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Isabela Gonçalves do Nascimento

Caracterização química de óleos de sementes: Aplicação na

formulação de um batom

Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente ao

Grau de Mestre em Controlo de Qualidade

Especialidade em Produtos de Cosmética e Higiene Corporal

Trabalho realizado sob a orientação de:

Mestre Maria Antónia Nunes

Professora Doutora Maria Beatriz Prior Pinto Oliveira

Setembro, 2018

Caracterização química de óleos de sementes: Aplicação na formulação de um batom | FFUP

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ii

De acordo com a legislação em vigor, não é permitida a reprodução de qualquer parte

desta Dissertação/Tese.


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iii

AGRADECIMENTOS

Gostaria primeiramente de agradecer à Professora Doutora Beatriz Oliveira por ter

me convencido a cursar este mestrado, quando as opções e dúvidas eram ainda maiores

do que são hoje, e por proporcionar a possibilidade deste estudo na sua equipa de

investigação de tanta qualidade e competência.

Um agradecimento à orientação da Mestre Maria Antónia Nunes e da Doutora

Francisca Rodrigues, por toda a disponibilidade, atenção, compreensão, comentários e

correções do meu português brasileiro, e por terem abraçado tão fortemente um tema que

no decorrer do tempo passou por tantas mudanças. Muito obrigada mesmo!

Outro forte agradecimento à Mestre Silvia Bessada pelo auxílio e ensinamentos na

determinação de vitamina E, à Professora Doutora Helena Amaral por me ajudar na

utilização do texturómetro no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de

Farmácia da Universidade do Porto e à Diana Pinto, pelas várias vezes que precisei de sua

ajuda no espectrofotómetro. Sem vocês grande parte deste trabalho não teria acontecido,

porque eu estaria quebrando a cabeça com os softwares e repetindo os ensaios até hoje.

Agradeço também ao Professor Doutor Manuel Alvarez-Orti da Universidade de

Castilla-La Mancha (Albacete, Espanha) por fornecer as amostras de óleo de sementes de

melão.

Ainda, agradeço à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto pela

disponibilidade, estrutura e devastadora população feminina que lá trabalham, investigam

e mudam o mundo.

Por último, agradeço à minha família, sobretudo minha mãe e meu marido, que

sempre me apoiaram em minhas escolhas e que nestes dois últimos anos ouviram

pacientemente tanto minhas reclamações quanto minhas conquistas, mesmo que não

tivessem a menor ideia do que eu estava a dizer.


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iv

RESUMO

Atualmente, a indústria cosmética procura utilizar ingredientes de origem vegetal

nas formulações de produtos, em muito devido ao interesse do consumidor por produtos

naturais e por, tendencialmente, serem mais seguros e inócuos. Esta crescente procura

cria potenciais oportunidades para os fabricantes inovarem e desenvolverem novos

produtos.

Os óleos de grainha de uva (Vitis vinifera L.) e de sementes de melão (Cucumis

melo L.) são subprodutos da indústria agroalimentar que possuem compostos (por

exemplo, ácidos gordos, vitamina E e compostos fenólicos), que podem conferir atividade

emoliente, antioxidante, antienvelhecimento, fotoprotetora e antimicrobiana aos produtos

onde são incorporados. Por outro lado, o óleo de semente de abóbora (Cucurbita pepo

subsp. pepo var. styriaca) é o produto maioritário do cultivo desta variedade. As sementes

de abóbora são submetidas a um processo de torrefação que aumenta a sua estabilidade

oxidativa e a concentração dos diferentes compostos bioativos presentes (fitoesteróis,

carotenoides e compostos fenólicos), em comparação com o óleo de semente não torrada.

O óleo de se semente de abóbora é um óleo edível e muito utilizado no sudeste europeu,

sendo, contudo, pouco utilizado em formulações cosméticas.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma formulação para um batom que

incorporasse na sua constituição um óleo vegetal como ingrediente ativo. O óleo foi

selecionado entre o óleo de grainha de uva (OGU), o óleo de sementes de melão (OSM) e

o óleo de sementes de abóbora (OSA), de acordo com as características químicas

previamente avaliadas e consideradas de importância para o objetivo. Assim, foi

determinada a cor, a estabilidade oxidativa, a composição em ácidos gordos e vitamina E,

o teor de clorofilas e carotenoides, os compostos fenólicos e flavonoides totais e a atividade

antioxidante, avaliada pelo método do poder antioxidante por redução do ião férrico (FRAP)

e inibição do DPPH• dos três óleos vegetais.

Relativamente ao parâmetro da cor, o OGU apresentou uma tonalidade verde,

enquanto no OSM predomina a coloração amarela. O OSA caracterizou-se por apresentar

pouca luminosidade, ser opaco relativamente à intensidade e ter uma tonalidade violeta.

A estabilidade oxidativa foi similar para o OGU e o OSM (2,18 e 2,25 h), enquanto

o OSA apresentou uma média de 8 h. Os ácidos gordos maioritários determinados foram

o ácido linoleico (OGU: 68,7%; OSM: 71,3%; OSA: 51,4%), o ácido oleico (OGU: 18,5%;

OSM: 15%; OSA: 29,7%), o ácido palmítico (OGU: 7,1%; OSM: 8,6%; OSA: 12,2%) e o

ácido esteárico (OGU: 4,9%; OSM: 4,5%; OSA: 5,7%). O vitâmero maioritário do OGU foi


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v

o α-tocoferol (209 mg/kg óleo), enquanto no OSM e no OSA foi o γ-tocoferol (439 e 703

mg/kg óleo, respetivamente). Comparando os três óleos, o OSA apresentou teores

superiores de clorofilas (1,6 mg/kg), carotenoides (13,7 mg/kg), compostos fenólicos totais

(35,5 mg EAG/kg), flavonoides totais (16,1 mg EC/kg) e maior atividade antioxidante

avaliada pelo método FRAP e inibição do DPPH• (879,87 μmol ESF/kg e 67,04 μmol

Trolox/kg, respetivamente).

Tendo em conta os resultados obtidos, o OSA foi selecionado para o

desenvolvimento da fórmula cosmética de batom. O batom foi caracterizado sob o ponto

de vista físico e químico ao tempo 0, bem como após 30 dias de armazenamento a

diferentes condições de temperatura e humidade relativa (HR) (25 °C/65% HR) e 40

°C/75% HR). O batom ao tempo 0 apresentou um teor de compostos fenólicos totais de

173,9 mg EAG/g batom, de flavonoides totais de 277,7 mg EC/g batom, inibição do DPPH•

de 23,3 μmol Trolox/kg batom e FRAP de 4,2 mol ESF/kg batom. As amostras

armazenadas a 20 e 40 °C mostraram diferenças significativas nos parâmetros relativos à

cor, compostos fenólicos totais (342 e 285 mg EAG/g batom, respetivamente), flavonoides

totais (754 e 723 mg EC/g batom, respetivamente), inibição do DPPH• (4,9 e 6,9 μmol

Trolox/kg batom, respetivamente) e FRAP (3,7 e 3,5 mol ESF/kg batom, respetivamente).

Não foram determinadas diferenças significativas (p>0,05) relativamente à dureza, ao

tempo 0 e após armazenamento a 20 °C/65% HR. No entanto foram encontradas

diferenças significativas (p<0,05) no armazenamento a 40 °C/75% HR.

Considerando os resultados obtidos é possível concluir que o desenvolvimento de

novos produtos cosméticos à base de óleos vegetais é viável. A incorporação de

ingredientes como o óleo de abóbora em produtos como batom, é de potencial interesse

para a indústria cosmética, devido à atual tendência dos consumidores para evitarem

aditivos sintéticos nas formulações e preferirem a sua substituição por produtos naturais e

de origem sustentável.

Palavras-chave: Batom; óleo de grainha de uva; óleo de semente de melão; óleo de

semente de abóbora.

ABSTRACT


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vi

Nowadays, the cosmetic industry is searching for vegetable ingredients for products

formulations based on consumer's interest for natural compounds, generally considered

innocuous and safer. This growing demand creates new opportunities to industry to

innovate and develop new products.

Grape seed oil (Vitis vinifera L.) and melon seed oil (Cucumis melo L.) are agro-

industrial by-products rich in compounds (e.g., fatty acids, vitamin E and phenolic

compounds) that confer emollient, antioxidant, anti-aging, photoprotective and antimicrobial

activities to cosmetic formulations. On the other hand, pumpkin seed oil (Cucurbita pepo

subsp. pepo var. styriaca) is the major product obtained in these species cultivation. The

pumpkin seeds are submitted to a roasting process that increases the oxidative stability and

bioactive compounds concentration (phytosterols, carotenoids and polyphenols), when

compared to the non-roasted seed oil. This oil is edible and widely used in Southeastern

European cuisine. Nevertheless, it is not commonly applied in cosmetic products.

The aim of this work was to develop a lipstick formulation with a vegetable oil as

active ingredient. The oil was selected among the three oils studied (grape seed oil (GSO),

melon seed oil (MSO) and pumpkin seed oil (PSO)), accordingly to their chemical features,

previously evaluated, and considered significant to achieve the purposed goal. Therefore,

it was assessed the vegetable oils color parameters, oxidative stability, the fatty acids and

vitamin E profiles, chlorophylls and carotenoids contents, total phenolic and flavonoids

compounds, and the antioxidant activity, evaluated by ferric reducing antioxidant power

(FRAP) and DPPH• inhibition.

Regarding the color parameters, GSO presented a corresponding hue value to the

green color, while OSM is related to yellow. OSA is characterized by low lightness, opaque

chroma and violet hue.

Oxidative stability was similar to GSO and MSO (2.18 and 2.25 h, respectively),

while PSO had an average induction time of 8 h. The major fatty acids were linoleic acid

(GSO: 68.7%; MSO: 71.3%; PSO: 51.4%), oleic acid (GSO: 18.5%; MSO: 15%; PSO:

29.7%), palmitic acid (GSO: 7.1%; MSO: 8.6%; PSO: 12.2%) and stearic acid (GSO: 4.9%;

MSO: 4.5%; PSO: 5.7%). The major GSO’s vitamer was α-tocopherol (209 mg/kg), while in

MSO and PSO was γ-tocopherol (438 and 703 mg/kg, respectively). Among the three oils,

PSO presented the highest levels of chlorophylls (1.6 mg/kg), carotenoids (13.65 mg/kg),

total phenolics (35.5 mg EAG/kg) and flavonoids (16.1 mg EC/kg) as well as antioxidant

activity evaluated by FRAP and DPPH• inhibition assays (879.87 μmol ESF/kg and 67.04

μmol Trolox/kg, respectively).

Considering the results obtained, PSO was selected for the development of the

lipstick formula. The physical and chemical characteristics of the lipstick were evaluated at


____________________________________________________________________________________

vii

time 0 and after 30 days of storage at 25 ºC/65% relative humidity (RH) and 40 º C/75%

RH. At time 0, the lipstick presented a total phenolics and flavonoids contents of

respectively, 173.9 mg GAE/g and 277.7 mg CE/g of lipstick. The antioxidant activity

evaluated by FRAP was 4.2 mol ESF/kg and DPPH• inhibition was 23.33 μmol Trolox/kg of

lipstick. Samples stored at 20 and 40 °C showed significant differences in color parameters,

total phenolic compounds (342 and 285 mg GAE/g of lipstick, respectively), total flavonoids

(754 and 723 mg CE/g lipstick, respectively), DPPH• inhibition (4.9 and 6.9 μmol Trolox/kg

of lipstick, respectively) and FRAP (3.7 and 3.5 mol ESF/kg of lipstick, respectively). There

were no significant differences (p>0.05) regarding hardness at moment 0 and after storage

at 20 °C/65% RH. However, there were observed significant differences (p<0.05) in storage

at 40 °C/75% RH.

Considering the results obtained, it is possible to conclude that new cosmetic

products development based on vegetable oils is feasible. Including ingredients as pumpkin

oil in products as lipstick has potential interest to the cosmetic industry, due to the current

consuming trend to avoid synthetic additives and to replace them by natural and sustainable

ones.

Keywords: Lipstick; grape seed oil; melon seed oil; pumpkin seed oil.

COMUNICAÇÕES


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viii

1. Isabela G. do Nascimento, M. Antónia Nunes, Francisca Rodrigues, Manuel

Alvarez-Orti, José E. Pardo, M. Beatriz P. P. Oliveira. Chemical composition of

grape and melon seed oils: A comparative study of two by-products from agro-

industry, XVII Congress of Food and Nutrition, Maio 2018, Lisboa, Portugal.


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ix

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ........................................................................................ iii

RESUMO .......................................................................................................... iv

ABSTRACT ........................................................................................................ v

COMUNICAÇÕES ........................................................................................... vii

ÍNDICE ............................................................................................................. ix

ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... xii

ÍNDICE DE TABELAS ..................................................................................... xiii

LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................... xiv

1. Introdução ............................................................................................... 1

1.1. Sustentabilidade ....................................................................................... 2

1.2. Óleo de Grainha de Uva ........................................................................... 3

1.3. Óleo de Sementes de Melão .................................................................... 7

1.4. Óleo de Sementes de Abóbora ................................................................. 8

1.5. Efeitos benéficos dos compostos bioativos na pele ................................ 12

1.6. Produtos labiais ...................................................................................... 13

2. Objetivos ................................................................................................15

2.1. Objetivos específicos .............................................................................. 15

3. Materiais e Métodos ...............................................................................16

3.1. Padrões e Reagentes ............................................................................. 16

3.2. Amostras de óleos .................................................................................. 16

3.3. Caracterização dos óleos ....................................................................... 17

3.3.1. Determinação da cor ....................................................................17

3.3.2. Determinação da estabilidade oxidativa .......................................19

3.3.3. Determinação de clorofilas e carotenoides ...................................20

3.3.4. Composição em ácidos gordos por GC-FID .................................21

3.3.5. Determinação do perfil da vitamina E por HPLC ...........................23


____________________________________________________________________________________

x

3.3.6. Determinação do teor de compostos fenólicos totais ....................24

3.3.7. Determinação do teor de flavonoides totais ..................................25

3.3.8. Determinação da atividade antioxidante pelo método FRAP ........25

3.3.9. Determinação de atividade antioxidante por inibição do DPPH•....26

3.4. Desenvolvimento da fórmula do batom ................................................... 27

3.5. Ensaios de estabilidade acelerada ......................................................... 28

3.5.1. Características organoléticas .......................................................28

3.5.2. Preparação da amostra e determinação do teor de compostos fenólicos

totais 28

3.5.3. Determinação do teor de flavonoides totais ..................................28

3.5.4. Determinação da atividade antioxidante pelo método de FRAP ...29

3.5.5. Determinação da atividade antioxidante por inibição do DPPH• ...29

3.5.6. Determinação da dureza ..............................................................29

3.6. Análise estatística ................................................................................... 30

4. Resultados e Discussão .........................................................................31

4.1. Caracterização química dos óleos .......................................................... 31


4.1.2. Determinação da estabilidade oxidativa .......................................32

4.1.3. Determinação da composição em ácidos gordos .........................34

4.1.4. Determinação do perfil da Vitamina E...........................................37

4.1.5. Determinação do teor de clorofilas e carotenoides, compostos

fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante (inibição do DPPH• e FRAP) ........39

4.2. Caracterização química do batom .......................................................... 42

4.3. Ensaios de estabilidade acelerada ......................................................... 43


4.3.2. Determinação dos teores de compostos fenólicos totais, flavonoides

totais e atividade antioxidante pelos métodos de inibição do DPPH• e FRAP .......45

4.3.3. Determinação da dureza ..............................................................47

5. Conclusão ..............................................................................................49


____________________________________________________________________________________

xi

5.1. Perspetivas para o futuro ........................................................................ 49

6. Referências ............................................................................................51


____________________________________________________________________________________

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Fatores de maior impacto no mercado cosmético global. ................... 1

Figura 2. Produção mundial de uvas por tipo de produto. ................................. 4

Figura 3. Fruto e grainha de V. vinifera L. ......................................................... 5

Figura 4. Fruto e sementes de C. melo L. ......................................................... 7

Figura 5. Fruto e sementes de C. pepo var. styriaca. .......................................10

Figura 6. Utilização de batons por mulheres britânicas em 2017. ....................14

Figura 7. Óleo de grainha de uva (OGU). ........................................................16

Figura 8. Óleo de sementes de melão (OSM). .................................................17

Figura 9. Óleo de sementes de abóbora (OSA). ..............................................17

Figura 10. Chroma Meter CR-400. ...................................................................18

Figura 11. Gráfico CIELAB. ..............................................................................19

Figura 12. Equipamento Rancimat. ..................................................................20

Figura 13. Princípio do método Rancimat. .......................................................20

Figura 14. Espectrofotómetro. ..........................................................................21

Figura 15. GC-FID. ..........................................................................................23

Figura 16. HPLC. .............................................................................................23

Figura 17. Reação FRAP. ................................................................................26

Figura 18. Reação DPPH. ................................................................................26

Figura 19. Moldes utilizados para a produção do batom. .................................27

Figura 20. Texturómetro. ..................................................................................30

Figura 21. Tempos de indução de estabilidade oxidativa dos diferentes óleos.33

Figura 22. Proporção de ácidos gordos em % relativa e relação com tempo de

indução. ......................................................................................................................37

Figura 23. Batom desenvolvido com óleo de sementes de abóbora.................43

Figura 24. Batons após estabilidade a 20 °C (A) e estabilidade acelerada a 40 °C

(B). ..............................................................................................................................44

Figura 25. Dureza do batom desenvolvido e comparação com o batom comercial.

....................................................................................................................................47


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xiii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Empresas que utilizam ingredientes derivados da grainha de uva em

formulações cosméticas. .............................................................................................. 5

Tabela 2. Empresas que utilizam ingredientes derivados de sementes de melão em

formulações cosméticas. .............................................................................................. 8

Tabela 3. Empresas que utilizam ingredientes derivados da semente de abóbora

em formulações cosméticas. ........................................................................................ 9

Tabela 4. Curva de calibração dos padrões de vitamina E. ..............................24

Tabela 5. Excipientes e proporção utilizada na formulação desenvolvida ........27

Tabela 6. Características da cor dos óleos em CIELAB (L*a*b*) e CIELCH (L*C*h°).

....................................................................................................................................31

Tabela 7. Composição de ácidos gordos (% relativa). .....................................35

Tabela 8. Teor de Vitamina E nos óleos de grainha de uva, sementes de melão e

abóbora (mg/kg de óleo). ............................................................................................38

Tabela 9. Teores de clorofilas, carotenoides, compostos fenólicos totais (CFT),

flavonoides totais (FT) e atividade antioxidante (DPPH e FRAP). ...............................40

Tabela 10. Parâmetros de cor (L*, a* e b*) do batom obtidos ao tempo 0 e após 30

dias de armazenamento a 20 ºC/65% HR e 40 ºC/75% HR. .......................................44

Tabela 11. Teores de compostos fenólicos totais (CFT) e flavonoides totais (FT) e

atividade antioxidante (determinada pelo método de inibição do DPPH• e pelo método

FRAP) dos batons ao tempo 0 e após 30 dias de armazenamento a 20 °C/65% HR e 40

°C/75% HR. .................................................................................................................45


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xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

AGI Ácidos Gordos Insaturados

AGMI Ácidos Gordos Monoinsaturados

AGPI Ácidos Gordos Polinsaturados

AGS Ácidos Gordos Saturados

CFT Compostos Fenólicos Totais

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo

EAC Equivalentes de Ácido Cafeico

EAG Equivalentes de Ácido Gálhico

EC Equivalentes de Catequina

ERA Espécies Reativas de Azoto

ERO Espécies Reativas de Oxigénio

EQ Equivalentes de Quercetina

FAME Fatty Acids Methyl Esters (Ésteres Metílicos de Ácidos Gordos)

FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power (Poder Antioxidante por Redução

do Ião Férrico)

FT Flavonoides Totais

GC-FID Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (Cromatografia

Gasosa – Detetor por Ionização de Chama)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência)

OGU Óleo de Grainha de Uva

ONU Organização das Nações Unidas

OSA Óleo de Sementes de Abóbora

OSM Óleo de Sementes de Melão

TPTZ 2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazina


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1

1. Introdução

De acordo com o Regulamento (CE) n.º 1223/2009 do Parlamento Europeu e

Conselho da União Europeia, um produto cosmético é definido como “qualquer substância

ou mistura destinada a ser posta em contacto com as partes externas do corpo humano

(epiderme, sistemas piloso e capilar, unhas, lábios e órgãos genitais externos) ou com os

dentes e as mucosas bucais, tendo em vista, exclusiva ou principalmente, limpá-los,

perfumá-los, modificar-lhes o aspeto, protegê-los, mantê-los em bom estado ou corrigir os

odores corporais” [1].

O mercado cosmético divide-se nas categorias de cuidados com a pele e sol,

cuidados com os cabelos, desodorizantes, maquilhagem e fragrâncias [2]. Os produtos de

cuidados com a pele e sol e de cuidados capilares são os mais consumidos e representam

uma percentagem considerável do mercado global de produtos cosméticos [2].

Segundo Rajput [2], os consumidores procuram cada vez mais cosméticos com

ingredientes naturais na formulação. Esta tendência terá um grande impacto no mercado

de cosméticos até 2022 (Figura 1) [2]. Além disso, a mudança no estilo de vida dos

consumidores influencia o mercado cosmético. O consumidor está cada vez mais

preocupado com a origem dos ingredientes cosméticos, procurando informações sobre os

efeitos negativos na saúde dos ingredientes/aditivos sintéticos. Assim, a substituição de

ingrediente sintéticos por compostos naturais é uma opção que pode diminuir os efeitos

adversos dos primeiros como alergias, prurido e até carcinogénese [2, 3].

Figura 1. Fatores de maior impacto no mercado cosmético global.

PIB: Produto Interno Bruto. Adaptado de Rajput [2].


____________________________________________________________________________________

2

A crescente procura por produtos naturais, fitoterápicos e orgânicos cria potenciais

oportunidades para os fabricantes inovarem e desenvolverem novos produtos, indo de

encontro às preferências dos consumidores [2].

1.1. Sustentabilidade

A Organização das Nações Unidas (ONU) define desenvolvimento sustentável,

como a constatação e solução de necessidades essenciais da população mundial atual,

sem limitar os recursos do meio ambiente e comprometer as necessidades das gerações

futuras [4]. A sustentabilidade é a compreensão global de que o ambiente, a economia e a

sociedade devem estar em equilíbrio [5]. A sustentabilidade ambiental assegura a

integridade dos ecossistemas, em que o consumo humano é suficiente para que seja

possível realizar o reabastecimento de recursos; na sustentabilidade económica é

permitido que a população tenha acesso a recursos que suprem as suas necessidades,

com um sistema económico em longo e real crescimento, disponibilizando fontes seguras

de subsistência; na sustentabilidade social os direitos humanos e as necessidades básicas

são alcançáveis por toda a população mundial, permitindo o acesso a recursos suficientes

para manter as comunidades saudáveis e seguras, assegurando direitos pessoais,

culturais e de trabalho, e simultaneamente protegendo contra a discriminação [5].

Apesar da taxa de crescimento anual populacional estar a diminuir em comparação

com os últimos 50 anos (a população mundial duplicou entre 1959 e 1999), a ONU estima

que a população mundial atinja os 10 mil milhões em 2055 [6]. Assim, novas estratégias

de produção e disponibilidade alimentar serão necessárias [7, 8].

A utilização de subprodutos tem sido considerada uma estratégia para reduzir os

resíduos industriais, ao mesmo tempo que acrescenta mais valor à cadeia de produção. O

reaproveitamento de subprodutos é extremamente valorizado, de forma a melhorar e

garantir a gestão sustentável de recursos, através das políticas de crescimento verde,

como o conceito da economia circular ou da política dos “3R” (Reduzir, Reutilizar e

Reciclar) [9, 10]. Na indústria, estes princípios requerem a redução geral das matérias-

primas e da energia utilizada, a reutilização de resíduos industriais e o aumento da

proporção de materiais recicláveis, além da aplicação destes princípios em todo o ciclo de

vida dos produtos e serviços, desde a extração e fabrico até ao transporte, utilização,

reutilização e eliminação [11].

A recuperação e transformação de resíduos da produção industrial em novos

ingredientes ou produtos consumíveis em diferentes indústrias (como a alimentar, a

farmacêutica ou a cosmética) permite diminuir os impactes ambientais, reduzir a


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3

quantidade de matéria-prima que a indústria requer e, simultaneamente, sustentar o

crescimento económico, melhorando a competitividade [9, 12].

A indústria agroalimentar, setor que transforma matérias-primas em alimentos e

bebidas, gera um grande volume de subprodutos, como por exemplo, talos, sementes,

folhas e cascas, entre outras partes não edíveis [13, 14]. Estes subprodutos são

tradicionalmente utilizados para a prática de compostagem, adubação do solo e ração

animal, no entanto, nem sempre essas aplicações são economicamente eficientes [14, 15].

Além disso, deve-se ter em consideração que os subprodutos do processamento de

hortícolas e frutos são de interesse nutricional e biológico, uma vez que são ricos em

proteínas, hidratos de carbono, lípidos e compostos aromáticos e alifáticos específicos,

sendo matérias-primas baratas e abundantes, que podem ser utilizadas novamente na

indústria alimentar, assim como em outros setores como o farmacêutico, o cosmético e o

do biodiesel [14-16].

A indústria cosmética é uma das maiores investidoras em investigação, com

particular foco na sustentabilidade, em particular no uso de substâncias naturais nas

formulações, indo de encontro à necessidade de desenvolvimento sustentável e exigência

deste padrão pelos consumidores [2, 17].

Deste modo, a valorização de subprodutos, que antes poderiam ser classificados

como resíduos da indústria agroalimentar, promove a proteção ambiental, o

desenvolvimento sustentável e a competitividade entre empresas [14].

1.2. Óleo de Grainha de Uva

A uva (Vitis vinifera L.) é um dos frutos com maior distribuição à escala mundial,

tendo atingido em 2014 uma produção global de 74,5 milhões de toneladas [18]. Segundo

dados de 2016, os cinco maiores produtores mundiais foram a China, a Itália, os Estados

Unidos, a França e a Espanha [19]. Cerca de 48% corresponde à produção de uva utilizada

na produção de vinho (Figura 2) [20]. Durante a produção do vinho são geradas elevadas

quantidades de subprodutos, como grainhas, peles, caules e folhas, normalmente tratados

como resíduos [12]. O seu reaproveitamento gera enorme interesse, não só sob o ponto

de vista da sustentabilidade ambiental, mas também como estímulo no campo económico

e social, uma vez que reduz a produção de resíduos e permite a criação de uma nova

matéria-prima [12].


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4

Figura 2. Produção mundial de uvas por tipo de produto. Adaptado de [20].

A relevância da utilização dos subprodutos da produção do vinho reduz a carga

ambiental durante o processo de fabrico e reflete-se nos países com grande área de vinha

e produção de vinho. Portugal apresenta a 9.ª maior área mundial de plantação de vinha,

com 217 mil hectares em 2015, atingindo uma produção de cerca de 800 738 toneladas de

uvas em 2016 [12, 20, 21]. Uma vez que se estima que 3,5% do peso das uvas corresponde

às grainhas [22], a produção de grainha em 2016 terá atingido aproximadamente as 28 000

toneladas (valor calculado).

A partir da grainha de uva (Figura 3) pode-se extrair o óleo, resultando um resíduo

sólido restante do processo de extração: farinha da grainha de uva [23]. Os métodos

tradicionais de extração do óleo consistem na prensagem mecânica e na extração com

solventes [24]. As técnicas convencionais apresentam algumas desvantagens, como o

tempo prolongado de extração, a exigência de solventes de alta pureza (e o custo

associado), a evaporação de grande quantidade de solvente e a decomposição de

compostos termolábeis [24]. Para ultrapassar estas limitações, foram desenvolvidas

tecnologias mais avançadas não convencionais como a extração por líquido pressurizado,

ultrassons, micro-ondas, fluidos supercríticos e campos elétricos pulsados. No entanto,

estas metodologias podem ter um custo de extração mais elevado [24]. A prensagem

mecânica é ainda uma extração bastante utilizada e valorizada, uma vez que não utiliza

solventes ou calor, evita a perda de compostos voláteis, não conduz à produção de

resíduos de solventes e apresenta um custo inferior. Assim, é o método de eleição para o

óleo de grainha de uva (OGU) utilizado na indústria alimentar [23].


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5

Figura 3. Fruto e grainha de V. vinifera L.

Os compostos bioativos presentes na grainha de uva e consequentemente no seu

óleo condicionam as ações emolientes, antioxidantes, antienvelhecimento, fotoprotetoras

e antimicrobianas que lhe são atribuídas [25-29]. Assim, na indústria cosmética, o OGU é

já utilizado em diferentes produtos comercializados, como cremes hidratantes, cremes

antienvelhecimento, esfoliantes, champôs, condicionadores e géis de banho (Tabela 1)

[30-34].

Tabela 1. Empresas que utilizam ingredientes derivados da grainha de uva em formulações cosméticas.

Empresa Localização Produtos Referência

29 Cosmetics® Estados Unidos Cremes hidratantes [31]

Cremes

antienvelhecimento

Esfoliantes corporais

Maquilhagens

Géis de banho

Desmaquilhantes

Anadia® Espanha Esfoliante

[35]

The Body Shop® Inglaterra Serum capilar

[36]

Caudalie®

França Cremes hidratantes [30, 37]

Cremes

antienvelhecimento

Protetores solares


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6

Esfoliantes

Champôs

Dagua Natural® Brasil Cremes hidratantes [38]

Esfoliantes

The Grapeseed

Company®

Estados Unidos Sabonetes [33]

Cremes

antienvelhecimento

Cremes hidratantes

Champôs

Condicionadores

HoneyDew® Estados Unidos Champô

[39]

Korres® Grécia Esfoliante

[40]

Lola Cosmetics® Brasil Champôs [34]

Condicionadores

Sprays protetores de

cabelo

Lush® Reino Unido Creme hidratante

[41]

Merlot Skin Care® Estados Unidos Cremes hidratantes [32]

Cremes

antienvelhecimento

Tónicos de limpeza

Géis de banho

Esfoliantes

NV Organics® Estados Unidos Hidratantes [42]

Champôs

Phyto® França Produtos antiqueda capilar [43, 44]

Skinfood® Coreia do Sul Óleos e loções hidratantes [45]

Produtos de banho

Além destes exemplos, há também cosméticos desenvolvidos para o setor

veterinário, como um bálsamo contra ressecamentos e fissuras nos focinhos de cães

contendo OGU [46].


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7

O OGU possui diversos compostos como ácidos gordos polinsaturados (58 – 79%),

monoinsaturados (12 – 29,9%) e saturados (8,5 – 20,2%), sendo os ácidos linoleico e

oleico, os maioritários (58 – 78% e 12 – 28%, respetivamente) [47]. Além disso, apresenta

também carotenoides (0,2 mg/kg), compostos fenólicos (59 – 360 mg EAG/kg), entre os

quais, os flavonoides catequina (0,00028%, m/m), galhocatequina (0,03%, m/m) e

epigalhocatequina (0,036%, m/m) [48-50]. Tem ainda na sua composição vitamina E (395

– 755 mg/kg), compreendendo 102 – 305 mg/kg de tocoferóis e 274 – 468 mg/kg de

tocotrienois, principalmente γ-tocotrienol (74 – 322 mg/kg), α-tocotrienol (137 – 264 mg/kg)

e α-tocoferol (77 – 257 mg/kg) [51].

1.3. Óleo de Sementes de Melão

O melão (Cucumis melo L.), apesar de comercializado como fruto, é um hortícola

da família Cucurbitaceae [52, 53]. Este hortícola apresenta uma grande variabilidade

genética, sendo de fácil adaptação e podendo ser cultivado em todas as regiões tropicais

e subtropicais do mundo [52, 53]. Os maiores produtores de melão, segundo dados de

2016, são a China, a Turquia, o Irão, o Egito, a Índia e o Cazaquistão [19].

O melão amarelo, também conhecido como melão espanhol, é um tipo de melão do

grupo inodorus, muito cultivado devido à sua resistência ao manuseio [54]. É redondo

ovalado, tem casca amarela e polpa que varia entre branco e creme [54], como mostra a

Figura 4.

Figura 4. Fruto e sementes de C. melo L.

O melão pode ser consumido em natura, minimamente processado e em sumos,

iogurtes e gelados, após processamento industrial [55, 56]. Estes processos geram

subprodutos como cascas, polpa e principalmente sementes [57]. As sementes do melão

são fontes de óleos e proteínas, sendo o óleo utilizado na preparação de alimentos em

África e no Médio Oriente. Além disso, em países árabes, as sementes podem ser

utilizadas como snacks quando torradas com sal, ou usadas em saladas quando secas

[57].


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8

O óleo de sementes de melão (OSM) é descrito como ingrediente para cosmética

pela Comissão Europeia, com a função de agente condicionante da pele [58]. A Tabela 2

apresenta alguns produtos cosméticos que utilizam o OSM como ingrediente na

formulação.

Tabela 2. Empresas que utilizam ingredientes derivados de sementes de melão em formulações cosméticas.


Alba botânica® Estados Unidos Champô

Condicionador

[59, 60]

Eos® Estados Unidos Hidratante para

os lábios

[61]

Nature’s Gate® Estados Unidos Champô

Condicionador

[62, 63]

Os compostos bioativos do óleo de melão são os ácidos gordos polinsaturados

(44,7 – 69,2%), monoinsaturados (16,2 – 32,4%) e saturados (14,6 – 23,0%), sendo os

maioritários os ácidos linoleico (44,7 – 69,0%) e oleico (15,9 – 31,0%) [16, 57, 64, 65].

Possui ainda, compostos fenólicos (80 – 304,1 mg EAG/100 g) e flavonoides (87,5 mg de

equivalentes de quercetina (EQ)/100 g) [57]. A vitamina E total pode variar entre 220 e 828

mg/kg de óleo, sendo os vitâmeros maioritários o γ-tocoferol (100 – 460 mg/kg) e o α-

tocoferol (37 – 74 mg/kg) [66, 67].

1.4. Óleo de Sementes de Abóbora

A abóbora, tal como o melão, é da família Cucurbitaceae [68], compreendendo

várias espécies como Cucurbita moschata, C. maxima, C. mista, C. ficifolia, C. telfairia

occidentalis e C. pepo [69]. Segundo dados de 2016, é principalmente cultivada na China,

Índia, Rússia, Ucrânia e Estados Unidos [19]. O seu cultivo pode ter duas aplicações:

consumo alimentar ou uso medicinal. A utilização mais comum é na alimentação. No

entanto, têm sido referenciadas utilizações na medicina tradicional, por exemplo, no

tratamento de diabetes e no uso interno e externo contra vermes e parasitas [69].


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9

Tabela 3. Empresas que utilizam ingredientes derivados da semente de abóbora em formulações cosméticas.


Cara® Canadá Máscara esfoliante

[72]

Jane Iredale® Estados Unidos Corante para face e

lábios

[73]

Kivvi® Letónia Creme pós-barba

[74]

La Bella Figura® Estados Unidos Creme hidratante

[75]

Nudus® Austrália Batom

[76]

Pai® Reino Unido Óleo e creme

hidratante

[77]

Peony Cosmetics® Estados Unidos Desmaquilhante

[78]

RapidLash® Estados Unidos Máscara de cílios

[79]

Sevi® Estados Unidos Champô

Condicionador

[80, 81]

SIBU®

Estados Unidos Creme

antienvelhecimento

[82]

Sculpt® Estados Unidos Serum

antienvelhecimento

[83]

Styrian Gold® Canadá Loção hidratante

Sabonete

Bálsamo labial

[84-86]

The Fanciful Fox® Estados Unidos Creme hidratante

Esfoliante

[87, 88]

Vidazen® Serum

antienvelhecimento

[89]


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10

Entre as espécies de abóbora, a C. pepo é economicamente uma das mais

importantes a nível mundial [69]. Esta espécie possui características polimórficas, com

grandes variações de tamanho, forma e cor do fruto, e os seus cultivares podem ser

divididos em duas subespécies diferentes: subsp. pepo e subsp. ovifera [70].

Segundo a Comissão Europeia, o extrato das sementes de C. pepo é classificado

cosmeticamente como agente condicionante da pele [71]. Este ingrediente (C. pepo

(pumpkin) seed extract) pode ser encontrado na formulação de diversos cosméticos

(Tabela 3).

Além do extrato da semente de C. pepo, foi igualmente possível encontrar

cosméticos que utilizam o óleo de abóbora da variedade styriaca [85]. A C. pepo subsp.

pepo var. styriaca (Figura 5) é uma variedade típica da Estíria, uma província austríaca, e

a extração do seu óleo é muito popular e economicamente importante no sudeste europeu,

nomeadamente na Hungria, Eslovénia, Sérvia e Croácia [90, 91].

Figura 5. Fruto e sementes de C. pepo var. styriaca.

A abóbora é cultivada maioritariamente para extrair o óleo das suas sementes,

representando um elevado valor económico para a região onde é produzida [91]. O óleo é

edível, mas devido à sua cor, forte aroma e composição em ácidos gordos, não é utilizado

na confeção de alimentos. Normalmente é um óleo utilizado em frio, em molhos para

saladas [92].

Esta variedade desenvolveu-se na primeira metade do século XIX, através de uma

mutação acidental natural [91]. A mutação de genes recessivos levou a que se

desenvolvesse uma casca fina ao redor da sua semente, denominada “semente nua” ou

“semente sem casca” [91]. Esta modificação facilita a extração do óleo e é um dos fatores

que modificam a sua coloração, ao apresentar cor verde-escura com dicroísmo, em que

exibe duas cores diferentes, dependendo das circunstâncias de observação [91, 93]. Estas


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11

características diferem da coloração translúcida e amarela clara do óleo extraído de

sementes de outras espécies de Cucurbita spp. [91].

O óleo final é caracterizado entre óleo virgem e refinado, pois o seu processo de

produção envolve uma fase de torrefação das sementes. No entanto, não há refinação do

óleo extraído, nem é realizada a sua extração exaustiva, realizando-se apenas uma

prensagem [91].

A torra das sementes ocorre a temperaturas entre os 100 e os 130 °C durante 60

minutos, e este processo origina um óleo com sabor e odor a nozes e com modificação da

cor, devido às reações de Maillard, de caramelização e de oxidação de lípidos e proteínas

[94]. O aquecimento também desnatura as proteínas e inativa parcial ou completamente

enzimas como a lipase e a lipoxigenase, aumentando a estabilidade do óleo [94].

A reação de Maillard consiste numa complexa cascata de reações entre

aminoácidos e açúcares redutores que ocorrem durante o aquecimento, resultando na

formação de substâncias castanhas chamadas melanoidinas [95]. Essas reações

contribuem para a formação de fenóis e compostos antioxidantes, sendo as melanoidinas

e as melanoproteínas também antioxidantes [94, 96]. Os estágios iniciais de torrefação

caracterizam-se pela diminuição da capacidade antioxidante devido à perda de

antioxidantes termolábeis, associados geralmente à fração oleosa das sementes [94]. A

formação de compostos antioxidantes aumenta em estágios mais avançados de torrefação,

conforme as reações de Maillard ocorrem [94].

A torrefação, quando pouco intensa, não interfere na concentração de ácidos

gordos. No entanto, altas temperaturas podem degradar principalmente os ácidos gordos

polinsaturados (AGPI) devido à peroxidação lipídica. Além disso, a torrefação pode

degradar fitoesteróis, carotenoides e tocóis [94, 96].

Raczyk et al. (2017) realizaram um estudo de comparação de óleos do mesmo tipo

de abóbora com e sem realizar a torra das sementes, reportando no óleo com torrefação

das sementes maiores teores de fitoesteróis, carotenoides e estabilidade oxidativa e

menores teores de esqualeno, tocoferóis e índices de peróxido e de acidez [97]. No

entanto, a degradação de carotenoides e fitoesteróis do óleo cuja semente sofreu a

torrefação foi maior após 3 meses de armazenamento, enquanto os tocoferóis mantiveram-

se mais estáveis em relação ao óleo de sementes não torradas [97]. Nem o processo de

torrefação nem o processo de armazenamento modificaram a composição em ácidos

gordos de ambas as amostras [97].

Os principais compostos bioativos do óleo de sementes de abóbora (OSA) estiriano

são os ácidos gordos polinsaturados (45,6%), monoinsaturados (35,9%) e saturados

(18,5%), tendo como maioritários os ácidos linoleico (35,6 – 60,8%), oleico (21 – 46,9%) e


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12

palmítico (9,5 – 14,5%) [91, 98]. Além destes, possui também carotenoides (5,4 mg/kg) e

um teor de compostos fenólicos totais que varia entre 1,4 e 3,2 mg de equivalentes de

ácido cafeico (EAC) por 100 g [97, 99]. A vitamina E total pode variar entre 92 e 905 mg/kg,

sendo os vitâmeros maioritários o γ-tocoferol (52,3 – 644 mg/kg), o γ-tocotrienol (21,3 –

145 mg/kg), o α-tocoferol (16,7 – 78,7 mg/kg) e o δ-tocoferol (0 – 105,4 mg/kg) [98, 99].

1.5. Efeitos benéficos dos compostos bioativos na pele

Os óleos de grainha de uva, sementes de melão e sementes de abóbora possuem

uma vasta quantidade de metabolitos secundários, consoante descrito anteriormente [100].

Estes metabolitos complementam o desenvolvimento vegetativo, contribuindo para a

interação da planta com o meio ambiente onde está inserida, visando a sua sobrevivência

e proliferação [100]. Quando os metabolitos secundários também possuem atividade sobre

outros sistemas biológicos são considerados compostos bioativos [100]. Os compostos

bioativos mencionados para os diferentes óleos favorecem a sua utilização em fórmulas

cosméticas. Os compostos fenólicos (flavonoides, ácidos fenólicos, taninos e estilbenos)

possuem ação antioxidante, assim como a vitamina E [37, 91, 101-106]. Os flavonoides,

taninos e estilbenos apresentam também atividade antimicrobiana [101, 107, 108]. Já os

ácidos gordos têm ação emoliente [109].

A atividade antioxidante é uma das principais ações pretendidas dos óleos

utilizados neste trabalho. A produção de espécies reativas de oxigénio (ERO) e de azoto

(ERA) ocorre de forma natural no metabolismo humano, promovendo reações de oxidação

e de redução [110]. Estas espécies, também designadas como radicais livres, podem ser

produzidas em excesso quando em contato com agentes externos, como por exemplo a

radiação solar, poluentes, pesticidas, solventes industriais ou ozono, levando à perda de

equilíbrio entre compostos pró-oxidantes e antioxidantes, e, consequentemente, ao stress

oxidativo e danos nos tecidos celulares [111, 112]. Na pele, o stress oxidativo estimula as

enzimas de degradação epitelial e o envelhecimento cutâneo [27].

A atividade antioxidante de compostos fenólicos como estilbenos, ácidos fenólicos,

taninos e flavonoides, além da vitamina E, proporciona atividade fotoprotetora e

antienvelhecimento [27, 113, 114]. A fotoproteção está relacionada com a ação dos ácidos

fenólicos (ácidos vanílico, cafeico e clorogénico), flavonoides (catequina, epicatequina,

quercetina e proantocianidinas) e estilbenos (resveratrol) [113]. Os seus anéis aromáticos

têm a capacidade de absorver radiação UV e a atividade antioxidante inibe os danos

causados pela radiação UV incidente [115-117]. A atividade fotoprotetora do OGU já foi

reportada em diferentes ensaios in vitro e in vivo [26, 29, 112, 118].


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13

O envelhecimento cutâneo é influenciado por fatores como processos metabólicos,

genética, mudanças hormonais e exposição ambiental [119]. A exposição ao meio

ambiente tem importância devido aos danos causados pela radiação UV e consequente

produção de radicais livres, os quais podem ser reduzidos na presença de antioxidantes

[119]. A inibição pelos compostos antioxidantes das enzimas de degradação epitelial,

nomeadamente a hialuronidase e a elastase, conduz à regeneração cutânea e à ação anti-

inflamatória [120, 121]. Além disso, é importante ter em conta a ação clareadora que

compostos como o ácido protocatecuico, o resveratrol e as proantocianidinas podem

exercer devido à inibição da tirosinase, uma enzima específica cujo produto de ação nos

melanócitos é a melanina [27, 37, 122].

Para além da atividade antioxidante, a atividade antimicrobiana é devida à presença

de compostos fenólicos como a catequina, a epicatequina e a epigalhocatequina, o

resveratrol e taninos [101, 108]. Segundo Mattos et al. (2017), os grupos hidroxilo dos

compostos fenólicos têm a capacidade de se acumular na bicamada lipídica das bactérias,

causando um desarranjo na estrutura e função da membrana [108]. Após este processo, o

composto penetra na célula, exercendo atividade inibitória num local ativo no citoplasma,

aumentando a permeabilidade da membrana, levando à perda de organelos e de ATP e,

consequentemente, à lise celular [108].

Por fim, a atividade emoliente deve-se à presença de ácidos gordos. Os ácidos

gordos estão presentes naturalmente na epiderme e possuem funções como barreira de

permeação cutânea, sendo componentes essenciais do filme lipídico da superfície

cutânea, mantendo a hidratação, elasticidade e suavidade da pele [123]. Além disso,

servem para a produção de lípidos complexos do sebo pelas glândulas sebáceas,

promovem a acidificação do estrato córneo e sinalizam os queratinócitos, regulando a

homeostase epidérmica [123, 124].

1.6. Produtos labiais

Os produtos para os lábios, como batons, bálsamos, brilhos, delineadores e crayons

labiais, têm como objetivo colorir e/ou lubrificar os lábios [125]. Colorir os lábios é uma

prática realizada desde a antiguidade até os dias de hoje, sendo utilizados por mulheres

de todas as idades [126]. Segundo dados de 2017, cerca de 40% das mulheres britânicas

utilizam batom labial todos os dias ou várias vezes na semana (Figura 6) [126, 127].


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14

Figura 6. Utilização de batons por mulheres britânicas em 2017. Adaptado de Statista [127].

A fórmula de um batom contém ceras, óleos e pigmentos [128]. Além disso, deve

ter atributos como aparência homogénea, boa capacidade de conservação e manutenção,

não apresentar exsudação, ter estabilidade térmica, resistir à rutura, apresentar odor e

sabor agradáveis, ter formato adequado ao uso, proteger os lábios, mantendo a sua

humidade e suprimindo fissuras labiais, apresentar bom espalhamento, não possuir aspeto

untuoso, oferecer aderência duradoura, não produzir brilho excessivo e não migrar [127].

Os bálsamos labiais podem ou não ser fisicamente similares aos batons comuns.

São normalmente formulados à base de petróleo e o seu objetivo é humidificar e ajudar na

cicatrização de fissuras labiais [128]. Os bálsamos labiais fornecem propriedades

lubrificantes, conferindo um filme labial, sendo principalmente usados como barreira

protetora contra condições ambientais adversas [128].


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15

2. Objetivos

O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver um batom labial contendo na sua

fórmula um óleo de sementes como ingrediente ativo na sua composição. O óleo utilizado

na fórmula foi escolhido entre as seguintes opções: óleo de grainha de uva (OGU), óleo de

sementes de melão (OSM) e óleo de sementes de abóbora (OSA). A seleção foi feita tendo

em conta as características químicas, dos óleos em estudo, que melhor corresponderam

às características pretendidas no produto cosmético a ser desenvolvido.

2.1. Objetivos específicos

▪ Determinar a composição em ácidos gordos, vitamina E, compostos fenólicos

totais, flavonoides totais, clorofilas, carotenoides e a atividade antioxidante

(determinada pelo método FRAP e inibição do DPPH•) de três óleos vegetais:

óleo de grainha de uva (OGU), óleo de sementes de melão (OSM) e óleo de

sementes de abóbora (OSA), que correspondem à valorização de subprodutos

da indústria agroalimentar (OGU e OSM) e de um produto especial cultivado com

esse fim (OSA);

▪ Determinar a estabilidade oxidativa e a cor dos três óleos vegetais em estudo;

▪ Selecionar o óleo com as melhores características para ser aplicado numa

fórmula de batom;

▪ Desenvolver e caracterizar uma formulação de batom labial;

▪ Determinar o teor de compostos fenólicos totais, teor de flavonoides totais e

atividade antioxidante (determinada pelo método FRAP e inibição do DPPH•) do

batom desenvolvido;

▪ Determinar a estabilidade química e tecnológica do batom desenvolvido.


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16

3. Materiais e Métodos

Neste capítulo são descritas as metodologias utilizadas para a determinação da cor,

estabilidade oxidativa, clorofilas e carotenoides, composição em ácidos gordos, perfil de

vitamina E, teor de compostos fenólicos totais e flavonoides totais, atividade antioxidante

pelo método de FRAP e inibição do DPPH• dos óleos, bem como as técnicas utilizadas

para a determinação desses parâmetros na fórmula de batom desenvolvida.

3.1. Padrões e Reagentes

Os reagente trifluoreto de boro 14%, diclorometano, ácido gálhico, TPTZ (2,4,6-

tri(2-piridil)-s-triazina), trolox, carbonato de sódio, sulfato ferroso, DPPH (2,2-difenil-1-

picril-hidrazilo), acetato de sódio e catequina foram adquiridos à Sigma-Aldrich (Steinheim,

Alemanha). O hidróxido de potássio, sulfato de sódio anidro, reagente Folin–Ciocalteau,

ácido clorídrico, cloreto férrico, nitrito de sódio, hidróxido de sódio e cloreto de alumínio

eram da Merck (Darmstadt, Alemanha). O padrão de ácidos gordos FAME 37 foi adquirido

à Supelco (Bellefonte, PA, USA). O n-hexano PA e etanol absoluto era da Carlo Erba (Val-

de-Reuil, França) e o cicloexano da Romil Chemicals (Cambridge, Reino Unido). O tocol

foi adquirido à Matreya (State College, PA, Estados Unidos) e o metanol PA e o ácido

acético glacial à Chem-Lab (Zedelgem, Bélgica).

3.2. Amostras de óleos

A amostra de óleo refinado de grainha de uva (Figura 7) foi fornecida pela Destilaria

Levira (Anadia, Portugal) em janeiro de 2018. O óleo foi acondicionado a -20 °C e protegido

da luz até análise.

Figura 7. Óleo de grainha de uva (OGU).


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17

A amostra de óleo de sementes de melão (Figura 8) foi adquirida no mês de

novembro de 2017 em Albacete (Espanha), tendo sido acondicionado a -20 °C e protegido

da luz até análise.

Figura 8. Óleo de sementes de melão (OSM).

A amostra de óleo de sementes de abóbora (C. pepo var. styriaca) (Figura 9) foi

adquirida num estabelecimento comercial da cidade do Porto (Portugal). Este óleo foi, à

semelhança dos outros, armazenado a -20 °C e protegido da luz até posterior análise.

Figura 9. Óleo de sementes de abóbora (OSA).

3.3. Caracterização dos óleos

3.3.1. Determinação da cor

A cor foi determinada através do procedimento de Gorjanović et al. [99], cálculos de

X-Rite [129] e ASTM International [130]. Para este ensaio foi utilizado um colorímetro-

espectrofotómetro manual Minolta Chroma Meter CR-400 (Minolta, Japão) (Figura 10) e

determinadas as coordenadas CIELAB e CIELCH. As amostras foram colocadas em placas

de Petri de 5,5 cm de diâmetro e analisadas diretamente com o colorímetro. Os valores

adquiridos em XYZ foram aplicados nos seguintes cálculos:


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18

L* = 116 (Y/Yn)1/3 – 16

a* = 500 [(X/Xn)1/3 – (Y/Yn)1/3]

b* = 200 [(Y/Yn)1/3 – (Z/Zn)1/3]

C* = (a*2 + b*2)1/2

h° = arctan (b*/a*)

Xn, Yn e Zn, correspondem aos valores do branco. Sendo o Minolta Chroma Meter

um aparelho que corresponde ao Observador Padrão 2° da CIE de 1931 e iluminante à luz

natural (D65) [131], os valores do branco correspondem a Xn = 95,047, Yn = 100 e Zn =

108,883 [130].

Figura 10. Chroma Meter CR-400.

L* corresponde à luminosidade, tendo valores de 0 (preto) a 100 (branco); a* varia

de vermelho (+90) a verde (-90) e b* de amarelo (+90) a azul (-90). Se a* ou b*

apresentarem valor 0 correspondem à cor cinza [99, 132]. Ainda, h° corresponde à

tonalidade e C* à intensidade (Figura 11) [129].


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19

Figura 11. Gráfico CIELAB. Adaptado de X-Rite® [133]

3.3.2. Determinação da estabilidade oxidativa

A estabilidade oxidativa foi determinada através do tempo de indução à oxidação

em Rancimat (Metrohm 892 Professional Rancimat) (Figura 12). A avaliação da

estabilidade oxidativa é um método de aceleração da vida útil de um produto [134]. Neste

método, os ácidos gordos são oxidados através de calor e passagem de oxigénio contínuos

[135]. Inicialmente, são formados peróxidos, como produtos primários da oxidação, e

depois produtos secundários, indicando a oxidação dos ácidos gordos [135]. Os produtos

de oxidação incluem ácidos orgânicos de baixa massa molecular e voláteis, como o ácido

acético e o ácido fórmico [135]. Estes produtos são transportados pela corrente de ar para

o frasco de medição contendo água desionizada (Figura 13). A condutividade elétrica neste

recipiente é medida continuamente. A presença dos ácidos voláteis aumenta a

condutividade [135]. O tempo que decorre até estes produtos secundários começarem a

surgir, indicando a degradação dos ácidos gordos da amostra, é denominado “tempo de

indução”. Quanto maior o tempo de indução, mais estável é a amostra [134, 135].


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20

Figura 12. Equipamento Rancimat.

Para a determinação da estabilidade oxidativa foram utilizadas as seguintes

condições: 3 g de amostra; fluxo de ar a 20 L/h; 120 °C. No final da análise foi obtida uma

curva de condutividade elétrica e registado o tempo (horas) necessário para alcançar o

ponto de inflexão da condutividade [134]. Todas as determinações foram feitas em

duplicado.

Figura 13. Princípio do método Rancimat.

3.3.3. Determinação de clorofilas e carotenoides

A determinação dos teores de clorofilas e carotenoides totais foi feita segundo

Minguez-Mosquera et al. [136]. Para isso, foi pesada uma alíquota de 1 g de amostra e

utilizado cicloexano para perfazer um volume total de 10 mL. Os tubos foram agitados no

vortex durante 30 segundos e em seguida centrifugados por 5 minutos a 5000 rpm

(Heraeus Labofuge A, Hanau, Alemanha). A absorvência da solução foi lida em


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21

espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 (Shimadzu, Japão) (Figura 14) a comprimentos de

onda de 670 e 470 nm para clorofilas e carotenoides, respetivamente, tendo sido utilizadas

células de quartzo. Os pigmentos foram quantificados de acordo com as seguintes

fórmulas:

Clorofila (mg/kg de óleo) = (A670 x 106)/(613 x 100 x d)

Carotenoides (mg/kg de óleo) = (A470 x 106)/(2000 x 100 x d)

onde A é a absorvência da amostra, 613 o coeficiente de extinção para clorofilas (feoftina

sendo o componente maioritário), 2000 o coeficiente de extinção de carotenoides (luteína

sendo o componente maioritário) e d o tamanho da célula (1 cm) [137].

Figura 14. Espectrofotómetro.

3.3.4. Composição em ácidos gordos por GC-FID

Os ácidos gordos foram determinados de acordo com a norma ISO 12966-2:2012

e Costa et al. [138, 139]. Para a preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos foram

utilizadas duas metodologias: procedimento rápido de transmetilação em condições

alcalinas e transmetilação com trifluoreto de boro (condições ácidas).

Na transmetilação básica foram adicionadas 2 gotas (aproximadamente 15 mg) de

óleo a 2 mL de n-hexano e a mistura agitada em vortex. De seguida, foram adicionados

200 μL de solução de hidróxido de potássio em metanol 2 M, seguida de agitação em vortex

durante 1 minuto. Adicionou-se a seguir sulfato de sódio anidro para remoção da água.

Repetiu-se uma agitação em vortex por 1 minuto e centrifugação 5 minutos a 3000 rpm

(Heraeus Biofuge Pico, Hanau, Alemanha). Foram transferidos 800 μL do sobrenadante

para um vial de injeção.


____________________________________________________________________________________

22

Na transmetilação ácida pesaram-se aproximadamente 40 mg de amostra e

adicionaram-se 2 mL de diclorometano e 1,5 mL de hidróxido de potássio 0,5 M. A solução

foi agitada e colocada em estufa a 100 °C durante 10 minutos. Após arrefecimento durante

5 minutos em gelo, adicionaram-se 2 mL de trifluoreto de boro (14%) em solução de

metanol. A solução foi posteriormente colocada em estufa a 100 °C durante 30 minutos.

Após arrefecimento em gelo, adicionaram-se 2 mL de água desionizada e 5 mL de n-

hexano e centrifugou-se (5 minutos; 3000 rpm) (Heraeus Labofuge A, Hanau, Alemanha).

A fase superior foi recolhida para outro tubo de vidro de 4 mL, onde foi adicionado sulfato

de sódio anidro para remoção da água da solução. Finalmente, foram transferidos 800 μL

do sobrenadante para um vial de injeção.

Para a análise cromatográfica dos ésteres metílicos de ácidos gordos utilizou-se um

cromatógrafo gasoso Shimadzu GC-2010 Plus (Shimadzu, Tóquio, Japão) equipado com

um injetor automático split/splitless Shimadzu AOC-20i (Shimadzu, Tóquio, Japão) e um

detetor de ionização de chama (Shimadzu, Tóquio, Japão) (Figura 15). O cromatógrafo

estava equipado com uma coluna capilar de sílica fundida CP-SIL 88 (50 m x 0,25 mm

diâmetro interno x 0,20 µm de espessura de filme; Varian, Middelburg, Holanda). Usaram-

se as seguintes condições analíticas: gás de arraste: hélio; razão de split de 1:50; volume

de injeção: 1 µL; temperatura da coluna inicial 120 °C durante 5 minutos, programada para

aumentar até 160 °C à velocidade de 2 °C/minuto, permanecendo a esta temperatura

durante 2 minutos; aumento da temperatura até 220 °C a 2 °C/minuto; de seguida a

temperatura aumenta até 220 °C e permanece durante 10 minutos. A temperatura da

injeção foi de 250 °C e a temperatura do detetor de 270 °C.

Os ésteres metílicos dos ácidos gordos foram identificados por comparação dos

tempos de retenção dos picos das amostras com os da mistura padrão (FAME 37, Supelco,

Bellefonte, PA, EUA). Para o tratamento dos dados recorreu-se ao software GS Solution

(Shimadzu, Tóquio, Japão). Os resultados foram expressos em % relativa.


____________________________________________________________________________________

23

Figura 15. GC-FID.

3.3.5. Determinação do perfil da vitamina E por HPLC

Para a determinação do perfil da vitamina E, foram rigorosamente pesados 30 mg

de óleo e adicionados 50 μL de solução de padrão interno (tocol, 0,1 mg/mL) e 1 mL de n-

hexano para HPLC, de acordo com Pimentel et al. [140]. A solução foi centrifugada durante

5 minutos a 5000 rpm (Heraeus Biofuge Pico, Hanau, Alemanha). Foram depois

transferidos 800 μL para um vial de injeção. Para a análise cromatográfica foi utilizado um

sistema de HPLC (Jasco, Tokyo, Japan) equipado com um detetor de díodos (MD-2015)

acoplado a um detetor de fluorescência (FP-2020), com excitação a 290 nm e emissão a

330 nm (Jasco, Tokyo, Japan) (Figura 16).

Figura 16. HPLC.


____________________________________________________________________________________

24

Para a separação cromatográfica foi utilizada uma coluna de fase normal

SupelcosilTM LC-SI (75 mm × 3.0 mm, 3.0 µm) (Supelco, Bellefonte, USA). A eluição

isocrática foi composta de n-hexano:1,8-dioxano (98:2) numa taxa de fluxo de 0,7 mL/min.

Os vitâmeros da vitamina E foram identificados com base no espectro UV e comparados

com os tempos de retenção dos respetivos padrões (Tabela 4).

Tabela 4. Curva de calibração dos padrões de vitamina E.

Padrão Curva de calibração (µg/ml) R2

α-tocoferol

β-tocoferol

γ-tocoferol

δ-tocoferol

α-tocotrienol

β-tocotrienol

γ-tocotrienol

δ-tocotrienol

0,06 - 50,39

0,06 - 48,89

0,04 - 35,23

0,06 - 51,67

0,06 - 44,54

0,04 - 31,21

0,06 - 49,57

0,07 - 55,84

0,9975

0,997

0,997

0,9969

0,995

0,9972

0,9961

0,9981

3.3.6. Determinação do teor de compostos fenólicos totais

Para a determinação do teor de compostos fenólicos totais (CFT) foi utilizado o

reagente Folin-Ciocalteu, perante o qual os compostos fenólicos presentes na amostra

atuam como agentes redutores, formando um complexo de cor azul através de reações de

oxirredução [141], que permite a quantificação dos grupos hidroxilo [142].

Os CFT foram extraídos de acordo com Demirtas et al. e Capannesi et al. [51, 143].

Inicialmente, foram pesados 2,5 g de óleo. A amostra foi solubilizada em 2,5 mL de n-

hexano com ajuda de vortex, durante 1 minuto. Adicionaram-se 2,5 mL de solução de

metanol/água (80:20, v/v) e foi novamente agitada em vortex durante 1 minuto.

Posteriormente a solução foi centrifugada durante 5 minutos a 5000 rpm (Thermo Scientific,

Heraeus Megafuge 16, Hanau, Alemanha). A fase lipídica foi removida e realizada nova

extração com metanol/água. O procedimento foi repetido mais duas vezes. As soluções

hidroalcoólicas foram novamente centrifugadas (3000 rpm; 5min) (Thermo Scientific,

Heraeus Megafuge 16, Hanau, Alemanha) e a gordura remanescente foi retirada. Os

extratos obtidos foram combinados e acondicionados adequadamente para posterior

análise.

De acordo com Costa et al. [139], foram transferidos para microplaca 30 μL de

solução padrão de ácido gálhico ou amostra ou branco (água desionizada), aos quais foram


____________________________________________________________________________________

25

adicionados 150 μL de reagente Folin-Ciocalteu (1:10) e 120 μL de carbonato de sódio

7,5%. A microplaca foi incubada a 45 °C durante 15 minutos ao abrigo da luz. Após 30

minutos de arrefecimento à temperatura ambiente, a absorvência foi lida a 765 nm em leitor

de microplacas Synergy HT Reader (BioTek Instruments, Synergy HT GENS5, EUA). Foi

igualmente feita uma curva de calibração de ácido gálhico (5 - 100 mg/L; R2=0,9999). Os

resultados foram expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálhico por

quilograma de óleo (mg EAG/kg). Todas as determinações foram feitas em triplicado.

3.3.7. Determinação do teor de flavonoides totais

O teor de flavonoides totais (FT) foi determinado por um ensaio colorimétrico, a

partir da formação de complexos flavonoide-alumínio, apresentando coloração rosa e maior

absorvência para maiores concentrações de flavonoides [144].

De acordo com Costa et al., adicionaram-se a 500 μL de amostra (solução

hidroalcoólica do óleo), padrão ou branco em tubo de ensaio, 2 mL de água destilada e

150 μL de nitrito de sódio (NaNO2) a 5% [139]. Após 5 minutos de reação adicionaram-se

150 μL de cloreto de alumínio (AlCl3 a 10%) e aguardou-se 1 minuto. Por fim, adicionou-se

1 mL de hidróxido de sódio 1 M e 1,2 mL de água desionizada. As absorvências foram lidas

num leitor de microplacas Synergy HT Reader (BioTek Instruments, Synergy HT GENS5,

USA) a 510 nm. Foi utilizada catequina como padrão, obtendo-se uma curva de calibração

(5 - 300 mg/L; R2=0,998). Os resultados foram expressos em miligramas de equivalentes

de catequina por quilograma de óleo (mg EC/kg). Todas as determinações foram feitas em

triplicado.

3.3.8. Determinação da atividade antioxidante pelo método FRAP

O método FRAP (poder antioxidante por redução do ião férrico) tem como base a

redução do ião Fe3+ a Fe2+ por um componente antioxidante [145]. Este reagente é um

complexo formado pelo cloreto férrico (FeCl3) e TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) (Figura 17)

[145].


____________________________________________________________________________________

26

Figura 17. Reação FRAP.

Para a determinação da atividade antioxidante pelo FRAP seguiu-se o método de

Costa et al. [139]. Para isso, foram colocados em microplaca 35 μL de amostra, branco ou

solução padrão e 265 μL de reagente FRAP (10 mL de tampão acetato 0,3 M, 1 mL solução

TPTZ 10 mM e 1 mL FeCl3 20 mM). Após incubação a 37 °C durante 30 minutos (ao abrigo

da luz), a absorvência foi lida em leitor de microplacas Synergy HT Reader (BioTek

Instruments, Synergy HT GENS5, USA) a 595 nm. Utilizou-se sulfato ferroso 1mM como

padrão, obtendo-se uma curva de calibração (25 - 500 μM; R2=0,987). Os resultados foram

expressos em moles de equivalentes de sulfato ferroso por quilograma de óleo (mol

ESF/kg). Todas as determinações foram feitas em triplicado.

3.3.9. Determinação de atividade antioxidante por inibição do DPPH•

A molécula de DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) possui um radical livre estável,

que em solução confere coloração violeta [146]. Este ensaio caracteriza-se pela

capacidade do composto antioxidante doar átomos de hidrogénio, sequestrando o DPPH•

e reduzindo-o a hidrazina (Figura 18) [146]. Quando a hidrazina é formada, ocorre mudança

de cor violeta para amarelo claro [146]. Deste modo, a intensidade da coloração e a maior

absorvência está inversamente relacionada com a capacidade antioxidante e o tempo de

reação da amostra [146].

Figura 18. Reação DPPH.

A determinação foi realizada de acordo com Costa et al. [139]. Inicialmente, foi

preparada uma solução de DPPH de 6x10-5 M, a qual apresentava uma absorvência entre


____________________________________________________________________________________

27

0,65 e 0,66 a 595 nm. De seguida, foram transferidos para microplaca 30 μL de amostra,

padrão ou branco aos quais foram adicionados 270 μL da solução de DPPH 6x10-5 M.

Como branco foi utilizada uma mistura de metanol/água (80:20). O padrão selecionado foi

o Trolox, tendo-se obtido uma curva de calibração (5 - 175 mg/L; R2=0,997). O decréscimo

da absorvência (a cada 2 minutos) foi determinado a 525 nm durante 20 minutos em leitor

de microplacas Synergy HT Reader (BioTek Instruments, Synergy HT GENS5, USA). Os

resultados foram expressos em μmol de equivalentes de Trolox por quilograma de óleo

(μmol Trolox/kg). Todas as determinações foram feitas em triplicado.

3.4. Desenvolvimento da fórmula do batom

A fórmula do batom teve como base as formulações propostas por Palmeira-de-

Oliveira et al. [147], usando um dos óleos estudados neste trabalho – o óleo de abóbora

como ingrediente ativo. Os excipientes e as proporções escolhidas para a formulação estão

apresentados na Tabela 5.

Tabela 5. Excipientes e proporção utilizada na formulação desenvolvida

Ingredientes Concentração

Lanolina

Vaselina branca

10%

20%

Cera de abelha

Óleo de sementes de abóbora

20%

50%

Os batons foram preparados em manta, com regulação da temperatura, por fusão

dos excipientes até obtenção de uma mistura homogênea. A mistura foi depois vertida para

moldes de plástico até solidificar (Figura 19).

Figura 19. Moldes utilizados para a produção do batom.


____________________________________________________________________________________

28

3.5. Ensaios de estabilidade acelerada

Para avaliação da estabilidade da formulação desenvolvida, ao momento 0 e após

30 dias de armazenamento a 20 °C com humidade relativa (HR) de 65% e a 40 °C com HR

de 75%, avaliou-se a estabilidade química (CFT, FT, atividade antioxidante pelos métodos

de FRAP e inibição do DPPH•) e a estabilidade física (cor e dureza) dos batons

desenvolvidos. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

3.5.1. Características organoléticas

As características organoléticas (odor, cor e aspeto) foram avaliadas durante as

análises. Para a determinação da cor, foi produzida uma amostra de batom em placa de

Petri. A cor foi determinada de acordo com o procedimento anteriormente descrito no

capítulo 3.3.1.

3.5.2. Preparação da amostra e determinação do teor de compostos fenólicos

totais

Para a determinação dos CFT, FT e atividade antioxidante foi utilizado uma amostra

de 25 mg de batom dissolvido em 60 mL de metanol e sonicados (Sonica® Ultrasonic

Cleaner, Milão, Itália) a 60 °C durante 40 minutos, como descrito por Westfall [148].

A determinação do CFT foi realizada conforme descrito no capítulo 3.3.6. Os

resultados foram expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálhico por grama de

batom (mg EAG/g), e a curva de calibração obtida foi entre 0,625 e 40 mg/L (R2=0,999)

para as amostras a tempo 0 e entre 5 e 100 mg/L (R2=0,999) para as amostras

armazenadas por 30 dias. Todas as determinações foram feitas em triplicado.

3.5.3. Determinação do teor de flavonoides totais

O método utilizado foi o descrito por Costa et al. [139] no capítulo 3.3.7, com

adaptações para microplaca. As absorvências foram lidas no mesmo leitor de microplacas

a 510 nm. Foi utilizada catequina como padrão, obtendo-se uma curva de calibração entre

2,5 e 300 mg/L (R2=0,999). Os resultados foram expressos em miligramas de equivalentes

de catequina por grama de batom (mg EC/g). Todas as determinações foram feitas em

triplicado.


____________________________________________________________________________________

29

3.5.4. Determinação da atividade antioxidante pelo método de FRAP

A determinação da atividade antioxidante pelo método FRAP foi feita de acordo com

o capítulo 3.3.8. A curva de calibração de padrão de sulfato ferroso 1 mM foi feita entre

3,125 e 500 μM (R2=0,999). Os resultados foram expressos em moles de equivalentes de

sulfato ferroso por grama de batom (mol ESF/g). Todas as determinações foram feitas em

triplicado.

3.5.5. Determinação da atividade antioxidante por inibição do DPPH•

A determinação de atividade antioxidante por inibição do DPPH• foi feita de acordo

com 3.3.9. Foi obtida uma curva de calibração de Trolox de 0,625 a 75 mg/L (R2=0,998).

Os resultados foram expressos em % de inibição de DPPH• e em μmol de equivalentes de

Trolox por grama batom (μmol Trolox/g). Todas as determinações foram feitas em

triplicado.

3.5.6. Determinação da dureza

A dureza da formulação foi avaliada através da determinação da força máxima (em

Newtons) necessária para penetrar na amostra. Esta análise foi realizada em Texturómetro

Stable Micro Systems TA.XT2i (Surrey, Reino Unido), com sonda metálica de 2 mm de

diâmetro (P/2, Dia Cylinder Stain) e com uma célula de carga de 5 kg (Figura 20). As

condições de ensaio foram: ensaio em modo de compressão, velocidade pré-teste de 3

mm/s, teste de 1 mm/s e pós teste de 3 mm/s, distância de penetração de 2 mm.

Foi igualmente determinada a dureza da amostra de batom hidratante comercial

para comparação.


____________________________________________________________________________________

30

Figura 20. Texturómetro.

3.6. Análise estatística

A análise estatística dos resultados (Testes de Homogeneidade de Variância, Teste

One Way ANOVA e Tukey) foi realizada com software estatístico IBM SPSS Statistics para

Windows, versão 25.0 (IBM Corp., EUA). Todos os resultados são apresentados como

média ± desvio padrão.


____________________________________________________________________________________

31

4. Resultados e Discussão

4.1. Caracterização química dos óleos


A Tabela 6 apresenta os resultados dos diferentes parâmetros da cor obtidos para

os óleos. O valor da tonalidade (h°) de OGU corresponde no gráfico CIELAB (Figura 11) à

cor verde, enquanto o OSM tem predominantemente coloração amarela. O OSA encontra-

se do lado oposto do gráfico, sendo caracterizado por apresentar pouca luminosidade,

intensidade opaca e tonalidade violeta.

Em relação à luminosidade, existem diferenças significativas entre os três óleos

(p<0,05), sendo o OSA a amostra mais escura. Relativamente à a* (que varia entre

vermelho e verde), o OGU encontra-se na coloração verde, enquanto OSA aproxima-se da

coloração vermelha. No eixo b* (cujas cores variam entre amarelo e azul), OSM aproxima-

se mais da cor amarela, seguido de OGU e OSA (p<0,05), enquanto que no parâmetro C*

(intensidade), OSM apresenta intensidade de cor mais acentuada em oposição à OSA.

Tabela 6. Características da cor dos óleos em CIELAB (L*a*b*) e CIELCH (L*C*h°).

OGU OSM OSA

L*

a*

51,00 ± 0,05b

-5,41 ± 0,06c

53,81 ± 0,08a

-3,06 ± 0,06b

35,93 ± 0,13c

0,93 ± 0,04a

b*

C*

h°

12,45 ± 1,7b

13,59 ± 1,54b

113,83 ± 3,42b

17,64 ± 0,31a

17,9 ± 0,31a

99,84 ± 0,08c

-0,51 ± 0,02c

1,06 ± 0,04c

331,42 ± 1,02a

Resultados expressos como média ± desvio padrão (n=8). Letras diferentes em cada linha significam diferenças significativas entre as amostras (p<0,05). OGU: óleo de grainha de uva; OSM: óleo de semente de melão; OSA: óleo de semente de abóbora.

Num estudo realizado por Shinagawa et al. utilizando diferentes amostras de OGU

brasileiras, os autores constataram que os óleos apresentaram valores de L* entre 4,6 e

16,2, valores de a* entre -1,05 e 0,86, valores de b* entre 4,58 e 10,2, valores de C* entre

4,66 e 10,24 e tonalidade entre 79,37° e 97,28° [149]. Neste trabalho, OGU apresentou um

valor de L* de 51, o que significa que esta amostra apresenta maior luminosidade em

comparação com as amostras utilizadas no referido estudo. O OGU também apresenta

uma coloração mais próxima do verde (a* de -5,4) e do amarelo (b* de 12,5), além de ter

uma coloração mais intensa (C* de 13,59), quando comparadas com os resultados de

Shinagawa et al.


____________________________________________________________________________________

32

Relativamente ao OSM, estudos realizados por Mariod et al. e Azhari et al.

utilizando variedades diferentes de C. melo, obtiveram óleos de cor mais vermelha (a* entre

1,9 e 2,2) e amarela (b* entre 29,3 e 35) e com maior intensidade (C* entre 29,3 e 35,07)

do que o óleo utilizado neste estudo [150, 151]. Além disso, Azhari et al. também registaram

uma maior luminosidade (L* a 64,6), enquanto no OSM deste trabalho foi obtido um L* de

53,8, o que significa uma menor luminosidade [150].

Gorjanović et al. caracterizaram o óleo de sementes de diferentes variedades de

abóbora do sudeste europeu, obtendo óleos mais escuros (valores de L* entre 19,8 e 20,5)

em relação ao OSA deste trabalho [99]. De facto, apenas a amostra de óleo de origem

austríaca apresentou valores similares aos obtidos no presente trabalho, com resultados

do parâmetro a* de 0,68, do parâmetro b* de -0,16 e conferindo tonalidade a 346,76°,

valores próximos à OSA, mas menos intenso (C* de 0,7) [99]. Gorjanović et al.

correlacionaram os valores mais baixos de a* com uma maior atividade antioxidante [99].

4.1.2. Determinação da estabilidade oxidativa

Os gráficos apresentados na Figura 21 apresentam os resultados obtidos na

estabilidade oxidativa expressos em tempo de indução, demonstrando uma maior

estabilidade do OSA em relação aos outros óleos.

Num estudo realizado por Lutterodt et al. utilizando diferentes variedades de OGU,

foram obtidos resultados entre 19,7 e 40 horas (4 mL, 80 °C, 7 L/h), enquanto Pardo et al.

reportaram valores entre 6,38 e 9,36 horas (3,5 g, 98 °C, 10 L/h) em diferentes variedades

de uva provenientes de Espanha [23, 152]. No entanto, estes valores podem dever-se às

diferentes condições utilizadas para a indução à oxidação (volume da amostra, temperatura

e fluxo de oxigénio). Por outro lado, Petkova et al. determinaram a estabilidade oxidativa

em diferentes variedades de OSM mas utilizando uma temperatura inferior (100 °C) à

utilizada no presente trabalho, obtendo valores de estabilidade oxidativa entre 7,2 e 14,3

horas [67]. Já Mariod et al. e Azhari et al. realizaram os ensaios em condições similares às

utilizadas neste trabalho. No entanto, estes investigadores utilizaram uma maior massa de

óleo, tendo Mariod et al. obtido resultados de OSM entre 5,7 e 5,9 horas (3,6 g, 120 °C, 20

L/h), enquanto Azhari et al. reportaram um tempo de indução de 4,8 horas (3,6 g, 120 °C,

20 L/h) [150, 153].


____________________________________________________________________________________

33

Figura 21. Tempos de indução de estabilidade oxidativa dos diferentes óleos. OGU: óleo de grainha de uva; OSM: óleo de semente de melão; OSA: óleo de semente de abóbora.

No estudo elaborado por Gorjanović et al. com amostras de OSA, utilizando uma

menor massa de amostra (2,5 g), foram obtidos tempos de indução entre 4 e 4,5 horas

[99]. Andjelkovic et al., utilizando uma maior massa de amostra (5 g), reportaram valores

de tempo de indução entre 3,5 e 5,2 horas, enquanto Murkovic et al. obtiveram uma média

de 6,8 horas [98, 154].

Para além das condições de análise, a estabilidade oxidativa pode variar conforme

a presença e concentração de diferentes compostos bioativos com capacidade

antioxidante, nomeadamente compostos fenólicos, vitamina E, clorofilas e carotenoides,

podendo levar a uma maior ou menor estabilidade oxidativa [135, 149].

Além disso, a presença de um maior teor de ácidos gordos polinsaturados (AGPI)

em óleos vegetais é determinante para uma maior suscetibilidade à oxidação

comparativamente a um óleo com um teor de AGPI inferior [155]. Os resultados obtidos

podem indicar a existência de uma maior percentagem de ácidos gordos saturados (AGS)

e monoinsaturados (AGMI) no OSA e de AGPI no OGU e no OSM, como pode ser

posteriormente constatado na Tabela 7. Além disso, pode-se observar que existe um


____________________________________________________________________________________

34

menor teor de antioxidantes no OGU e no OSM (Tabela 9) o que pode condicionar o tempo

de indução [23].

4.1.3. Determinação da composição em ácidos gordos

A percentagem relativa dos ácidos gordos é apresentada na Tabela 7. Nesta tabela

podem ser comparadas as metodologias utilizadas para a preparação de ésteres metílicos

de ácidos gordos. A transmetilação ácida (utilizando trifluoreto de boro), além de utilizar

reagentes mais tóxicos e levar à presença de artefactos no início da injeção cromatográfica,

mostrou também ser uma metodologia mais morosa, obtendo-se resultados finais similares

aos obtidos utilizando a transmetilação básica. Por seu lado, a transmetilação básica

permitiu uma preparação mais fácil e rápida. No entanto, a realização dos dois

procedimentos foi importante, uma vez que a transmetilação básica não derivatiza ácidos

gordos livres, podendo interferir no resultado final dos óleos [138].


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35

Tabela 7. Composição de ácidos gordos (% relativa).

OGU OSM OSA

T. Ácida T. Básica T. Ácida T. Básica T. Ácida T. Básica

Ácido Mirístico (C14:0) 0,02 ± 0,00c 0,04 ± 0,00b 0,05 ± 0,00b 0,04 ± 0,00b 0,09 ± 0,01a 0,1 ± 0,00a

Ácido Pentadecanóico (C15:0) - - - 0,02 ± 0,00 - -

Ácido Palmítico (C16:0) 7,17 ± 0,03c 7,13 ± 0,03c 8,58 ± 0,06b 8,55 ± 0,00b 12,2 ± 0,02a 12,15 ± 0,01a

Ácido Palmitoleico (C16:1) 0,09 ± 0,01bc 0,09 ± 0,00b 0,07 ± 0,00c 0,08 ± 0,01bc 0,12 ± 0,01a 0,13 ± 0,00a

Ácido Heptadecanóico (C17:0) 0,06 ± 0,00b 0,06 ± 0,01b 0,05 ± 0,01bc 0,07 ± 0,00a 0,04 ± 0,00c 0,05 ± 0,00bc

Ácido cis-10-Heptadecenóico (C17:1) - - - 0,01 ± 0,00 - -

Ácido Esteárico (C18:0) 4,89 ± 0,01b 4,88 ± 0,00b 4,48 ± 0,03c 4,49 ± 0,00c 5,69 ± 0,02a 5,72 ± 0,00a

Ácido Oleico (C18:1n9c) 18,43 ± 0,12b 18,47 ± 0,01b 14,97 ± 0,06c 14,99 ± 0,00c 29,56 ± 0,01a 29,66 ± 0,02a

Ácido Linoleico (C18:2n6c) 68,75 ± 0,14b 68,65 ± 0,02b 71,44 ± 0,12a 71,25 ± 0,02a 51,46 ± 0,04c 51,35 ± 0,03c

Ácido Araquídico (C20:0) 0,17 ± 0,01b 0,18 ± 0,01b 0,14 ± 0,01c 0,15 ± 0,00c 0,4 ± 0,01a 0,41 ± 0,00a

Ácido α-Linolénico (C18:3n3) 0,29 ± 0,01a 0,29 ± 0,01a 0,18 ± 0,02c 0,18 ± 0,01c 0,24 ± 0,01b 0,23 ± 0,00b

Ácido cis-11-Eicosenóico (C20:1n9) 0,14 ± 0,01b 0,17 ± 0,01a 0,09 ± 0,01cd 0,11 ± 0,00c 0,07 ± 0,01e 0,08 ± 0,00de

Ácido cis-11,14-Eicosadienóico (C20:2)

- 0,02 ± 0,00a - 0,02 ± 0,00b - -

Ácido Behénico (C22:0) - 0,03 ± 0,00b - 0,03 ± 0,00b 0,12 ± 0,00a 0,12 ± 0,00a

Ácidos Gordos Saturados 12,30 12,32 13,28 13,36 18,55 18,55

Ácidos Gordos Monoinsaturados 18,66 18,72 15,09 15,19 29,74 29,87

Ácidos Gordos Polinsaturados 69,04 68,95 71,62 71,45 51,70 51,58

Ácidos Gordos Insaturados 87,70 87,68 86,72 86,64 81,45 81,45

Resultados expressos como média ± desvio padrão (n=4). Letras diferentes em cada linha significam diferenças significativas (p<0,05). OGU: óleo de grainha de uva; OSM: óleo de semente de melão; OSA: óleo de semente de abóbora; T. Ácida: transesterificação ácida; T. Básica: transesterificação básica.


____________________________________________________________________________________

36

O ácido gordo maioritário no OSM, OGU e OSA é o acido linoleico (71, 69 e 51%

respetivamente), seguido do ácido oleico. O OSA apresenta um teor de ácido oleico de

aproximadamente 30%, superior ao teor no OGU (18%) e OSM (15%). Além disso, o OSA

apresenta maior percentagem de ácidos gordos saturados, principalmente os ácidos

palmítico (12%) e esteárico (6%), enquanto que as concentrações destes ácidos gordos no

OGU é de 7 e 5% e no OSM é de 9 e 4,5%.

Os valores obtidos para o OGU estão de acordo com o Decreto-Lei n.º 106/2005,

que estabelece limites de 58 e 78% para o ácido linoleico (C18:2n6c) e de 12 e 28% para

o ácido oleico (C18:1n9c) [47]. Outros autores, como Tuberoso et al., Demirtas et al.,

Zielińska et al. e Górnaś et al., reportaram um perfil e percentagem relativa de ácidos

gordos muito similares aos do presente trabalho. Por exemplo, o ácido linoleico (C18:2n6c)

apresentou valores entre 56,4 e 85% [16, 48, 51, 156].

O perfil de ácidos gordos do OSM está próximo aos estudos realizados por Mallek-

Ayadi et al., Górnaś et al., Maran et al., de Melo et al., Azhari et al., da Silva et al. e Petkova

et al. [16, 57, 64, 65, 67, 150, 157]. No presente estudo, é possível observar uma maior

percentagem relativa de ácido linoleico (C18:2n6c) em comparação com a bibliografia

consultada (que oscila entre 45 e 69%) e menor percentagem de ácido oleico (C18:1n9c)

(cujos valores variam entre 19 e 31%).

Relativamente ao perfil de ácidos gordos do OSA, este está dentro do intervalo de

resultados obtidos por Tuberoso et al., Zielińska et al., Murkovic et al. e Gohari Ardabili et

al. [48, 98, 156, 158]. Estes estudos reportam percentagens relativas de ácido esteárico

(C18:0) entre 3,1 e 7,4%, de ácido palmítico (C16:0) entre 8 e 14,5%, de ácido oleico

(C18:1n9c) entre 21 e 46,9% e de ácido linoleico (C18:2n6c) entre 35,6 e 60,8%.

Os óleos vegetais estudados apresentam uma maior percentagem de AGPI, a

forma de ácidos gordos mais suscetível à oxidação devido à presença de ligações duplas

[159]. O ácido oleico (C18:1n9c) (ácido gordo maioritário no azeite), por ter uma única

ligação dupla na sua estrutura química, pode ter influência positiva na estabilidade

oxidativa dos óleos, principalmente quando associado à presença de tocoferóis, como o α-

tocoferol [160, 161]. Por seu lado, o ácido linoleico (C18:2n6c) possui baixa estabilidade

oxidativa devido às duas ligações duplas mais propensas à oxidação, o que promove a

rancificação oxidativa dos óleos [162]. As amostras com alta concentração de ácido

linoleico e baixa concentração de ácido oleico têm menor estabilidade oxidativa e,

consequentemente, menor tempo de indução. Da mesma forma, ao igualar-se as

concentrações destes ácidos gordos, a sua estabilidade é melhor e o tempo de indução

maior [98]. Além disso, é possível observar uma maior percentagem de ácido oleico

(C18:1n9c) no OSA, que se reflete num maior tempo de indução (Figura 22). Também pode


____________________________________________________________________________________

37

ser observada uma menor percentagem de ácido oleico em OGU e OSM, resultando em

uma menor estabilidade oxidativa (Figura 22).

Figura 22. Proporção de ácidos gordos em % relativa e relação com tempo de indução. OGU: óleo de grainha de uva; OSM: óleo de semente de melão; OSA: óleo de semente de abóbora; AGS:

ácidos gordos saturados; AGI: ácidos gordos insaturados

4.1.4. Determinação do perfil da Vitamina E

Na Tabela 8 são apresentados os vitâmeros de vitamina E determinados neste

estudo. Os 8 vitâmeros (α, β, γ e δ – tocoferol e α, β, γ e δ – tocotrienol) possuem ação

antioxidante, neutralizando espécies reativas de oxigénio (ERO) e a peroxidação lipídica,

protegendo principalmente as ligações duplas dos ácidos gordos polinsaturados [163-165].

Apesar de todos os tocoferóis e tocotrienóis apresentarem atividade antioxidante, a forma

mais ativa e presente no metabolismo humano é o α-tocoferol [166]. No entanto, o γ-

tocoferol é muitas vezes o vitâmero maioritário nas sementes vegetais e derivados, devido

à sua biossíntese [164]. Na realidade, o α-tocoferol acumula-se maioritariamente nos

tecidos fotossintéticos e as formas intermediárias de biossíntese da vitamina E (δ, γ e β –

tocoferóis) são retidas em maiores concentrações nas sementes e outros tecidos não

fotossintéticos [163, 164, 166]. Este fenómeno pode ser observado nos óleos de semente

de melão e abóbora, os quais possuem γ-tocoferol como vitâmero maioritário.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

OGU OSM OSA

Ho

ras

% r

ela

tiva

de

áci

do

s go

rdo

s

AGS Ácido Linoleico Ácido Oleico Outros AGI Tempo de indução


____________________________________________________________________________________

38

Tabela 8. Teor de Vitamina E nos óleos de grainha de uva, sementes de melão e abóbora (mg/kg de óleo).

OGU OSM OSA

α – Tocoferol 209,13 ± 2,8a 143,5 ± 9,9c 181,2 ± 5,16b

γ – Tocoferol 14,47 ± 0,36c 438,7 ± 50,49b 702,54 ± 10,82a

δ – Tocoferol - 23,88 ± 1,19a 20,66 ± 0,81b

α – Tocotrienol 107,1 ± 3,78a 21,79 ± 0,82c 54,04 ± 1,01b

γ – Tocotrienol 113,86 ± 3,95a - -

β – Tocotrienol - 15,25 ± 0,9b 54,5 ± 3,47a

Tocoferóis totais 223,6 606,08 904,4

Tocotrienóis totais 220,95 37,05 108,53

Vitamina E Total 444,55 643,13 1012,93

Resultados expressos como média ± desvio padrão (n=4). Letras diferentes em cada linha significam diferenças significativas (p<0,05). OGU: óleo de grainha de uva; OSM: óleo de semente de melão; OSA: óleo de semente de abóbora.

O OSA possui um teor de vitamina E total de 1 g/kg, seguido do OSM (643 mg/kg)

e OGU (444 mg/kg). O OGU é o óleo com maior teor de α-tocoferol e α-tocotrienol (209 e

107 mg/kg, respetivamente), além de ser o único onde o γ-tocotrienol foi detetado (114

mg/kg). O OSA apresenta a maior concentração de β-tocotrienol (54,5 mg/kg)

comparativamente a OSM (15 mg/kg) e γ-tocoferol (702,5 mg/kg), seguido de 438,7 mg/kg

em OSM e 14 mg/kg em OGU. De facto, OSA é o óleo com maior teor de vitamina E total

entre os óleos estudados. O OSM tem os menores teores de α-tocoferol (143,5 mg/kg), α-

tocotrienol (21,8 mg/kg), β-tocotrienol (15,3 mg/kg) e tocotrienóis totais (37 mg/kg) quando

comparados com OGU e OSA, tendo apenas a maior concentração de δ-tocoferol (24

mg/kg, contra 20,7 mg/kg do OSA).

Os resultados obtidos para os vitâmeros α-tocoferol, γ-tocoferol, γ-tocotrienol no

OGU analisado neste estudo estão de acordo com os obtidos por Demirtas et al.: α-

tocoferol: 77 - 257 mg/kg; γ-tocoferol: 0 - 48 mg/kg; e γ-tocotrienol: 74 - 322 mg/kg [51]. No

entanto, o teor de α-tocotrienol em Demirtas et al. é superior (137 a 264 mg/kg),

representando uma maior concentração de tocotrienóis totais (251 a 468 mg/kg) [51].

A concentração de α-tocoferol do OSM é superior aos teores reportados por Mallek-

Ayadi et al., Rabadán et al., Azhari et al. e da Silva et al. que obtiveram, entre diferentes

variedades de melão, teores compreendidos entre 20 - 74 mg/kg [57, 66, 150, 157]. Neste

trabalho, o teor de γ-tocoferol do OSM (438,7 mg/kg) está acima do obtido por Azhari et

al., da Silva et al., e Mallek-Ayadi et al. (131 a 249 mg/kg), e corresponde aos teores obtidos


____________________________________________________________________________________

39

por Rabadán et al. (100 a 460 mg/kg) [57, 66, 150, 157]. Dos vitâmeros minoritários,

Rabadán et al. detetaram δ-tocoferol e β-tocotrienol (concentrações não indicadas) e

Mallek-Ayadi et al. reportaram 60,9 mg/kg de δ-tocoferol, um teor superior ao encontrado

neste trabalho (23,9 mg/kg) [57, 66].

Estudos realizados com OSA do sudeste europeu por Gorjanović et al. e por

Murkovic et al. apresentaram concentrações entre 16,7 e 78,7 mg/kg para o α–tocoferol e

entre 52,3 e 644 mg/kg para o γ–tocoferol, valores inferiores aos encontrados no presente

estudo [98, 99]. Murkovic et al. ainda detetou γ-tocotrienol (21,3 a 145 mg/kg), o que não

ocorreu neste trabalho [98]. Ainda, o mesmo autor obteve menores teores de α–tocotrienol

(2,3 a 15,5 mg/kg) em relação ao presente trabalho [98].

Conforme sugerido por Przybylski et al., o α-tocoferol tem um efeito antioxidante

inferior ao γ-tocoferol, principalmente quando presente em altas concentrações [167]. O

excesso de α-tocoferol é oxidado a temperaturas próximas dos 45 °C e os seus radicais

agem como iniciadores da degradação do óleo. O mesmo não acontece com o γ-tocoferol,

no qual se constata que quanto maior a concentração, maior a proteção antioxidante,

mesmo a temperaturas mais altas (65 °C) [167]. Este fator pode refletir-se nos resultados

da estabilidade oxidativa e atividade antioxidante dos óleos estudados, uma vez que o OSA

é o óleo com maior concentração de γ-tocoferol. Além disso, a concentração deste vitâmero

e da vitamina E total em OSA mostra potencial resistência para a produção do batom e

posterior estabilidade do produto, em comparação aos outros óleos.

4.1.5. Determinação do teor de clorofilas e carotenoides, compostos fenólicos,

flavonoides e atividade antioxidante (inibição do DPPH• e FRAP)

Os resultados obtidos para a determinação de clorofilas, carotenoides, CFT, FT e

atividade antioxidante estão apresentados na Tabela 9.

As clorofilas são responsáveis por conferir coloração esverdeada, enquanto os

carotenoides contribuem para a cor amarela, vermelha ou laranja [168]. Ao comparar os

valores obtidos para OGU e OSM, é possível observar que a concentração de clorofila é

superior no OGU, o que pode justificar a tonalidade verde (Tabela 6). OSM possui maior

concentração de carotenoides do que de clorofilas, o que fundamenta sua coloração

amarela. Segundo Fruhwirth et al., a coloração verde-escura do OSA da região da Estíria

ocorre devido à grande presença de compostos tetrapirrólicos como protoclorofilas (a e b)

e protofeofitinas (a e b) [91]. Em comparação com o OGU e OSM, o OSA possui uma

concentração superior de carotenoides, que conferem a pigmentação amarela, ainda que

esta cor seja apenas visível em baixas quantidades de óleo.


____________________________________________________________________________________

40

Tabela 9. Teores de clorofilas, carotenoides, compostos fenólicos totais (CFT), flavonoides totais (FT) e atividade antioxidante (DPPH e FRAP).

OGU OSM OSA

Clorofilas

(mg/kg óleo)

0,41 ± 0,01b 0,13 ± 0,01c 1,6 ± 0,05a

Carotenoides

(mg/kg óleo)

0,14 ± 0,00b 0,17 ± 0,01b 13,65 ± 0,31a

CFT

(mg EAG/kg óleo)

7,68 ± 0,48c 14,48 ± 0,44b 35,5 ± 2,17a

FT

(mg EC/kg óleo)

1,12 ± 0,15c 2,89 ± 0,12b 16,14 ± 0,64a

DPPH

(μmol Trolox/kg óleo)

45,59 ± 4,97b 20,93± 1,54c 67,04± 6,66a

FRAP

(μmol ESF/kg óleo)

186,86 ± 2,44c 278,59 ± 22,43b 879,87 ± 56,48a

Resultados expressos como média ± desvio padrão (n=3). Letras diferentes para cada linha significam diferenças significativas (p<0,05). OGU: óleo de grainha de uva; OSM: óleo de semente de melão; OSA: óleo de semente de abóbora; CFT: teor de compostos fenólicos totais; FT: teor de flavonoides totais; EAG: equivalentes de ácido gálhico; EC: equivalentes de catequina; ESF: equivalentes de sulfato ferroso.

Ben Mohamed et al. obtiveram teores de clorofilas entre 1 e 3,8 mg/kg e de

carotenoides entre 2,6 e 4,8 mg/kg de OGU, apresentando valores mais altos que os deste

estudo [137]. No estudo feito por Shinagawa et al. verificou-se que as amostras de OGU

utilizadas possuíam maior concentração de carotenoides que clorofilas, tendo obtido

valores de a* com menor coloração verde que as deste estudo (entre -0,28 e -1,11) e

correlacionado fortemente os carotenoides com o componente b*, que confere a cor

amarela [149]. Este fator apoia os resultados obtidos neste trabalho, em que foram

encontrados valores de a* mais próximos do verde (-5,4) e maior proporção de clorofilas

do que carotenoides. Ainda, Tuberoso et al. avaliaram amostras de OGU e obtiveram

teores de clorofilas de 8,4 mg/kg de óleo e de β-caroteno de 0,2 mg/kg de óleo, sendo que

a presença de carotenoides relaciona-se com valores superiores de b*, enquanto a* está

correlacionada com a presença de clorofilas [48].

Por outro lado, poucos estudos foram encontrados em relação ao teor de clorofilas

e carotenoides em OSM e OSA. Da Silva et al. estudaram o OSM obtendo 6,3 mg/kg de

óleo de carotenoides totais, enquanto ensaios realizados com OSA por Tuberoso et al.

reportaram valores de clorofilas de 30,8 mg/kg de óleo e de β-caroteno de 5,5 mg/kg de

óleo [48, 157].


____________________________________________________________________________________

41

Os teores de CFT no OGU e no OSM são diferentes dos obtidos por outros autores

[50, 57]. Num ensaio realizado por Karaman et al., o OGU apresentou um valor de CFT de

123 mg EAG/100 g [50]. Por outro lado, foi reportado 304,1 mg EAG/100 g de OSM [57].

Ambos os resultados foram superiores aos obtidos no presente estudo. Os resultados

obtidos para o OSA estão de acordo com um estudo realizado por Andjelkovic et al. (24,7

- 50,9 mg EAG/kg de óleo) [154]. Karaman et al. obtiveram para o OGU um teor de FT de

108 mg EC/100 g de óleo, enquanto Mallek-Ayadi et al. reportaram um teor de flavonoides

de OSM de 87,52 mg EQ/100 g [50, 57].

Melo et al. definiram que a % de inibição de DPPH• abaixo de 50% é considerada

como baixa atividade antioxidante [169]. De acordo com este critério, os óleos analisados

no presente estudo apresentam baixa atividade antioxidante (OGU:14,4%; OSM: 12,3%; e

OSA: 17% de inibição). Um estudo realizado por Codină et al. reportou uma % de inibição

de 32,39% para o OGU, enquanto Andjelkovic et al. obtiveram valores entre 32 e 62% de

inibição para o OSA [154, 170]. Da mesma forma, Gorjanović et al. reportaram uma % de

inibição entre 38,25 e 57,39% para as diferentes variedades de OSA. Azhari et al.

determinaram para o OSM um valor de IC50 de 25,25 mg/mL, cerca de 44% inferior ao ácido

ascórbico (IC50 de 14,05 mg/mL) [99, 150].

Relativamente ao ensaio FRAP, Doshi et al. obtiveram valores entre 47,1 e 134,8

mM EQ/mL de extrato de duas diferentes variedades de V. vinifera [171]. Para OSM, da

Silva et al. reportaram 127,7 μmol ESF/100 g de óleo, enquanto Peiretti et al. determinou

um valor de 5,4 μmol ESF/g em extratos de C. pepo [157, 172].

Comparando os óleos estudados, pode ser notado que o OGU e o OSM obtiveram

resultados inferiores ao OSA nos teores de clorofilas, carotenoides, estabilidade oxidativa,

vitamina E total, CFT, FT e atividade antioxidante. A forma de tratamento e produção do

OSA, bem como o processo de torra das sementes que precedem a extração deste óleo,

o qual é o único que não é proveniente de um subproduto da indústria agroalimentar, pode

ter uma influência positiva na sua qualidade [91]. Além disso, compostos como os

carotenoides podem ser eluídos no solvente extrator, tendo impacto na determinação

espectrofotométrica dos CFT [154].

Neste trabalho, optou-se por realizar a extração dos CFT com base em estudos

previamente realizados em óleo de grainha de uva e azeite. Assim, a extração dos CFT foi

efetuada utilizando como solvente uma solução metanol/água (80:20, v/v). No entanto e

considerando os resultados obtidos, outras proporções poderiam ser testadas (por

exemplo, 60:40 ou 50/50, v/v) de forma a otimizar o processo de extração. Ainda, poderia

ser adicionado um outro ciclo de extração ao procedimento. Ademais, a eficácia de

extração de outros solventes (por exemplo, etanol) poderia ser também avaliada.


____________________________________________________________________________________

42

Vários fatores podem condicionar os resultados obtidos em OGU e OSM, como a

variedade e origem do fruto, as condições edafoclimáticas e as condições de

armazenamento da amostra. De facto, em alguns estudos consultados e citados neste

trabalho a amostra de OGU é preparada diretamente no laboratório procedendo-se à

remoção da grainha da uva, extração do óleo e análises em condições laboratoriais

controladas prevenindo todos os efeitos com impacto negativo na qualidade do óleo. Neste

estudo, as grainhas de uva que deram origem ao óleo, encontravam-se em condições reais

numa indústria (destilaria), estando sujeitas tanto às condições ambientais como também

à morosidade expectável que ocorre entre a colheita das uvas, produção do vinho,

transporte do bagaço da uva para a destilaria, separação e remoção das grainhas de uva,

corte da grainha e extração do óleo. Desta forma, a composição química do óleo poderá

ficar comprometida. O OGU é um óleo refinado e não bruto, o que poderá também

contribuir para a perda de alguns compostos bioativos. É importante realçar que a utilização

de ingredientes derivados de subprodutos da industria agroalimentar e sujeitos às

condições atrás referidas poderão ser a matéria-prima válida a ser utilizada. No entanto,

outros estudos poderão ainda ser realizados considerando, por exemplo, a mesma matéria-

prima, mas não submetida ao processo de refinação de forma a compreender se para o

desenvolvimento de produtos cosméticos, esta será uma mais valia.

4.2. Caracterização química do batom

Considerando os resultados obtidos para os óleos, o OSA foi selecionado para ser

utilizado na formulação do batom. Este óleo apresentou uma boa relação entre AGPI e

AGS e melhores resultados na estabilidade oxidativa, CFT, FT, vitamina E e atividade

antioxidante, apresentando um perfil mais adequado ao objetivo deste estudo.

Após a preparação e solidificação do batom nos moldes, observou-se uma boa

consistência, sendo de fácil aplicação e aderência adequada aos lábios. O batom tinha

uma coloração verde escura e opaca (Figura 23). No entanto, não ocorreu transferência de

cor para os lábios, quando da sua aplicação. O aroma assemelhou-se ao de nozes, como

já descrito no óleo.


____________________________________________________________________________________

43

Figura 23. Batom desenvolvido com óleo de sementes de abóbora.

4.3. Ensaios de estabilidade acelerada

Os ensaios de estabilidade são importantes no processo de desenvolvimento de

um produto cosmético, uma vez que é através destes que é possível avaliar o período de

tempo que o produto é capaz de manter as suas propriedades químicas, físicas,

microbiológicas e toxicológicas [173]. Trata-se de um procedimento preditivo, em que o

comportamento do produto é avaliado em diferentes condições ambientais que visam

acelerar possíveis alterações que possam ocorrer numa situação real [173]. A estabilidade

em tempo real é realizada à temperatura ambiente (25 ± 2 °C) e com uma HR de 60 ± 5%,

enquanto a estabilidade acelerada se efetua em condições de armazenamento de 40 ± 2

°C e HR de 75 ± 5% [174].

As alterações físicas podem ser avaliadas através das características organoléticas

(aspeto, cor e odor), ensaios de dureza e massa média do produto, enquanto as alterações

químicas correspondem ao doseamento das substâncias químicas presentes (por

exemplo, os compostos antioxidantes) [174].

Em relação às alterações físicas, não se verificaram diferenças significativas na

média das massas (a qual se manteve nos 12,34 ± 0,03 g nos diferentes tempos) bem

como no odor dos batons produzidos após 30 dias de armazenamento, independentemente

da temperatura (20 ou 40 °C). As amostras mantiveram a uniformidade, sem apresentar,

por exemplo, gotículas de óleo à superfície, como aconteceu no estudo realizado por

McIntosh et al., indicando a compatibilidade entre os ingredientes da fórmula [175]. Os


____________________________________________________________________________________

44

subcapítulos seguintes apresentam outras alterações físicas e químicas analisadas neste

estudo.


Na Figura 24 pode-se observar a diferença de cor entre as duas amostras

armazenadas a 20 e a 40 ºC. A amostra armazenada a 40 °C (B) apresenta um fundo mais

castanho, enquanto a amostra armazenada a 20 °C (A) mantêm o fundo esverdeado

quando comparada à amostra no tempo 0.

Figura 24. Batons após estabilidade a 20 °C (A) e estabilidade acelerada a 40 °C (B).

De facto, os resultados do colorímetro-espectrofotómetro apresentados na Tabela

10 mostram que a amostra inicial (Figura 23) apresenta valores superiores dos

componentes h° e b*, conferindo ao batom uma maior tonalidade amarela, enquanto a

amostra armazenada a 40 °C (Figura 24-B) obteve o menor grau de tonalidade (h°) e um

valor de eixo a* mais positivo, o que corresponde a uma maior coloração vermelha e

castanha. Por seu lado, a amostra armazenada a 20 °C (Figura 24-A) apresenta valores

medianos em relação às outras amostras, com exceção de L*, apresentando-se como a

amostra com maior luminosidade.

Tabela 10. Parâmetros de cor (L*, a* e b*) do batom obtidos ao tempo 0 e após 30 dias de armazenamento a 20 ºC/65% HR e 40 ºC/75% HR.

T0 T30

20 °C/65% HR 40 °C/75% HR

L* 25,26 ± 0,08c 27,45 ± 0,06a 26,76 ± 0,08b

a* 6,46 ± 0,2c 7,91 ± 0,01b 9,97 ± 0,07a

b* 8,87 ± 0,17a 7,49 ± 0,07c 7,82 ± 0,08b

C* 10,97 ± 0,25b 10,89 ± 0,05b 12,67 ± 0,07a

h° 53,96 ± 0,36a 43,42 ± 0,29b 38,13 ± 0,37c

Resultados expressos como média ±desvio padrão (n=3). Letras diferentes em cada linha significam diferenças significativas (p<0,05).

B A


____________________________________________________________________________________

45

4.3.2. Determinação dos teores de compostos fenólicos totais, flavonoides

totais e atividade antioxidante pelos métodos de inibição do DPPH• e

FRAP

Conforme demonstrado na Tabela 11, o tempo e a temperatura após 30 dias de

armazenamento influenciaram o CFT e os FT dos batons, ocorrendo um aumento

significativo (p<0,05) após o período de armazenamento. Este aumento pode ter ocorrido

devido à formação de novos compostos provenientes do processo de degradação do

produto ou de reação com os ingredientes da fórmula. De facto, Ali et al., utilizando um

extrato de planta num teste de estabilidade (durante 180 dias) comprovaram que algumas

amostras tiveram uma elevada variação no CFT, tendo inclusivamente sido detetado um

novo composto fenólico durante este período de tempo (2,4-di-tert-butilfenol) [176]. Os

batons armazenados a 40 °C não obtiveram um aumento tão acentuado como os

armazenados a 20 °C. No entanto, estes valores não foram significativamente diferentes

(p>0,05).

Tabela 11. Teores de compostos fenólicos totais (CFT) e flavonoides totais (FT) e atividade antioxidante (determinada pelo método de inibição do DPPH• e pelo método FRAP) dos batons ao tempo 0 e após 30 dias de armazenamento a 20 °C/65% HR e 40 °C/75% HR.

T0 T30

20 °C/65% HR 40 °C/75% HR

CFT

(mg EAG/g batom)

173,88 ± 30,7b 341,86 ± 98,96a 285 ± 60,61a

FT

(mg EC/g batom)

277,7 ± 0,00b 753,81 ± 83,33a 723,18 ± 62,44a

DPPH

(μmol Trolox/kg batom)

23,33 ± 0,00a 4,88 ± 0,66c 6,90 ± 0,66b

FRAP

(mol ESF/kg batom)

4,2 ± 0,13a 3,65 ± 0,00b 3,49 ± 0,00c

Resultados expressos como média ± desvio padrão (n=3). Letras diferentes em cada linha significam diferenças significativas (p<0,05). EAG: equivalentes de ácido gálhico; EC: equivalentes de catequina; ESF: equivalentes de sulfato ferroso.

Os resultados do CFT obtidos neste trabalho são diferentes aos reportados em dois

estudos em que os autores incorporaram extratos vegetais em cremes. De acordo com os

autores, após 180 dias de armazenamento a 20 ºC/65% HR e 40 °C/75% HR, as amostras

apresentaram valores inferiores de CFT em relação ao tempo 0, independentemente da


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46

temperatura de armazenamento [177, 178]. Além disso, a inibição do DPPH• aumentou nas

amostras a 20 °C/65% HR e diminui nas amostras armazenadas a 40 °C/75% HR [177,

178]. No entanto, os resultados obtidos podem ter sido influenciados pelos ingredientes

contidos na fórmula e ao maior tempo de estabilidade acelerada.

Neste trabalho não foi possível verificar se durante os 30 dias de estabilidade

acelerada o aumento de CFT se deveu à ocorrência de reações entre os compostos

(diminuindo o teor de CFT). Também, será importante considerar que se o período de

tempo do ensaio fosse aumentado (por exemplo, para 180 dias de armazenamento) se

verificaria o aumento de CFT ou se pelo contrário, ocorreria uma redução do teor destes

compostos bioativos. Para isso, seria necessária uma maior duração do ensaio de

estabilidade. Ademais, os ingredientes do batom podem ter reagido entre si e terem sido

formados compostos fenólicos ou não-fenólicos detetáveis no método de Folin-Ciocalteu.

Estes compostos podem não apresentar atividade antioxidante. Também, efeitos

antagónicos entre os compostos bioativos podem explicar a diminuição da atividade

antioxidante no presente trabalho, tanto nos ensaios de inibição do DPPH• como no FRAP.

De facto, o método de Folin-Ciocalteu tem como desvantagem a ausência de

especificidade, ao detetar compostos não-fenólicos, o que pode interferir na correlação

entre CFT e atividade antioxidante. No entanto, este método é simples, rápido e permite

uma rápida avaliação do teor de CFT numa amostra.

Kusuma et al. incorporaram extrato de inhame na formulação de um batom com a

finalidade de dar cor ao produto [179]. O extrato foi utilizado em concentrações entre 15 e

25%, tendo sido obtidos menores valores de inibição do DPPH• em comparação com os

resultados do extrato de inhame [179]. O mesmo pode ser observado no presente trabalho.

De facto, as amostras de óleo e batom não são totalmente comparáveis, devido à presença

de outros ingredientes na formulação, o que pode interferir na funcionalidade do óleo. Os

polifenóis presentes na cera de abelha e o aquecimento dos ingredientes durante a

preparação são outros fatores com impacto no teor de compostos bioativos no produto

final. Assim, para melhor clarificar as possíveis reações ocorridas durante os testes de

estabilidade, a determinação de CFT, FT e a atividade antioxidante poderão ser

determinados, previamente, em cada um dos demais ingredientes da fórmula do batom,

principalmente naqueles que poderão ter um maior impacto na composição química final.

Ainda, os compostos fenólicos poderão ser identificados e quantificados através de HPLC-

DAD-MS (método com maior especificidade) para melhor compreensão das reações

ocorridas durante o armazenamento.


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47

4.3.3. Determinação da dureza

A avaliação da dureza (Figura 25) permitiu observar que inicialmente as amostras

do batom comercial apresentaram maior dureza do que o batom preparado. Após 30 dias

de armazenamento verificou-se que nas amostras armazenadas a 40 °C/75% HR o valor

da dureza diminuiu, enquanto nas amostras armazenadas a 20 °C/65% HR não foram

observadas diferenças significativas em relação ao tempo 0 (p>0,05). Pelo contrário, no

caso do batom comercial, a dureza determinada foi significativamente diferente ao tempo

0 e 30, a ambas as temperaturas (p<0,05). A adesividade apresentada no texturómetro foi

desprezível.

Figura 25. Dureza do batom desenvolvido e comparação com o batom comercial. Resultados expressos como média ± desvio padrão (n=5). Batom OSA: Batom preparado com óleo de semente de abóbora; T0: batom analisado no tempo 0; T30; 20°C/65%HR: batom armazenado por 30 dias a 20 °C e 65% de humidade relativa; T30; 40°C/75%HR: batom armazenado por 30 dias a 40 °C e 75% de umidade relativa.

O batom preparado com OSA mostrou não ter muita resistência à temperatura, o

que indica menor estabilidade em relação ao batom comercial. No entanto, este facto pode

ter ocorrido devido ao batom produzido não ter na sua formulação qualquer tipo de aditivo,

como ocorre no batom comercial [180].

Para avaliar a aceitabilidade da dureza e outros parâmetros do batom desenvolvido

como adesividade, espalhabilidade, brilho, etc., pode ser realizada uma análise sensorial

por painel de peritos técnicos e por painel de consumidores.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Batom OSA Batom Comercial

Forç

a M

áxim

a (N

)

T0 T30; 20°C/65%HR T30; 40°C/75%HR


____________________________________________________________________________________

48

Num estudo realizado por Palmeira-de-Oliveira et al., foram desenvolvidas 6

formulações de lápis medicamentoso cuja dureza variou entre <0,6 e 4,7 N [147]. As

amostras com menor dureza (<0,6 N) apresentavam maior concentração de vaselina

branca (30 e 40%). Após os ensaios de estabilidade acelerada, os autores verificaram que

o batom com cera de carnaúba na fórmula manteve-se mais duro, muito provavelmente

devido ao alto ponto de fusão deste composto [147]. Por outro lado, Kasparaviciene et al.

verificaram que uma maior concentração de cera de abelha nas formulações tem maior

correlação com a dureza dos batons desenvolvidos do que a concentração de óleo

utilizado, neste caso uma mistura de OGU com óleo de espinheiro amarelo [181].

Posteriormente, considerando os resultados obtidos pelo painel de análise

sensorial, os fatores acima descritos poderão ser reavaliados e realizados ajustamentos

nas formulações do batom, passando por exemplo, pela adição ou substituição de um

ingrediente ou mudança nas suas proporções. O melhoramento da formulação

desenvolvida neste trabalho pode passar por uma menor concentração de vaselina, de

forma a obter uma maior dureza do batom.


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49

5. Conclusão

Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma fórmula cosmética de batom

utilizando um óleo vegetal como ingrediente ativo. Para isso, a primeira etapa do trabalho

consistiu em analisar o OGU, o OSM e o OSA, de modo a selecionar o mais indicado para

formular o batom.

O OGU e o OSM apresentaram teores inferiores de clorofilas e carotenoides totais,

bem como de vitamina E, CFT, FT e atividade antioxidante relativamente ao OSA. A

estabilidade oxidativa deste óleo foi também superior ao OGU e ao OSM. O facto do OSA

ter sido utilizado neste estudo para o desenvolvimento do batom não significa que a

utilização dos outros dois óleos nesta formulação seja impossibilitada. No entanto, é

provável que os resultados obtidos seriam proporcionalmente inferiores. Além disso, é

possível constatar que os baixos resultados do OGU, principalmente quando comparados

com outros estudos, possam ter ocorrido devido à refinação do óleo.

O batom desenvolvido era um produto uniforme, com boa textura e aroma. Durante

os testes de estabilidade acelerada foram verificadas pequenas modificações de textura

nas amostras armazenadas a 20 °C/65% HR quando comparadas com o batom comercial

testado, bem como variações significativas para a amostra armazenada a 40 °C/75% HR.

Verificaram-se ainda modificações na cor, bem como um aumento dos CFT e diminuição

da atividade antioxidante durante os testes de estabilidade a 20 °C/65% HR e 40 °C/75%

HR.

O estudo e desenvolvimento de novos produtos cosméticos à base de óleos

vegetais, entre outros extratos naturais, é de grande interesse para a indústria cosmética,

uma vez que há atualmente uma tendência crescente por parte dos consumidores para

reduzir os ingredientes sintéticos das formulações, substituindo-os por produtos naturais e

de origem sustentável. Além disso, a aplicação destes ingredientes numa fórmula de batom

resulta numa boa opção de estudo, uma vez que é um produto cosmético de produção

simples e com larga utilização pelos consumidores.

5.1. Perspetivas para o futuro

Futuramente podem ser realizados outros testes para a formulação desenvolvida,

nomeadamente uma análise sensorial do produto e um teste de hidratação com biometria

cutânea. Existe igualmente a possibilidade de incorporação de corantes no batom com o

objetivo de colorir os lábios. Ainda, o batom pode ter a sua fórmula adaptada a outros tipos


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50

de óleos vegetais, realizando os mesmos testes aqui propostos para comparação dos

resultados.

Finalmente, podem ser identificados e quantificados os compostos fenólicos nas

amostras de batom ao tempo 0 e após armazenamento a diferentes temperaturas por

HPLC-DAD-MS, para uma melhor compreensão dos resultados obtidos para a atividade

antioxidante.


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51

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