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  • CNPEM | LNLS CTBE LNBio LNNano

    Caracterizao molecular e fenotpica de

    plantas transgnicas de citros visando resistncia Xanthomonas citri.

    Bolsista Jlio Csar Gomes de Sousa Filho.

    Estudante de Biotecnologia da Universidade Federal de So Carlos.

    Orientador Dr. Celso Eduardo Benedetti / LNBio.

  • 2

    Caracterizao molecular e fenotpica de

    plantas transgnicas de citros visando resistncia Xanthomonas citri.

    Bolsista Jlio Csar Gomes de Sousa Filho.

    Estudante de Biotecnologia da Universidade Federal de So Carlos.

    Orientador Dr. Celso Eduardo Benedetti / LNBio.

    Campinas, 2012.

  • 3

    We keep moving forward, opening new doors, and doing new

    things, because we're curious and curiosity keeps leading us down new

    paths.

    Walter Elias Walt Disney

  • 4

    AGRADECIMENTOS

    minha Famlia que sempre me apoiou e comemorou minhas conquistas, incluindo essa to

    importante;

    Ao CNPEM/ABTLuS pela realizao do programa que me permitiu desenvolvimento cientfico

    e pessoal de imensa valia;

    Ao Roberto (Patriarca dos Teis) e a querida e doce Tati pela organizao e coordenao do

    programa, estando sempre disponveis para ajudar e nos divertindo sempre. Muito Obrigado!

    Ao Celso Benedetti pela oportunidade, pela escolha, por dedicar parte do seu tempo minha

    orientao, pela ateno e pela grande contribuio ao desenvolvimento cientfico. Muito Obrigado!

    Bruna por sempre me acompanhar na bancada, nas risadas, nos almoos e nas conversas

    sobre Walt Disney World. Malu pelas boas risadas, preciosas dicas e por ceder o clone da protena

    WRKY bem como as plantas transformadas que foram a base do trabalho realizado. Adriana pelas

    ajudas, helps quase constantes, bons toques, diverses, almoos, salvamentos para que no

    perdesse o nibus, pela MEGA ajuda na extrao de RNA e na entrega deste relatrio. Jaque pelas

    dicas, broncas, diverso constante, pelo emprstimo de seu cavalo de fogo, por conseguir uma

    membrana de PVDF em tempo recorde e por receber algumas broncas em nome do Jlio do LPP.

    Mariane pelas dicas, protocolos, risadas, almoos, ajuda na reviso deste trabalho. Caio pela

    companhia em experimentos, pelas discusses cientficas, pelo incentivo, almoos e risadas. Vocs

    do LPP foram essenciais. Muito Obrigado!

    Aos funcionrios do CNPEM e membros do LNBio pela receptividade e auxlio dispensados

    sempre que preciso. Cito aqui alguns como: Cris do ABC que me salvou uma noite e deu preciosas

    dicas, Rosngela da biblioteca, Cludia e Di da lavagem, e Priscila do LMA.

    Aos professores doutores Dulce Helena, Iran Malavazi, Andrea Fuentes, Anderson Cunha e

    Mnica Rosas, por me apresentarem o mundo cientfico. Como j dito a alguns de vocs, sem vocs

    eu no estaria aqui. Muito Obrigado!

    Aos bons amigos, Marina Salles, Ktia, Carol, Adriano, Henry, Heber e Dani por estimularem

    meus passos acadmicos e por compartilharem comigo bons momentos. Muito Obrigado!

    Agradeo especialmente Juliana Poltronieri, que me acompanhou at nessa boa aventura.

    Aos Bolsistas, um a um, pela companhia, risadas, almoos, passeios e troca de experincia

    incrvel. Em especial aos companheiros de LNBio: Andrea, Mariana, Vincius e Felipe. Muito

    Obrigado!

    A todos que contriburam direta ou indiretamente para a realizao deste trabalho.

    Muito Obrigado!

  • 5

    RESUMO

    O Cancro Ctrico, causado por Xanthomonas citri uma doena bacteriana que afeta a

    maioria das variedades comerciais de citros levando a perdas econmicas. Buscando produzir

    plantas de citros resistentes X. citri nosso laboratrio est desenvolvendo linhagens

    transgnicas para porta-enxertos e variedades copa de citros. Baseado em uma anlise de

    expresso gnica em larga escala realizada pelo grupo anteriormente, duas estratgias para a

    produo de plantas de citros resistente X. citri esto sendo utilizadas. A primeira envolve a

    super expresso de um fator de transcrio WRKY conhecido por regular resposta de defesa

    basal em plantas. A segunda estratgia envolve a expresso de efetor bacteriano ativador de

    transcrio do tipo III, ou efetor TAL, o qual age como modulador da expresso gnica no

    hospedeiro. A expresso dos transgenes ser avaliada por PCR e Western Blot. Plantas

    transformadas foram desafiadas com X. citri para o desenvolvimento dos sintomas do cancro,

    que so caracterizados pela formao de pstulas na superfcie da folha. Os nveis de expresso

    de alguns genes de defesa que so alvos dos efetores de Xanthomonas tambm sero

    avaliados nos transgenes.

    Palavras Chave: Xanthomonas citri, efetores TAL, WRKY

    ABSTRACT

    Citrus canker, caused by Xanthomonas citri, is a bacterial disease that affects most of the

    commercial citrus varieties leading to economic losses. With the aim of producing citrus plants

    resistant to X. citri our laboratory is developing transgenic lines for citrus rootstock and scion

    varieties. Based on a large scale gene expression analysis undertaken by the group previously,

    two strategies for the production of citrus plants resistant to X. citri are being used. The first

    involves the overexpression of a WRKY transcription factor known to regulate basal defense

    responses in plants. The second strategy involves the expression of a bacterial type III

    transcription activator effector, or TAL effector, which acts as a modulator of gene expression in

    the host. The expression of the transgenes will be evaluated by PCR and Western blot analysis.

    Transformed plants were challenged with X. citri for the development of canker symptoms, which

    are characterized by the formation of raised pustules on the leaf surface. The expression levels of

    a number of defense-related genes as direct targets of the Xanthomonas TAL effector will also be

    examined in the transgenes.

    Keywords: Xanthomonas citri, TAL effectors, WRKY.

  • 6

    SUMRIO

    LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 7

    1 REVISO DE LITERATURA ................................................................................... 8

    O cancro ctrico .................................................................................................... 8

    Interao Planta Patgeno .................................................................................. 9

    Efetores TAL ...................................................................................................... 10

    Fatores de transcrio do tipo WRKY ................................................................. 11

    Estratgias para obteno de plantas resistentes ao cancro ctrico. .................. 12

    2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 13

    3 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 13

    Deteco de plantas geneticamente modificadas por PCR.. .............................. 13

    Subclonagem, expresso e purificao do fator de transcrio do tipo WRKY. . 14

    Anlise da expresso dos transgenes. ............................................................... 16

    Avaliao dos nveis transcricionais de genes de interesse. .............................. 18

    Desafio das plantas com Xanthomonas citri e avaliao fenotpica ................... 19

    4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 20

    Deteco de plantas geneticamente modificadas por PCR.. .............................. 20

    Subclonagem, expresso e purificao do fator de transcrio do tipo WRKY. . 23

    Anlise da expresso dos transgenes.. .............................................................. 25

    Avaliao dos nveis transcricionais de genes de interesse. .............................. 29

    5 CONCLUSO E PERSPECTIVAS ....................................................................... 30

    6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 31

  • 7

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1: Leses caractersticas do Cancro Ctrico em frutos e folhas. .................................. 8

    Figura 2 - Esquematizao de um efetor TAL.. .................................................................... 10

    Figura 3 - Representao dos aminocidos da poro N-terminal de um fator WRKY de

    Arabdopsis thaliana ........................................................................................................... 122

    Figura 4A Eletroforese em gel de agarose 1% de extraes de DNA por metodologia

    convencional (CTAB). 4B -Eletroforese em gel de agarose 1% de extraes de DNA por

    metodologia convencional tratadas com RNAse Mix (Fermentas) ....................................... 20

    Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR para detectar plantas

    transformadas com efetores TAL. ..................................................................................... 21

    Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR para detectar plantas

    transformadas com efetores TAL/ Platinum Taq Polimerase (Invitrogen) e DNA tratado com

    RNAse.. ............................................................................................................................... 22

    Figura 7 - Eletroforese em gel de agarose 1% de reao de PCR de Gradiente de

    temperatura para otimizar a PCR para amplificao dos efetores TAL em plantas

    trasnformadas. ..................................................................................................................... 22

    Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose 1% de PCR para identificao de plantas

    transformadas com efetores TAL nas condies otimizadas ................................................ 23

    Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose 1% de digestes para subclonagem. ................. 23

    Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose 1% de PCR de colnias de E.Coli DH5

    transformadas com a construo pET28a/WRKY. ............................................................... 24

    Figura 11 - Anlise da expresso e purificao da protena WRKY em E. Coli BL21 (DE3)

    por SDS-PAGE 13%. ........................................................................................................... 25

    Figura 12 Anlise da extrao de protenas totais de folhas transformadas por SDS-PAGE

    10% e 13%. ......................................................................................................................... 26

    Figura 13 Western Blot das protenas de interesse em plantas transformadas. ................ 26

    Figura 14 Western Blot para avaliao de alquotas de anticorpo anti-PthA disponveis.. 27

    Figura 15 Western Blot para teste de deteco de anticorpo anti-WRKY. ......................... 27

    Figura 16 - Correlao entre Western Blot de plantas transformadas com fator WRKY e

    fentipo das plantas desafiadas com X. citri ..................................................................... 28

    Figura 17 Correlao entre Western Blot de plantas transformadas com fator WRKY e

    fentipo das plantas desafiadas com X. citri .................................................................... 29

    Figura 18 Eletroforese de RNA em gel de agarose 1% desnaturante.. ............................. 30

  • 8

    1 REVISO DE LITERATURA

    O Cancro Ctrico

    O setor da citricultura um dos mais expressivos dentro do agronegcio no

    Brasil: suas exportaes renderam, em 2009, 2,15 milhes de toneladas de

    produtos e US$ 1,84 bilho em receita, representando cerca de 3% das exportaes

    do agronegcio do pas (NEVES et al., 2009).

    Uma das maiores ameaas citricultura o Cancro Ctrico, causado por duas

    linhagens de bactrias gram-negativas do gnero Xanthomonas: Xanthomonas citri

    (Xac) e Xanthomonas aurantifolii (Xaa). Os dois grupos causam sintomas bem

    parecidos em seus hospedeiros, sugerindo um mecanismo comum de

    patogenicidade (BRUNINGS; GABRIEL, 2003).

    Os sintomas mais evidentes do cancro so decorrentes de hiperplasia (aumento

    da diviso celular) e hipertrofia (aumento do volume celular), desencadeadas pelo

    patgeno ao alterar a transcrio de alguns genes do hospedeiro (CERNADAS et

    al., 2008), levando formao de leses circulares, inchadas e encharcadas nas

    folhas, frutos e galhos. Tecidos jovens como folhas de brotaes e frutos nas

    primeiras fases de crescimento so mais susceptveis a infeco com Xanthomonas

    citri (BRUNINGS & GABRIEL, 2003).

    A entrada da Xanthomonas citri no tecido vegetal ocorre por aberturas como

    estmatos, hidatdios e feridas provocadas por espinhos e/ou larva mineradora dos

    citros. A Xac se instala no mesfilo e em estgio avanado da doena as leses

    podem romper a epiderme liberando bactria no ambiente contribuindo para a

    disseminao, que facilitada por ventos, chuvas, insetos, alm de equipamentos

    de colheita e manuteno das plantas (AMARAL, 2003; BRUNINGS; GABRIEL,

    2003).

    Figura 1: Leses caractersticas do Cancro Ctrico em frutos e folhas.(BRUNINGS & GABRIEL,

    2003).

  • 9

    Trata-se de uma doena economicamente importante e por tal a bactria

    causadora alvo de estudos moleculares buscando desenvolvimento de

    ferramentas para controle desta e/ou produo de plantas resistentes para reduzir

    perdas de produo (AMARAL, 2003).

    Interao Planta - Patgeno.

    As plantas esto constantemente sujeitas a infeco por patgenos. Uma das

    formas de reconhecer e responder a infeco envolve a percepo de padres

    moleculares associados a microrganismos/patgenos (microbial- or pathogen-

    associated molecular patterns ou MAMPs/PAMPs), isto , molculas que so

    conservadas e essenciais (exemplos so: flagelina e lipossacardeos) nos

    microrganismos, so detectadas por receptores presentes na superfcie celular do

    hospedeiro. Esses receptores costumam possuir domnios citoplasmticos que

    sinalizaro clula o reconhecimento feito no meio extracelular, como o caso do

    receptor da flagelina cujo domnio citoplasmtico ativa uma cascata de sinalizao

    por MAPKs (Mitogen-activated protein kinases) que resultar em resposta de

    defesa. Trata-se de um processo lento (JONES; DANGL, 2006).

    Uma segunda linha de defesa ocorre dentro da clula do hospedeiro atravs

    da expresso de genes de resistncia (R) cujos produtos protecos costumam

    possuir domnios de ligao a nucleotdeo (Nucleotide Binding ou NB) e domnios

    ricos em leucina (leucine rich repeat ou LRR), sendo esses ltimos importantes para

    realizao de interaes protena-protena. Essas protenas podem, na clula do

    hospedeiro, reconhecer protenas do patgeno ditas de avirulncia (avr), que so

    geralmente responsveis pelo desencadeamento da patologia e foram translocadas

    para o ambiente celular do hospedeiro. Esse reconhecimento lembra uma interao

    do tipo receptor-ligante e desencadeia respostas de defesa que promovem a rpida

    morte celular no local da infeco para conter o avano do patgeno em um evento

    chamado resposta de hipersensibilidade (hypersensitive response ou HR). Caso o

    patgeno no avance temos uma interao planta-patgeno incompatvel. Em

    contrapartida, quando a interao avr/R no ocorre, possivelmente por ausncia do

    gene R correspondente no hospedeiro, o fator Avr fica livre para agir na clula

    vegetal, provavelmente desencadeando os sintomas por consequncia de mediar

  • 10

    modificaes na clula do hospedeiro. Essa interao dita compatvel (FEBRES et

    al., 2009; DOMINGUES, 2011).

    Efetores TAL

    Aps se instalar no mesfilo do hospedeiro, a bactria transloca para as

    clulas vegetais algumas molculas ditas efetoras. Essa translocao mediada

    pelo sistema de secreo tipo III (T3S). Os efetores podem suprimir respostas de

    defesa, desencadear os sintomas da patologia e alterar a bioqumica do ambiente

    celular.

    Efetores de Xanthomonas citri da famlia AvrBs3/PthAs so efetores que em

    especial modulam a expresso gnica do hospedeiro. Esses efetores ativadores de

    transcrio (transcription activator-like ou TAL) so compostos estruturalmente por:

    um domnio central de 34/35 resduos de aminocidos que se repetem em tandem

    sendo as repeties de nmero varivel; domnios de localizao nuclear (nuclear

    localization signals ou NLS) e de ativao transcricional (acidic transcription

    activator-like domain ou AAD). (Figura 2).

    Aps sua translocao pelo T3S estes so endereados ao ncleo aps

    reconhecimento da regio do NLS por uma -importina, que com o apoio de uma -

    importina promovem a importao do efetor para o ncleo. No ncleo esses efetores

    vo modular a expresso gnica do hospedeiro contribuindo para o desenvolvimento

    do cancro e suprimindo respostas de defesa basais da planta. Estudos j

    demonstraram que a expresso transiente de PthA (um efetor TAL de X. citri) em

    citros suficiente para induzir hiperplasia e hipertrofia (KAY; BONAS, 2009;

    BOGDANOVE et al., 2010).

    O mecanismo molecular de ligao dos efetores TAL ao DNA foi elucidado e

    depende da participao dos domnios repetitivos de 33/34 aminocidos, onde os

    Figura 2 - Esquematizao de um efetor TAL. Esto representados os domnios internos

    repetitivos, o domnio rico em leucina (LRR), os sinalizadores nucleares (NLS) e o domnio cido de

    ativao transcricional (AAD). Na poro N-terminal tambm comum a existncia de sinalizadores

    para o sistema secretrio tipo III (TS3).

  • 11

    aminocidos das posies 12/13 so resduos variveis (RAV) e h um cdigo para

    o reconhecimento especfico de uma sequncia de nucleotdeos sendo cada

    diferente par de aminocidos 12/13 reconhecedor de um nucleotdeo especfico .

    Esses estudos possibilitaram predizer alvos de ligao dos efetores TAL atravs da

    anlise dos RAVs contidos em suas regies repetitivas (BOCH et al., 2009).

    X. aurantifolii apresentam efetores equivalentes aos PthAs de X.citri. Nosso

    grupo levantou possveis genes de laranja alvos desses efetores TAL de X.

    aurantifolii, constatamos dentre estes alguns genes relacionados ao sistema de

    defesa. Sabendo que infeco de X. aurantifolii em laranja induz uma srie de

    genes relacionados resposta de defesa com pouco ou nenhum desenvolvimento

    de sintomas (CERNADAS et al., 2008) sugerimos a ocorrncia de transativao de

    genes de defesa pelos efetores de X. aurantifolii. Esse trabalho busca avaliar os

    nveis transcricionais de alguns desses genes possivelmente transativados em

    plantas transformadas com os efetores TAL de X. aurantifolii. Esses estudos sero

    feitos por q-RT PCR.

    Fatores de transcrio do tipo WRKY

    Protenas do tipo WRKY so fatores de transcrio bem distribudos no Reino

    Vegetal. Sua estrutura marcada por um domnio (WRKY - triptofano; arginina;

    lisina; tirosina) de aproximadamente 60 aminocidos com atividade

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