótica e portanto da osmolaridade da solução: quanto mais concentrada uma solução maior sua pressão osmótica e maior seu potencial osmótico. Disso resulta também que soluções ISOSMOLARES têm a mesma pressão osmótica e o mesmo potencial osmótico. O que aconteceria se colocássemos um litro da solução de NaCl no lado A e um litro de glicose no lado B, utilizando um único dispositivo. A B NaCl Glicose 0,2 Osm M 0,2 Osm 4,92 4,92 atm Nenhum dos compartimentos aumentaria de volume às custas do outro pois as soluções exercem a mesma pressão osmótica, ou seja, têm o mesmo potencial osmótico, só que, em sentidos inversos. Donde se conclui que tratando-se de uma membrana semi-permeável, não existindo gradiente de pressão osmótica não ocorre transferência efetiva de solvente por osmose. E se colocássemos dois litros da solução de NaCl no lado A e apenas um litro da solução de glicose no lado B ? A B A B M M (Início) (Equilíbrio) NaCl (0,20 Osm) Glicose (0,20 Osm) Haverá uma transferência efetiva de solvente de A para B. Nesse porém, o processo não pode ser denominado de osmose porque ocorreu em decorrência de um gradiente de pressào hidrostástica e não osmótica. As duas soluções tinham, inicialmente, a mesma pressão e portanto o mesmo potencial pois continuam sendo isosmolares. É interessante observar que no equilíbriuo as pressões hidrostáticas (os níveis líquidos) não são iguais. Isto ocorre porque, à medida que o solvente se desloca de A para B devido ao gradiente hidrostático, a osmolaridade do NaCl vai aumentando, a da glicose vai diminuindo e começa a aparecer um gradiente de sentido inverso ao gradiente hidrostático. O equilíbrio é atingido quando o fluxo de A para B devido ao gradiente hidrostático se iguala ao fluxo de B para A devudi ai gradiente osmótico. Temos o inverso do que ocorreu no esquema mostrado na página 16: lá um gradiente de concentração (ou osmótico) gerou um gradiente hidrostático de sentido inverso.

14

Se tivéssemos colocado volumes diferentes das soluções de modo que as mesmas não ficassem submetidas a um gradiente de pressão hidrostática, não haveria nenhum transporte efetivo de solvente. Poderíamos obter tal situação utilizando o esquema abaixo. A B NaCl Glicose 0,2 Osm 0,2 Osm M Não se deve portanto atribuir à OSMOSE qualquer transporte efetivo de solvente. Analisemos agora o que ocorreria se colocássemos no lado A um litro de solução de glicose 0,4 Osm. A membrana continua sendo SEMI-PERMEÁVEL a ambas as soluções. Quanto ao aspecto hidrostático, não há nenhum desequilíbrio. Logo, se houver algum transporte, este não pode ser atribuído a um gradiente de pressão hidrostática. Antes de conluir como seria alcançado o equilíbrio, imaginemos o que aconteceria se colocássemos separadamente as soluções nos seus respectivos compartimentos em contato com seus solventes puros. O NaCl exerceria uma pressão osmótica de 4,92 atm transportanto solvente no sentido de B para A.

A glicose, por sua vez, exerceria uma pressão duas vezes maior (9,84 atm) transportando solvente no sentido A para B. Colocando agora as duas soluções em contato através da membrana, quem ganharia? As soluções não são mais ISOSMOLARES e portanto não têm mais o mesmo potencial osmótico. Assim, ganha o compartimento que possuir maior potencial osmótico, ou seja, maior capacidade de retirar solvente do outro compartimento. A B A B

. . M o o

o M

. o o

. . . . .

o o o o

. . . . o o o

(Início) (Equilíbrio)

NaCl 0,2 Osm Glicose 0,4 Osm 4,92 9,84 Podemos observar que a solução hiperosmolar ganha e a hiposmolar perde solvente. A explicação é simples: sabemos que quanto maior a quantidade de soluto em uma solução , mais baixa é a energia cinética média das moléculas do solvente e menor o número de choques eficazes na membrana. Sendo assim, a energia cinética média e o número de choques do solvente na solução hiposmolar é maior que na solução hiperosmolar, o que resulta num fluxo efetivo do solvente da solução hiposmolar para a solução hiperosmolar. Isto não quer dizer que o transporte efetivo do solvente por osmose foge às leis da difusão. Na verdade o solvente está se deslocando de uma solução mais concentrada para outra menos concentrada, se considerarmos a sua concentração e não a do soluto.

É importante relembrar e salientar que, na análise que fizemos até agora, estabelecemos

sempre a condição de que a membrana fosse SEMI-PERMEÁVEL a ambas as soluções. As conclusões obtidas, só podem ser aplicadas quando essas condições são respeitadas.

Se, no esquema que utilizamos anteriormente (início desta página) a membrana fosse semi-permeável à solução de NaCl mas permeável à solução de glicose, o equilíbrio seria totalmente diferente. Apesar da solução de glicose ter um potencial osmótico maior que o da solução de NaCl, o mesmo não pode ser evidenciado porque a membrana não se distribue homgeneamente, ou seja, com a mesma concentração nos dois compartimentos e não exerce nenhum efeito osmótico permanente (Dependendo da membrana pode-se observar às vezes um efeito osmótico temporário que aparece antes que o equilíbrio final seja alcançado). No final, porém, tudo ocorre como se tivéssemos colocado a solução de NaCl no compartimento A e o solvente puro no compartimento B:

o x o o x x o x x o o o x o x o o o x o

(Início) (Equilíbrio) NaCl 0,2 Osm

15

Compare com o esquema da página anterior, inclusive quanto ao gradiente de pressão hidrostática que existe no equilíbrio. O asterisco junto ao símbolo M significa que se trata de outra membrana. Os seres vivos não possuem nenhuma membrana que seja estritamente SEMI-PERMEÁVEL a todos os líquidos biológicos. A membrana capilar por exemplo, é semi-permeável a soluções de macromoléculas mas é totalmente permeável a soluções de pequenas moléculas (NaCl, sacarose, uréia, etc.). A membrana celular, em geral, é semi-permeável a soluções de NaCl, CaCl, sacarose, insulina, manitol, mas é permeável a soluções de uréia. Não se pode, portanto, prever o comportamento osmótico de uma solução nos seres vivos baseando-se apenas no conhecimento da sua osmolaridade, da sua pressão osmótica ou do seu potencial osmótico. Vimos que as conclusões obtidas, quando a membrana é semi-permeável a todas soluções envolvidas. Passamos então a trabalhar com outra propriedade das soluções ou dos compartimentos que denominamos TONICIDADE. Podemos conceituar a TONICIDADE de uma solução (ou compartimento) como sendo a sua capacidade de retirar ou “absorver” solvente de outra solução qualquer, da qual está separada por uma membrana qualquer. Se as duas soluções têm a mesma capacidade, ou seja, a mesma tonicidade, os fluxos de solvente nos dois sentidos serão iguais e nenhuma das duas aumenta de volume às custas da outra. Dizemos que as soluções são ISOTÔNICAS. Se as soluções têm tonicidades diferentes, o fluxo de solvente será maior no sentido da solução de menor tonicidade para a solução de maior tonicidade. Esta última, portanto, tende a aumentar de volume e é classificada como HIPOTÔNICA. Comparando os conceitos de POTENCIAL OSMÓTICO e de TONICIDADE podemos deduzir que o primeiro é um caso particular do segundo. Vimos que: - o potencial osmótico é a capacidade de ganhar solvente quando a solução está separada do solvente puro por uma membrana semi-permeável. - a tonicidade é a capacidade de ganhar solvente quando a solução está separada de outra solução qualquer, ou do solvente, por uma membrana qualquer. Significa que o potencial osmótico de uma solução corresponde à sua tonicidade máxima e que soluções totalmente permamentes tem tonicidade nula. Da comparação entre as definições de potencial osmótico e tonicidade deduzimos também que soluções ISOSMOLARES (também chamadas isosmóticas) nem sempre são ISOTÔNICAS. Isto ocorre porque a Osmolaridade depende apenas da concentração do soluto enquanto que Tonicidade depende também da permeabilidade de membrana que separa as soluções. Pode inclusive acontecer que uma solução HIPEROSMOLAR seja HIPOTÔNICA em relação a outra. Examinemos as seguintes situações, utilizando o sistema de dois compartimentos A e B, separados por uma membrana M. I - Colocando-se no compartimento A solução 0,3 Osm de NaCl e no compartimento B solução 0,3 Osm de glicose, sendo a membrana semi-permeável a ambas as soluções. A B A B x o x o x o x o x M o x M o x o x o x o x o x o x o (Início) (Equilíbrio) NaCl 0,3 Osm Glicose 0,3 Osm Como as duas soluções têm a mesma osmolaridade (0,3) são ISOSMOLARES e têm portanto o mesmo potencial osmótico. Sendo a membrana semi-permeável às duas soluções, suas tonicidades serão e, no caso, iguais. Os dois compartimentos serão portanto ISOSMOLARES e ISOTÔNICO. II - Colocando-se NaCl 0,3 Osm em A e glicose 0,4 Osm em B. A membrana é a mesma do exemplo anterior. A B A B o o x o o x o o x o x o x o x o o x x o o o x x o o x o o o NaCl Glicose (0,3 Osm) (0,4 Osm)

16

Quanto à osmolaridade, o compartimento B é HIPEROSMOLAR em relação ao compartimento A (0,4 é maior que 0,3). Sendo a membrana semi-permeável às duas soluções, suas tonicidades serão máximas porém, a tonicidade em B ganha solvente e é HIPERTÔNICO em relação ao compartimento A. De modo análogo, o compartimento A é HIPOSMOLAR e HIPOTÔNICO em relação ao compartimento B. Com respeito às situações I e II podemos concluir que, tratando-se de membranas semi-permeáveis, há sempre correspondência entre a OSMOLARIDADE e a TONICIDADE. III - Colocando-se NaCl 0,3 Osm em A e glicose 0,3 Osm em B, sendo a membrana agora, permeável a ambas as soluções. A B A B x o o

x M o x M o

x o x o

x o x o o

x

o o o x x o

(Início) (Equilíbrio) Quanto à osmolaridade as soluções são ISOSMOLARES. Como a membrana é permeável, suas tonicidades são nulas e portanto iguais. Assim, as soluções são ISOSMOLARES e ISOTÔNICAS mas, no equilíbrio, teremos os dois solutos homogeneamente distribuídos nos dois compartimentos. Comparando com a situação I , seria tentador pensar que soluções isosmolares são sempre isotônicas, que a membrana seja permeável ou semi-permeável a ambas as soluções. Na verdade, isto é verdade. O que não é verdade é que a osmolaridade sempre corresponde à tonicidade, que a membrana seja permeável ou semi-permeável. Vejamos a situação seguinte. IV - Colocando-se NaCl 0,5 Osm em A e glicose 0,2 Osm em B. A membrana é a mesma da situação anterior. A B A B x o x M o x M o x o x o x o o x o o x o x o x x o o (Início) (Equilíbrio) NaCl 0,3 Osm Glicose 0,4 Osm Quanto à osmolaridade, A é HIPEROSMOLAR em relação a B. Porém, como a membrana é permeável às duas soluções, suas tonicidades serão nulas e iguais. Logo, A é ISOTÔNICO em relação a B. De modo análogo, B é HIPOSMOLAR mas é ISOTÔNICO em relação a A. Analisando as situações III e IV, concluímos que soluções separadas por membranas permeáveis, são sempre ISOTÔNICAS, não importa quais sejam suas OSMOLARIDADES. V - Colocando-se em A solução 0,3 Osm de NaCl e em B solução 0,3 Osm de uréia sendo a membrana impermeável ao NaCl mas permeável a uréia. A B A B o x x M o o x o M x o x o x o x x o x o x x o o x o

(Início) (Equilíbrio) NaCl 0,3 Osm

17

Quanto à osmolaridade, A é ISOSMOLAR em relação a B. Porém, como a membrana é permeável à solução de uréia, esta não exerce nenhuma tonicidade. Logo, o compartimento A ganha solvente sendo portanto HIPERTÔNICO em relação a B. O compartimento B, por sua vez, é ISOSMOLAR mas HIPOTÔNICO em relação ao compartimento B. Se tivéssemos utilizado NaCl 0,1 Osm em A e uréia 10,0 Osm em B, a solução de uréia continuaria sendo HIPOTÔNICA apesar de ser agora HIPEROSMOLAR (numa proporção de 100 para 1). VI - Colocando-se em A solução de NaCl 0,3 Osm e em B uma solução mista de glicose 0,3 Osm e uréia 0,5 Osm. A membrana é impermeável ao Nacl e à glicose mas permeável a uréia. A B A B x o x o x o x o x o x o x x o x x o o x o o (Início) (Equilíbrio) NaCl 0,3 Osm Glicose 0,3 Osm/ Uréia 0,5 Osm Quanto à osmolaridade, A é HIPOSMOLAR em relação a B. O potencial osmótico no compartimento B é maior que no compartimento A mas a tonicidade de B é mantida apenas pelo potencial osmótico da glicose, já que a tonicidade da uréia é nula. Como o potencial osmótico, isto é, a tonicidade do NaCl é igual a da glicose, as soluções são ISOTÔNICAS. Quer dizer, o compartimento a é HIPOSMOLAR mas é ISOTÔNICO em relação a A. Observe-sa que, retirando a uréia do compartimento B, teríamos um equilíbrio idêntico ao que ocorreu na situação I. Da análise das situações V e VI, podemos tirar uma conclusão final que é válida para todas as situações: A TONICIDADE de um compartimento isolado por uma determinada membrana correspondente ao potencial osmótico das partículas NÃO DIFUSÍVEIS através dessa membrana. Só se pode aumentar a tonicidade (ou o volume) de um compartimento isolado por uma determinada membrana acrescentando, a esse compartimento, soluto não difusível através dessa membrana.

VII - EQUILÍBRIO DE GIBBS-DONNAN Como uma grande parte das proteínas dos organismos vivos estão sob a forma de dispersão coloidal, em solução iônica e separadas por membranas semi-permeáveis, é necessário que se estude um tipo especial de distribuição de íons que é profundamente influenciada pela presença de partículas não difusíveis carregadas eletricamente. A M B A M B Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Na+ Cl- Na+ Prot-Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Na+ prot- Na+ Cl- Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Na+ Na+ Na+ Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- Prot- Na+Cl- Na+ Prot- Na+ Na+ Cl-

Na+ Prot-Na+ Cl- Na+ Prot- Na+ Cl- (Início) (Início) Prot

- : 12 Cl

- : 12 Prot

- : 12 Cl

- : 7

Na+

: 12 Na+ : 12 Na+ : 14 Na

+ : 10

Cl- : 5

18

Consideremos o sistema acima constituído por dois compartimentos separados por uma membrana M. No compartimento A foi colocado um litro de solução 0,12 M de íons Na+ equilibrados por ânions proteinato (Prot-). Ao compartimento B, adicionamos o mesmo volume de solução 0,12 M de NaCl. A membrana é impermeável apenas ao ânions protéicos. Apesar de estar submetido a um gradiente de concentração, o íon proteinato (Prot-), por ser uma macromolécula, não pode atravessar os poros da membrana. Por isso não difunde de A para B. O íon Na+ atravessa livremente a membrana mas seu fluxo efetivo inicial é nulo: a quantidade que passa de A para B é igual à que passa de B para A porque sua concetração é a mesma nos dois lados da membrana. O íon cloreto (Cl-) porém, têm todas as condições para apresentar um fluxo efetivo diferente de zero pois : 1 - Está submetido a um gradiente de concentração e 2 - a membrana lhe é permeável. O cloreto se difunde então de B para A devido a um gradiente de concentração. Como o íon cloreto se difunde inicialmente sem seu cátion correspondente (Na+), esta difusão realiza um trabalho elétrico que se manifesta sob a forma de energia potencial elétrica (Voltagem). Se estabelece assim um campo elétrico (negativo em A, positivo em B) qued tende a dificultar a passagem de íons cloreto do lado B para o lado A e, ao mesmo tempo, promove um fluxo efetivo de íons sódio também de B para A. É importante lembrar que o fluxo efetivo de Na+ se deve a um gradiente elétrico criado pela difusão do cloreto a qual decorreu de um gradiente de concentração. Ocorre com o sódio o inverso do que ocorreu com o cloreto: a difusão por gradiente elétrico gerou um gradiente de concentração. O processo continua até que os dois íons atinjam um equilíbrio eletroquímico, mesmo que os dois compartimentos não atinjam também um equilíbrio osmótico. Dizemos que o íon cloreto (Cl-), ao se difundir de B para A, realiza um trabalho útil porque a energia potencial de concentração (química) está se transformando em energia potencial elétrica. A energia potencial de concentração pode ser calculada por uma equação derivada da expansão isotérmica dos gases perfeitos, aplicada para cada íon: Ec = R . T ln (Cl -) b Energia potencial de concetração (Cl -) para o íon cloreto. Ec = R . T ln (Na+) b Energia potencial de concentração (Na+) a para o íon sódio. O equilíbrio de Donnan é alcançado quando o campo elétrico estabelecido através da membrana pela difusão do íon cloreto promove um aumento do íon sódio no lado B, de tal modo que a diferença de energia potencial de concentração para o Na+ anula totalmente a diferença de energia potencial de concentração para o Cl

-. Então:

R . T ln (Cl- )b + R . T ln (Na+ ) b = 0 (zero) (Cl- )a (Na+ ) a Donde se conclue que: (Na+ ) b = (Cl- ) b = r (Relação de Gibbs-Donnan) (Na+ ) a (Cl- ) a ou (Na+ )a . (Cl- ) a = (Na+ ) b . (Cl-) b Uma vez atingido o equilíbrio de Donnan, podemos afirmar que: a - A concentração do cátion difusível (Na+) é sempre maior no lado que contém o ânion não-difusível (Prot-). b - A concentração do íon Cl- continua maior no lado B, porém passa a existir cloreto também do lado A do sistema. c - Se formos calcular as tonicidades de cada solução, notaremos que o compartimento que contém o íon NÃO difusível é sempre hipertônico. d - Como consequência, o equilíbrio de Donnan gera um desequilíbrio osmótico, isto é, o equilíbrio de Donnan é eletro-químico e não osmótico. e - Para impedir que o compartimento que contém o íon NÃO difusível retire solvente do outro compartimento, se poderia aplicar uma pressão mecânica ou hidrostática de sentido inverso. É o que acontece, por exemplo, ao nível dos capilares sanguíneos. VIII - ESQUEMA DE STARLING. IMPORTÂNCIA DA PRESSÃO ONCÓTICA. Os capilares constituem os vasos sanguíneos de paredes mais delgadas e de calibre mais fino. O sangue chega até eles pelas artérias, as quais em ramificações sucessivas e sem transição real vão diminuindo seu calibre e simplificando sua estrutura até se converterem em capilares. Estes vasos, por sua vez, se reúnem novamente sem transição real e dão origem às veias. Os capilares, portanto, podem ser divididos esquematicamente em uma porção arterial e uma porção venosa.

Nos capilares, os nutrientes trazidos pelo sangue e destinados às células atravesam as suas paredes para se misturar com o líquido intersticial e daí passar para o interior das células. As substâncias eliminadas das células fariam um percurso inverso. A passagem de líquidos e substâncias através dos capilares é feita por processos de filtração, difusão e osmose. A filtração é a passagem de líquidos através dos poros dos capilares. E depende, fundamentalmente, de duas pressões: a pressão hidrostática (PH), devido à compressão mecânica que o coração exerce sobre o sangue, e a pressão oncótica (PO) devido à presença de macromoléculas, partículas não difusíveis, no plasma.

19

A pressào hidrostática (PH) é exercida no sentido de expulsar líquido do espaço intravascular para o espaço intersticial. A pressào oncótica (PO) tende a trazer líquido do espaço intersticial para o intravascular. Na porção arterial do capilar a PH é maior que a PO e, então, o líquido sai dos capilares para o espaço intersticial por filtração. Na porção venosa do capilar a PO é maior que a PH e, então, o líquido volta para o interior do capilar por osmose. Como a diferença de pressão na porção arterial do capilar é maior do que na porção venosa, a quantidade de líquido que sai dos capilares na porção arterial é maior do que a quantidade que entra na porção venosa. Pra retirar o restante do líquido do espaço intersticial se faz necessário a presença de um sistema de drenagem auxiliar do sistema venoso, o sistema linfático.

Esquema de Starling capilar

Porção | Porção Arterial | Venosa | PH | PH PEf PO | PO PEf | | 40 15 25 | 25 10 15 Vasos Linfáticos (Pressão em mmHg) (PEF= Pressão Efetiva de Filtração) OBS: A concentração de macromoléculas é constante ao longo de todo o leito capilar. A diferença consiste na resultante entre TONICIDADE (PO) e PRESSÃO HIDROSTÁTICA. O esquema de Starling serve para explicar o equilíbrio do volume líquido do leito vascular, e, pode ser associado ao equilíbrio de Gibbs-Donnan, visto anteriormente, considerando-se o LIV como meio que contém a partícula não-difusível e que a membrana endotelial capilar é carregada negativamente na superfície em contato com o LIV, o que explica as diferenças entre as concentrações de Na+ no LIV e no LIT. Uma outra teoria utilizada para explicar o intercâmbio de líquidos entre o LIV e o LIT é a da vasomotricidade, que envolve também o jogo de influência entre a pressão hidrostrática (filtração) e a pressão osmótica (osmose).

20

Difusão, potencial de equilíbrio E potencial de membrana

I- INTRODUÇÃO Todas as partículas em solução aquosa possuem um movimento errático, aleatório, que promove colisões moleculares num contínuo intercâmbio de energia cinética entre as partículas do sistema. Tal como as moléculas de um gás, as partículas de um soluto qualquer ao se dissolverem em determinado líquido, adquirem liberdade de movimento e com isso passam a colidir muitas vezes umas com as outras. Estas colisões intermoleculares constituem o mecanismo pelo qual a velocidade das partículas do soluto muda continuamente. É exatamente essa semelhança com o comportamento dos gases que permite a aplicação da equação dos gases perfeitos no cálculos da pressão osmótica e na dedução da equação de Nernst, como veremos adiante . Como resultado desses choques intermoleculares contínuos, existe uma distribuição de velocidade entre as partículas dissolvidas , para cada instante. De modo que, a cada instante, a maioria das moléculas assume valores de velocidade que estão muito próximos de uma média de velocidade que, por sua vez, está diretamente relacionado com a temperatura do sistema. Consequentemente, ao elevar-se a temperatura de um corpo há um aumento na energia cinética translacional média de suas moléculas ou partículas, e que equivale a acelerar a difusão para o caso de soluções líquidas ou gasosas. A difusão é um processo de intercâmbio contínuo das moléculas de um gás ou de uma solução. É portanto, uma consequência do intercâmbio de energia cinética translacional entre as moléculas de um sistema. A difusão pode ocorrer em um meio homogêneo ou através de um obstáculo (uma membrana, por exemplo). II- FATORES QUE PROMOVEM A DIFUSÃO Considere-se um recipiente constituído por dois compartimentos I e II separados por uma membrana M, nos quais se colocou água. Adicionando-se dois solutos A(*) e B(+), sendo a membrana permeável apenas ao soluto B, observamos o seguinte: I M II I M II * + * * * + + * + * + + * + * * + * + + * + * + Início Após a difusão - haverá uma passagem efetiva de moléculas B do lado I para o lado II, até que seja atingido o equilíbrio. - o equilíbrio será atingido quando as concentrações dos lados I eII forem iguais para a substância difusível. - mesmo quando as concentrações dos lados I e II forem iguais, continuará havendo difusão de I para II mas, como está havendo difusão igual em sentido contrário, o fluxo efetivo será zero. - aumentando-se a temperatura do sistema, o fluxo efetivo continuará sendo nulo (zero) mas, a difusão estará aumentada em ambos os sentidos. - o soluto A, como não pode atravessar os poros da membrana, não se difunde para o lado II. Concluindo: Os fatores que regem a difusão de soluto, não carregados eletricamente, através de uma membrana são: temperatura, concentração e permeabilidade. III- DIFERENÇA DE POTENCIAL QUÍMICO (DIFERENÇA DE POTENCIAL DE CONCENTRAÇÃO) Tomando-se uma substância A, não ionizada, contida em apenas um de dois compartimentos, separados por uma membrana permeável, como o esquema abaixo: I M II P2 P1 . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . I II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sistema Analogia com os gases perfeitos

21

Com relação ao sistema, podemos afirmar o seguinte: - Como existe um gradiente de concentração entre um lado e outro da membrana, há uma diferença de potencial químico, acumulada no lado I em relação ao lado II. - Essa diferença de concetração, sendo a membrana permeável, somente se manterá se houver, de alguma forma um gasto de energia do ambiente ou da membrana, capaz de neutralizar o fluxo efetivo de partículas do lado I para o lado II. - O fluxo efetivo de moléculas de I para II, dissipará toda a energia potencial, inicialmente acumulada sob a forma de gradiente de concentração e, portanto, pode ser convertida em trabalho. - Como podemos então calcular essa energia potencial de concentração do sistema? Para isso precisamos fazer uma analogia do sistema como o comportamento dos gases perfeitos. Associemos então os compartimentos I e II com cilindros vedados por êmbolos que deslizam sem atrito, conforme a força exercida sobre eles. Consideremos ainda que ambos os cilindros permaneçam a temperatura constante e que exista uma quantidade de gás perfeito apenas no cilindro I. Qual a semelhjança existente entre os cilindros com gás perfeito e os compartimentos com a solução? - O compartimento I, como é mais concentrado, assemelha-se ao cilindro I que está sob maior pressão. - A mesma analogia pode ser feita ao relacionar-se o compartimento II como o cilindro II, que inicialmente estão ambos “vazios”. Se fôssemos, por um mecanismo qualquer, diminuindo gradativamente a pressão P1 do cilindro I, até que a mesma ficasse igual a P2, notaríamos que seria realizado um trabalho de difusão isotérmica pelo gás, que poderia ser comparado ao trabalho de difusão isotérmica do soluto do compartimento I para o compartimento II, de modo que a sua concetração diminuiria gradativamante e se torne igual a C2. P1 P2 C1 ( - ) C2 C2 . . M M . . . V2 . . . . . . . . V1 . . . . . . . . . I II I II Tal como o gás que se expandiu isotermicamente de P1 para P2, ao diminuirmos o peso (força) sobre o êmbolo, e realizou um trabalho, as partículas de uma solução, ao se difundirem de uma concentração C1 para C2, poderão realizar um “trabalho útil” se convenientemente acopladas a determinados sistemas físico-químicos. Por exemplo, se cada partícula que difundisse carregasse uma carga elétrica, seria realizado um trabalho elétrico. O trabalho de expansão isotérmica de um gás pode ser calculado pela equação: W = R . T. ln P1 (Pressão) P2 ou W = R . T . ln V2 V1 P1 ............. (P1,V2) se (P2, V2) P2 ............................. W = & ^ Ep V1 V2 Volume Essa equação nos permite calcular o trabalho (W) realizado por um gás em expansão isotérmica e corresponde, portanto, à diferença de energia a potencial (^- E), entre duas pressões (P1 e P2), que pode ser convertida em trabalho. Como, então, poderemos adaptar essa equação para o cálculo da diferença de potencial químico existente entre duas concentrações (C1 e C2) de um determinado soluto em solução aquosa? A fórmula geral para o cálculo da concentração (C) de uma solução é: C = Qs donde Qs = C . V V Quando um gás se expande, ou um determinado soluto se difunde, a quantidade total de partículas do sistema, ou seja, Qs, continua a mesma, apenas o volume (V) ocupado é que aumenta. Portanto, durante a “expansão” do soluto: Qs1 (Inicial) = Qs2 (final) ou C1 . V1 = C2 . V2

22

donde C1 = V2

C2 V1

Substituindo-se os valores de V pelos valores de C na equação para gases, obteremos a equação que nos permite calcular a diferença de potencial químico ou de concentração (^- Eq) que existe entre diferentes concentrações de uma determinada substância em solução ( em dois compartimentos separados por uma membrana, por exemplo), ou também, a quantidade de energia que deverá ser gasta para estabelecermos uma diferença de concentração no sistema por um processo ativo: ^ Ec = R . T . ln C1 C2 IV - ENERGIA POTENCIAL ELÉTRICA (GRADIENTE ELÉTRICO) A fórmula citada anteriormente é adequada quando a substância é molecular, porém quando se trata de subtância ionizada, devemos levar em consideração não somente a diferença de potencial químico existente entre os dois lados da membrana, como também o trabalho elétrico realizado por determinada substância iônica ao se difundir através da membrana. Qual o trabalho elétrico realizado quando um mol de determinado íon covalente se difunde contra um determinado campo elétrico? Em outras palavras qual o trabalho realizado para o transporte de cargas positivas (1 mol) de uma distância grande ( considere-se infinita) até o pólo positivo? W = q . ^ v O trabalho elétrico (We) é o produto da diferença de potencial (^-V) pelo número de cargas elétricas elementares transportadoras (q). Por uma questão de coerência de unidades, se a diferença de potencial elétrico é expressa em volt, a quantidade de cargas (q) carregadas por 1 mol de íon qualquer de valência z, passa ser calculada pela equação: q = z . F O trabalho elétrico ficará então expresso em joule e corresponde à energia potencial elétrica (^- Ee) adquirido pelo sistema. We = z . f . ^ v = ^ Ee Mas, qual a utilidade em sabermos que o trabalho elétrico ou a energia potencial elétrica acumulada por transporte de um determinado íon pode ser calculada pela expressão matemática abaixo? ^ Ee = z . F . ^ v IV . 1 - Trabalho Elétrico nos Sistemas Biológicos Ocorre que nos sistemas biológicos as células e respectivos compartimentos intersticiais efetuam um intercâmbio de líquidos e eletrólitos que é afetado não somente pelo gradiente de concentração e pela permeabilidade da membrana como também, pela diferença de potencial elétrico transmembrana. Imaginemos, como exemplo, um sistema constituído por dois compartimentos separados por uma membrana impermeável apenas a macromoléculas. Coloquemos no compartimento I uma determinada substância que, em solução, se dissocia em um íon protéico (proteinato, Prot-) com carga negativa e no íon potássio ( K+) para equilibrá-lo eletricamente. (Veja esquema abaixo). I M II I M II - + Prot- K+ Prot- K+ - + K+ Prot- Prot- - + K+ Prot- K+ K+ Prot- - + K+ Prot- Prot- - + K+ Prot- K+ Prot- K+ - + - + (Inicio) (Equilíbrio) Sendo a membrana permeável apenas ao íon potássio, este se difundirá do lado I para o lado II. Porém, como se trata de uma carga elétrica, é evidente que toda difusão implica em um trabalho elétrico, que é acumulada sob a forma de energia potencial elétrica (voltagem ou diferença de potencial elétrico) entre as duas faces da membrana, uma vez que o íon se difunde separando-se do ânion que lhe dava neutralidade elétrica.

23

Portanto, em virtude do íon potássio (K+) atravessar a membrana sozinho há o aparecimento de uma diferença de potencial elétrico (^ v) entre as superfícies I e II da membrana. Ou seja, a membrana fica polarizada. Devemos levar em consideração que inicialmente o K

+ tende a estabelecer um fluxo efetivo

de cada cátion do lado I para o lado II, em virtude da existência de um gradiente de concentração (potencial químico ou energia de concentração). A voltagem ou campo elétrico que se estabelece na membrana , no entanto tende a provocar um fluxo de K

+ em sentido contrário (de II para I) que vai terminar contrabalançando o fluxo iônico por

potencial químico. Quando a diferença de energia potencial de concentração (^ Ec) for igual e contrária à diferença de energia potencial elétrica (^ Ee), digamos então que a voltagem transmembrana é igual ao potencial de equilíbrio (P . Eq), para o íon em questão (no caso, o K

+). Nestas condições, a diferença de

energia potencial total entre os lados I e II é igual a zero e, apesar da difusão continuar em ambos os sentidos, o fluxo efetivo de íons através da membrana é nulo. Isto é, uma vez que a voltagem atinja o potencial de equilíbrio para uma determinada diferença de concentração, a ENERGIA LIVRE ( diferença de potencial eletroquímico, ^ u) é igual a zero. A diferença de potencial eletroquímico (^ u) pode ser calculada pela soma algébrica da energia potencial elétrica com a energia potencial de concentração para determinado íon: ^ u = ^ Ee + ^ Ec ou seja ^ u = z . f . ^ v + R .T . ln C1

C2

Dissemos que, quando o sistema atinge o equilíbrio, a diferença de potencial eletroquímico (^ u ) é nula (igual a zero) . Logo: C1 z . F . ^ v + R . T . ln ----------- = 0 C2 Donde: C1 z . F . ^ v = -R . T . ln -------- C2 C2 z . F . ^ v = R . T . ln -------- C1 R . T C2 ^ v = -------- ln ------- z . F C1 ^ v é o gradiente elétrico, ou seja, a diferença de potencial elétrico que deve existir, entre as duas faces da membrana, para contrabalançar ou equilibrar um gradiente de concentração. Por esse motivo, ^ v passa a ser chamado Potencial de Equilíbrio (PEq). Assim: R . T C2 P . Eq = ---------- ln --------- (Equação de Nerst) z . F C1

IV.2-Potencial de Equilíbrio Voltemos a analisar o esquema mostrado na página 06 . Designaremos como EFLUXO (Ef) a passagem de íons K+ de I para II, como INFLUXO (If) passagem de íons K+ de II para I e como FLUXO EFETIVO (Fe) a diferença entre o EFLUXO e INFLUXO. No início (tempo “zero”) , a membrana está despolarizada, o efluxo é máximo (100), o influxo é nulo (0) e o fluxo efetivo (Fe) é igual ao efluxo. No momento subsequente o tempo “zero”, no entanto, a membrana já está ligeiramente polarizada, ou seja, começa a aparecer uma diferença de potencial elétrico (d.d.p) devido à difusão das cargas positivas de I para II. Ao mesmo tempo, começa a existir um fluxo de II para I, ou seja, um influxo. O Fluxo efetivo, porém, ainda é grande e continua a passar cargas positivas de I para II, tornando a membrana cada vez mais polarizada. Registrando-se com um voltímetro de boa sensibilidade, a d.d.p (voltagem) entre os dois lados dsa membrana em função do tempo, teríamos um resultado como na figura 01 (abaixo):

Fig.01 d.d.p

(mV)

Pot. Equilíbrio Px 0 0 tx t Tempo

24

Fig.02

100

FLUXO Ef Fe If 0 0 Px P.Eq d.d.p (mV) 0 t tempo Relacionando-se a polarização da membrana ((d.d.p) com os fluxos (Efluxo, Influxo, e Fluxo Efetivo), obteríamos um resultado como mostrado na figura 02. Partindo-se do princípio elementar de eletrostática de que cargas iguais se repelem, torna-se fácil compreender que quando a diferença de potencial cai aumentando ( o lado II cada vez mais positivo), o EFLUXO vai diminuindo e o INFLUXO vai aumentando. Depois de um tempo t, o efluxo se torna igual ao influxo e o FLUXO EFETIVO de íons torna-se nulo. Neste momento, a d.d.p torna-se constante (Fig. 01) porque a quantidade de cargas (K

+) que migram de I para II por gradiente de concentração (potencial

químico) é igual ao número de cargas positivas que retornam de II para I por gradiente elétrico (potencial elétrico). A d.d.p transmembrana cresce a partir do “zero” até atingir o Potencial de Equilíbrio, que é a diferença de potencial elétrico ou o campo elétrico que se deve estabelecer através de uma membrana, na existência de um gradiente de concentração, para que o fluxo efetivo de determinado íon seja igual a zero. No potencial Px mostrado nas figuaras 01 e 02, por exemplo, a polarização (d.d.p) da membrana é ainda insuficiente para fazer com que o Influxo (If) seja igual ao Efluxo (Ef). Logo, nesse potencial, o Fluxo Efetivo (Fe) de cargas positivas (K+) é ainda diferente de zero e a membrana continua a ser polarizada até atingir o Potencial de Equilíbrio. Devemos lembrar ainda que, ao concluirmos que o fluxo efetivo de determinado íon através da membrana, e sim, que a difusão deste íon é igual nos dois sentidos (difusão por gradiente de concentração = difusão por gradiente elétrico). Iniciando-se a experiência já com uma determinada concentração de íon potássio no lado II, a membrana também ficaria polarizada; bastaria que a concentração em II fosse menor que em I. A figura 02, entretanto, tomaria outro aspecto, porque, mesmo com uma d.d.p igual a zero (no início) o Influxo seria diferente de zero. Além disso, o Potencial de Equilíbrio seria menor, porque sendo o gradiente de concentração menor, bastaria uma menor polarização para tornar o Fluxo Efetivo igual a zero. Compare as figuras 03 e 04 com as figuaras 01 e 02. Fig. 03 d.d.p (mV) fig. 01 Pot. Equilíbrio 0 0 t tt Tempo Aumentando-se gradativamente a concentração do K

+ no lado II com relação a uma

determinada concentração fixa no lado I, notaremos que o Influxo inicial (quando o Potencial transmembrana é igual a zero) torna-se cada vez maior e o Fluxo Efetivo cada vez menor. Isto equivale a dizer que, quanto menor for o gradiente de concentração química (potencial químico), menor será a diferença de Potencial transmemrana( potencial elétrico) necessária para que o fluxo efetivo seja nulo. Na figura 04 vemos que quanto maior a concentração inicial no lado II, isto é, quanto menor o gradiente de concentração menor o potencial elétrico necessário para atingir o equilíbrio (P. Eq). FLUXO Fig.04 100 Ef C3* If3 If2 C2* If1 C1* 0

25

P.Eq3 P.Eq2 P.Eq1 d.d.p(mV) C* = Concentração no lado II em relação a uma concentração fixa no lado I (C3 > C2 > C1 ). Quando as concentrações iniciais (nos lados I e II ) forem iguais, o gradiente de concentração será nulo e o Fluxo Efetivo tambem o será. Desse modo, nenhuma carga elétrica passará de I para II e nenhum gradiente elétrico será necessário para fazer com que a difusão do íon de I para II seja igual à difusão de II para I . Em resumo - O Potencial de Equilíbrio Transmembrana é a diferença de potencial elétrico que se deve estabelecer através de uma membrana, para que o fluxo efetivo de um determinado íon seja igual a zero, apesar da existência de um gradiente de concentração. O Potencial de Equilíbrio para um determinado íon, em solução aquosa contido em dois compartimentos separados por uma membrana de permeabilidade seletiva, pode ser calculada aplicando-se a Equação de Nerst, que é uma expressão matemática deduzido de princípios fisico-químicos da conservação da energia (1

0 Lei da Termodinâmica e trabalho de expansão isotérmica de um gás). Equação

de Nerst: RT C2 P . Eq = ---------- ln ----------- zF C1 ( C1 > C2 ) Tratando-se de íon negativo (monovalentes) multiplica-se o resultado por -1 ou inverte-se a razão entre as concentrações. O Potencial de Equilíbrio obtido indica sempre a d.d.p existente no lado interno

com relação

ao lado externo. Obtendo-se um resultado de -75mV entre as faces interna e externa da membrana, sendo a face interna negativa. É importante lembrar ainda que o equilíbrio eletroquímico é um fenômeno puramente PASSIVO. Se, para um determinado íon , o gradiente de concentração não está equilibrado matematicamente (pela equação de Nerst) com a polarização existente na membrana, é sinal de que esse íon deve estar submetido a um processo ATIVO e/ou deve ser muito pouco permeante. Nas células musculares dos mamíferos, por exemplo, o potencial elétrico existente através da membrana celular (potencial de repouso) corresponde ao Potencial de Equilíbrio do íon Cl

- mas é um

pouco menor que o Potencial de Equilíbrio do K+ e muito diferente do Potencial de Equilíbrio para o íon Na

+

e realiza um transporte ativo de Na+ e K

+ (bomba de NA

+ e K

+ ). O íon Cl

- se equilíbra passivamente.

V-POTENCIAL DE REPOUSO OU POTENCIAL DE MEMBRANA CELULAR As células animais contém proteínas, íons fosfatos e bicarbonatos equilibrados eletricamente pelos íons potássio, e, em menor escala pelo sódio. Ao passo que o meio extracelular contém, principalmente, NaCl e em menor concentração o potássio e o bicarbonato. Na representação abaixo, vemos os meios intra e extracelular com seus respectivos íons. As dimensões dos símbolos correspondem às suas concentrações relativas. Os sinais (+) e (-) representam a polarização elétrica existente entre as faces da membrana. + + + + + + - - - - + + - Prot- Na+ - + + - K

+ - +

+ - HPO4- cL- - +

+ - - - - + + + + + + A tabela abaixo mostra a composição média dos meios intra e extracelulares de uma fibra muscular de mamífero. A tabela apresenta também os potenciais de equilíbrio eletroquímico para os íons Na+, K+ e Cl-, calculados conforme a Equação de Nerst, e o Potencial de Membrana ou Potencial de Repouso (PR) existente na célula.

_____________________________________________________________________

Ïon *Ce *Ci P.Eq(mV)

_____________________________________________________________________

Na+ 145 12 +65

_____________________________________________________________________

9K+ 154 155 -95

_____________________________________________________________________

Cl- 120 3,8 -90

_____________________________________________________________________

Potencial 0 -90 ///

_____________________________________________________________________

* (mEq/l) Eq. de Nerst : P. Eq (mV) = 60 . log Ce

26

Ci Pode-se observar que o Potencial de Repouso (PR) que realmente existe na membrana da célula é bastante diferente do Potencial de Equilíbrio requerido para o íon sódio, um pouco menor que Potencial de Equilíbrio para o íon potássio e exatamente igual ao Potencial de Equilíbrio para o íon cloro. Significa que apenas que o Cl- está em equilíbrio eletroquímico, ou seja, o seu gradiente de concentração está exatamente contrabalanceado pela polarização da membrana. Isto leva à suposição de que o equilíbrio eletroquímico do cloro é quem determina o potencial de repouso. Tal suposição pode ser verificada variando-se a concentração extracelular do Cl- e medindo-se o potencial de membrana. Experimentalmente verificou-se que alterações moderadas da concentração do Cl- não modificam significativamente o potencial de repouso(PR). Descartado o papel do cloreto, o íon mais provável de desempenhar algum papel na gênese do potencial de membrana seria o K

+, pois seu potencial de equilíbrio está muito próximo do PR. Essa

hipótese também pode ser verificada baseando-se na equação de Nerst: se o potencial de repouso é determinado pelo equilíbrio eletroquímico do potássio, variações na sua concentração extracelular deveriam provocar alterações no potencial de repouso. De fato, experimentalmente, foi comprovado que um aumento na concentração extracelular do K

+ diminue o potencial de repouso.

Para compreender como a distribuição eletroquímica do K+

poderia gerar um potencial de membrana, imaginemos uma membrana celular despolarizada, sendo subitamente colocada em contato com os meios intra e extracelulares. É conveniente relembrar que o K

+ intracelular está equilibrado eletricamente

com ânions NÃO DIFUSÍVEIS (Prot- e HPO4=).

Devido à existência de íons potássio tanto no LIC como no LEC, é evidente que haverá difusão de K

+ tanto do meio intra para o extracelular (EFLUXO), como do meio extra para o meio intracelular

(INFLUXO). Entratanto, como a concentração de K+ no LIC é maior que no LEC, teremos um EFLUXO

maior que o INFLUXO, isto é, um FLUXO EFETIVO de K+ do meio intra para o extracelular.

Como o potássio se difunde sem seu ânion correspondente, é evidente que a membrana começa a se tornar polarizada, pois cada K+ que se desloca do meio intra para o extracelular carrega uma carga positiva e deixa uma carga negativa. (i) M (e) (i) M (e) (i) M (e) - + - + - + Prot- Prot- + Prot- + K+ k+ K+ - + k+ K+ - + k+ If - + (Início) (Equilíbrio) A medida em que a membrana vai se carregando eletricamente, o EFLUXO diminue, ao mesmo tempo em que se eleva o INFLUXO. A um certo ponto os dois se igualam e o FLUXO EFETIVO se torna igual a zero. Desse ponto em diante, a diferença de potencial elétrico entre as duas faces da membrana se torna constante. Esse potencial corresponde ao potencial de equilíbrio do potássio para as concentrações intra e extracelular existente e pode ser calculado pela Equação de Nerst (no caso, vale - 95mV). É importante compreender e frisar que a quantidade de K+ necessária para criar esta diferença de potencial elétrico é pequena (1/100000) em relação às quantidades totais de K+ nos meios intra e extracelulares, de modo que a equação de Nerst pode ser aplicada usando-se as concentrações iniciais e não as finais , após o equilíbrio. Relacionando-se, em um gráfico, os fluxos de K+ com a polarização gradativa de membrana (d.d.p), teríamos o seguinte resultado: Fig.06 Fluxo Ef P.Repouso If P.Eq

0 -90 -95 d.d.p(mV)

Se o Potencial de Repouso da membrana celular fosse determinado apenas pelo Equilíbrio Eletroquímico do K+, deveríamos esperar que seu valor correspondesse ao Potencial de Equilíbrio para o K+, determinado pela Equação de Nerst. Na verdade, o que se vê é que o Potencial de Repouso (-90mV) é um pouco menor que o Potencial de Equilíbrio do K+ (-95mV). Ness asituação, temos que admitir que o

27

EFLUXO passivo está sendo maior que o INFLUXO (veja o gráfico), de modo que a célula está continuamente perdendo potássio, isto é, cargas positivas. Como o Potencial de Repouso se mantém constante deve existir um mecanismo ATIVO de entrada de K+ que equilibre continuamente o escape passivo. Tal mecanismo já foi identificado e é denominado “bomba”de K+. O íon Na+ seria o menos provável de gerar o Potencial de Repouso pois, para as concentrações existentes nos meios intra e extracelulares seu Potencial de Equilíbrio (+65mV) calculado pela Eq. de Nerst é bastante diferente do Potencial de Repouso realmente existente na membrana (-90mV). Na verdade a distribuição do Na+ tende a anular o Potencial de Repouso pois, tanto o seu gradiente de concentração quanto o gradiente elétrico da membrana (positivo fora, negativo dentro) favorecem sua entrada passiva na célula. Ora, cada íon sódio que entrasse carregaria uma carga positiva que iria neutralizar as cargas negativas no interior da célula e diminuindo gradativamente o Potencial de Repouso. De modo que podemos visualizar a célula como uma “cidade” constantemente assediada pelo sódio. A única maneira definitiva da célula impedir essa “invasão” pelo sódio seria tornar a membrana absolutamente impermeável aos íons Na+. Tal solução, porém, seria desvantajosa para a célula, pois restringiria bastante suas possibilidades de intercâmbio com o meio ambiente. O que ocorre na prática, é que a membrana celular, apesar de não ser completamente impermeável, apresenta, em condições de repouso, uma baixíssima permeabilidade ao sódio. Medidas efetuadas em várias células demonstraram que a permeabilidade da membrana ao Na+ é cerca de 100 vezes menor que ao K+. Entretanto, a simples diminuição da permeabilidade não impede a penetração contínua, embora pequena, do Na+ na célula pois essa baixa permeabilidade é compensada pela presença de dois gradientes que forçam a entrada do Na+: o gradiente de concentração e o elétrico. Assim, obrigatoriamente, a célula está passivamente e continuamente ganhando Na+, ou seja, cargas positivas. Como o Potencial de Repouso não varia, apesar dessa enrtrada contínua de cargas positivas, temos que admitir novamente a existência de um mecanismo ATIVO que promova a extrusão do Na+ para contrabalançar sua contínua penetração PASSIVA na célula, e manter constante o Potencial de Repouso. Esse mecanismo também já foi indentificado e é denominado “bomba”de Na+. Na realidade, a “bomba”de Na+ funcionava acoplada à “bomba”de K+, constituindo a chamada “bomba”de Na+ e K+. Essa “bomba” consiste num complexo enzimático existente na membrana celular que, utilizando energia fornecida pelo ATP, transporta íon Na+ do meio intra para o extracelular e o íon K+ do meio extra para o intracelular. Uma visão global da membrana celular, em condições “de repouso” , mostraria os seguintes fluxos:

(i) - M + (e) 1-Influxo passivo

Na+ 1 Na+ 2-Efluxo passivo

2 3-Transporte ativo

3

4-Transporte ativo

K+ 4 5-Influxo passivo

5 K+ 6-Efluxo passivo

6

Cl- 7 7-Influxo passivo

Prot- 8 Cl- 8-Efluxo passivo

HPO4=

- M +

Obs:

- O tamanho das setas indica a intensidade dos fluxos - A espessura das setas indica a permeabilidade relativa das membranas, exceto para os transportes ativos . A “Bomba”de Na+ e K+ é de suma importância para a manutenção das concentrações intra e extracelulares do Na+ e do K+ e, indiretamente, para a manutenção do Potencial de Repouso. Tal importância pode ser verificada experimentalmente, bloqueando-se a “Bomba” de Na+ e K+, por meio de inibidores enzimáticos como a ouabaina. A inibição da “Bomba” de Na+ e K+ resulta, inicialmente, num aumento da polarizaçã0, ou seja, numa hiperpolarização da membrana. Isto ocorre porque, como vimos, existe um FLUXO EFETIVO passivo de K+ que, normalmente, é contrabalançada pelo Transporte Ativo: bloqueando o Transporte Ativo, o fluxo de K+, ou seja, de cargas positivas, vai aumentando a polarização da membrana até atingir o Potencial de Equilíbrio para o K+ (veja fig).

28

Poder-se-ia argumentar que, quando a “Bomba” de Na+ e K+ está inibida o fluxo de Na+ deixa de ser contrabalançado pelo Transporte Ativo de modo que passa a existir um Fluxo Efetivo de Na+ que tenderia a causar uma hipopolarização e não uma hiperpolarização da membrana. Na verdade, isto ocorre mas, como a membrana é muito mais permeável a K+ do que ao Na+, o efeito que predomina, inicialmente, é a hiperpolarização devida ao fluxo de K+. O Fluxo Efetivo do Na+ tem um efeito retardado, ou melhor, a longo prazo, por causa da baixa permeabilidade de membrana a esse íon. Se a “Bomba”de Na+ e K+ permanece inibida por um longo período, o Na+ (cargas positivas) vai penetrando lentamente na célula e diminuindo gradativamente o Potencial de Repouso. Essa hipopolarização progressiva da membrana, por sua vez, provoca um escape contínuo de K+ em virtude do Potencial de Repouso se tornar novamente menor que o Potencial de Equilíbrio do K+. Num cômputo geral, o efeito a longo prazo da inibição da “Bomba”de Na+ e K+ seria a anulação dos gradientes de concentração do Na+ e K+ e o desaparecimento quase completo da polarização da membrana. Restaria apenas a polarização decorrente do Efeito de Gibbs-Donnan em virtude da presença dos ânions não difusíveis no interior da membrana. Analisando a situação de cada íon isoladamente, veríamos o seguinte: Íon Cl- : - O fluxo é exatamente igual ao influxo. Isto ocorre porque o gradiente elétrico existente na membrana é exatamente igual ao que seria necessário para equilibrar o gradiente de concnetração. O influxo ocorre a favor do gradiente de concnetração mas contra o gradiente elétrico enquantro o efluxo ocorre contra o gradiente de concentração mas a favor do gradiente elétrico. Íon K+ : - O influxo ocorre contra o gradiente de concentração mas a favor do gradiente elétrico. - O efluxo ocorre a favor do gradiente de concentração mas contra o gradiente elétrico. Porém, no caso do K+, o gradiente elétrico existente (-90 mV) é menor do que seria necessário (-95 mV) para equilibrar o gradiente de concentração. Desse modo, o efluxo é maior que o influxo e a célula está continuamente perdendo K+. Essa perda PASSIVA de K+ é contrabalançada pelo transporte ATIVO efetuado pela “Bomba”de Na+ e K+, de tal modo que o fluxo efetivo é nulo e as concentrações interna e externa de K+ se mantêm constantes. Íon Na+ : - O efluxo é muito pequeno porque, primeiro, a membrana é muito pouco permeável ao sódio, e, segundo esse efluxo ocorre contra um gradiente de concentração e contra um gradiente elétrico. - O influxo tende a ser bastante intenso porque ocorre a favor tanto do gradiente de concentração como do gradiente elétrico mas não o é, por causa da baixa permeabilidade da membrana. De qualquer modo, o influxo é maior que o efluxo e o Na+ está continuamente penetrando na célula. Essa invasão PASSIVA de Na+, que terminaria por anular o Potencial de Repouso, é contrabalançado pelo transporte Ativo efetuado pela “Bomba”de Na+ e K+. Desse modo, o fluxo efetivo do íon sódio também é nulo e suas concentrações intra e extracelular se mantêm constantes.

29

FUNÇÃO DA HEMOGLOBINA NO TRANSPORTE DE GASES E NO TAMPONAMENTO SANGUÍNEO

O sangue venoso chega aos alvéolos pulmonares na seguinte situação: a) baixo conteúdo de O2 (foi consumido pelos tecidos) no plasma e nas hemácias. b) elevado conteúdo de CO2 (liberado pelos tecidos) na forma de CO2 dissolvido, H2CO3 e HCO3

-, no plasma e nas hemácias.

c) Hemoglobina desoxigenada e protonada. Os prótons (H+) são provenientes da

dissociação do H2CO3 que se formou devido ao elevado conteúdo de CO2 (CO2 + H2O H2CO3 H

+ + HCO3

-). A hemoglobina desoxigenada funcionou como a base conjugada de um tampão impedindo

que os H+ liberados permanecessem na forma livre e baixasse o pH do meio, e facilitou lo transporte de CO2

na forma de HCO3-. Caso não houvesse o tamponamento pelo Hb o pH do meio baixaria rapidamente (pois

o sistema tampão HCO3- / H2CO3 não tampona seus próprios componentes - o H2CO3 no caso) e a

eliminação de CO2 celular seria dficultada pois o gradiente de concentração CO2 células / CO2 plasma desapareceria rapidamente devido à saturação do plasma. d) Proteínas plasmáticas na forma carbamínica, também devido ao elevado conteúdo de CO2 do plasma (CO2 + Prot -NH2 Prot-NHCOOH). Todos os componentes citados (O2, HBO2, Hb,

+HHb, H

+, HCO3

-, Prot-NH2, Prot-

NHCOOH, CO2) estão em equilíbrio REVERSÍVEL entre si pois todos participam de uma cadeia de reações que se inicia, de um lado, captação ou liberação de O2 e, do outro, na captação ou liberação de CO2. São as variações de concentração desses dois gases que, de acordo com a lei da ação das massas, disparam as reações, ora num sentido, ora no sentido inverso, procurando novo equilíbrio. Repetindo, no sangue venoso todos os componentes do sistema transportador de O2 e CO2 estão em equilíbrio dinâmico. Atingindo os capilares pulmonares, o sistema transportador (sagnue) se depara com uma alta concentração de O2 e uma baixa concentração de CO2; exatamente o inverso das condições do sangue. Haverá então um fluxo de O2 do alvéolo para o sangue e um fluxo de CO2 do sangue para o alvéolo, alterando suas respectivas concentrações. Dissemos anteriormente que são as variações de concentrações desses gases (O2 e CO2) que, de acordo com a lei de ação das massas, disparam as reações, num sentido ou no outro. Normalmente eles atuam de modo cooperativo, isto é, deslocam o equilíbrio num mesmo sentido. Isto acontece porque eles se encontram nos extremos da cadeia de reações; o aumento na concentração de um concomitante com a diminuição na concentração do outro desloca todas as reaões num mesmo sentido, seja no sentido da oxigenação e perda de CO2 ( sentido 1) ou no da desoxigenação e ganho de CO2 (sentido 2) pelo sangue. As condições ao nível dos pulmões (alta de O2 e baixa de CO2 alveolar) são favoráveis ao sentido 1 e teremos então os seguintes processos: a) A alta concentração de O2 (proveniente do alvéolo) facilita a oxigenação da hemoglobina (reação 1) que se encontra na forma protonada (+HHb). A captação de O2 pela hemoglobina protonada diminue sua afinidade pelos prótons (H

+) que serão então liberados no meio(reação 2). A hemoglobina

passará para a forma oxigenada e desprotonada. b) O aumento da concentração de H

+ no meio (devido à desprotonação da +HHbO2)

associado à alta concentração de HCO3- deslocará a reação H

+ + HCO3 H2CO3 (reação 3) no

sentido da formação do H2CO3. Um aumento na concentração deste, por sua vez, deslocará a reação H2CO3 H2O + CO2 (reação 4) no sentido da formação de CO2 o que facilitará sua difusão para o alvéolo que já está facilitada pela baixa concentração de CO2 no mesmo. Se tivéssemos iniciado o raciocínio com a alteração na concentração do CO2, o resultado final seria o mesmo: ganho de O2 pelo sangue. Senão vejamos: a diminuição da concentração plasmática de CO2 (devido à sua difusão para o alvéolo) desloca a reação 4 no sentido da reposição do CO2 que se difundiu, o que leva a um consumo de H2CO3. Um consumo deste, por sua vez, desloca a reaçào 3 no sentido de repor o H2CO3 consumido, o que provoca uma diminuição na concentração de H

+. Esta, por sua vez, facilita o deslocamento das reações 2 e

1 no sentido da desprotonação e oxigenação da hemoglobina. c) Por fim, a diminuição do CO2 no sangue (devido à sua difusão para o alvéolo) desloca a reação Prot-NHCOOH Prot-NH2 + CO2 (reação 5) no sentido da liberação de CO2 que continuará se difudindo para o alvéolo. Desse modo, o CO2 recebido pelo sangue, ao nível dos tecidos, e que vinha transportado nas forma de CO2 dissolvido HCO3

-, H2CO3 e Prot - NHCOOH foi “excretado” nos alvéolos pulmonares, ao

mesmo tempo em que o sangue era oxigenado. O sangue que saiu os pulmões e irá para os tecidos (sangue arterial) apresenta-se nas seguintes condições, com todos os seus componentes novamente em equilíbrio dinâmico: a’ elevado conteúdo de O2 (recebido ao nível dos alvéolos) no plasma e nas hemácias. b’ baixo conteúdo de CO2 (perdido ao nível dos alvéolos), tanto na forma de CO2, dissolvido como na forma de HCO3

- e H2CO3, no plasma e nas hemácias.

c’ Hemoglobina oxigenada e desprotonada. Os prótons (H+) foram liberados devido à

oxigenação da hemoglobina protonada. Neste caso a hemoglobiana funcionou como o ácido conjugado de um tampão (compare com o item c no sangue venoso) impedindo que o consumo de H

+ devido ao

deslocamento das reações 3 e 4 aumentassem o pH do meio e facilitou a eliminação de CO2,promovendo o deslocamento das reações 3 e 4 nesse sentido. d’ Proteínas na forma amínica (Prot-NH2) devido ao baixo conteúdo plasmático de CO2. Pode-se observar que o sangue arterial apresenta-se em um estado oposto àquele do sangue venoso.

30

Ao atingir os tecidos o sistema transportador de O2 e CO2 (sangue), agora, depara-se com uma situação inversa daquela encontrada nos pulmões, ou seja, uma baixa concentração de O2 e uma alta concentração de CO2 nas células, situação esta decorrente do metabolismo celular. Esta situação propiciará um fluxo de O2 do sangue para as células e um fluxo de CO2 das células para o sangue, alterando suas respectivas concentrações, o que deslocará todas as reações no sentido contrário aquele que ocorreu ao nível dos alvéolos pulmonares: 1’ O fluxo de CO2 das células para o plasma aumenta sua concentração no mesmo, o que desloca a reação 4 no sentido da formação de H2CO3 que, por sua vez, se dissociará em HCO3

- e H

+.

Caso a hemoglobina não funcionasse como um tampão, prótons (H+) liberados iriam se acumulando e

diminuindo o pH do meio, o que dificultaria a formação de H2CO3 e o armazenamento do CO2 na forma de HCO3

-.`

2’- O fluxo de O2 do plasma para as células desloca a reação 1 no sentido da desoxigenação da hemoglobina o que facilita o seu funcionamento como tampão (item anterior) pois a hemoglobina na forma desoxigenada tem maior afinidade pelos prótons (H+) do que na forma oxigenada. 3’- Por fim, o aumento da concentração plasmática de CO2 deslocará a reação 5 no sentido da associação do CO2 aos grupos -NH2 das proteínas deixando-os na forma carbamínica (prot-NHCOOH). Cedendo O2 para as células e recebendo o CO2 por elas produzido, o sangue volta às condições citadas no início (itens a, b, c, d - sangue venoso). Fecha-se assim o início de transporte de O2 dos pulmões para os tecidos e de CO2 dos tecidos até os pulmões onde será eliminado pela respiração. Observações: I - Os grupos amina (-NH2) da hemoglobina participam também no transporte de CO2 na forma carbamínica (-NHCOOH). Seu comportamento é semelhante ao das proteínas plasmáticas. Não foram incluídas no esquema por motivos de simplificação. II - Quando se diz que no sangue venoso a hemoglobina está na forma desoxigenada e desprotonada, trata-se de uma simplificação. Na verdade, tanto no sangue venoso como no arterial, existe sempre um equilíbrio entre as quatro formas da hemoglobina: oxigenada protonada (+HHbO2), oxigenada desprotonada (HbO2), desoxigenada protonada (+Hhb) e desoxigenada desprotonada (Hb). Dependendo das condições haverá a PREDOMINÂNCIA não de uma forma sobre as outras, mas sim, de uma situação sobre a outra. No sangue arterial, a alta concentração de O2 e a diminuição da concentração de +H, facilitará a predominância da forma oxigenada desprotonada sobre a forma desoxigenada protonada (HbO2: 96%, +HHb: 4%). Já no sangue venoso, a baixa concentração de O2 (perdido ao nível dos tecidos ) e à acidez do meio (proveniente da dissociação do H2CO3, formado pela hidratação do CO2 liberado pelos tecidos), resultarão na diminuição da percentagem de hemoglobina oxigenada desprotonada (HbO2 - 65%) e aumento da percentagem da forma desoxigenada protonada (+HHb - 35%). +HHb - 35% O2 HbO2 - 65% O2

A +HHbO2 +HHbO2 B

H+ +HHb - 4% H+

HbO2 - 96%

No esquema acima o círculo superior mostra a situação da hemoglobina no sangue venoso e o círculo inferior, no sangue arterial. O lado B mostra as reações que ocorrem ao nível dos pulmões: captação de O2 e liberação de H+. O lado A mostra o deslocamento do equilíbrio do sistema quando o mesmo atinge os tecidos: lliberação de O2 e a captação de H+. A existência da hemoglobina na forma oxigenada- protonada é efêmera pois existe uma influência antagônica do O2 e do H+ sobre a hemoglobina: a oxigeneção da hemoglobina diminue sua afinidade pelos prótons (H+) que são então liberados e o contrário, ao contrário. Esse fenômeno é denominado Efeito Bohr.

Essa influência antagônica do O2 e dos prótons sobre a hemoglobina é uma decorrência da sua própria estrutura. O íon Fe++ do grupo heme, de acordo com seu estado oxigenado ou desoxigenado influencia a distribuição eletrônica do radical lateral do aminoácido histidina que é quem funciona como doador ou aceptor dos prótons. Quando o Fe++ está oxigenado o radical lateral histidina torna-se menos negativo e portanto com menor afinidade pelos prótons. A desoxigenação do Fe++ desloca a negatividade do complexo para o radical da histidina que passa a captar os prótons do meio.

31

GRUPO HEME - Fe++ O2

Prot - CH2 - C = CH

HN N H+

CH

(Histidina)

32

Capilar Pulmonar

Plasma Hemácia

Alvéolo +HHb 1 HbO2 2 Pulmonar +HHbO2

O2 O2 H+

HCO3- 3 HCO3

-

H2CO3

4

CO2

CO2 H2O

5

Prot-NH2 Prot-NHCOOH SANGUE VENOSO

O2 H2CO3

HCO3

O2 +HHb H2CO3 H

+ H+

CO2 HCO3-

H

Prot-N COOH

CO2

Capilar Pulmonar

Células Plasma Hemácia

+HHb 1 HbO2

+HHbO2 2

O2 O2 H+

HCO3- HCO3- 3

H2CO3

4

CO2 H2O

CO2 5

33

Prot-NH2 Prot-NHCOOH

34

BIOELETROGÊNESE I Potencial de Ação Potencial de Equilíbrio Membranas Excitáveis ATPases Transportadoras

BIOELETROGÊNESE II

Músculo Liso Músculo Esquelético Contração Muscular Lisa e Esquelética As membranas celulares com sua composição iônica intra e extracelular apresenta uma diferença de potencial eletroquímico transmembrana, variável de célula para célula dependendo do tecido e que em repouso possui valor constante. Este potencial apresenta uma polaridade negativa no intracelular e positiva no extracelular devido às macromoléculas não difusíveis existente no interior das células. No estado de repouso a célula apresenta-se com uma grande permeabilidade aos íons K+ de Potencial de Equilíbrio (P. Eq.) em torno de -95 mV e mostra-se praticamente impermeável aos íons Na+ que possui P.Eq. em torno de +65mV. Na presença de um estímulo a membrana que antes era praticamente impermeável ao Na+, torna-se altamente permeável, elevando-se assim a concentração de Na+ intracelular em decorrência do aumento do influxo deste íon. Isso provoca uma despolarização na membrana celular. Com propósito de compensar essa despolarização a célula eleva o efluxo de K+ sendo assim repolarizada. Chega a um determinado ponto que o eletrofluxo é muito grande , hiperpolarizando a célula . Neste ponto a célula através das ATPases Na-K coloca Na para fora e K para o interior da célula, deixando a membrana em equilíbrio elétrico mas ainda com um pequeno desequilíbrio químico. Todas estas alterações elétricas que ocorrem na membrana celular após a presença de um estímulo denomina-se Potencial de Ação (P.A.). A membrana celular possui proteínas específicas para grupos de substâncias chamadas de receptores. As substâncias podem ligar-se a estas proteínas de todos os tipos de interações químicas: iônica, pontes de hidrogênio, forças de Van Der Waals e covalente. No caso de ligações covalentes a ação é bastante prolongada. Publicações mais antigas mostraram que existia na membrana celular vários tipos de proteínas (receptores). Existia receptores próprios para hormônios esteróides que poderiam induzir a síntese proteíca específica (R1) e em caso dos neurotransmissores seriam eles proprios canais de íons associados aos canais nas membranas plasmáticas da célula alvo (R2). Outros receptores (R3 e R3i) atuariam estimulando ou inbindo respectivamente a adenilato ciclase que por conseguinte alteraria a concentração intracelular da adenosina monofosfato (AMPc). Isto ocorreria através de distintas ligações com Guanosina (GTP) com proteínas reguladoras (Gs e Gi) respectivamente. Se Gs for ativada de forma tal que possa estimular a adenilato (A.C.), esta se ligará ao GTP formando o complexo agonista-receptor apropriado o que elevará os níveis de AMPc intracelularmente. Se no entanto for ativada a Gi, esta indiretamente inibirá a A.C. que por sua vez diminuirá os níveis de AMPc celular. Os níveis de AMPc podem determinar ou não os estímulos de proteínas cinases dependentes. O influxo de Ca++ é regulado através de receptores distintos (R4 e R5). ESQUEMA1. O Ca++ citoplasmático regula algumas funções diretamente e outras apenas quando encontra-se ligado à proteínas reguladoras intracelulares dependentes de cálcio, a calmodulina (CaM). O complexo CaM-Ca++ controla as funções de algumas proteínas diretamente e de outras pela ativação de um grupo, distinto de proteínas cinases dos quais a miosina de cadeia leve (MLCK) é um exemplo. A teoria mais recente não se refere a estes receptores citados anteriormente, mas a mecanismos reguladores da atividade celular estritamente ao fenômeno da cascata. Existe na membrana celular a fosfolipase C (PLC) que através da ativação da proteína Guanina Nucleotídeo (G) por ocupação do receptor específico pelo agonista ativa-a levando à hidrólise dos inositois bifosfato da membrana. Esta hidrólise ocasiona a fosforilação do inositol 1,4,5 trifosfato (INaP 3) e do Diacilglicerol (DG) resultando em inositol Tetrafosfato (InsP 4) que por sua vez libera Ca++ dos estoques intracelulares que estimula a C-quinase, através da estimulação da calmodulina. ESQUEMA 2.

ATPases transportadores A membrana plasmática constitui-se de uma membrana lipoproteica que delimita a célula. O “modelo de mosaico fluido” sugerido por Singer e Nicolson, 1972, sugerem que as proteínas integrais formam um conjunto heterogêneo de moléculas dispostas de modo que seus grupos apolares mergulham no interior hidrofóbico da membrana, enquanto seus grupos polares se projetam para a fase aquosa. Estas proteínas funcionariam como “carriar” que translocariam íon de um lado para outro da membrana as custas de mudanças conformacionais. Este transporte indo contra um gradiente qualquer requer de energia. Sendo assim as proteínas transportadoras funcionam como enzimas capazes de hidrolizar a ligação entre os fosfatos B e Y do ATP, liberando ADP e Pi e de aproveitar a energia resultante para o transporte de íons. O transporte ativo de Na+ e K+ é catalizado por uma enzima Na-K-ATPase descoberta por Skou (1957). Trabalhos feitos com medida em fragmentos de membrana e fluxos ativos de Na+/K+ medida em eritrócitos íntegros, mostraram as seguintes características: 1). Ambos estão localizados na membrana e utilizam ATP 2). Ambos são ativados sinergicamente por Na+ e K+

35

3). Em ambos o íon amoníaco pode substituir o K 4). As concentrações de Na+ e K+ necessárias para produzir metade da ativação máxima em ambos os processos são muito próximas. 5). A ovabaína inbe os processos, sendo 10

-7 M a dose necessária para a inibição.

6). Em ambos, concentração muito altas de Na+ inbem competitivamente a ativação pelo K e vice-versa. A enzima apresenta um sítio de alta afinidade pelo Na e baixa pelo K voltando para o lado interno da membrana, e outro sítio de alta afinidade pelo K e de baixa afinidade pelo Na+ voltado para o lado externo da membrana. A ATPase Na/K foi evidenciada em todos os tecidos onde há transporte ativo de Na e K, incluindo: cérebro, nervo periférico, hemáceas, rim músculos, baço, fígado, pulmão, estômago, retina, cristalino, vários tecidos epiteliais, diversas glândulas. Em outros animais, como: músculos, pele, bexiga de anfíbios, axônios de lulas gigantes, nervo periférico de caranguejo, rim de lagosta. Recentemente foi demonstrado a presença de ATPases em células (algas marinhas) com características bastante semelhantes às Na/K ATPases.

Mecanismos de Reação da Na/K – ATPases

A fosfoenzima (E1 - P) capaz de reagir reversívelmente com o ADP resintetizando ATP estaria voltada para o lado interno da membrana e apresentaria Na ligado a ela. Durante o ciclo de reação esta fosfoenzima sofreria uma mudança conformacional dependendo de alto Mg, convertendo-se em um segundo tipo fosfoenzima (E2 - P) voltada para o lado externo da membrana que, apresentando baixa afinidade ao Na, prontamente liberaria este íon para o meio extracelular. A ligação de K a esta fosfoenzima (E”- P) promoveria sua desfosforilação seguinte de seu retorno à “posição” intracelular acompanhada da liberação de K no meio intracelular. ESQUEMA 2 e 3.

CITOPLASMA

Esquema 03 Pi 2K+ 3Na+ ATP ADP 3Na Lado E1 + 3Na+ + ATP E1-P + ADP Interno Pi + E2 E2-P 2K + E2-P Lado 2K H2O 2 K Externo _____________________________________________________________ 2K+ 3Na+ MEIO EXTRACELULAR Miosina nos canais Cinase e Contração do Músculo Liso Evidências sugerem que existe no músculo liso receptor para o Ca++ na proteína leiotonina análogo a troponina C. O músculo liso contém maiores concentrações de Ca++ nos receptores das proteínas calmodulina (Ca M) e enzima específica Ca M - dependente e elevadas taxas de miosina (MICK), a actina - dependente da ativação da miosina ATPase. No modelo de contração muscular lisa, e Ca++ dependente da ativação da MLC.P. interage com a actina formando um ciclo actina-miosina, regulando os processos filamentosos. Recentemente foi descoberta a proteína caldesmon, que está associada com o domínio A-TM-M. É também um componente do sistema contrátil na motilidade das células. Na ausência de Ca++ e CaM, caldesmon pode ligar-se à A-TM, inibindo a formação da ligação entre A-MLC.P. Neste modelo a MLCK na resposta contrátil poderá ocorrer: 1) A contração ocorre com elevadas concentrações intracelulares de Ca++ livre, com caldesmon controlando o sistema. 2) No músculo contraído contém altas concentrações de MIC.P. Estudos mostraram que a elevada concentração de Ca++ ocorre somente durante 2-5 só tem valores levemente altos durante o platô sustentado. No músculo esquelético, na maioria das vezes, há uma correspondendência entre duração da contração e magnitude e duração como aumento ihntracelular de Ca++. Isto não ocorre no músculo liso. A troponina C é ausente no músculo liso. A quantidade de actina e miosina é maior no músculo liso do que no músculo esquelético. durante a contração sustentada no músculo esquelético (tétano), o cosumo de oxigênio é alto mas durante a contração do músculo a taxa de O2 eleva-se no início da contração mas cai os valores somente durante a fase de platô. Ainda que as proteínas intermediarias estejam em ambos os músculos, elas são consideralmente maior no músculo liso comparando-se com o músculo esquelético. O rearranjo também é diferente. O músculo liso é constituído de dois domínios distintos: domínio fibrilar: a caldesmon - troponina actina -miosina (CD + TM - A - M) e o domínio contendo actina ligada a proteínas filamina e proteína intermediária desmina, formando domínio filamina actina-desmina (F - A - D). No músculo esquelético somente um estímulo leva a contração muscular. No músculo liso tem sido provada a participação direta do Ca++ na contração lisa.

Contração Muscular Lisa

36

Os músculos lisos possuem filamentos portéicos responsáveis pelo mecanismo da contração muscular formado pelas proteínas: caldesman- tropomiosina- actina-miosina (CD-TM-A-M) e actina-desmina C A-D. Durante o repouso, o músculo liso é formado por uma ponte de actina-miosina-caldesmon que impede a ligação com a tropomiosina e uma outra proteína , filamina, que está associada ao domínio actina-desmina. Uma ativação celular por qualquer um dos mecanismos: 1) ativação fosfollipase C; 2) ativação de adenosina monofosfato (AM PC); 3) estimulação direta da G proteína por agnosta, como patra substância P, eleva os níveis de Ca++ promovendo a fosforilação da meromiosina de cadeia leve (MILK) em MIC-P. Os níveis eleados de Ca++ também promovem a dissociação de caldesmon através de Ca++ cdependente de calmodulina e ativação do domínio filamina-actina-desmina (F-A-D). Tudo isso reduz concentração muscular. durante a contração da proteína C-quinase promove a fosforilação de outras proteínas, como desmina, sinemina, caldesmon e de várias proteínas citolíticas. O mecanismo de fachadura dos filamentos durante a concentração muscular é causada pela reorganização e estabillização supramolecular dos componentes do domínio F-A-D. A iniciação da contração resultou na formação de ciclo A-M. as propriedades desta ponte ocorre com a MLC. P formando uma destas pontes foi desfoforilado (A-MLC.P. -------- A-MLC + Ci). Na contração sustentada e Ca++ depende é elevado somente na fase inicial, durante a ativação da MLCK retornando aos valores basais.

Estudos da Ultraestrutura Através de novos métodos de imunoflluorescência microscópica e imunocitoquímica e microscopia e;etrônica na análise das células musculares lisas observou-se a presença de dois domínios distintos. CD - TM - A - M - F - A - livre de miosina e caldesmon. Mostrou também a presença de outras proteínas intermediárias: sinemina, vinculina, plactina e filamina na superfície densa de plaquetas e intracelularmente alta quantidade de actina. Gelsolina poderia temporariamente elevar o mecanismo dependente de Ca++. No início o consumo de oxigênio é elevado oudiminue com a aividade da miosina ATPase.

Kinase C, sua função no Músculo Liso A atividade da fosfolipase C fosforaliza INSP 3 em INSP 4 mobilizando o Ca++ localizado na vesícula mitocondrial. O aumento do Ca++ no retículo sarcoplasmático ativa a calmodulina dependente do Ca++ (Ca M) . A C -Kinase foi descoberta por Niskizuka no cérebro. Sempre que uma célula é ativa por um agonista dois eventos ocorrem: a hidrólise de PIP 2 e ativação da C - Kinase. Os ferbais ester, como DG, TPA (13-O-tetra decanoyl pherbor - 13 - acetato) e PDB (forbol dibutirato) ativam a C-Kinase.

C - Kinase Dependente de Fosforilação no Músculo Liso Durante a fase inicial celular o Ca++ no citosol regula a ativação de CaM - dependente. Caldesmon é o substrato para 2 proteínas cinases: Ca++ CaM e C-Kinase. A fosforilação de caldesmon altera o efeito de interação do domínio A-TM-M. Caldesmon fosforilada inivbe a interação A-D. Estudos mo9stram que a fosforilação de caldesmon eleva a ponto de ligação A-M necessária manter a tensão muscular. Após a mudança conformacional da tropomiosina ocorrida após a ligação Ca++ - Troponina C. Liberando o centro ativo da actina este se ligará a meromiosina de cadeia leve levando ao mecanismo de deslizamento dos filamentos formados pelas proteínas musculares, ou seja, à Contração Muscular. Para ocorrer o retorno muscular é necessário a retirada do Ca++ do sarcoplasma por meio da ATP-ase Ca++, eliminando à ligação Ca++ Troponina C. O sarcômero é um complexo resultante de zonas claras e escuras que aparecem no músculo esquelético em decorrência de pouco ou muito de determinada proteína. Possui uma banda A escura formada basicamente de miosina, mostando-se escura. No interior desta banda I predominantemente tropomiosina, e no interior desta uma linha Z. Durante a contração muscular pela teoria dos filamentos deslizantes, o sarcômero diminui de tamanho, desaparece a banda H eI. A banda A permanece. Voltando ao repouso tudo volta ao normal.

BIBLIOGRAFIA GOODMAN & GILMAN. As Bases Farmacológicas da Terapêutica. 7ª edição. Guanabara Koogan. 1987. LACAZ. VIEIRA. BIOFÍSICA. MARINHO, Lis C. Estudo Químico e Farmacológico do Extrato e Alcalóides Quinolizidínicos isolados de Bowdichia virgilioides, Kunth. Tese de Mestrado.

37

CONTRAÇÃO MUSCULAR 1 - ESTRUTURA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO Os músculos esqueléticos são constituídos por células finas, alongadas e multinucleadas, denominadas fibras musculares. As fibras musculares possuem de 10 a 100 Im, e comprimento variável conforme o tipo de movimento pelo músculo executado. Ao microscópio ótico, especialmente com iluminação de contraste de fase, as fibras apresentam faixas finas transversais, alternadamente claras e escuras, ao longo de todo seu comprimento. Por isso os músculos esqueléticos são classificados como músculos estriados. O conteúdo intracelular das fibras é na maior parte, ocupado pelos elementos contráteis de diâmetro de 1 a 2 Im, dispostos paralelamente por todo comprimento da fibra, as miofibrilas. O padrão de estriações exibido pelas fibras é atribuído às miofibrilas. Nas miofibrilas observa-se alternação sucessivas de bandas densas, chamadas bandas A (de anisotrópicas) e bandas menos densas, chamadas bandas I (de isotrópicas). Cada banda I apresenta uma fina linha escura dividindo-a ao meio, perpendicularmente, a linha Z. No músculo em repouso, a região central da banda A apresenta uma densidade um pouco menor que o restante da banda, é chamada de banda H. E, por fim, perpendicularmente e na região central da banda H, existe uma linha mais densa, a linha M.

SARCÔMERO A I H Z Z Z Define-se como sarcômero o segmento delimitado por duas linhas Z sucessivas, tendo no seu interior uma banda A separando duas semibandas I. O sarcômero é a unidade contrátil, e tem em média 2 a 3 Im de comprimento. Outras estruturas celulares, também são encontradas. A membrana plasmática da fibra muscular é chamada sarcoplasma, o citoplasma sarcoplasma, o retículo endoplasmático de retículo sarcoplasmático. Possuem também, muitas mitocôndrias localizadas preferencialmente na periferia da fibra, mas também entre as miofibrilas. O músculo como um todo é envolvido por uma membrana chamada epimísio. Percorrendo feixes de fibras musculares, existe uma membrana proveniente de invaginação do epimísio que é o perimísio. Por último envolvendo uma única fibra muscular encontramos o endomísio. 2 - ESTRUTURA AO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO Ao microscópio eletrônico, observa-se que as miofibrilas são constituídas por dois tipos de miofilamentos chamados grossos e finos. Os filamentos finos são constituídos por três tipos de proteínas: Actina, Troponina e Tropomiosina, estas inserem-se na linha Z, projetando-se de cada lado em direção ao centro do sarcômero. Os filamentos grossos são constituídos pela agregação de moléculas de uma outra proteína, a miosina. Localizam-se na região central do sarcômero. No músculo em repouso, os filamentos finos opostos não se encontram no centro do sarcômero, explicando a região mais clara no centro da banda A, a banda H. No centro desta observa-se uma linha mais densa, denominada linha M. Em cortes transversais feitos em diferentes níveis do sarcômero, observa-se que cortes na altura da banda I só contêm filamentos finos, e aqueles na altura da banda H somente filamentos grossos. Já nos cortes feitos na região da banda A estão presentes os dois tipos de filamentos, dispostos em um arranjo espacialmuito regular. Cada filamento grosso é rodeado por seis filamentos finos, dispostos como se estivesse constituíndo os vértices de um hexágono. Por outro lado, cada filamento fino acha-se rodeado por três grossos. Portanto, há uma relação de 2:1 entre o número de filamentos grossos e finos. 3 - PROTEÍNAS CONTRÁTEIS As miofibrilas são constituídas de quatro proteínas principais. A miosina, que forma os filamentos grossos, e a actina, principal componente dos filamentos finos, estão diretamente envolvidas no processo de contração muscular. Duas outras - tropomiosina e troponina, que se localizam nos filamentos finos - tem um papel regulador, funcionando como ïnterruptor”, pois atuam para ligar ou desligar o processo.

3.1 - A Miosina

38

Esta proteína constitue cerca de 55% do total de proteínas do músculo estando, portanto, provavelmente envolvida no fenômeno contrátil. É também uma enzima que cataliza a hidrolise do ATP. A molécula de miosina é alongada, constituída de uma porção filamentosa, vulgarmente chamada de cauda, terminada em uma das extremidades por uma porção globular, a cabeça. Na realidade a cabeça é formada por duas porções globulares, ligadas por um curto segmento aparentemente muito flexível. Com tempos muito curtos de tratamento pela tripsina, a molécula é rompida em dois fragmentos, denominados meromiosina leve (MML) e pesada (MMP). A MML é segmento da cauda, enquanto a MMP é o restante da cauda com as porções globulares a ele ligadas. Com tratamento mais prolongados pela tripsina, a MMP é quebrada nos chamados subfragmentos 1 e 2. Os primeiros (S-1) corresponde às partes globulares isoladas, destituídas de qualquer resto da parte filamentosa presente na MMP, que constitue o subfragmento 2 (S-2). O tratamento com uma outra enzima proteolítica, a papaína, ataca preferencialmente a junção das partes globulares, separando s-1 do restante da molécula. Isolando-se os diversos fragmentos, pode-se constatar o sítio de hidrólise do ATP, que está localizado no s-1 (região globular) que é também, a única parte capaz de se fixar aos filamentos finos. A molécula de miosina é, assim, extremamente interessante, por apresentar duas regiões morfologicamente distintas. A cauda desempenha um papel estrutural formando o arcabouço do filamento grosso. A cabeça é capaz de se ligar a filamentos finos e é a sede de trandução de energia química em mecânica, base do processo contrátil. O peso molecular da miosina é de cerca de 470.000. É constituída de duas cadeias polipeptídicas principais e quatro “cadeias leves”. Na cauda, estas cadeias se encontram enroladas, uma em torno da outra, numa estrutura chamada hélice dupla ou “coiled coil”. Em uma das extremidades, após um curto trecho em que não estão mais unidas entre sí, as cadeias se enovelam constituindo as regiões globulares. S2 S1 20A MML MMP Na estrutura quaternária da miosina, ela apresenta ainda quatro cadeias leves (CL) presas aos S-1, duas em cada uma dessas porções globulares. O papel dessas CL na atividade funcional da miosina ainda não está esclarecido. Há sugestões de que elas desempenham um papel estabilizador da conformação tridimensional das regiões globulares.

3.2 - Actina Constitue-se 20-25% de massa de proteínas das miofibrilas. Quando solúvel, em água ou solução de força iônica muito baixa, é chamada de actina-G. Em soluções de força iônica elevada, como o interior das células musculares, ela se polimeriza, passando à forma F-actina (fibrosa). A polimerização pode ser facilmente revertida, voltando à forma monomérica. Cada unidade de actina presente na F-actina tem uma molécula de ADP (adenosina difosfato) firmemente ligada. Quando ocorre a despolarização, e estando ATP presente no meio, a G-actina troca seu ADP por ATP. Durante a repolarização o ATP é hidrolizado em ADP (que permanece ligado) e fosfato inorgânico (que é liberado para o meio). Deve-se resaltar que a actina não é uma ATPase como a miosina. Isto porque não ocorre nenhuma hidrólise desta nucleotídeo antes ou depois da polimerização. A hidrólise que se observa é um simples processo estequiométrico, uma molécula de ATP sendo hidrolisada para cada unidade de G-actina que se incorpora à F-actina. (G-actina - ADP ) n ------------------- nG - actina - ADP G - actina - ADP + ATP -------------- G - actina - ATP + ADP nG - actina - ATP - ATP ---------------(G - actina - ADP) n + nPi 4 - PROTEÍNAS REGULADORAS 4.1 - Tropomiosina Esta proteína apresenta uma estrutura muito semelhante à cauda da molécula de miosina, e sue nome decorre do fato de que seu descobridor acreditava ser uma molécula precursora da síntese da miosina. Ela é, entretanto, consideralvemte menor do que a cauda da miosina, apresentando um peso molecuoar de 70.000. É formada por duas cadeias polipeptidicas. Cada uma delas apresenta, como a cauda da miosina, na proteína nativa, uma hélice enrolada uma sobre a outra, sob a forma de dupla hélice.

39

4.2 - Troponina É uma proteína com peso molecular de 76.000 formada por três subunidades que possuem funções especificadas bem distintas. Estas subunidades foram denominadas TnC (a que se liga ao Ca++), TnI (a que inibe a atividade ATPásica do complexo actinomiosina) e TnT (a que se liga à tropomiosina). A TnC tem peso molecular de 18.000. Pura, apresenta quatro sítios de ligação de Ca++ que podem ser divididos em duas classes: dois deles são sítios de alfa afinidade, os outros dois são sítios de afinidade menor. Entretanto, na troponina completa, ou mesmo quando se adiciona TnI à TnC, os quatro sítios passam a apresentar a mesma afinidade pelo Ca++. Além de se ligar a TnI é capaz de se ligar à TnT porém não é capaz de se ligar a tropomiosina ou F-actina. A ligação de Ca++, tanto à TnC pura quanto à troponina completa, acarreta mudanças conformacionais na molécula protéica. TnI - esta subunidade tem peso molecular de 20.000. É capaz de se ligar à TnC e à F-actina, porém não à tropomiosina. Apresenta a propriedade de inibir a atividade ATPásica magnésio-dependente da actomiosina sintética, esteja o Ca++ presente ou não. TnT - é a maior subunidade com peso molelcular de 37.000. é capaz de se ligar à TnC e à tropomiosina, mas não é capaz de se ligar à TnI ou F-actina. Sua função é ligar o restante da molécula de troponina ao filamento fino, ou mais especificamente, à tropomiosina.

MECANISMO DA CONTRAÇÃO MUSCULAR Antes de falar a respeito da contração, é necessário falar a respeito de potencial de ação. Quando um estímulo é aplicado o impulso nervoso é propagado através do potencial de ação. a propagação do P.A. prossegue-se despolarizando e repolarizando a membrana da célula nervosa. Na porção final do nervo (telodendro) existe vesículas que contém no seu interior o mediador químico - acetilcolina para o músculo esquelético. Estas vesículas estão carregadas negativamente fora e positivamente no seu interior. Por esta razão elas estão continuamente em repulsão com a face interna da membrana celular nervosa. Quando o potencial de ação chega à terminaçào nervosa e ocorre a inversão de cargas decorrente da despolarização pelo P.A., a vesícula se aproxima, se acopla à membrana e abre-se lançando na fenda sináptica o mediador químico. O mediador, assim ocupará seu receptor na membrana muscular gerando P. A. que será propagado através dos tubos T (invaginação da membrana muscular). Os túbulos T formam com duas vesículas do retículo sarcoplasmático um sistema denominado Tríade. No interior das vesículas do retículo sarcoplasmático existe vesículas contendo no seu interior Ca++ que será lançado no sarcoplasma, durante a propagação do P.A. através dos túbulos T, para que ocorra a transdução do impulso nervoso. O mecanismo pelo qual o estímulo elétrico determina a liberação do Ca++ a nível de Tríade ainda não está explicado. Com o lançamento do Ca++ para o sarcoplasma, este se ligará na TnC iniciando o processo de Contração Muscular. Na ausência do Ca++, o sítio de ligação da cabeça da miosina na actina está bloquado, ou seja, não é formado o complexo actinomiosina, não havendo pois, contração muscular. Com a liberação do Ca++ do Rs para o sarcoplasma e este se ligando à TnC leva a uma mudança de conformação de toda troponina, ocasionando o deslocamento da troponina para uma posição mais próxima à ranhura entre as actina, o que permite o acesso da cabeça da miosina (M) ao seu sítio de ligação-actina. O deslocamento da troponina ocorre ao longo de toda sua molécula. Observa-se com isso que o comprimento da banda A permanece constante, enquanto o comprimento da banda I e o da banda H varia proporcionalmente com o grau de encurtamento ou estiramento. O encurtamento é ocasionado pelo deslizamento dos filamentos finos por entre os grossos. Ocorre, também diminuição do sarcômero, com a aproximação progressiva das linhas z. A banda H vai desaparecendo pela aproximação das extremidades dos filamentos finos opostos e a banda I diminuindo proporcionalmente. Como o sarcômero existe em grande número e ao longo de toda fibra muscular, o encurtamento deste leva ao encurtamento da fibra, e portanto do músculo. O Ca++ liberado será logo rearmazenado para o RS, a sua ATPase transportadora, ocorrendo então o relaxamento muscular. Com o relaxamento, o sarcômero volta ao tamanho normal, assim como a fibra e o músculo. A banda H reaparece, a banda I retorna ao tamanho normal.

ESTÍMULOS

LIMIAR: estimúlo de qualquer tipo que possa desencadear uma resposta. SUBLIMIAR: estímulo que não é capaz de desencadear uma resposta. SUPRALIMIAR: Estímulo de força superior ao limiar, sendo portanto capaz de desencadear resposta. Os estímulos sublimiares quando são aplicados de maneira contínua eles podem se somarem e desencadear resposta. Em um estímulo supralimiar desencadeia uma coantração mais vigorosa do que um estímulo limiar, isto porque o número de fibras atingidas com o estímulo supralimiar é superior ao atingido pelo estímulo limiar. O mesmo não ocorre quando ambos são aplicados em uma única fibra muscular. Neste caso a resposta é a mesma para ambos os estímulos. BIBLIOGRAFIA 1 - VIEIRA-LACAZ, Francisco. biofísica. guanabara koogan. Rio de janeiro. 1981. OBS.: A maioria das informações citadas nesta apostila foram copiadas do livro acima citado.

40

INTRODUÇÃO A RADIOBIOLOGIA

I - INTRODUÇÃO O uso das radiações nos diversos campos da tecnologia humana traz consigo, ao mesmo tempo, benefícios e riscos. Para que sejam minorados os riscos e maximizados os benefícios deve-se compreender bem os efeitos biológicos das radiações, ou seja, a Radiobiologia. Desde o século passado que se notou a existência destes efeitos e, pela falta de conhecimetos básicos de Biologia houve dissociação entre os avanços científicos que pesquisaram as radiações sofreram no próprio organismo doenças resultantes destes efeitos. Após as explosões atômicas de Hiroshima e Nagasaki, foi que os efeitos biológicos das radiações começaram a ser amsi conhecidos com o estudo dos sobreviventes. A Radiobiologia se classifica em: - Radiobiologia das radiações ionizantes (Rx, raios gama, feixe de partículas aceleradas, etc) e Radiobiologia das radiações não ionizantes ou Fotobiologia (radiações ultravioleta).

II - ORIGEM E EVOLUÇÃO DA RADIOLESÃO Em um organismo exposto a um feixe de radiações ionizantes há o aparecimento de alterações (lesão) em diversos níveis de organização. De tal modo que, podemos estudar essas alterações em fragmentos moleculares, moléculas, organelas celulares, células, tecidos, órgãos e organismos. Os processos que originam as radiolesões podem ser classificadas em três fases: Fase Física - em que há transferência da energia da radiação para o organismo vivo, produzindo excitações moleculares e ionizações. Tem uma duração aproximada de 10

-13 s; Fase Físico-química - reações dos

produtos resultados da fase anterior, com o aparecimento de produtos secundários. Esta fase dura mais ou menos 10

-16 s; Fase Biológica - alterações nos processos bioquímicos do organismo como resultado das

reações ocorridas na fase física físico-química. Esta fase depende muiito das condições metabólicas do organismo e ainda, é nesta fase em que pode haver reparações das radiolesões. Pode durar de segundos a anos. As radiolesões podem lesar as células por dois mecanismos: mecanismo direto (em que a energia da radiação é transferida ao ADN) e mecanismo indireto (a energia da radiação é transferida à moléculas vizinhas ao ADN, como a água por exemplo).

III - EFEITOS DAS RADIAÇÕES SOBRE O ADN E AS PROTEÍNAS a) Efeitos das Radiações sobre o ADN - degradação das bases púricas e pirimídicas - rompimento das cadeias helicoidais, que pode ocorrer em apenas uma hélice (simples) ou nas duas (duplas) - rotura das pontes de hidrogênio - aparecimento de ligações inter e intramoleculares b) Efeitos das radiações sobre as proteínas - rotura da cadeia polipeptídica - rompimento das pontes de hidrogênio - alterações nos aminoácidos Estes efeitos levam a perda da atividade funcional das proteínas que pode ser medida através de atividade enzimática.

IV - RADIOSSENSIBILIDADE

A avaliação dos efeitos fisiológicos das radiações pode ser feita de diversas maneiras. Pode-se escolher, por exemplo, a incapacidade de divisão celular, o bloqueio da síntese de macromoléculas ou a parada na respiração. Mas, nem sempre apenas um desses critérios se presta para esta avaliação. Desse modo, o conceito de radiossensibilidade dos organismos vivos é muito variável, pois varia de acordo com o critério escolhido para se medir o efeito. Fatores que modificam a radiossensibilidade: Químicos - agem provavelkmente por intermédio de três mecanismos: por modificação da lesão inicial, por alteração dos processos de reparação ou por pertubações metabólicas celulares. Efeito oxigênio - em um sistema biológico, irradiado com radiações ionizantes, na presença de oxigênio sua radiossensibilidade aumenta. Sensibilidade por análogos de bases nitrogenadas - bactérias que se reproduzem na presença de alguns análogos de bases pirimídicas, como por exemplo o 5-bromouracil incorporam esses análogos em suas moléculas de ADN e apresentam maior radiossensibilidade. Proteção química - existem algumas substâncias que reduzem os efeitos das radiações nos organismos vivos, quando presentes no meio durante a irradiação. Dentre estas, cita-se vários compostos sulforados (cisteína, cisteamina, etc.), inibidores da atividade enzimática (NaCl), alguns hormônios e vitaminas. Físicos - existem alguns fatores físicos que podem alterar a radiossensibilidade de um organismo, tais como a temperatura com que as células destes organismos são incubadas e os fatores relacionados com a radiaçãso (dose, tempo de exposição, tipo de radiação, etc). Biológicos - o mais importante destes fatores é a presença e funcionalidade dos mecanismos de restauração. Outros fatores são o grau de diferenciação da célula e sua velocidade de

41

mitose (são mais radiossensíveis as células em multiplicação intensa, assim como a radiossensibilidade é inversamente proporcional ao grau de diferenciação celular).

V - MECANISMOS DE RESTAURAÇÃO DAS CÉLULAS São os meios através dos quais as células tentam corrigir o que foi lesado de seus componentes que interagiram com radiações. São classificados em três grupos: - restauração da biomolécula lesada por desapareci mento do radioproduto; - restauração por retirada do fragmento lesado e sua substituição por novo pedaço íntegro (Excisão); - a célula faz cópias dos fragmentos não alterados da biomolécula e, forma uma molécula normal (recombinação)

VI - EFEITOS SOMÁTICOS DAS RADIAÇÕES Os efeitos somáticos das radiações se classificam em: imediatos e retardados. Os imediatos são os que aparecem até 60 dias após a irradiação, e os que se manifestam depois deste tempo são os retardados. Os efeitos imediatos podem ser sub-classificados em gerais (quando todo o organismo é exposto às radiações) e localizados (quando apenas alguns tecidos, órgãos ou aparelhos são expostos às radiações).

VI-A) Efeitos Imediatos Gerais; Síndrome aguda de radiação Dose Letal Média (LD50(30)) - é a melhor forma de expressar a mortalidade provocada em uma população de animais irradiados. E a dose letal para 50% dos animais irradiados após 30 dias. Para o ser humano essa dose se encontra numa faixa de 250 a 450 rad. (ver página 04). Síndrome aguda de irradiação - os sintomas e sinais observados em indivíduos expostos a elevadas doses de radiação são dependentes da dose de radiação aplicada. Doses acima de 100.000 rad. acarretam morte imediata do organismo irradiado. Com doses entre 10.000 e 100.000 rad, em 1 a 2 dias haverá êxito letal, com o aparecimento de sintomas predominantes de uma síndrome do sistema nervoso central (excitabilidade, incordenação motora, alterações respiratórias e circulatórias, etc.). VI-B) Efeitos Imediatos Localizados - alterações no sistema hematopoético - pancitopenia devido à diminuição funcional da medula óssea. - no aparelho digestivo há modificações funcionais tais como anorexia, o alimento permanece mais tempo no estômago, diminuição da absorção dos alimentos, etc. - eritema e depilação.

VI - EFEITOS TARDIOS DAS RADIAÇÕES - carcinogênese - diminuição da vida média dos animais irradiados - efeitos no crescimento e desenvolvimento (malformações congêni tas) - efeitos localizados (cataratas, esterilizações, etc.) Efeitos somáticos das radiações Dificuldades do estudo em seres humanos. Não se pode fazer estudos em “cobaias” humanas naturais: - sobreviventes de Hiroshima e Nagasaki - sobreviventes em acidentes de reatores e usinas nucleares (Chernobil) - profissionais da área - pacientes de radioterapia (superdosagem de I

131 e outros)

- pessoas envolvidas em acidentes de contaminação radioativa (Goiânia-GO) - população de áreas de alto nível de radioatividade natural: Guarapari-ES, Araxá-MG, Morro velho-MG. Casos de leucemia (frequên- (Hiroshima) cia relati- va) (Japão) 1945 1960 Ano

42

Animal DL50 (30d) (rad) Homem 250-450 Cão 350 Camundongo 550 Macaco 600 Galinha 600 Sapo 700 Rato 750 Coelho 800 Pardal 800 Tartaruga 1.500 Peixe Dourado 2.500

Síndrome Aguda de Irradiação S Efeitos tardios O 100d Síndrome do S.H. B R 10d Síndrome do S.G.I. E 1d Síndrome do S.N.C. V 1h I Morte molecular D A 500 1000 10000 100000 Dose (rad) 100 F r r e e l q a u t ê i n v c a i (%) a Pre-implantação Organogenese Feto (Época de irradiação) 1 - Anomalias (SNCl, olhos, esqueleto) 2 - Morte pré-natal 3 - Morte neo-natal ou efeitos tardios (catarata, esterilidade) Exercício - Introdução à radiobiologia 01 - Justifique a necessidade do estudo da Radiobiologia? 02 - O que é radiolesão? Quais suas faces? 03 - Quais as alterações que as radiações provocam no ADN e nas proteínas? 04 - De que modo a radiossensibilidade de um organismo pode ser medida? 05 - Cite três fatores que modificam a radiossensibilidade de um organismo. 06 - Qual a necessidade de uso de complexo vitamínico por um paciente que está fazendo radioterapia? 07 - como as células procuram reparar as radiolesões? 08 - O que é Dose Letal Média (LDP (30))? E seu valor para o ser humano? 09 - De que depende uma síndrome de irradiação? Exemplifique. 10 - Cite quatro efeitos tardios das radiações.

QUESTIONÁRIO PROTEÇÃO RADIOLÓGICA

01 - Qual o objetivo da proteção Radiobiológica? 02 - Que vem a ser Radiação de Fundo? Qual sua origem? 03 - A que se deve a exposição interna? 04 - Quais as medidas práticas que se deve tomar para evitar exposições interna? 05 - A que se deve a exposição interna? 06 - Quais os fatores básicos de proteção contra as radiações externas?

43

07 - Qual o símbolo usado para denotar presença de radiação? 08 - Dê os limites anuais de dose Equivalente Efetivo de Dose para: a) trabalhadores b) indivíduos do público 09 - Dê os limites de Equivalente de Dose para: a) trabalhadores b) indivíduos do público Sequência dos acontecimentos no Desenvolvimento de Lesão por radiolesão Estágio 1 processo físico de absorção da radiação ionizante; Tempo: 10

-16 a 10

-12s ionização e excitação dos átomos.

Estágio 2 Tempo: Milissegundos - reações químicas iniciais. Estágio 3 alterações de moléculas biologicamente importantes. Tempo: segundos a horas. Estágio 4 fenômenos biológicos: mutações efeitos não letais; Tempo: horas a anos. Efeitos letais. Radiólise da Água Pierre Curie verificou a produção de Hidrogênio e Oxigênio em solução de sais de rádio como consequência da interação das partículas alfa com as moléculas de água. Mais tarde, foi detectada a formação de peróxido em soluções aquosas irradiadas e caracterizada a formação de radicais livres. Radical livre - é um átomo, ou molécula que possui um ou mais elétrons não emparelhados, que os assegura alta reatividade química. OH OH- OH OHÁ ionte hidroxila radical livre hidraxil -Radiólise da água ausência de Oxigênio. H2O H2O+ + é é . H2O H2O

-

H2O+ + H2O H

+ + H2O + OHÁ

H2O

- + H2O OH

- + H2O + HÁ

---------------------------------------------------------------------------------- H2O + hf HÁ + OH- -Radiólise da água em presença de oxigênio. e

- + O2 O2

-

O2

- + H2O OH

- + HO2Á

HÁ + O2 HO2Á OHÁ + H2O2 H2O+ + HO2Á OBS: Os radicais formados em presença de Oxigênio são 3 vexes mais reativas. ORIGEM DAS LESÕES INDUZIDAS PELAS RADIAÇÕES As lesões são induzidas por: - Efeitos diretos: A energia da radiação é transferida para o ADN, modificando-lhe a estrutura; - Efeitos indiretos: a energia é transferida para uma molécula intermediária (água, por exemplo) cuja radiólise acarreta formação de produtso altamente reativos, capazes de lesar o DNA.

44

Direto Indireto Os efeitos diretos e indiretos variam em função de diversos fatores: - temperatura; - teor de água; - teor de oxigênio; - presença de outras osmolaridades que possam “capturar”os produtos de radiólise da água; - etc.

RADIOSSENSIBILIDADE RELATIVA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS Radiossensiblilidade Tipo celular Características relativa elevada Células primordiais vida curta indiferenci- hematopoéticas, ada, divide-se regular espermatogônias, -mente. células das cristas intestinais. pouco elevada células precursoras da divide-se limitada de série hematopoética. vezes; diferenciada até certo grau. média células endoteliais, divide-se irregularmen- fibroblastos. te, período de vida mui -to variável. pouco baixa células epiteliais vida longa; não se divi do fígado, rim, glându- -de frequentemente; la salivar, etc. grau variável de dife- renciação. baixa neurônios, eritrócitos, não se divide; altamen células musculares, -te diferenciada. etc. RADIAÇÕES IONIZANTES DE IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA Raios-Gama - ondas eletromagnéticas de alta energia (sem carga). - produzidas por desintegração radioativa. Partículas Beta - emissões particuladas; carregadas; leves. - produzidas por desintegração radioativa ou por aceleradores. Partículas Alfa - emissões particuladas; carregadas; pesadas. Raios X - ondas eletromagnéticas de alfa energia (sem cargas). - produzidas em tubos de raios X. Prótons, Dêuterons Núcleos Pesados - emissões particuladas, carregadas, pesadas. - produzidas por aceleradores. Nêutrons - emissões particuladas, sem carga, pesadas. - produzidas por aceleradores. Mésons PI (Íons Negativos) - emissões particuladas, carregadas, mais pesadas que betas e mais leves que prótons. - produzidas por aceleradores.

45

EFEITOS BIOLÓGICOS DA RADIAÇÃO Nível de organização Tipo de lesão Efeitos importantes Células aberrações cromos- morte celular, inibi- sômicas, mutações. ção da divisão celu- lar; transformação p/ estado maligno. Tecido hipoplasia; trans- rotura na função formação de célu- tissular; morte: in- las p/ estado ma- dução de câncer. ligno. Corpo inteiro lesão do sistema - óbito. hematopoético,gas- trintestinal, nervoso central. transformaçào do - câncer tecido para estado maligno. CLASSIFICAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS CAUSADOS POR RADIAÇÕES - Efeitos Estocásticos: sào aqueles cuja ocorrêcia depende da dose recebida, sem limiar (ex.: mutações genéticas e câncer). - Efeitos não estocásticos: são aqueles cuja severidade do dano aumenta com a dose. É possível se estabelecer uma dose llimiar. - Efeitos Hereditários ou Genéticos: danos nas células dos órgãos reprodutores, e surgem somente no descendente da pessoa irradiada. Têm caracter acumulativo (Estocástico). - Efeitos Somáticos: danos das células do corpo da própria pessoa irradiada. Depende: da dose total absorvida; da taxa de absorção da região e área do corpo; e do valor da dose limite. Os efeitos somáticos pode ser: a) Imediatos: são aqueles de aparecimento rápido (de hora a semanas), após exposição aguda. b) Retardados: são aqueles que surgem depois de anos ou mesmo décadas. SÍNDROME DE IRRADIAÇÃO AGUDA APÓS EXPOSIÇÃO DE CORPO INTEIRO Sistema Nervoso Central - Síndrome SNC - Principal órgão determinante: cérebro. Lilmiar da síndrome: 2.000 R. Latência da síndrome: ¼ h a 3 h. Limiar do óbito: 5.000 R. Tempo de óbito: 2 dias. Sinais e sintomas: letargia, tremores, convulsões, ataxia. Sistema Gastrintestinal Principal órgão determinante: Intestino Delgado. Limiar da Síndrome: 500 R. Latência da síndrome: 3 a 5 dias. Limiar de óbito: 1.000 R. Sinais e sintomas: mal-estar, anorexia, nálseas, vômitos, diarréia, disfunção G1, mfebre, desidratação, perda de eletrólitos, colapso circulatório. Síndrome Hematopoética Principal órgão determinante: medula óssea. Limiar da sídrome: 100 R. Latência da síndrome: 2 a 3 semanas. Limiar de óbito: 3 a 8 semanas. Sinais e sintomas: mal-estar, febre, dispnéia, fadiga, leucopenia, trombopenia, púrpura. RADIOSSENSIBILIDADE TISSULAR RELATIVA Sensibilidade relativa. Tecidos ---------------------------------------------------------------------------------------------- Elevada Epitélio linfóide, hematopoético,espermato- gênico, epitélio intestinal. Pouco elevada no epitélio estratificado oro- faríngeo, epitélio epidérmico. Média Tecido conjuntivo intersticial, vascular del- gado, cartilagem ou osso em crescimeto. Pouco baixa Cartilagem ou osso maduro, epitélio hepáti

46

-co, epitélio renal, pancreático, tiróideo e supra-renal. Baixa Tecido muscular neuromuscular. ----------------------------------------------------------------------------------------------

47

CROMATOGRAFIA I - INTRODUÇÃO A cromatografia é um método físico-químico muito utilizado na análise qualitativa de misturas homogêneas como, por exemplo, extratos de tecidos animais ou vegetais. O método se baseia no carreamento da mistura por uma fase móvel, que pode ser um fluido líquido ou gasoso, através de outra fase essencialmente fixa ou estacionária, que pode ser um sólido ou um líquido preso em um suporte. As substâncias de misturas se distribuem entre as duas fases de acordo com os seus coeficientes de particão ou de adsorção. A técnica consiste em depositar a mistura na fase fixa e fazer passar através desta a fase móvel. As substâncias que possuem maior afinidade com a mesma a uma velocidade tanto maior quanto for a afinidade com essa fase. As substâncias que tiverem maior afinidade com a fase fixa permanecerão próximo do ponto onde aplicadas, ou seja, se deslocarão com uma velocidade tanto menor quanto maior for a interação ou afinidade com a fase fixa. É como se a fase fixa “segurasse” as substâncias que lhe são afins e a fase móvel carreasse as outras, promovendo, desse modo, a separação das mesmas. II - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO Quando a fase fixa é constituída por sólido poroso ou finamente granulado (sílica, carbonato de cálcio, óxido de alumínio, carvão, amido, etc) a cromatografia é dita de ADSORÇÃO porque se baseia na maior ou menor capacidade de adsorção dos componentes da mistura sobre a superfície do sódio que é chamado adsorvente. Quando a fase móvel flui através do sólido, vai carreando as substâncias menos adorvidas, promovendo assim a resolução da mistura. Algumas condições devem ser observadas nesse tipo de cromatografia, especialmente com relação às características da substância usada como adsorvente que: 1 - deve ser insolúvel na fase móvel 2 - não deve sofrer nenhuma alteração de natureza química durante o processo 3 - não deve reagir quimicamente nem com a fase móvel e nem com as substâncias componentes da mistura. Não se poderia, por exemplo, fazer uma cromatografia de partição utilizando a água como fase móvel e a sacarose como adsorvente porque quando se iniciasse o processo a fase móvel iria dissolvendo a fase fixa. A cromatografia de adsorção pode ser efetuada utilizando-se basicamente duas técnicas: a) Cromatografia em camada fina na qual a fase fixa (o adsorvente) é distribuído homogeneamente em finas camadas sobre uma placa de vidro (lâmina de microcópio, por exemplo). A mistura a ser resolvida é colocada próxima a uma das extremidades da placa que, em seguida, é mergulhada ou colocada em contato com a fase móvel. Por capilaridade a fase móvel vai ascendendo na fase fixa e, ao atingir a mistura, inicia o processo de separação. A) B) suporte fase móvel fase fixa fase fixa (adsorvente) componen- mistura tes da mistura fase móvel suporte b) Cromatografia em coluna. Nesse caso o adsorvente é colocado em colunas de vidro. A mistura de substância é adsorvida no topo da coluna e, em seguida, passa-se a fase móvel através do adsorvente. Esse aranjo permite que as frações (componentes da mistura) possam ser coletadas separadamente quando saem na outra extremidade da coluna. A cromatografia em coluna permite ainda a utilização de gases como fase móvel. III - CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO Coeficiente de partição Uma substância colocada em contato com um sistema bifásico constituído por dois líquidos imisíveis se distribuirá entre eles de acordo com a maior ou menor afinidade ou solubilidade que possua em relação ao par de líquidos empregados. Esse fenômeno é denominado PARTIÇÃO porque indica o modo como se distribue ( ou como se “parte”) um mesmo soluto em relação a dois solventes imisíveis. Para cada substância pode-se definir um coeficiente de partição (alfa) que corresponde à razão entre as concentrações (não é entre as quantidades !!) do soluto na fase superior (Cs) e na fase inferior (Ci).

48

Cs Solvente 1 Cs a = ----------- Ci Ci Solvente 2 Em relação a um determinado par de solvente imisível, o coeficiente de partição é característica de cada substância e depende apenas da temperatura. Normalmente, o par de solvente utilizado é constituído por um líquido de natureza polar e outro de natureza apolar. Isto é necessário porque se os dois solventes tiverem a mesma natureza, provavelmente serão miscíveis, o que impediria o fenômeno da partição. A distribuição de uma mistura em relação ao par de solvente é também determinado pela natureza dos componentes da mistura: as substâncias de natureza apolar se dissolverão mais (não é somente !!) no solvente apolar e as de natureza polar, no solvente polar. Cromatografia de Partição A Cromatografia de Partição se ba- seia no fenômeno da partição, mais espe- cificamente, nas diferenças entre os coe- suporte ficientes de partição dos componentes de (papel) uma mistura em relação a um par de sol- ventes imisíveis. fase fixa A técnica consiste em tomar imóvel (água) um dos solventes, no qual é colocada a mistura, e fazer passar através deste o ou- mistura tro solvente, que será a fase móvel. A i- mobilização de um dos solventes é conse- fase móvel guido por meio da fixação do mesmo em (butanol) um suporte sólido, que pode ser uma tira de papel de filtro, uma fina camada de sílica ou uma coluna de material poroso. IV - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA Nesse tipo de cromatografia a fase fixa é constituída por uma resina porosa que contém grupamentos ionizáveis que podem adquirir cargas positivas ou negativas: /---------------------\ | v | R ---- SO3 - Na+ NH4+ Cl- ^ | | \----------------------/ R ---- SO3 - Na+ NH4+ Cl- fase fixa fase móvel V - CROMATOGRAFIA POR FILTRAÇÃO EM GEL Não é exatamente um processo de cromatografia. Trata-se na verdade de uma ultrafiltração ao inverso utilizando-se pequenas esferas porosas com filtros ou peneiras moleculares. A técnica consiste em embeber os grãos de gel (“fase fixa”) e colocá-los em uma coluna de vidro. A mistura de substância a serem separadas é colocada no topo da coluna e em seguida passa-se a fase móvel que pode ser água ou uma solução apropriada. A separação se processa de acordo com a forma e o diâmetro das substâncias da mistura. As moléculas maiores saem “na frente” ao contrário do que ocorreria numa filtração convencional. Isto ocorre porque as moléculas pequenas, pelo fato de poderem penetrar nos poros dos grãos de gel têm um percurso maior que as moléculas maiores que passam “por fora”dos grãos de gel.

49

CROMATOGRAFIA POR FILTRAÇÃO EM GEL Fase móvel Grãos de gel Mistura (ampliado) Fase fixa (grãos de gel) Suporte

50

ELETROFORESE I - INTRODUÇÃO A eletroforese consiste na migração de substâncias carregadas eletricamente, quando submetidas à ação de um campo elétrico externo. Foi desenvolvida inicialmente por Tiselius, em 1937, e tem grande utilidade na análise qualitativa de misturas homogêneas. Na área biomédica, sua aplicação é bastante ampla, indo desde pesquisas mais simples sobre a composição de sistemas ou líquidos biolóagicos até como método auxiliar no diagnóstico e prognóstico de diversas patologias humanas. Na clínica médica, por exemplo, a eletroforese é um dos exames fundamentais no estudo de alterações das proteínas plasmáticas do organismo. II - PRINCÍPIO DO MÉTODO É uma lei geral de Eletricidade, o fato de que cargas elétricas de sinais opostos se atraem e cargas elétricas de mesmo sinal se repelem. Assim, partículas com carga elétrica livre, quando submetidas a um campo elétrico, serão atraídas pelos polos opostos às suas cargas, ou seja, as partículas carregadas positivamente (cátions) serão atraídas pelo polo negativo (CÁTODO) e as partículas carregadas negativamente(ânions) serão atraídas pelo polo positivo (ÂNODO). Se não existir algum fator que impeça o livre deslocamenmto das partículas, a ação do campo elétrico fará com que elas migrem em direção aos respectivos polos de atração. Isto pode ser conseguido, por exemplo, colocando-se as partículas em solução ou suspensão, como mostra o esquema abaixo: . . . . . . (-) (+) (-) (+)

A+ B-

A+ A+A+

B-

B-

B-

A+B-

A+B-

A+ A+ B-

B-

Após algum tempo de aplicação do campo elétrico, as partículas positivas estarão mais concentradas em torno do CÁTODO e as partículas negativas em torno do ÂNODO. Obtém-se assim, uma separação entre partículas de cargas opostas. A velocidade de migração das partíclas em direção aos pólos de atração é diretamente proporcional à força elétrica exercida pelo campo elétrico sobre cada partícula e inversamente proporcional à viscosidade e força iônica do meio. A lei de Columb estabelece que a força elétrica exercida sobre cada partícula depende da intensidade do campo elétrico e da quantidade de carga elétrica livre da partícula. São, portanto, três os fatores que determinam a velocidade de migração de uma partícula num experimetno eletroforético: - a viscosidade e força iônica do meio - a intensidade do campo elétrico (voltagem) - a quantidade de carga elétrica efetiva da partícula Na prática, as partículas analisadas por eletroferese, são submetidas a um campo elétrico constante e se deslocam num meio de força iônica e viscosidade também constantes. Nessas condições, a velocidade de migração vai depender fudamentalmente da quantidade de carga elétrica efetiva das partículas. Consequentemente, a eletroforese pode ser usada, não somente para separar partículas de cargas elétricas opostas, mas também, para separar partículas de carga elétrica de mesmo sinal, desde que as mesmas estejam em quantidades diferentes. ... ... ( - ) ( + ) ( - ) ( + ) C= C= A+ B- C= A+ A+ A+ A+ B- C= B- C= B- B- A+ B- C= B- A+ C= A+ B- C= Note no esquema acima, as partículas C= se deslocarão com uma velocidade maior que as partículas B- e, num determinado instante, poderão estar totalmente separadas. O volume, a forma e a massa molecular das partículas são outros fatores menos importantes, que também podem influir na velocidade de migração. III - TIPOS DE ELETROFORESE

51

III.1 - Eletroforese Livre Nesta técnica eletroforética, as partículas se deslocam livremente no meio condutor; daí porque é chamada eletroforese livre. A eletroforese livre tem aplicação no estudo analítico de macromoléculas mas apresenta algumas desvantagens: permite a ampla difusão das partículas e dificulta a obtenção isolada das frações separadas. Além disso, a passagem da corrente elétrica, aquecendo o líquido condutor, promove movimentos de convecção que interferem na migração das partículas. III.2 - Eletroforese em Suporte Neste caso, a migração das partículas se faz sobre um suporte sólido ou semi-sólido, embebido no líquido condutor e mergulhado pelas extremidades em cubas que comtêm os eletrodos. O esquema abaixo mostra um modelo de eletroforese em suporte: . . . amostra suporte ( - ) ( + ) A mistura de substâncias (amostras) é coletada na parte central do suporte. De acordo com as cargas efetivas das partículas, estas migrarão para os pólos positivo ou negativo e, após algum tempo, estarão localizadas em pontes diferentes do suporte, constituindo as chamadas “frações”ou “zonas”. amostra ponto de aplicação ( - ) ( + ) A eletroforese em suporte é também denominada eletroforese de zona ou anticonvectante. Como suporte, foram empregadas inicialmente, tiras de papel de filtro. Em seguida vieram o acetato de celulose e os géis de ágar, amido e acrilamida. O papel permite a separação de cinco (5) frações de proteínas do soro humano, após cerca de dezesseis (16) horas de aplicação de um campo elétrico apropriado. Com os géis de amido e acrilamida, chega-se a obter até vinte (20) frações em uma ou duas horas. Uma grande vantagem da eletroforese em suporte é que, após a migração, as frações permanecem isoladas e podem ser retiradas separadamente ou fixadas ao suporte. Substâncias incolores podem ser reveladas, no próprio suporte, por meio de reações características com corantes adequados. Além disso, a coloração das frações permite uma avaliação quantitativa da amostra por meio da densitometria. IV - ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Atualmente, todos os tipos de substâncias podem ser separadas por eletroforese. Mesmo as que não possuem carga natural, podem adquirí-la por meio de reações com grupamentos ou radicais ionizados. Os glicídios por exemplo, formam complexos com o íon borato e podem então ser analisados por eletroforese. É, no entanto, no estudo das proteínas que a eletroforese se constitue num método físico-químico valioso para separar e analisar misturas dessas macromoléculas, determinar suas mobilidades e caracterizá-las. Além disso, a composição protéica quantitativa de um sistema biológico, como o soro sanguíneo por exemplo, revela importantes dados sobre o estado geral do animal. As proteínas são heteropolímeros (macromoléculas) constituídas por centenas a milhares de monômeros chamados aminoácidos, que obedecem à fórmula geral: H H \ / N O | / / R -- C -- C | \ H OH Os aminoácidos apresentam, portanto, um radical amina ( -NH2 ) e um radical carboxila ( -COOH ) ligados a um mesmo átomo de carbono. Na formação das proteínas, a carboxila de um aminoácido reage com o grupamento amina do aminoácido seguinte, formando as chamadas ligações peptídicas: ... H \ / N O | / / R1 -- C -- C a | \ H N O

52

| / / R2 -- C -- C b | \ ..................... H : OH H : H ................. \ / N O | / / R3 -- C -- C | \ H OH H H \ / N | . . . . . . No esquema anterior, a letra b mostra a formação de uma ligação peptídica, e a letra a mostra uma ligação já formada. Os diversos aminoácidos existentes na natureza diferem entre sí pelo radical lateral R. De acordo com o caráter ácido-básico desse grupamento, os aminoácidos podem ser classificados em três categorias: I - Monoácido-monobásico, quando R é neutro II - Diácido-monobásico, quando R tem caráter ácido III - Monoácido-dibásico, quando R tem caráter básico Uma nomeclatura mais simples, embora não muito correta, poderia classificá-la em aminoácidos neutros, ácidos e básicos, respectivamente. O esquema a seguir, apresenta exemplos de aminoácidos de cada uma das categorias: H H \ / N O | / / H -- C -- C GLICINA ( I ) | \ H OH H H \ / O N O \ \ | / / C -- CH2 -- C -- C ÁCIDO ASPÁRTICO ( II ) / | \ HO H OH H H \ / H N O \ | / / N -- ( CH2 )4 -- C -- C LISINA ( III ) / | \ H H OH Devido à presença na sua estrutura de, pelo menos, um grupamento básico ( -NH2 ) que pode captar prótons ( H+ ), e um grupamento ácido ( -COOH ) que pode doar prótons ( H+ ), os aminoácidos se comportam como substâncias anfóteras, isto é, podem doar ou captar prótons na dependência do meio em que se encontram. Tudo depende da “oferta” : uma solução que oferece uma alta concentração de H+, isto é, um baixo pH, dificulta a liberação de prótons (H+) pelo grupo carboxila que permanece na forma de -COOH, e facilita a captação dos mesmos pelo grupo amina (-NH2) que passa para a forma de -NH3

+. Elevando-se

gradativamente o pH, isto é, diminuindo-se a concentração de H+, o grupo carboxila (-COOH) começa a

liberar prótons, passando para a forma -COO-, mas o grupo amina continua protonado (-NH3+). Por fim, em concentrações hidrogeniônicas ainda baixas, o grupamento - NH3+ começa a perder prótons para a solução, passando para a forma desprotonada (-NH2). Ao liberar prótons (H+), o grupo carboxila (-COOH) adquire carga negativa (-COO-) enquanto o grupo amina (-NH2), ao captar prótons, aquire carga positiva (-NH3+). Desse modo, os aminoácidos podem apresentar carga elétrica efetiva nula, negativa ou positiva, dependendo da “oferta” de H+ pela solução onde são colocados. Um aminoácidos “neutro”, como a glicina, poderia adquirir três configurações dependendo do pH, ou seja, da concentração de H+ da solução onde é colocado: NH3+ NH3+ NH2 H+ | | |

53

H __

C __

COOH H __

C __

COO- H __

C__

COO- | | | H H H+ H (A) (B) (C) <-------------------------------------------------------------------------------------------> aumento de pH ou diminuição da concentração de H+ Quando a glicina é colocada em solução de pH muito baixo (A), ou seja, em uma alfa concentração de H+, tanto o radical amina como o radical carboxila estão protonados. Nessas condições, o aminoácido adquire carga elétrica positiva pois o grupo carboxila apresenta carga nula mas o grupo amina está carregado positivamente. Em pH muito alto (C), devido à carboxilação de H+, tanto o grupo amina quanto o grupo carboxila liberam prótons (H+) para a solução. O aminoácido adquire então carga elétrica negativa pois, agora, o grupo amina apresenta carga nula mas o grupo carboxila está carregado negativamente. Num pH intermediário (B), a concentração hidrogeniônica será o suficiente para permitir a liberação de prótons pelo grupo carboxila mas mantém o grupo amina protonado. Nessa situação, o aminoácido apresenta-se sob a forma dipolar (ZWITTERIONICA) com carga elétrica efetiva nula pois o grupo carboxila está carregado negativamente e o grupo amina positivamente. A formação do zwitteríon é possível porque o grupamento -NH3+ é um ácido mais fraco que o -COOH, de modo que a ionização completa de cada um se efetua em diferentes valores de pH. O pH no qual o aminoácido adquire a forma dipolar, isto é, apresenta cargas elétricas negativas e positivas equivalentes, é denominado PONTO ISOELÉTRICO(pI) desse aminoácido. Cada aminoácido tem um pI específico. Quando colocado em uma solução de pH igual ao seu pI e submetido a um campo elétrico, o aminoácido não sofre migração para nenhum dos pólos pois, nessas condições, apresenta carga elétrica efetiva nula. O ponto isoelétrico (pI) funciona como um pH “neutro” para o aminoácido, isto é, equivale à concentração de H+ na qual as forças ácidas e básicas do aminoácido são equivalentes. Se o aminoácido é colocado num pH maior que seu pI, ou seja, num pH “básico”, ele funciona como ácido, libera (perde) prótons (H+) e adquire carga elétrica negativa. Quando colocado em um pH menor que seu pI, ou seja, num pH mais “ácido”, o aminoácido funciona como base, capta (ganha) prótons(H+) e adquire carga elétrica positiva. Os aminoácidos “neutros” (monoácido-monobásico) apresentam pI próximo de 7, geralmente menor. É o caso da glicina que tem pI = 6,1. Os aminoácidos “ácidos” (diácido-monobásico) devem apresentar pI baixo (menor que 7) porque a concentração hidrogeniônica deve ser alta o suficiente para manter um dos dois grupos carboxilas na forma protonada (-COOH). O ácido aspártico, por exemplo, tem pI = 2,0. Com os aminoácidos “básicos” (monoácido-dibásico) ocorre o inverso: o pI deve ser maior que 7, isto é, a concentração hidrogeniônica da solução deve ser baixa o suficiente para permitir que um dos grupos amina esteja na forma desprotonada. O pI da lisina, por exemplo, vale 10. O esquema a seguir mostra as configurações que podem ser adquiridas pelos aminoácidos glicina (GLI), o ácido aspártico (ASP) e lisina (LIS), relacionadas com uma escala de pH de 0 a 14: 0 7 14 \-----------------------------------------------------------------------------------/ GLI ^ | H H H | | | H - C - NH3+ <==> H - C - NH3+ <==> H - C - NH2

| | | COOH COO- COO- 0 7 14 \----------------------------------------------------------------------------------- / ASP ^ | COOH COOH COO- COO- | | | | CH2 CH2 CH2 CH2 | | | | H - C -NH3

+ <=> H - C - NH

+3 <=> H - C - NH

+3 <=> H - C - NH2

| | | | COOH COO- COO- COO-

54

0 7 14 \-----------------------------------------------------------------------------------/ LIS ^ | NH

+3 NH

+3 NH

+3 NH2

| | | | (CH2)4 (CH2)4 (CH2)4 (CH2)4 | | | | H - C - NH3

+ <==> H - C - NH3

+ <==> H - C-NH2 <=> H-C-NH2

| | | | COOH COO- COO- COO- As setas indicam o pH no qual, cada aminoácido adquire a forma zwitteriônica. Se colocássemos uma mistura de glicina, ácido aspártico e lisina no centro de um suporte embebido em um tampão de pH igual a 6,1 e aplicássemos um campo elétrico às extremidades do suporte, teríamos as seguintes ocorrências: - a glicina permaneceria no ponto de aplicação pois está exposta a um pH igual ao seu pI (carga nula) - o ácido aspártico migraria para o polo positivo pois está exposto a um pH maior que o seu pI, no qual funciona como ácido (perde H+, adquirindo carga negativa)

- a lisina migraria para o polo negativo pois está exposta a um pH menor que o seu pI, no qual funciona como base (ganha H+, adquirindo carga positiva)

O esquema abaixo mostra a localização que teriam os aminoácidos, após a aplicação do campo elétrico por um tempo apropriado:

ponto de aplicação ( - ) pH=6,1 ( + ) LIS

+ GLI

0 ASP

-

Utilizando-se um tampão de pH = 10, em vez de 6,1, a lisina teria carga nula e não migraria para nenhum dos pólos. A glicina e o ácido aspártico migrariam ambos para o pólo positivo pois estão colocados em um pH maior que seus pontos isoelétricos. No entanto, a separação entre eles ainda seria possível pois a glicina teria uma carga negativa enquanto o ácido aspártico teria duas, de modo que suas velocidades de migração seriam diferentes. O esquema abaixo mostra o resultado que seria obtido:

ponto de aplicação ( - ) pH=10 ( + ) LIS

0 GLI

- ASP

=

De um modo geral, a velocidade de migração (v) é diretamente proporcional à diferença entre o pI do aminoácido e o pH do tampão, e inversamente proporcional à massa molecular (MM) do aminácido: ( pI - pH ) v = k . --------------- MM O comportamento eletroforético das proteínas é semelhante ao dos aminoácidos. Apesar de que, na formação das ligações peptídicas, isto é, na formação da cadeia protéica, os grupamentos amínicos de um aminoácido são neutralizados definitivamente pelos grupamentos carboxílicos do aminoácido seguinte, sobram dois grupamentos terminais: um grupo amina numa extremidade e um grupo carboxila na outra. Além disso, os radicais laterais ® dos aminoácidos “ácidos” ou “básicos” ficam livres para doar ou receber prótons (H+) da solução e fornecer diferentes qualidades e quantidades de cargas elétricas à proteína. Como os aminoácidos, as proteínas aparesentam também pontos isoeétricos. A diferença é apenas quantitativa: enquanto os aminoácidos apresentam apenas uma carga negativa e uma positiva, no ponto isoelétrico (pI), uma proteínas pode apresentar, por exemplo, quarenta (40) cargas positivas e quarenta (40) negativas.

55

No ponto isoelétrico, a “oferta”(concentração) de H+ pela solução faz com que a quantidade de grupamentos básicos protonados (carga positiva) seja igual à quantidade de grupamentos ácidos desprotonados (carga negativa), de modo que a carga elétrica efetiva da proteína seja nula. Nessa situação, a proteína não migra para nenhum dos polos. Colocando-se em um pH maior que seu pI, ou seja, com uma “oferta” menor de H+, a proteína perde H+ para a solução. Perder H+ significa perder cargas positivas e, assim, a proteína fica com carga residual negativa. Quanto mais distante estiver o pI do pH da solução, mais fraca será a “oferta” de H+ e mais prótons (H+) a proteína perderá para a solução. Consequentemente, maior será sua carga negativa e maior sua velocidade de migração em direção ao ânodo. Em valores de pH menores que o pI, a “oferta” de H+ pela solução será cada vez maior. A proteína, então, captará cada vez mais prótons, adquirindo carga positiva cada vez maior. A velocidade de migração, por sua vez, será também cada vez maior. A diferença entre o pI da proteína e o pH da solução (pI - pH) pode ser usada como regra simples para se avaliar a qualidade (se negativa ou positiva) e a quantidade relativa de cargas elétricas adquiridas pela proteína. Suponhamos quatro proteínas X, Y, V e Z, de pontos isoelétricos respectivamente iguais a 4, 6, 7 e 9, colocadas em um tampão de pH = 7. As diferenças pI - pH valerão: X : pI - pH = 4 - 7 = -3 Y : pI - pH = 6 - 7 = -1 V : pI - pH = 7 - 7 = 0 Z : pI - pH = 9 - 7 = +2 As proteínas X e Y apresentariam cargas negativas porém, a quantidade de cargas presentes na proteína X seria maior que na proteína Y. A proteína V teria carga nula e a proteína Z teria carga positiva. A velocidade de migração das proteínas é também influenciada pela massa molecular mas, depende fundamentalmente da quantidade de carga elétrica efetiva da partícula. Assim, a diferença pI - pH também serve para se avaliar a velocidade de migração das partículas e sua localização no suporte. Nas condições citadas anteriormente, as proteínas X, Y, V e Z, submetidas a uma eletroforese, apresentariam a seguinte disposição: Ponto de aplicação (-) pH=7 Z V Y X Colocadas em pH = 10, todas as proteínas migrariam para o polo positivo (ânodo), mas com diferentes velocidades, proporcionais às diferenças pI - pH de cada um. V - APLICAÇÕES BIOMÉDICAS Apesar da multiplicidade de proteínas existentes no plasma humano, a eletroforese permite classificá-las em frações principais que apresentam propriedades físico-químicas semelhantes. Comumente, a classificação é efetuada com base na eletroforese em papel ou acetato de celulose, que separa as proteínas plasmáticas em seis frações principais. A tabela apresentada na página seguinte relaciona as seis principais frações protéicas do plasma, juntamente com seus pontos isoelétricos:

____________________________________________________________________

FRAÇÃO pI

____________________________________________________________________

Albumina 4,7 a1 - globulina 4,8 a2 - globulina 4,9 B - globulina 5,2 Fibrinogênio 5,3 Y - globulina 6,3

____________________________________________________________________

56

Utilizando-se o soro sanguíneo, em lugar do plasma, obtêm-se apenas cinco frações pois o fibrinogênio está. Dependendo das condições da eletroforese, o acetato de celulose permite a subdivisão da fração B em B1 - globulina e B2 - globulina. Para fins de análise clínica, a eletroforese de proteínas do soro é efetuada utilizando-se o acetato como suporte, equilibrado com um tampão de pH = 8,6. Nessas condições, todas as frações proteícas apresentarão carga negativa e migrarão para o ÂNODO (pólo positivo). A velocidade de migração, como vimos, será proporcional à diferença pI - pH, para cada fração, e estará em ordem decrescente da albumina para a gama-globulina. Após coloração apropriada, um eletroforetograma de soro humano normal, apresenta o seguinte aspecto: Ponto de aplicação Eletroforetograma (soro, pH = 8,6) (-) (+) A A d p

a2

a1

perfil eletroforético Por meio de aparelhos denominados DENSITÔMETROS, pode-se analisar e registrar a intensidade relativa de cor de cada fração. Com isto, obtém-se o perfil eletroforético do soro ( pág. anterior), que possibilita o cálculo da proporção percentual de cada fração em relação ao total. Sabendo-se a concentração total de proteínas, que pode ser obtida facilmente por fotoabsorciometria, pode-se fazer uma avaliação qualitativa e quantitativa bastante segura do estado geral do paciente. Em condições normais, a concentração total de proteínas no soro humano é de 6 a 8 g%. As concentrações reais (em g%) de cada fração são apresentadas na tabela a seguir: ---------------------------------------------------------------------------------------------- | CONCENTRAÇÃO FRAÇÃO ----------------------------------------------- | g% % ---------------------------------------------------------------------------------------------- 2 Albumina | 4.5 - 5.5 | 52.0 - 68.0 ---------------------------------------------------------------------------------------------- | a1 | 0.2 - 0.4 | 2.4 - 4.4 ---------------------------------------------------------- | a2 | 0.5 - 0.8 | 6.1 - 10.1 Globulinas --------------------------------------------------------- | B | 0.7 - 1.2 | 8.5 - 14.5 ---------------------------------------------------------- | Y | 0.7 - 1.3 | 10.0 - 21.0 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Proteínas totais | 6.0 - 8.0 | 100.00 ---------------------------------------------------------------------------------------------- As proteínas plasmáticas são responsáveis por funções: manutenção da pressão oncótica do compartimento sanguíneo, trasporte de substâncias, coagulação, defesa imunitária e outras. A concentração dessas proteínas no plasma é determinada principalmente pelo estado nutritivo do animal e pelas funções hepática e renal. Assim, indivíduos acometidos por processos patológicos que alterem estes parâmetros, apresentam modificações nos seus perfis eletroforéticos. Essas modificações podem ser de natureza qualitativa e/ou quantitativa. Desnutrição, glomerulonefrites, insuficiência hepática e doenças neoplásicas, são processos patológicos que provocam diminuição da fração albumina.

57

As globulinas encontran-se elevadas nos processos infecciosos agudos e diminuídas em decorrência de desnutrição e leucemia. As alterações nas globulinas podem ser de natureza geral ou seletiva.

58

Bioeletrogênese Dados anteriores mostraram a determinação do potencial de equilíbrio de um íon, definindo-o como sendo a diferença de potencial químico necessária para equilibrar a diferença de potencial elétrico. Ou seja, um íon atravessando uma membrana por diferença inicial química, gera uma diferença de potencial elétrico que quando estes dois vetores se igualarem, ou seja, a velocidade com que o íon entra na célula por potencial químico se igualar à quantidade de íon que sai por potencial elétrico é atingido o potencial de equilíbrio para este determinado íon. A célula é composta de inúmeros íons fora e dentro, cada um eletroquimicamente em equilíbrio. Todos estes íons, geram uma diferença de potencial elétrica (ddp) entre o meio intracelular e o extracelular. Cada célula apresenta um valor desta diferença de potencial chamada potencial de membrana, de repouso ou transmembrana. Membranas celulares: a princípio, pensou-se que as membranas celulares eram constituídas por delicada camada de material semelhante a lipídeos entremeadas por diminutos canais preenchidos por água. Estudos posteriores sugeriram que a membrana plasmática consistia de uma camada dupla de lipídeos anfipáticos com suas cadeias de hidrocarbonetos orientados para dentro, formando uma fase hidrofóbica contínua, e suas extremidades hidrofílicas orientadas para fora. Isto foi ampliado, por um modelo dinâmico, do mosaico fluido, no qual as moléculas protéicas globulares penetram de um lado ou de outro da dupla camada fluida de fosfolipídeos ou o atravessam por completo (Simger e Nicholson, 1972). Cada molécula de lipídeo na camada dupla consegue mover-se lateralmente, conferindo à membrana na fluidez, flexibilidade, elevada resistência elétrica e impermeabilididade relativa às moléculas extremamente polares. As proteínas intrísecas da membrana e lipídeos conseguem formar canais hidrofóbicos e hidrofílicos que permitem o transporte de moléculas com características diferentes. FATORES FÍSICO - QUÍMICOS QUE INFLUENCIAM NO TRANSPORTE TRANSMEMBRANA Os fármacos atravessam as membranas tantoo através de processos passivos como por mecanismos que envolvem a participação ativa dos componentes da membrana. No primeiro caso, a molécula costuma atravessar por difusão passiva através de um gradiente de concentração, graças à sua solubilidade na camada lipídica dupla. Esta concentração é diretamente proporcional à magnitude dos gradientes de concentração através da membrana e ao coeficiente maior a concentração do fármaco na membrana e mais rápida sua difusão. Isto para substâncias não iônicas. Caso o fármaco seja iônico, as concentrações no estado de equilíbrio dinâmico dependerão de diferenças de pH através da membrana que influenciam a ionização da molécula e o gradiente eletroquímico do íon. A maioria das membranas biológicas é relativamente permeável à água, e este fluxo pode levar consigo pequenas substâncias hidrossolúveis. De modo geral, as substâncias de peso molecular superior a 100 - 200 não atravessam a membrana celular. Embora a maioria dos íons inorgânicos seja pequeno o suficiente para penetrar na célula, seu raio iônico hidratado é relativamente grande. Muitos possuem seus fluxos através da membrana por transporte ativo. A maioria dos fármacos é constituída por ácidos ou bases fracos que existem em solução sob a forma ionizada e não-ionizada. As moléculas não-ionizadas costumam ser lipossolúveis e conseguem difundir-se artavés da membrana celular. Em contrapartida as moléculas ionizadas geralmente não conseguem penetrar na membrana lipídica por causa de sua baixa lipossolubilidade. No suco gástrico, onde o pH = 1,4 a forma predominante é de não-ionizada, portanto o fármaco atravessa bem a membrana, mas no plasma onde o pH = 7,4 a forma predominante é a ionizada, sendo impossível o transporte transmembrana. O fluxo maciço através dos porso intercelulares é o principal mecanismo de passagem de fármacos através da maioria das membranas endoteliais capilares, com exceção do sistema nervoso central (SNC). Estes poros intercelulares são suficientemente grandes para que a difusão nos capilares seja limitada pelo fluxo sanguíneo, e não pela hidrossolubilidade ou por gradientes de pH. Isto é um fator importante na filtração renal. É um processo limitado. A periocitose dos fármacos, entretanto, é questionável. O transporte ativo de alguns fármacos ocorre através de membranas neuronais, do plexo coróide de células tubulares renais e hepatócitos. O termo difusão facilitada descreve um processo de transporte mediado por transportadores, no qual não exite demamda de energia e o movimento da substância em questão não pode ocorrer contra um gradiente eletroquímico. É extremamente seletivo, e ocorre quando a difusão simples seria muito lenta.

MECANISMO DE AÇÃO DAS DROGAS:

O efeito da maioria das drogas resulata da sua interação com os componentes macromoleculares do organismo. Os termos substância receptora e, mais simplesmente, receptor, foram criados para derrotar o componente do organismo com o qual o agente químico pressupostamente deveria interagir. Embora qualquer componente macromolecular funcional do organismo pode servir operacionalmente como receptor, um grupo particularmente importante do receptor de drogas é constituído pelas proteínas. RECEPTORES : Pelo menos do ponto de vista numérico as proteínas constituem a classe mais importante de receptores celulares. As drogas ligam-se a elas por interações conhecidas como: iônica, hidrogênica, hidrofóbica, de Van Der Waals e covalentes. Se a ligação for covalente a duração da droga é frequentemente, mais não necessariamente, prolongada.

59

A função desses receptores fisiológicos, muitos dos quais são componentes da membrana plasmática, consiste em acoplar-se ao ligante apropriado e propagar o seu sinal regulador na célula alvo, seja pelo poder de um efeito intracelular direto, seja promovendo a síntese ou a liberação de uma outra molécula reguladora intracelular, conhecida como: segundo mensageiro. MODELOS ESTRUTURAIS DE RECEPTORES FISIOLÓGICOS Canal iônico cont. por ago- Enzimas reguladoras nista por agonista Z Fig-01 L L L L

PRO CIN GUA CIC

Z G PRO Íons GTP GMP Pro-PO4 Cíclico 1 - São receptores compostos de várias subunidades em volta de um canal central. Os canais iônicos deflagrados por alteração de voltagem são moléculas correlacionadas. Fig - 02 2 - Receptores cataléticos que funcionam como proteínas-cinases (Pro Cin), ou guanililciclases (Gua Cic), possuem campos catalíticos globlulares na face citoplasmática da membrana plasmática, separados dos seus domínios de ligação do ligante (LL) por uma sequência polipeptídica. 3 - Os receptores acoplados à proteína G, acredita-se, dobram-se como sete hélices transmembrana com um término amino glicosilado (CHO) fora da célula. Receptores para vários neurotransmissores formam canais íon-seletivos na membrana plasmática e transportam os seus sinais alterando a composição iônica ou o potencial de membrana. Ex.: nicotinicocolinérgico. Grande número de receptores na membrana regulam proteínas efetuadoras distintas através da mediação de um grupo de proteínas que se ligam ao GTP, conhecidas como proteínas G. Ex.: hormônios peptídios. Os receptores nesses grupos agem facilitando a ligação de GTP a proteínas G específicas. A ligação com o GTP ativa a proteína G de tal modo que ela, por sua vez possa regular a atividade e fatores específicos como: adenililciclase, fosfolipases C e A2. Uma célula individual pode expressar de cinco ou mais proteínas G. As proteínas G são ligadas à face interna da membrana plasmática. São moléculas heterotriméricas (as subunidades são designadas alfa, beta e gama). e sua classificação baseia-se na identidade da sua subunidade alfa distinta. As proteínas G servem como interruptores moleculares nos sistemas transmembranas de sinalização. Elas podem transmitir sinais estimulatórios ou inibitórios para várias proteínas egetoras. SEGUNDOS MENSAGEIROS CITOPLASMÁTICOS: Os sinais fisiológicos também são integrados no interior da célula como resultado das interações entre as vias dos segundos mensageiros. Fig -03 CAMP + AC

G1 bOMBA

CAMP +

+

Gs DE PCA Gi.o

+

+ CCPC +

PCC CAM GS + Ca

+2

PLC CH Ca

+2 -

60

G? GI.O

Ca

+2

Fig -1 - Interações entre os segundos mensageiros AMP cíclico e Ca

++.

Os segundos mensageiros são poucos. Desse modo, sua síntese ou liberação frequentemente resulta da ativação de muitas vias. Eles atuam tanto de maneira direta, alterando o metabolismo do outro, quanto indiretamente, partilhando alvos intracelulares. O AMP cíclico, o segundo mensageiro a ser identificado em primeiro lugar, é sintetizado pela adenililciclase em resposta à ativação de vários receptores; a estimulação é mediada pela GS e a inibição por uma ou mais proteínas G intimamente relacionadas denominados Gi. Em algumas células, basicamente nos neurônios, a adenililciclase também é estimulada pelo Ca++ que ativa via calmodulina, proteína reguladora Ca++ - ligante. A hidrólise de AMPc é catalisada por vários fosfodiesterases, que podem ser ativadas pelo Ca++ e calmoldulina ou pelo próprio AMPc, sendo que a expulsão do AMPc da célula é realizada por, pelo menos, um sistema de transporte ativo. A AMPc funciona ativando as proteínas cinases AMPc-cdependentes, os quais regulam inúmeras proteínas cinases intracelulares, catalizando a sua fosforilação. A concentração citoplasmática de Ca++ outro ubíquo segundo mensageiro, é controlada pela regulação de vários canais Ca++- específicos diferentes da membrana plasmática ou pela sua liberação dos depositos das organelas intracelulares. Os canais de Ca++ podem ser abertos por despolarização elétrica, interação com Gs, fosforilação por uma proteína - cinase AMP cíclico - dependete, ou pelo K+ ou ainda pelo próprio Ca++. A abertura pode ser inibida por outras proteínas G (Gi e Go). Um canal pode responder a várias dessas entradas. A liberação de Ca++ dos depósitos intracelulares é mediada ainda por um outro segundo mensageiro, o inositol 1, 4, 5 - trifosfato (lP3). O IP3 é o produto de hidrólise do lipídio de membrana fosfatidil-inositol 4, 5 - bifosfato; esta reação é catalizada por uma fosfolipase C. Esta enzima é, ela mesma, regulada por pelo menos duas proteínas g, nenhuma delas identificada. O Ca++ regula a atividade celular interagindo com várias proteínas mediadoras, mas os exemplos mais notáveis são a proteína - cinase C e a calmodulina. A proteína cinase C, assim como a proteína - cinase AMP cíclico-dependente, tem muitos substratos, incluindo uma série de proteínas envolvidas em outros sistemas de sinalização. A ativação da proteína - cinase C pelo Ca++ é potenciada pelo diacelgglicerol, o outro produto da reação da fosfolipase C que libera IP3. O alcance da atividade regulatória da calmodulina também é amplo. Assim, com referência apenas aos exemplos do AMPcíclico e do Ca++, já se pode avaliar a complexidade da interação dos sistemas celulares de sinalização.

61

CROMATOGRAFIA

A cromatografia é um método de separação de substâncias baseado em vários princípios físicos e físico-químicos dependentes do método empregado. A cromatografia pode ser: Partição, filtração gel, troca iônica e adsorção, sendo que este pode ser subdividida em cromatografia analítica e preparativa. O princípio de separação da cromatografia de partição basea-se na solubilidade da substância em determinada substância. Quem for mais solúvel segue o solvente que caminha na placa por capilaridade. A filtração em gel faz a separação cromatográfica pela diferença do pelo molecular. É uma filtração ao inverso, pois saem primeiro as moléculas grandes. Isso ocorre porque as moléculas menores penetram nos poros do gel constituintes da coluna fazendo com isso um percurso maior, deixando a coluna por último, saindo primeiro as de peso molecular maior. O princípio de separação da cromatografia de troca iônica ébaseado na ligação eletrostática da substância com a resina constituinte da coluna que adquire carga de acordo com o pH da solução em que ela se encontra portanto a resina poderá ser de carga nula quando o pH = 7 pois a oferta de H+ é igual a liberação ficando com o número de cargas positivas igual ao número de cargas negativas o que lhe dá um carater eletrostático nulo. Se o material da coluna for colocado em pH < 7 a oferta de prótons pelo meio será grande a resina captará prótons os que lhe dará carátercatiônico (+). O inverso ocorrerá com pH > 7, oferta de prótons baixa há liberação de prótons para fase móvel o que dará carater aniônico (-). O número de cargas da amostra também influencia na separação, pois sairá primeiro os de menor número de cargas. A cromatografia de adsorção é baseada no prinçípio físico-químico de separação onde a fase móvel reage com a fixa e em seguida os constituintes da amostra também as ligarão quimicamente com a fase fixa. Cada ligação e desligação é feita em saltos. Portanto, um maior número de saltos implicará em menor adsorção, e maior solubilidade na fase móvel. Amostra

Solvente Este tipo de cromatografia se subdivide em cromatografia analítica e preparativa. A cromatografia analítica é usada na identificação do número de subst6ancias isoladas. Já a preparativa é usada para se isolar propriamente a substância. AMOSTRA A1 + A2 + A3 + A4

- Concentra no rotavapor

62

Placa Analítica 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 - I SUBST Placa Revaladora - I SUBST Como após a revelação da placa observa-se 2 posições das manchas, subentende-se que existiam 2 substâncias na amostra. Substância Mistura as duas e aplica na placa preparativa 2 substâncias misturadas subst. 1 subst. 2 Mistura Revela e em seguida isola cortando cada faixa. Coloca solvente. Filtra e seca. Tem-se assim as substâncias isoladas. - Ainda existe dois tipos de cromatografia a líquido e a gasoso. 1 2

63

ÁCIDOS E BASES: EXAME SALIVAR

A saliva afeta os dentes e a microflora de várias maneiras. Vários componentes e propriedades da saliva estão associados com o desenvolvimento da cárie dentária. Durante os últimos anos, a influência dos fatores salivares, na colonização dos microrganismos cariogêncios sobre os dentes, tem sido foco de interesse, mas nenhum deles teve seu valor diagnóstico provado. Muitas correlações significativas têm sido encontradas apenas entre a velocidade do fluxo salivar e a capacidade tambpão por um lado, e atividade de cáries por outro. Estas importantes propriedades da saliva podem ser confirmadas através de métodos simples. A baixa velocidade do fluxo salivar e baixa capacidade tampão levam à eliminação reduzida dos microrganismos e restos alimentares, o que prejudica a neutralização de ácidos e reduz a tendência à remineração das lesões iniciais do esmalte. Uma baixa velocidade do fluxo salivar é, geralmente, acompanhado por um número aumentado de S. mutans e Lactobacillus. Assim, uma alta atividade de cárie, vista em pessoas com uma velocidade reduzida do fluxo salivar, pode ser devido não apenas à redução da resistência do hospedeiro, mas também a um predomínio das exigências microbianas.

Determinação da Velocidade do Fluxo Salivar

Material: cilindro calibrador, funil, pedaço de cera parafinada (cerca de 1,5 g) e um cronômetro. Método: o paciente deve reter na boca o pedaço de parafina até que ele fique amolecido, a saliva produzida durante este espaço de tempo é deglutida. Acionar o cronômetro quando o paciente começar a mastigar a parafina. A saliva produzida é colhida em intervalos frequentes, no funil sobre o cilindro. Após cerca de 5 minutos deverá parar de mastigar e expelir a última porção da saliva estimulada. Quando a velocidade do fluxo é alta, este tempo pode ser diminuido. Entretanto, se a velocidade é baixa, deve haver um aumento do tempo. No geral, o paciente deve mastigar pelo menos durante 2 minutos, ou 2 ml de saliva deve ser colhida. O volume da saliva produzida é medido e a velocidade da secreção demonstrada em mililitros por minuto (por exemplo: 3,5 ml em 5 minutos é igual a 0,7 ml / minuto). Resultados: Velocidade normal do fluxo em adultos: 1,2 ml / min. Velocidade do fluxo acentuadamente diminuída: 0,7 ml / min. Xerostomia: 0,7 ml /min. Uma certa variação entre duas amostras tomadas em diferentes ocasiões, geralmente, é observada. Para reduzir esta variação, as amostras deverão, sempre que possível, ser tomadas sob condições idênticas. O paciente deve estar um pouco inquieto quando a primeira amostra é tirada, isto reduz a velocidade do fluxo. O mesmo efeito é percebido quando o paciente está lendo ou distraído com qualquer coisa. Por isto, quando a amostra da saliva é tirada, o paciente deve estar sozinho, sem revistas, livros ou outras distrações. A amostra de saliva colhida para determinação da velocidade do fluxo pode ser usado também para determinação da capacidade do tampão e para exames microbiológicos. Capacidade Tampão Material: a saliva estimulada pela parafina é obtida da mesma maneira descrita anteriormente. Como a capacidade tampão da saliva geralmente aumenta após comer, as amostras para a determinação deverão ser tomadas cerca de 2 horas depois de cada refeição. Método: adicionar 1 ml de saliva a 3 ml de Hcl a 0,005 M. Para eliminar o dióxido de carbono, agitar a amostra e remover a tampa. deixar a amostra repousar por 10 minutos e, então, medir o pH final. Isto pode ser feito com o papel indicador de pH se um medidor de pH não estiver disponível. Existem, no comércio, estojos especiais (dentco-buff) que contém um pequeno frasco com um ácido fraco e um indicador de cores. O estojo também carrega uma seringa com a qual 1 ml da amostra de saliva pode ser injetada no frasco teste. Depois de misturar, a cor resultante é comparada com uma escala de cores acessória. Resultados: Capacidade tampão normal: pH final entre 5 e 7. Capacidade tampão baixa: pH final 4. saliva + HCl CO2 + Os valores de pH entre 4 e 5 deverão ser considerados como valores limites. Discussão Os métodos simplificados, usando inicadores de pH, podem dar resultados que são difíceis de interpretar em certos intervalos do pH. Entretanto, eles são sensíveis e bastante seguros para a identificação de pacientes com baixa capacidade tampão. Os métodos, no entanto, não devem ser usados para a diferenciação entre pacientes com capacidade tampão normal ou boa. Como foi dito acima, a baixa velocidade do fluxo salivar e baixa capacidade tampão podem implicar o aumento do risco de cárie. Como a velocidade diminuída do fluxo salivr está sempre acompanhada por um número aumentado de S. mutans e Lactobacillus, um exame microbiológico deverá ser realizado em tais casos.

64

Se o exame da saliva mostra que valores negativos (baixos) estão presentes, deve-se constatar se eles são ocasionais ou constantes. Se eles são constantes, a razão disto deve ser determinada. Para referência sobre as medidas no tratamento de valores salivares baixos.

65

SUMÁRIO Soluções............................................................................................... 04 Composição e Propriedades Físico-Químicas dos Compartimentos dos organismos Superiores......................................................................... 11 Difusão, Potencial de Equilíbrio e Potencial de Membrana ................... 33 Função da Hemoglobina no Transporte de Gases e no Tamponamento Sanguíneo............................................................................................... 47 Bioeletrogenêse I .................................................................................... 52 Bioeletrogênese II ................................................................................. 52 Contração Muscular ................................................................................ 58 Introdução à Radiobiologia ...................................................................... 64 Cromatografia .......................................................................................... 74 Eletroforese ............................................................................................. 78