clart papilomavirus humano 4 genotipagem de...

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CLART PAPILOMAVIRUS HUMANO 4

GENOTIPAGEM DE PAPILOMAVIRUS HUMANO POR IDENTIFICAÇÃO GENÓMICA

PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO

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CLART PAPILOMAVIRUS HUMANO 4

CLART® HPV4 está sob a proteção de 2 famílias de patentes que correspondem aos pedidos de Patentes Interncionais PCT WO2007017699 e WO2011116797, e que incluem membros regionais e nacionais em diferentes territórios, incluindo patentes concedidas em Espanha, Alemanha, Dinamarca, França, Itália, Suécia, México, Rússia, China e Israel, e aplicações de patente em utilização na Brasil e Canadá. CLART® CLART-Strip®, CAR®, SAICLART® e AUTOCLART® são marcas registadas da GENOMICA.

GENOMICA, S.A.U. Parque Empresarial Alvento, Edificio B

Calle Vía de los Poblados, 1 – 1ª planta

28033 Madrid, Espanha

www.genomica.com

Versão 3

Junho 2015

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ÍNDICE: 1. QUADRO DE SÍMBOLOS

2. DESCRIÇÃO DO PROTOCOLO

3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO

3.1. REAGENTES PARA EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO

3.2. REAGENTES DE VISUALIZAÇÃO

3.3. OUTROS COMPONENTES

4. MATERIAL ADICIONAL

4.1. REAGENTES E MATERIAL

4.2. EQUIPAMENTO

5. RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO

5.1. RECOMENDAÇÕES GERAIS

5.2. PRECAUÇÕES PARA A VISUALIZAÇÃO

6. RECOLHA DE AMOSTRAS

6.1. ESFREGAÇO

6.2. SUSPENSÕES CELULARES

6.3. TECIDO FIXADO EM FORMOL E INCLUÍDO EM PARAFINA

7. PROTOCOLO DE TRABALHO

7.1. REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO

7.2. VISUALIZAÇÃO DO PRODUTO AMPLIFICADO PARA CLART-Strip® (CS)

7.2.1 visualização Manaus 7.2.2.visualização com o autoclart®

8. LEITURA DE RESULTADOS

9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE TRABALHO

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

12. TABELA

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1. QUADRO DE SÍMBOLOS

Ler por favor as instruções de manipulação

Prazo de validade

Dispostivo para diagnóstico in vitro

Código de lote

Conservar à temperatura ambiente

Conservar entre 4 ºC e 8 ºC

Conservar entre –30 ºC e –18 ºC

25ºC

20ºC

8ºC

4ºC

-18ºC

- 30ºC

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2. DESCRIÇÃO Baseado na amplificação de fragmentos específicos do genoma viral e sua hibridização com sondas

específicas para cada tipo de HPV, o dispositivo CLART PAPILLOMAVIRUS Humano 4 é capaz de detetar infecções e co-infecções de até 35 genótipos do HPV a partir de uma única amostra (em um único tubo). Esta abordagem apresenta várias vantagens:

A sua elevada sensibilidade permite a deteção de quantidades mínimas de DNA Viral.

A sua elevada especificidade permite a deteção de genótipos de HPV específico, por

reconhecimento de uma sequência altamente conservada do genoma viral.

Este teste é facilmente executado num laboratório hospitalar.

Detecta rapidamente a presença dos tipos de HPV com maior relevância clínica em poucas

horas.

O dispositivo CLART PAPILOMAVIRUS Humano 4 detecta a presença de 35 tipos (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68a y b, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89) de HPV mais relevantes clinicamente em diferentes tipos de amostras (swabs e suspensões celulares) A deteção dos diferentes genótipos de HPV é feita através da amplificação por PCR de um fragmento de 450 pb da região L1. Esta sequência altamente conservada apresenta pequenas variações entre os diferentes tipos de HPV o que permite a sua identificação genómica por reconhecimento do DNA viral com sondas específicas. Desta forma assegura-se a especificidade da detecção. A deteção do produto amplificado por PCR é efetuada através de uma nova plataforma tecnológica baseada em microarrays de baixa densidade: CLART® (Clinical Arrays Technology). A plataforma baseia-se em um princípio muito simples, mas muito rentável. Consiste em incluir um microarray no fundo de um poço de placa microtitulada (CLART-Strip®-CS) (Figura 1), este sistema simplifica consideravelmente o processo de hibridização e visualização quando comparado com os sistemas de microarrays clássicos.

Figura 1. CLART-Strip® CS em formato de tiras de 8 poços

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A hibridização do produto amplificado por PCR é detetada pela formação de um precipitado insolúvel nas zonas do microarray onde os produtos amplificados foram capturados pelas sondas. Durante a PCR os produtos amplificados são marcados com biotina. Estes produtos marcados, hibridizam com as respetivas sondas específicas que se encontram imobilizadas na superfície do microarray. Depois de incubar com o conjugado estreptavidina-peroxidase, este liga-se à biotina conferindo aos produtos amplificados e hibridizados, atividade de peroxidase. Na presença de o-Dianisidina, a atividade da peroxidase metaboliza este composto, formando um precipitado insolúvel nos locais onde ocorreu a hibridização (Figura 2)

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Hibridização

Sondas do array

Incubação comconjugado

Precipitação especifica

Produtos marcados

Conjugado

Reação com revelador

Biotina

Figura 2: Esquema do método de visualização. As sondas, imobilizadas na superfície, hibridizam com os produtos de amplificação complementares marcados com biotina. O conjugado HRP (estreptavidina de rábano, HorseRadish Peroxidase) é adicionado à reação e a componente estreptavidina do conjugado liga-se à biotina, conferindo ao complexo hibridizado atividade de peroxidase. Finalmente o substrato o-Dianisidina é adicionado e é metabolizado pela ação da HRP, formando-se um precipitado insolúvel no local da hibridização.

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3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DA EMBALAGEM

O dispositivo CLART PAPILOMAVIRUS Humano 4 contém reagentes suficientes para a extração e análise do DNA de 48 ou 96 amostras clínicas. Os reagentes incluídos na embalagem estão agrupados em duas caixas, uma vez que devem ser armazenados a temperaturas diferentes. Todos os reagentes são estáveis nas condições indicadas de conservação até à data de validade indicada.

3.1. Reagentes para amplificação

Os tubos de amplificação são transportados a –20º C.

Os Tubos de Amplificação contêm 45 µl de mistura de reacção. São enviados prontos a usar e devem ser conservados a –20º C. Só deverá descongelar, em gelo, o número de tubos necessários, deixando os restantes a -20º C.

Nota: na caixa do dispositivo está incluído um indicador autocolante irreversível de temperatura. O aparecimento de uma cor rosa na janela de visualização indica que os produtos ultrapassaram a temperatura de conservação de -20ºC e o dispositivo não deve ser utilizado.

3.2. Reagentes de Visualização

O dispositivo de visualização é expedido e conservado a 4ºC. AVISO: Após receber os CLART-Strip® (CS) estes devem ser conservados à temperatura ambiente.

CLART-Strip® (CS) (incluem as sondas específicas). São enviados num envelope selado. Depois de aberto, o envelope deve ser fechado e conservado à temperatura ambiente (25oC máx.), protegido da luz.

SH (Solução de Hibridização). Conservar a 4ºC .

DC (Diluente do Conjugado). Conservar a 4ºC.

CJ (Conjugado). Conservar a 4ºC. Centrifugar brevemente antes de utilizar.

RE (Solução de Revelação). Conservar a 4º C, protegido da luz..

TL (Tampão de lavagem). Conservar a 4ºC.

Suporte e tampa para a Tira de 8 poços.

3.3. Outros componentes Para a captura e posterior processamento da imagem são necessários os seguintes componentes:

CAR® (CLINICAL ARRAY READER) (figura 3): que permite a leitura e interpretação automática até 12 CS, o que significa, um total de 96 amostras. Esta plataforma é fabricada exclusivamente para os dispositivos da GENOMICA.

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SAICLART®: software desenvolvido e validado pela GENOMICA para processamento de imagens.

Software específico do dispositivo CLART® HPV 4 concebido e validado pela GENOMICA

Figura 3. CAR® (CLINICAL ARRAY READER)

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4. MATERIAL ADICIONAL 4.1. Reagente e material

Água Destilada.

Etanol a 96%

Luvas descartáveis.

Pontas de pipetas com filtro ou com êmbolo.

Recipiente com gelo picado.

Tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml autoclavados.

Suportes para Tubos de 1.5 ml.

Suportes para tubos de 0.5 ml/0.2 ml.

Solução salina a 0,9% NaCl 4.2. Equipamento O equipamento que se segue é necessário para a fase de visualização automática. O autoclart® (Figura 3) permite o processamento automático de 12 tiras ou 96 amostras.

Figura 4. autoclart®

Microcentrífuga.

Termociclador.

Câmara de fluxo laminar para o laboratório de extração.

Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, 20-200 µl e 200-1000 µl) para uso no laboratório de extração.

Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, 20-200 µl e 200-1000 µl) para uso no laboratório de visualização.

Termomixer (a 25°C, 30°C e 65º C) com agitação ajustável, compatível com tubos tipo Eppendorf.

Vortex.

Sistema de Vácuo (opcional).

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5. RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO Muito Importante: Ler cuidadosamente esta seção antes de iniciar a técnica. 5.1. Recomendações Gerais 1. A técnica deve realizar-se em duas áreas separadas fisicamente, para evitar a contaminação das amostras com produtos amplificados anteriormente. Cada uma das áreas deve ter o seu próprio material de trabalho identificado (pipetas, pontas, tubos, suportes, luvas, etc.) que nunca deve sair das respetivas áreas.

Área Pré-PCR: Nesta área, efetua-se a preparação das amostras, a extração de DNA e a adição do material extraído aos tubos de amplificação. A manipulação da amostra deve ser efetuada dentro de uma câmara de fluxo laminar.

Área Pós-PCR: Nesta área efectua-se a amplificação e visualização da amostra. O material que se encontra nesta área nunca deve entrar em contacto com a área de Pré-PCR. Depois de trabalhar na área de pós-PCR não volte à área pré-PCR.

2. Utilizar sempre luvas. É recomendável substituir de luvas com alguma frequência. 3. Limpar as áreas de trabalho (bancada do laboratório, câmaras, suportes, pipetas, termociclador) minuciosamente, com hipoclorito diluído a 10%, após cada processamento de amostras; é obrigatório desinfetar todas a áreas de trabalho em caso de contaminação. No caso de termocicladores e termomixers, é aconselhado limpá-los antes e depois da sua utilização, nestas mesmas condições.

4. Utilizar sempre pontas com filtro ou pipetas com escoamento parcial para evitar contaminações. Devem ser utilizadas pipetas distintas em cada área. Eliminar a ponta da micropipeta após pipetagem. 5. Utilizar sempre material descartável ou autoclavado. 6. Nunca misturar reagentes de dois tubos diferentes, mesmo que sejam do mesmo lote. 7. Fechar os tubos dos reagentes imediatamente após utilização para evitar contaminações. 8. Separar sempre os tubos uns dos outros durante a manipulação, tendo especial atenção durante a extracção. 9. A GENOMICA não assume qualquer responsabilidade pelos resultados obtidos com o dispositivo, se forem utilizadas amostras diferentes das recomendadas.

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5.2. Precauções para a extração e adição de material extraído para o tubo de amplificação

1. Usar sempre luvas 2. Limpar as superfícies de trabalho das câmaras com solução de lixívia diluída a 10%. 3. Ligar o fluxo laminar e a luz UV, pelo menos, 20 minutos antes da extração. Desligar a luz UV quando estiver a trabalhar dentro da câmara. 4. A preparação das amostras antes da extração deve ser efetuada dentro da câmara. 5.3. Precauções para a visualização 1. Evitar que a ponta da pipeta ou o sistema de vácuo toquem no fundo do tubo onde se encontra o microarray, para não o danificar. 2. Adicionar todas as soluções às paredes da tira. Evitar pipetar diretamente para o fundo onde se encontra o microarray. 3. É conveniente não adicionar a solução SH (solução de hibridização) até se adicionarem os produtos desnaturados de PCR. 4. O array não deve permanecer seco.

5. Após a incubação com a solução CJ, é muito importante lavar bem a microarray para evitar que fiquem resíduos que possam reagir com a solução RE, resultando num precipitado inespecífico que pode dar lugar a falsas interpretações do resultado. 6. Evitar a formação de bolhas na superfície do microarray ao adicionar as diferentes soluções. 7. Quando estiver a visualizar a imagem no leitor, confirmar que os marcadores de posição aparecem e que não há bolhas ou pontos a interferir com a leitura. Caso contrário, limpar o fundo do tubo com papel de celulose ou toque suavemente o tubo com o dedo. 6. COLHEITA DE AMOSTRAS 6.1. Swabs As amostras devem ser coletadas em swab (algodão ou “escovinha”) limpo e seco, e deve ter largura suficiente para obter uma coleta satisfatória. Não pode ser usado nenhum tipo de dispositivo que venha a causar sangramento, pois sangue pode interferir na amostra. Colocar o swab já com material coletado em seu tubo respectivo, que deve conter algum tipo de meio de conservação. Manter o swab a 4ºC até o processamento durante sete dias, ou a -20ºC caso seja processado após esse período. 6.2. Suspensões Celulares Estas suspensões celulares são do tipo das utilizadas para realizar citologias cervicovaginais de capa fina por filtração através de membranas (ThinPrep®, Cytyc). Colher a amostra com uma

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escova ou espátula. Suspender novamente a amostra agitando o dispositivo utilizado num frasco com meio de transporte. Eliminar o dispositivo utilizado e conservar a amostra a 4ºC até ao seu processamento. 7. PROTOCOLO DE TRABALHO As amostras coletadas também podem ser testadas com ou sem extração de DNA. Em alguns casos, pode-se precisar de algum tipo de tratamento para elas. Por favor, atenção aos protocolos abaixo, sobre o tratamento das amostras para não extração de DNA. 7.1. Processamento de amostra sem extração de DNA

7.1.1. Swab seco

Adicionar 1.5 ml de solução salina. Vortexar vigorosamente para que a amostra esteja pronta para a reação de amplificação.

Caso a amostras já tenha sido extraída, não adicionar solução salina novamente, somente adicione 5 µl da solução remanescente para a PCR.

7.1.2. Digene STM

Adicionar 200 µl da amostra em um tubo de 1.5 ml.

Centrifugar a 4.000 rpm durante 1 minuto. Descartar o sobrenadante.

Adicionar 1 ml de solução salina, vortexar e centrifugar por 1 minuto a 4.000 rpm. Descartar o sobrenadante.

Adicionar novamente 1 ml de solução salina, vortexar e centrifugar por 1 minuto a 4.000 rpm. Descartar o sobrenadante.

Ressuspender o pellet em 50 µl de água DNAse free

7.1.3. Suspensão celular, ThinPrep

Transferir 400 µl da suspenção celular para um tubo de 1.5 ml.

Centrifugar por 1 minuto a 13.000 rpm. Descartar o sobrenadante.

Adicionar 400 µl de solução salina. Vortexar.

Centrifugar por 1 minuto a 13.000 rpm. Descartar o sobrenadante.

Ressuspender o pellet em 25 µl de água DNAse free 7.2. Reação de amplificação Recomendações específicas para a amplificação:

Trabalhar na área pre-PCR, numa câmara de fluxo laminar e seguindo as recomendações indicadas no ponto 5.1.

Adicionar o material resultante, extraido ou não extraido (ver protocolo 7.1) diretamente no tubo de amplificação, em uma câmara de fluxo laminar e seguir as

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recomendações indicadas no ponto 5.1. Durante o processo, manter os tubos separados e em gelo e seguir as etapas abaixo:

1. Descongelar um Tubo de Reação por cada amostra e manter em gelo. Não usar temperaturas superiores a 37ºC para a descongelação. 2. Centrifugar uns segundos os Tubos de Reação na microcentrífuga para que fique todo o líquido no fundo do tubo (se não se dispõe de adaptadores de microcentrífuga para os Tubos de Reação, poderão utilizar-se em seu lugar tubos de um tamanho maior aos quais se tenha retirado a tampa). 3. Adicionar 5 µl do material resultante das amostras, extraido ou não extraido, aos Tubos de Reação, e ressuspender várias vezes com a micropipeta. Deixar os tubos em gelo. 4. Programar no Termociclador os seguintes ciclos de temperaturas: 5. Iniciar o programa e colocar os Tubos de Reacção no Termociclador quando o bloco tiver ultrapassado os 90 ºC. Deste modo minimizam-se as possíveis amplificações inespecíficas devidas a hibridização ocorrida abaixo da temperatura de reação. A duração da amplificação é de cerca de 4 horas, ainda que possa variar ligeiramente dependendo do Termociclador. 7.3. Visualização do produto amplificado para as CLART-Strip® (CS): Recomendações específicas antes de iniciar o processo de visualização:

O PROTOCOLO DESCRITO A SEGUIR DEVE REALIZAR-SE SEMPRE NUMA ÁREA PÓS-PCR. NUNCA TRANSPORTAR O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ÁREA DE PRÉ-PCR.

1. Ligar o CAR® (CLINICAL ARRAY READER) antes de iniciar o procedimento. A auto-calibração do equipamento leva uns minutos, e é necessário introduzir o nome das amostras no programa antes da leitura.

2. Assegurar-se de que, antes de iniciar a hibridização, a temperatura do termomixer atingiu

os 65º C durante, pelo menos, 1 hora.

1 Ciclo 95ºC 5 min

40 Ciclos 94ºC 30 seg 55ºC 60 seg 72ºC 90 seg

1 Ciclo 72ºC 8 min

20ºC (mantidos) até à recolha dos tubos (opcional)

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3. Aquecer a SH (solução de hibridização) no termomixer.

4. Preparar a solução de lavagem antes de cada análise, não utilizar soluções anteriores ou quaisquer soluções remanescentes de análises anteriores.

5. Utilizar uma ponta com filtro diferente para cada poço e substituí-la de cada vez que se adicionar um reagente.

6. O pente de 8 pontas utilizado na bomba de aspiração deve ser descartado após utilização

ou descontaminado com uma solução de lixívia a 10% após cada análise. Certificar-se de que o sistema de vácuo funciona corretamente e não deixar restos de líquido nos poços.

7. Todos os tampões devem ser completamente aspirados dos poços sem tocar no fundo.

7.3.1 Visualização Manual

1. Desnaturação: Colocar os tubos de amplificação no termociclador quando tiver atingido 95ºC e incubar os tubos durante 10 min. Não exceder 10 min. de tempo de desnaturação para prevenir que os tubos sejam abertos e que possa ocorrer a contaminação. Retirar os tubos da incubação aos 95º C e colocá-los imediatamente no gelo.

2. Preparação da Solução TL diluída:

Para 8 Poços (uma Strip) adicionar:

1 ml de Solução TL + 9 ml de água destilada. Resultam 10 ml de solução TL diluída necessárias para uma Tira.

3. Pré-Lavagem das CS: Antes de iniciar a análise, é necessário efetuar uma pré-lavagem

das CS, adicionando 200 µl de solução TL diluída por poço. Após a adição, homogeneizar a solução diluída 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta, evitando tocar na superfície da Strip. Aspirar a solução diluída TL com o sistema de vácuo e verificar que os poços ficam completamente limpos sem líquido no fundo. Adicionar o tampão logo de seguida da seguinte forma:

4. Hibridização: A Solução de Hibridização (SH) deve ser aquecida a 50º C de modo a dissolver os sais cristalizados. Adicionar 100 µl de tampão SH a cada poço (evitando a formação de espuma), + 5 µl de produto desnaturado em cada poço. Homogeneizar com a ajuda da pipeta evitando tocar no array e incubar a strip, coberta com a tampa de plástico transparente no Termociclador durante 1 hora a 65ºC com agitação a 550 rpm.

Após uma hora, retirar o CS do Termociclador e aspirar o tampão SH com o sistema de vácuo.

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(Configurar o Termociclador para 30º C com agitação para posterior utilização na etapa 6. Retirar a tampa para acelerar o processo de arrefecimento).

5. Dupla Lavagem: Usar pontas diferentes para cada poço em ambas as lavagens.

Adicionar 200 µl de tampão TL diluído e homogeneizar 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta. Eliminar a solução TL diluída com o sistema de vácuo. Repetir esta lavagem uma vez e deixar a CS com 200 µl de tampão TL até que o Termomixer atinja os 30ºC.

6. Bloqueio e Conjugado: Preparar a solução CJ diluída 15 minutos antes de terminar a

hibrização e mantê-la no gelo até à sua utilização. É aconselhado centrifugar o tampão CJ durante 10 segundos antes de utilizar.

Preparar o tampão CJ diluído: para uma strip (8 poços) adicionar como se segue:

1 ml de Tampão DC

9 µl da solução CJ. Homogeneizar em vortex brevemente a solução CJ diluída antes da utilização.

Remover o tampão TL diluído sem deixar secar o array e adicionar 100 µl de tampão CJ diluído a cada poço. Incubar no Termociclador a 30º C a 550 rpm durante exatamente 15 minutos. Após esta incubação, retirar a tira e eliminar imediatamente o tampão CJ diluído com o sistema de vácuo, (ver figura 4). (Programar o Termomixer a 25ºC com agitação para a etapa 8. Retirar a tampa para acelerar o arrefecimento.)

7. Tripla lavagem: Adicionar imediatamente 200 µl de solução TL diluída por poço,

homogeneizar 10 a 15 vezes com a ajuda da pipeta e retirar o tampão TL diluído com o sistema de vácuo sem deixar secar o array. Repetir esta lavagem duas vezes e deixar o CS com 200 µl do tampão TL à temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos ou até a temperatura do Termomixer atingir 25 ºC. É muito importante que o tampão CJ diluído seja completamente removido dos poços, uma vez que este pode reagir com o tampão RE produzindo um sinal inespecífico.

8. Revelação com o Tampão RE: Retirar completamente o tampão TL diluído sem deixar o

Array secar e adicionar 100 µl de tampão RE por poço. Incubar no Termomixer a 25ºC durante 10 min sem agitação.

Atenção! É muito importante utilizar o Termociclador sem agitação nesta etapa.

9. Após 10 min., retirar o tampão RE com o sistema de vácuo. O Array deve secar nesta

altura.

10. CAR® (CLINICAL ARRAY READER): Colocar a Strip no CAR®, este irá analisar os Arrays automaticamente.

7.3.2. A visualização com o autoclart®

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1. Desnaturação: Utilize o aparelho de ciclagem térmica para desnaturar os tubos de amplificação. Coloque os tubos de amplificação no aparelho de ciclagem térmica e, quando o mesmo atingir 95º C, incube os tubos durante 8 minutos. Retire os tubos da incubação a 95º C e coloque-os, imediatamente, no gelo. Desnature o produto de amplificação antes de colocar os reagentes de visualização no autoclart®:

2. Ligue o equipamento autoclart® e siga as instruções apresentadas no ecrã:

3. Feche a porta e carregue no botão.

4. Selecionar “Run Program” (acionar o Programa), a partir do menu principal.

5. Selecione o ensaio HPV4 test de entre os constantes na lista.

6. Selecione o alvéolo da tira onde vai ter início o processamento do ensaio: A1 ou E1, para o caso dos 4 primeiros alvéolos já estarem processados.

7. Selecione a quantidade de amostras a serem processadas. Com o autoclart®, o utilizador pode processar de 4 até 96 amostras por processamento. Em qualquer dos casos as amostras devem ser múltiplos de quatro.

8. Confirme se a quantidade de amostras e o alvéolo de arranque (A1 ou E1) estão corretos.

9. Coloque o suporte dos bicos (cheio) em posição.

10. Carregue a microchapa da matriz no suporte. Certifique-se que o fecho está seguro, a fim de se poder trancar a chapa.

11. Verifique se ambos os recipientes, do desperdício de bicos e desperdício de líquidos, estão vazios e em posição.

12. Encha a garrafa de DI com 250 ml de água destilada.

13. Adicione cada reagente ao respetivo recipiente específico. O autoclart® calcula os volumes específicos necessários, de acordo com a quantidade de amostras indicadas:

TL (Tampão de Lavagem). O volume apresentado no ecrã indica o tampão de lavagem diluído necessário. Para preparar o tampão de lavagem diluído, dilua, por favor, 1:10 do reagente TL fornecido em água destilada;

SH (solução de hibridização). Pronto para utilizar. Adicione o volume especificado no recipiente, uma vez temperado.

CJ (Conjugado). Recomenda-se que se centrifugue, por breves momentos, o CJ, antes de o utilizar. O ecrã apresenta o volume final do CJ diluído a adicionar, o que significa que cada ml indicado no ecrã deve ser preparado da seguinte forma: 1 ml de DC (Diluente do Conjugado) e 5 µl de reagente CJ. Centrifugue a solução diluída para que a mesma fique completamente misturada.

RE (Reagente). Adicione o volume de RE indicado no ecrã.

14. Feche a porta e carregue no botão para iniciar o programa.

O dispositivo inicia a preparação do sistema. Em seguida, efetua as pré-lavagens do CJ e

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adiciona a solução de hibridização. Uma vez terminados estes passos, o dispositivo emite um bipe como sinal para o utilizador adicionar as amostras sobre o CS. O autoclart® continuará a emitir bipes até o utilizador abrir a porta.

15. Para a adição das amostras sobre o CS, retire, cuidadosamente, a placa do autoclart® autoclart® e adicione cada um dos seguintes volumes dos produtos desnaturados, da mesma amostra, para o mesmo alvéolo. Misture com cuidado para não tocar na matriz e para colocar a microchapa de novo no autoclart®. Carregue no botão para continuar com o processo de visualização.

16. Uma vez terminado o processo de visualização, a autoclart® emitirá um bipe, indicando o fim do programa. Retire, com cuidado, a microplaca e proceda com o passo da leitura do CAR®.

17. CAR® (CLINICAL ARRAY READER – “Leitor da Matriz Clínica”): Colocar a Strip no CAR®, este irá analisar os Arrays automaticamente.

8. LEITURA DE RESULTADOS O Processamento dos dados obtidos a partir de cada uma das análises é completamente automático. O equipamento de leitura/análise emitirá um relatório com os resultados. No ecrã irá aparecer uma tabela com três colunas. Na coluna da esquerda aparecerão os tipos de HPV que podem ser detetados, a coluna central apresenta o resultado positivo ou negativo para cada tipo de HPV, resultante da análise, e a coluna da direita mostra a conformidade dos controlos de DNA e de amplificação. 9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Um dos principais inconvenientes da detecção por amplificação genómica é a possível ocorrência de resultados falsos negativos devido à qualidade inadequada de DNA na amostra (quantidade insuficiente na amostra, degradação de DNA ou perda de DNA durante a extração) ou a presença de inibidores de DNA Polimerase (hemoglobina, resíduos de parafina, sais, etc.) nas amostras a

serem analisadas. Contudo o CLART Papilomavirus Humano 4 elimina falsos negativos, uma vez que tem incluído controlos internos no tubo onde a amostra é analisada e que são amplificados ao mesmo tempo que o DNA viral. Cada tubo de amplificação do dispositivo contém os seguintes primers:

Um par de primers que amplifica o fragmento do gene humano CFTR (DNA genómico ou do paciente). Este é utilizado como controlo de DNA genómico.

Um par de primers que amplifica um plasmídeo modificado que se encontra no tubo e que é utilizado como controlo da reacção de amplificação.

Primers para o HPV. Estas reações de amplificação foram desenhadas de forma a favorecer a reação de amplificação do HPV em relação aos outros dois controlos. Em relação a estes controlos, a amplificação do DNA genómico é favorecido em relação ao controlo interno da reacção de amplificação.

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A explicação para este desenho é a seguinte: O Controlo interno de DNA Genómico é essencial para confirmar um verdadeiro resultado negativo, uma vez que informa se o DNA do paciente está presente na amostra mesmo que não tenha havido amplificação de nenhum tipo de HPV. O Controlo Interno de amplificação só é essencial quando não existe amplificação no tubo, uma vez que vai ajudar a distinguir entre um PCR inibido e uma amostra onde não se encontra DNA. Contudo, quando o HPV está presente na amostra, irá sempre haver uma preferência para amplificar os genótipos em vez dos controlos de amplificação. Ou seja, sob determinadas condições (i.e. quando um elevado número de cópias de um tipo particular de HPV ou quando vários genótipos de HPV estão presentes na amostra) os controlos internos podem não surgir (sem sinal). Tendo em conta estas observações, podemos considerar os seguintes resultados.

AMOSTRA

POSITIVO para

qualquer genótipo

CONTROLO DE DNA

GENÓMICO

CONTROLO DE AMPLIFICAÇÃO

INTERPRETAÇÃO

√ √ √ POSITIVO

É considerado um RESULTADO VÁLIDO.

CONTROLO PCR

CONTROLO DE DNA GENÓMICO

GENÓTIPO HPV

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Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO, mesmo que a amplificação do controlo diga SEM SINAL. Isto deve-se à competição entre os três tipos de DNA durante a reacção de amplificação.

AMO TRA

POSITIVO para

qualquer genótipo

CONTROLO DE DNA

GENÓMICO

CONTROLO DE AM LIFICAÇÃO

INTERPRETAÇÃO

√ √ SEM SINAL POSITIVA

Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO, mesmo que o resultado para os dois controlos seja SEM SINAL. Isto deve-se ao elevado número de cópias de um genótipo de um HPV presente na amostra.

AMOSTRA POSITIVO para

qualquer genótipo

CONTROLO DNA

GENÓMICO


INTERPRETAÇÃO

√

SEM SINAL

SEM SINAL

POSITIVO


GENÓTIPO HPV

GENÓTIPO DE HPV

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AMOSTRA

NEG TIVO para

qualquer genótipo

CONTROLO DE DNA

GENÓMICO


INTERPRETAÇÃO

√ √ √ NE ATIVO

Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO.

AMOSTRA

NEGATIVO para

qualquer genótipo

CONTROLO DNA

GENÓMICO

CONTROLO DE AMPLIFICAÇ O

INTERPRETAÇÃO

√ √ SEM SINAL NEGATIVO

Este é considerado um RESULTADO VÁLIDO, mesmo que não se obtenha o controlo PCR, devido a uma grande concentração de DNA genómico.

CONTROLO PCR CONTROLO DE DNA GENÓMICO


22

BRANCO NEGATIVO

para qualquer genótipo

CONTROLO DNA

GENÓ ICO


INTERPRETAÇÃO

H2O √ SEM SINAL √ NEGATIVO

Este é considerado como um RESULTADO VÁLIDO, por se tratar de um BRANCO, só o controlo PCR deveria aparecer porque não há DNA na amostra para ser amplificado.

AMOSTRA

NEGATIVO para

qualquer genótipo

CONTROLO DNA

GENÓMICO


INTERPRETAÇÃO

√ SEM S NAL √ SEM DNA

É considerado como um RESULTADO INVÁLIDO. Este resultado aparece por não haver DNA na amostra, o que pode acontecer por diversas razões:

1. Não existe DNA suficiente na amostra 2. Perda de DNA durante o processo de extração

A solução nestes casos é repetir a técnica desde a extração ou obter uma nova amostra do doente.

CONTROLO PCR

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AMOSTRA

NEGATIVO para

qualquer amostra

CONTROLO DE DNA

GENÓMICO


INTERPRETAÇÃO

√ SEM SINAL SEM SINAL PCR INIBIDO

Este é considerado um RESULTADO INVÁLIDO. Tal acontece porque há algumas substâncias que podem inibir a AND polimerase. A solução é verificar que não tem nenhuma destas substâncias e em seguida é preferível repetir a extração, ou obter uma nova amostra.

Um resultado incerto pode surgir devido a uma destas possibilidades:

Quando três cópias da mesma sonda são muito diferentes entre si.

Quando há uma co-infecção e um dos vírus detectados está no limiar entre o positivo e o negativo.

10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE TRABALHO FONTES DE INTERFERÊNCIA CONHECIDAS

Certas substâncias podem interferir com o dispositivo CLART Human Papillomavirus 4. Estas são principalmente substâncias que inibem a DNA polimerase e por conseguinte a reação de amplificação. As interferências mais conhecidas são:

Hemoglobina ou Parafina. O DNA extraído de esfregaços cervicovaginais pode conter pequenas quantidades de hemoglobina, enquanto o DNA extraído a partir de amostras de tecidos incluídos em parafina, pode estar contaminado com pequenas quantidades deste meio. Não obstante o nosso dispositivo de Extracção-Purificação minimizar estes efeitos, ainda existe a possibilidade de interferência.

Ácido acético ou Iodo. Se a recolha da amostra a analisar se realizar depois de uma colposcopia, a contaminação do ácido acético ou iodo pode ocorrer. Pelo facto de ambos os compostos poderem inibir reacções de PCR, recomendamos que se faça a recolha da amostra antes da colposcopia.

Marcadores alinhados

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Uso das amostras não adequadas. A análise de qualquer outro tipo de amostra que não as

indicadas no manual do dispositivo CLART Human Papillomavirus 4, assim com a recolha incorreta das amostras, pode levar a que o resultado da análise não seja conclusivo. Por exemplo, se a zaragatoa for colocada num meio alternativo, a PCR pode ser inibida ou se o tempo de fixação de um tecido em formol for excessivo, o DNA pode degradar-se.

Conservação inadequada das amostras. Se submeter as amostras a condições que podem resultar na degradação do DNA, os resultados podem ser incertos.

ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS 1. Parâmetros analíticos:

Sensibilidade analítica. A sensibilidade analítica foi determinada por amplificação específica de diferentes genótipos de HPV clonados em plasmídeos recombinantes. (Columa 102 cópias e 10 cópias). A sensibilidade dos tipos (columa 50 cópias) também foram determinados de amostras do WHO HPV LabNet Proficiency Study of HPV DNA Typing de 2013.

HPV GENOTYPE 10

2 cópias 50 cópias

*(2013 WHO HPV

10 cópias

6 100% 100%

11 100% 100% 80%

16 100% 100% 80%

18 100% 100% 80%

26 100%

31 100% 100%

33 100% 100% 80%

35 100% 100% 60%

39 100% 100% 80%

45 100% 100% 80%

51 100% 100% 80%

52 100% 100%

53 100%

56 100% 100% 80%

58 100% 100% 60%

59 100% 100% 80%

66 100% 100%

68a 100% 100%

68b 100% 100% 80%

82 100%

N: 110

* Dados expressos em equivalentes genómicos. Tabela 1. Sensibilidade analítica do dispositivo CLART® HPV 4.

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Devido ao significado clínico dos tipos 16 e 18 de HPV, incluímos os dados de sensibilidade destes tipos do WHO HPV LabNet Proficiency Study of HPV DNA Typing de 2013 de forma a comparar a detecção de DNA HPV e metodologias de tipificação para a avaliação de vacinas de HPV e na implementação efetiva e monitorização de programas de vacinação de HPV. Desde que sejam detetados pelo menos 50 unidades internacionais (equivalentes genómicos) de HPV tipo 16 e HPV

tipo 18, este conjunto de dados é considerado proficiente, facto esse ocorrido com o CLART HPV4. 2. Parâmetros de utilidade diagnóstica. Para determinar diversos parâmetros de diagnóstico do dispositivo CLART® Human Papillomavirus 4, foram feitos estudos comparativos com a versão anterior do dispositivo. Esta comparação foi efetuada em colaboração com dois hospitais espanhóis e um português.

Serviço de Microbiologia do Hospital Universitário Germans Trías i Pujol de Badalona.

Unidade de Virologia do Hospital Virgen de la Arrixaca, Múrcia.

Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário de San Carlos.

Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla. Foram analisadas 419 amostras, incluindo 44 swabs, 101 tecidos embebidos em parafina e 232 ThinPrep® liquid-based cytology. O quadro seguinte apresenta os dados de sensibilidade e especificidade diagnósticas para os tipos de HPV detetados no CLART® HPV 4:

Tipo HPV

Sensibilidade Especificidade Tipo HPV Sensibilidade Especificidade Type 6 100,0 100,0 Type 56 100,0 99,7

Type 11 83,3 100,0 Type 58 93,3 100,0

Type 16 100,0 100,0 Type 59 95,0 99,7

Type 18 100,0 100,0 Type 61 100,0 100,0

Type 31 93,8 100,0 Type 62 87,0 100,0

Type 33 100,0 100,0 Type 66 100,0 99,8

Type 35 100,0 100,0 Type 68 100,0 99,8

Type 39 100,0 100,0 Type 70 81,8 100,0

Type 40 100,0 100,0 Type 71 100,0 100,0

Type 42 100,0 100,0 Type 72 100,0 100,0

Type 43 100,0 100,0 Type 73 100,0 100,0

Type 44 100,0 99,5 Type 81 100,0 100,0

Type 45 100,0 100,0 Type 82 90,0 100,0

Type 51 100,0 100,0 Type 83 100,0 100,0

Type 52 92,6 100,0 Type 84 100,0 100,0

Type 53 97,1 100,0 Type 89 100,0 99,5

Type 54 100,0 100,0

Tabela 2. Parâmetros de diagnóstico do dispositivo CLART® HPV 4.

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11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bosch, F.X., Lorincz, A., Muñoz, N., Maijer, C.J.L.M. and Shah K.V.: “The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer”. J. Clin. Pathl. 55, 244-265 (2002). Calleja-Macías, I.E., Villa, L.L., Prado, J.C. et al. "Wordwide genomic diversity of the high-risk human papillomavirus types 31, 35, 52, 58, for close relatives of human papilloma virus type 16”. Journal of Virology. 79, 13630-13640 (2005). Chranioti A., Spathis A., Aga E., Merustoudis C. Pappas A., Panayiotides I. and Karakitsos P. “Comparison of two commercially available methods for HPV Genotyping: CLART HPV2 and Linear Arrays HPV Genotyping Test”. Analytical and Quantitative Cytopathology and Histopathology. Volumen 34, number 5, October 2012. De Villiers, E.M.: “Heterogeneity of the human papillomavirus group”. J. Virol. 63, 4898-4903 (1989). Dunne, E.F., Unger E.R., Sternberg m., McQuillan G., Swan D.C., Patel S.S., Markowitz L.E.: “Prevalence of VPH infection among females in the United States”. JAMA, February 28, 2007-Vol 297, nº 8. Flavio, L.: “VPH genotyping: are different hybridization methods comparable in detecting high risk infections?” 23rd International papillomavirus conference and clinical workshop. September 2006. Praga. Garbugliaa A. R., Piselli P., Lapaa D., Sias C., Del Nonnoc F., Baiocchinic A., Cimagliab C., Agrestab A. and Capobianchia M. R. “Frequency and multiplicity of human papillomavirus infection in HIV-1 positive women in Italy”. Journal of Clinical Virology. JCV-2429 (2012). Goldman B., Rebolj M., Rygaard C., Preisler S., Ejegod DM, Lyngea E., and Jesper Bonde. “Patterns of cervical coinfection with multiple human papilloma virus types in a screening population in Denmark”. Vaccine 2013 Mar 15;31 (12): 1604-9. Kjær S.K., Frederiksen K., Munk C., Iftner T. Long-term Absolute Risk of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 3 or Worse Following Human Papillomavirus Infection: Role of Persistence. J Natl Cancer Inst. 2010 Sep 14. Muñoz, N., Bosch, X., Sanjosé, S., Herrero, R., Castellsagué, X., Shah, K.V., Snijders, P.J.F. y Meijer, C.J.L.M. “Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer”. N. Engl. J. Med. 348, 518-527 (2003). Pista, A., Freire de Oliveira C., Lopes C., and Cunha M. J., on behalf of the CLEOPATRE Portugal Study Group. “Human Papillomavirus Type Distribution in Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 2/3 and Cervical Cancer in Portugal A CLEOPATRE II Study”. International Journal of Gynecological Cancer & Volume 23, Number 3, March 2013 Ronco G., P. Giorgi-Rossi, F. Carozzi, M. Confortini, P. Palma, A. Mistro, B. Ghiringhello, S. Girlando, A. Gillio-Tos, L. Marco, C. Naldoni, P. Pierotti, R. Rizzolo, P. Schincaglia, M.Zorzi, M. Zappa,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20841605

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20841605

27

N.Segnan, J. Cuzick. “Efficacy of human papillomavirus testing for the detection of invasive cervical cancers and cervical intraepithelial neoplasia: a randomised controlled trial”. Lancet Oncol. 2010 Mar;1 1(3):249-57. Suarez Moya, A., Esquivias Gómez, J.I., Vidart Aragón, J.A. Picazo de la Garza, J.J.: “Detección y tipificación mediante biología molecular del virus del Papilloma humano en muestras genitales”. Rev. Esp. Quimioterap., Junio 2006; Vol. 19 (Nº2); 161-166. Verdasca, N.; A. Coelho; F. Ribeiro; A. Pista.: “Detection of VPH DNA from cervical samples in a group of portuguese women: comparison of two VPH genotyping assays”. 24th internacional papillomavirus conference and clinical workshop, Nov 3-9, 2007, Beijing, P.R.China." Verdasca, N., A. Coelho, F. Ribeira, A. Pista.: “Detection of VPH DNA from cervical samples in a group of portuguese women: comparison of two VPH genotyping assays”. 23rd International papillomavirus conference and clinical workshop. September 2006. Praga.

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12. TABELA Riscos oncogénicos dos tipos de HPV detetáveis com o dispositivo CLART® HPV4.

TIPO RISCO ONCOGÉNICO *

TIPO RISCO ONCOGÉNICO *

PVH 6 Baixo Risco PVH 56 Alto Risco

PVH 11 Baixo Risco PVH 58 Alto Risco

PVH 16 Alto Risco PVH 59 Alto Risco

PVH 18 Alto Risco PVH 61 Baixo Risco

PVH 26 Provavelmente Alto Risco PVH 62 Baixo Risco





PVH 40 Baixo Risco PVH 72 Baixo Risco

PVH 42 Baixo Risco PVH 73 Provavelmente Alto Risco

PVH 43 Baixo Risco PVH 81 Baixo Risco

PVH 44 Baixo Risco PVH 82 Provavelmente Alto Risco




PVH 53 Provavelmente Alto Risco PVH 89 Baixo Risco

PVH 54 Baixo Risco

* Accordo com: Bouvar d V, Baan R, Straif K, Grosse Y, Secretan B, El Ghissassi F et al. A review of human carcinogens -Part B: biological agents. Lancet Oncol 2009:10( 4):321 322

clart papilomavirus humano 4 genotipagem de...

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