Caracterização fenotípica pelo antibiograma de cepas de ... ?· Caracterização fenotípica pelo…

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<ul><li><p>1221Caracterizao fenotpica pelo antibiograma de cepas de Escherichia coli isoladas de manipuladores...</p><p>Cincia Rural, v.36, n.4, jul-ago, 2006.</p><p>Cincia Rural, Santa Maria, v.36, n.4, p.1221-1227, jul-ago, 2006</p><p>ISSN 0103-8478</p><p>RESUMO</p><p>Este trabalho objetivou caracterizarfenotipicamente isolados de Escherichia coli a partir deamostras obtidas de mos e narizes de manipuladores, de leitecru e de queijo Minas Frescal produzidos em um laticnio emGois, Brasil, visando a estabelecer uma relao decontaminao entre o manipulador e/ou a matria-prima e oproduto final. Foram coletadas 24 amostras de leite cru e dequeijo Minas Frescal, 46 swabs de mos e 46 de narizes dosmanipuladores envolvidos na fabricao do queijo, no perodoentre maro/2004 e fevereiro/2005. As 69 cepas isoladas foramsubmetidas ao teste de suscetibilidade a seis antimicrobianos(ampicilina, cefalotina, ciprofloxacina, gentamicina,sulfametoxazol trimetoprin e tetraciclina) e, a partir deste teste,foi possvel agrup-las em 17 diferentes perfis fenotpicos (AQ). Somente um perfil fenotpico (E) foi semelhante entre cepasde E. coli isoladas, tanto de amostra de queijo (14Qb) como deum dos manipuladores (10M1). Tal resultado sugere umapossvel contaminao do produto durante a sua manipulao;portanto, apenas neste caso pde-se estabelecer a origem daE. coli para o queijo. Nas demais situaes, no foi possveldeterminar a fonte da bactria para o queijo. Conclui-se que oantibiograma no se mostrou um teste eficiente nadeterminao da fonte de microrganismos para o produtofinal.</p><p>Palavras-chave: Coliformes, manipulao, leite cru, queijoMinas Frescal.</p><p>ABSTRACT</p><p>The present work aimed to type E. coli strainsobtained from handlers hands and noses, raw milk and MinasFrescal cheese produced by a dairy milk processing plant inGois, Brazil in order to establish a contamination relationshipbetween the sources of E. coli and cheese. Twenty-four sampleswere collected from raw milk and Minas Frescal cheese, 46</p><p>from hands and 46 from noses of handlers involved in thecheese manufacturing, between March/2004 and February/2005. All 69 E. coli strains isolated were submitted to thesusceptibility test for six antimicrobials (ampicillin, cephalothin,ciprofloxacin, gentamicin, trimethopim-sulphamethoxazoleand tetracycline. The strains were grouped in 17 differentphenotypic susceptibility profiles (A-Q). The test allowed toestablish correlation among a cheese strain (14Qb) and ahandler (10M1) strain that presented the same susceptibilityprofile (E) suggesting a possible product contamination duringthe handling. In conclusion, the phenotypic susceptibilityprofiles determinated by the antibiogram method failed toestablish a correlation between the strains obtained from theprobable sources (handlers and milk) and the final products.</p><p>Key words : Coliforms, handling, raw milk, Minas Frescalcheese.</p><p>INTRODUO</p><p>O leite considerado, devido suacomposio qumica, um excelente meio de cultura,podendo ser facilmente contaminado por vriosmicrorganismos (DOYLE et al., 1997; CHYE et al., 2004).Portanto, o leite deve ser obtido com a mxima higienee mantido em baixa temperatura, desde a ordenha at oseu beneficiamento, visando a garantir ascaractersticas fsicas, qumicas e nutricionais(BONFOH et al., 2003). A composio do leite, suamicrobiota natural, a contaminao ps-pasteurizao,o processamento e manipulao, os equipamentos, atemperatura inadequada durante estocagem e otransporte podem resultar em altos nveis de</p><p>1Faculdade de Nutrio, Universidade Federal de Gois (UFG), Goinia, Gois, Brasil. Rua 23, n. 243, 704, Setor Central, 74015-120, Goinia, Gois, Brasil. E-mail: raq7@brturbo.com.br. *Autor para correspondncia.</p><p>2Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica,UFG, Goinia, Gois, Brasil.</p><p>Caracterizao fenotpica pelo antibiograma de cepas de Escherichia coli isoladas demanipuladores, de leite cru e de queijo Minas Frescal em um</p><p>laticnio de Gois, Brasil</p><p>Maria Raquel Hidalgo Campos1* Andr Kipnis2 Maria Cludia Dantas Porfrio Borges Andr2Carla Atavila da Silva Vieira2 Liana Borges Jayme1</p><p>Patrcia Pimentel Santos2 lvaro Bisol Serafini2</p><p>Phenotypic characterization by antibiogram of Escherichia coli strains isolated from handlers, rawmilk and Minas Frescal cheese samples in a dairy process</p><p>plant in Gois, Brazil</p><p>Recebido para publicao 27.09.05 Aprovado em 08.02.06</p></li><li><p>1222 Campos et al.</p><p>Cincia Rural, v.36, n.4, jul-ago, 2006.</p><p>microrganismos patognicos em queijos (ARAJO etal., 2002).</p><p>No Brasil, a indstria de laticnios expressiva. Em 2003, foram produzidos 22.254 milhesde litros de leite (IBGE, 2003) e em 2002, foramproduzidas 31.762 toneladas de queijo Minas Frescal(BARROS et al, 2004).</p><p>O queijo Minas Frescal um queijo branco,semelhante ao Queso Blanco fabricado em outrospases da Amrica Latina, produzido a partir de leite devaca pasteurizado, caracterizado por alta atividadegua, baixo pH (5,15,6) e 1 a 6% de Cloreto de Sdio(NaCl) (FREITAS et al., 1993). Possui cerca de 43% a55% de umidade e uma vida de prateleira de 10 a 14 dias(GONZALEZ et al., 2000). Na sua fabricao, utiliza-secoalho enzimtico ou qumico, remove-se o soro erealiza-se a moldagem e a salga (ARAJO et al., 2002).Esse queijo tem ampla aceitao comercial e faz partedo hbito alimentar da populao das diversas regiesdo pas (LOGUERCIO &amp; ALEIXO, 2001; ALMEIDAFILHO et al., 2002; CMARA et al., 2002; CARDOSO&amp; ARAJO, 2004; ROOS et al., 2005). Destaca-se quegeralmente fabricado a partir de leite cru, sendo umproblema em sade pblica, pois constitui-se em veculopara inmeros agentes etiolgicos de enfermidadeszoonticas, entre eles a E. coli (ARAJO et al., 2002;SCHOUTEN et al., 2004).</p><p>Segundo DE BUYSER et al. (2001), difcilestimar a proporo de doenas transmitidas por leitee derivados, devido s limitaes dos sistemas devigilncia. Na Frana, o leite e os seus derivadosestiveram envolvidos em 5% dos 3.839 surtos dedoenas transmitidas por alimentos de origembacteriana entre 1988 e 1997. Neste pas, dos 60 surtosrelatados, 48% foram relacionados ao leite cru. Domesmo modo, de 1 a 5% dos casos relatados em outrospases como Esccia, Inglaterra e Pas de Gales(COWDEN et al., 1995; AMMON, 1997), EstadosUnidos (BEAN et al., 1997) e Holanda (SIMONE et al.,1997) estiveram relacionados ao leite cru.</p><p>No Brasil, tem-se evidenciado a presenade microrganismos patognicos em queijo MinasFrescal, sendo amplamente reconhecida a presena decoliformes fecais neste produto em vrios estudosrealizados em diferentes locais, como em Belo Horizonte/MG (PEREIRA et al., 1999), em Cuiab/MT(LOGUERCIO &amp; ALEIXO, 2001), em Poos de Caldas/MG (ALMEIDA FILHO &amp; NADER FILHO, 2002), emcidades do interior do Paran (KOTTWITZ &amp;GUIMARES, 2003), no Rio de Janeiro/RJ (BARROSet al., 2004), no Distrito Federal (CARDOSO &amp;ARAJO, 2004) e em Trs Passos/RS (ROOS et al.,2005).</p><p>A E. coli faz parte da microbiota entrica demamferos e aves, sendo uma bactria Gram-negativapertencente famlia Enterobacteriaceae (BRENER,1984). isolada com freqncia em alimentos e emprodutos lcteos, incluindo os armazenados sobrefrigerao (NATARO &amp; KAPER, 1998; FDA, 2002).</p><p>Nas ltimas duas dcadas, muitos mtodostm sido aplicados para comparar cepas de E. coli natentativa de identificar os mecanismos de transmissoe as fontes de contaminao (ZADOKS et al., 2002).Entre as tcnicas fenotpicas utilizadas, o teste desuscetibilidade a antimicrobianos tem sidoespecialmente usado devido a seu baixo custo e facilidade de execuo, alm de contribuir para informarsobre a resistncia microbiana (KLUYTMANS et al.,1995; ACCO et al., 2003).</p><p>O objetivo deste estudo foi caracterizarfenotipicamente, por meio do teste de suscetibilidadein vitro, as cepas de E. coli isoladas das amostras demanipuladores de leite cru e de queijo Minas Frescalanalisadas e determinar a relao de contaminao, sepresente, entre a matria-prima (leite cru), ou omanipulador e o produto final (queijo).</p><p>MATERIAL E MTODOS</p><p>No perodo de maro de 2004 a fevereiro de2005, foram coletadas 140 amostras em um laticnio noestado de Gois, sendo: 24 amostras de leite cru (nopasteurizado), 24 amostras de queijo ( 500g), 46amostras de mos e 46 de nasofaringe obtidos de quatromanipuladores, funcionrios da rea de processamentode queijo. As amostras foram colhidas quinzenalmente(uma de leite cru, uma de queijo fabricado a partir domesmo leite coletado, uma da nasofaringe e uma dasmos de cada manipulador que trabalhava no dia dacoleta), segundo os critrios estabelecidos porMIDURA &amp; BRYANT (2001).</p><p>As anlises microbiolgicas foram realizadasno Laboratrio de Microbiologia de Alimentos daUniversidade Federal de Gois e se basearam nastcnicas descritas no FDA (2002). Foram feitas asseguintes determinaes: anlise presuntiva paracoliformes, coliformes fecais e E. coli; anliseconfirmativa para coliformes; completa para E. coli(colorao de Gram e provas do IMViC). Como testefenotpico de tipagem bacteriana, foi realizado o testede suscetibilidade a antimicrobianos de todos isolados,usando a tcnica de difuso em placas segundo NCCLS(2003). Os antibiticos usados foram ampicilina,cefalotina, ciprofloxacina, gentamicina, sulfametoxazoltrimetoprin e tetraciclina. A interpretao dosresultados foi feita de acordo com os padres do NCCLS(2003).</p></li><li><p>1223Caracterizao fenotpica pelo antibiograma de cepas de Escherichia coli isoladas de manipuladores...</p><p>Cincia Rural, v.36, n.4, jul-ago, 2006.</p><p>RESULTADOS E DISCUSSO</p><p>Na tabela 1, pode ser observado que umtotal de 69 cepas de E. coli foram isoladas das 47amostras positivas de leite cru, de queijo Minas Frescal,de nasofaringe e das mos de manipuladores dolaticnio local do estudo. A presena de diversas cepasde E. coli indica que essa contaminao pode ser deorigem fecal e, portanto, esse alimento est emcondies higinicas insatisfatrias, representandorisco direto sade humana e animal (NATARO &amp;KAPER, 1998; BABK et al., 2005).</p><p>ContaminaoManipuladores - O laticnio estudado</p><p>contava, poca da pesquisa, com quatro funcionriosque trabalhavam diretamente na fabricao do queijo,codificados em algarismos 1, 2, 3 e 4. Dos quatromanipuladores, trs (75%) apresentaram-secontaminados, pelo menos uma vez, nas mos e/ou nonariz durante o perodo da coleta. Das 46 amostrasobtidas da nasofaringe e das 46 obtidas a partir dasmos dos manipuladores investigados, foram isoladas11 (12%) cepas de E. coli, sendo trs (6,5%) danasofaringe e oito (17,4%) das mos (Tabela 1).</p><p>Esses resultados mostram porcentagens decontaminao superiores aos obtidos em outraspesquisas. A Organizao Mundial de Sade relata que60% das doenas de origem alimentar so provocadaspor microrganismos, sendo o manipulador o principalveculo dessa transmisso (SILVA JR., 2002). CURTISet al. (2000) encontraram E. coli nas mos de 21,9%dos manipuladores de um restaurante em Caracas,Venezuela. J no estudo realizado por CARDOSO(1999), foi encontrada uma porcentagem superior(97,3%) de E. coli em mos de manipuladores derestaurantes da Bahia.</p><p>A E. coli faz parte da microbiota do tratogastrointestinal humano desde o nascimento. A partirda, pode disseminar para outras regies do corpo econseqentemente para os alimentos, quando</p><p>produzidos sem os conhecimentos adequados de boasprticas de manipulao (NATARO &amp; KAPER, 1998).De acordo com OLIVEIRA et al. (2003), a E. coli estentre os principais responsveis por surtos detoxinfeco alimentar quando associados condieshiginico-sanitrias insatisfatrias dos manipuladores,como falha na higienizao das mos, indicandocontaminao de origem fecal. Portanto, diante dosresultados encontrados neste estudo, a presenadestas bactrias nas mos e na nasofaringe dosmanipuladores representa grande importnciaepidemiolgica devido possibilidade de transfernciaessas bactrias aos alimentos durante toda a sua cadeiade produo.</p><p>Leite cru - Das 24 amostras de leite crucoletadas, 19 (79,2%) apresentaram contaminao porE. coli, isolando-se 33 cepas. Dados semelhantesforam encontrados em pesquisa realizada por REA etal. (1992) sobre a ocorrncia de bactrias indicadoras epatognicas no leite cru na Irlanda, onde evidenciaramcoliformes em 100% das amostras analisadas, sendo60% delas contaminadas por E. coli (Tabela 1).</p><p>No Estado de So Paulo, BADINI (1993)observou que, de 60 amostras de leite cru, 68,3%apresentaram contagens de microrganismos mesfilos;destes, 83,3% foram de coliformes totais e 18,3% decoliformes fecais. CHYE et al. (2004), pesquisando 360fazendas de gado leiteiro na Malsia, analisaram 930amostras de leite cru e relataram que 90% das amostrascontinham coliformes e 65% estavam contaminadas porE. coli com contagens acima dos padres permitidos.</p><p>Segundo LIRA et al. (2004), a carne bovinae o leite cru tm sido confirmados como as fontes maisprovveis de doenas transmitidas por alimentos emsurtos investigados na ltima dcada, principalmenteno Canad, nos Estados Unidos, no Reino Unido e noJapo. A carga microbiana inicial do leite estdiretamente relacionada higiene da ordenha e limpeza dos utenslios utilizados para sua coleta etransporte.</p><p>Tabela 1 - Contaminao por E. coli e amostras obtidas de narizes e mos de manipuladores, de leite cru e de queijo Minas Frescal coletadasem laticnio de Gois, Brasil, 2004/2005.</p><p>Amostras positivasFonte Nmero de amostrascoletadas Nmero Freqncia (%)</p><p>Nmero de cepasisoladas</p><p>Nariz 46 03 6,5 03Manipulador</p><p>Mos92</p><p>4611</p><p>0812,0</p><p>17,411</p><p>08Leite cru 24 19 79,2 33Queijo 24 17 70,8 25</p><p>TOTAL 140 47 - 69</p></li><li><p>1224 Campos et al.</p><p>Cincia Rural, v.36, n.4, jul-ago, 2006.</p><p>Considerando que, neste estudo, 79,2% dasamostras avaliadas apresentaram E. coli e que o leiteno sofreu nenhum processo de pasteurizao para afabricao do queijo, cepas patognicas provenientesde contaminao fecal do animal e/ou do manipuladordurante a obteno do leite e a produo do queijopodem ser disseminadas para o consumidor.</p><p>Queijo Minas Frescal - Observou-se apresena de E. coli em 17 (70,8%) das 24 amostras dequeijo Minas Frescal coletadas, sendo isoladas 25cepas (Tabela 1).</p><p>Resultados semelhantes foramapresentados por PEREIRA et al. (1999), na cidade deBelo Horizonte, os quais observaram 74,3% decontaminao por coliformes fecais em amostras dequeijo Minas Frescal. MONGE et al. (1994) estudaram20 amostras de queijos comercializados em San Jos,Costa Rica, identificando E. coli em 100% das amostrase em contagens superiores a 1.100/g.</p><p>O elevado percentual de amostras de queijoMinas Frescal apresentando E. coli bastantepreocupante, haja vista o risco potencial de causarenfermidades e ainda a possibilidade da presena deoutros enteropatgenos como a Salmonella. Osresultados encontrados demonstram que as condieshiginico-sanitrias do produto testado no sosatisfatrias, podendo apresentar risco sade dosconsumidores em razo de sua larga comercializaono Estado.</p><p>Diante deste quadro, seria recomendada aatuao mais incisiva dos rgos de fiscalizao</p><p>sanitria, no intuito de aplicar o que preconizado naproduo deste tipo de queijo, como a pasteurizaodo leite. uma prtica simples que, se corretamenteaplicada, permite a diminuio da carga microbianainicial com conseqente eliminao de patgenos. Almdisso, a implementao das boas prticas de fabricaominimizaria o perigo da provvel contaminao humanae ambiental.</p><p>Tipagem por meio de suscetibilidade aantimicrobianos - A suscetibilidade das 69 cepas de E.coli isoladas frente aos antimicrobianos testados estdemonstrada na tabela 2. Quarenta e dois dos isolados(60,9%) foram suscetveis a todos os antibiticostestados. Destaca-se que, entre os manipuladores, osisolados a partir do nariz apresentaram resistncia de33,3% cefalotina, ao sulfametoxazol trimetropim e tetraciclina. Nenhuma cepa isolada do nariz apresentouresistncia ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina.As cepas isoladas das mos apresentaram resistnciade 12,5% para cefalotina e tetraciclina e no foiobservada resistncia ampicilina, ciprofloxacina, gentamicina e aosulfametoxazol trimetropim.</p><p>Em relao ao leite cru, maior resistncia(18,2%) foi encontrada para tetraciclina, sendo quenenhum isolado apresentou resistncia ciprofloxacinae gentamicina. Quanto ao queijo Minas Frescal,observou-se resistncia (4,0%) ampicilina, aosulfametoxazol trimetoprim e tetraciclina esusceptibilidade aos demais antibiticos.</p><p>A partir do teste de suscetibilidade para as69 cepas isoladas, foi possvel agrup-las em 17</p><p>Tabela 2 - Suscetibilidade aos antimicrobianos das cepas de E. coli isoladas de amostras obtidas de manipuladores, leite cru e de queijoMinas Frescal coletadas em laticnio de Gois, Brasil, 2004 / 2005.</p><p>Antimicrobianos no (%)Fonte Suscetibilidade*</p><p>AMP CEF CIP GEN SUT TET</p><p>S 3(100) 1 (33,3) 2 (66,7) 3 (100) 2 (66,7) 2 (66,7)SI 0 (0) 1 (33,3) 1 (33,3) 0 (0) 0 (0) 0 (0)Nariz (3)R 0 (0) 1 (33,3) 0 (0) 0 (0) 1 (33,3) 1 (33,3)S 8 (100) 6 (75) 7 (87,5) 8 (100) 8 (100) 6 (75)SI 0 (0) 1 (12,5) 1 (12,5) 0 (0) 0 (0) 1 (12,5)</p><p>Man</p><p>ipul</p><p>ador</p><p>es</p><p>Mos (8)R 0 (0) 1 (12,5) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (12,5)S 29 (87,8) 22 (66,7) 32 (97) 33 (100) 32 (97) 23 (69,7)SI 2 (6,1) 7 (21,2) 1 (3) 0 (0) 0 (0) 4 (12,1)Leite cru (33)R 2 (6,1) 4 (12,1) 0 (0) 0 (0) 1 (3) 6 (18,2)S 24 (96) 22 (88) 24 (96) 24 (96) 24 (96) 23 (92)SI 0 (0) 3 (12) 1 (4) 1 (4) 0 (0) 1 (4)Queijo (25)R 1 (4) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (4) 1 (4)</p><p>* S sensibilidade; SI sensibilidade intermediria; R - resistnciaAMP ampicilina; CEF cefalotina; CIP ciprofloxacina; GEN gentamicina;SUT sulfametoxazol-trimetoprin, TET tetraciclina</p></li><li><p>1225Caracterizao fenotpica pelo antibiograma de cepas de Escherichia coli isoladas de manipuladores...</p><p>Cincia Rural, v.36, n.4, jul-ago, 2006.</p><p>diferentes perfis fenotpicos (A Q), conformeapresentado na tabela 3. Das cepas isoladas, 42 seapresentaram no perfil A, seis no perfil B, trs no perfilC, duas nos perfis D a G, e os demais perfis com umacepa cada.</p><p>No presente estudo, foi possvel identificarapenas um perfil fenotpico (E) semelhante entre cepasde E. coli isoladas, tanto de amostra de queijo (14Qb)como de amostra de um dos manipuladores (10M1). Talresultado sugere que possa ter ocorrido contaminaodo queijo durante a sua manipulao; portanto, apenasneste caso pde-se estabelecer a origem da E. colipara o produto final. Nas demais situaes, no foipossvel determinar a fonte da bactria para o queijo,pois, dentro dos mesmos perfis, houve a presena decepas isoladas tanto do manipulador quanto do leite.</p><p>Nas ltimas duas dcadas, muitos mtodostm sido aplicados para comparar cepas de E. coli afim de identificar os mecanismos de transmisso efontes de contaminao (ZADOKS et al., 2002). Entreas tcnicas fenotpicas, o teste de suscetibilidade aantimicrobianos tem sido especialmente usado devido</p><p>a seu baixo custo, facilidade de execuo, alm decontribuir para informar sobre a resistncia microbiana(KLUYTMANS et al., 1995; ACCO et al., 2003).</p><p>Porm, os mtodos de tipagem fenotpica,que detectam caractersticas expressadas pelosmicrorganismos, so limitados pela capacidade destesem alterar a expresso de genes. Mutaes pontuaispodem resultar em regulao anormal ou em alteraofuncional do gene responsvel por um fentipodeterminado. Assim, isolados da mesma espcie egeneticamente indistinguveis podem apresentarfentipo variado. Portanto, os testes de resistncia aantimicrobianos podem ser teis como triagem inicialpara identificao de cepas de microrganismos emsurtos de doenas transmitidas por alimentos, podendoser complementados com mtodos de tipagemgenotpica (ARBEIT, 1999; TENOVER et al., 1997).Entretanto, o antibiograma apresenta limitaes, com

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