chung et al., 2010. bmc plant biology, 10_103-128
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Loci de resistência que afetam distintos estágios da patogênese do fungo: uso de linhas de introgressão para mapeamento de QTL e
caracterização do patossistemamilho – Setosphaeria turcica
Loci de resistência que afetam distintos estágios da patogênese do fungo: uso de linhas de introgressão para mapeamento de QTL e
caracterização do patossistemamilho – Setosphaeria turcica
Chung et al., 2010. BMC Plant Biology, 10:103-128Chung et al., 2010. BMC Plant Biology, 10:103-128IntroduçãoIntrodução
• Patogênese é uma série de eventos que ocorre numainteração patógeno-hospedeiro;
• A variação genética no hospedeiro e/ou patógenopode ter efeitos quantitativos ou qualitativos sobre aextensão da doença;
• Resistência quantitativa tenha um efeitorelativamente pequeno sobre a patogênese, este tipode resistência é de interesse agrícola, porque é maisdurável;
• Um grande número de QTL para resistência a doençaforam mapeadas em plantas, mas pouco se sabesobre as bases genéticas subjacentes ou mecanismosde defesas envolvidos.
IntroduçãoIntrodução
• Mancha foliar foi utilizada como sistema modelo paraidentificar e caracterizar QTL de doença em nívelmacro e microscópico.
• Setosphaeria turcica (Exserohilum turcicum anamorfo)
• Uma das doenças foliares mais prevalentes namaioria das regiões de cultivo de milho do mundo.
• Formas qualitativas e quantitativas de resistênciacontra S. turcica estão disponíveis em germoplasma,e têm sido amplamente utilizados, isolados ou emassociação, nos programas de melhoramento deresistência.
IntroduçãoIntrodução
• Análise de QTLs utilizando linhagens purasrecombinantes (RILs) proporciona maior poderestatístico na detecção de QTL.
• Linhas de introgressão podem ser eficientemente utilizadaspara produzir linhas quase-isogênicas (NILs), que permitemuma análise cuidadosa dos efeitos fenotípicos associadoscom os segmentos introgredidos.
• No geral, a resistência em plantas adultas ou folhasmais velhas é maior do que em plantas jovens;
• A expressão e a eficácia de muitos genes/QTL temsido observados sendo regulados por condiçõesambientais.
• Saber se o QTL doença confere resistência específicaou de amplo espectro.
IntroduçãoIntrodução
• Utilização de linhas de introgressão e derivados deNILs para mapeamento de QTLs e caracterizaçãomacro e microscópica do patossistema Setosphaeriaturcica-milho.
• Linhas de introgressão disponíveis TBBC3;– Genótipo doador Tx303;– Genótipo parental recorrente B73;
Material e MétodosMaterial e Métodos
• Material vegetal:
– Conjunto de 82 linhas de introgressão (Univ. CN);
– Informação genotípica foi publicamente disponibilizada para cada linha, consistindo de 14 RFLPs e 116 SSR no genoma.
• Avaliação da mancha foliar
– Cultivo do fungo – meio LCA e em grãos de sorgo;
– Plantas juvenis (5-6 folhas) e plantas adultas (2 semanas antes do espigamento)
– Inóculo líquido – CV
– Inóculo sólido – Campo
Material e MétodosMaterial e Métodos• Caracterização fenotípica da resistência à
mancha foliar:
– Análise microscópica
• Eficiência de infecção;
• Incidência de multiplos apressórios
• Eficiência na invasão vascular
• Diâmetro reforçado de área fluorescente
– Análise macroscópica
• PI
• EL
• AFD primária
• AFD
• SD
• CPD – Curva de progresso da doença
– Quantificação da biomassa fúngica na planta porqPCR.
Material e MétodosMaterial e Métodos• Avaliação para resistência múltipla a doenças:
– Murcha de Stewart – Pantoea stewartii;
– Antracnose – Colletotrichium graminicola;
– Carvão – Ustilago maydis;
– Ferrugem – Puccinia sorghi.
– Análise microscópica
• Extração de DNA e genotipagem (SSR – DNA Analyzer);
• Desenho experimental:
– Aurora (NI)
– Clayton (CN)
• 2 repetições
• 14 blocos por repetição
• 6 linhas experimentais com linha controle B73.
Linhas de introgressãoda população BC3
Subconjunto de linhas de introgressão
B73 x linhas de introgressão selecionadas
Populações BC4F2
Conjuntos derivados de NILs
NILs selecionados
Figura 1 - Estratégias para o mapeamento e caracterização de QTLs usando linhas de introgressão.
(A) Avaliação fenotípica do conjunto completo de 82 linhasde introgressão (PI, AFL e SD).
(C) Avaliação fenotípica de 15 linhas de introgressão
selecionadas quanto a resistência/suscetibilidade àmancha foliar comparada a B73. Juvenis e adultas (PI,AFL, EL).
(D) Desenvolvimento de populações segregantes BC4F2
(E) Cada planta foi testada com marcadores-alvo para asregiões introgredidas. Foram determinados QTLs
candidatos à mancha foliar(F) Desenvolvimento de NILs carregando diferentesintrogressões de Tx303 provenientes de populações F2.
(G) Validação de QTL nas NILs.
(H) Seleção de NILs carregando QTL para caracterizaçãodetalhada do mesmo.(I) NILs avaliados com vários componentes da doençaalvo em suas diferentes fases de desenvolvimento.
(B) Identificação de linhas que diferiam de B73 ou queapresentavam fenótipos extremos, além de QTLsputativos.
(J) Caracterização preliminar dos potenciais efeitos doQTL em múltiplas doenças.
Identificação de outliers e QTLs putativos à
mancha foliar na população TBBC3
• 82 linhas de introgressão
– A população TBBC3 foi geralmente mais suscetível que B73 tanto em NI quanto na CN;
– Em Aurora (NI)
• 3 linhas foram consideradas mais resistentes;
• 20 linhas foram consideradas mais suscetíveis que B73 – AFL primária;
• 39 foram mais suscetíveis que B73 com base na curva
de progresso da doença.
– Em Clayton (CN)
• 8 linhas foram consideradas mais resistentes;
• 13 foram mais suscetíveis que B73 com base na curva de progresso da doença.
Avaliação fenotípica no subconjunto de 15 linhas TBBC3
Mais resistentes que B73 (parental recorrente)Mais suscetíveis que B73 (parental recorrente)
Co
nsis
ten
tem
en
te
mais
resis
ten
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on
sis
ten
tem
en
tem
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su
scetí
vel
Validação de qNLB1.02B73 e qNBL1.06Tx303
em conjuntos selecionados de NIL
Figura 2 – Efeitos do qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 no campo. (A) Diferentes níveis
de resistência em B73, Tx303, TBBC3-38-05F (NIL com qNBL1.06) e TBBC3-42-10E-02 (com qNBL1.02). Fotos tiradas em Aurora (NI), 7ª folha - 28 DAI.
Validação de qNLB1.02B73 e qNBL1.06Tx303
em conjuntos selecionados de NIL
Figura 2 – Efeitos do qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 no campo. (B) Substituição do aleloB73 pelo alelo Tx303 (1.02) aumenta e muito a suscetibilidade à mancha foliar. Fotostiradas em Aurora (NI), 68 DAI.
Figura 3 – Micrografias de luz da infecção e recente colonização de S. turcica em folhasde milho. Amostras da casa de vegetação coradas com azul de tripano.
Germinação do conídio e
formação do apressório.
Tubo de penetração do
apressório perfurando a cutícula e parede celular
Linhagem CML52 (resistente). Osconídios continuam a produzir novostubos germinativos até esgotar suasreservas.
Diminuição citoplasmática do conídio foi observada após processo de infecção, propagação
das hifas a células adjacentes causando morta da hospedeira.
Figura 4 – Micrografias de fluorescência da patogênese de S. turcica em folhas de milho.Amostras da casa de vegetação tratadas com azul de anilina-KOH.
Conídio
germinando na
superfície da folha.
Hifas infectivas
crescendo em
contato com as
células do mesófilo
Resposta de
defesa induzida
em torno do local da infecção.
Deposição de
calose e acúmulo
de compostos
fenólicos
autofluorescentes.
Hifas infectivas
crescendo em
direção ao feixe vascular
Hifas crescendo
fora do feixe
vascular vizinhos
Hifas se
espalhando com
sucesso pelo
sistema vascular
Movimento das
hifas através do
feixes vasculares
Colonização
necrótica de
hifas na lesão de murcha
Figura 5 – Investigação microscópica dos efeitos de QTL nos componentes da doença.
Efeito do QTL no crescimento micelial de S. turcica na planta
Figura 6 – Quantificação do efeito do QTL no crescimento micelial de S. turcica naplanta usando DNA baseado qPCR
Coleta – 9 DAI
Caracterização preliminar dos efeitos potenciais dos QTLs para múltipla
resistência a doenças - NILs
Caracterização preliminar dos efeitos potenciais dos QTLs para múltipla
resistência a doenças - NILs
• Diferenças significativas foram observadas entre Tx303 e
B73;
– Em campo Tx303 é resistente à Murcha de Stewart e à antracnose;
– Em campo B73 é mais resistente ao carvão e à ferrugem comum;
• Evidências sugerem que qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73
foram efetivos para resistência à murcha de Stewart;
• NILs que possuiam qNBL1.06Tx303 eram mais resistentes que B73;
• qNBL1.06Tx303 foi ineficiente para resistência à antracnose, carvão e ferrugem;
• qNBL1.02B73 foi ineficiente para resistência à antracnose e carvão, mas potencialmente eficiente para ferrugem.
DiscussãoDiscussão
• 2 QTLs para resistência à mancha foliar, qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 foram identificados com sucesso, validados e caracterizados usando população de linhas de introgressão e derivados de NILs.
• O mecanismo subjacente à resistência conferido por qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303
é improvável que seja o mesmo que o mecanismo subjacente a resistência qualitativa conferidos por genes importantes conhecidos atualmente.
•
DiscussãoDiscussão
• PI é uma característica-alvo conveniente na seleção e melhoramento para resistência a mancha foliar;
• qPCR foi empregado pela 1ª vez para medição da biomassa de S. turcica na planta (apenas nos estágios iniciais da doença);
• Apesar do custo elevado, o qPCR serve como boa ferramenta para quantificar mais cedo o grau de colonização micelial de S. turcica.
DiscussãoDiscussão
H#1 - QTL individual afeta distintos estágios do desenvolvimento da doença
• Avaliações macro e microscópicas revelaram
características distintas de qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 e no desenvolvimento da doença;
• Incorporando um QTL eficaz em retardar a invasão da vasculatura deve assim aumentar consideravelmente a resistência total.
DiscussãoDiscussão
H#2 – Eficácia do QTL para doença é afetada pela maturidade da planta
• Geralmente a expressão consistente da resistência ou
suscetibilidade foi observada nas duas fases (floração e desenvolvimento da doença), não apresentando nenhuma implicação na eficácia destes QTLs em plantas maduras.
DiscussãoDiscussão
H#3 – A eficácia do QTL é afetado
por condições ambientais
• Uma grande limitação para aplicações de QTLs é a falta
de consistência dos efeitos destes em diversos ambientes;
• Os dados obtidos nesse trabalho foram consistentes nos locais avaliados, sugerindo sua aplicabilidade para o melhoramento genético a resistências.
• Os resultados sugerem que a resistência de qNLB1.02B73
foi expresso de forma estável na CV e no campo,
enquanto que qNLB1.06Tx303 conferia um nível de resistência maior no campo do que na CV.
DiscussãoDiscussão
H#4 – QTL para resistência à mancha foliar
inclui genes ou grupos de genes que
envolvem um amplo espectro de resistência
• Em NILs sugere-se que tanto qNLB1.02B73 quanto
qNLB1.06Tx303 abranjam gene(s) que contribuem com efeitos inespecíficos de defesa.
ConclusãoConclusão
• Identificação bem sucedida de 2 QTLs expressos
seguramente, que pode potencialmente ser utilizado para proteger o milho de S. turcica em diferentes ambientes.
• Clonagem baseada em mapas irá revelar mais sobre os genes e os mecanismos subjacentes às características distintas de qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 nas fases da patogênese.
• Mapeamento de grandes populações foram gerados a
partir do NILs e o mapeamento fino de qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 está em andamento.
Obrigada!Obrigada!