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Citologia aspirativa por agulha fina (CAAF), emtestículo de onça pintada (Panthera onca), utilizadacomo ferramenta no diagnóstico de infertilidade

Testicular fine needle aspiration cytology as adiagnostic tool in jaguar (Panthera onca) infertility

Regina Celia Rodrigues da PAZ¹;Denise Pereira LEME²;Roberta Mara ZÜGE¹;Cecília PESSUTI³;Eliana Ferraz SANTOS4;Renato Campanarut BARNABE¹

Resumo

Técnicas de biópsia, caracterizadas pela remoção de segmentosde órgãos e tecidos para análise histopatológica, não são indicadasno auxílio diagnóstico de alterações testiculares para animaisameaçados de extinção, por não serem totalmente isentas deriscos. Neste sentido, é de grande interesse que se desenvolvamtécnicas de biópsia testicular cada vez mais seguras e com omínimo de conseqüências negativas. Com este intuito três onçaspintadas (Panthera onca) foram submetidas a exames de CitologiaAspirativa por Agulha Fina (CAAF). Amostras foram obtidasatravés da punção aspirativa dos testículos, esfregaços foramconfeccionados, corados com Panótico e analisados sobMicroscopia Óptica. Simultaneamente foram realizadas coletasde sêmen para avaliação do volume, pH, concentração,motilidade, vigor e morfologia espermáticas. Quanto à avaliaçãoespermática, os animais apresentaram valores semelhantes aosencontrados na literatura quanto ao volume, pH, motilidade,vigor e morfologia espermáticas. Quanto a concentraçãoespermática os animais apresentaram valores abaixo dosencontrados na literatura. Nos exames de CAAF, todas asgerações de células germinativas foram identificadas, indicandoespermatogênese normal em todos os animais, com exceçãodas espermátides finais duplas que ainda não foram relatadascomo achados em punções testiculares de outras espécies, oque vem confirmar a elevada porcentagem de célulasteratológicas encontradas nesses animais. Desta forma, podemosconcluir que a CAAF testicular é um método diagnóstico auxiliarimportante na detecção de alterações testiculares em casos desub ou infertilidade, podendo ser utilizados na rotina deinvestigação do trato reprodutivo masculino, quando o examehistopatológico, por ser um método altamente invasivo, édesaconselhável.

1-Departamento de Reprodução Animal da Faculdade deMedicina Veterinária e Zootecnia da USP, São Paulo - SP2-Departamento de Reprodução Animal e RadiologiaVeterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecniada UNESP, Botucatu - SP3-Parque Zoológico Municipal �Quinzinho de Barros�, Sorocaba - SP4-Bosque dos Jequitibás, Campinas - SP

Palavras-chaveAnimais selvagens.Espermatogênese.Sêmen animal.

Correspondência para:REGINA CELIA RODRIGUES DA PAZDepartamento de Reprodução AnimalFaculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USPAvenida Prof. Orlando Marques de Paiva, 87Cidade Universitária Armando Salles de Oliveira05508-270 - São Paulo - SPe-mail:[email protected]

Recebido para publicação: 03/07/2002Aprovado para publicação: 27/09/2002

Brazilian Journ al of Veterinary Research and Animal Science (2003) 40:100-107ISSN printed: 1413-9596ISSN on-line: 1678-4456

Braz J vet Res anim Sci 40(2) 2003

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Introdução

A onça pintada (Panthera onca),o maior felino das Américas1, éconsiderada como espécie ameaçada deextinção pelo Instituto Brasileiro doMeio Ambiente e dos RecursosNaturais Renováveis (IBAMA). Aperda e constante fragmentação de seuhabitat são um dos principais fatorescausadores de diminuição no númerode animais em vida livre. Em cativeiro,o reduzido número de animais, o altograu de parentesco e o baixo sucessoreprodutivo, tem sido uma barreira parasobrevivência da espécie.Considerando a importância dapropagação de animais em cativeiropara preservação da espécie, areprodução de indivíduos comprocedência torna-se um componenteindispensável para conservação.

A biópsia testicular, por não serum procedimento totalmente isento deriscos, podendo trazer conseqüênciasindesejáveis à vida reprodutiva doanimal, é de uso desaconselhável emanimais em vias de extinção,principalmente quando linhas genéticasnão podem ser perdidas.

A Citologia Aspirativa porAgulha Fina (CAAF), por ser ummétodo simples, rápido e seguro naobtenção de amostras de órgãos etecidos2, surge como métodoalternativo na determinação daatividade espermatogênica3. Estatécnica pode ser utilizada como partedo exame andrológico, indicada noscasos de aumento de volume testicular,oligozoospermia ou azoospermia4,5,6,ou na seleção de animais ameaçadosde extinção sub ou inférteis, porémimportantes geneticamente para aespécie, para participação emprogramas de reprodução assistida,utilizando-se biotecnologias dareprodução, como a fertilização in vitro(FIV) ou injeção intra-citoplasmática

Material e Método

Foram utilizados três machos deonças pintadas (Panthera onca), comidade entre 10 e 12 anos, mantidas noBosque dos Jequitibás, em Campinas/SP (n=2) e no Parque ZoológicoMunicipal �Quinzinho de Barros�, emSorocaba/SP (n=1).

Os animais foram anestesiadospor meio da utilização de dardos, comauxílio de zarabatana, utilizando-se aassociação Tiletamina Zolazepan(ZOLETIL 50 ®-Virbac), naproporção de 10mg/kg7.

Citologia aspirativa por agulhafina foi realizada através da punçãotesticular, com agulha (30x8mm) eseringa (10ml) descartáveis, após anti-sepsia local com álcool 70%. Com omaterial obtido, foram confeccionadosesfregaços em lâminas histológicas,secos ao ar ambiente e coradas comPanótico. As células daespermatogênese e de Sertoli foramidentificadas e quantificadas pormicroscopia óptica, sob aumento de1200x. Foram contadas 200 célulasconsecutivas da série espermatogênica,separadas em porcentagens deespermatogônias, espermatócitos

(ICSI) visando sua reprodução econseqüentemente a conservação daespécie.

Com o objetivo de verificar aeficiência da CAAF testicular em onçaspintadas (Panthera onca), na tentativa deavaliar a atividade espermatogênica eidentificar células germinativas comalterações morfológicas quejustifiquem o elevado índice deanormalidades espermáticas e baixaconcentração espermática, encontradasnesta espécie em cativeiro, estametodologia foi aplicada, já quesomente o exame histopatológicopoderia revelar com exatidão a causaefetiva das alterações observadas.

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primários, espermatócitos secundários,espermátides iniciais, espermátidesfinais e espermatozóides. As células deLeydig não foram identificadas. Ascélulas de Sertoli, interpostas às célulasespermáticas, foram contadasseparadamente e verificou-se suaporcentagem em relação ao total decélulas espermatogênicas3.

A consistência dos testículos foiaferida por palpação e classificada comorígido, normal e flácido. BiometriaTesticular foi realizada externamente,com auxílio de paquímetro. Foramaferidos comprimento e largura dostestículos direito e esquerdo. Osresultados obtidos foram analisadossegundo a fórmula: V = C x L2 x 0,524,onde V é o volume a ser calculado; C éo comprimento do testículo; L é alargura do testículo elevada à segundapotência8. Obtendo-se, dessa forma, ovolume do testículo medido. Paraaferição do volume total foramsomados os volumes de cada testículo.

A coleta de sêmen foi realizadapor eletroejaculação utilizando-seaparelho Torjet 65C (Eletrovet) eeletrodo retal bipolar, com três tiraslongitudinais em cobre. O diâmetro doeletrodo utilizado foi de 2,3 cm comcomprimento de 29 cm. A série de

eletrochoques seguiu o protocolosugerido por Howard9.

Para obtenção do pH, umagota do material obtido foi colocadasobre tira reagente (Sigma). Paraavaliação da motilidade, uma alíquotado ejaculado foi depositada sobrelâmina de vidro para microscopia,coberta com lamínula, previamenteaquecidas a 37°C em mesa aquecedora(Eletrovet) e levada ao microscópioótico binocular (Olimpus BHK). Sobreplaca aquecida (Eletrovet) à 37°C foiavaliada quanto à motilidadeespermática em escala de 0 a 100 porcento e vigor na escala de 0 a 59. Amorfologia e concentração dosespermatozóides foi avaliada por meioda fixação do ejaculado (1:3) em formolsalino 10,00%. A concentração foirealizada utilizando-se câmarahematimétrica (câmara de Neubauer),sob microscopia óptica em aumento de400x10. Para determinação damorfologia espermática foi utilizadapreparação em câmara úmida. Foramcontadas 100 células por lâmina emmicroscópio de contraste de fase(ZEISS), em aumento 1200 vezes, e asanormalidades, classificadas emdefeitos maiores e defeitos menores,apresentadas em porcentagem11.

Figura 1Tipos celulares encontrados em esfregaços de CAAF de testículos de onça pintada (Panthera onca): CI = EspermatócitoI; Ti = Espermátide inicial; Tf = Espermátide final; S = Célula de Sertoli; Seta = Espermatozóide; Tracejado = Hemácias

Paz, R. C. R. et al.


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Figura 2Tipos celulares encontrados em esfregaços de CAAF de testículos de onça pintada (Panthera onca): Sg =Espermatogônia; CI = Espermatócito I; Ti = Espermátide inicial; Tf = Espermátide final; S = Célula de Sertoli; Seta= Espermatozóide

Resultados

Nos exames de CAAF, todas asgerações de células germinativas foramobservadas. Células espermatogênicas ecélulas de Sertoli foram identificadas(Figuras 1 e 2) e avaliadasquantitativamente (Tabela 1) indicandoespermatogênese normal em todos osanimais, com exceção das espermátidesfinais duplas que ainda não foramrelatadas como achados em punçõestesticulares de outras espécies. Das seisamostras dos três pares de testículospuncionados apenas uma foi descartadapela grande contaminação com sangue,impedindo sua avaliação.

Na avaliação clínica dos testículosestes foram classificados como normais,sendo os dados de volume testicularapresentados na Tabela 3. Quanto àavaliação espermática foram aferidosvolume, pH, motilidade, vigor,anormalidades espermáticas econcentração espermática em todos osanimais, estando os dados apresentadosna Tabela 2.

Discussão

As características das célulasespermatogênicas e células de Sertoliobservadas nos exames de CAAFtesticular destes animais foramsemelhantes às descritas em outrasespécies, o que faci l i tou aidentificação, e conseqüentemente aavaliação quantitativa dos tiposcelulares descritos3,6,12.

Contaminação das amostraspor sangue foi citada por Rajwanshi,Radhika e Vaidyanathan13, onde 6,00%de seus pacientes (humanos)apresentaram contaminação total porsangue, impossibi l i tando ainterpretação do exame.

Em relação à quebra dabarreira hemato-testicular, Leme14

não evidenciou nenhuma dasalterações seminais compatíveis comdegeneração testicular de origemauto-imune, em equinos submetidosa uma média de oito punçõestesticulares até 100 dias da primeira



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Tabela 2Análise do sêmen de onças pintadas (Panthera onca) mantidas em cativeiro, São Paulo, 2000

Animais Volume Motilidade Vigor pH Concentração Defeitos DefeitosMaiores Menores

1 6,0 ml 70 % 4 8,0 1,2 x 106/ml 29 % 12 %2 5,1 ml 50 % 3 8,5 1,0 x 106/ml 27 % 08 %3 6,0 ml 70 % 3 8,5 0,2 x 106/ml 37 % 41 %

M/DP 5,7±0,5 63,3±11,5 3,3±0,6 8,3±0,3 0,8±0,53 31±5,29 20,3±18

Tabela 3Biometria testicular e Palpação testicular e do epididímo de onças pintadas (Panthera onca), mantidas em cativeiro,São Paulo, 2000

Animais Biometria testicular Consistência

1 15,0 cm3 Normal2 16,2 cm3 Normal3 23,3 cm3 Normal

M/DP 18,17±4,48 -

Tipos celulares 1 2 3 M/DP

Espermatogônia (Sg) 4,0 3,2 6,0 4,40 ± 1,44Espermatócitos I (CI) 8,0 4,2 7,5 6,57 ± 2,06Espermatócitos II (CII) 1,0 �- 0,5 0,75 ± 0,35Espermátides iniciais (Ti) 11,0 11,5 20,5 14,33 ± 5,35Espermátides finais (Tf) 28,0 37,0 24,0 29,66 ± 6,66Espermatozóides (Seta) 43,0 43,5 31,75 39,42 ± 6,64Células de Sertoli (S) 26,5 13,2 9,75 16,48 ± 8,84* Teratológicas 0,5 0,5 14,25 5,08 ± 7,94

*Espermátides finais duplas.

Tabela 1Tipos celulares (%) encontrados em esfregaços de CAAF de testículos de onças pintadas (Panthera onca), São Paulo, 2000

punção. Foresta e Varotto5, até trêsmeses após a CAAF testicular emhumanos, não detectaram odesenvolvimento de anticorposantiespermatozóides.

Na aval iação cl ínica dostestículos a consistência foi normalpara os três animais, porém comrelação à biometria testicular, estesapresentaram volume médio

testicular (18,17±4,48) inferior aosdados encontrados por Morato et al.7.

A literatura apresenta poucostrabalhos avaliando sêmen de onçapintada (Panthera onca)7,9,15,16, noentanto, foi possível verificar, que aqual idade do sêmen de onçasmantidas em Zoológicos no Brasil foiinferior a encontrada por Howard9 emonças mantidas em Zoológicos



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americanos.A avaliação espermática dos

animal experimentais apresentouvalores semelhantes aos obtidos deoutros animais em cativeiro no Brasilquanto ao volume, pH, motilidade,vigor e anormalidades espermáticas,porém estes animais apresentaramconcentração espermáticainferior7,15,16.

Todos os animaisapresentaram elevado índice dedefeitos maiores (31±5,29), sendoque o animal 3 apresentou índice dedefeitos menores (41,00%) elevadoem relação aos demais. A presençade elevada porcentagem de defeitosmenores neste animal pode estarrelacionada a má manipulação doejaculado, podendo também estarrelacionada ao aumento detemperatura do epidídimo17. Comrelação aos defeitos maiores, suasprincipais causas envolvem fatoresnutricionais, genéticos e ambientais,sendo originados durante aespermatogênese17.

Alterações e redução naespermatogênese foram associadas adeficiência de vitamina A por váriosautores18,19,20, sendo o restabelecimentode espermatogênese normal conseguidoapós fornecimento adequado devitamina A. A presença de alteraçõesdegenerativas nos testículos podem estarrelacionadas a deficiência de vitaminaE21. Esta deficiência, por sua vez, podedeterminar danos irreversíveis aostestículos, sendo que mesmo após orestabelecimento de fornecimentoadequado de vitamina E não haveriamelhora na morfologia espermática.

Considerando-se o fator

genético, a baixa qual idadeespermática em felinos silvestres temsido associada à baixa variabilidadegenética22. Elevado g rau deconsangüinidade e concomitanteperda de variabil idade genéticadeterminam uma maior ocorrência deesper matozóides anormais23. Arealização de análise de variabilidadegenética e/ou o estudo depaternidade podem contribuirsubstancialmente para a elucidaçãoda causa da baixa qual idadeesper mática, já que os animaisestudados são de origemdesconhecida.

Fatores ambientais tambémpodem promover alterações naqualidade espermática. O tipo derecinto, o número de animais por recintoe a interação tratador-animal sãodeterminantes para o sucessoreprodutivo de felinos em cativeiro24.Segundo o padrão determinado peloplano de manejo de pequenos felinos25,o qual atende às necessidades básicaspara felinos, os recintos nos quais osanimais são mantidos são inadequadosquanto à estrutura e ambientação.Segundo Mellen24, o sucessoreprodutivo dos animais é maior quandoos animais são mantidos aos pares e nãoem grupos, o que se justifica pelo fatode se tratar de animais de hábito solitárioe territorial, que formam casais apenasnos períodos de acasalamento.

O elevado índice deespermátides finais duplas (5,08 ±7,94) encontrado nos esfregaços deCAAF vem confirmar a presença deespermatozóides teratológicos,principalmente a elevada proporção deespermatozóides com 2 cabeças,encontrados no sêmen destes animais.



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Conclusões

Nas condições de realização desteexperimento, e dentro das finalidades aque foi proposto, podemos concluir quea Citologia Aspirativa por Agulha Fina(CAAF) mostrou-se uma técnica simplese eficiente na avaliação da atividadeespermatogênica. Além disso, foi umdeterminante qualitativo e quantitativo

nos diferentes tipos celulares.Caracterizou-se como atividadeespermatogênica normal nos animaisestudados, porém não totalmente livrede contaminação hemática. Aparece,ainda, como um importante métodoauxíliar no diagnóstico de casos de sub/infertilidade, no qual a biópsia testicularseria de uso desaconselhável por se tratarde uma espécie em extinção.

Summary

Several methods of testicular punch biopsy were proposed forobtaining material for histologic or cytologic evaluation, butdid not received enough clinical acceptance because it wasconsidered to be too traumatizing. The fine Needle Aspiration(FNA) is considered a useful, simple and fast method to obtainsamples from tissues. Regarding the importance of FNA inwild animals, this technique was tried in captive adult jaguar(Panthera onca) aiming the evaluation and possible causes ofinfertility. Using a needle and disposable syringe, the testis wereaspirated. The whole aspirated was smeared onto a microscopeslide and stained with Diff-quick method. Semen samples werecollected by electroejaculation and analyzed for pH, totalvolume, motility, status, total spermatozoa count andmorphology. Evaluation of sperm volume, pH, motility vigorand morphology were normal. However, was found belowconcentration. Cytologic quantification revealed germinativecells in all testicles. Among serial types of morphological normalspermatogenesis cells, there were found theratological formsof double final spermatids. These anomalous forms of finalspermatids have not been noticed yet in FNA papers. So, weconcluded that FNA together with other techniques, providesa useful tool in male infertility diagnostics, mainly when relatedto endangered species.

Key-wordsWild animal.Spermatogenesis.Semen.

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