Caracterização fenotípica e molecular de leveduras isoladas em um

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<ul><li><p>UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS </p><p>CARACTERIZAO FENOTPICA E MOLECULAR DE </p><p>LEVEDURAS ISOLADAS EM UM HOSPITAL DO MATO GROSSO </p><p>DO SUL </p><p>LUANA MIRELI CARBONERA RODRIGUES </p><p>DOURADOS- MS </p><p>2015 </p></li><li><p>LUANA MIRELI CARBONERA RODRIGUES </p><p>CARACTERIZAO FENOTPICA E MOLECULAR DE </p><p>LEVEDURAS ISOLADAS EM UM HOSPITAL DO MATO GROSSO </p><p>DO SUL </p><p>Dissertao apresentada Universidade </p><p>Federal da Grande Dourados Faculdade </p><p>de Cincias da Sade, para obteno do </p><p>Ttulo de Mestre em Cincias da Sade. </p><p>Orientadora: Dra. Kelly Mari Pires de </p><p>Oliveira. </p><p>DOURADOS- MS </p><p>2015</p></li><li><p>Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP). </p><p>R685c Rodrigues, Luana Mireli Carbonera. </p><p>Caracterizao fenotpica e molecular de leveduras isoladas em </p><p>um hospital do Mato Grosso do Sul. / Luana Mireli Carbonera </p><p>Rodrigues. Dourados, MS : UFGD, 2015. </p><p>52f. </p><p>Orientador: Profa. Dra. Kelly Mari Pires de Oliveira. </p><p>Dissertao (Mestrado em Cincias da Sade) Universidade </p><p>Federal da Grande Dourados. </p><p>1. Candida. 2. CHROMagar Candida. 3. VITEK 2.4. Anlise da </p><p>sequencia de DNA. 5. Susceptibilidade antifngica. I. Ttulo. </p><p>CDD 664.68 </p><p>Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca Central UFGD. </p><p>Todos os direitos reservados. Permitido a publicao parcial desde que citada </p><p>a fonte. </p></li><li><p>ii </p><p>Agradecimentos </p><p>Agradeo primeiramente a Deus pela vida, amor e grandiosa bondade para com </p><p>seus filhos. Que sempre me concede foras e me guia pelos caminhos do bem. Confio </p><p>em teus planos Senhor. </p><p>Ao meu anjo da guarda, Dr. Eduardo Henrique Carbonera Ramos (in memorian) </p><p>por ser meu espelho e minha fora, por cuidar to bem de nossa famlia e nos proteger ai </p><p>de cima. Amo-te meu Irmo. Sempre te amarei, Eternamente. </p><p> minha orientadora Prof. Dr. Kelly Mari Pires de Oliveira pela amizade, </p><p>carinho e ateno para comigo durante toda a realizao deste trabalho. Por sua </p><p>dedicao e pelos sbios ensinamentos que levarei para a vida. </p><p>Aos professores do programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade da </p><p>UFGD por todos os ensinamentos passados durante as disciplinas ministradas. </p><p> minha famlia, meu tudo. Obrigada por me apoiarem em tudo e me dar foras </p><p>para continuar. Longe de seus cuidados aprendi o real valor de seus ensinamentos e o </p><p>quo so essenciais em minha vida. Minha base, meu viver. </p><p>Ao meu namorado Leandro Urbano Marquezim por aguentar todo o meu </p><p>extresse, reclamaes, por me acalmar e cuidar de mim. A distncia nunca nos separou, </p><p>sempre estivemos unidos e sempre com muito amor. Muito Obrigada anjo, no sei se </p><p>conseguiria sem voc! </p><p>As companheiras de mestrado e mais novas amigas que levarei para sempre, </p><p>pelas risadas e momentos de descontraes. Luciana, Masa, Kesia, Flora, Dbora e </p><p>Natlia. </p><p>Ao meu anjo protetor aqui de Dourados, Las, por sempre estar se preocupando e </p><p>me dando foras em todos os momentos. Por me alegrar e me devolver a paz em dias </p><p>ruins e por ter se tornado uma irm. Te amo amiga! </p><p>Aos colegas de graduao Danielle, Louise, Mariany e Adriane por estar comigo </p><p>at hoje e por ter se tornado grandes irms, minhas fofas, presente que Dourados e a </p><p>vida me concedeu. </p><p>Aos colegas de laboratrio de microbiologia aplicada da UFGD pela ajuda, </p><p>companheirismo e momentos felizes, em especial a Mestre Adriana, por todos os </p><p>ensinamentos, ajudas e por me apresentar este mundo da microbiologia. </p><p> Mestre e Microbiologista Flvia Patussi por toda a ajuda durante a realizao </p><p>do projeto, pela pacincia e ajuda no isolamento das leveduras. </p></li><li><p>iii </p><p>A todos os funcionrios do HU-UFGD e da FCBA-UFGD que de alguma forma </p><p>contribuiram para a realizao deste estudo. </p><p> Mestre Danielly Beraldo por toda a ajuda e suporte na biologia molecular. </p><p> UFGD pelo suporte dado durante a realizao do trabalho. </p><p> banca pelas sugestes e trabalho dedicado a avaliao do presente estudo. </p><p> CAPES e a FUNDECT pelo apoio financeiro. </p><p>A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuiram para a realizao deste </p><p>trabalho. </p></li><li><p>iv </p><p>Dedicatria </p><p> Deus, por sempre me conceder sabedoria nas escolhas dos melhores caminhos, </p><p>coragem para acreditar, fora para no desistir e proteo para me amparar. </p><p>A minha famlia pelo amor, apoio, confiana e motivao incondicional. Que sempre </p><p>me impulsiona em direo as vitrias dos meus desafios. </p></li><li><p>v </p><p>Combati o bom combate, terminei a minha carreira, guardei a f. II Timteo 4,7. </p></li><li><p>vi </p><p>Sumrio </p><p>Agradecimentos ................................................................................................................ ii </p><p>Dedicatria....................................................................................................................... iv </p><p>Lista de Abreviaturas ...................................................................................................... vii </p><p>Resumo .......................................................................................................................... viii </p><p>Abstract ............................................................................................................................ ix </p><p>1 INTRODUO ........................................................................................................ 1 </p><p>2 REVISO DA LITERATURA ................................................................................. 3 </p><p>2.1 Histrico e biologia do gnero Candida ............................................................ 3 </p><p>2.2 Candida albicans e Candida no Candida albicans (CNCA) ........................... 4 </p><p>2.3 Principais infeces hospitalares causadas por Candida ................................... 7 </p><p>2.4 Prevalncia e distribuio de Candida ............................................................... 9 </p><p>2.5 Mtodos de identificao de Candida spp. ...................................................... 11 </p><p>2.6 Mecanismos de ao dos antifngicos ............................................................. 14 </p><p>2.7 Resistncia a drogas antifngicas .................................................................... 16 </p><p>3 OBJETIVOS............................................................................................................ 18 </p><p>3.1 Objetivo geral .................................................................................................. 18 </p><p>3.2 Objetivos especficos ....................................................................................... 18 </p><p>4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................... 19 </p><p>5 ARTIGO CIENTFICO........................................................................................... 34 </p><p>6 ANEXOS ................................................................................................................. 51 </p><p>6.1 Anexo 1: Normas para publicao do peridico .............................................. 51 </p><p>6.2 Anexo 2: Carta de Submisso .......................................................................... 52 </p></li><li><p>vii </p><p>Lista de Abreviaturas </p><p>RAPD Analise por DNA polimorfico amplificado ao acaso randomly </p><p> amplified polymorphic DNA analysis </p><p>CNCA Candida no Candida albicans </p><p>UTI Unidade de Terapia Intensiva </p><p>EUA Estados Unidos da Amrica </p><p>RFLP Analise de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restricao - </p><p> Restriction Fragment Length Polymorphisms </p><p>PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado- Pulsed-field Gel Eletrophoresis </p><p>PCR Reao em Cadeia da Polimerase- Polymerase Chain Reaction </p><p>ITS Internal Transcribed Spacer </p><p>HU-UFGD Hospital Universitrio da Universidade Federal da Grande Dourados </p></li><li><p>viii </p><p>Resumo </p><p>A correta identificao dos isolados e a determinao do perfil de susceptibilidade so </p><p>fatores necessrios para uma terapia adequada. O estudo avaliou as diferentes tcnicas </p><p>de identificao de espcies de Candida por meio do VITEK 2, CHROMagar Candida e </p><p>Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). O sistema automatizado VITEK 2 tambm foi </p><p>avaliado para a determinao da suscetibilidade antifngica, em conjunto com o </p><p>mtodo da microdiluio em caldo. 81 amostras de Candida foram coletas de maro de </p><p>2013 a maro de 2014. A identificao das leveduras foi realizada pelo VITEK 2, </p><p>CHROMagar Candida e PCR. O VITEK 2 apresentou 34,6% de identificao incorreta. </p><p>O CHROMagar Candida no identificou 14,8% dos isolados at nvel de espcie e </p><p>apresentou 8,6% de erros em sua identificao. A PCR identificou corretamente 100% </p><p>dos isolados e os dados foram confirmados pelo seqenciamento da regio ITS. O perfil </p><p>de susceptibilidade antifngica foi determinado pelo VITEK 2 e microdiluio em caldo </p><p>(MIC). 11,1% dos isolados apresentaram resistncia a anfotericina B (AMB), 4,9% ao </p><p>fluconazol (FLC) e 2,4% ao voriconazol (VRC). Pelo MIC, 7,4% dos isolados </p><p>apresentaram resistncia e a apenas ao VRC. Um isolado apresentou resistncia ao VRC </p><p>nos dois mtodos de susceptibilidade testados. 50% dos isolados de Candida krusei no </p><p>foi identificado pelo VITEK 2 e 50% dos isolados desta espcie apresentaram como </p><p>susceptvel ao FLC, o que demonstra a importncia de avaliar os dois resultados antes </p><p>da teraputica. Portanto, a PCR uma ferramenta rpida, til e precisa para a </p><p>identificao de leveduras, mas, ainda no vivel para a rotina hospitalar. O VITEK 2 </p><p> uma ferramenta de grande valia para a identificao e determinao da </p><p>susceptibilidade antifngica, mas, considerando centros hospitalares onde h baixa </p><p>disponibilidade de recursos, o CHROMagar Candida para a identificao laboratorial </p><p>das espcies de leveduras apresentou como uma alternativa vivel, pois seus resultados </p><p>so to bons como o sistema automatizado, com um menor custo-benefcio. </p><p>Palavras-chave: Candida, CHROMagar Candida, VITEK 2, analise da seqncia de </p><p>DNA, susceptibilidade antifngica. </p></li><li><p>ix </p><p>Abstract </p><p>The correct identification of the isolates and determining the susceptibility profile are </p><p>factors necessary for adequate therapy. The study evaluated the different techniques for </p><p>identification of Candida species using the VITEK 2, CHROMagar Candida and </p><p>Reaction Polymerase Chain (PCR). The automated system VITEK 2 was also evaluated </p><p>for the determination of antifungal susceptibility together with the microdilution broth </p><p>method. 81 samples of Candida were collected from March 2013 to March 2014. The </p><p>identification of yeasts was performed by VITEK 2, CHROMagar Candida and PCR. </p><p>The VITEK 2 showed 34.6% of misidentification. The CHROMagar Candida did not </p><p>identify 14.8% of the isolates to the species level and 8.6% had errors in their </p><p>identification. The PCR correctly identified 100% of the isolates and data were </p><p>confirmed by sequencing the ITS region. The susceptibility profile antifungal was </p><p>determined by the VITEK 2 and microdilution (MIC). 11.1% of isolates were resistant </p><p>to amphotericin B (AMB), 4.9% to fluconazole (FLC) and 2.4% to voriconazole (VRC). </p><p>The MIC, 7.4% of the isolates showed resistance and just the VRC. One isolate showed </p><p>resistance VRC susceptibility in the two tested methods. 50% of isolates of Candida </p><p>krusei was not identified by VITEK 2 and 50% of the isolates of the species presented </p><p>as susceptible to CRF, which shows the importance of evaluating the two results before </p><p>therapy. Therefore, the PCR is a fast, useful and accurate tool for identifying yeasts, but </p><p>is not yet feasible for the hospital routine. The VITEK 2 is a valuable tool for </p><p>identification and determination of antifungal susceptibility, but considering hospitals </p><p>where there is low availability of resources, the CHROMagar Candida for laboratory </p><p>identification of yeast species presented as a viable alternative because their results are </p><p>as good as the automated system, with a lower cost-effective. </p><p>Keywords: Candida, CHROMagar Candida, VITEK 2, analysis of the DNA sequence, </p><p>antifungal susceptibility. </p></li><li><p>1 </p><p>1 INTRODUO </p><p>Infeces hospitalares fngicas tm aumentado em todo o mundo, no somente </p><p>em ocorrncia, mas tambm na gravidade da doena provocada por elas, principalmente </p><p>em pacientes imunocomprometidos, destacando aquelas causadas pelo gnero Candida. </p><p>Estas so responsveis pela maioria das infeces fngicas, sendo considerado um </p><p>patgeno oportunista, causando desde infeces superficiais de pele e mucosa at </p><p>infeces invasivas, principalmente no ambiente hospitalar (ZAUGG et al., 2001; </p><p>PAPPAS et al., 2004; CLEVELAND et al., 2012; COSTA et al., 2015). </p><p>Candida albicans a espcie mais frequente no ambiente hospitalar, porm, nas </p><p>ltimas dcadas outras espcies de Candida no-Candida albicans (CNCA) como C. </p><p>tropicalis, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. krusei e C. glabrata </p><p>esto sendo comumente isoladas. Infeces causadas por estas leveduras so relevante </p><p>em estudos de vigilncias de infeces hospitalares, pois possuem patogenicidade e </p><p>perfil de sensibilidade a antifngicos variveis, com registros de resistncia aos </p><p>principais antifngicos utilizados na clnica mdica (COLOMBO et al., 1999; CHI et </p><p>al., 2011; ORTEGA et al., 2011). </p><p>As espcies de leveduras diferem em sua suscetibilidade aos antifngicos. </p><p>Estudos descrevem a ocorrncia de sensibilidade diminuda para azis entre espcies de </p><p>CNCA como C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosise e C. tropicalis. </p><p>O uso crescente de anfotericina B em hospitais pode estar associado com o </p><p>aparecimento de CNCA resistentes a drogas, principalmente C. glabrata, C. lusitaniaee </p><p>e C. guillermondii (COLLIN et al., 1999; FURLANETO et al., 2011; SCHMALRECK </p><p>et al., 2012; TORTORANO et al., 2012). </p><p>Por conta das peculiaridades apresentadas por diferentes espcies de Candida </p><p>como epidemiologia, distribuio, resistncia a antifngicos, emergncia de novas </p><p>espcies que causam infeco, importante a identificao dessas leveduras em nvel de </p><p>espcie, principalmente quando relacionadas a doenas sistmicas (GIOLO &amp; </p><p>SVIDZINSKI, 2010; NEMCOVA et al., 2015). </p><p>Sendo assim, a identificao em nvel de espcies e a determinao do perfil de </p><p>susceptibilidade so importantes tanto para conhecer a prevalncia dos agentes </p><p>envolvidos como para monitorar e detectar resistncia, podendo contribuir para a </p><p>escolha teraputica adequada (ALAM et al., 2014). Devido importncia da </p></li><li><p>2 </p><p>identificao das espcies de Candida envolvidas em infeces hospitalares e a </p><p>crescente resistncia aos antifngicos, este estudo visou caracterizar as leveduras do </p><p>gnero Candida isoladas de pacientes internados em um hospital pblico de Dourados, </p><p>Mato Grosso do Sul. </p></li><li><p>3 </p><p>2 REVISO DA LITERATURA </p><p>2.1 Histrico e biologia do gnero Candida </p><p>Os primeiros relatos de leses causadas por Candida no homem foram feitos por </p><p>Hipcrates (460 a 337 a.C.) por observao de placas esbranquiadas presentes na </p><p>cavidade bucal de recm-nascidos e pacientes debilitados. Tambm Galeno (200 a 130 </p><p>d.C.) observou estas mesmas leses em crianas enfermas, j que a manifestao clnica </p><p>de candidase bucal em recm-nascidos j era frequente na Europa no sculo XVIII. Em </p><p>1839, Langenbeck observou pela primeira vez, em aftas bucais de um paciente com </p><p>febre tifide, leveduras do gnero Candida e classificou erradamente esse micro-</p><p>organismo como agente etiolgico da doena. David Gruby, em 1842, classificou a </p><p>levedura no gner...</p></li></ul>