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Vivências: Revista Eletrônica de Extensão da URI ISSN 1809-1636

Vivências. Vol. 11, N.20: p.10-20, Maio/2015 10

COMPOSIÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE FRENTE A Artemia salina DAS SEMENTES E VAGENS DE Lupinus lanatus Benth

Chemical composition and toxicity assessment face to Artemia salina seeds and pods of Lupinus

lanatus Benth

Maiara LOPES1 Ana Cristina STEIN2

Carlos Eduardo Blanco LINARES3 Sandro Rogério GIACOMELLI 4

RESUMO Plantas pertencentes ao gênero Lupinus são caracterizadas pelo alto teor proteico em suas sementes, o qual é considerado um grande atrativo para a realização de pesquisas, visando à utilização segura na alimentação humana e animal. Desta forma a caracterização fitoquímica de espécies pertencentes ao gênero Lupinus fez-se necessária, sendo assim possível inferir que nas sementes e vagens de L. lanatus encontram-se metabólitos secundários como alcaloides, saponinas e triterpenos substituídos em C3 por desoxioses e a presença de estruturas triterpênicas com possível anel lactônico pentagonal, característico de heterosídeos cardiotônicos, foi observada apenas nas vagens desta espécie. Na obtenção de constituintes voláteis, obteve-se 0,001% de rendimento das sementes de L. lanatus, enquanto nas vagens de mesma espécie não foram encontrados constituintes voláteis. Os teores de compostos fenólicos totais encontrados, foram de 31,33 ± 2,36 e 20,33 ± 1,33 µEAG/mgEB para sementes e vagens de L. lanatus, respectivamente. Na avaliação da atividade antioxidante, fez-se possível a percepção da tendência que o percentual de inibição possui de diminuir enquanto aumenta a concentração do extrato bruto. Para o teste de toxicidade frente a A. salina encontraram-se valores de CL50 de 1712,912 µg/mL e 1352,976 µg/mL para sementes e vagens de L. lanatus respectivamente. Os estudos realizados com as sementes e vagens de L. lanatus contribuem significativamente para o conhecimento desta espécie, visto que a mesma é nativa do Rio Grande do Sul e permanece sem utilização agrícola ou alimentícia. Palavras chave: Lupinus; fitoquímica, citotoxidade.

1Aluna de iniciação científica e acadêmica do curso de Química Industrial da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Campus de Frederico Westphalen 2Doutora em Ciências Farmacêuticas e Professora do Departamento de Ciências da Saúde da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Campus de Frederico Westphalen 3Doutor em Bioquímica e Professor do Departamento de Ciências da Saúde da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Campus de Frederico Westphalen 4Doutor em Química e Professor do Departamento de Ciências Exatas e da Terra da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Campus de Frederico Westphalen



ABSTRACT Plants of the genus Lupinus are characterized by high protein content in the seeds, which is considered a major draw for conducting research aiming at safe use in food and feed. Thus the phytochemical characterization of species of the genus Lupinus was necessary, so it is possible to infer that the seeds and L. lanatus pods are secondary metabolites such as alkaloids, saponins and triterpenes replaced by C3 desoxioses and the presence of structures triterpenoidal possible with pentagonal ring lactone, characteristic of cardiotonic glycosides, was observed only in the pods of this species. In obtaining the volatile constituents yielded 0.001 % yield of seed L. lanatus while the pods of the same kind volatile constituents were not found. The contents of total phenolic compounds found were 31.33 ± 2.36 and 20.33 ± 1.33 µEAG/mgEB for seeds and pods of L. lanatus, respectively. In the evaluation of antioxidant activity was made possible perception of the trend that the inhibition percentage has to decrease while increasing the concentration of the crude extract. To the front toxicity test to A. salina met CL50 values of 1712,912 µg/mL e 1352,976 µg/mL for seeds and pods L. lanatus respectively. Studies of the seeds and pods L. lanatus contribute significantly to the knowledge of this species, since it is native to Rio Grande do Sul and remains without food or agricultural use. Keywords: Lupinus; phytochemical, cytotoxicity. INTRODUÇÃO

Plantas medicinais são utilizadas pela humanidade para aliviar ou curar enfermidades desde as mais antigas civilizações. Sendo muitos medicamentos utilizados hoje pela indústria farmacêutica, desenvolvidos a partir das mesmas. A fitoterapia neste cenário apresenta grande relevância, constituindo uma forma terapêutica que vem crescendo significativamente, sendo seu mercado mundial avaliado em US$ 12,4 bilhões. (FERREIRA, 2006).

Este amplo mercado tem incentivado o interesse científico, a fim de desenvolver estudos químicos e farmacológicos, que visam obter novos compostos que possam ser utilizados pela terapêutica. Ressaltando que a biodiversidade brasileira merece destaque, uma vez que, cerca de 17 % das espécies vegetais da flora contém estudos em relação as suas propriedades medicinais (GUERRA & NODARI, 2010). Surgindo assim, a oportunidade de identificação e estudo de compostos bioativos possivelmente presentes em nossa região (BARREIRO, 2002).

O gênero Lupinus de ocorrência no Velho e Novo Mundo compreende cerca de 280 espécies de plantas herbáceas e arbustivas, multi e unifoliares. O mesmo desempenha importância agrícola na Região Mediterrânea e África, sendo cultivado em áreas agrícolas inférteis para recuperar do solo devido à capacidade de fixação de nitrogênio (LANÇAS, et. al, 1997). Plantas pertencentes ao gênero são ainda caracterizadas pelo alto teor protéico em suas sementes o qual é considerado um grande atrativo para a realização de pesquisas, visando à utilização segura na alimentação humana e animal.

Estudos químicos realizados com várias espécies pertencentes ao gênero Lupinus relatam a presença de alcaloides em elevadas concentrações, bem como saponinas, taninos, flavonoides, diterpenos fenólicos, ácidos fenólicos e carotenóides. Segundo Wink & Witte (1995) o grande grupo de alcaloides, é o único com clara função ecológica na defesa da planta, contra insetos e herbívoros, micro-organismos (vírus, bactérias, fungos), fitopatógenos (nematóides, moluscos, insetos, vertebrados) e função alelopática (competição com outras espécies de plantas). Sendo atribuídas a estes várias atividades farmacológicas e toxicológicas, tais como, atividade antiviral,



antibacteriana, anti-inflamatória, diurética, sedativa, depressora do Sistema Nervoso Central (SNC), alucinógeno e mutagênica. MATERIAIS E MÉTODOS Coleta e preparo dos extratos brutos

O material botânico, vagens e sementes de L. lanatus, foram coletadas no mês outubro de 2013, as margens da BR-386, entre os municípios de Seberi/RS e Palmeira das Missões/RS. A extração e preparação do extrato bruto foi feita segundo Hoelzel et al (2005) com modificações, sendo assim, após serem secas, em estufa com circulação forçada de ar a 40 ºC, as partes constituintes foram separadas e trituradas em moinho de facas e submetidas à extração sob-refluxo por 5 horas durante 6 dias com MeOH (Vetec). A solução obtida foi filtrada e as fases orgânicas foram reunidas, sendo o solvente removido em evaporador rotativo sob pressão reduzida, a temperatura de 50 °C todos os dias a fim de concentrar o extrato bruto. Em seguida, o mesmo foi liofilizado, obtendo-se assim o extrato bruto liofilizado para realização das análises propostas no projeto. Análises Fitoquímicas

As análises fitoquímicas foram realizadas conforme descrito por HARBORNE, 1998, para detectar a presença das principais classes de metabólitos secundários das sementes e vagens da espécie em estudo.

A detecção de alcaloides foi realizada utilizando-se os reagentes de Dragendroff, Mayer, Bertrand, e Wagner. A presença de alcaloides foi considerada positiva quando ocorreu a imediata formação de precipitado após a adição dos reagentes. A pesquisa de flavonoides realizada pelo método de Cianidina, o qual baseia-se na formação de coloração vermelha após adição de ácido clorídrico e magnésio metálico em soluções contendo flavonoides. Taninos e saponinas foram analisados pelo método de complexação de proteínas e formação de espuma, respectivamente. Foi analisada também a presença de cumarinas pelo método de observação da fluorescência do sublimado em meio alcalino, assim como a pesquisa de antraquinonas realizada pelo desenvolvimento de coloração em meio alcalino. Para o teste de cianogenéticos, transferiu-se para um tubo de ensaio, cerca de 2 mL de CHCl3 e em seguida adicionou-se o material vegetal no tubo e então o tubo de ensaio foi fechado com uma rolha contendo uma tira de papel filtro previamente embebida e secada em solução de picrato de sódio e por fim, levado a banho-maria a 40 °C por dez minutos. Constituintes Voláteis

A obtenção dos constituintes voláteis das vagens e sementes de L. lanatus foi realizada por arraste a vapor em aparelho de Clevenger, onde em um balão de fundo redondo de 1000 mL, foi adicionado aproximadamente 100,0 g da amostra (sementes ou vagens) e acrescentado 500 mL de água destilada. Em seguida, adaptou-se o aparelho de Clevenger ao balão, preencheu-se com água fria a parte do tubo graduado e o tubo de retorno. O balão foi aquecido, com o auxílio de uma manta térmica até a ebulição da água e mantida por aproximadamente 4 horas. Determinação dos Compostos Fenólicos Totais

A determinação dos compostos fenólicos totais presentes nos extratos brutos das sementes e vagens de L. lanatus foi determinada pelo método espectrofotométrico empregando o reagente de Folin-Ciocalteu (Medi Química), conforme SINGLETON & ROSSI (1965) com modificações.



Inicialmente, preparou-se soluções de 200 µg/mL de cada extrato bruto (sementes e vagens), em seguida, adicionou-se 200 µL de solução e 200 µL do reagente de Folin-Ciocalteau em tubos de ensaio envoltos por papel alumínio, para que ficassem protegidos da luz e cobriu-os com papel filme, aguardando 5 minutos. Após, adicionou-se 3 mL de carbonato de sódio 2% (m/v), agitou-se em agitador de tubos e recobriu-os. Após 30 minutos, determinou-se a absorbância em espectrofotômetro UV-1600 Pró-análise em 760 nm. Todas as determinações foram realizadas em triplicata. A curva de calibração foi obtida utilizando-se ácido gálico como padrão na faixa de concentração de 50-300 µg/mL. Os resultados então foram expressos em equivalentes de ácido gálico (EAG) por miligrama de extrato bruto. Determinação da Capacidade Antioxidante

A capacidade antioxidante foi avaliada utilizando-se o método do sequestro de radicais livres do DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidrazil), segundo ALMEIDA (2006), com modificações, no qual se baseia em um ensaio fotométrico onde o radical livre DPPH, que apresenta coloração roxa intensa em solução alcoólica, se reduz em presença de moléculas antioxidantes, formando o 2,2 difenil-1-picrilhidrazil, que é incolor. Para isso, prepararam-se soluções de 25, 50, 100, 150 e 200 µg/mL das sementes e vagens de L. lanatus em MeOH (Vetec) e em seguida, transferiu-se 1 mL de cada diluição para tubos de ensaio já identificados e adicionou-se 3 mL de DPPH 01 mM. Aguardou-se 30 minutos e realizou-se a leitura em espectrofotômetro UV-1600 Pró-análise em 517 nm. Os cálculos foram efetuados com o auxílio da equação 1, onde Ab DPPH e Ab amostra, significam respectivamente, absorbância do branco do DPPH e absorbância da amostra.

Ensaio de Toxicidade frente à Artemia salina

Os ensaios de toxicidade foram realizados de acordo com MCLAUGHLIN et al (1998). Para a eclosão dos ovos preparou-se 3 L de água marinha artificial, sendo que, para cada litro de água destilada adicionou-se 23 g NaCl; 11 g MgCl2.6H2O; 4 g Na2SO4; 1,3 g CaCl2.2H2O ou CaCl2.6H2O; 0,7 g KCl (DALL´STELLA, 2008). Os ovos de A. salina (20 mg) foram adicionados ao aquário para eclodir por 48 horas, sob aeração contínua e expostos a uma fonte de luz. A temperatura foi mantida em 26±1 °C e o pH ajustado para aproximadamente 9,0 com Na2CO3 para evitar a mortalidade das larvas por diminuição do pH durante a incubação. A diluição dos extratos das sementes e vagens foi efetuada de modo a se obter concentrações de 10, 100 e 1000 µg/mL em solução salina contendo 2 % de tween 80 (Polysorbate 80).

Para realização desse teste, foi transferido com pipeta de Pasteur 10 náupleos de A. salina, em tubos de ensaio contendo as concentrações desejadas dos extratos das sementes e vagens de L. lanatus. Após 24 horas, sob iluminação artificial foi realizada a contagem do número de náupleos sobreviventes. Sendo assim calculada a concentração letal mediana (CL50). Como controle positivo foi utilizado uma solução aquosa de K2Cr2O7, 60 µg/mL e como controle negativo foi utilizado a solução salina com 2 % de tween 80 (Polysorbate 80). RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização fitoquímica

A caracterização fitoquímica é uma etapa fundamental no estudo de produtos naturais,



sendo possível delinear estudos químicos, farmacológicos e bromatológicos com base nos metabolitos secundários produzidos pela espécie em estudo. Neste sentido a investigação fitoquímica de espécies pertencentes a gênero Lupinus fez-se necessária, sendo realizados testes com as sementes e vagens de L. lanatus, para identificação dos principais grupos de metabólitos secundários, tais como alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas, antraquinonas, cumarinas e glicosídeos cardiotônicos.

Para identificação de alcaloides foram realizados testes em meio ácido e em meio básico. Foram testados os seguintes reativos gerais de alcaloides: Dragedorff, Mayer, Bertrand e Bonchardat Wagner. Após, realizados os ensaios, foi possível inferir que sementes e vagens de L. lanatus são positivas para alcaloides, devido à formação imediata de precipitado para ambos os reativos. Na investigação de flavonoides realizada pelo método de Cianidina, as sementes foram consideradas negativas, visto a não observação de coloração vermelha no meio reacional. (Figura 1).

Figura 1: Identificação de alcaloides e flavonoides: I) Formação de precipitado após a adição de dos reativos A) Dragendroff, B) Bertrand, C) Meyer, D) Wagner; II) Análise de flavonoides pelo método de Cianidina: A) Teste realizado com as vagens de Lupinus lanatus; B) Reação negativa para flavonoides.

Na análise de saponinas do material vegetal, a persistência de espuma em meio ácido foi inferida como positiva. O teor de saponinas foi determinado pelo índice afrosimétrico. Conforme observado na figura 2, foi confirmada a presença de saponinas nas sementes e vagens de L. lanatus que apresentou formação de espuma ácido persistente. A altura da espuma em todos os tubos no índice afrosimétrico de espuma foi inferior a 1 cm, o que permite afirmar que o índice de espuma é menor do que 100 (BRASIL, 2010).



Figura 2: Identificação de Saponinas I) Teste de formação de espuma ácido persistente; II) Índice afrosimétrico de espuma.

A investigação de glicosídeos cardiotônicos envolveu três etapas, a primeira investigou a existência do núcleo triterpênico, pelo teste de Liebermann-Burchard, a segunda analisou a presença do anel pentagonal lactônico através da Reação de Kedde, e a terceira investigou a presença de desoxioses ligados na estrutura através da Reação de Keller-Kilian (Figura 3).

A detecção da presença de glicosídeos cardiotônicos no teste de Liebermann-Burchard foi realizada pela observação da coloração na zona de contato entre o anidrido acético e o ácido sulfúrico, sendo observado nesta região à formação de um halo com coloração avermelhado indicando a existência provável de núcleo triterpênico (HARBORNE, 1998). A reação de Baljet, realizada para constatar a presença de anel lactônico pentagonal, característico dos heterosídeos cardiotônicos, é considerada positiva através da formação de composto com coloração alaranjada, após adição dos reagentes. O teste de Keller-Kiliani é caracterizado positivo quando ocorre a formação de coloração vermelho-acastanhada na zona de contato, entre os solvente, indicando quando positivo a presença de 3 desoxiaçucares ligados a estrutura triterpênica. Com base nos resultados obtidos foi possível observar a possível presença de glicosídeos cardiotônicos com esqueleto triterpênico, nas vagens de L. lanatus. No teste realizado com as sementes a reação de Baljet foi considerada negativa, visto a não observação de coloração alaranjada após a adição dos reativos, sendo constatada positividade na reação de Liebermann-Burchard e Keller-Kiliani, indicando a existência de estruturas triterpênica com substituição de desoxioses na posição na hidroxila de C3.



Figura 3: Identificação de cardiotônicos A) Reação de Liebermann-Burchard, com aparecimento de coloração vermelha na zona de contato entre o ácido sulfúrico e o anidrido acético; B) Reação de Baljet; C) Reação de Keller-Kiliani.

Através da análise da figura 4 é observado que o teste realizado para caracterização de antraquinonas não alterou a coloração da fase aquosa, sendo ambos os constituintes vegetais testados considerados negativos para esta classe de compostos. Da mesma forma os testes para cumarinas (observação da fluorescência em meio alcalino) e taninos (precipitado de proteína) foram considerados negativos para os materiais vegetais analisados.

Figura 4: Teste fitoquímicos de identificação de antraquinonas, cumarinas e taninos. A) Teste de identificação de compostos antracênicos, não ocorreu alteração de coloração na camada aquosa, B) Teste de identificação de cumarina, a observação da fluorescência foi realizada através da comparação entre a amostra e o guaco (Mikania glomerata) caracterizado como positivo para cumarinas; C) Teste de identificação de taninos pelo método de complexação de proteínas.

Para o teste de cianogenéticos (figura 5), foi considerado como reação positiva se o papel impregnado com uma solução de picrato de sódio, inicialmente de coloração amarela, adquirisse coloração vermelha, devido ao desprendimento de HCN. Após aguardar dez minutos, retirou-se o papel-teste do banho-maria para observar a presença ou ausência de cianogenéticos. Como pode ser observado na figura 5, não houve mudança de coloração, podendo-se concluir assim que as sementes e vagens de L. lanatus não apresentam cianogenéticos.

Figura 5: Teste de cianogenéticos A: Papel-teste impregnado com uma solução de picrato de sódio antes de ser colocado no banho-maria. B: Papel-teste impregnado com uma solução de picrato de sódio após ser retirado do banho-maria. A síntese dos resultados da caracterização fitoquímica das sementes e vagens de L. lanatus encontra-se na tabela 1. TABELA 1: CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE



METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS SEMENTES E VAGENS DE L. lanatus L. lanatus

Metabólito Reativo Sem. Vag.

Alcaloides Dragendorff, Bertrand,

Mayer, Wagner + +

Flavonoides Cianidina - -

Saponinas Espuma ácido

persistente + +

Triterpenóides Lieberman-Burchard + +

Taninos Gelatina, Acetato de

Chumbo - -

Cumarinas Fluorescência no UV - -

Antraquinonas Coloração em meio

alcalino - -

Cianogenéticos - - - *Sementes (Sem.); Vagens (Vag.); Positivo (+); Negativo (-) Constituintes Voláteis

A partir da destilação por arraste a vapor em aparelho de Clevenger, foi possível averiguar que as sementes de L. lanatus apresentam níveis muito baixos de constituintes voláteis (0,001 m/m), quando comparamos o seu rendimento (0,001 %) com os rendimentos encontrados na literatura (DUTRA, 2008) para outras sementes, como por exemplo as de Pterodon emarginatus Vogel (5,41 %), pertencente a família Leguminosae, que possui um rendimento consideravelmente alto. Enquanto que nas vagens não foi detectada a presença de constituintes voláteis.

Compostos Fenólicos Totais

Os compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas no reino vegetal, em particular nas frutas e em outros vegetais. São conjuntos heterogêneos que apresentam em sua estrutura vários grupos benzênicos característicos, substituídos por grupamentos hidroxilas (HERNÁNDEZ & GONZÁLES,1999).

A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio de uma variedade de técnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu encontra-se entre as amplamente utilizadas (VALKO, et al, 2004). Sendo assim, a partir da equação da reta obtida através da curva padrão de ácido gálico feita dentre a faixa de concentração de 50-300 µg/mL, que apresentou R2 = 0,9902, determinou-se o teor de compostos fenólicos totais presentes nas sementes e vagens de L. lanatus. Os resultados obtidos na determinação dos compostos fenólicos totais pelo método Folin– Ciocalteu, expressos como µg Equivalentes de Ácido Gálico (EAG) por miligrama de Extrato Bruto (EB), são apresentados na Tabela 2. TABELA 2: TEOR DE COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS DOS EXTRATOS BRUTOS DAS SEMENTES E VAGENS DE L. lanatus

Extrato Bruto Teor de Compostos Fenólicos Totais (µEAG/mgEB)*

Sementes 31,33 ± 2,36 Vagens 20,33 ± 1,33

Cada valor foi obtido por meio da média ± desvio padrão de pelo menos três replicatas * µg Equivalentes de Ácido Gálico (EAG) por miligrama de Extrato Bruto (EB)



Como se pode observar na tabela 2, existe uma diferença no teor de compostos fenólicos totais entre os extratos brutos das sementes (31,33 ± 2,36 µEAG/mgEB) e vagens (20,33 ± 1,33 µEAG/mgEB) de L. lanatus, sendo esse teor maior nas sementes em relação as vagens de mesma espécie. Confrontando os teores de compostos fenólicos totais obtidos para as sementes e vagens de L. lanatus, com os teores encontrados na literatura (ROESLER, et al; 2007) para as sementes de Annona crassiflora Mart (136,99 ± 7,565 µEAG/mgEB), detentora de altos teores de compostos fenólicos, pode-se concluir que as sementes quanto as vagens de L. lanatus possuem baixos teores de compostos fenólicos totais.

Capacidade Antioxidante

As metodologias largamente empregadas para se determinar a atividade antioxidante de modo prático, rápido e sensível são as que envolvem um radical cromóforo, simulando as espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo o radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina) um dos mais utilizados (ARNAO et al., 2000). O radical livre DPPH é um cromóforo muito estável, com um pico de absorção no comprimento de onda de 517 nm, apresentando solução de coloração violeta intensa (BLOIS; 1958; ARNAO et al., 2000). À medida que o DPPH sofre redução pelos componentes presentes na solução teste, observa-se mudança da coloração da solução original de violeta intensa para amarela, proporcional à concentração da substância com potencial antioxidante presente, podendo ser medida espectrometricamente a 517 nm (BLOIS, 1958).

Com o auxílio da equação 1, foi determinado o percentual de inibição dos extratos das sementes e vagens de L. lanatus (Tabela 3). TABELA 3: PERCENTUAL DE INIBIÇÃO DOS EXTRATOS DAS SEMENTES E VAGENS DE L. lanatus EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES

Concentração % DPPHinibido* (Sementes) % DPPHinibido* (Vagens) 25 µg/mL 92,333 ± 0,46 95,300 ± 0,69 50 µg/mL 89,105 ± 0,39 88,975 ± 0,59 100 µg/mL 67,703 ± 1,40 78,858 ± 0,59 150 µg/mL 56,809 ± 1,03 71,465 ± 0,22 200 µg/mL 42,801 ± 0,78 61,089 ± 1,03

Cada valor foi obtido por meio da média ± desvio padrão de pelo menos três replicatas * Percentual de Inibição

A partir dos valores de percentual de inibição de cada diluição dos extratos das sementes e vagens de L. lanatus, pode-se observar que o percentual de inibição tende a diminuir enquanto aumenta a concentração do extrato bruto por mL de solvente. Além disso, também sendo possível verificar a diferença entre os percentuais de inibição de vagens e sementes. O percentual de inibição obtido dos extratos das sementes é menor em relação aos resultados observados para os extratos das vagens.

Toxicidade frente a Artemia salina

A avaliação da bioatividade de extratos de plantas, medida pela toxicidade frente A. salina, pode fornecer informações valiosas ao trabalho de químicos de produtos naturais e farmacólogos, indicando fontes vegetais com importantes atividades biológicas. Neste contexto, a utilização de bioensaios para o monitoramento da bioatividade de extratos, frações e compostos isolados de plantas vem crescendo consideravelmente nos laboratórios de pesquisa em nível mundial como método alternativo para o uso de animais de laboratório. A. salina é um micro crustáceo amplamente conhecido como indicador de toxicidade em um bioensaio, que utiliza a CL50



(concentração letal média) como parâmetro de avaliação da atividade biológica (MCLAUGHLIN et al., 1998).

Assim sendo, após a contagem do número de sobreviventes, determinou-se a concentração letal média (CL50) e 95 % de intervalo de confiança do extrato bruto das sementes e vagens de L. lanatus utilizando-se o método estatístico ACTION 2.2, e estes estão expressos na Tabela 4. Para a citotoxidade foram considerados valores de CL50 menores que 1000 µg/mL (MCLAUGHLIN et al., 1998).

TABELA 4: TESTE DE TOXICIDADE FRENTE A Artemia salina DOS EXTRATOS BRUTOS DAS SEMENTES E VAGENS DE L. lanatus *

Extrato Bruto CL50 (µg/mL) Intervalo de Confiança (95 %)

Sementes 1712,91 1622,89-1802,93 Vagens 1352,98 1318,91-1387,04

*Como controle positivo foi utilizado dicromato de potássio (60 µg/mL) e como controle negativo foi utilizado solução salina com 2 % de tween 80

Segundo os resultados apresentados na tabela 4, as sementes (CL50 1712,91 µg/mL) quanto as vagens (CL50 1352,98 µg/mL) de L. lanatus não apresentaram efeitos citotóxicos. Quando comparados entre si, as sementes apresentam efeitos citotóxicos menores. Correlacionando os resultados obtidos para as sementes e vagens de L. lanatus com os resultados encontrados na literatura (NUNES, et al; 2008) para sementes de Mimosa paraibana Barneby (CL50 602,5 µg/mL), gênero de leguminosas pantropical considerada citotóxica (CL50 < 1000 µg/mL), pode-se confirmar a baixa citotoxidade das sementes e vagens de L. lanatus, sendo que esta pode ser considerada uma característica interessante para utilização de extratos vegetais em ambientes naturais.

CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos é possível inferir que encontram-se nas vagens e sementes de L. lanatus metabólitos secundários como alcaloides, saponinas e triterpenos substituídos em C3 por desoxioses. A presença de estruturas triterpênicas com possível anel lactônico pentagonal foi observada apenas nas vagens desta espécie. Não sendo observado a presença de cumarinas, taninos, cianogenéticos e antraquinonas nos constituintes vegetais analisados. Na obtenção de constituintes voláteis por arraste a vapor em aparelho de Clevenger, as sementes de L. lanatus apresentaram níveis muito baixos de constituintes voláteis em comparado com sementes de P. emarginatus e nas vagens de mesma espécie não foram encontrados constituintes voláteis. Os teores de compostos fenólicos totais para as sementes e vagens de L. lanatus foram considerados baixos quanto comparados com as sementes de A. crassiflora. Na avaliação da atividade antioxidante, foi possível perceber a tendência que o percentual de inibição tem de diminuir enquanto aumenta a concentração do extrato bruto. Por fim, no teste de toxicidade frente a A. salina as sementes e vagens de L. lanatus não foram consideradas citotóxicas quando comparado com sementes de M. paraibana.



REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMEIDA, J. M. D. et al. Avaliação da atividade antioxidante utilizando sistemas β-caroteno/ácido linoléico e método de seqüestros de radicais DPPH. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.26, n.2, abr./jun. 2006, p.446-452. ARNAO MB, CANO A, ACOSTA M 2000. A method to measure antioxidant activity in organic media: application to lipophilic vitamins. Redox Rep 5: 365-370. BARREIRO, E. J. Química Medicinal: As bases Moleculares da ação dos Fármacos. Porto Alegre, 2 ed., 2008. BLOIS MS 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200. BRASIL, Agência nacional de vigilância sanitária. Farmacopéia Brasileira. 5 ed. Brasília: Anvisa, 2010. DALL’STELLA, D. S. G. Estudo fitoquímico de Dorstenia multiformis Miquel (Moraceae) e de suas ações antibacteriana, antifúngica, alelopática, antioxidante e toxicológica. Curitiba, 2008. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná. DUTRA, R.F. Avaliações fitoquímica e farmacológica das sementes de Pterodon emarginatus Vogel. Juiz de Fora, 2008. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora. GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Biodiversidade: aspectos biológicos, geográficos, legais e éticos. In: SIMÕES, M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Ed.4, Porto Alegre/Florianópolis: Ed. UFRGS/UFSC, pp 13-26, 2002. HARBORNE, A. J. Phytochemical methods a guide to modern techniques of plant analysis. 3 ed. New York: Chapman, 1998. HERNÁNDEZ, A.M.; PRIETO GONZÁLES, E.A. Plantas que contienen polifenoles. Revista Cubana de Investigaciones Biomedica , Ciudad de la Habana v.18, n.1, p. 12-14,1999. HOELZEL, C. S. M, et al. An unusual quinolinone alkaloid from Waltheria douradinha. Science Direct. Phytochemistry 66 (2005) 1163-1167. MCLAUGHLIN, J. L.; ROGERS, L. L.; ANDERSON, J. E.The use of Biological assays to evaluate botanicals.Drug Information Journal . V. 32, p. 513-524, 1998. MEYER, B.N. et al. Brine Shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Plantamedica, v. 45, p. 31, 1982. NUNES, P. X. et al. Constituintes químicos, avaliação das atividades citotóxica e antioxidante de Mimosa paraibana Barneby (Mimosaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia. 18 (Supl.): 718-723, Dez. 2008. ROESLER, R. et al. Atividade antioxidante de frutas do cerrado. Ciência e Tecnologia de Alimentos. Campinas, 2007. SINGLETOM, V.L; ROSSI Jr., J.A. Colorimetry of total phenolics with phophomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enalogy and Viticulture, v. 16, p 144-158, 1965. VALKO, M. et al. Arch. Biochem.Biophys.2004, 430, 37; Omoni, A. O.; Aluko, R. E.; Trends Food Sci.Technol.2005, 16, 344. WINK, C., WINK, M. Lupin. An ancient crop for the New Millenium. Romneya-Verlag, Dossenheim, 1999. WINK, M.; MEIBNER, C.; WITTE, L. Patterns of quinolizidine alkaloids in 56 species of the genus Lupinus. Phytochemistry, New York, v. 38, n. 1, p. 139-153, 1995.

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