UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

VALIDAÇÃO E COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS EMPREGADAS NA DETERMINAÇÃO DE CMP EM LEITE

Autor: Cleusely Matias Souza

Orientador: Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau

GOIÂNIA

2007

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CLEUSELY MATIAS DE SOUZA

VALIDAÇÃO E COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS EMPREGADAS NA DETERMINAÇÃO DE CMP EM LEITE

Tese apresentada para a obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da

Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração: Higiene e Tecnologia de Alimentos

Orientador: Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau

Comitê de Orientação: Prof. Dr. Celso José de Moura

Profa. Dra. Iolanda Aparecida Nunes

GOIÂNIA 2007

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Esta folha em branco será substituída por uma outra assinada pela banca Se retirá-la vai dar problema nas demais. O que você acha?

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Dedico

Ao meu querido, admirável e amado filho Antenor

Precioso como a lápide de rubis; Razão de existência em minha curta eternidade,

E razão de nobres declarações de amor.

A minha amável, meiga e generosa mamãe Sebastiana (Tia Fia)

Mamãe amada, Mulher que admiro e respeito,

Guerreira na causa dos aflitos e abandonados, Santa, maravilhosa, a mulher dos meus sonhos.

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AGRADECIMENTOS

Ao Deus eterno, pelo amparo e proteção nos momentos de tribulações, sustentando-me e colocando pessoas amigas e fraternas no meu caminho. Às minhas mães, Celeste Martins e Sebastiana Velasco, por estarem presentes sempre em minha vida, principalmente nos momentos difíceis. Ao meu companheiro e amigo, Tasso Lins Marinho, que durante todo o tempo esteve ao meu lado, segurando a minha mão e confortando o meu coração. Aos meus irmãos e sobrinhas pela amizade e dedicação. Ao meu orientador professor Edmar Soares Nicolau pela orientação, paciência e apoio para desenvolvimento deste trabalho, com fraternal afeto. Ao meu querido mentor e sábio professor Albenones José de Mesquita, pelo carinho, amizade e dedicação. À banca de qualificação pela seriedade na avaliação e sugestões Ao professor Moacir Evandro Lage, pessoa humana, paciente, amigo, extremamente atencioso e dedicado, que esteve presente nos momentos de desânimo e total desespero. Sem o seu apoio e carinho, praticamente seria impossível a realização de um sonho ...doutorado. A professora Iolanda A. Nunes, co-orientadora, pela amizade, correções, sugestões preciosas. Ao professor Celso José de Moura, co-orientador, pela colaboração e profissionalismo. A Karyne de Oliveira Coelho, amiga fraterna e companheira das horas de agonia, estando ao meu lado o tempo todo ajudando em todas as etapas do presente trabalho, agüentado, às vezes, o mau humor das horas de desânimo e cansaço. Obrigada pela a sua amizade e carinho. A professora Cíntia Minafra e Resende pelo carinho, amizade e solidariedade nas horas difíceis. A Dra. Sandra Fukuda pelo carinho e doação de artigos científicos. Ao meu querido e inesquecível amigo professor Jurij Sobestiansky, pessoa que admiro muito e que jamais esquecerei pela sua amizade, força, determinação e carisma.

vi

A Fundação Educacional de Jataí, Campus da UFG de Jataí, ao Programa de Pós-Graduação da Escola de veterinária, Centro de Pesquisa em Alimentos por proporcionar o desenvolvimento do presente trabalho. Aos meus colegas de Curso Regiane Porto, Moema Chediak, Priscila Alonso, Karyne Coelho, Cláudia Bueno, Marcele Louise Tadaiesky Arruda, Valter F.F. Bueno, Robert Taylor, Ana Paula Santim, Rodrigo Balduíno. Aos técnicos de laboratório Rodrigo Almeida Oliveira, Silmara Damaso Fernandes e Winder Macusuel B. Oliveira pela ajuda e colaboração na execução da parte prática da tese. E ao nosso querido Wilson Cosme Ricardo, mestre dos magos, pelo carinho e amizade. Ao professor Jaison Pereira de Oliveira pelo carinho e empenho nos tratamentos estatísticos do trabalho. Ao professor Antônio Carlos S. L. Júnior e a encarregada do laboratório de microbiologia e físico-química, Silvana Coelho Leão que contribuíram de forma competente para a realização deste trabalho As bolsistas, Ana Izabel Passarella Teixeira, Lorena Alves de Carvalho e Tainá Leite Almeida que demonstraram carinho, amizade, cooperação e profissionalismo no decorrer do desenvolvimento do presente trabalho. A todos aqueles que acreditaram e torceram pela realização deste trabalho.

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SUMÁRIO

Página

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS ......................................................... ix

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 6

CAPÍTULO 2 – VALIDAÇÃO INTRALABORATORIAL DO MÉTODO

COLORIMÉTRICO ADAPTADO PARA DETERMINAÇÃO DE CMP EM LEITE

CRU REFRIGERADO .......................................................................................... 10

INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12

MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 15

Local do experimento ........................................................................................... 15

Validação do equipamento de espectrofotometria ............................................... 15

Validação do método colorimétrico adaptado....................................................... 16

Procedimento ....................................................................................................... 16

Validação do método colorimétrico por comparação com a técnica CLAE. ......... 20

Colheita de amostras ........................................................................................... 20

Análises laboratoriais ........................................................................................... 21

Método colorimétrico adaptado. ........................................................................... 21

Cromatografia líquida de alta eficiência ............................................................... 22

Análises estatísticas ............................................................................................. 24

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 25

Exatidão ............................................................................................................... 25

Precisão ............................................................................................................... 25

Linearidade. .......................................................................................................... 27

Seletividade. ......................................................................................................... 29

Limite de detecção e quantificação. ..................................................................... 29

Comparação do método colorimétrico com a técnica CLAE. ............................... 30

CONCLUSÕES .................................................................................................... 32

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 33

viii

CAPÍTULO 3 – COMPARAÇÃO DE TRÊS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA

PESQUISA DE SORO EM LEITE CRU REFRIGERADO .................................... 38

INTRODUÇÂO ..................................................................................................... 40

MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 43

Amostragem ......................................................................................................... 43

Análises Laboratoriais .......................................................................................... 43

Cromatografia líquida de alta eficiência ............................................................... 43

Método colorimétrico adaptado. ........................................................................... 45

Método da ninidrina ácida. ................................................................................... 46

Análise estatística ................................................................................................ 47

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 48

CONCLUSÕES .................................................................................................... 54

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 55

CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS. ........................................................ 59

RESUMO GERAL

O presente trabalho foi conduzido com objetivo de validar intralaboratorialmente o método colorimétrico adaptado na determinação do caseinomacropeptídeo (CMP) e comparar três metodologias analíticas para detecção de soro em leite cru refrigerado. A validação foi realizada por meio de metodologia de validação reconhecida, utilizando parâmetros de avaliação e por comparação com a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As características típicas consideradas foram: exatidão, precisão, linearidade, seletividade, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ). Os métodos utilizados na comparação foram: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), ninidrina ácida e colorimétrico adaptado. Para a realização do experimento foram colhidas 100 amostras de leite cru refrigerado de tanque de expansão de 24 propriedades rurais do Estado de Goiás. Para a validação, os limites de recuperação do analito variaram de 123,78% a 137,47%. Para a precisão foram obtidos valores de coeficiente de variação (CV) de 0,66% a 1,79% determinados pelo analista 1 e valores de 0,53% a 0,97% estimados pelo analista 2. Com relação à precisão intermediária observou-se que houve diferença entre analistas. Observou-se pelo coeficiente de regressão que a relação entre as concentrações de fortificação e os valores recuperados é suficientemente linear (0,99) com CV (0,44% a 2,50%). A recuperação do analito foi sempre uma resposta maior que a concentração utilizada. Nos dados de seletividade observou-se uma boa separação entre o soro e os constituintes do leite. O LD e LQ foram respectivamente 0,1% e 0,6%. Na comparação entre os métodos a média da concentração de soro detectada nas amostras positivas pela CLAE (22,06%) foi significativamente superior (p<0,01) a média detectada pelo método colorimétrico adaptado (6,76%). Na comparação entre técnicas Das amostras colhidas, em 68% não foi detectada a presença de soro pela técnica CLAE. Estas, quando submetidas à análise pelo método da ninidrina ácida, apresentaram 10 (14,7%) de amostras negativas e 58 (85,3%) de positivas. O teor médio de ácido siálico encontrado na técnica da ninidrina foi de 5,58µg/mL, com valor mais freqüente de 2,70µg/mL. Os valores mínimo e máximo encontrados foram de 1,96µg/mL e 48,63µg/mL, respectivamente. Das 68 amostras negativas pela CLAE, duas foram positivas (2,94%) e 66 (97,06%) negativas, quando analisadas pelo método colorimétrico. A freqüência relativa de amostras positivas foi de 32%, apresentando a CLAE a maior média de soro (14,37%), seguida do método colorimétrico (5,28%) e da ninidrina ácida (3,12%). Os valores mínimos e máximos encontrados foram de 0,44% e 41,36%; 0,02% e 14,51% e 0,69% e 9,82%, respectivamente para CLAE, colorimétrico adaptado e ninidrina ácida. Os métodos quando submetidos a um teste (Tukey 5%) visando a comparação entre médias de soro revelaram: CLAE (4,59%), colorimétrico (1,89%) e ninidrina ácida (1,66%) diferença significativa (p<0,01) entre eles. Baseado nos parâmetros de avaliação utilizados na validação, concluiu-se que o método colorimétrico adaptado pode ser considerado uma metodologia de triagem para a detecção de adição de soro em leite, reservando a CLAE as contraprovas laboratoriais e casos duvidosos. Com relação à comparação de métodos, a técnica CLAE diferiu dos métodos de ninidrina ácida e colorimétrico, enquanto que, estes não diferiram entre si (p>0,05), podendo ambos ser utilizados como metodologias de triagem. Dentre as três técnicas, a CLAE foi a metodologia de maior sensibilidade na detecção e quantificação do soro em leite cru refrigerado. Palavras chaves: soro de queijo, tanque de expansão, CMP, HPLC, parâmetros de validação, fraude.

x

ABSTRACT This experiment was runned to validate, at intralaboratorial level, the adapted colorimetric method in detecting the caseinomacropeptide (CMP) and to compare the three methodologies available to detect milk whey in refrigerated raw milk. For validation purposes, we used a well-known validation method with validation parameters and we compared them to the standard technique: the high performance liquid chromatography (HPLC). Exactness, precision, linearity, selectivity, limit of detection (LD) and limit of quantification (LQ) were the characteristics taken into account. The methodologies compared were: high performance liquid chromatography (HPLC), acid ninidrine and adapted colorimetric method. The experiment was conducted by analyzing 100 samples of refrigerated raw milk in bulk tanks from 24 dairy properties in the State of Goiás. The limits for analytes recovery ranged from 123.7 to 137.47%. Regarding to precision we obtained values of 0.66 to 1.79% for coefficient of variation (CV) found by the analyst 1 and 0.53 to 0.97% for the CV found by analyst 2. There was statistical difference between analysts when the intermediate precision was taken into consideration and there was also sufficient linearity (0.99, CV= 0.44 to 2.50%) estimated by the coefficient of regression regarding to statistical relationship between concentrations of fortifications and values of recuperation. Values for the recuperation of analyte were always greater than those ones of the concentration used. Data for selectivity showed an acceptable separation degree between milk whey and the others milk constituents. LD and LQ were 0.1 and 0.6% respectively. When the methods were compared, the mean for concentration of milk whey for positive samples detected by the HPLC method (22.06%) was statistically greater (p<0.01) than the mean detected by the colorimetric method (6.76%). When comparing the techniques, milk whey was not detected by HPLC method in 68% of the samples harvest. When analyzed by acid ninidrine method, 10 (14,7%) were negative and 58 (85,3%) were positive. The average concentration of sialic acid by the ninidrine method was 5.58µg/mL (the most frequent value was 2.70µg/mL) and lower and higher values were 1.96 and 48.63µg/mL respectively. Among the 68 negative samples by the HPLC method, two of them (2,94%) were classified as positive and 66 (97,06%) as negative by the colorimetric method. Relative frequency of positive samples was 32/100 and the higher mean of milk whey detection was 14.37% by HPLC followed by 5.28% with the colorimetric method and 3.12% when the acid ninidrine method was used. Lower and higher values detected were as follow: 0.44 and 41.36% for HPLC; 0.02 and 14.51% for the colorimetric method; 0.69 and 9.82% for acid ninidrine method. When statistically compared (Tukey test 95% confidence interval), the means of HPLC (4.59%), Colorimetric test (1.89%) and acid ninidrine test (1.66%) were significantly different (p<0.05). In conclusion, based on the parameters of evaluation used on validation process, the adapted colorimetric method can be considered as a screening method for the detection of fraudulent addition of whey in milk while the HPLC method should be used for laboratorial confirmation and controversial situations. Concerning the comparison among the methods, the HPLC technique was statistically different from the other methodologies: acid ninidrine and adapted colorimetric method, which showed no differences between them (p>0,05), and both of them can be used as screening methods. Among the three methodologies, the HPLC was the one with higher sensibility on detecting and quantifying the whey in raw refrigerated milk. Key-words: Milk whey, bulk tanks, CMP, HPLC, validation parameters, fraud.

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS

A produção de leite no Brasil cresceu a uma taxa média de 4,5% ao

ano na última década, passando de 17 bilhões de litros em 1995 para 25.333

bilhões em 2005. Atualmente, o Brasil é o sexto maior produtor, com um volume

total de 26 bilhões de litros. Os Estados que mais produzem são Minas Gerais,

Goiás, Paraná, Rio Grande do Sul e São Paulo, respectivamente (ANUALPEC,

2006).

No entanto, mesmo com a intensificação da produção, o país depara-

se com problemas relacionados à qualidade do leite cru, principalmente em

virtude das atividades de controle da qualidade, as quais se restringiam, até 2005,

basicamente a adulterações do produto cru ou a prevenção de fraudes. Mediante

a adoção de parâmetros físico-químicos como densidade à 15ºC, acidez, teor de

gordura, de extrato seco desengordurado, redutase, índice crioscópico e

estabilidade ao alizarol. Quanto aos parâmetros microbiológicos, os mesmos só

eram adotados para o leite tipo "A” e “B” (BRASIL, 1980; 2002).

Tendo como enfoque estes aspectos, recentemente, o Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por meio da Instrução Normativa

número 51 (IN51) de 2002, que entrou em vigor em 1° julho de 2005 nas regiões

sul, sudeste e centroeste, estabeleceu novos parâmetros para produção e

avaliação do leite cru. Ressalta-se que dentre os parâmetros previstos, a

contagem bacteriana total (CBT) torna-se uma ferramenta utilizada na

averiguação da qualidade do leite, sendo que o limite máximo para CBT do leite

cru refrigerado é de 1.000.000 UFC/mL, prevendo a redução gradativa para

100.000 UFC/mL em 2011. No que concerne às normas para a produção,

destaca-se à adoção do sistema de granelização, que tem por finalidade o

resfriamento do leite após a ordenha a uma temperatura de 4°C a 7ºC na

propriedade e 10°C na indústria em um período máximo de 3h, sendo que o

armazenamento no tanque de expansão na propriedade não deve ultrapassar

48h, seguindo o transporte em caminhão isotérmico para a indústria beneficiadora

(BRASIL, 2002).

Sabe-se que a qualidade do leite cru e, conseqüentemente, dos seus

derivados, pode ser influenciada por vários fatores, dentre os quais pode-se citar

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a alimentação, o manejo e o potencial genético dos rebanhos (HARRIS &

BACHMN, 1998). Por outro lado, os fatores relacionados à obtenção,

armazenagem e transporte do produto recém-ordenhado relacionam-se

diretamente à qualidade microbiológica do produto incluindo aqui os prazos de

validade do leite e de seus derivados (BRANDÃO, 2000; VIDAL-MARTINS et al.,

2005).

Considerando as alterações propostas na IN 51 e os principais fatores

que afetam a qualidade do leite, PINTO et al. (2006) observaram que a

estocagem do leite cru refrigerado na fonte de produção reduz substancialmente

as perdas econômicas por atividade acidificante de bactérias mesofílicas. Porém,

esta estocagem permite a seleção de bactérias psicrotróficas, especialmente,

quando o leite é estocado por um período prolongado ou que foi obtido,

armazenado e transportado em condições inadequadas de higiene, sendo que

estes fatores podem acontecer de maneira associada ou não.

Em relação aos microrganismos psicrotróficos, SANTOS & FONSECA

(2001) relataram em um estudo de revisão que a palavra psicrotrófico tem sido

utilizada como sinônimo de psicrófilo gerando dificuldade na utilização dos

termos. Visando sanar este contratempo os autores propuseram que psicrófilo

seriam bactérias com temperatura ótima de crescimento inferior a 7,2°C e os

psicrotróficos aqueles microrganismos que se multiplicam a uma temperatura

ótima entre 20 a 40°C, sendo capazes de crescer em temperatura inferior a 7°C

(COUSIN, 1982; SANTANA et al., 2001).

As principais bactérias psicrotróficas responsáveis pela contaminação

do leite são as Gram-negativas dos gêneros, Pseudomonas, Aeromonas,

Achromobacter, Alcaligenes, Serratia, Flavobacterium e Chromobacterium e as

Gram-positivas dos gêneros Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus,

Clostridium, Leuconostoc, Lactococcus, Microbacterium e Lactobacillus (GARCÍA-

ARMESTO & SUTHERLAND, 1997; RYSER, 1999). Dentre estes

microrganismos, o gênero Pseudomonas é o mais freqüentemente isolado de

leites e derivados acondicionados sob refrigeração à temperatura entre 0 e 7°C

(COUSIN, 1982; WIEDMANN et al. 2000; PINTO et al., 2006).

Ainda no que se refere aos psicrotróficos, SANTOS & FONSECA

(2007) ressaltaram a importância e o efeito destes microrganismos para a cadeia

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láctea. Os pesquisadores relataram que estas bactérias produzem enzimas

lipolíticas e proteolíticas termorresistentes, as quais continuam agindo mesmo

após a pasteurização ou tratamento UHT “ultra-high temperature”, sobre os

constituintes do leite, causando reflexos negativos no produto final e diminuindo a

vida de prateleira.

FUKUDA (2003) destaca ainda que, quando as condições higiênico-

sanitárias não forem devidamente adotadas na cadeia produtiva do leite, a

atividade proteolítica por meio da ação dos microrganismos psicrotróficos, torna-

se a principal responsável pela proteólise do leite. O interessante é que esta

alteração ocorre de forma similar à ação da renina na fase inicial de coagulação

do leite durante a produção de queijo. A atividade proteolítica do leite também

pode ocorrer devido a enzimas nativas como a plasmina (FUKUDA et al., 2004) e

ainda favorecida pelo processo de refrigeração. CROMIE (1992) relata que a

estocagem do leite em baixas temperaturas faz com que a β-caseína se dissocie

da micela, ocasionando um aumento da quantidade de caseína solúvel em até

30%, tal fato é indicativo de que a refrigeração pode aumentar à susceptibilidade

das frações de caseína à proteólise.

Além dos aspectos citados, ao analisar a qualidade do leite, outros

fatores devem ser considerados, as fraudes, as quais visam aumentar o tempo de

vida de prateleira do produto e/ou aumentar o ganho, com o litro do alimento

vendido. Essa é uma prática que tem merecido atenção dos órgãos de

fiscalização pelo fato de implicar na incorporação de proteínas do soro em leites

cru e beneficiados, principalmente bebidas lácteas, leite em pó (MONTÁÑEZ et

al., 2000; SOUZA et al., 2000; FERREIRA & OLIVEIRA, 2003), queijos (LO &

BASTIAN, 1998), leite UHT (RECIO et al., 1996; TOLENTINO et al., 2006), leite

pasteurizado (URBÁN, 1998) entre outros. Embora o valor nutricional da proteína

do soro seja alto, a substituição do leite por soro precisa ser especificada com

clareza, pois, caso contrário, é considerado fraude (VELOSO et al., 2002).

A adição fraudulenta desta proteína é normalmente detectada e

quantificada pela determinação do glicomacropeptídeo (GMP) ou

caseinomacropeptídeo (CMP). Este polipeptídeo é um componente específico do

soro obtido após a coagulação do leite pela renina que deverá estar ausente no

leite em condições normais (GREENBERG & DOWER, 1986; RECIO et al., 1997).

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O que torna preocupante é que este polipeptídio também pode estar presente em

condições onde ocorre proteólise por ação de microrganismos psicrotróficos ou

enzimas naturais do leite, dificultando assim, obter informações quanto à origem

do problema (FUKUDA, 2003; PINTO et al., 2006; SANTOS & FONSECA 2007).

Deste modo, o MAPA estabeleceu na portaria n° 124, de 23 de

setembro de 1991, dois métodos oficiais para detecção de soro no leite, sendo um

qualitativo e o outro quantitativo. O primeiro procedimento é realizado utilizando o

reativo de Ehrlich para a determinação do ácido siálico. Enquanto que o método

quantitativo detecta e quantifica o GMP por meio da cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) (BRASIL, 1991). A pesquisadora FUKUDA (2003) ressalta ainda

que a CLAE é a técnica aceita internacionalmente para identificar e quantificar o

CMP.

A aplicação destes métodos se torna muitas vezes inviáveis em virtude

do alto custo dos equipamentos, reagentes e da necessidade de mão-de-obra

altamente especializada (RECIO et al., 1997). Assim sendo, têm sido realizados

estudos com o intuito de simplificar a marcha analítica e aumentar a sensibilidade

dos métodos existentes (FUKUDA et al., 1994; OLIVEIRA et al., 1998; FUKUDA

et al., 2004).

Dessa forma, OLIVEIRA et al. (1998) adaptaram o método Ehrlich. No

método convencional a leitura é baseada na coloração desenvolvida pela reação

do ácido siálico ligado ao GMP, liberado por hidrólise ácida e detectado como um

cromóforo púrpura após reação com p-dimetilaminobenzaldeído (BRASIL, 1991),

enquanto que no método colorimétrico adaptado, utiliza-se a espectrofotometria

na região visível do espectro a 520nm, sendo a leitura baseada na absorbância

da coloração opaca do resíduo de ácido siálico. Por sua vez FUKUDA et al.

(1994, 1996) padronizaram a técnica de determinação quantitativa do ácido siálico

livre no leite através de espectrofotômetro. Em 2003, FUKUDA relatou que esta

metodologia apresentou correlação positiva (r=0.981) com o método oficial de

CLAE.

Outros métodos têm sido descritos visando à detecção e quantificação

do CMP na pesquisa do soro em leite dentre os quais, os métodos

cromatográficos (RECIO et al., 1996; VELOSO et al., 2001), em particular, a

cromatografia de exclusão molecular (VAN HOOYDONK & OLIEMAN, 1982),

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“reversed-phase High-performance liquid chromatographic” (CLAE em fase

reversa) (OLIEMAN & VAN RIEL, 1989; URBANKE et al., 1992; RECIO et al.,

2000a) e cromatografia de troca iônica (LÉONIL & MOLLÉ, 1991). A eletroforese

capilar (RECIO et al., 1996, 2000b; MIRALLES et al., 2000; VELOSO et al., 2001;

MIRALLES et al., 2003) de zona com uma coluna hidrofílica de sílica fundida

(RIEL & OLIEMAN, 1995) foi também utilizada com sucesso. Um outro método

usado é a espectroscopia por absorção (MIRALLES et al., 2000) e por absorção

no ultravioleta (VELOSO et al., 2001). Por último podem-se citar os métodos

imunológicos (VELOSO et al., 2001).

Considerando os aspectos mencionados o presente estudo foi proposto

com o objetivo de validar o método colorimétrico adaptado para a quantificação de

proteólise no leite, comparando-o com os resultados obtidos pelas técnicas de

CLAE e espectrofotométrica utilizando-se a ninidrina ácida.

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REFERÊNCIAS 1. ANUALPEC, 2006. Anuário da Pecuária Brasileira – FNP Consultoria &

Comércio. NEHMI, J. M. D.; NEHMI FILHO, V.; FERRAZ, J. V. (Coord.). São Paulo: Argros, 2006, 370p.

2. BRANDÃO, S.C.C. O futuro da qualidade do leite brasileiro. Revista Indústria

de laticínios, ano 5, n.28, p.68-70, jul/ago., 2000. 3. BRASIL. Ministério da Agricultura, leis, decretos, etc. Inspeção industrial e

sanitária de leite e derivados. In: Regulamento da inspeção industrial e sanitária de produtos de origem animal (RIISPOA), aprovado pelo decreto n° 30.691 de 29/03/52, alterado pelo decreto n°1.255 de 25/06/62. Brasília, 1980.

4. BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Portaria nº. 124 de 23 set.

1991, Aprova métodos analíticos qualitativo e quantitativo de detecção de soro em leite. In: Diário Oficial da União, 20 nov. 1991, p.26245-6.

5. BRASIL. Instrução Normativa n. 51 de 18 de setembro de 2002. Dispõe sobre

regulamentos técnicos aplicado ao leite cru e pasteurizado. Diário Oficial da União, Brasília, 20 set. 2002. Seção 1, n. 183, 46p.

6. COUSIN, M.A. Presence and activity of psychrotrophic microorganisms in milk

and dairy products: a review. Journal of Food Protection, v.45, p.172-207, 1982.

7. CROMIE, S. Psychrotrophs and their enzyme residues in cheese milk.

Australian Journal of Dairy Technology, v.47, n.2, p.96-100, 1992. 8. FERREIRA, M.P.L.V.O.; OLIVEIRA, M.B.P.P. Determination of

caseinomacropeptide by an RP-HPLC method and monitoring of the addition of rennet whey to powdered milk. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, v.26, p.99-107, 2003.

9. FUKUDA, S. P.; ROIG, S. M.; PRATA, L. F. Metodologia quantitativa para

determinação espectrofotométrica de ácido siálico em leite. In: XII Congresso Nacional de Laticínios, Juiz de Fora/MG. Anais do XII Congresso Nacional de Laticínios. p.114-120, 1994.

10. FUKUDA, S. P.; ROIG, S. M.; PRATA, L. F. Aplicação do método da ninidrina

ácida como teste de “screening” de plataforma para a detecção da adição de soro ao leite. Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos – SBCTA, v.16, n.1, p.52-56, 1996.

11. FUKUDA, S. P. Estudo da correlação entre o método da ninidrina ácida e

a cromatografia líquida de alta eficiência para a dosagem de glicomacropeptídeo e caseinomacropeptídeo em leite. 2003. 149f. Tese (Doutorado em Tecnologia de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas.

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12. FUKUDA, S.P.; ROIG, S.M.; PRATA, L.F. Correlation between acidic ninhydrin

and HPLC methods to evaluate fraudulent addition of whey in milk. Journal EDP Science, v.84, p.501-512, 2004.

13. GARCÍA-ARMESTO, M. R.; SUTHERLAND, A. D. Temperature

characterization of psychrotrophic and mesophilic Bacillus species from milk. Journal of Dairy Research, v. 64, p. 261-270, 1997.

14. GREENBERG, R.; DOWER, H. J. Detection of added whey protein

concentrate in nonfat dry milk by amino acid analysis. Journal Agriculture and Food Chemistry, n.34, p.30-32, 1986.

15. HARRIS JR, B. & BACHAMAN, K. C. Nutritional and management factors

affecting solid-non-fat, acidity and freezing point of milk. Gainesville, Institute of Food and Agricultural Sciences, 1998. (Florida Cooperative Extension Service, DS25).

16. LÉONIL, J.; MOLLÉ, D. A method for determination of macropeptide by cation-

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CAPÍTULO 2 – VALIDAÇÃO INTRALABORATORIAL DO MÉTODO COLORIMÉTRICO ADAPTADO PARA DETERMINAÇÃO DE SORO EM LEITE CRU REFRIGERADO

RESUMO: O experimento foi conduzido com o objetivo de validar intralaboratorialmente o método colorimétrico adaptado utilizando a técnica espectrofotométrica e tendo por base o método qualitativo para detecção de soro no leite para pesquisa de caseinomacropeptídeo (CMP), metodologia oficial empregada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). A validação foi realizada por meio de uma metodologia de validação reconhecida, utilizando parâmetros de avaliação e por comparação com a técnica padrão, ou seja, comparando a metodologia colorimétrica com o método validado que é a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As características típicas consideradas para avaliação e desempenho do método colorimétrico foram exatidão, precisão, linearidade, seletividade, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ). Para realização da validação por comparação entre métodos testado e validado, foram colhidas 100 amostras de leite cru refrigerado de tanque de expansão de 24 propriedades rurais do Estado de Goiás. Os limites de recuperação do analito variaram de 123,78% a 137,47%. Para a precisão foram obtidos valores de coeficiente de variação (CV) de 0,66% a 1,79% determinados pelo analista 1 e valores de 0,53% a 0,97% estimados pelo analista 2. Com relação à precisão intermediária observou-se que houve diferença entre analistas. Observou-se pelo coeficiente de regressão que a relação entre as concentrações de fortificação e os valores recuperados é suficientemente linear (0,99) com CV (0,44% a 2,50%). A recuperação do analito foi sempre uma resposta maior que a concentração utilizada. Nos dados de seletividade observou-se uma boa separação entre o soro e os constituintes do leite. O LD e LQ foram respectivamente 0,1% e 0,6%. Na comparação entre os métodos a média da concentração de soro detectada nas amostras positivas pela CLAE (22,06%) foi significativamente superior (p<0,01) a média detectada pelo método colorimétrico adaptado (6,76%). Baseado nos parâmetros de avaliação utilizados na validação, concluiu-se que o método colorimétrico adaptado pode ser considerado uma metodologia de triagem para a detecção de adição de soro em leite, reservando a CLAE as contraprovas laboratoriais e casos duvidosos. Palavras–Chave: Soro em leite, parâmetros de validação, CLAE, método

espectrofotométrico, método colorimétrico.

11

INTRALAB VALIDATION OF THE COLORIMETRIC METHOD ADAPTED TO DETERMINE WHEY IN REFRIGERATED RAW MILK

ABSTRACT. This experiment was runned to validate, at intralaboratorial level, the adapted colorimetric method by means of spectrophotometry based on the qualitative methodology to detect milk whey by the screening of caseinomacropeptide (CMP), the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA) official method. For validation purposes, we used a well-known validation method with validation parameters and we compared them to the standard technique, the high performance liquid chromatography (HPLC). Exactness, precision, linearity, selectivity, limit of detection (LD) and limit of quantification (LQ) were the characteristics taken into account. To proceed the validation by comparing the tested method to the one to be validated, we analyzed 100 samples of refrigerated raw milk in bulk tanks from 24 dairy properties in the State of Goiás. The limits for analytes recovery ranged from 123.7 to 137.47%. Regarding to precision we obtained values of 0.66 to 1.79% for coefficient of variation (CV) found by the analyst 1 and 0.53 to 0.97% for the CV found by analyst 2. There was statistical difference between analysts when the intermediate precision was taken into consideration and there was also sufficient linearity (0.99, CV= 0.44 to 2.50%) estimated by the coefficient of regression regarding to statistical relationship between concentrations of fortifications and values of recuperation. Values for the recuperation of analyte were always greater than those ones of the concentration used. Data for selectivity showed an acceptable separation degree between milk whey and the others milk constituents. LD and LQ were 0.1 and 0.6% respectively. When the methods were compared, the mean for concentration of milk whey for positive samples detected by the HPLC method (22.06%) was statistically greater (p<0.01) than the mean detected by the colorimetric method (6.76%). Based on the parameters used in this validation process, we conclude that the adapted colorimetric method can be used as a screening method for the detection of fraudulent addition of whey in milk while the HPLC method should be used for laboratorial confirmation and controversial situations. Key words: Milk whey, validation parameters, HPLC, spectrophotometry, colorimetric method.

12

INTRODUÇÃO Com o aumento da exigência do consumidor por segurança alimentar,

a demanda global para uma produção de leite de alta qualidade vem crescendo

nas últimas décadas (MONARDES, 2004). Dentre os parâmetros utilizados para

se avaliar a qualidade do leite, pode-se citar as características sensoriais, a

composição química, a contagem de células somáticas, a contagem bacteriana

total, a presença de contaminantes e adulterantes (RIBEIRO et al., 2000).

No que concerne, especificamente, às fraudes, SOUZA et al. (2000)

relataram a ocorrência da incorporação de proteínas do soro em leites cru e

beneficiados, principalmente bebidas lácteas, leite em pó, leite UHT “ultra-high

temperature” (TOLENTINO et al., 2006) e queijos (LO & BASTIAN, 1998) entre

outros. Embora o valor nutricional da proteína do soro seja alto, ou seja, similar ao

da caseína, a substituição do leite por soro precisa ser especificada com clareza,

pois, caso contrário, é considerada fraude (VELOSO et al., 2002).

A adição fraudulenta destas proteínas é normalmente detectada e

quantificada pela determinação do caseinomacropeptídeo (CMP). Este

polipeptídeo pode também ser denominado de glicomacropeptídeo (GMP) ou

caseinoglicomacropeptídeo (CGMP), o qual resulta da quebra da ligação

peptídica da κ-caseína entre os aminoácidos Phe105 – Met106. Desta cisão

forma-se a para-κ-caseína (1-105) que permanece nas micelas de caseína e o

GMP (106-169) que fica no soro (FOX, 1989; BRODY, 2000; VELOSO et al.,

2002). O GMP carreia todos os açúcares da κ-caseína, sendo que um desses

açúcares é o ácido siálico ou ácido N-acetilneuramínico (NANA). Há possibilidade

de obtenção de fragmentos com ausência glucídica, nesse caso, o peptídeo

terminal é designado de CMP (GUINEE & WILKINSON, 1992). De acordo com

SAITO & ITOH (1992) a fração glucídica do CMP é referida também como GMP.

A importância nutricional, funcional e a grande diversidade das

proteínas presentes no leite explicam o elevado interesse no estudo da

composição desta fração. Desse interesse, tem resultado um acentuado

desenvolvimento de métodos analíticos que incluem técnicas que permitem não

só a quantificação, como a separação e a identificação das proteínas (VELOSO et

al., 2001).

13

Atualmente, os métodos oficiais para detecção de soro no leite são: o

método qualitativo utilizando o reativo de Ehrlich, para a determinação qualitativa

do ácido siálico e o método quantitativo utilizando a cromatografia líquida de alta

eficiência - CLAE (BRASIL, 1991), internacionalmente aceita para identificar e

quantificar o CMP, devido à precisão na detecção da presença de fraude por

adição de soro de queijo ao leite (FUKUDA, 2003; FUKUDA et al., 2004).

Outros métodos têm sido descritos visando à detecção e quantificação

do CMP na pesquisa do soro em leite, e dentre eles, os cromatográficos (RECIO

et al., 1996; VELOSO et al., 2001), em particular, a cromatografia de exclusão

molecular (VAN HOOYDONK & OLIEMAN, 1982), de fase reversa (OLIEMAN &

VAN RIEL, 1989; URBANKE et al., 1992; RECIO et al., 2000a) e cromatografia de

troca iônica (LÉONIL & MOLLÉ, 1991). A eletroforese capilar (RECIO et al., 1996,

2000b; MIRALLES et al., 2000; VELOSO et al., 2001; MIRALLES et al., 2003) de

zona com uma coluna hidrofílica de sílica fundida (RIEL & OLIEMAN, 1995) foi

também utilizada com sucesso. Um outro método usado é a espectroscopia por

absorção (MIRALLES et al., 2000) e por absorção no ultravioleta e, por último

pode-se citar os métodos imunológicos (VELOSO et al., 2001).

Fazendo menção ao método qualitativo adotado pelo Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA (BRASIL, 1991), segundo

OLIVEIRA et al. (1998) informa-se que é uma metodologia de execução lenta,

trabalhosa e onerosa. Visando criar para rotina uma técnica mais rápida, simples,

fácil, econômica e que não necessita de mão-de-obra especializada, OLIVEIRA et

al. (1998) adaptaram o método qualitativo no intuito de utilizá-lo como técnica de

triagem, sendo denominado de método colorimétrico adaptado. Uma outra

metodologia validada e empregada na determinação quantitativa de ácido siálico

no leite trata-se da técnica espectrofotométrica que utiliza a ninidrina ácida

conforme descrito por FUKUDA et al. (1996; 2004).

Para que um novo método analítico gere informações seguras e

interpretáveis sobre a amostra, ele deve ser submetido a uma avaliação

denominada de validação (WHO, 1992) cuja finalidade é demonstrar que

determinada técnica analítica é adequada para o seu propósito (BRASIL, 2003;

NICOLÓSI, 2003; VALENTINI et al., 2004). No entanto, VALENTINI (2002)

ressalta que validar um método analítico, não significa que este possa ser

14

aplicado sem restrições, uma vez que, resultados de análises são influenciados

por diversos fatores.

A metodologia analítica pode ser validada de duas formas, a validação

intralaboratorial que é indicada quando se pretende validar métodos novos que

por ventura tenham sido desenvolvidos no próprio laboratório ou simplesmente,

para verificar se o método adotado por outras fontes está bem aplicado. Nesta

forma de validação, os parâmetros são todos mensurados, exceto o parâmetro

reprodutibilidade (THOMPSON et al., 2002). A validação interlaboratorial avalia

todas as características de desempenho inclusive o parâmetro reprodutibilidade.

A validação interlaboratorial é obtida pelo estudo colaborativo envolvendo vários

laboratórios (SOARES, 2001).

Para avaliação de desempenho de uma técnica analítica é necessária

a utilização de parâmetros ou características típicas como a exatidão/acurácia,

precisão, linearidade, seletividade/especificidade, limite de detecção e limite de

quantificação (CAUSON, 1997; BRITO et al., 2002. THOMPSON et al., 1999;

NICOLÓSI, 2003; RIBANI et al., 2004).

Considerando estes aspectos, o presente trabalho foi proposto com o

objetivo de validar o método colorimétrico adaptado, utilizando a

espectrofotometria na região do visível para determinação de soro de queijo em

leites crus refrigerados.

15

MATERIAL E MÉTODOS

Local do experimento O presente trabalho foi desenvolvido em parceria com uma indústria de

laticínio do Estado de Goiás, submetida a inspeção sanitária permanente, por

meio do Serviço de Inspeção Federal (SIF). As análises laboratoriais foram

realizadas no Centro de Pesquisa em Alimentos (CPA) da Escola de Veterinária

(EV) da Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia - Goiás.

Para garantir a qualidade analítica dos resultados, os analistas foram

treinados adequadamente e os equipamentos devidamente calibrados momentos

antes da realização do processo de validação.

Calibração do equipamento de espectrofotometria A calibração do equipamento foi realizada juntamente com o técnico

responsável pela montagem do equipamento e treinamento dos técnicos,

momentos antes do início do processo de validação do método colorimétrico

adaptado pela técnica de espectrofotometria.

O espectrofotômetro Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS

(Massachusetts/EUA) possui um kit software L610 – 0109, UV Winlab (STD),

versão 5.15 Rev. C, com lâmpada de tungstênio e deutério. A faixa de espectro

neste aparelho varia de 190 a 1.100nm e o mesmo foi instalado por um técnico

certificado pela empresa. O equipamento possui uma Certificação de Declaração

de Conformidade. Esse documento afirma que esse produto teve sua

performance testada e verificada em fábrica de acordo com as especificações de

qualidade (diretriz EMC 89/36/ECC, 9/31/ECC e 93/68ECC).

Na instalação, o técnico realizou a verificação de desempenho do

equipamento por meio de vários testes com padrões certificados e, em seguida,

foram emitidos relatórios atestando a conformidade do equipamento.

Quanto à integridade desse sistema de validação, rotineiramente,

auditorias são realizadas e certificadas pela Instituição “British Standards” como é

requerida pelo ISO 9001, internacionalmente reconhecido pela sua segurança em

Qualidade.

16

Validação do método colorimétrico adaptado A validação do método colorimétrico adaptado foi realizada pela técnica

espectrofotométrica, tomando-se por base a técnica qualitativa para detecção de

soro no leite, metodologia oficial empregada pelo Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento (MAPA), BRASIL (1991) adaptada por OLIVEIRA et al

(1998).

Esta metodologia baseia-se no princípio de que o CMP contendo ácido

siálico, também denominado de ácido n-acetilneuramínico (NANA), resultante da

ação de renina sobre o leite, é isolado do soro por precipitação com ácido

tricloroacético e ácido fosfotúngstico (BRASIL, 1991). Este método analítico

adaptado utiliza a espectrofotometria na região visível do espectro a 520nm e

basea-se na leitura da absorbância da opacidade pelo resíduo de ácido siálico.

A adaptação realizada por OLIVEIRA et al (1998) consiste em não

utilizar do reativo de Ehrlich, que tem por finalidade liberar o ácido siálico ligado

ao CMP usado como marcador para o soro por meio de uma hidrólise ácida. Em

seqüência é detectado como um cromóforo púrpura após reação com p-

dimetilaminobenzaldeído, segundo BRASIL (1991).

Procedimento Os parâmetros analíticos ou também chamados de características de

desempenho investigadas no processo de validação, a fim de demonstrar o

desempenho do método foram: Exatidão/acurácia; precisão; linearidade;

seletividade/especificidade; limite de detecção/sensibilidade; limite de

quantificação.

O padrão utilizado para a realização da validação da técnica analítica

de espectrofotometria pelo método colorimétrico adaptado por OLIVEIRA et al

(1998), foi soro de queijo, obtido após a adição do coalho em pó e subseqüente

coagulação da caseína em leite genuíno, colhido na fazenda da EV/UFG

momentos antes das análises.

A curva padrão foi preparada com as seguintes concentrações: 1%,

2%, 5%, 10% e 20% e mais o branco. O coeficiente de correlação calculado foi de

0,99.

17

As amostras de leite genuíno, recém-colhidas na unidade de produção

de leite da EV/UFG, foram fraudadas com a adição de quantidades previamente

conhecidas de soro de leite, de acordo com o parâmetro analisado.

A metodologia de extração da amostra seguiu a descrita por BRASIL

(1991).

a) Exatidão Representa o nível de concordância entre o valor médio obtido de

resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e o valor de

referência aceito como verdadeiro ou exato (ICH, 1995a; BARROS, 2002).

Para avaliação deste parâmetro foram realizadas 36 determinações

contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, quatro diferentes níveis

de concentração – um próximo ao limite de quantificação; outro próximo à

concentração máxima permitida pelo método em teste, e duas concentrações

próximas à média da faixa de uso do método. Esta metodologia está em acordo

com o recomendado pelo ICH (1995b) e BRASIL (2003) que indicam um valor

mínimo de nove determinações com três níveis diferentes de concentração. Os

níveis de concentração utilizados foram 2%, 5%, 10% e 20%, com nove réplicas

cada.

A exatidão foi calculada por meio do ensaio de recuperação do analito.

Essa avaliação foi feita comparando a média dos resultados obtidos por meio de

estudos de recuperação de quantidades previamente conhecidas do soro de leite,

adicionado por incorporação na matriz da amostra (BARROS, 2002; BRASIL,

2003). As medições de recuperação foram expressas em percentagem da

quantidade medida da substância em relação à quantidade adicionada na

amostra.

A exatidão foi expressa relacionando a concentração média

determinada experimentalmente com a concentração teórica.

Concentração média experimental Exatidão = X100

Concentração teórica

18

b) Precisão Avalia o grau de concordância entre resultados individuais obtidos,

aplicando-se o método repetidamente a múltiplas amostragens de um produto

homogêneo, sob condições pré-estabelecidas. A precisão foi considerada em dois

níveis: repetibilidade ou precisão intra-corrida e precisão intermediária ou precisão

inter-corridas (ICH, 1995a; BRASIL, 2003).

A repetibilidade, concordância entre os resultados de medições

sucessivas de um mesmo método, foi verificada por 36 determinações,

contemplando o intervalo linear do método, ou seja, quatro concentrações, uma

baixa, duas médias e uma alta, com nove réplicas cada, de acordo com o ICH

(1995b) e BRASIL (2003). Foram realizadas medições sucessivas efetuadas sob

as mesmas condições de medição, procedimento, analista, instrumento usado

sob as mesmas condições, local, repetições em um curto intervalo de tempo.

Para a avaliação da precisão intermediária foram utilizados os dados

em dias diferentes, com analistas diferentes e com o mesmo equipamento, uma

vez que este nível revela o efeito das variações dentro do laboratório.

A precisão foi calculada usando coeficiente de variação (CV) (BRASIL,

2003), onde s representa o desvio padrão e x a média.

CV (%) = S x 100 X

c) Linearidade É a capacidade do método analítico, dentro de uma determinada faixa,

de obter resultados que, diretamente ou por meio de cálculos matemáticos, são

proporcionais à concentração do analito na amostra, ou seja, é a capacidade do

método em comprovar que o resultado obtido é diretamente proporcional a

concentração do analito em uma determinada amostra (USPC, 1999; BARROS,

2002; NICOLÓSI, 2003).

A linearidade foi estabelecida adicionando concentrações conhecidas e

decrescentes de soro de queijo, até o menor nível detectável. Foram realizadas

30 determinações com 10 diferentes níveis de concentrações e com três

replicatas cada. O número de determinações avaliadas neste trabalho está em

19

acordo com os requisitos mínimos sugerido pelo ICH (1995b), GARP (1999) e

BRASIL (2003), que prevê no mínimo cinco níveis de concentrações diferentes

com três replicatas cada. Já a International Union of Pure and Applied Chemistry

(IUPAC) recomenda que a determinação seja realizada com o mínimo de seis

níveis de concentração (THOMPSON et al., 2002). As concentrações foram: 30%,

25%, 20%, 15%, 10%, 7,0%, 5,0%, 2,0%, 1,0% e 0,5%.

Em seqüência, foi realizada a análise de progressão linear das

concentrações e depois de observado uma relação linear entre os resultados, os

dados foram submetidos ao tratamento estatístico indicado para determinação do

coeficiente de correlação e desvio padrão relativo.

d) Seletividade Avalia a capacidade que o método possui de medir com exatidão o

analito de interesse em presença de outros componentes na amostra (impurezas,

produtos de degradação entre outros). Em resumo, é a habilidade do método

analítico em diferenciar e quantificar o analito (BARROS, 2002; BRASIL, 2003;

RIBANI et al, 2004).

Para a avaliação deste parâmetro foram utilizadas amostras de leite cru

de procedência conhecida. A seletividade foi avaliada realizando-se o espectro de

varredura no UV - visível, ou seja, a 190 a 1100nm, do leite puro, de uma amostra

fraudada com 20% de soro e do soro puro. Esta metodologia de avaliação está

em acordo com o preconizado por ICH (1995b), diferindo somente quanto à

avaliação do soro puro. Este soro constituiu apenas um elemento adicional na

estimativa deste parâmetro. A leitura foi feita avaliando a absorbância de cada

amostra e, então os espectros foram comparados.

e) Limite de detecção (LD) É a menor concentração do analito presente em uma amostra em

exame que pode ser detectado, mas não necessariamente quantificada, sob

determinadas condições experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003; IMMETRO,

2003).

Este parâmetro foi determinado adicionando-se concentrações

conhecidas e decrescentes de soro de queijo, de tal modo, que se pudesse

20

distinguir entre ruído e sinal analítico pela detecção da menor concentração capaz

de produzir o efeito esperado. Foram realizadas 30 determinações com 10

diferentes níveis de concentrações e com três replicatas cada. Os níveis de

concentrações utilizadas foram 1,0%; 0,8%; 0,6%; 0,4%; 0,2%; 0,175%; 0,150%;

0,125%; 0,1% e 0,0%.

A determinação da relação sinal-ruído foi realizada por meio da

comparação entre a medição dos sinais de amostras em baixas concentrações

conhecidas do soro de leite na matriz e um branco destas amostras. Dessa forma

foi estabelecida uma concentração mínima na qual a substância pode ser

facilmente detectada.

f) Limite de quantificação (LQ) É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser

determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais

estabelecidas (BRASIL, 2003).

O LQ foi estabelecido por meio de análise de amostras contendo

concentrações decrescentes do soro de queijo até o menor nível detectável com

precisão e exatidão aceitáveis (BRASIL, 2003; NICOLÓSI, 2003).

Os mesmos critérios de LD foram adotados para o LQ, utilizando para

este parâmetro a relação de limite de quantificação e detecção.

O LQ foi baseado no menor ponto de concentração onde houve

linearidade. Este procedimento está de acordo com o recomendado pela BRASIL

(2003).

Validação do método colorimétrico por comparação com a técnica CLAE.

Colheita de amostras Foram colhidas 100 amostras de leite cru refrigerado de tanques de

expansão de 24 propriedades rurais do Estado de Goiás. Após homogeneização

do leite por cinco minutos no tanque de expansão e ambientação do copo coletor,

foram colhidas alíquotas de 100mL de leite, seguindo da transferência para

frascos previamente lavados e desinfetados com álcool a 70%, de acordo com o

recomendado pelo MAPA (BRASIL, 2002).

21

Após a colheita, as amostras foram devidamente identificadas,

acondicionadas em caixas isotérmicas e transportadas sob temperatura de

refrigeração, para o CPA da EV/UFG, onde foram acondicionadas à temperatura

de 18°C negativos até o momento do processamento.

As amostras de leite cru refrigerado foram submetidas às técnicas de

CLAE e espectrofotometria, empregando o método colorimétrico adaptado por

OLIVEIRA et al. (1998) para detecção de soro de queijo em leite, de acordo com

BRASIL (1991). Das 100 amostras colhidas e analisadas, apenas 32 foram

selecionadas para o estudo da comparação entre as técnicas, por apresentarem a

presença de soro igual ou superior a 1% pela técnica CLAE.

Análises laboratoriais

Método colorimétrico adaptado. As análises foram realizadas em espectrofotômetro Lambda 45 UV/VIS

(Perkin Elmer) na região visível do espectro a 520 nm.

O método colorimétrico adaptado baseia-se na leitura da coloração

opaca do resíduo de ácido siálico.

A metodologia empregada foi a descrita por OLIVEIRA et al., (1998).

Foram transferidos, para um béquer de 250mL, 10mL da amostra de

leite e adicionado, sob cuidadosa agitação, 10mL de solução do ácido

tricloroacético (TCA) a 24%. Após esse procedimento, deixou-se a solução em

repouso por 30 minutos, seguindo-se da filtração em papel de filtro (Whatman n°

40). Transferiu-se 15mL do filtrado para um tubo de centrífuga, com capacidade

aproximada de 35mL, seguindo-se da adição de 0,5mL de solução de ácido

fosfotúngstico a 20%. Em seguida, agitou-se por 10 segundos deixando-o em

repouso por 10 minutos, utilizando-se agitador de tubos e leu-se a absorbância

em espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 520 nm.

Paralelamente foi preparada uma amostra em “branco”, utilizando leites

crus genuínos, colhidos na própria fazenda da EV/UFG durante a ordenha

matutina, que seguiu todos os passos anteriormente citados para a extração da

amostra.

22

Foram feitas soluções padrão com 1%, 2%, 5%, 10% e 20% de soro

para estabelecer a curva de calibração do equipamento. O soro utilizado para a

elaboração da curva padrão, foi obtido da coagulação enzimática do leite puro a

uma temperatura de 32°C a 37°C, o qual foi adicionado o coalho, seguindo as

recomendações do fabricante.

O resultado final foi obtido comparando os resultados das amostras de

leite colhidas, com a curva padrão previamente estabelecida. A prova foi

considerada positiva quando ocorreu a presença de soro igual ou superior a 3%

de acordo com OLIVEIRA et al., (1998).

Cromatografia líquida de alta eficiência Para a determinação e quantificação do soro, adotou-se a metodologia

proposta em BRASIL (1991).

Para determinação percentual do teor de soro mediante a técnica da

CLAE foi feita uma curva padrão preparada utilizando-se leite genuíno, de

procedência conhecida, como visualizada na Figura 1. Para o seu preparo, o leite

foi adulterado com soro de queijo nas proporções de 5%, 10%, 15% e 20% de

acordo com recomendado pela metodologia oficial (BRASIL, 1991). O soro de

queijo utilizado na elaboração da curva padrão foi obtido após a adição do coalho

em pó e subseqüente coagulação da caseína em leite genuíno, colhido na

fazenda da EV/UFG momentos antes das análises.

y = 35124x + 91820R2 = 0,9912

0100000200000300000400000500000600000700000800000900000

0 5 10 15 20 25

%

área

FIGURA 1 – Curva padrão para determinação percentual do soro em

leite cru refrigerado.

23

Para o preparo da amostra para análise, 22mL de leite foram tratados

com 10mL da solução de ácido tricloroacético (TCA) a 24%, seguindo-se

incubação a 25ºC/60min em banho-maria, em repouso. Após este período

realizaram-se duas filtrações, a primeira em filtro qualitativo (papel de filtro

Whatman n° 40), descartando-se aproximadamente cinco mililitros do filtrado, e a

segunda em filtro MILLIPORE de 0,45 µm (MILLEX LCR com membrana PTFE

modificada para filtração de solventes orgânicos e aquosos 0,45µm 13 mm não

esterilizada).

A determinação cromatográfica foi realizada com a injeção de 20µL do

filtrado no cromatógrafo (GILSON 118 UV/VIS) operando em vazão de 1mL/min. e

a detecção na faixa do UV-VIS em comprimento de onda de 205nm, com a linha

de base já devidamente estabilizada.

A corrida cromatográfica foi realizada em aparelho de cromatografia

líquida de alta eficiência (GILSON), com uma bomba isocrática (GILSON 306),

com injetor automático ASTED – XL da marca GILSON e looping de 200µL e

coluna Zorbax GF-250 Bioséries da Agilent de 9mm de diâmetro interno por

250mm de comprimento. A fase estacionária da coluna era composta por

partículas esféricas de sílica, modificadas na superfície por zircônio estabilizado,

enquanto que a fase ligada era composta por monocamada molecular hidrofílica

com diâmetro de poro de 150A°. A solução da fase móvel usada na separação foi

um padrão fosfato com pH6 (1,74g de fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) p.a.,

12,37g de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) p.a. e 21,41g de sulfato de

sódio (Na2SO4) dissolvido em 1000mL de água destilada (deionizada)).

Foi construído um gráfico de porcentagem de soro “versus” a

intensidade do sinal do detector, ou altura do pico, calculando-se a equação da

reta de regressão, sendo aceitos valores de r≥0.95. Foi realizada a comparação

do cromatograma da amostra com o do leite adicionado de soro e em seguida

identificou-se o pico com o mesmo tempo de retenção do soro e calculando-se a

porcentagem de soro na amostra, por interpolação da leitura do sinal na reta de

regressão do leite adicionado de soro. Segundo BRASIL (1991) a prova foi

considerada positiva quando a presença de soro foi superior a 1%, determinado a

partir da curva padrão nos picos com o mesmo tempo de retenção do CMP.

24

Foi avaliado o grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos

métodos colorimétrico adaptado e CLAE, determinando o grau de exatidão

(BRASIL, 2003b).

Análises estatísticas Na análise Estatística, vários testes e modelos matemáticos foram

utilizados na estimação dos parâmetros. Parâmetro central como a média

aritmética e dispersão como o desvio padrão e coeficiente de variação, também

foram utilizados (COCHRAN & COX, 1968; PIMENTEL GOMES, 1985 e

CENTENO, 1999). A variável estudada foi o soro de leite em amostras fortificadas

e leite colhido em tanques de expansão.

25

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Exatidão Os valores de recuperação do analito (RA%) obtidos para os níveis de

soro em estudo, são apresentados na Tabela 1. Nota-se diante dos dados

obtidos, que os limites de recuperação do analito, estão enquadrados no intervalo

de 123,28%, na concentração de 20% de soro a 137,47%, na concentração de

5% de soro.

A região de recuperação entre 80,0 e 110,0% é considerada aceitável

em estudos de validação de método (PINTO & JARDIM, 2000). Ao contrastar com

os resultados encontrados neste trabalho (123,78% a 137,47%) verifica-se uma

discrepância nos percentuais (80,0 e 110,0%) indicando que o método não tem

exatidão aceitável.

TABELA 1. Recuperação do analito em função da concentração de soro adicionado em leite cru refrigerado, analisado pelo método colorimétrico adaptado. Goiânia - GO. 2007

Concentração

soro (%)

n

RA (%) s

CV (%)

t

2 9 134,071 0,024 0,883 4316,039 5 9 137,470 0,123 1,788 914,788

10 9 132,078 0,087 0,659 1104,662 20 9 123,276 0,163 0,661 428,485

n: repetições; RA: recuperação do analito (exatidão); s: desvio padrão; CV: coeficiente de variação (precisão) e t: valor do teste t (Student) calculado; t.05(8) = 2,31 (valor do t tabelado para α 5% e 8 graus de liberdade).

Na avaliação da exatidão do teste, verificou-se diferença significativa

(p<0,01) em todos os níveis de concentração. Nesse caso, notou-se que a

recuperação do analito não foi satisfatória. Em todos os níveis de concentração,

as recuperações do analito foram acima de 100%, chegando a 137,47% no nível

de 5% de soro. Nesse caso, constatou-se que não houve uma exatidão aceitável

do método colorimétrico adaptado para detecção de soro em leite cru refrigerado.

Precisão A Tabela 2 apresenta os resultados de recuperação, avaliados

intralaboratorialmente, e os respectivos coeficientes de variação (CV) obtidos na

26

análise de leite fortificado. As análises de recuperação foram realizadas por dois

técnicos em dias distintos. Para avaliar a repetibilidade, nível que revela o efeito

das variações dentro do laboratório, foram realizadas avaliações sucessivas

efetuadas sob as mesmas condições de medição, procedimento, analista,

instrumento utilizado e local, enquanto que a precisão intermediária foi

determinada em dias diferentes, por analistas diferentes e com o mesmo

equipamento.

Ainda observando a Tabela 2, nota-se que os CVs, obtidos a partir dos

valores referentes ao ensaio de recuperação, foram considerados adequados,

pois forneceram valores baixos. Métodos que quantificam compostos em macro

quantidades requerem um CV de 1 a 2%, enquanto que para análise de traços ou

impurezas, é de até 20% (HUBER, 1998). Nesse estudo foram obtidos valores de

CV de 0,66% a 1,79% determinado pelo analista 1 e valores de 0,53% a 0,97%

estimado pelo analista 2. Dessa forma, como a maioria dos valores de CV

mostrou-se baixo, pode-se inferir que o método proposto apresentou

repetibilidade.

TABELA 2. Recuperação do analito em função da concentração de soro

adicionado em leite cru refrigerado, submetido à análise de validação. Goiânia - GO. 2007

Analista Concentração

soro (%) n RA (%) Média s CV (%) t

2 9 134,071 2,681 0,024 0,883 4316,0391 5 9 137,470 6,873 0,123 1,788 914,788 10 9 132,078 13,208 0,087 0,659 1104,662 20 9 123,276 24,655 0,163 0,661 428,485 2 9 96,274 1,925 0,018 0,971 597,804

2 5 9 129,418 6,471 0,043 0,659 2070,218 10 9 132,591 13,259 0,113 0,853 864,205 20 9 84,494 16,899 0,089 0,530 518,847

n: repetições; RA: recuperação do analito (exatidão); s: desvio padrão; CV: coeficiente de variação (precisão) e t: valor do teste t (Student) calculado; t.05(8) = 2,31 (valor do t tabelado para α 5% e 8 graus de liberdade).

Com relação à precisão intermediária observa-se que houve diferença

entre analistas (Tabela 2). A resposta medida pelo primeiro analista foi

significativamente (P<0,05) diferente da resposta medida pelo segundo analista

nas concentrações de 2%, 5% e 20%. A diferença encontrada foi pequena na

27

análise de uma mesma amostra em dias diferentes por técnicos distintos. Sendo a

precisão a característica mais representativa da variabilidade dos resultados em

um único laboratório, pode-se concluir que os resultados encontrados estão em

desacordo com a literatura (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004) que a cita como

um parâmetro ideal na verificação de que no mesmo laboratório, o método

fornecerá os mesmos resultados. Essa diferença significativa entre as avaliações

dos dois analistas pode ser devido a uma falta de ajuste melhor do método e/ou

interação analista-método. Na concentração de 10% não houve diferença

significativa (p>0,05) entre os resultados analisados, indicando que o método

nessa concentração apresentou precisão, ressaltando mais uma vez a existência

da interação analista/métodos.

Linearidade. Os resultados referentes à linearidade são apresentados na Tabela 3 e

Figura 2.

TABELA 3. Estudo do limite de detecção e quantificação de soro de queijo

adicionado ao leite em diferentes concentrações, pelo método colorimétrico, dados em valores de absorbância. Goiânia - GO. 2007

R Concentrações utilizadas (% soro)

0,000 0,100 0,125 0,150 0,175 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 Absorbância

1 0,176 0,228 0,217 0,228 0,228 0,252 0,252 0,262 0,266 0,272 2 0,176 0,226 0,218 0,228 0,227 0,255 0,253 0,260 0,266 0,272 3 0,176 0,227 0,218 0,228 0,228 0,255 0,254 0,260 0,268 0,273 M 0,176 g 0,227 e 0,218 f 0,228 e 0,228 e 0,254 d 0,253 d 0,261 c 0,267 b 0,272 a

s 0,000 0,001 0,001 0,000 0,001 0,002 0,001 0,001 0,001 0,001 CV (%) 0,000 0,441 0,265 0,000 0,254 0,682 0,395 0,443 0,433 0,212 R: repetição; M: média; s: desvio padrão; CV: coeficiente de variação; Médias seguidas de mesma letra, não diferem significativamente entre si (Tukey; p<0,05).

Observa-se pelo coeficiente de regressão que a relação entre as

concentrações de fortificação e os valores recuperados é suficientemente linear

até a concentração de 1% de soro adicionado ao leite. Nesse caso, nota-se que

os valores recuperados foram, na maioria dos casos, maiores do que a

28

concentração de fortificação. A precisão da reta de regressão (R2) foi de 0,99, isto

é 99% da variabilidade da recuperação do analito é explicada pelo modelo linear

(Figura 2). Esse valor de 0,99 está em acordo com o coeficiente de correlação

mínimo recomendado em BRASIL (2003). Um coeficiente de correlação acima de

0,90, de acordo com o INMETRO (2003), já seria um indicativo de ajuste ideal dos

dados para a linha de regressão, sendo esse valor aceitável para a finalidade

almejada. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida,

pois quanto mais próximo de 1,0 (um), menor a dispersão do conjunto de pontos

experimentais e, menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.

FIGURA 2. Relação entre a concentração de fortificação de soro e a

recuperação do analito para a determinação da linearidade.

Após a verificação da relação linear entre os resultados, determinou-se

o coeficiente de correlação (r) que foi de 0,99. Para as fortificações em estudo,

verificou-se que os CVs foram baixos, apresentando variação de 0,44% na

dosagem de 30% a 2,50% na dosagem de 15%. Segundo GARP (1999) para se

ter boa precisão experimental os CVs devem ser inferior a 5%. Isso permite

afirmam ressaltar que, no estudo realizado uma boa precisão experimental foi

alcançada.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15 20 25 30

Unidade de Concentração (% de soro)

Uni

dade

de

Resp

osta

(%

de

soro

) Y = - 0,8806 + 1,2571X

29

Seletividade. De acordo com os dados de seletividade apresentados na Figura 3,

pode-se observar que há uma boa separação entre o soro e constituintes do leite.

Tendo como base estes dados pode-se afirmar também que o método

desenvolvido mostrou-se específico e seletivo. A característica de desempenho

em questão, garante segundo a USPC (1999), que o sinal de resposta seja

unicamente do composto de interesse. Caso este parâmetro não seja

assegurado, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente

comprometidas (RIBANI et al., 2004).

FIGURA 3. Curvas de determinação da absorbância de soro em leite cru

refrigerado. Soro de queijo puro (A); Leite adicionado de 20% de soro de queijo (B) e Leite puro (C).

Limite de detecção e quantificação.

Os resultados referentes aos limites de detecção (LD) e de

quantificação (LQ) em amostras fortificadas com soro de queijo são apresentados

na Tabela 3. Nota-se que o estabelecimento do LD ocorreu por meio de análise

30

de soluções de concentrações conhecidas do analito até o menor nível detectável.

No presente estudo, observou-se que o LD é de 0,1%, ou seja, o menor nível de

concentração de soro detectável. Para o LQ notou-se que a menor concentração

capaz de ser quantificada sem interferência de viés, foi de 0,6%, sendo

determinado através da análise de variância e do teste de comparação de média

(p<0,05).

A partir do resultado de 0,6%, observa-se diferença significativa

(p<0,05) entre os valores de absorbância, com linearidade crescente, como

observado na Figura 4. Esses resultados proporcionaram uma exatidão de

111,81% e precisão de 4,43%. Esses valores permitem afirmar que na análise de

soro pelo método colorimétrico, o menor nível capaz de ser quantificado (0,6%)

equivale a uma recuperação correspondente a 11,81% (0,67% de soro) superior

ao limite mínimo de quantificação.

FIGURA 4. Curva de concentração de soro e absorbância para estudo

do limite de quantificação.

Comparação entre método colorimétrico adaptado e a técnica CLAE Analisando a Tabela 4, observa-se que a média da concentração de

soro detectada pela CLAE (22,06%) foi superior a média detectada pelo método

colorimétrico (6,76%). Na comparação dos métodos pelo teste t de Student,

verifica-se que houve diferença significativa (p<0,01), ou seja, o método CLAE foi

mais sensível para a detecção de soro de queijo que o método colorimétrico

0,17

0,19

0,21

0,23

0,25

0,27

0,29

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000CONCENTRAÇÃO (% DE SORO)

31

adaptado (Figura 5). Esperava-se que realmente a técnica CLAE fosse a mais

sensível, uma vez que, além de ser uma metodologia internacionalmente

reconhecida e validada, é também empregada como método oficial pelo MAPA na

detecção e quantificação do caseinomacropeptídeo no leite.

Estudando a correlação entre os métodos foi encontrado um valor de

0,57. Essa correlação foi significativa (p<0,01), podendo-se afirmar que o método

colorimétrico pode ser usado como ferramenta na triagem na detecção de soro no

leite.

TABELA 4. Comparação entre os resultados médios proporcionados pelo método colorimétrico adaptado e cromatográfico (CLAE) na determinação de soro de queijo em leite. Goiânia - GO. 2007

Repetição Métodos

Colorimétrico Cromatografia (CLAE) Média 6,766 22,061 Desvio padrão 3,862 8,635 CV (%) 57,078 39,141 Teste t p < 0,0001 Correlação (r) 0,5735 (p < 0,0001)

0,000

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

35,000

40,000

45,000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

amostras

conc

entra

ção

de so

ro (%

)

ColorimétricoCromatografia (CLAE)

FIGURA 5. Comparação entre os resultados da análise de soro pelo método colorimétrico e cromatográfico (CLAE) em amostras de leite cru

refrigerado.

32

CONCLUSÕES

O método colorimétrico adaptado pode ser empregado na triagem de

amostras visando a detecção de adição de soro em leite, reservando à

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) as contraprovas laboratoriais ou os

casos dúbios.

O método colorimétrico adaptado no que pese ser simples, rápido e

barato, não pode ser utilizado como método quantitativo, visto que, não apresenta

boa exatidão. Para ser considerado um método oficial torna-se necessário a

realização de testes inter-laboratoriais

33

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CAPÍTULO 3 – COMPARAÇÃO ENTRE TRÊS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE SORO EM LEITE CRU REFRIGERADO

RESUMO: O presente experimento foi conduzido com o objetivo de comparar três métodos analíticos para determinação de soro em leite cru refrigerado. Os métodos empregados na detecção fraudulenta da adição do soro de queijo em leite ou de sua proteólise foram: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), o da ninidrina ácida e o colorimétrico adaptado. Foram colhidas em 24 propriedades rurais do Estado de Goiás, 100 amostras de leite cru refrigerado de tanques de expansão. Das amostras colhidas, em 68% não foi detectada a presença de soro pela técnica CLAE. Estas, quando submetidas à análise pelo método da ninidrina ácida, apresentaram 10 (14,7%) de amostras negativas e 58 (85,3%) de positivas. O teor médio de ácido siálico encontrado na técnica da ninidrina foi de 5,58µg/mL, com valor mais freqüente de 2,70µg/mL. Os valores mínimo e máximo encontrados foram de 1,96µg/mL e 48,63µg/mL, respectivamente. Das 68 amostras negativas pela CLAE, duas foram positivas (2,94%) e 66 (97,06%) negativas, quando analisadas pelo método colorimétrico. A freqüência relativa de amostras positivas foi de 32%, apresentando a CLAE a maior média de soro (14,37%), seguida do método colorimétrico (5,28%) e da ninidrina ácida (3,12%). Os valores mínimos e máximos encontrados foram de 0,44% e 41,36%; 0,02% e 14,51% e 0,69% e 9,82%, respectivamente para CLAE, colorimétrico adaptado e ninidrina ácida. Os métodos quando submetidos a um teste (Tukey 5%) visando a comparação entre médias de soro revelaram: CLAE (4,59%), colorimétrico (1,89%) e ninidrina ácida (1,66%) diferença significativa (p<0,01) entre eles. A técnica CLAE diferiu dos métodos de ninidrina ácida e colorimétrico, enquanto que, os métodos da ninidrina e colorimétrico não diferiram entre si (p>0,05), podendo ambos ser utilizados como metodologias de triagem. Dentre as três técnicas, a CLAE foi a metodologia de maior sensibilidade na detecção e quantificação do soro em leite cru refrigerado. Palavras–Chave: CLAE, método da ninidrina ácida, método colorimétrico,

GMP/CMP, fraude, proteólise, leite cru.

39

COMPARING THREE ANALYTICAL METHODS FOR DETECTION OF WHEY IN REFRIGERATED RAW MILK This experiment was runned, at the State of Goias, to compare three analytical methods (high performance liquid chromatography – HPLC, acid ninidrine and adapted colorimetric method) for detection of whey in refrigerated milk due to fraudulent addition of cheese whey or from its proteolysis. We took 100 samples of refrigerated raw milk from bulk tanks in 24 in-state rural properties. We did not detect whey by HPLC in 68% of the samples (68/100) of refrigerated raw milk but when those 68 samples were analyzed by the acid ninidrine method only 10 out 68 (14.7%) were negative and 58 out 68 (85.3%) were positive. The average concentration of sialic acid by the ninidrine method was 5.58µg/mL (the most frequent value was 2.70µg/mL) and lower and higher values were 1.96 and 48.63µg/mL respectively. Among the 68 negative samples by HPLC, two (2.94%) were positive and 66 (97.06%) were negative by the colorimetric method. Relative frequency of positive samples was 32/100 and the higher mean of milk whey detection was 14.37% by HPLC followed by 5.28% with the colorimetric method and 3.12% when the acid ninidrine method was used. Lower and higher values detected were as follow: 0.44 and 41.36% for HPLC; 0.02 and 14.51% for the colorimetric method; 0.69 and 9.82% for acid ninidrine method. When statistically compared (Tukey test 95% confidence interval), the means of HPLC (4.59%), Colorimetric test (1.89%) and acid ninidrine test (1.66%) were significantly different (p<0.05). HPLC method was statistically different from both acid ninidrine and colorimetric while no statistical difference (p>0.05) was found between those latter tests (colorimetric and acid ninidrine tests) allowing us to conclude that those two tests can be useful just for initial screenings. We also conclude that HPLC was the most sensitive method for detection and quantification of whey in refrigerated raw milk. Key words: HPLC, acid ninidrine method, colorimetric method, fraud, GMP/CMP, proteolysis, raw milk.

40

INTRODUÇÂO Ao analisar a qualidade do leite, alguns fatores devem ser

considerados, dentre eles, são as fraudes que visam a normalmente aumentar o

tempo de vida de prateleira do produto e/ou o rendimento do alimento vendido.

Uma fraude tem merecido atenção especial por implicar na incorporação de

proteínas do soro em leite cru, bebidas lácteas e leite em pó (MONTÁÑEZ et al.,

2000; SOUZA et al., 2000), queijos (LO & BASTIAN, 1998), leite UHT “Ultra High

Temperature” (RECIO et al., 1996; TOLENTINO et al., 2006) e leite pasteurizado

(URBÁN, 1998), entre outros.

Embora o valor nutricional da proteína do soro seja alto, a adição de

soro ao leite precisa ser especificada com clareza, pois, caso contrário, é

considerado fraude (VELOSO et al., 2002). A adição fraudulenta desta proteína é,

normalmente detectada e quantificada por meio da determinação do

caseinomacropeptídeo (CMP). Este polipeptídeo, um componente específico do

soro obtido após a coagulação do leite pela renina, deve estar ausente no leite em

condições normais (GREENBERG & DOWER, 1986; RECIO et al., 1997). Caso

ocorra a presença de mais de 1% de soro determinado pela técnica CLAE, de

acordo com a legislação, a prova será considerada positiva (BRASIL, 1991).

Durante a fabricação do queijo ocorre a hidrólise da κ-caseína do leite,

no sítio de clivagem entre os aminoácidos Phe105 – Met106. Com a clivagem, ocorre

a liberação da para-κ-caseína, que permanece na coalhada (resíduos 1±105), e

de um peptídeo terminal de 64 aminoácidos denominado de glicomacropeptídeo

(GMP), também denominado de caseinomacropeptídeo (CMP) ou ainda de

caseinoglicomacropeptídeo (CGMP) (resíduos 106±169) que é removido com o

soro (FOX, 1989; BRODY, 2000; VELOSO et al., 2002). O CMP carreia todos os

açúcares da κ-caseína, sendo que um desses é o ácido siálico ou N-

acetilneuramínico (NANA). Há possibilidade de obtenção de fragmentos com

ausência glicídica, e neste caso o peptídeo terminal é designado de CMP

(GUINEE & WILKINSON, 1992). A fração glicídica do CMP é referida também

como GMP (SAITO & ITOH, 1992) e a determinação deste ácido em soro doce

reflete a concentração de CMP presente no leite (GUINEE & WILKINSON, 1992).

O elevado interesse no estudo da composição da fração glicídica

reside na importância nutricional, funcional e na grande diversidade das proteínas

41

presentes no leite, o que tem resultado em acentuado desenvolvimento de

métodos analíticos que incluem técnicas que permitem não só a quantificação,

mas também na separação e a identificação das proteínas do leite (VELOSO et

al., 2001).

Atualmente, os métodos oficiais para detecção de soro no leite

compreendem o método quantitativo que utiliza a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) (BRASIL, 1991). Esta técnica é internacionalmente aceita para

identificar e quantificar o CMP, devido à precisão em confirmar fraude por adição

de soro de queijo no leite (FUKUDA, 2003; FUKUDA et al., 2004) e o método

qualitativo utilizando o reativo de Ehrlich para a determinação qualitativa do ácido

siálico (BRASIL, 1991). Entretanto, essas técnicas são caras, difíceis de serem

executadas e requerem mão-de-obra especializada.

Outros métodos têm sido descritos visando a detecção e quantificação

do CMP na pesquisa do soro em leite, dentre os quais os cromatográficos (RECIO

et al., 1996; VELOSO et al., 2001), em particular a cromatografia de exclusão

molecular (VAN HOOYDONK & OLIEMAN, 1982), CLAE em fase reversa

(reversed-phase High-performance liquid chromatographic) (OLIEMAN & VAN

RIEL, 1989; URBANKE et al., 1992; RECIO et al., 2000a) e a cromatografia de

troca iônica (LÉONIL & MOLLÉ, 1991). A eletroforese capilar (RECIO et al., 1996,

2000b; MIRALLES et al., 2000; VELOSO et al., 2001; MIRALLES et al., 2003) de

zona com uma coluna hidrofílica de sílica fundida (RIEL & OLIEMAN, 1995) foi

também utilizada com sucesso. Um outro método usado é a espectroscopia por

absorção (MIRALLES et al., 2000) e por absorção no espectro ultravioleta

(VELOSO et al., 2001), bem como os métodos imunológicos (VELOSO et al.,

2001).

Visando à determinação quantitativa de ácido siálico (NANA) no leite,

FUKUDA et al. (1996) validaram o método espectrofotométrico utilizando a

técnica da ninidrina ácida. Esta metodologia, de acordo com FUKUDA et al.

(1996; 2004), pode ser utilizada como substituta das demais na detecção da

adição de soro em leite. Estes autores ressaltam que o teor de CMP ou de ácido

siálico em leite e seus derivados têm atuado como um importante marcador das

ações proteolíticas. Somente no ano de 2006, através da Instrução Normativa No 68 de 12 de dezembro, é que foi aprovada a utilização da ninidrina ácida para a

42

determinação quantitativa de ácido siálico livre e ligado à glicoproteína do leite

como técnica oficial do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

(MAPA) (BRASIL, 2006a).

Segundo FURLANETTI & PRATA (2003), a determinação dos níveis de

NANA também é adotada pela comunidade econômica européia para detectar e

coibir fraudes pela adição de soro ao leite cru e ao leite em pó

Visando trabalhar na rotina com uma técnica mais rápida, simples, fácil,

econômica e que não necessita de mão-de-obra especializada, OLIVEIRA et al.

(1998) propuseram uma adaptação ao método qualitativo para detecção de soro

no leite adotado pelo MAPA (BRASIL, 1991), que foi denominado de método

colorimétrico adaptado. A adaptação consistiu em não utilizar o reativo de Ehrlich,

cuja finalidade era liberar o ácido siálico ligado ao CMP, usado como marcador

para o soro, através de uma hidrólise ácida e, em seqüência, detectado como um

cromóforo púrpura após a reação com p-dimetilaminobenzaldeído.

Baseado nos parâmetros precisão, exatidão, seletividade, linearidade,

limite de detecção e quantificação utilizados para validação, a técnica

colorimétrica adaptada e validada (conforme pesquisa em andamento neste

laboratório), tem sido considerada uma metodologia de triagem para a detecção

de adição de soro em leite, deixando a CLAE para contraprovas laboratoriais e

casos duvidosos.

Considerando o exposto, propôs-se o presente trabalho com o objetivo

de comparar três metodologias: CLAE, ninidrina ácida e método colorimétrico

adaptado, na determinação de soro em leite.

43

MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi desenvolvido em parceria com uma indústria de

laticínios do Estado de Goiás, submetida a inspeção sanitária permanente do

Serviço de Inspeção Federal (SIF), do MAPA.

Amostragem Foram colhidas 100 amostras de leite cru refrigerado de tanque de

expansão de 24 propriedades rurais do Estado de Goiás. Após homogeneização

do leite por cinco minutos e da ambientação do copo coletor, foram colhidas

alíquotas de 100mL de leite, seguido da transferência para frascos que foram

previamente lavados e sanitizados com álcool a 70%, de acordo com o

recomendado pelo MAPA (BRASIL, 2002).

Após a colheita, as amostras foram devidamente identificadas e

acondicionadas em caixas isotérmicas contendo gelo e transportadas

imediatamente ao CPA/EV/UFG e armazenadas a -18°C até o momento das

análises.

Análises Laboratoriais As análises pelos métodos da ninidrina ácida e colorimétrico adaptado

foram realizadas em espectrofotômetro Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS com

faixa de espectro de 190 a 1.100nm, com kit software L610 – 0109, UV Winlab

(STD), versão 5.15 Rev. C, com lâmpada de tungstênio e deutério

(Massachusetts/EUA).

Cromatografia líquida de alta eficiência Para a determinação e quantificação do CMP adotou-se a metodologia

descrita em BRASIL (1991).

Para determinação percentual do teor de soro pela técnica da CLAE

fez-se uma curva padrão com leite genuíno de procedência conhecida, (Figura 1).

Para obtenção da curva, o leite foi adulterado com soro de leite de composição

padrão nas proporções de 5%, 10%, 15% e 20% (BRASIL, 1991). O soro de

queijo utilizado na elaboração da curva padrão foi obtido após a adição do coalho

44

em pó e subseqüente coagulação da caseína em leite genuíno, colhido na

fazenda da EV/UFG momentos antes das análises.

y = 35124x + 91820R2 = 0,9912

0100000200000300000400000500000600000700000800000900000

0 5 10 15 20 25

%

área

FIGURA 1 – Curva padrão para determinação percentual do soro em leite cru refrigerado

Para o preparo da amostra, 22mL de leite foram tratados com 10mL da

solução de ácido tricloroacético (TCA) a 24%, seguindo-se incubação a

25ºC/60min em banho-maria, em repouso. Após este período, realizaram-se duas

filtrações, a primeira em filtro qualitativo (papel de filtro Whatman n° 40),

descartando-se aproximadamente 5mL do filtrado, e a segunda em filtro

MILLIPORE de 0,45 µm (MILLEX LCR com membrana PTFE modificada para

filtração de solventes orgânicos e aquosos 0,45µm 13 mm não esterilizada).

A determinação cromatográfica foi realizada com a injeção de 20µL do

filtrado no cromatógrafo (GILSON 118 UV/VIS), que operou em vazão de 1mL/min

e a detecção foi feita na faixa do UV-VIS em comprimento de onda de 205nm,

com a linha de base já devidamente estabilizada.

A corrida cromatográfica foi realizada em aparelho de cromatografia

líquida de alta eficiência (GILSON), com uma bomba isocrática (GILSON 306),

com injetor automático ASTED – XL da marca GILSON e looping de 200µL e

coluna Zorbax GF-250 Bioséries da Agilent de 9mm de diâmetro interno por

250mm de comprimento.

A fase estacionária da coluna foi composta por partículas esféricas de

sílica, modificadas na superfície por zircônio estabilizado, e a fase ligada

45

composta por monocamada molecular hidrofílica, com diâmetro de poro de 150A°.

A solução da fase móvel usada na separação constituiu em um padrão fosfato

com pH6 dissolvido em 1000mL de água destilada (deionizada).

Foi construído um gráfico de porcentagem de soro “versus” a

intensidade do sinal do detector, ou altura do pico, calculando-se a equação da

reta de regressão, tendo sido aceitos valores de r≥0.95. O cromatograma da

amostra foi comparado com o do leite adicionado de soro e em seguida

identificou-se o pico com o mesmo tempo de retenção do soro, calculando-se o

percentual de soro na amostra por interpolação da leitura do sinal na reta de

regressão do leite adicionado de soro. A prova foi considerada positiva quando a

presença de soro foi superior a 1% (BRASIL, 1991).

Método colorimétrico adaptado. Adotou-se a metodologia descrita por OLIVEIRA et al., (1998), que

baseia-se na leitura da opacidade causada pelo resíduo de ácido siálico em

espectrofotômetro na região visível do espectro a 520 nm (OLIVEIRA et al., 1998).

Para determinação percentual do teor de soro pela técnica

colorimétrica, fez-se uma curva padrão com leite genuíno de procedência

conhecida. Para o seu preparo, o leite foi adulterado com soro de queijo de

composição padrão nas proporções de 1%, 2%, 5%, 10% e 20% (BRASIL, 1991).

O soro de queijo utilizado na elaboração da curva padrão foi obtido após a adição

do coalho em pó e subseqüente coagulação da caseína em leite genuíno, colhido

na fazenda da EV/UFG momentos antes das análises.

Paralelamente, foi preparada uma amostra “branco”, utilizando-se leites

crus genuínos colhidos na fazenda da EV/UFG durante a ordenha matutina,

sendo seguidos todos os passos já descritos para extração da amostra.

Foram transferidos para um béquer de 250mL, 10mL da amostra de

leite e adicionado, sob cuidadosa agitação, 10mL de solução do ácido

tricloroacético (TCA) a 24%. Deixou-se, a solução em repouso por 30 minutos,

seguindo-se da filtração em papel de filtro (Whatman n° 40) e transferência de

15mL do filtrado para tubo cônico de 35mL e adição de 0,5mL de solução de

ácido fosfotúngstico a 20%. Após a adição deste ácido, deixou-se em repouso por

46

10 minutos, realizando em seqüência, a agitação do tubo e leitura da absorbância

em espectrofotômetro utilizando comprimento de onda de 520 nm.

O resultado final foi obtido por comparação entre os valores

encontrados nas amostras de leite colhidas nos tanques de expansão, e a curva

padrão previamente estabelecido. A prova foi considerada positiva quando o soro

foi detectado em percentual igual ou superior a 3% (OLIVEIRA et al., 1998).

Método da ninidrina ácida. Foi adotada a metodologia descrita por FUKUDA et al (1996). Para a

construção da curva padrão preparou-se uma solução estoque contendo 294µg

de ácido siálico/mL. A partir desta solução, por diluição, uma solução de trabalho

contendo 98µg de ácido siálico/mL, de onde foram tomadas 10 alíquotas, em

duplicatas, sendo inicial de 0,001mL e a final de 1mL, representando

concentrações que variaram de 9,8 a 98µg de ácido siálico. Os volumes das

alíquotas foram completadas para 1mL com água destilada. Adicionou-se em

cada tubo 1mL de ácido acético glacial e 1mL de solução de ninidrina ácida (2,2 –

Dihydroxy 1,3 indanedione – C9H6O4 - SIGMA Grade). Os tubos foram colocados

em banho-maria por 10min sendo, em seguida, esfriados à temperatura ambiente

em banho de gelo e realizada a leitura a 470nm, para construção da curva

padrão.

A cada 15mL de leite foram acrescidos, sob agitação, 15mL de ácido

tricloroacético (TCA) a 24%. Após homogeneização e repouso por 30 min, a

mistura foi filtrada em papel de filtro (Whatman n° 40). Do filtrado foram retiradas

alíquotas de 10mL, em duplicata, e adicionou-se a cada uma delas 1mL de ácido

fosfotúngstico a 20%. Seguiu-se centrifugação a 3.500rpm/10min, desprezou-se

cuidadosamente o sobrenadante e dispersou-se o sedimento com 4mL de álcool

etílico 95%, com o auxílio de um bastão de vidro, que foi enxaguado com 2mL do

álcool. Procedeu-se a uma nova centrifugação por 10min/3.500rpm. Desprezou-

se novamente o sobrenadante e adicionou-se, ao resíduo, 2mL de ácido acético

glacial P.A.. e 1mL do reagente de ninidrina ácida. Após homogeneização, a

mistura foi aquecida em banho-maria fervente por 10min. Após o desenvolvimento

de cor, que variava de amarelo-claro a marron-amarelado, a solução foi resfriada

47

em água gelada até atingir a temperatura ambiente. Em seguida fêz-se a leitura

da absorbância a 470nm.

O espectrofotômetro foi calibrado com o “branco” e as leituras foram

transformadas em concentração de ácido N-acetilneuramínico (NANA) ou ácido

siálico (µg/mL) utilizando-se a curva padrão elaborada com ácido siálico puro

(BRASIL, 2003).

O resultado final foi obtido por comparação da leitura da absorbância

da amostra com a curva padrão de ácido siálico e expresso em µg/mL.

Análise estatística Na análise Estatística, vários testes e modelos matemáticos foram

utilizados na estimativa dos parâmetros. Medidas de tendência central como a

média aritmética e dispersão como o desvio padrão e coeficiente de variação

também foram utilizados (COCHRAN & COX, 1968; PIMENTEL GOMES, 1985 e

CENTENO, 1999). A variável estudada foi o soro de leite em amostras de leite cru

colhidas em tanques de refrigeração por expansão direta.

48

RESULTADOS E DISCUSSÃO Das 100 amostras de leite cru refrigerado, colhidas em tanques de

expansão, em 68% não foi detectada a presença de soro pela técnica da CLAE.

Estas, quando submetidas à análise pelo método da ninidrina ácida,

apresentaram teor médio de ácido siálico de 5,58 µg/mL ± 5,70µg/mL. A média

moda, ou seja, o valor de maior freqüência na distribuição situou-se em

2,70µg/mL NANA e os valores mínimo e máximo encontrados foram de

1,96µg/mL e 48,63µg/mL, respectivamente.

O valor mais freqüente quando se empregou a técnica da ninidrina

ácida (2,70µg/mL) está em acordo com o teor médio para leite autêntico

detectado por FUKUDA et al (1994) e com o recomendado na Instrução

Normativa (IN) 68, que oficializou a técnica de detecção do ácido siálico livre e

ligado a glicoproteína do leite. Segundo a Normativa, amostras de leite cru

autêntico apresentam teor médio de 2,71µg/mL ± 0,83µg/mL de ácido siálico

(BRASIL, 2006a). Das 68 amostras negativas pela CLAE e analisadas pelo

método da ninidrina, apenas 14,7% foram classificadas como leite autêntico,

enquanto que 85,3% como leite fraudado.

Dentre as amostras consideradas fraudadas pelo método da ninidrina

ácida, verificou-se teor máximo de soro de 48,63µg/mL, resultado superior ao teor

médio de ácido siálico em amostras de soro industrial, que é de 42,35µg/mL

(FUKUDA et al., 1994, 1996; BRASIL 2006a), podendo chegar a um valor máximo

de 70,5µg/mL (FUKUDA et al. 1996).

De acordo com a interpretação prática do método da ninidrina ácida

realizada por FUKUDA et al. (1996) para análise de leite cru em plataforma, o

valor médio de 5,58µg/mL ± 5,70µg/mL de NANA, detectado no presente trabalho,

está classificado na categoria de suspeito, uma vez que o resultado encontra-se

dentro do intervalo de 5,14<C≤10,64µg de NANA livre/mL. A autora ressalta ainda

que, a detecção da adição de soro no leite, é considerada negativa quando os

valores são ≤5,14µg de NANA livre/mL de leite e positivo >10,64µg de NANA

livre/mL de leite. O valor médio encontrado no presente experimento (5,58µg/mL)

assemelha-se ao encontrado por FUKUDA et al. (1996) para leite cru refrigerado,

de 6,93µg/mL de NANA, estando portanto, incluído na faixa de categoria

49

considerada “suspeita de fraude por adição de soro”. Este valor 5,58µg/mL com

desvio padrão de ± 5,70µg/mL implicaria na suposição de conduta duvidosa do

produtor, uma vez que as amostras foram colhidas em tanques de expansão. No

entanto, há que se consideram outros fatores importantes como a temperatura do

leite armazenado em tanques de expansão, o tempo de armazenamento e a

higienização dos tanques. Assim, o teor de NANA em leites com mais horas de

estocagem sob refrigeração, bem como, obtido sob higienização precária pode

apresentar multiplicação de microrganismos psicrotróficos, acarretando certa

hidrólise protéica com posterior liberação do CMP, que segundo FUKUDA et al.

(1994) e NAKANO & OZIMEK (1999) são os responsáveis pelo teor de ácido

siálico nas amostras.

O leite enquadrado na categoria suspeita segundo FUKUDA et al.

(1996) deve receber um tratamento diferenciado, não podendo ser condenado e

tão pouco considerado negativo. O ideal seria se possível, fazer um rastreamento

e acompanhamento sistemático de todo o ciclo de produção, do

acondicionamento e do transporte desse leite.

No caso da adição fraudulenta do soro de queijo em leite, o fraudador

pode proceder de duas formas, adicionando quantidades ínfimas de soro,

caracterizando uma fraude sutil, que pouco contribuirá para o aumento do teor de

ácido siálico. Consequentemente, a fraude não será detectada devido aos valores

situarem-se em níveis considerados normais. Por isso, sugerem-se considerar

como padrão, os valores médios estabelecidos pela legislação. A outra maneira

de enganar o consumidor é a adição grosseira do soro. Nesta a intenção do

fraudador é adicionar uma quantidade maior de soro, tendendo ao exagero,

visando lucros cada vez mais altos (FUKUDA et al, 1996).

Ainda em relação as 68 amostras negativas pela CLAE, duas foram

positivas (2,94%), quando analisadas pelo método colorimétrico adaptado. Nesse

caso, ressalta-se que 66 amostras (97,06%) podem ser consideradas como leite

genuíno. Tendo como base esse resultado pode-se afirmar que o método

colorimétrico foi o que mais se aproximou da técnica CLAE em termos de

sensibilidade, quando comparado com o da ninidrina ácida (14,70%). Esses

dados confirmam os encontrados por (SOUZA et al., pesquisa em andamento

neste laboratório) em seu trabalho de validação do método colorimétrico,

50

utilizando parâmetros de avaliação, onde propõe que o mesmo pode ser

considerado uma metodologia de triagem para a detecção de adição de soro em

leite.

No presente estudo, foi encontrado 32 amostras positivas para

presença de soro pelo método da CLAE em 100 amostras colhidas. A média de

soro foi de 14,37%, superior, portanto, às médias detectadas pelos métodos

colorimétrico adaptado (5,28%) e o da ninidrina ácida (3,12%).

As médias, juntamente com os valores mínimos e máximos para cada

metodologia estão apresentadas na Figura 2.

FIGURA 2. Representação gráfica da comparação entre as metodologias para detecção e quantificação de soro no leite, por meio das

médias, valores mínimos e máximos, das amostras positivas para CLAE

A CLAE apresentou valor mínimo e máximo de 0,44% e 41,36%, o

método colorimétrico de 0,02% e 14,51% e a ninidrina ácida de 0,69% e 9,82%,.

Comparação os métodos por meio do emprego do teste t de Student verifica-se

que houve diferença significativa (p<0,01) entre os mesmos tendo o método da

CLAE sido mais sensível na detecção de soro de queijo que os métodos

colorimétrico adaptado e ninidrina ácida. Comparando a média do teor de soro

obtida pelo método colorimétrico (5,28%), com a da ninidrina ácida (3,12µg/mL),

51

observa-se que o método colorimétrico apresentou sensibilidade um pouco maior,

porém não significativa (p>0.05). Na verdade, esperava-se que realmente a CLAE

fosse a mais sensível entre as técnicas comparadas, uma vez que, constitui uma

metodologia validada e empregada como método oficial pelo MAPA (BRASIL,

1991) na detecção e quantificação do caseinomacropeptídeo no leite além de

internacionalmente reconhecida.

Comparando os resultados obtidos por meio das técnicas CLAE,

colorimétrico adaptado e ninidrina ácida, nas 100 amostras analisadas, observa-

se diferença significativa (p<0,01) entre eles. Quando comparadas pelo teste de

Tukey, 5%, verifica-se que a média geral da CLAE (4,59%) difere (p<0,05) da

ninidrina ácida (1,66%) e colorimétrico (1,89%). Por outro lado, as médias obtidas

pelos métodos ninidrina e colorimétrico não diferem entre si (Tabela 1). Os

valores mínimo e máximo obtidos por meio dos métodos CLAE, colorimétrico e

ninidrina foram de zero% e 41,36%, zero% e 14,51% e 0,20% e 9,82%, nesta

ordem.

TABELA 1 – Médias e Desvio Padrão dos resultados das análises de soro em leite pelos métodos da ninidrina ácida, colorimétrico e para CLAE. Goiânia - GO. 2007

FV GL SQ QM F Pvalor

Tratamento 2 538,33 269,16 7,53 0,0006 Resíduo 297 10617,07 35,74 - -

Médias dos tratamentos (%) Ninidrina ácida Colorimétrico CLAE 1,66 ± 2,20a 1,86 ± 3,27a 4,59 ± 9,58b

FV: Fonte de variação; GL: Grau de liberdade; SQ: Soma de quadrado; QM: Quadrado médio; F: Teste F; Pvalor: probabilidade dos tratamentos não diferirem entre si (p<0,01). Médias seguidas de uma mesma letra não diferem entre si (Tukey, 5%).

Comparando os três métodos de detecção de soro em leite, tendo

como base a média da concentração de soro nas 100 amostras analisadas,

verifica-se que as metodologias diferiram entre si, CLAE (4,59 ± 9,58),

colorimétrico (1,86 ± 3,27) e da ninidrina ácida (1,66 ±2,20) e seus respectivos

desvios padrão. Pode-se inferir com base no desvio padrão que houve uma

variabilidade entre a média amostral e a verdadeira média entre cada

metodologia, principalmente entre a CLAE e as demais técnicas. Observa-se,

52

diante dos dados obtidos, juntamente com os valores mínimos e máximos para

cada método, CLAE (zero% e 41,36%), colorimétrico (zero% e 14,51%) e

ninidrina ácida (0,20µg/mL e 9,82µg/mL) que apesar da CLAE diferir dos demais,

o método colorimétrico adaptado e o da ninidrina ácida não apresentaram

diferença significativa. Admite-se, portanto, que o método colorimétrico adaptado

e o da ninidrina ácida, são ferramentas eficientes e de suma importância na

triagem de amostras destinadas à análise laboratorial para detecção de soro em

leite cru, corroborando com FUKUDA et al. (1994; 1996) que relataram ser o

método da ninidrina ácida um teste para “screening” na classificação do leite

recebido pelas indústrias de laticínios.

Com base na quantidade de amostras que apresentaram CMP

elevado, FUKUDA (2003) relatou que o congelamento das amostras pode afetar

os resultados do teor de CMP, tanto pela metodologia CLAE, quanto pela

ninidrina ácida. A autora sugere o envio do filtrado de TCA, em vez da amostra

congelada. Em 2004, FUKUDA e colaboradores indicaram a técnica da ninidrina

ácida para determinação quantitativa do ácido siálico em leite e SOUZA et al.

(pesquisa em andamento), o método colorimétrico para a detecção e

quantificação do CMP, como técnicas substitutas da CLAE, pelos seguintes

motivo: fácil execução, rapidez e eficiência na detecção rotineira da adição

fraudulenta de soro de queijo ao leite fluido. FUKUDA et al (2004) e SOUZA et al.

sugerem que a CLAE, metodologia sofisticada, de alta sensibilidade, precisão e

acurácia, seja utilizada em caso dúbio e em contraprova, por ser um processo

oneroso, demorado, trabalhoso e que requer mão de obra qualificada. Somam-se

a isto, o custo da manutenção e o tempo de vida útil das colunas cromatográficas.

Atualmente, existem várias metodologias disponíveis para análise

quantitativa do soro, como por exemplo, a técnica da cromatografia de fase

reversa (THOMA et al., 2006) que segundo os autores trata-se de ferramenta

eficiente na detecção das principais proteínas do soro e do CMP. Porém, a CLAE

por exclusão molecular - SEC (OLIEMAN & VAN DEN BEDEM, 1983),

metodologia utilizada neste trabalho, que vem sendo consagrada pela sua

eficiência, sensibilidade e, por ser, segundo STRANGE et al. (1992), amplamente

utilizada no isolamento das proteínas menores do soro do leite.

53

De acordo com a IN69 de 13 de dez. de 2006, que instituiu critério de

avaliação da qualidade do leite in natura, os leites que apresentarem índices de

CMP de até 30 mg/L devem ser destinados ao abastecimento direto, os que

estiverem entre 30 mg/L e 75mg/L, enviados à produção de derivados lácteos e,

acima de 75mg/L, encaminhados para alimentação animal e/ou indústria química

(BRASIL, 2006b).

Com base na IN69, das 32 amostras positivas ao método da CLAE, 10

(31,25%) deveriam ser destinadas ao abastecimento direto, duas (6,25%)

produção de derivados lácteos e 20 (62,5%) para a alimentação animal. Com

relação às técnicas da ninidrina ácida e colorimétrico adaptado, 16 (50%) e 12

(37,5%), respectivamente, estariam aptas para o consumo. Das 16 (50%)

amostras positivas testadas pelo método da ninidrina ácida, 12 (37,5%) deveriam

ser destinadas para a produção de produtos lácteos e quatro (12,5%) enviados a

alimentação animal. Das 20 (62,5%) amostras positivas pelo método

colorimétrico, 12 (37,5%) deveriam ser destinados à produção de lácteos,

enquanto que, oito (25%) à alimentação animal (BRASIL, 2006b).

Assim, com base nos resultados obtidos com a CLAE e segundo os

critérios da IN69, apenas 10 amostras estariam aptas para o consumo direto,

duas serviriam para produção de derivados e 20 estariam impróprias para o

consumo humano.

54

CONCLUSÕES De acordo com os resultados encontrados, concluiu-se:

A CLAE é a metodologia de maior sensibilidade na determinação do

soro de queijo em leite, e os métodos da ninidrina ácida e colorimétrico adaptado

poderão ser empregados na triagem, visando à detecção e quantificação de soro

de queijo.

55

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de 13 de dez. de 2006, Institui critério de avaliação da qualidade do leite in natura, concentrado e em pó, reconstituídos, com base no método analítico oficial físico-químico denominado “Índice CMP”. In: Diário Oficial da União, Brasília, 15 dez. 2006b.

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jun. de 2007, aprova revoga a Portaria Ministerial n° 124 de 23 de set. de 1991. In: Diário Oficial da União, Brasília, 11 jun. 2007.

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.

CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS Com a globalização, o consumidor tem à sua disposição uma grande e

diversificada oferta de produtos lácteos. O controle de qualidade do leite e

derivados tornou-se mais rigoroso e freqüente, uma vez que o consumidor e os

órgãos de regulamentação vem se tornando, a cada dia, mais exigente com

relação à qualidade dos alimentos.

Deste modo, os critérios empregados para definir a qualidade do leite

cru vêm mudando para atender a demandas oficiais, da indústria e dos

consumidores e aos requisitos de segurança alimentar e rendimento industrial. As

características de um leite de qualidade podem ser resumidas em três fatores: a

qualidade higiênica, o valor nutritivo e a manutenção das características

sensoriais, que podem ser alteradas no leite, devido à ação proteolítica de

microrganismos.

Neste aspecto, são especialmente importantes os procedimentos

higiênicos adotados na produção e armazenamento do leite na fazenda, assim

como no seu transporte até a indústria, a fim de se obter um produto com boa

qualidade microbiológica. Problemas relacionados com falta de higiene,

temperatura e tempo de estocagem inadequados do leite, propiciam a

contaminação e favorecem a multiplicação de microrganismos deteriorantes que

produzem enzimas proteolíticas termoestáveis, levando à degradação das

proteínas do leite, especialmente da caseína e ocasionando à produção de soro.

É importante ressaltar os problemas relacionados às fraudes por adição de

substâncias não permitidas ao leite, como por exemplo, o soro de queijo.

A utilização do leite com qualidade microbiológica ruim influenciará as

etapas futuras do processamento industrial. Portanto, existem fatores que podem

auxiliar no controle do crescimento bacteriano, como por exemplo, uso da

refrigeração na propriedade e granelização do transporte. No entanto, a prática

isolada do resfriamento do leite não garante a qualidade do produto. Ao resfriar o

leite, dá-se oportunidade de seleção e multiplicação de microrganismos

psicrotróficos, que podem influenciar negativamente a qualidade do leite e de

seus derivados. Obviamente, que isto poderá ocorrer caso medidas higiênicas

sanitárias adequadas não forem adotadas.

60

Considerando a intensa procura por alimentos seguros para o

consumidor, torna-se indispensável, tanto para indústria de laticínios quanto para

entidades de regulamentação e fiscalização, meios que possam responder de

forma precisa e rápida a problemas que surgem ao longo das fases de produção

e comercialização, minimizando assim gastos. Assim sendo, considerando os

resultados obtidos neste experimento, a cadeia produtiva do leite poderá utilizar o

método colorimétrico adaptado e/ou da ninidrina ácida como metodologias para

triagem na detecção e quantificação de soro de queijo em leite cru refrigerado ou

mesmo processado. Desta forma, utilizando a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE), apenas para os casos, onde se faça necessário contraprovas

laboratoriais ou em casos dúbios.

Ressalta-se a necessidade do setor de lácteos averiguarem as

condições de produção, armazenamento, transporte, processamento e

distribuição, pois, nas condições de realização do presente estudo, o tempo de

armazenamento não afetou os teores de soro e CBT no leite cru refrigerado, bem

como constatou-se a inexistência de correlação entre as variáveis, de modo que,

a ocorrência da adição fraudulenta de soro deverá ser computada na avaliação da

qualidade do leite, em situações onde sejam encontrados soro de queijo no leite.