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  • CNPEM | LNLS CTBE LNBio LNNano

    Caracterizao molecular e fenotpica de

    plantas transgnicas de citros visando resistncia Xanthomonas citri.

    Bolsista Jlio Csar Gomes de Sousa Filho.

    Estudante de Biotecnologia da Universidade Federal de So Carlos.

    Orientador Dr. Celso Eduardo Benedetti / LNBio.

  • 2

    Caracterizao molecular e fenotpica de

    plantas transgnicas de citros visando resistncia Xanthomonas citri.

    Bolsista Jlio Csar Gomes de Sousa Filho.

    Estudante de Biotecnologia da Universidade Federal de So Carlos.

    Orientador Dr. Celso Eduardo Benedetti / LNBio.

    Campinas, 2012.

  • 3

    We keep moving forward, opening new doors, and doing new

    things, because we're curious and curiosity keeps leading us down new

    paths.

    Walter Elias Walt Disney

  • 4

    AGRADECIMENTOS

    minha Famlia que sempre me apoiou e comemorou minhas conquistas, incluindo essa to

    importante;

    Ao CNPEM/ABTLuS pela realizao do programa que me permitiu desenvolvimento cientfico

    e pessoal de imensa valia;

    Ao Roberto (Patriarca dos Teis) e a querida e doce Tati pela organizao e coordenao do

    programa, estando sempre disponveis para ajudar e nos divertindo sempre. Muito Obrigado!

    Ao Celso Benedetti pela oportunidade, pela escolha, por dedicar parte do seu tempo minha

    orientao, pela ateno e pela grande contribuio ao desenvolvimento cientfico. Muito Obrigado!

    Bruna por sempre me acompanhar na bancada, nas risadas, nos almoos e nas conversas

    sobre Walt Disney World. Malu pelas boas risadas, preciosas dicas e por ceder o clone da protena

    WRKY bem como as plantas transformadas que foram a base do trabalho realizado. Adriana pelas

    ajudas, helps quase constantes, bons toques, diverses, almoos, salvamentos para que no

    perdesse o nibus, pela MEGA ajuda na extrao de RNA e na entrega deste relatrio. Jaque pelas

    dicas, broncas, diverso constante, pelo emprstimo de seu cavalo de fogo, por conseguir uma

    membrana de PVDF em tempo recorde e por receber algumas broncas em nome do Jlio do LPP.

    Mariane pelas dicas, protocolos, risadas, almoos, ajuda na reviso deste trabalho. Caio pela

    companhia em experimentos, pelas discusses cientficas, pelo incentivo, almoos e risadas. Vocs

    do LPP foram essenciais. Muito Obrigado!

    Aos funcionrios do CNPEM e membros do LNBio pela receptividade e auxlio dispensados

    sempre que preciso. Cito aqui alguns como: Cris do ABC que me salvou uma noite e deu preciosas

    dicas, Rosngela da biblioteca, Cludia e Di da lavagem, e Priscila do LMA.

    Aos professores doutores Dulce Helena, Iran Malavazi, Andrea Fuentes, Anderson Cunha e

    Mnica Rosas, por me apresentarem o mundo cientfico. Como j dito a alguns de vocs, sem vocs

    eu no estaria aqui. Muito Obrigado!

    Aos bons amigos, Marina Salles, Ktia, Carol, Adriano, Henry, Heber e Dani por estimularem

    meus passos acadmicos e por compartilharem comigo bons momentos. Muito Obrigado!

    Agradeo especialmente Juliana Poltronieri, que me acompanhou at nessa boa aventura.

    Aos Bolsistas, um a um, pela companhia, risadas, almoos, passeios e troca de experincia

    incrvel. Em especial aos companheiros de LNBio: Andrea, Mariana, Vincius e Felipe. Muito

    Obrigado!

    A todos que contriburam direta ou indiretamente para a realizao deste trabalho.

    Muito Obrigado!

  • 5

    RESUMO

    O Cancro Ctrico, causado por Xanthomonas citri uma doena bacteriana que afeta a

    maioria das variedades comerciais de citros levando a perdas econmicas. Buscando produzir

    plantas de citros resistentes X. citri nosso laboratrio est desenvolvendo linhagens

    transgnicas para porta-enxertos e variedades copa de citros. Baseado em uma anlise de

    expresso gnica em larga escala realizada pelo grupo anteriormente, duas estratgias para a

    produo de plantas de citros resistente X. citri esto sendo utilizadas. A primeira envolve a

    super expresso de um fator de transcrio WRKY conhecido por regular resposta de defesa

    basal em plantas. A segunda estratgia envolve a expresso de efetor bacteriano ativador de

    transcrio do tipo III, ou efetor TAL, o qual age como modulador da expresso gnica no

    hospedeiro. A expresso dos transgenes ser avaliada por PCR e Western Blot. Plantas

    transformadas foram desafiadas com X. citri para o desenvolvimento dos sintomas do cancro,

    que so caracterizados pela formao de pstulas na superfcie da folha. Os nveis de expresso

    de alguns genes de defesa que so alvos dos efetores de Xanthomonas tambm sero

    avaliados nos transgenes.

    Palavras Chave: Xanthomonas citri, efetores TAL, WRKY

    ABSTRACT

    Citrus canker, caused by Xanthomonas citri, is a bacterial disease that affects most of the

    commercial citrus varieties leading to economic losses. With the aim of producing citrus plants

    resistant to X. citri our laboratory is developing transgenic lines for citrus rootstock and scion

    varieties. Based on a large scale gene expression analysis undertaken by the group previously,

    two strategies for the production of citrus plants resistant to X. citri are being used. The first

    involves the overexpression of a WRKY transcription factor known to regulate basal defense

    responses in plants. The second strategy involves the expression of a bacterial type III

    transcription activator effector, or TAL effector, which acts as a modulator of gene expression in

    the host. The expression of the transgenes will be evaluated by PCR and Western blot analysis.

    Transformed plants were challenged with X. citri for the development of canker symptoms, which

    are characterized by the formation of raised pustules on the leaf surface. The expression levels of

    a number of defense-related genes as direct targets of the Xanthomonas TAL effector will also be

    examined in the transgenes.

    Keywords: Xanthomonas citri, TAL effectors, WRKY.

  • 6

    SUMRIO

    LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 7

    1 REVISO DE LITERATURA ................................................................................... 8

    O cancro ctrico .................................................................................................... 8

    Interao Planta Patgeno .................................................................................. 9

    Efetores TAL ...................................................................................................... 10

    Fatores de transcrio do tipo WRKY ................................................................. 11

    Estratgias para obteno de plantas resistentes ao cancro ctrico. .................. 12

    2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 13

    3 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 13

    Deteco de plantas geneticamente modificadas por PCR.. .............................. 13

    Subclonagem, expresso e purificao do fator de transcrio do tipo WRKY. . 14

    Anlise da expresso dos transgenes. ............................................................... 16

    Avaliao dos nveis transcricionais de genes de interesse. .............................. 18

    Desafio das plantas com Xanthomonas citri e avaliao fenotpica ................... 19

    4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 20

    Deteco de plantas geneticamente modificadas por PCR.. .............................. 20

    Subclonagem, expresso e purificao do fator de transcrio do tipo WRKY. . 23

    Anlise da expresso dos transgenes.. .............................................................. 25

    Avaliao dos nveis transcricionais de genes de interesse. .............................. 29

    5 CONCLUSO E PERSPECTIVAS ....................................................................... 30

    6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 31

  • 7

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1: Leses caractersticas do Cancro Ctrico em frutos e folhas. .................................. 8

    Figura 2 - Esquematizao de um efetor TAL.. .................................................................... 10

    Figura 3 - Representao dos aminocidos da poro N-terminal de um fator WRKY de

    Arabdopsis thaliana ........................................................................................................... 122

    Figura 4A Eletroforese em gel de agarose 1% de extraes de DNA por metodologia

    convencional (CTAB). 4B -Eletroforese em gel de agarose 1% de extraes de DNA por

    metodologia convencional tratadas com RNAse Mix (Fermentas) ....................................... 20

    Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR para detectar plantas

    transformadas com efetores TAL. ..................................................................................... 21

    Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR para detectar plantas

    transformadas com efetores TAL/ Platinum Taq Polimerase (Invitrogen) e DNA tratado com

    RNAse.. ............................................................................................................................... 22

    Figura 7 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR de Gradiente de

    temperatura para otimizar a PCR para amplificao dos efetores TAL em plantas

    trasnformadas. ..................................................................................................................... 22

    Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose 1% de PCR para identificao de plantas

    transformadas com efetores TAL nas condies otimizadas ................................................ 23

    Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose 1% de digestes para subclonagem. ................. 23

    Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose 1% de PCR de colnias de E.Coli DH5

    transformadas com a construo pET28a/WRKY. ............................................................... 24

    Figura 11 - Anlise da expresso e purificao da protena WRKY em E. Coli BL21 (DE3)

    por SDS-PAGE 13%. ........................................................................................................... 25

    Figura 12 Anlise da extrao de protenas totais de folhas transformadas por SDS-PAGE

    10% e 13%. ......................................................................................................................... 26

    Figura 13 Western Blot das protenas de interesse em plantas transformadas. ................ 26

    Figura 14 Western Blot para avaliao de alquotas de anticorpo anti-PthA disponveis.. 27

    Figura 15 Western Blot para teste de deteco de anticorpo anti-WRKY. ......................... 27

    Figura 16 - Correlao entre Western Blot de plantas transformadas com fator WRKY e

    fentipo das plantas desafiadas com X. citri ..................................................................... 28

    Figura 17 Correlao entre Western Blot de plantas transformadas com fator WRKY e

    fentipo das plantas desafiadas com X. citri .................................................................... 29

    Figura 18 Eletroforese de RNA em gel de agarose 1% desnaturante.. ............................. 30

  • 8

    1 REVISO DE LITERATURA

    O Cancro Ctrico

    O setor da citricultura um dos mais expressivos dentro do agronegcio no

    Brasil: suas exportaes renderam, em 2009, 2,15 milhes de toneladas de

    produtos e US$ 1,84 bilho em receita, representando cerca de 3% das exportaes

    do agronegcio do pas (NEVES et al., 2009).

    Uma das maiores ameaas citricultura o Cancro Ctrico, causado por duas

    linhagens de bactrias gram-negativas do gnero Xanthomonas: Xanthomonas citri

    (Xac) e Xanthomonas aurantifolii (Xaa). Os dois grupos causam sintomas bem

    parecidos em seus hospedeiros, sugerindo um mecanismo comum de

    patogenicidade (BRUNINGS; GABRIEL, 2003).

    Os sintomas mais evidentes do cancro so decorrentes de hiperplasia (aumento

    da diviso celular) e hipertrofia (aumento do volume celular), desencadeadas pelo

    patgeno ao alterar a transcrio de alguns genes do hospedeiro (CERNADAS et

    al., 2008), levando formao de leses circulares, inchadas e encharcadas nas

    folhas, frutos e galhos. Tecidos jovens como folhas de brotaes e frutos nas

    primeiras fases de crescimento so mais susceptveis a infeco com Xanthomonas

    citri (BRUNINGS & GABRIEL, 2003).

    A entrada da Xanthomonas citri no tecido vegetal ocorre por aberturas como

    estmatos, hidatdios e feridas provocadas por espinhos e/ou larva mineradora dos

    citros. A Xac se instala no mesfilo e em estgio avanado da doena as leses

    podem romper a epiderme liberando bactria no ambiente contribuindo para a

    disseminao, que facilitada por ventos, chuvas, insetos, alm de equipamentos

    de colheita e manuteno das plantas (AMARAL, 2003; BRUNINGS; GABRIEL,

    2003).

    Figura 1: Leses caractersticas do Cancro Ctrico em frutos e folhas.(BRUNINGS & GABRIEL,

    2003).

  • 9

    Trata-se de uma doena economicamente importante e por tal a bactria

    causadora alvo de estudos moleculares buscando desenvolvimento de

    ferramentas para controle desta e/ou produo de plantas resistentes para reduzir

    perdas de produo (AMARAL, 2003).

    Interao Planta - Patgeno.

    As plantas esto constantemente sujeitas a infeco por patgenos. Uma das

    formas de reconhecer e responder a infeco envolve a percepo de padres

    moleculares associados a microrganismos/patgenos (microbial- or pathogen-

    associated molecular patterns ou MAMPs/PAMPs), isto , molculas que so

    conservadas e essenciais (exemplos so: flagelina e lipossacardeos) nos

    microrganismos, so detectadas por receptores presentes na superfcie celular do

    hospedeiro. Esses receptores costumam possuir domnios citoplasmticos que

    sinalizaro clula o reconhecimento feito no meio extracelular, como o caso do

    receptor da flagelina cujo domnio citoplasmtico ativa uma cascata de sinalizao

    por MAPKs (Mitogen-activated protein kinases) que resultar em resposta de

    defesa. Trata-se de um processo lento (JONES; DANGL, 2006).

    Uma segunda linha de defesa ocorre dentro da clula do hospedeiro atravs

    da expresso de genes de resistncia (R) cujos produtos protecos costumam

    possuir domnios de ligao a nucleotdeo (Nucleotide Binding ou NB) e domnios

    ricos em leucina (leucine rich repeat ou LRR), sendo esses ltimos importantes para

    realizao de interaes protena-protena. Essas protenas podem, na clula do

    hospedeiro, reconhecer protenas do patgeno ditas de avirulncia (avr), que so

    geralmente responsveis pelo desencadeamento da patologia e foram translocadas

    para o ambiente celular do hospedeiro. Esse reconhecimento lembra uma interao

    do tipo receptor-ligante e desencadeia respostas de defesa que promovem a rpida

    morte celular no local da infeco para conter o avano do patgeno em um evento

    chamado resposta de hipersensibilidade (hypersensitive response ou HR). Caso o

    patgeno no avance temos uma interao planta-patgeno incompatvel. Em

    contrapartida, quando a interao avr/R no ocorre, possivelmente por ausncia do

    gene R correspondente no hospedeiro, o fator Avr fica livre para agir na clula

    vegetal, provavelmente desencadeando os sintomas por consequncia de mediar

  • 10

    modificaes na clula do hospedeiro. Essa interao dita compatvel (FEBRES et

    al., 2009; DOMINGUES, 2011).

    Efetores TAL

    Aps se instalar no mesfilo do hospedeiro, a bactria transloca para as

    clulas vegetais algumas molculas ditas efetoras. Essa translocao mediada

    pelo sistema de secreo tipo III (T3S). Os efetores podem suprimir respostas de

    defesa, desencadear os sintomas da patologia e alterar a bioqumica do ambiente

    celular.

    Efetores de Xanthomonas citri da famlia AvrBs3/PthAs so efetores que em

    especial modulam a expresso gnica do hospedeiro. Esses efetores ativadores de

    transcrio (transcription activator-like ou TAL) so compostos estruturalmente por:

    um domnio central de 34/35 resduos de aminocidos que se repetem em tandem

    sendo as repeties de nmero varivel; domnios de localizao nuclear (nuclear

    localization signals ou NLS) e de ativao transcricional (acidic transcription

    activator-like domain ou AAD). (Figura 2).

    Aps sua translocao pelo T3S estes so endereados ao ncleo aps

    reconhecimento da regio do NLS por uma -importina, que com o apoio de uma -

    importina promovem a importao do efetor para o ncleo. No ncleo esses efetores

    vo modular a expresso gnica do hospedeiro contribuindo para o desenvolvimento

    do cancro e suprimindo respostas de defesa basais da planta. Estudos j

    demonstraram que a expresso transiente de PthA (um efetor TAL de X. citri) em

    citros suficiente para induzir hiperplasia e hipertrofia (KAY; BONAS, 2009;

    BOGDANOVE et al., 2010).

    O mecanismo molecular de ligao dos efetores TAL ao DNA foi elucidado e

    depende da participao dos domnios repetitivos de 33/34 aminocidos, onde os

    Figura 2 - Esquematizao de um efetor TAL. Esto representados os domnios internos

    repetitivos, o domnio rico em leucina (LRR), os sinalizadores nucleares (NLS) e o domnio cido de

    ativao transcricional (AAD). Na poro N-terminal tambm comum a existncia de sinalizadores

    para o sistema secretrio tipo III (TS3).

  • 11

    aminocidos das posies 12/13 so resduos variveis (RAV) e h um cdigo para

    o reconhecimento especfico de uma sequncia de nucleotdeos sendo cada

    diferente par de aminocidos 12/13 reconhecedor de um nucleotdeo especfico .

    Esses estudos possibilitaram predizer alvos de ligao dos efetores TAL atravs da

    anlise dos RAVs contidos em suas regies repetitivas (BOCH et al., 2009).

    X. aurantifolii apresentam efetores equivalentes aos PthAs de X.citri. Nosso

    grupo levantou possveis genes de laranja alvos desses efetores TAL de X.

    aurantifolii, constatamos dentre estes alguns genes relacionados ao sistema de

    defesa. Sabendo que infeco de X. aurantifolii em laranja induz uma srie de

    genes relacionados resposta de defesa com pouco ou nenhum desenvolvimento

    de sintomas (CERNADAS et al., 2008) sugerimos a ocorrncia de transativao de

    genes de defesa pelos efetores de X. aurantifolii. Esse trabalho busca avaliar os

    nveis transcricionais de alguns desses genes possivelmente transativados em

    plantas transformadas com os efetores TAL de X. aurantifolii. Esses estudos sero

    feitos por q-RT PCR.

    Fatores de transcrio do tipo WRKY

    Protenas do tipo WRKY so fatores de transcrio bem distribudos no Reino

    Vegetal. Sua estrutura marcada por um domnio (WRKY - triptofano; arginina;

    lisina; tirosina) de aproximadamente 60 aminocidos com atividade de ligao ao

    DNA e em especial uma sequncia denominada W-BOX (C/T)TGAC(T/C). Para

    realizar essa ligao, o fator depende do motivo invarivel WRKY e dos resduos

    cistena e histidina do domnio WRKY que participam da formao de um zinc finger

    caracterstico (Figura 3) (ULKER; SOMSSICH, 2004; RUSHTON et al., 2010).

    Estudos evidenciaram a presena de W-BOXES (stios de ligao dos fatores

    WRKY em DNA) nas regies promotoras de clusters de genes expressos em

    condies de reao de defesa sistmica, sugerindo participao desses fatores de

    transcrio nos processos de defesa das plantas. Recentemente alguns fatores

  • 12

    WRKY foram associados a MAPK (Mitogen-activated protein kinases) cujas

    cascatas podem culminar na ativao da transcrio de fatores WRKY (OSORIO,

    2010) (PANDEY; SOMSSICH, 2009). Alm disso, a transcrio de genes WRKY

    forte e rapidamente ativada pela ocorrncia de feridas, infeco por patgenos e

    condies de estresse abitico.

    Estudos demonstraram que a super expresso de fatores WRKY em

    Arabidopsis thaliana e Oryza sativa resultaram na induo de genes de defesa.

    Estes aparecem, portanto, como potenciais candidatos na produo de culturas com

    resistncia aumentada a patgenos (LIU et al., 2007; HWANG, S.-HEE et al., 2011).

    Estratgias para obteno de plantas resistentes ao cancro ctrico.

    Esse trabalho analisa plantas que foram transformadas com dois efetores TAL

    de X. aurantifolii e um fator de transcrio WRKY endgeno, sempre

    separadamente. As construes feitas colocam os genes sob controle de um

    promotor levantado pelo grupo que sensvel ao dano e infeco com X. citri. As

    plantas sofreram transformao mediada por Agrobacterium.

    Sugerimos a transativao de genes de defesa pelos efetores TAL nas

    plantas transformadas com estes, podendo resultar em linhagens mais resistentes

    ao patgeno. Nas plantas transformadas com o fator WRKY sugerimos que a super

    expresso deste, pode conferir s linhagens um maior nvel de resistncia ao

    patgeno (PANDEY; SOMSSICH, 2009).

    A susceptibilidade das plantas transformadas foi avaliada por desafio das

    plantas com o patgeno.

    Figura 3 - Representao dos aminocidos da poro N-terminal de um fator WRKY de

    Arabdopsis thaliana. Em negrito, est destacada a sequncia WRKY bem conservada. Com

    asteriscos esto indicados os resduos de cistena e histidina que participam da formao do zinc

    finger (ULKER; SOMSSICH, 2004).

  • 13

    2 OBJETIVOS

    - Verificar a expresso das protenas de interesse em plantas transgnicas de citros

    transformadas com as construes para tal;

    - Correlacionar a expresso transgnica do fator de transcrio e dos efetores em

    estudo com o desenvolvimento do Cancro Ctrico;

    3 MATERIAIS E MTODOS

    3.1. Deteco de plantas geneticamente modificadas por PCR.

    Extrao de DNA genmico

    Uma primeira extrao de DNA genmico das plantas e reao subsequente

    de PCR foram realizadas com REDExtract-N-Amp Plant PCR Kit (Sigma Aldrich)

    seguindo as recomendaes do fabricante e utilizando primers que amplificam uma

    parte (800bp) da regio C-terminal de efetores TAL de Xanthomonas citri.

    Alternativamente, para extrao de DNA genmico por metodologia

    convencional utilizando CTAB (Brometo de cetil trimetil amnio) como detergente,

    uma folha foi recolhida e congelada em nitrognio lquido em tubo de 2 mL. O

    material foi macerado com basto de vidro. Ao p obtido foi adicionado Tampo de

    Extrao (CTAB 0,8%; NaCl 800 mM; EDTA 22 mM; Tris-HCl pH 8,0 220 mM; -

    mercaptoetanol 0,2%) e soluo 24:1 de clorofrmio : lcool isoamlico. As amostras

    foram vortexadas e incubadas a 55C por 10 minutos. A amostra foi centrifugada, o

    sobrenadante transferido e a ele adicionado isopropanol para precipitao do DNA.

    O pellet foi lavado com etanol 70%. O DNA foi ressuspendido em tampo TE (10 mM

    Tris, pH 7.5 8.0, 1 mM EDTA) (Sigma Aldrich). A suspenso foi tratada com RNAse Mix (Fermentas) seguindo as recomendaes do fabricante. A qualidade da

    extrao foi aferida por eletroforese em gel de agarose 1%.

  • 14

    Reao de PCR

    Protocolo 1: Utilizao de DNA extrado por metodologia convencional (1L), oligos

    de interesse que amplificam uma regio de 800 bp dos efetores TAL e enzima

    DreamTaq Polimerase (Fermentas), seguindo as recomendaes do fabricante. A

    temperatura de annealing foi 55C.

    Protocolo 2: Utilizao de DNA extrado por metodologia convencional, tratado com

    RNAse Mix (Fermentas) (1L), oligos de interesse que amplificam uma regio de

    800 bp dos efetores TAL e enzima Platinum Polimerase (Invitrogen),uma Hot Start,

    seguindo as recomendaes do fabricante. A temperatura de annealing foi 55C.

    Protocolo 3: PCR de gradiente de temperatura nas condies do protocolo 2,

    variando apenas a enzima: TrueStart Hot Start Taq Polimerase (Fermentas). O DNA

    utilizado havia sido tratado com RNAse Mix (Fermentas) e as temperaturas de

    annealing testadas foram: 55C, 55.9C, 57C, 58.3C, 59.3C e 59.9C

    Protocolo Final: PCR utilizando 2L de DNA extrado por metodologia convencional,

    tratado com RNAse Mix (Fermentas) , oligos de interesse que amplificam uma regio

    de 800 bp dos efetores TAL e enzima TrueStart Hot Start Taq Polimerase

    (Fermentas) seguindo as recomendaes do fabricante. A temperatura de annealing

    foi 60C.

    3.2. Subclonagem, expresso e purificao do fator de transcrio do tipo

    WRKY.

    Subclonagem do gene de fator do tipo WRKY.

    A construo pGEM/WRKY (cedida pela pesquisadora Maria Luiza Oliveira) e

    o vetor de expresso pET28a (Novagen) foram digeridos com as enzimas de

    restrio (Fermentas) NcoI (CCATGG) e SacI (GAGCTC) e o produto da digesto

    avaliado por eletroforese em gel de agarose 1%. As bandas de interesse foram

    excisadas e purificadas a partir do gel com o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN)

    seguindo as recomendaes do fabricante.

  • 15

    Os produtos da purificao: vetor linearizado e regio gnica codificante,

    foram postos ligao nas propores 1:3 e 1:5 na presena da enzima ligase

    (Fermentas) em reao de aproximadamente 14 horas mantida a 16C, seguindo as

    recomendaes do fabricante. A ligao em vetor pET28a permitiu fusionamento da

    protena de interesse cauda 6xHis, permitindo posterior purificao por

    cromatografia de afinidade.

    O DNA ligado foi transformado por choque trmico em clulas de E.coli DH5

    quimiocompetentes. A transformao se deu por incubao da reao em banho de

    gelo por meia hora, choque trmico de 1 minuto e 30 segundos em banho-maria a

    42C seguido de 1 minuto em banho de gelo. Procedeu-se adio de meio LB

    (Triptona 1%; Extrato de Levedura 0,5%; NaCl 1%; pH 7,5) e incubao celular a

    37C e 200 rpm para restabelecimento e diviso celular.

    As clulas foram plaqueadas em meio LB slido suplementado com

    canamicina (25 g. mL-1) e incubado a 37C por 18 horas. Foram picadas 13

    colnias dentre as obtidas, fervidas em 40 L de gua tipo 01. Uma alquota do

    fervido foi utilizada como template para PCR de colnia (DreamTaq Polimerase /

    Fermentas) utilizando os oligos do gene em estudo. Duas colnias PCR positivas

    foram incubadas overnight em 10 mL de meio LB a 37C e 200 rpm. Foi feita mini-

    preparao de 3 mL de cultura, com o kit QIAprep Mini Prep Kit (QIAGEN), seguindo

    as recomendaes do fabricante, para isolamento da construo plasmidial de

    interesse.

    A construo pET28a/WRKY foi transformada por choque trmico em clulas

    de E. coli BL21(DE3) quimiocompetentes. O produto de transformao foi plaqueado

    em meio LB suplementado com canamicina (25 g. mL-1) e incubado a 37C por 18

    horas. Uma colnia crescida na placa foi picada e incubada overnight em 5 mL de

    meio LB suplementado com canamicina (25 g. mL-1) a 37C e 200 rpm.

    Expresso e purificao da protena WRKY.

    Um pr-inculo foi diludo em 0,5 L de meio LB tambm suplementado com

    canamicina (25 g. mL-1) e incubado a 37C at que a O.D. 600 (optical density) da

    cultura a 600 nm atingisse 0.9. A cultura foi induzida com 0,4 mM de IPTG (Isopropyl

    -D-1-thiogalactopyranoside) e incubada por 4 horas a 30C sob agitao de 200

    rpm. A cultura foi pelletada em centrfuga refrigerada. Alquotas da cultura foram

  • 16

    feitas antes e ao fim da induo para posterior anlise por SDS PAGE (sodium

    dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) (LAEMMLI, 1970).

    Uma alquota do pellet obtido foi ressuspendido em Tampo A ( 20 mM Tris-

    HCl pH 8.0; 5 mM Imidazol; 200 mM NaCl; 1 mM PMSF; Glicerol 2%). O contedo foi

    tratado com lisozima e sonicado em banho de gelo com intensidade de 24% e

    pulsos curtos. A amostra foi centrifugada por uma hora a 4C para obteno do

    sobrenadante. Alquotas das fases foram feitas para posterior anlise.

    A purificao do sobrenadante por cromatografia de afinidade foi feita em

    resina TALON Metal Affinity Resin (Clontech). A coluna foi equilibrada com 15

    volumes Tampo A, o sobrenadante foi aplicado na coluna e esta foi lavada com 15

    volumes de Tampo B (20 mM Tris-HCl pH 8.0; 200 mM NaCl; 1 mM PMSF; Glicerol

    2%). A eluio foi realizada com 2 volumes de Tampo C (20 mM Tris-HCl pH 8.0;

    250 mM Imidazol; 200 mM NaCl; 1 mM PMSF; Glicerol 2%). Alquotas de expresso

    e purificao da protena WRKY foram analisadas em SDS PAGE 13%. (LAEMMLI,

    1970).

    3.3. Anlise da expresso dos transgenes.

    Extrao das protenas totais de tecido vegetal

    A extrao de protenas totais se deu em 03 condies diferentes: 1) a partir

    de 04 discos de folha de dimetro 6.5 mm; 2) a partir de 06 discos de folha de 6.5

    mm de folha machucada; 3) A partir da folha inteira.

    As folhas retiradas das plantas foram postas em tubos de 2 mL, que foram

    mantidos em gelo at o momento da extrao. Foi escolhida dentre as 03 condies

    j citadas a mais adequada para cada construo e o material foi macerado em

    cadinho embebido em gua tipo 01, procedeu-se a adio de 400 L de SDS PAGE

    Sample Buffer 2X (200 mM Mercaptoetanol; SDS 4% (p/v); Azul de bromofenol

    0,2% (p/v); Glicerol 20% (v/v); 100 mM Tris HCl pH 6.8) (SAMBROOK &

    RUSSELL,2001 ) A extrao foi verificada por SDS PAGE 10% e 13% (LAEMMLI,

    1970) .

  • 17

    Imunodeteco por Western Blot

    As protenas totais foram separadas por SDS PAGE (LAEMMLI, 1970)

    utilizando gis 10% e 13% em corrida de aproximadamente 1 hora sob corrente

    constante de 15 mA por gel. A transferncia destas para membrana de PVDF

    (Millipore) foi realizada em tampo de transferncia gelado (Tris 48mM; Glicina 39

    mM; SDS 0,0037%; Metanol 20%) sob corrente constante de 350 mA por 1 hora e

    15 minutos. A membrana foi bloqueada temperatura ambiente por uma hora e

    meia sob agitao com soluo TBS-T (20 mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 0,05%

    Tween20, pH 7,5) + 5% (p/v) de leite em p desnatado. Em seguida a membrana foi

    incubada sob agitao, por toda a noite a 4C, com soluo TBS-T pH 7,5 + 5% leite

    em p desnatado contendo o anticorpo primrio na titulao mais conveniente. No

    dia seguinte foram feitas 03 lavagens sob agitao, de 10 minutos cada, com 15 mL

    de TBS-T. Incubou-se a membrana, sob agitao e a temperatura ambiente, com

    soluo TBS-T + 5% de leite desnatado em p com anticorpo secundrio Anti-Rabbit

    (GE-Health Care) tambm na titulao desejada (geralmente 1:3000). Foram

    repetidas as 03 lavagens com TBS-T, como descrito anteriormente. A deteco foi

    feita por quimiluminescncia com o kit ImmunoCruz: Western Blotting Luminol

    Reagent (Santa Cruz Biotechnology) em filme de alta performance Amersham

    Hyperfilm ECL (GE Health Care), sempre seguindo as recomendaes dos

    fabricantes. (MACPHEE, 2010)

    Stripping de membrana

    Algumas membranas de PVDF foram recuperadas com Stripping Buffer

    (100mM -mercaptoetanol ; 62,5 mM Tris-HCl pH 6.7; SDS 2%), onde 50 mL do

    tampo foram incubadas com a membrana a 60C sob agitao. Seguiram-se 03

    lavagens sob agitao, de 10 minutos cada, com 15 mL de TBS-T (20 mM Tris-HCl;

    150mM NaCl; 0,05% Tween20, pH 7,5) + 5% (p/v) de leite em p desnatado. Aps o

    procedimento repetiram-se os passos do Western Blot partindo do bloqueio da

    membrana.

  • 18

    3.4. Avaliao dos nveis transcricionais de genes de interesse

    Desenho de oligonucleotdeos para reao de qRT-PCR

    Oligonucleotdeos correspondentes a vrios genes de citros, identificados

    como alvos diretos de efetores TAL de Xanthomonas aurantifolii foram desenhados

    utilizando o software Primer Express 3.0 (Life Technologies).

    Extrao de RNA de tecido vegetal e sntese de cDNA

    Uma folha jovem foi congelada e macerada em nitrognio lquido utilizando

    cadinho previamente incubado com gua oxigenada. Ao p claro obtido foi

    adicionado reagente TRIzol (Invitrogen) e o contedo incubado a temperatura

    ambiente e vortexado. Adicionou-se clorofrmio. Foi realizada centrifugao

    refrigerada e a fase aquosa obtida, contendo RNA, foi recuperada. Adicionou-se a

    essa 2-propanol e o contedo foi centrifugado a 4C para precipitao do RNA. O

    pellet foi lavado com Etanol 75% gelado e centrifugado. Esperou-se at a secagem

    do pellet para posterior ressuspenso em gua DEPC (Diethylpyrocarbonate) 0,1%.

    Para atestar a qualidade da extrao e a integridade do material extrado, foi

    realizada eletroforese em gel de agarose desnaturante. O gel foi preparado por

    fundio da agarose em gua e posterior adio de tampo MOPS (200 mM MOPS;

    60 mM Acetato de Sdio; 10 mM EDTA; pH 7.0)

    A qualidade do RNA extrado foi aferida por eletroforese em gel de agarose

    1% desnaturante, com MOPS 1X (MOPS 20 mM; Acetato de Sdio 5 mM; EDTA 1

    mM pH 7.0 em gua DEPC 0,1%) e formaldedo 5%.

    O RNA foi quantificado em espectrofotmetro (SAMBROOK &

    RUSSELL,2001 ) por medida da absorbncia da amostra, diluda em gua DEPC

    0,1%, nos comprimentos de onda 260 e 280 nm. Foi utilizada cubeta UVette

    (Eppendorf) RNA free.

    Sntese de cDNA.

    O RNA quantificado foi tratado com DNAse I (Fermentas) seguindo as

    recomendaes do fabricante e em seguida foi realizada sntese de fita simples de

    cDNA utilizando The Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) partindo

    de aproximadamente 2,5 g de RNA total.

  • 19

    qRT PCR e anlise dos dados.

    A reao de qRT PCR foi realizada em plataforma 7500 Real-Time PCR

    System (Applied Biosystems) utilizando diluies especficas do cDNA produzido

    para avaliar a quantidade necessria para deteco dos transcritos. O qRT PCR

    foi feito com Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (2X) (Fermentas)

    com adio do cDNA de interesse e dos primers para cada gene analisado mais dois

    genes endgenos de controle em concentrao final aproximada de 0,3 M,

    seguindo as recomendaes do fabricante.

    3.5. Desafio das plantas com Xanthomonas citri e avaliao fenotpica.

    Cultura permanente de Xanthomonas citri 306 foi plaqueada em meio LB sem

    sal (Triptona 1%; Extrato de Levedura 0,5%; gar 1,5%) suplementado com

    Ampicilina (25 g.mL-1) e incubada a 30C por 48 horas.

    Para desafio das plantas foi preparada soluo aquosa de Xanthomonas citri

    306 de O.D600 = 0.28, o que corresponde a aproximadamente 2.105 UFC/mL . Na

    infiltrao foram injetados entre 20 e 50 L de soluo bacteriana em folhas jovens e

    maduras das plantas envolvidas no projeto. Diluies da soluo utilizada foram

    plaqueadas e incubadas para contagem celular e avaliao das bactrias

    inoculadas. O desenvolvimento dos sintomas foi acompanhado com o tempo. A cepa

    de X. citri utilizada tambm foi plaqueada em meio LB sem sal suplementado com o

    inseticida Decis 25 EC 0,1% (Bayer Environmental Science) para avaliar o efeito

    deste no desenvolvimento da bactria, em vista da utilizao do mesmo na

    manuteno dos insetos no ambiente das plantas.

    O desenvolvimento dos sintomas foi acompanhado por fotos a partir do

    dcimo dia ps-inoculao. Quando de quinze dias do desafio das plantas com

    Xanthomonas as folhas foram recolhidas e fotos das leses foram tiradas em lupa

    com magnitudes de 10X e 20X de ampliao.

  • 20

    4 RESULTADOS E DISCUSSO

    4.1. Deteco de plantas geneticamente modificadas por PCR.

    Extrao de DNA genmico

    A extrao de DNA genmico de folhas por metodologia convencional,

    utilizando CTAB como detergente, foi bem sucedida (Figura 4A) e permite

    visualizao de bandas superiores e majoritrias, que correspondem ao DNA

    genmico extrado. Alguns rastros tambm so perceptveis e indicam

    contaminaes com RNA. O tratamento das extraes com RNAse Mix (Figura 4B)

    (Fermentas) limpou os rastros e melhorou a condio do material para PCR.

    Figura 4A Eletroforese em gel de agarose 1% de extraes de DNA por metodologia convencional (CTAB). As amostras 1-28 correspondem extrao de DNA genmico de plantas possivelmente transformadas com efetores TAL de Xanthomonas aurantifolii. 4B -Eletroforese em gel de agarose 1% de extraes de DNA por metodologia convencional tratadas com RNAse Mix (Fermentas) 1-14: Amostras de DNA genmico (4A) ps tratamento com RNAse Mix (Fermentas). M: MassRuller DNA Ladder Mix (Fermentas).

    Tentativas de extrao de DNA genmico e amplificao, com o REDExtract-

    N-Amp Plant PCR Kit no foram bem sucedidas. Anlise por eletroforese em gel

    de agarose 1% evidenciou baixa ou no extrao de DNA com o kit. O produto do

    PCR obtido com o kit tambm foi avaliado por eletroforese em gel de agarose 1% e

    no apresentou amplificado.

    Reao de PCR

  • 21

    Eletroforese em gel de agarose 1% do primeiro protocolo de reao PCR (Figura

    5) apresentou muitos amplicons inespecficos, no permitindo deteco dos efetores

    de forma eficiente. Supondo influncia da contaminao com RNA, o DNA extrado

    por metodologia convencional foi tratado com RNAse MIX (Fermentas). A seta

    (Figura 5) indica amplificado de 800 bp, como esperado, no controle positivo.

    Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR para detectar plantas

    transformadas com efetores TAL. M: MassRuller DNA Ladder Mix (Fermentas). 1-27: plantas

    testadas. C-: plantas controle no transformadas. C+: PthA clonado em vetor pET (controle positivo).

    Eletroforese em gel de agarose 1% do produto de PCR do segundo protocolo

    (Figura 6) apresentou diminuio das amplificaes inespecficas, mas estas ainda

    atrapalhavam a identificao de plantas transformadas com os efetores TAL.

  • 22

    Figura 6- Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR para detectar plantas

    transformadas com efetores TAL/ Platinum Taq Polimerase (Invitrogen) e DNA tratado com

    RNAse. M: MassRuller DNA Ladder Mix (Fermentas). 1-12: plantas testadas. C-: plantas controle

    no transformadas. C+: PthA clonado em vetor pET (controle positivo).

    O protocolo de PCR com gradiente de temperatura (Figura 7) indicou

    59.9C/60C como a melhor temperatura de annealing para o protocolo em questo

    porque minimizou as amplificaes inespecficas no controle negativo (1) e permitiu

    amplificao notvel na planta positiva (3) e no controle positivo (2).

    O protocolo de PCR final, congregando as otimizaes, praticamente eliminou

    as amplificaes inespecficas e possibilitou identificar como positivas

    (transformadas) as plantas 11, 16, 17,22 e 24. (Figura 8). Infelizmente algumas das

    plantas PCR positivas estavam pequenas impossibilitando desafio com X. citri.

    Figura 7 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR de gradiente de temperatura

    para otimizar a reao para amplificao dos efetores TAL em plantas transformadas. M:

    MassRuller DNA Ladder Mix (Fermentas). 1: planta controle no transformada 2: PthA clonado em

    vetor pET (controle positivo). 3: planta transformada identificada como possvel PCR positiva em

    anlise anterior. A temperatura de annealing utilizado para cada reao est indicada acima das

    canaletas.

  • 23

    Figura 8 Eletroforese em gel de agarose 1% de PCR para identificao de plantas

    transformadas com efetores TAL nas condies otimizadas M: MassRuller DNA Mix Ladder

    (Fermentas). C-: Plantas no transformadas (controles negativos) . 1-26: Plantas testadas. C+: PthA

    clonado em vetor pET (controle positivo).

    4.2. Subclonagem, expresso e purificao da protena WRKY.

    Subclonagem do gene de WRKY.

    Visando obter controle positivo para procedimentos de Western Blot, o gene

    WRKY foi subclonado e expresso. A construo inicial pGEM/WRKY e o vetor

    pET28a foram digeridos com sucesso pelas enzimas NcoI e SacI (Figura 9). A banda

    nica em 1 apresenta o vetor pET28a linearizado. A banda em destaque em 2

    mostra o inserto livre do vetor de propagao.

    Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose 1% de

    digestes preliminares para subclonagem. M:

    MassRuller DNA Mix Ladder (Fermentas). 1: Vetor

    pET28a digerido com as enzimas NcoI e SacI (5260 bp). 2:

    Construo pET28a/WRKY digerida com as enzimas NcoI

    e SacI. O fragmento de interesse est em destaque (1kB).

  • 24

    A transformao da ligao em E. coli DH5 gerou colnias que foram

    submetidas a PCR de colnia (Figura 10) que resultou em amplificao do

    fragmento de interesse (1 kB) em quase todas as colnias. A amplificao no

    controle positivo est indicada pela seta (Figura 10)

    Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose 1% de PCR de colnias de E.Coli DH5

    transformadas com a construo pET28a/WRKY. M: MassRuller DNA Mix Ladder (Fermentas).

    1-12 : PCR de colnias (para amplificao do gene WRKY : 1kB) de E.Coli DH5 crescidas em LB

    Canamicina aps transformao qumica com a construo pET28a/WRKY. C+: Construo

    pGEM/WRKY (controle positivo).

    Expresso e purificao da protena WRKY

    Clulas de E. Coli BL21 (DE3) transformadas e crescidas foram pr-

    inoculadas, diludas no dia seguinte e induzidas. A cultura induzida por IPTG e

    purificao da protena WRKY em E. Coli BL21 (DE3) foram avaliadas em SDS-

    PAGE 13% (LAEMMLI, 1970) (Figura 11) que evidencia os maiores nveis de

    protena 4 horas aps a induo (canaleta 2) e ainda mostra a induo da expresso

    da protena de interesse clonada em vetor pET28a sob controle do promotor T7.

    A figura 11 tambm relata a prevalncia da protena de interesse na frao

    insolvel aps sonicao (canaleta 3). Apesar disto, procedeu-se com a purificao

    em coluna de gravidade com 0,5 mL de resina. A eluio com imidazol (canaleta 7)

    no tem banda aparente no gel de SDS PAGE 13%, contudo, analises posteriores

    de Western Blot detectaram a protena nessa frao.

  • 25

    Experimentos de otimizao da expresso e purificao da protena podem

    ser realizados futuramente para estudos estruturais.

    4.3. Anlise da expresso dos transgenes.

    Extrao das protenas totais de tecido vegetal

    Os melhores protocolos de extrao de protenas totais foram aqueles que

    forneceram maior quantidade de material biolgico, isto , aquele que utilizava a

    folha inteira como material. Contudo, blots que detectaram super expresso foram

    feitos com extrao de 5 discos de folha. A figura 12 mostra gis SDS PAGE de

    extraes em diferentes condies onde possvel perceber a diferena de

    quantidade proteica. A qualidade da extrao geralmente foi associada

    identificao qualitativa da banda correspondente enzima Rubisco, abundante em

    plantas e que se apresenta de forma marcante na separao de protenas totais de

    plantas em eletroforese em gel de poliacrilamida.

    Figura 11 - Anlise da expresso e purificao da protena WRKY em E. Coli BL21 (DE3) por

    SDS-PAGE 13%. MM: Marcador de peso molecular Unstained Molecular Weight Marker (Fermentas).

    1. Amostra de extrato celular da cultura no induzida (T0) . 2. Amostra de extrato celular de cultura 4

    horas aps a induo (T4). 3. Frao insolvel. 4. Frao solvel. 5. Lavagem da coluna de

    purificao. 6. Flow da coluna de purificao 7. Eluio com Imidazol 250 mM.

  • 26

    Figura 12 Anlise da extrao de protenas totais de folhas por SDS-PAGE 10% e 13%.

    Imunodeteco por Western Blot

    A deteco por Western Blot passou por adequaes de protocolo at

    deteco das protenas de interesse nas plantas transformadas. A figura 13 mostra

    blot onde a titulao do anticorpo e a quantidade de protenas totais no foram

    suficientes para a deteco, sendo notvel apenas as protenas recombinantes

    utilizadas como controle positivo. Em 13A e 13 B vemos um PthA recombinante

    detectado. Em 13C e 13D visualizamos a detecco da WRKY recombinante

    produzida. Para estes casos foram utilizadas titulaes 1:3000 e 1:1000 de

    anticorpos primrios.

    Figura 13 Western Blot das protenas de interesse em plantas transformadas. A e B: Tentativa de

    deteco de efetores TAL em plantas transformadas. C e D: Tentativa de deteco do fator WRKY em

    plantas transformadas.

  • 27

    Como alternativa, utilizamos para as duas vertentes de deteco uma

    titulao de 1:500 de anticorpo primrio correspondente. Foi possvel deteco das

    protenas de interesse, mas notou-se background alto quando do uso de algumas

    alquotas de anticorpo anti-PthA (utilizado para detectar os efetores TAL). Buscando

    amenizar o background testamos alquotas diferentes do anticorpo na deteco de

    protena recombinante. A figura 14 mostra 3 alquotas de anticorpo diferentes

    detectando PthA recombinante. As trs alquotas foram classificadas como

    satisfatrias. Uma dessas alquotas foi aplicada na tentativa de deteco dos

    efetores em plantas transformadas, contudo no alcanamos deteco satisfatria.

    Figura 14 Western Blot para avaliao de alquotas de anticorpo anti-PthA disponveis. 1,2,3:

    PthA recombinante detectado com diferentes alquotas (1,2, e 3) de anticorpo anti PthA.

    Testamos o anticorpo anti-WRKY disponvel detectando a protena

    recombinante na frao insolvel, alm de 4 diluies seriadas de 10x desta frao

    para aferir a amplitude de deteco. Foram tambm postas a deteco alquotas do

    Flow e da eluio, como mostra a figura 15. Visualizamos a banda majoritria de

    aproximadamente 37,5 kDa, correspondente a protena WRKY fusionada a cauda 6x

    His Tag na eluio e em outras canaletas, atestando a qualidade do anticorpo.

    Partindo para a deteco das protenas em plantas transformadas com o fator

    Figura 15 Western Blot para teste

    de deteco de anticorpo anti-WRKY.

    P: amostra da frao insolvel obtida

    no ensaio de expresso. D1,D2,D3 e

    D4: diluies seriadas (10x) da frao

    insolvel obtida no ensaio de

    expresso. FT: flow through . EL:

    Eluio da protena recombinante.

  • 28

    WRKY temos na figura 16 um Western Blot onde nota-se que os nveis da protena

    nas plantas testadas chegam a ser levemente menores que o controle. importante

    notar que a quantidade de protena no controle maior que nas canaletas das

    plantas testadas, como mostra o gel blotado (16D). A figura 16C mostra a aparncia

    da leso nas folhas das respectivas plantas transgnicas expressando o fator WRKY

    16 dias aps o desafio, apresentando menor desenvolvimento dos sintomas, apesar

    da pouca quantidade da protena quando comparado ao controle representado em

    16B. Sugerimos aqui um retardamento no desenvolvimento do cancro por

    decorrncia da super expresso do fator WRKY. Cabe ainda a repetio dos

    experimentos para a confirmao dos resultados.

    Figura 16 - Correlao entre Western Blot de plantas transformadas com fator WRKY e fentipo

    das plantas desafiadas com X. citri A: Western Blot de plantas transformadas com a

    construo WRKY. C-: controle negativo (planta no trasnformada) WRKY: WRKY recombinante

    fusionado a 6xHis Tag (~36 kDa); 1-6: plantas transformadas com WRKY. B-C: Leses

    caractersticas de cancro ctrico ( 10 x ampliadas) aps 16 dias da inoculao com X. citri. B:

    planta controle; C: planta 02 D: Gel SDS PAGE 13% idntico ao blotado para o Western

    representado em A.

    A Figura 17 mostra outro Western Blot para deteco de fator WRKY em

    plantas controle e transformadas. Em particular, as plantas transgnicas de 3 a 5

    mostram aumento dos nveis de protena de WRKY em relao aos controles,

    sugerindo que eles esto, de fato, super expressando a WRKY. Curiosamente,

  • 29

    possvel correlacionar os nveis mais elevados de expresso nas plantas WRKY 3, 4

    e 5 com uma reduo no desenvolvimento do cancro em relao ao controle (17B),

    como indicado na Figura 17C, D e E, respectivamente. Sugerimos que esses nveis

    proteicos correspondem a super expresso e esta contribuiu para menor

    desenvolvimento dos sintomas.

    Figura 17 Correlao entre Western Blot de plantas transformadas com fator WRKY e

    fentipo das plantas desafiadas com X. citri A: Western Blot de plantas transformadas com a

    construo WRKY. C e C: controles negativos (plantas no transformadas) WRKY: WRKY

    recombinante fusionado a 6xHis Tag (~36 kDa); 1-6: plantas transformadas com WRKY. B-E: Leses

    caractersticas de cancro ctrico (10 x ampliadas) aps 16 dias da inoculao com X. citri. B:

    planta controle; C: planta 3; D: planta 4; E: planta 5. F: Gel SDS PAGE 13% idntico ao blotado para

    o Western representado em A.

    4.4. Avaliao dos nveis transcricionais de genes de interesse

    Extrao de RNA de tecido vegetal e sntese de cDNA

    As extraes de RNA foram realizadas com sucesso (Figura 18), fato

    evidenciado pelas bandas ribossomais e a ausncia de rastros que indicariam

    degradao do material. As amostras foram quantificadas por espectrofotometria e

    esto em concentrao de aproximadamente 2,5 g/L. A razo entre as

    absorbncias em 260nm e 280nm de aproximadamente 1.55.

  • 30

    O cDNA foi sintetizado e um experimento preliminar de qRT-PCR foi

    realizado na tentativa de analisar os nveis transcricionais de genes tidos como alvos

    moleculares do efetores transformados.

    Figura 18 Eletroforese de RNA em gel de agarose 1% desnaturante. 1: RNA de concentrao

    conhecida (7g/L). 2-5: Extrao de RNA das amostras de interesse.

    5 CONCLUSO E PERSPECTIVAS

    Nossos resultados mostraram que a proposta de super expresso de um fator

    WRKY visando resistncia ao cancro ctrico pode ser interessante, com base no

    observado em plantas com maiores nveis dessa protena, onde houve menor

    desenvolvimento dos sintomas do cancro. Cabem estudos moleculares mais

    intensos para validar a proposta.

    Sobre as plantas transformadas com os efetores TAL, o trabalho permitiu

    consolidar alguns procedimentos da anlise que facilitaro estudos mais avanados

    das caractersticas dessas plantas transgnicas. A anlise da influncia da

    expresso desses transgenes nos nveis transcricionais de genes de defesa de

    citros como alvos de desses efetores uma perspectiva do trabalho.

    A continuao das anlises ser possvel aps crescimento das plantas

    utilizadas, o que vai facilitar os trabalhos pela maior disponibilidade de material

    vegetal.

  • 31

    6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

    AMARAL, A. M. DO. Cancro Ctrico: permanente preocupao da citricultura no

    Brasil e no mundo. Comunicados Tcnicos, 2003. Braslia - DF: Embrapa.

    BOCH, J.; SCHOLZE, H.; SCHORNACK, S. et al. Breaking the code of DNA binding

    specificity of TAL-type III effectors. Science, v. 326, n. 5959, p. 1509-12, 2009.

    BOGDANOVE, A. J.; SCHORNACK, S.; LAHAYE, T. TAL effectors: finding plant

    genes for disease and defense. Current Opinion in Plant Biology, v. 13, n. 4, p.

    394-401, 2010.

    BRUNINGS, A. M.; GABRIEL, D. W. Xanthomonas citri: breaking the surface.

    Molecular Plant Pathology, v. 4, p. 141-157, 2003.

    CERNADAS, R. A.; CAMILLO, L. RODRIGUES; BENEDETTI, C. E. Transcriptional

    analysis of the sweet orange interaction with the citrus canker pathogens

    Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii.

    Molecular Plant Pathology, 2008.

    DOMINGUES, M. N. Caracterizao de protenas de Citrus sinensis que

    interagem com a protena efetora PthA, indutora do cancro ctrico, 2011.

    UNICAMP.

    FEBRES, V. J.; KHALAF, A.; GMITTER, F. G.; GLORIA, J. Production of Disease

    Resistance in Citrus by Understanding Natural Defense Pathways and Pathogen

    Interactions. Molecular and Cellular Biology, 2009.

    HWANG, S.-HEE; WON, S.; HWANG, D.-JU. Plant Science Heterologous expression

    of OsWRKY6 gene in Arabidopsis activates the expression of defense related genes

    and enhances resistance to pathogens. Plant Science, v. 181, n. 3, p. 316-323,

    2011.

    JONES, J. D. G.; DANGL, J. L. The plant immune system. Nature, v. 444, n. 7117, p.

    323-9, 2006.

  • 32

    JOSEPH SAMBROOK; DAVID. W. RUSSELL. Molecular Cloning: A Laboratory

    Manual. 3rd ed.. New York: Cold Spring Harbor Lab Press, 2001.

    KAY, S.; BONAS, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant.

    Current Opinion in Microbiology, p. 1-7, 2009.

    LAEMMLI, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of

    Bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-85, 1970.

    LIU, X.; BAI, X.; WANG, X.; CHU, C. OsWRKY71 , a rice transcription factor , is

    involved in rice defense response. , v. 164, 2007.

    MACPHEE, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis.

    Journal of pharmacological and toxicological methods, v. 61, n. 2, p. 171-7,

    2010.

    NEVES, M. F.; TROMBIN, V. G.; MILAN, P. et al. O retrato da citricultura

    brasileira. 1st ed. Ribeiro Preto: Markestrat - CitrusBR, 2009.

    OSORIO, M. B. Anlise funcional de genes que codificam protenas WRKY,

    responsivos ao ataque do fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, agente

    causador da ferrugem asitica em soja [Glycine max (L.) Merrill], 2010. UFRGS.

    PANDEY, S. P.; SOMSSICH, I. E. The role of WRKY transcription factors in plant

    immunity. Plant physiology, v. 150, n. 4, p. 1648-55, 2009.

    RUSHTON, P. J.; SOMSSICH, I. E.; RINGLER, P.; SHEN, Q. J. WRKY transcription

    factors. Trends in Plant Science, v. 15, n. 5, p. 247-258, 2010.

    ULKER, B.; SOMSSICH, I. E. WRKY transcription factors: from DNA binding towards

    biological function. Current opinion in plant biology, v. 7, n. 5, p. 491-8, 2004.

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