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MATHEUS LOUREIRO SANTOS
COMPOSIÇÃO DA PAREDE CELULAR DOS FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS Pisolithus microcarpus e Pisolithus tinctorius
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae.
VIÇOSA, 2007
MINAS GERAIS – BRASIL
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MATHEUS LOUREIRO SANTOS
COMPOSIÇÃO DA PAREDE CELULAR DOS FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS Pisolithus microcarpus e Pisolithus tinctorius
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae.
APROVADA: 14 de agosto de 2007 ----------------------------------------------- -----------------------------------------------
Prof. Arnaldo Chaer Borges Prof. Olinto Liparini Pereira ----------------------------------------------- ----------------------------------------------- Profa. Elza Fernandes de Araújo Profa. Marisa Vieira de Queiroz (Co-orientadora) (Co-orientadora)
---------------------------------------------------- Prof. Maurício Dutra Costa
(Orientador)
3
A Deus.
Aos meus amados pais.
À minha avó Maria.
À minha irmã Marina.
Ao meu afilhado Robert.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por seu imenso amor a mim dispensado.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Microbiologia,
pela oportunidade de realizar o curso. À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo.
Ao professor Maurício Dutra Costa, pela orientação, paciência, amizade,
conselhos e simpatia dentro e fora do laboratório.
À professora Marisa Vieira de Queiroz, pelas contribuições e
aconselhamentos.
À professora Elza Fernandes de Araújo, por seu profissionalismo, suas
contribuições e sua dedicação.
Ao professor Arnaldo Chaer Borges, pelas suas sugestões e críticas.
Ao professor Marcos Rogério Tótola e à Rita de Cássia Fernandes, pela
ajuda na execução do FAME.
À Dra. Virgínia Maria Chaves Alves, pelos inúmeros auxílios.
Ao Jackson e ao Osias, cujas ajudas foram de enorme valia para a
execução dos experimentos.
Aos amigos do Laboratório de Associações Biológicas Micorrízicas,
Andrezim, Gilmara, Andrezão, Jhon, Rômula, Marliane, Lydice, Marlon, João,
Andréa, André Carvalho, Laélia, José, Bruno, Cidinha, Mariane, Samanta,
Angélica, Artur, Tomás e Luís, pelo excelente convívio durante todo esse
tempo.
5
Aos meus colegas do Mestrado em Microbiologia Agrícola, pela
companhia agradável nas aulas e fora da universidade.
Aos funcionários do Departamento de Microbiologia, Nilcéa, Laura,
Danilo, Pablo, Toninho e Paulo, pela ajuda e convivência.
Aos meus pais e irmã, razões da minha vida, pela paciência e
encorajamento sempre dados, mas, acima de tudo, por me fazer sentir a
pessoa mais amada do mundo.
À minha avó Maria Santiago, por ser o maior exemplo de vida para todos
os que têm o privilégio de conviver com ela. Também, aos meus avôs e avó já
falecidos, pois, apesar da distância, continuo a sentir seu amor por mim.
Ao meu afilhado Robert, que na sua inocência infantil me torna uma
pessoa mais responsável.
A todos os meus tios e primos, por tornarem todas as minhas viagens
em família momentos de muitas risadas e felicidade.
Aos meus padrinhos, Maria Heloísa e José Ronildo, que assumiram um
compromisso tão importante com Deus e meus pais, cumprindo esse
compromisso de maneira exemplar.
Aos meus irmãos da República Diagonal, Leozim, Dedé, Ktá, Mic, Flash,
Pablo, Alessandro, Paulo, Burrão, Jean, Tales, Chamex, Kenedy, Leandro,
Batalha, por me oferecerem uma verdadeira família aqui em Viçosa, e,
também, amizades que jamais passarão.
À todas as pessoas com quem fiz amizade durante esses anos.
Obrigado a todos de coração!
6
BIOGRAFIA
Matheus Loureiro Santos, filho de Antônio de Pádua Miguel dos Santos
e de Helena do Rosário Loureiro Santos, nasceu no dia 16 de abril de 1983 na
cidade de João Monlevade, MG. Iniciou a graduação em Ciências Biológicas na
Universidade Federal de Viçosa em abril de 2001, tendo graduado-se em julho
de 2005. Em agosto de 2005 iniciou o mestrado em Microbiologia Agrícola pela
Universidade Federal de Viçosa.
7
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................
viii
ABSTRACT...............................................................................................
x
1. INTRODUÇÃO......................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................
3
3. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................
13
3.1. Manutenção das culturas........................................................
13
3.2. Isolamento da parede celular..................................................
14
3.3. Análises químicas da parede celular......................................
14
3.4. Detecção de β-Glicanos..........................................................
16
3.5. Perfil de Ácidos graxos...........................................................
16
3.6. Efeito de compostos inibitórios
sobre a morfologia das hifas...................................................
17
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................
18
4.1. Composição química da parede celular..................................
18
4.2. Detecção de β-Glicanos.........................................................
22
4.3. Perfil de ácidos graxos............................................................
26
4.4. Efeito de compostos inibitórios 33
8
sobre a morfologia das hifas ................................................
4.4.1. Dimetomorfe..............................................................
33
4.4.2. Piroquilona................................................................
36
4.4.3. Quitosana..................................................................
38
5. CONCLUSÕES.....................................................................................
42
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................
43
9
RESUMO
SANTOS, Matheus Loureiro, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, agosto de 2007. Composição da parede celular dos fungos ectomicorrízicos Pisolithus microcarpus e Pisolithus tinctorius. Orientador: Maurício Dutra Costa. Co-orientadoras: Elza Fernandes de Araújo e Marisa Vieira de Queiroz.
Este trabalho teve como objetivos avaliar a composição química da
parede celular dos isolados PT301 de Pisolithus tinctorius e H4111 de
Pisolithus microcarpus, e verificar os efeitos dos fungicidas dimetomorfe e
piroquilona nas concentrações de 1, 5, 10, 15 e 30 ppm e da quitosana nas
concentrações de 1, 2, 5 e 10 mg mL-1 sobre a morfologia micelial. A parede de
Pisolithus microcarpus H4111 apresenta-se constituída por 46, 5 % de
açúcares neutros, 18,4 % de proteínas, 26,1 % de quitina e 3,8 % de cinzas. A
parede celular de Pisolithus tinctorius PT301 constitui-se de 48 % de açúcares
neutros, 17,7 % de proteínas, 23,5 % de quitina e 4,5 % de cinzas. Quanto à
constituição mineral da parede, verificou-se que a composição de nitrogênio,
fósforo e potássio dos dois isolados é semelhante, ao passo que os teores de
enxofre e sódio são maiores no isolado PT301. Nos teores de micronutrientes,
o fungo PT301 apresentou maiores teores em zinco, ferro e cobre. A parede
celular de Pisolithus demonstrou-se rica em quitina em toda a sua extensão. Os
glicanos β-1,3 são encontrados em maiores quantidades nas extremidades das
hifas. A análise de ácidos graxos demonstrou que a composição desses
compostos na parede celular difere daquela encontrada no micélio, embora em
ambas situações, os ácidos graxos mais comuns tenham sido os 16:0, 18:1w9c
10
e a mistura 18:0 A \18:2w6,9c. Foram detectados ácidos graxos apenas nos
micélios, bem como certos ácidos graxos foram detectados somente nas
paredes. Todos os três inibidores utilizados demonstraram-se capazes de
provocar alterações morfológicas nas hifas de Pisolithus. Foram verificados
inchamento das hifas, formação de estruturas globosas na extremidade e
também ao longo das hifas, além de ondulações e enrugamento do micélio. O
fungicida dimetomorfe também provocou alterações nos grampos de conexão
dos fungos.
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ABSTRACT
SANTOS, Matheus Loureiro, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, August, 2007. Composition of the cell wall from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus microcarpus and Pisolithus tinctorius. Advisor: Maurício Dutra Costa. Co-advisors: Elza Fernandes de Araújo and Marisa Vieira de Queiroz.
The objective oh this work was to estimate thr chemistry composition of
the Pisolithus’ s cell wall, and to check the effects caused by Dimethomorph,
Pyroquilon and Chitosan. Were used the strains H4111 and PT301. To
determinate the chemystri composition were used colorimetric methods and
chromatography. To detect the fungicide’s effects was used light microscopy.
The cell wall from Pisolithus H4111 appointed 45% of neutral suggars, 18,35%
of proteins, 26,14% of chitin and 3,8% of ash. The cell wall from Pisolithus
PT301 appointed 48% of neutral suggars, 17,67% of proteins, 23,46% of chitin
and 4,5% of ash. About the minerals from the cell walls, the macronutrient
composition of the two strains were similar. On the other hand, the
micronutrients composition from PT301 was higher at all the tested minerals.
The Pisolithus ’s cell wall is rich in chitin, while the β-1,3-glicans were revealed
in higher amounts at the tips of the hyphes. The fatty acids analysis revealed a
diferential profile betwwen the hyphe and the cell wall, althoug, in all the
situations, the predominant fatty acids were 18:2w6,9c, 18:1w9c and 16:0.
Some fatty acids were detected only in the hyphes. Others fatty acids were
detecte don the cell walls, but not oh the hyphes, and others fatty acids were
detected at hyphes and cell walls. The three fungicides tested were able to
12
cause morphological changes in Pisolithus. Were verificated hyphal sweeling,
vesicular formations on the hyphal tips and the presence of wrinkle hyphes. The
fungicide Dimethomorph provoked yet alterations on the morphology of the
connection clamps of the two strains.
1. INTRODUÇÃO
As micorrizas são associações simbióticas mutualistas comuns na
natureza. São formadas por fungos presentes no solo e raízes de plantas,
fornecendo vantagens para ambos os participantes da associação. Os fungos
são beneficiados pela presença de compostos carbonáceos oriundos do
processo fotossintético vegetal, enquanto que as plantas envolvidas na
associação apresentam aumento no crescimento, melhoria na capacidade de
absorver nutrientes e água, maior tolerância a metais pesados, maior tolerância
a patógenos radiculares, além de maior tolerância a extremos de temperaturas.
Estão descritas até o momento 7 tipos de associações micorrízicas, mas
dentre essas, as ectomicorrizas apresentam grande destaque, apesar de
apenas um pequeno número de espécies vegetais as formarem. Este tipo de
associação encontra-se amplamente distribuído em algumas espécies de
interesse industrial, tais como Eucalyptus spp. e Pinus spp.
O fungo basidiomiceto Pisolithus é considerado organismo modelo para
o estudo de fungos ectomicorrízicos, principalmente por se associar com várias
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espécies vegetais, sendo organismo de grande potencial biotecnológico. No
entanto, algumas lacunas ainda são encontradas no conhecimento sobre a
biologia, a fisiologia e a genética desse importante gênero fúngico. A presença
de parede celular pigmentada impede o desenvolvimento e a aplicação de
algumas técnicas químicas e moleculares importantes para a compreensão
mais aprofundada da simbiose ectomicorrízica.
A parede celular é estrutura de vital importância para os fungos, tendo
papel na manutenção da integridade celular, nas interações celulares, na
aderência a substratos, na proteção mecânica à célula, entre outras funções.
Os organismos pertencentes ao Reino Fungi apresentam caracteristicamente
parede celular rica em polissacarídeos e glicoproteínas, embora a composição
exata apresente grandes variações entre as diferentes espécies. Muito pouco
se conhece sobre a parede celular do fungo Pisolithus, não sendo encontrados
relatos nem mesmo dos principais constituintes que a formam. Essa falta de
conhecimento torna difícil a seleção de metodologias eficientes para provocar o
enfraquecimento da parede celular visando à produção de protoplastos.
Muitos compostos inibitórios descritos na literatura são capazes de
provocar o enfraquecimento da parede celular de fungos, podendo-se citar o
dimetomorfe, que inibe a biossíntese de parede, a piroquilona, que atua
impedindo a biossíntese da melanina, além da quitosana, que, graças à sua
natureza policatiônica, apresenta a capacidade de se adsorver à parede celular
enfraquecendo-a.
No entanto, o efeito desses compostos sobre a morfologia micelial de
Pisolithus é desconhecida, impedindo o uso de tais compostos visando à
protoplastização do micélio.
A necessidade de realização de estudos genéticos nesses organismos
visando à melhoria de suas características biotecnológicas levou à realização
desse trabalho, cujos objetivos centrais são a determinação da composição
química da parede celular dos fungos ectomicorrízicos P. tinctorius (Pers.)
(Coker e Couch) [syn. P. arrhizus; (Scop.:Pers.) Rauschert] PT301 e P.
microcarpus (Cooke & Massee) H4111 e a verificação dos efeitos dos
compostos inibitórios dimetomorfe, piroquilona e quitosana sobre a morfologia
dos micélios desses fungos.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
As micorrizas encontram-se amplamente distribuídas, sendo encontradas
em florestas boreais, temperadas, tropicais, bem como em montanhas,
pradarias e tundras. Estima-se que, aproximadamente, 95 % das raízes finas
da maioria das plantas terrestres estejam colonizadas por fungos micorrízicos
(Martin et al., 2007).
Na natureza, 83 % de todas as dicotiledôneas investigadas, 79 % das
monocotiledôneas e todas as gimnospermas estão associadas a pelo menos
uma espécie de fungo micorrízico (Smith e Read, 1997).
Estão descritas sete tipos de micorrizas, a saber: micorrizas
arbusculares, ectomicorrizas, ectendomicorrizas, micorrizas ericóides,
micorrizas de orquídeas, micorrizas arbutóides e as micorrizas monotropóides.
Embora esses diferentes tipos apresentem características estruturais distintas,
compartilham os processos fundamentais envolvidos no estabelecimento da
simbiose mutualista (Peterson e Farquhar, 1994).
Em florestas boreais e temperadas do hemisfério norte e em regiões
alpinas, as ectomicorrizas são os tipos dominantes (Nelhs et al., 2007). As
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árvores hospedeiras de fungos ectomicorrízicos incluem membros das famílias
Pinacea, Fagacea, Betulaceae, Myrtaceae, Rosaceae, Salicaceae, Cistaceae e
Dipterocarpaceae (Smith e Read, 1997). Embora cerca de 2000 espécies de
plantas formem ectomicorrizas, seu domínio em certas florestas cujas espécies
são fontes de madeira comercial, dão a essa associação grande importância
global. Além disso, as arvóres pertencentes às famílias dominantes das
florestas temperadas, Fagaceae e Pinaceae, são simbiontes ectomicorrízicos
obrigatórios (Nehls e Hampp, 2000).
No Brasil, a importância da associação deve-se ao cultivo de extensas
áreas com essências florestais ectomicorrízicas, tais como o pinho e o
eucalipto. Estima-se que as áreas plantadas com essas espécies no Brasil
sejam superiores a 4,8 milhões de hectares (SBS, 2001).
Pisolithus é um gasteromiceto de distribuição mundial muito ampla, já
tendo sido encontrado em grande variedade de habitats (Marx et al., 1977).
Pertence ao filo Basidiomycota, classe Basidiomycetes, ordem Boletales,
família Pisolithaceae (Catalogue of Life, 2007). Apresenta a capacidade de
formar ectomicorrizas com várias espécies de plantas, tanto angiospermas
quanto gimnospermas (Singla et al., 2004). Essa capacidade de associação
com raízes de várias espécies, o torna organismo modelo para o estudo das
associações ectomicorrízicas (Martin et al., 1999). Entre as espécies
colonizadas por esse fungo destacam-se várias de interesse florestal e
industrial, tais como as pertencentes aos gêneros: Abies, Acacia, Aflezia,
Allocasuarina, Alnus, Arbutus, Arctostaphylus, Betula, Carya, Castanea,
Castanopsis, Casuarina, Eucalyptus, Hopea, Larix, Pinus, Populus,
Pseudotsuga, Quercus e Tsuga (Cairney e Chambers, 1999).
Não obstante sua importância, várias lacunas permanecem abertas no
conhecimento sobre a biologia de Pisolithus, principalmente em função da
estrutura e composição da parede celular, o que impede a utilização de muitas
técnicas convencionais ou moleculares corriqueiramente aplicadas aos estudos
genéticos, fisiológicos e ecológicos de fungos ectomicorrízicos (Hébraud e
Févre, 1988).
A parede celular fúngica é complexa, composta principalmente por
polissacarídeos e glicoproteínas (Magnelli et al., 2005). Tanto para fungos
filamentosos quanto leveduriformes, a parede é importante para a forma da
célula e para a manutenção da integridade do organismo durante o
16
crescimento e divisão celular (Magnelli, 2002). Outras funções importantes para
as células dependem também da presença da parede, tais como a reprodução,
a dispersão, a sobrevivência, as interações com hospedeiros, a aderência a
substratos, a compatibilidade vegetativa e a proteção para a célula
(Albertsheim e Proutry, 1975; Schoffelmeer et al., 1999).
Graças à sua rigidez, a parede celular é essencial para a manutenção do
balanço osmótico necessário à sobrevivência do fungo, mas essa mesma
estrutura deve apresentar, também, certa plasticidade que permita a sua
remodelagem após a ocorrência de certos processos celulares (Magnelli et
al.,2002).
Além de todas as funções da parede, eventos como sinalização, adesão
e digestão extracelulares ocorrem devido à presença de enzimas ou de outras
substâncias presentes no meio ou liberadas a partir da parede celular fúngica
(Magnelli, 2005). Por ser estrutura de superfície, a parede celular desempenha
papel importante na interação da célula fúngica com o ambiente (Farkas,
1985).
Caracteristicamente, as paredes celulares fúngicas são formadas por
dois tipos de componentes: polissacarídeos, que formam microfibrilas
estruturais, destacando-se nesse grupo a quitina, e, também, por componentes
cimentantes, incluindo nesse grupo polissacarídeos, proteínas e lipídios (Ruiz-
Herrera et al., 1996). A quitina é um polímero linear formado pelo aminoaçúcar
2-amino-2-deoxiglicose (N-acetilglicosamina), unidas por ligações glicosídicas
do tipo β-1,4. As ligações β-1,4 desses polissacarídeos permitem às moléculas
formarem microfibrilas. As ligações entre as microfibrilas resultam na formação
de fibras rígidas. Já as outras ligações glicosídicas geralmente resultam em
moléculas helicoidais (Klis et al., 2002). Essas microfibrilas estruturais
exercem papel importante na estrutura e rigidez da parede celular (Ruiz-
Herrera et al., 1996).
Entre os carboidratos estruturais presentes na parede, as formas mais
comuns são os polímeros de glicanas, formadas por unidades de glicose, as
mananas, polímero de manose, além da quitina, constituída de N-
acetilglicosamina (Berry, 1982). São encontrados em menores quantidades na
parede celular dos fungos, a manose, a galactose, a xilose e a fucose,
açúcares encontrados associados a proteínas, formando glicoproteínas, ou são
encontrados como heteropolímeros complexos (Bulone et al., 1992).
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Apesar dessa constituição geral, há grande diversidade entre os
constituintes da parede de diferentes espécies fúngicas, sendo que a
composição pode ser usada na classificação taxonômica dos fungos
filamentosos (Bartnicki-Garcia, 1968), na identificação de leveduras (Gorin e
Spencer, 1970), e, também, na classificação e identificação dos micobiontes de
liquens (Carbonero et al., 2001). Além disso, os polissacarídeos da parede
celular extraídos por álcali e solúveis em água podem ser usados como
marcadores quimiotaxonômicos em níveis de gêneros ou subgêneros, tanto em
formas teleomórficas quanto anamórficas (Prieto et al., 1997).
Estudos de microscopia eletrônica de transmissão e citoquímicos
demonstram a estruturação em camadas da parede celular de Pisolithus
(Bonfante et al., 1998). A camada mais externa apresenta-se como rede densa,
de aspecto fibrilar ou floculento. Essa camada externa gera fibrilas de
polissacarídeos quando as hifas encontram-se na superfície das raízes
(Dexheimer et al., 1994).
Análises imunocitoquímicas demonstram que, de maneira geral, a
parede celular de Pisolithus apresenta camada interna translúcida a elétrons,
limitada por camada elétron - densa. A quitina e os demais glicanos, compostos
que promovem rigidez à estrutura da parede, estão localizados na camada
transparente. Já as proteínas, a exemplo da manoproteína gp95, são
preferencialmente acumuladas na camada mais externa da parede (Martin et
al., 1999).
Outros compostos presentes nas paredes celulares fúngicas são os
lipídeos (Batnicki-Garcia, 1968; Barbosa e Kemmelmeier, 1993). Os ácidos
graxos de parede podem contribuir para a rigidez dessa estrutura, além de
conferir propriedades hidrofóbicas às hifas e aos esporos (Bartnicki-Garcia,
1968).
Os lipídeos de parede celular contêm, principalmente, ácidos graxos
saturados, enquanto os ácidos graxos poliinsaturados, que estão presentes nas
demais frações lipídicas celulares, estão ausentes ou ocorrem em quantidades
muito pequenas (Cameron e Taylor, 1976). Fosfolipídeos são também
encontrados na parede celular fúngica, podendo inclusive representar porção
significativa dos lipídeos da parede celular (Taylor e Cameron, 1973). Outra
característica marcante dos lipídeos de parede é a ausência do ácido
palmitoléico (Bartnicki-Garcia, 1968).
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A análise de ácidos graxos presentes nos basidiósporos de Pisolithus
sp. revelou a presença de 17 ácidos diferentes, variando de 14 a 20 átomos de
carbono (Campos, 2005). A distribuição desses ácidos graxos no basidiocarpo
variou de acordo com estádio de desenvolvimento dos peridíolos. Os ácidos
graxos 15:0, 16:0 2OH, 17:1w9c, 18:1w6c e 20:2w6,9c foram detectados
apenas nos peridíolos indiferenciados (Campos, 2005). Os ácidos graxos 17:0
e 17:1w8c foram detectados nas três primeiras fases de desenvolvimento do
peridíolo, mas não foram encontrados nos esporos livres, enquanto os ácidos
16:0, 16:1w5c, a mistura 16:1w7c e 15:0iso2OH, o ácido 18:1w9c e a mistura
18:2w6,9c e 18:0 ante estavam presentes em todas as fases de
desenvolvimento dos peridíolos (Campos, 2005).
O perfil de ácidos graxos totais do micélio dos fungos ectomicorrízicos
Amanita muscaria (L.) Lam, Paxillus involutus (Batsch.: Fr.) Fr., Suillus luteus
(L.) Roussel, Suillus bovinus (Pers.) Roussel, Xerocomus badius (Fr.) Kühner e
Xerocomus subtomentosus (L.) Fr. demonstrou o predomínio do ácido graxo
18:2w6,9c, além de também estar presente em grande quantidade os ácidos
graxos 16:0 e 18:1w9c (Karlinski et al., 2007). Para esses fungos
ectomicorrízicos, a percentagem relativa média dos ácidos graxos 18:2w6,9c,
16:0 e 18:1w9c correspondeu repectivamente a 61,7 %, 13,76 % e 11,92 %
Uma classe de lipídeos de parede bem caracterizada em fungos são as
glicosilceramidas (GSL) (Nimrichter et al., 2005). Essas moléculas estão
envolvidas no crescimento celular, adesão microbiana, apoptose e distribuição
de proteínas (Nimrichter et al., 2005)
Glicoinositolfosforilceramidas (GIPCs) são GSL que apresentam uma
molécula de açúcar ligada à ceramida por uma ligação inositol fosfato
(Nimrichter et al., 2005). Na parede celular fúngica são também encontrados as
ceramidas monohexoses (CMHs), que contêm uma ceramida ligada a um
resíduo simples de açúcar (Nimrichter et al., 2005).
Foi demonstrado também que Candida albicans (C.P. Robins) Berkhout
sintetiza uma fosfolipomanana (PLM), que utiliza [Man-P-Man] como um
espaçador entre o inositol fosfoceramida e o açúcar (Trinel et al., 2002). A PLM
contém seqüências de β-oligomanosídeos que atuam como adesinas, induzem
a produção de citocinas, além de atuarem na proteção contra anticorpos. A alta
glicosilação torna essas GSLs altamente hidrofílicas, permitindo sua difusão na
parede celular (Nimrichter et al., 2005).
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CMHs fúngicas usualmente apresentam glicose e 9-metil-4,8-
esfingodienina ligadas a um ácido graxo hidroxilado (Barreto-Bergter et al.,
2004). Essas moléculas altamente conservadas são expressas em todas as
espécies de fungos analisadas. Apesar da presença do resíduo de açúcar,
CMHs são altamente hidrofóbicas (Barreto-Bergter et al., 2004).
Tabela 1. Perfil de ácidos graxos totais de culturas puras de fungos ectomicorrízicos.
Valores expressos em %.
Ácidos Amanita Paxillus Suillus Suillus Xerocomus Xerocomus
graxos muscaria involutus luteus bovinus badius subtomento
12:0 0 0 0.15 0.09 0.45 0.75
14:1 0 0 0.13 0 0.24 0
14:0 0.48 0.1 1.11 0.65 1.74 0.6
15:0 2OH 0.93 0 0 0 0 0
15:0 1.08 0.5 0.86 0.94 1.52 1.74
16:0Anteiso 0.02 0 0 0.05 0 0.13
16:1w11 2.09 0 0 0.94 0 7.15
16:1w9 0.03 0 0 0.5 0 0
16:1w7 0.32 0 1.55 0.3 1.59 0.86
16:1w5 0 1.26 0 0 0 2.33
16:0 7.05 16.84 9.88 11.41 18.2 19.19
16:0 2OH 1.75 1.51 0.61 0.85 1.82 1.81
17:0Anteiso 0 0 0.16 0.07 0 0
17:1w8 0.18 2.93 0.47 0.84 1.45 1.39
17:0 1.47 4.62 0 1.11 0.67 1.39
17:0 2OH 1.85 0 0 0 0 0
18:3w6 0 0 0.51 0.12 0 0
18:2w6,9 58.09 52.68 71.04 67.23 64.18 56.98
18:1w9 19.17 17.84 10.71 12.88 6.26 4.69
18:1w7 0 0 0.55 0.29 0.32 0
18:0 4.86 1.11 0.53 1.55 1.02 0.58
19:0 ISO 0.07 0.56 0 0 0 0
Fonte: Karlinski et al., 2007. Ácidos graxos são designados pelo número total de átomos de carbono, acompanhado do número de duplas ligações, com a posição da dupla ligação indicada a partir do metil terminal (w) da molécula. Adaptado de White et al., (1997).
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De extrema importância para a estrutura da parede celular de leveduras
são os glicosilfosfatidilinositol (GPI). Uma porção significativa das proteínas de
parede está ligada a um ancorador de GPI durante seu transporte para a
superfície celular. Na parede celular, o remanescente do ancorador GPI,
contendo as proteínas de parede, liga-se a outros componentes (Klis et al.,
2002).
O estudo de várias características moleculares e fisiológicas dos fungos
requer o enfraquecimento ou a eliminação da parede celular, o que permite o
isolamento de organelas citoplasmáticas, as investigações sobre síntese de
parede celular e crescimento celular sincronizado, a fusão celular, o preparo de
DNA de alto tamanho de fragmentos para clonagem e cariotipagem, a fusão
entre diferentes fungos, a recombinação genética entre organismos
sexualmente incompatíveis e a determinação de polimorfismos de tamanho de
cromossomos (Billich et al., 1988; Minuth e Esser, 1983; Barret et al., 1989;
Hanson e Howell, 2002; Prabavathy et al., 2006; Plummer e Howlett, 1993).
No caso específico de Pisolithus, a eliminação da parede celular é muito
complexa, possivelmente devido à sua intensa pigmentação, que pode conferir
maior proteção às hifas da hidrólise enzimática (Hébraude e Févre, 1988). Em
algumas espécies, quantidades substanciais de pigmentos, polifosfatos e íons
inorgânicos podem também estar presentes na parede celular (Bartnicki-
Garcia, 1968).
As melaninas são compostos de cor marrom escura ou preta,
negativamente carregados, com alta massa molecular, formados pela
polimerização oxidativa de compostos fenólicos (Fogarty e Tobin, 1996). A
melanização das células fúngicas resulta na deposição do complexo polimérico
na parede celular (Nimrichter et al., 2005). As melaninas favorecem a
sobrevivência dos fungos em condições ambientais adversas (Butler et al.,
2004). São responsáveis pela diminuição dos danos provocados pela
exposição à luz ultravioleta e à exposição à radiação solar (Wang e Casadevall,
1994). Além disso, as melaninas tornam o organismo menos susceptível ao
21
ataque de enzimas líticas produzidas por microrganismos do solo (Kuo e
Alexander, 1967). Também exercem importante papel na resistência à
dessecação e a altas temperaturas (Fogarty e Tobin, 1996).
A melanina mais comumente encontrada em fungos parece ser a
melanina diidroxinaftaleno (DHN), produzida por via policetídica e nomeada
pelo produto final 1,8-diidroxinaftaleno, que é polimerizado para formar a
melanina (Butler et al., 2005).
Pelo fato das melaninas oferecerem grandes vantagens adaptativas aos
fungos que as apresentam, muitos pesquisadores vêm estudando compostos
que inibem a síntese ou degradam a melanina, com o intuito de enfraquecer a
parede celular na tentativa de aumentar a susceptibilidade desses fungos à lise
(Butler et al., 2004; Jennings et al., 2000; Fujii et al., 2002). Entre esses
compostos se destaca a piroquilona (Figura 1). A piroquilona atua na
biossíntese de melanina da parede celular fúngica ao inibir a enzima
trihidroxinaftaleno redutase, enzima que catalisa a conversão de 1,3,8-
trihidroxinaftaleno a vermelona, etapa presente na rota de biossíntese da
melanina DHN (Jordan et al., 2001).
Um outro agente utilizado para o enfraquecimento da parede celular é o
dimetomorfe (BASF), composto derivado do ácido cinâmico e pertencente ao
grupo das morfolinas (Figura 1) Apresenta o nome químico (EZ)-4-[3-(4-
clorofenil)-3-(3,4-dimetoxifenil)acriloil]morfolina, É altamente seletivo contra
membros da ordem Peronosporales (Albert et al., 1991), apresenta nível
moderado de sistemicidade apoplástica (Cohen et al., 1995) e capacidade de
inibir vários estágios do ciclo de vida de Phytophthora infestans (Mont.) de Bary
por meio da interrupção da formação da parede celular (Kuhn et al., 1991).
Outro composto que provoca danos à parede celular de fungos é a
quitosana (Figura 1). A quitosana é um polímero de 2-amino-2-deoxi-D-
glicopiranose em ligações β-1,4, ou seja, é um derivado desacetilado da quitina
(Tikhonov et al., 2005). Esse composto é correntemente obtido a partir da
concha externa de crustáceos, tais como caranguejos e siris, a partir de
tratamento alcalino (Batista-Baños et al., 2006). As quitosanas comerciais
apresentam grau de desacetilação normalmente superior a 70% e massa
molecular que varia de 100.000 a 1,2 milhão de Da (Tikhonov et al., 2006).
22
(A)
(B)
(C)
23
Figura 1. Estrutura molecular dos inibidores químicos. (A) piroquilona, (B) dimetomorfe, (C) quitosana. Fonte: ANVISA
Várias hipóteses são postuladas para explicar o mecanismo pelo qual a
quitosana exerce sua função inibitória. Mais comumente, essas hipóteses são
divididas em dois mecanismos (Tikhonov et al., 2006): O primeiro mecanismo
envolve a adsorção da quitosana à parede celular fúngica. Isso é possível
devido à sua natureza policatiônica. O segundo mecanismo, por sua vez,
envolve a penetração da quitosana nas células vivas, levando à inibição de
várias enzimas, além de interferir com a síntese de RNA e de proteínas do
fungo (Rabea et al., 2003).
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
Os procedimentos experimentais foram realizados no Laboratório de
Associações Biológicas Micorrízicas, pertencente ao Departamento de
Microbiologia/BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas
Gerais. Foram utilizados os isolados H4111 de Pisolithus microcarpus, isolado
de Eucalyptus sp., proveniente da Austrália, e PT301 de Pisolithus tinctorius,
isolado de Pinus sp., proveniente da Geórgia EUA, ambos pertencentes à
coleção de culturas do Laboratório de Associações Biológicas Micorrízicas.
3.1. Manutenção das culturas
As culturas dos fungos foram mantidas em placas de Petri contendo 20
mL do meio de cultura Merlin Norkrans Modificado (MNM) [Marx, 1969],
acrescido de extrato de levedura a 0,5 g L-1, em BOD, a 28 °C, sendo
transferidos para meio de cultivo novo a cada 15 dias.
25
3.2. Isolamento da parede celular
O isolamento da parede celular foi realizado segundo Barbosa e
Kemmelmeier (1993) com modificações. O micélio de Pisolithus foi crescido a
28 °C por 15 dias em frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL de
solução MNM, tendo sido transferidos 5 discos de agar contendo micélio das
bordas de colônias. Após esse período, o micélio produzido foi coletado e
lavado com água destilada a 4 °C, para se eliminar traços do meio de cultura. A
seguir, foi suspendido em volume igual de água destilada acrescida de Fenil
Metil Sulfonil Fluoreto (PMSF) 1 mmol L-1 e triturado por cinco minutos em
liquidificador. A suspensão foi prensada em French® Pressure Cell Press SLM
AMINCO à pressão de 19000 psi por 7 vezes, utilizando célula de 5 mL. A
suspensão resultante foi centrifugada a 1600 g por 10 minutos em centrífuga
refrigerada Sorvall® RT6000B. O sedimento resultante foi lavado por
centrifugação a 1600 g por 10 minutos com NaCl 0,9% acrescido de PMSF 1
mM por 2 vezes. O resíduo originado foi suspenso em NaCl 0,9% gelado e
sonicado em Ultrassom Branson 1510 por 20 minutos em banho de gelo. A
suspensão sonicada foi centrifugada como descrito acima, e o sedimento
sonicado foi lavado por centrifugação (4300 g,10 minutos a 4 °C), por 9 vezes
com NaCl 0,9%, e 6 vezes com água Milli–Q gelada, ambas com PMSF. A
parede celular purificada foi liofilizada em liofilizador Edwards Super Modulyo e
mantida em dessecador. A parede liofilizada total do isolado H4111 pesou 5 g,
já a do isolado PT301 pesou 3 g.
3.3. Análises químicas da parede celular 3.3.1. Açúcares neutros e glicose. A hidrólise da parede celular foi realizada
incubando-se 1 mg da parede purificada com 1 mL de H2SO4 por 2 horas à
26
temperatura ambiente. A quantificação dos açúcares neutros foi feita pelo
método do fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956). A concentração de
glicose foi obtida utilizando-se o composto Enzimatique Color Liquide (Merck),
sendo utilizado 1 mL do reagente para 1 mL do hidrolisado diluído em água
Mili-Q, seguido da leitura da absorvância a 510 nm em espectrofotômetro BIO-
RAD Smart SpecTM 3000.
3.3.2. Proteínas. Um miligrama da parede celular liofilizada foi incubada com 1
mL de NaOH a 1 mol L-1 por 2 horas à temperatura ambiente. As proteínas
solúveis foram então quantificadas pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951).
Como padrão foi utilizado Soro Albumina Bovina (BSA).
3.3.3. N-acetilglicosamina. Um miligrama da parede celular liofilizada foi
incubado com 1 mL de HCl 6 mol L-1, por 8 horas, a 100 °C. O conteúdo de N-
acetilglicosamina foi determinado pelo método do p-dimetilaminobenzaldeído
(Kumar e Hansen, 1972).
3.3.4. Cinzas. Para se detectar o conteúdo de cinzas, 100 mg da parede
celular de cada isolado foi mantido em Mufla QUIMIS® a 500 °C até que as
amostras apresentassem massa constante.
3.3.5. Macronutrientes e Micronutrientes. Quinhentos miligramas da amostra
de parede foram transferidos para tubo digestor e acrescidos de 8 mL da
mistura ácida contendo ácido nítrico (65 %) e ácido perclórico (72 %), na
proporção 3:1. Esse material foi mantido a frio por 4 horas. Decorrido esse
tempo, o material foi aquecido lentamente até atingir 200 °C. Após a digestão,
o material foi resfriado e seu volume completado para 25 mL utilizando-se água
destilada. Os teores de minerais foram determinados conforme descrito por
Miyazawa et al. (1999).
Para as análises de nitrogênio, a digestão foi feita misturando-se 100
mg da amostra de parede com 3 mL de ácido sulfúrico, 1 mL de peróxido de
hidrogênio (30 %) e 1 g da mistura de sais de sulfato de potássio mais sulfato
de cobre (10:1) em tubo digestor. Esse material foi aquecido lentamente até
350 °C, resfriado, e o volume completado para 50 mL utilizando-se água
27
destilada. O teor de nitrogênio foi detectado pelo método de Kjeldahl conforme
descrito por Miyazawa et al. (1999).
3.4. Detecção de β-glicanos
Três discos de ágar contendo micélios dos dois isolados de Pisolithus
H4111 e PT301, retirados das bordas de colônias crescidas em meio MNM por
15 dias a 28 °C, foram transferidos para tubos de ensaio com tampas
rosqueadas contendo 5 mL de solução MNM e incubados por 15 dias a 28 °C.
Após esse período de crescimento, os micélios foram coletados e corados em
lâminas de microscopia com 100 μL de Calcofluor White a 1 μg mL-1, por 10
minutos, para a detecção de β-1,4-glicanos. Para a visualização de β-1,3-
glicanos, as hifas foram coradas por 10 minutos com Azul de Anilina a 0,05%
em tampão fosfato de potássio a 0,06 mol L-1. Essas lâminas foram
observadas em microscópio Olympus BX60 com acessórios para
epifluorescência Y-FL, utilizando a faixa de comprimento de onda de 450-520
nm. As imagens foram capturadas utilizando-se o sistema digital Olympus
Color 3.
3.5. Perfil de Ácidos Graxos.
Para a análise do perfil de ácidos graxos da parede celular e do micélio
dos isolados H4111 e PT301, foram utilizados 80 mg da fração da parede ou
do micélio fresco cultivado em frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo 100
mL do meio de cultivo MNM. Para tal, 3 discos de ágar contendo hifas foram
retirados das bordas de colônias crescidas em meio MNM a 28 °C por 15 dias e
transferidos para cada Erlenmeyer. Após o crescimento, o micélio foi lavado em
água destilada a 4 °C por 5 minutos. O material foi transferido para tubos de
ensaio com tampas vedadas por teflon, sendo os ácidos graxos saponificados
28
em 1 mL de metanol-hidróxido de sódio (150 mL de água deionizada, 150 mL
de metanol, 45 g de hidróxido de sódio) a 100 °C por 30 minutos. A seguir
foram adicionados a esse tubos 2 mL de metanol-HCl 6 mol L-1 (1:1,18), sendo
a mistura incubada a 80 °C por 10 minutos. A separação dos ésteres metílicos
de ácidos graxos da fase aquosa acídica para a fase orgânica foi realizada
adicionando-se 1,25 mL de hexano e metil tert-butil éter (1:1) ao tubo. Esse
material foi agitado por 10 minutos, a fase inferior descartada e a fase
superior, contendo os ésteres metílicos de ácidos graxos, foi recuperada. Essa
fase foi lavada com NaOH a 0,25 mol L-1, transferida para tubos de teste. Os
ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) foram determinados por
cromatografia gasosa em cromatógrafo HP 5890 série II. A identificação dos
ácidos graxos foi feita utilizando-se o sistema Sherlock da Microbial
Identification System, por comparação com a biblioteca TSBA 4.0.
3.6. Efeito de compostos inibitórios sobre a morfologia das hifas
A tubos de ensaio com tampas de rosca contendo 5 mL de meio de
cultivo MNM líquido, adicionado de sacarose 0,5 mol L-1,suplementado com 0,
1, 5, 10, 15 e 30 ppm de piroquilona ou dimetomorfe ou com 0, 1, 2, 5 e 10 mg
mL-1 de quitosana foram adicionados três discos de agar contendo hifas
retiradas das bordas de colônias crescidas em meio MNM por 15 dias a 28 °C.
Os tubos foram mantidos em câmara de crescimento a 28 °C por 10 dias. Após
o período de incubação, as hifas foram coletadas, coradas com Vermelho do
Congo a 2% e observadas em microscópio de luz Olympus BX60 visando
identificar as alterações morfológicas resultantes da presença dos compostos
no meio de cultivo.
29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Composição química da parede.
A análise dos constituintes químicos orgânicos da parede celular dos
isolados de P. microcarpus H4111 e P. tinctorius PT301 demonstrou
similaridade entre essas espécies no que concerne a composição da parede
(Tabela 2). Para o isolado H4111, os açúcares representam 72,6 % da massa
seca total da parede, sendo que 46,5 % correspondem aos açúcares neutros e
26,1 % aos açúcares aminados. O isolado PT301 apresenta 71,5 % da massa
seca da parede constituída por açúcares, sendo 48 % açúcares neutros e
23,5 % açúcares aminados.
Embora observa-se a predominância de açúcares na composição da
parede celular fúngica, variações inter-específicas significativas na contribuição
desses compostos para a constituição da parede têm sido relatadas na
literatura. A parede celular de diferentes isolados do fungo fitopatógeno
Fusarium oxysporum (Schldl.) apresenta conteúdo de açúcares neutros
variando de 63 a 66 % e de N-Acetilglicosamina correspondente a 11 % da
massa seca da parede. O conteúdo de proteínas presentes na parede desses
fungos não ultrapassa o valor de 8 % (Schoffelmeer et al., 1999).
30
O fungo Fusarium graminearum (Schwabe) apresenta constituição da
parede celular distinta de F. oxysporum, com concentração de açúcares
neutros de 40 % e de N-acetilglicosamina de 27 % (Barbosa e Kemmelmeier,
1993). As distintas composições da parede celular dessas duas espécies
podem ser atribuídas às diferenças na metodologia de cultivo, à idade do
micélio e, também, à fase do ciclo de vida em que esses microrganismos se
encontravam (Bartnicki-Garcia, 1968).
Estudos realizados com 44 espécies de Penicillium demonstraram que a
composição da parede celular não variou em função de diferentes fontes de
carbono adicionadas ao meio (Leal et al., 1997). Para esses fungos, a
composição da parede parece depender mais da idade do micélio (Ruiz-
Herrera, 1992).
Em Ustilago maydis (DC.) Corda, a participação de carboidratos na
constituição da parede celular da forma micelial é de 78,6 %, sendo que os
açúcares neutros, a N-acetilglicosamina e as proteínas solúveis contribuem
com 62,2, 16,4 e 12 %, respectivamente. A parede celular da forma
leveduriforme apresenta 73,1 % de polissacarídeos neutros, 14,2 % de N-
acetilglicosamina e 16 % de proteínas (Ruiz-Herrera et al., 1996).
Embora os fungos apresentem a quitina como principal polímero
responsável pela rigidez da parede, os oomicetos apresentam parede de
celulose ou de celulose e quitina (Bartnick-Garcia, 1968). Organismos deste
grupo, a exemplo dos gêneros Mindeniella, Araiospora e Phytophthora,
apresentam percentagens de açúcares neutros de mais de 90 % (Bartnick-
Garcia, 1965; Bertke e Aronson, 1985).
31
Tabela 2. Composição da parede celular dos fungos ectomicorrízicos Pisolithus
microcarpus, isolado H4111, e Pisolithus tinctorius, isolado PT301, após cultivo em meio Melin-Norkrans modificado, a 28 °C, por 15 dias.
Componentes Isolados
H4111 PT301
------------------------ % ----------------------
Açúcares neutros 46,5 48,0
Glicose 8,5 7,3
Proteínas 18,4 17,7
N-acetilglicosamina 26,1 23,5
Cinzas 3,8 4,5
Nitrogênio 2,8 2,8
Fósforo 0,2 0,2
Potássio 0,01 0,01
Cálcio 0 0
Magnésio 0 0
Enxofre 0,03 0,07
Sódio 0,31 0,44
---------------------- ppm ---------------------
Zinco 27 83
Ferro 1342 2463
Manganês 0 0
Cobre 109 208
32
O conteúdo de proteínas encontrado na parede celular dos dois isolados
foi semelhante, com valores próximos a 18 % (Tabela 2). Os teores de
proteínas descritos para outras espécies fúngicas se situam entre 8 e 24 %
(Shoffelmeer et al., 1999; Ruiz-Herrera et al., 1996; Pessoni et al., 2005).
Mais de 50 polipeptídeos distintos já foram encontrados em extratos da
parede celular de Pisolithus sp. (Martin et al., 1999). A análise de proteínas
revelou diferenças qualitativas e quantitativas significativas na composição da
parede celular de hifas em associação ou não (Tagu et al., 1996). As
glicoproteínas de 72 e de 95 KDa, gp72 e gp95, são as proteínas mais
abundantes na parede celular da hifa não-simbiótica (Tagu et al., 1996).
Observações microscópicas realizadas por meio de técnicas de
imunofluorescência utilizando anticorpos anti-gp95 demonstraram que a
manoproteína está presente na superfície celular no micélio não associado
(Martin et al., 1999).
Outra classe importante de proteínas de parede celular em Pisolithus é a
da família das hidrofobinas. Hidrofobinas são proteínas pequenas,
moderadamente hidrofóbicas, com um espaçamento conservado de oito
resíduos de cisteína (Wessels, 1997). Elas podem ser excretadas no meio ou
armazenadas na parede celular. Nesse último caso, conferem aumento na
hidrofobicidade da superfície das hifas, permitindo adesão à superfície do
hospedeiro, como também agregação de hifas (Wösten et al., 1994). As
hidrofobinas desempenham grande número de funções nas diferentes espécies
de fungos, tais como a participação na emergência da hifa aérea, na
emergência dos corpos de frutificação e, também, na formação de conídios
(Wessels, 1997), na patogênese (Talbot et al., 1993) e na simbiose (Tagu et al.,
1996). As hidrofobinas são recrutadas por vários fungos biotróficos para
interações de superfícies associadas com a infecção com a planta ou animal
hospedeiro e também desempenha função importante nas ectomicorrizas
(Tagu et al., 1998).
O conteúdo de cinzas encontrado na parede celular do isolado H4111 foi
de 3,8 % e o do isolado PT301, de 4,5 % (Tabela 2). Em Fusarium
33
graminearum as cinzas representam 4,5 % da massa seca da parede celular
(Barbosa e Kemmelmeier, 1993). Já em Mindeniella e Araiospora os teores de
cinzas equivalem a 2 % da massa seca da parede celular (Bertke e Aronson,
1985).
Os teores de nitrogênio, fósforo e potássio da parede celular foram os
mesmos para os isolados H4111 e PT 301 (Tabela 2). A presença de cálcio,
magnésio e manganês não foi detectada na parede celular desses isolados. O
isolado PT 301 apresentou quantidades de enxofre, sódio, zinco ferro e cobre
maiores do que as do isolado H4111, indicando diferenças inter-específicas no
acúmulo de micronutrientes por esses isolados (Tabela 2).
Alguns relatos indicam que a quantidade de fósforo na parede celular
fúngica situa-se na faixa de 0,3-0,4 % da massa seca da parede celular
(Bartnicki-Garcia, 1965; Barbosa e Kemmelmeier, 1993). Os valores de
concentração de fósforo obtidos neste trabalho (Tabela 2) encontram-se
próximos dessa faixa.
4.2. Detecção de β-Glicanos.
A análise de imagens das hifas de Pisolithus PT301 e H4111 corados
com o fluorocromo Calcofluor White revelaram a presença de β-glicanos por
toda a extensão da parede celular, formando camada homogênea ao longo da
hifa (Figura 2). A presença de quitina em todo o comprimento da parede celular
é também verificada nas demais espécies de fungos verdadeiros analisados
(Shoffelmeer et al., 1999; Barbosa e Kemmelmeier, 1993; Ruiz-Herrera et al.,
1996). Considerando-se a natureza estratificada das paredes celulares
fúngicas, a quitina parece estar restrita à camada transparente a elétrons
(Shoffelmeer et al., 1999).
Essa deposição de β-glicanos ocorre em grande quantidade também nos
septos e nos grampos de conexão (Figura 2). Estudos demonstram que o
fluorocromo Calcofluor White é uma sonda aniônica que se liga
preferencialmente a glicanos β-1,4, tais como quitina, celulose e quitosana. A
reação com glicanos β-1,3 e β-1,6 ocorre em extensão muito inferior (Pringle,
1991). Por esse motivo pode-se inferir que a fluorescência emitida por paredes
34
celulares de fungos verdadeiros coradas com calcofluor deve-se à presença de
quitina (Klis et al., 2002).
Além da quitina, outro β-glicano comum em paredes celulares de fungos
são os β-1,3-glicanos, sendo esses açúcares os principais responsáveis pela
força mecânica da parede célula de leveduras (Smits et al., 1999). A coloração
das hifas dos isolados PT301 e H4111 com azul de anilina evidenciou a
emissão de fluorescência proeminente nas extremidades das hifas (Figura 3),
demonstrando que essas regiões são mais ricas em β-1,3-glicanos do que o
restante do micélio (Figura 3). Shoffelmeer et al. (1999), utilizando a difração de
raios X para a análise da parede celular fúngica, demonstraram a distribuição
de β-1,3-glicanos na camada mais interna da parede celular.
Na sua forma madura, as cadeias de β-1,3-glicanos tornam-se
moderadamente ramificadas, podendo conter aproximadamente 3-4% de
resíduos de glicoses unidas por ligações β-1,6 (Manners et al., 1973). Essas
ramificações são importantes para impedir a extensa cristalização da parede
(Osumi, 1998). Como conseqüência dessa ramificação, várias regiões
redutoras estão presentes nessas moléculas. Esses sítios são utilizados para a
ancoragem de outros componentes da parede celular (Smits et al., 1999). Essa
alteração na conformação da molécula verificada com o aumento da idade do
micélio pode ser o principal responsável pela menor detecção de β-1,3-glicanos
nas partes mais velhas das hifas (Figura 3).
1
1Figura 2. Hifas de Pisolithus microcarpus H4111 e Pisolithus tinctorius PT301
coradas com Calcofluor White, mostrando a distribuição de β-1,4-glicanos. (A, B e E) Distribuição homogênea de β-glicanos ao longo da hifa. (C e D) Presença de β-glicanos nos grampos de conexão (gc) e septos (se). Eem grampos de conexão mais velhos, ocorre maior acúmulo de quitina. Escalas: A, C, D, E: 20 μm; B: 50μm.
35
A B
C D
gc
se
gc
se
E
36
A B
C D
Figura 3. Hifas de Pisolithus sp. coradas com Azul de Anilina. (A e B) Hifas de Pisolithus tinctorius PT301. (C e D) Hifas de Pisolithus microcarpus H411. Maior presença de β-1,3-glicanos nas extremidades das hifas (setas). Escala: A-B: 20 μm, C-D: 5 μm.
37
4.3. Perfil de Ácidos graxos: As frações de parede celular dos isolados H4111 e PT 301
apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas na composição de ácidos
graxos (Tabelas 3 e 4). Foram detectados 25 compostos diferentes na fração
de parede, sendo que a maior diversidade desses compostos foi observada
para o isolado PT 301 (Tabela 3). Os ácidos graxos da parede detectados
contêm de 8 a 20 carbonos, sendo predominantemente saturados ou com uma
insaturação. As percentagens relativas dos ácidos graxos variaram de 0,08 a
40,85 % (Tabela 3). Os ácido graxo mais abundante na parede celular de
H4111 foi o 18:0Ante/18:2w6,9c, enquanto que na parede de PT 301 foi o
18:1w9c (Figura 4). A composição em ácidos graxos da fração de parede
celular diferiu daquela dos micélios (Tabela 3).
Da mesma forma, os micélios dos isolados H4111 e PT 301 apresentaram
diferenças qualitativas e quantitativas na composição de ácidos graxos (Tabela
3), sendo detectados o total de 17 compostos de 10 a 20 carbonos, na maioria
saturados ou contendo uma insaturação. As percentagens relativas variaram
de 0,05 a 72,60 %, sendo a mistura 18:0ante/18:2w6,9c o mais abundante em
ambos os micélios.
O perfil de ácidos graxos totais do micélio livre dos fungos
ectomicorrízicos A. muscaria, P. involutus, S. luteus, S. bovinus, X. badius e X.
subtomentosus tem o predomínio do ácido graxo 18:2w6,9c, além de também
estarem presente em grande quantidade os ácidos graxos 16:0 e 18:1w9c
(Karlinski et al., 2007). Para esses fungos ectomicorrízicos, as percentagens
relativas médias dos ácidos graxos 18:2w6,9c, 16:0 e 18:1w9c
corresponderam, repectivamente, a 61,7%, 13,76% e 11,92% (Karlinski et al.,
2007).
38
01020304050607080
Perc
enta
gem
Rel
ativ
a
ParedeH4111
ParedePT301
MicélioH4111
MicélioPT301
18:1w9c 16:00 18:0A/18:2w6.9c Figura 4: Percentagens relativas dos ácidos graxos mais abundantes encontrados na parede celular e no micélio dos isolados H4111 e PT301 de Pisolithus
39
Tabela 3. Percentagem relativa dos ácidos graxos detectados no micélio e na parede celular de Pisolithus tinctorius PT301 e Pisolithus microcarpus H4111 cultivados em meio Merlin Norkrans Modificado por 15 dias a 28 °C Ácido graxo Pisolithus microcarpus Pisolithus tinctorius
Parede Micélio Parede Micélio
---------------------------------------% -----------------------------------
8:0 3OH - - 0,08 -
9:0 0,39 - 1,45 -
10:0 - 0,08 0,17 -
10:0 ISO - 0,09 - -
12:0 1,12 - 2,61 0,10
12:0 ANTEISO 0,40 - 0,39 -
13:0 ANTEISO 0,36 - 1,16 -
13:0 2OH - - - 0,05
13:0 - - 0,40 -
14:0 - - 0,96 0,09
16:0 19,13 12,83 25,90 12,83
16:1w9c 1,00 - - -
16:1w5c 0,48 - 0,56 -
16:0 2OH 1,53 0,99 1,49 0,60
16:1w7c\15iso2OH 1,02 0,85 1,14 0,93
16:1 2OH - 0,60 - 0,98
17:0 ANTEISO 0,27 - - 0,18
17:1w8c 0,98 0,76 1,02 0,80
17:0 0,38 - 0,43 -
18:0 0,89 0,61 1,29 0,61
18:1w9c 29,31 9,99 29,09 12,57
18:1 2OH 0,49 - 1,39 -
18:0A \ 18:2w6,9c 40,85 72,60 27,22 69,18
18:0 2OH - 0,37 - 0,24
19:0 ISO - - 0,58 -
40
20:0 ISO 0,59 - 0,87 -
20:1w9c - 0,10 0,60 0,47
20:2w6,9c - 0,21 - 0,15
(-) não detectado
41
42
43
Estudo do perfil de ácidos graxos em hifas de Pisolithus tinctorius
cultivadas em meio MNM a 20 °C por 20 dias demonstrou que entre os ácidos
graxos da porção de lipídeos neutros, o mais comum foi o 18:2w6,9 com
49,5%, seguido do 16:0 com 34,12% e o terceiro mais abundante foi o ácido
graxo 18:1w9 com 11,22% (Laczko et al., 2003). A porção correspondente aos
fosfolipídeos, as percentagens apresentadas para esses ácidos graxos foi
respectivamente 11,68%, 17,46% e 66,93% (Laczko et al., 2003).
A composição de ácidos graxos de um organismo depende da idade da
cultura, da fase de crescimento, da disponibilidade de oxigênio e da
composição do meio (Kock e Botha, 1998). Ao se verificar o perfil de ácidos
graxos de determinadas espécies de fungos ectomicorrízicos com diferentes
idades, verificou-se que os fungos com 20 dias de crescimento passam a sofrer
aumento do número de ácidos graxos quando comparados com as mesmas
culturas com 5 dias (Karlinski et al., 2007). Além disso, as condições de
crescimento como a temperatura e presença de precursores no meio alteram o
perfil de ácidos graxos (Lechevalier e Lechevalier, 1988). As diferenças
encontradas entre o presente trabalho e o outro realizado com Pisolithus
tinctorius (Laczko et al., 2003) podem ser resultados tanto da diferença de
idade das culturas trabalhadas (15 e 20 dias), bem como da diferença de
isolados e da temperatura de crescimento (28 e 20 °C, respectivamente).
O perfil de ácidos graxos totais dos basidiósporos de Pisolithus sp.
demonstrou alterações de acordo com o estádio de desenvolvimento dos
peridíolos (Campos, 2005). Os ácidos graxos 15:0, 16:0 2 OH, 17:1w9c,
18:1w6c e 20:2w6,9c foram encontrados apenas na região dos peridíolos
indiferenciados. Os ácidos graxos iso17:1w5c e 20:1w9c foram encontrados
apenas nos peridíolos jovens. Os ácidos graxos 14:0, 18:0 e 17:0 3OH foram
detectados apenas na região dos esporos livres. Os ácidos graxos 17:0 e
17:1w8c foram detectados nas três primeiras fases de desenvolvimento do
peridíolo, mas não nos esporos livres. Os ácidos graxos 16:0, 16:1w5c, a
44
mistura 16:1w7c e 15:0iso2OH, o 18:1w9c e a mistura 18:2w6,9c e 18:0 ante
foram encontrados em todas as fases de desenvolvimento dos peridíolos
(Campos, 2005).
4.4. Efeito dos fungicidas sobre a morfologia das hifas
4.4.1. Dimetomorfe
O fungicida dimetomorfe na concentração de 30 ppm inibiu
completamente o crescimento de P. tinctorius PT301 e P. microcarpus H4111.
Nas concentrações de 1, 5, 10 e 15 ppm, o composto provocou alterações
morfológicas nas hifas, com o aumento da concentração do fungicida no meio.
O tratamento com dimetomorfe a 15 ppm provocou alterações nos
grampos de conexão do isolado H4111, tornando-os arredondados e mais
expandidos (Figura 5). O processo de fusão do grampo com a célula sub-
apical foi também afetado negativamente (Figura 5 B e C).
A alteração e possível disfunção dos grampos de conexão são
obstáculos para os processos de migração nuclear necessários para a
formação do micélio dicariótico (Kope e Fortin, 1991). Uma das possíveis
conseqüências desse fato é a possibilidade de se conseguir fazer o isolamento
das linhagens monocarióticas que originaram esse micélio dicariótico.
Outras alterações observados nos tratamentos com dimetomorfe foram a
presença de estruturas globosas, bastante dilatadas tanto na ponta das hifas
(Figura 6 B, C, E e F) quanto ao longo do micélio (Figura 6 A e D), além de
terem sido visualizadas hifas anormalmente espessas e com sua superfície
modificada (Figura 6 B e G). Foi também visualizado grande vacuolização das
células, com redução das dimensões celulares (Figura 6 H).
Acredita-se que o dimetomorfe interrompa um ou alguns passos da
biossíntese da parede celular de oomicetos, uma vez que não provoca
alterações na estrutura de zoósporos, mas impede a formação do tubo
germinativo (Cohen et al., 1995). O composto apresenta características
semelhantes a outros fungicidas sistêmicos, sendo inclusive biologicamente
45
ativo a baixas concentrações (Albert et al., 2000). Além disso, moderada
intensidade desse fungicida pode ser gerada in vitro com relativa facilidade
(Chabane et al., 1993). Embora seu mecanismo de atuação não esteja
completamente elucidado, há evidências de que prejudique a biossíntese da
parede celular tanto de esporos quanto das hifas de vários oomicetos
fitopatogênicos (Cohen et al., 1995; Stein e Kirk, 2003). Encontram-se descritos
relatos sobre a efetividade do dimetomorfe contra Phytophtora infestans,
Peronospora hyoscyami (Thüm) e Phytophtora cryptogea (Pethyb. & Laff.)
(Benigni e Bompeix, 2004; Perez et al., 2003).
Portanto, esse fungicida é corriqueiramente utilizado para o controle de
oomicetos fitopatógenos, mas os resultados encontrados demonstram que a
utilização de doses baixas desse fungicida provoca o surgimento de grandes
quantidades de anomalias morfológicas, podendo essas alterações estarem
relacionados ao possível enfraquecimento da parede celular de Pisolithus
microcarpus e Pisolithus tinctorius.
46
A
B C
gc
gc
gc
Figura 5. Alterações morfológicas dos grampos de conexão (gc) de hifas
do isolado Pisolithus microcarpus H4111, cultivado por 10 dias a 28 °C em meio MNM suplementado com 15 ppm do fungicida inibidor da síntese de parede celular Dimetomorfe. Escala 20 μm.
47
4.4.2. Piroquilona
A utilização do fungicida piroquilona na concentração de 30 ppm
provocou a morte das hifas dos isolados PT301 e H4111. Quando a piroquilona
foi utilizada na concentração de 1 ppm não foram observadas alterações
morfológicas no micélio de nenhum dos isolados. A utilização do fungicida nas
concentrações de 5, 10 e 15 ppm foi responsável pelo aparecimento de
alterações morfológicas nos dois isolados de Pisolithus, sendo que na
concentração de 15 ppm a piroquilona provocou maior número de alterações
nas hifas. A quase totalidade das hifas tratadas com 15 ppm de piroquilona
apresentaram-se excessivamente enrugadas (Figura 7 C e D). Além das
rugosidades, verificou-se também um grande aumento na ramificação das hifas
tratadas (figura 7 A e B).
A piroquilona ou 1,2,5,6-tetrahidropirro [3,2,1-ij]quinolona-4-um, é um
fungicida pertencente ao grupo das morfolinas e apresenta como fórmula
química bruta C11H11NO. A piroquilona atua na biossíntese de melanina da
parede celular fúngica ao inibir a enzima trihidroxinaftaleno redutase, enzima
que catalisa a conversão de 1,3,8-trihidroxinaftaleno a vermelona, etapa
presente na rota de biossíntese da melanina DHN (Jordan et al., 2001).2
As melaninas DHN são as mais extensivamente estudadas em fungos,
principalmente devido à importância para a penetração do apressório em
células de arroz pelo fungo fitopatogênico Magnaporthe grisea (T.T. Hebert)
M.E. Barr (Howard e Valent, 1996). O apressório desse fungo produz altas
2 Figura 6. Alterações morfológicas provocadas por dimetomorfe nas hifas de
Pisolithus microcarpus H4111 e Pisolithus tinctorius PT301 coradas com Vermelho do Congo. (A e B) Presença de estruturas globosas no meio das hifas. (C, D, E e F) Presença de estruturas em formas de vesículas nas extremidades das hifas. (G) Engrossamento e ondulação das hifas. (H) Extensa vacuolização das células e diminuição das mesmas. Escala 20 μm.
48
concentrações citoplasmáticas de glicerol que serve para gerar alta pressão de
turgor que força a infecção das células hospedeiras (Money, 1997). A melanina
da parede celular desse fungo retém todo o glicerol no apressório, permitindo
alta taxa de transporte de glicerol para conservação do turgor (Butler et al.,
2005). Se a camada de melanina da parede celular está ausente, o processo
de infecção falha devido à alta taxa de perda de glicerol, trazendo como
conseqüência a perda da pressão de turgor (Butler et al., 2005).
49
A B
C D
E F
G H
50
As células da levedura Phaeococcomyces são produtoras constitutivas
de melanina DHN. Essas células são resistentes à degradação e lise por
preparações enzimáticas líticas contendo beta- glicanases e quitinases,
enquanto que as células mutantes albinas ou células selvagens que foram
inibidas na síntese de melanina pelo crescimento em meio ascorbato especial
de pH baixo, são rapidamente destruídas dentro de poucos minutos de
exposição (Butler et al., 2005).
As alterações morfológicas provocadas em Pisolithus pela utilização da
piroquilona demonstram que esse fungo apresenta em seu micélio a melanina
DHN. Além disso, verifica-se que essa melanina desempenha papel importante
na manutenção da estrutura de sua parede celular. Quando a biossíntese da
melanina foi inibida pelo fungicida, as alterações morfológicas resultantes
podem refletir o possível enfraquecimento da parede celular fúngica.
4.4.3. Quitosana
A utilização de quitosana nas concentrações de 1, 2 e 5 mg mL-1
provocou o aparecimento de alterações morfológicas nas hifas de H4111 e
PT301. A aplicação do composto nas concentrações de 10 e 15 ppm provocou
a inibição completa do crescimento. Tanto as hifas crescidas em meio
contendo 1 mg mL-1 quanto aquelas crescidas em meio suplementado com 5
mg mL-1 apresentaram várias alterações morfológicas (Figura 8). As hifas se
tornaram contorcidas, inchadas e em algumas hifas tratadas com o inibidor na
concentração de 5 mg mL-1 foram verificadas também grande dilatação das
extremidades apicais (Figura 8 A e B) Outras alterações morfológicas foram a
intensa constrição e aumento nas ramificações das hifas (Figura 8 C). Além
disso, a coloração com Calcofluor White demonstrou deposição irregular da
quitina na parede celular, sendo observadas pontuações ricas nesses glicanos
ao longo da parede, ao invés da distribuição regular e homogênea observada
nas hifas crescidas na ausência do inibidor (Figura 8 D e E).
Em soluções que apresentam pH inferior a 6,0, a quitosana torna-se
policatiônica, permitindo que reaja prontamente com substâncias
negativamente carregadas como proteínas, polissacarídeos aniônicos, ácidos
graxos e fosfolipídios, sendo que esse comportamento pode ser atribuída pela
51
A B
C D
Figura 7. Alterações na morfologia micelial de Pisolithus crescido por
10 dias a 28 °C em meio MNM suplementado com o fungicida inibidor da síntese de melanina Piroquilona. (A) Extremidade ramificada da hifa de Pisolithus tinctorius PT301. (B) Extremidades ramificadas das hifas de Pisolithus microcarpus H4111. (C) Hifas enrugadas de P. tinctorius. (D) Enrugamento das hifas de Pisolithus microcarpus.. Escala: A-B: 5 μm, C: 50 μm, D: 20 μm.
52
alta densidade dos grupamentos amino presentes na quitosana (Roller e Covil,
rmar qual o mecanismo de ação tenha sido
respon
o de quitosana a
conce
de celular de Pisolithus
somad
1999). Outra característica bastante peculiar às quitosanas é a capacidade de
se quelatar com íons de vários metais, tais como ferro, cobre, cádmio e
magnésio (Roller e Covil, 1999).
Embora não se possa afi
sável em provocar essas alterações morfológicas, presume-se que a
adsorção à parede tenha ocorrido. Graças à sua natureza policatiônica, a
quitosana interage com os resíduos negativamente carregados presentes na
superfície da parede celular. Essa interação leva ao enfraquecimento da
parede, com conseqüente perda de eletrólitos e compostos proteináceos
intracelulares (Benhamou e Thériault, 1992). Por tudo isso pode-se especular
que a quitosana provocou alterações na pemeabilidade da membrana, levando
a um desequilíbrio da pressão osmótica, e esse desequilíbrio provocou as
inúmeras alterações morfológicas verificadas.
Os resultados demonstram que a utilizaçã
ntrações de até 5 mg\mL pode ser uma boa alternativa para provocar o
enfraquecimento da parede celular de Pisolithus sp.3
A análise da constituição química da pare
a ao conhecimento dos efeitos causados à morfologia micelial desse
fungo por inibidores químicos abre novas perspectivas para a seleção de
metodologias eficientes visando ao enfraquecimento da parede celular com a
conseqüente produção de protoplastos de Pisolithus.
3 Figura 8. Alterações morfológicas provocadas por quitosana ao micélio de Pisolithus
tinctorius PT301 e Pisolithus microcarpus H4111. (A) Extremidade dilatada da hifa de P. tinctorius PT301. (B) Dilatações nas pontas das hifas de P. microcarpus H4111. (C) Micélio rico em constrições de Pisolithus H4111. (D e E) Distribuição heterogênea de quitina. Escala: A-D: 20μm, E: 5 μm.
53
A B
C D
E
54
5. CONCLUSÕES
• A parede celular do micélio de Pisolithus tinctorius e Pisolithus
microcarpus é formada predominantemente por açúcares neutros,
• tribuída de forma regular ao
longo de toda a sua extensão, enquanto o conteúdo de β-1,3-glicanos se
• à
do micélio, sendo encontrados ácidos graxos exclusivos de parede
• tomorfe, piroquilona e o composto quitosana
provocam o aparecimento de uma série de estruturas anormais nas hifas
seguido de N-acetilglicosamina e proteínas.
As hifas de Pisolithus apresentam quitina dis
encontra de forma muito mais abundante nas extremidades das hifas.
A composição de ácidos graxos da parede celular difere em relação
celular, assim como são detectados ácidos graxos presentes nas hifas e
ausentes na parede.
Os fungicidas dime
de Pisolithus, podendo esse fato estar relacionado ao possível
enfraquecimento da parede celular desse fungo.
55
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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