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11 a 14 de dezembro de 2012 – Campus de Palmas
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE RIZÓBIOS ISOLADOS DE FEIJÃO-
CAUPI E ESPÉCIES DE ADUBAÇÃO VERDE CULTIVADO EM SOLOS NO
CERRADO NO ESTADO DE TOCANTINS.
Nome dos autores: WESLANY SILVA ROCHA¹; ALOÍSIO FREITAS CHAGAS JÚNIOR²
Nome do Aluno1; Nome do Orientador
2
1Aluno do Curso de Agronomia; Campus de Gurupi e-mail: [email protected]. PIBIC/UFT
2Orientador(a) do Curso de Agronomia; Campus de Gurupi; e-mail:[email protected]
RESUMO
Em solos com baixa disponibilidade de fósforo a habilidade de estirpes de rizóbio de
solubilizar compostos de fosfato inorgânico é extremamente importante. Além disso, as bactérias
rizobiais do solo fixadoras de nitrogênio sintetizam naturalmente o ácido indol acético (AIA). Assim,
o objetivo deste trabalho foi caracterizar fenotipicamente e determinar a capacidade de solubilização
de fosfato de cálcio e fosfato de alumínio (P-Al) e produção de AIA de isolados de rizóbio isolados
de feijão-caupi e espécies de adubação verde. Quanto à capacidade de solubilização de fosfato os
isolados UFT R2052 (IS=11,67), UFT R2054 (IS=10,34), UFT R2059 (IS=5,25) e UFT R2061
(IS=13,66), obtiveram os maiores índices de solubilização. Todos os isolados de rizóbio estudados
foram capazes de produzir AIA, em meio de cultura, sendo maior com a adição de L-triptofano.
Palavras-chave: adubação verde, Fosfato de cálcio, fosfato de alumínio, ácido indol acético
INTRODUÇÃO
As leguminosas são preferência entre os agricultores e a principal razão é a fixação do
nitrogênio atmosférico por bactérias, principalmente dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium, que
vivem em simbiose com suas raízes.
O fósforo é um dos nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas e,
apesar de ser abundante em solos nas formas orgânicas e inorgânicas, muitos solos cultivados do
mundo, são deficientes em P na forma disponível para as plantas. Essa baixa disponibilidade de P nos
solos é devido à alta reatividade do P solúvel com cálcio (Ca), ferro (Fe) ou alumínio (Al) que atuam
na sua precipitação. Diversos micro-organismos do solo, incluindo bactérias e fungos, possuem a
capacidade de solubilizar fosfatos por meio de diferentes mecanismos, especialmente pela produção
de ácidos (Chagas Jr & Oliveira, 2001).
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O uso de microrganismos capazes de solubilizar fosfatos como bactérias fixadoras de N2,
pode ajudar a aumentar a disponibilidade de fosfatos para o crescimento das plantas leguminosas e
não leguminosas (Schoenfeld et al., 2005). Em adição, estirpes de rizóbio envolvidas na solubilização
de P podem aumentar o crescimento vegetal pelo aumento da eficiência da fixação biológica do
nitrogênio. Alguns microrganismos endofíticos, como os rizóbio também têm apresentado a
capacidade de estimular o crescimento das plantas por mecanismos como a produção de fito
hormônios. Um dos mais importantes reguladores naturais de crescimento são as Auxinas e dentre as
auxinas o AIA (Ácido indol-acético) predomina como sua principal forma.
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente estirpes de rizobios e
avaliar “in vitro” as suas capacidades de solubilização de fosfato de cálcio e alumínio e produção de
ácido indol-acético por isolados de espécies utilizadas como adubo verde em solos do cerrado no
estado do Tocantins.
MATERIAL E MÉTODOS
Para fonte de inóculos de rizóbio, foram obtidas diferentes amostras de solo de regiões do
Estado de Tocantins, que visou avaliar as características de eficiência dos isolados de rizóbio nativo
na fixação do N2, usando feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp.), crotalária (Crotalaria
spectabilis, Crotalaria juncea L.), feijão porco (Canavalia ensiformis), lab-lab (Dolichos lab lab),
mucuna preta (Mucuna pruriens L.), feijão guandu (Cajanus cajan L.), calopogônio (Calopogonium
muconoides), soja (Glycine max L.) e invasora não identificada, como plantas iscas. O experimento
deu-se em casa de vegetação e a coleta das plantas se deu no inicio da floração, seguido de uma
lavagem e separação da parte aérea. O sistema radicular foi levado ao laboratório de microbiologia
onde foram retirados três nódulos de cada repetição, sendo feito o isolamento e caracterização
morfológica.
Para avaliação da produção do fito hormônio AIA, as colônias de rizóbios de 2-3 mm de
diâmetro crescidas em meio YMA (Vicent, 1970) foram transferidas para tubos de Erlenmeyer
contendo 25 ml de meio YM líquido na presença de 100 ml L-1
de L-Tryptofano. Após quatro dias
de crescimento sob uma mesa rotatória (100 rpm) a 26ºC ± 2ºC o sobrenadante bacteriano foi
separado por rotação (12.000 rpm) durante 15 minutos (Gordon & Weber, 1951). Para as análises
colorimétricas de AIA foram utilizadas um parte do reagente de Salkowski [(FeCl3 0,5 M + HClO4
(35%)] e duas partes do sobrenadante obtido de cada bactéria. Após a comprovação qualitativa da
presença de AIA (coloração rosa após 25 minutos de reação a 26±2ºC), o fito hormônio foi
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quantificado espectrofotometricamente em 530 nm. As concentrações, em μg mL-1
foram
calculadas a partir de uma curva padrão construída com a forma sintética de AIA.
Os isolados foram também riscados em meios específicos para solubilização de fosfatos,
contendo 10 g de Glucose, 2 g de Extrato de Levedura e 15 g de Ágar. Neste meio acrescentou-se
uma solução A contendo 5 g de K2HPO4 (50 mL de água) e uma solução B contendo 10 g de CaCl2
(100 mL de água), para a formação do fosfato de cálcio precipitado. Foi acrescentado o corante azul
de bromotimol no meio P-Ca, com o objetivo de visualizar a alteração do pH do meio pelas
bactérias, em função da alteração da cor do meio (Hara & Oliveira, 2004), ajustando-se o pH para
6,5 para a formação do halo de solubilização de fosfato de cálcio. Com base nos índices de
solubilização, as bactérias foram classificadas como isolados com baixa (IS < 2), média (2 ≤ IS < 4)
e alta solubilização (IS > 4).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A caracterização morfológica foi avaliada através da observação de características
fenotípicas (Tabela 1) dos isolados retirados dos nódulos das plantas iscas. Não foi possível separar
os isolados de rizóbios em grupos semelhantes, pois os mesmos apresentavam características
bastante variadas.
Quanto ao índice de solubilização de fosfato de cálcio (Tabela 02) dos 13 isolados, apenas
cinco (38,5%), UFT R2054 (IS=10,34), UFT R2052 (IS=11,67), UFT R2061 (IS=13,66), UFT
R2059 (IS=5,25), obtiveram índices de solubilização altos sendo classificadas como precoce e
acidificaram o pH do meio de cultura, e o isolado UFT R2058 (IS=0,5), obteve o menor
índice,sendo classificado como baixa solubilização. Os isolados UFT R2053, UFT R2055, UFT
R2060, UFT R2056, UFT R2057, UFT R2063, UFT R2051, UFT R2062 não apresentaram a
capacidade de solubilizar fosfato de cálcio e alumínio. Porém todas, com exceção do UFT R2057 e
UFT R2063, acidificaram o meio de cultura. Nenhum isolado solubilizou o fosfato de alumínio.
Todos os isolados apresentaram capacidade de sintetizar AIA. Os isolados UFT R2051, UFT
R2054 e UFT R2058 produziram as maiores concentrações de AIA nos tratamentos sem adição de
L-triptofano. As concentrações de AIA produzidas pelos isolados sem adição de L-triptofano variou
de 1,0 a 9,0 mg L-1
(Tabela 3). Com a utilização do L-triptofano, o isolado UFT R2060 foi superior
aos demais isolados (Tabela 3), variando de 16,6 a 61,3 mg L-1
. Os isolados UFT R2051, UFT
R2054, UFT R2057, UFT R2061 e UFT R2062 apresentaram as menores concentrações,
respectivamente. Na comparação dos tratamentos com e sem L-triptofano, houve diferença
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significativa, evidenciando o efeito positivo da utilização do L-triptofano como indutor para síntese
de AIA (Tabela 3).
A capacidade de solubilização de fosfato e produção de AIA pelos isolados de rizóbio
avaliados sugere o uso potencial desses fungos como promotores do crescimento radicular de
espécies vegetais de importância agrícola. Resultados semelhantes foram reportados para diferentes
isolados de rizóbio, conforme documentado por (Chagas Jr. et al., 2009; 2010).
Tabela1: Caracterização morfológica de isolados de Rizóbios de espécies recomendadas para
adubação verde.
Espécies Isolados T C pH DC FC EC BC TR CC TM QM
Canavalia ensiformis UFTR 2051 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Bu Mui
Dolichos lablab UFTR 2052 < 3 Ác < 2 Cir Pl Irr N Br Vi Po
Crotalaria spectabilis UFTR 2053 < 3 Ác < 2 Cir El Irr N Br Vi Mui
Cajanus cajan L. UFTR 2054 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Vi Po
Cajanus cajan L. UFTR 2055 < 3 Ác < 2 Irr El Irr N Am Vi Mui
Invasora não identificada UFTR 2056 < 3 Ác < 2 Cir El In N Br Vi Mui
Vigna unguiculata L. Walp. UFTR 2057 < 3 Ác > 2 Cir El In N Br Vi Mui
Calopogonium muconoides UFTR 2058 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Am Bu Po
Mucuna pruriens UFTR 2059 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Bu Po
Dolichos lab lab UFTR 2060 < 3 Ác < 2 Cir El In S Br Vi Mui
Glycine max L. UFTR 2061 < 3 Ác < 2 Cir El In N Br Vi Mui
Dolichos lab lab UFTR 2062 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Vi Mui
Crotalaria juncea UFTR 2063 < 3 Alc < 2 Cir Pl In N Br Vi Po TC= tempo de crescimento; pH = pH do meio de cultura (Ác = Acidificou, Alc = Alcalinizou); DC = diâmetro da
colônia em mm; FC = forma da colônia (Irr = irregular, Cir = circular); EC = elevação da colônia (El = elevada,Pl=
plana); BC = borda da colônia (In = inteira, Irr = irregular); TR = transparência da colônia (N= não, S = sim); CC = cor
da colônia (Br = branca, Am= Amarela); TM= Tipo de muco (Bu= Butirico, Vi= viscos); QM=quantidade muco (
Mui= Muito, Po= Pouco).
Tabela 2: Índice de solubilização de fosfato de cálcio, pH do meio e o tempo de solubilização de
fosfato por rizóbios isolados de espécies de adubação verde ISOLADOS ESPECIES VEGETAL Inicio solub. IS¹ INICIAL IS¹ FINAL
UFT R2054 Cajanus cajan L. 3 5,66 10,34
UFT R2052 Dolichos lablab 3 6 11,67 UFT R2061 Glycine max L. 3 7 13,66
UFT R2053 Crotalaria spectabilis 0 0 0
UFT R2055 Cajanus cajan L 0 0 0 UFT R2058 Calopogonium muconoides 12 0 0,5
UFT R2060 Dolichos lab lab 0 0 0
UFT R2056 Invasora não identificada 0 0 0
UFT R2057 Vigna unguiculata L. Walp. 0 0 0 UFT R2059 Mucuna pruriens 6 0 5,25
UFT R2063 Crotalaria juncea 0 0 0
UFT R2051 Canavalia ensiformis 0 0 0 UFT R2062 Dolichos lab lab 0 0 0
1 = Índice de solubilização (Inicial e Final); 2 = Tempo de Solubilização; 3 = Capacidade de modificar o pH do meio de
cultura
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Tabela 3: Produção de AIA (mg L-1
) por rizóbio isolados de espécies de adubação verde na ausência e
presença de L-triptofano.1
Tratamentos AIA (mg L-1
)
S Trip. C Trip.
UFT R2051 9,0 aB 23,8 cA UFT R2052 5,9 bB 34,4 bA
UFT R2053 5,2 bB 33,4 bA
UFT R2054 7,4 aB 27,5 cA UFT R2055 6,2 bB 31,0 bA
UFT R2056 5,2 bB 34,9 bA
UFT R2057 1,0 cB 16,6 cA
UFT R2058 8,5 aB 37,5 bA UFT R2059 1,1 cB 31,6 bA
UFT R2060 4,8 bB 61,3 aA
UFT R2061 4,6 bB 17,4 cA UFT R2062 5,6 bB 22,6 cA
UFT R2063 4,6 bB 31,6 bA
Média 5,3 B 31,1 A
C.V.2 11,9 13,2 1Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem entre si pelo teste Scott Knott a 5%.
2
Coeficiente de variação.
LITERATURA
CHAGAS Jr, A.F; OLIVEIRA, L.A; OLIVEIRA, A. N. Produção de ácido indolacético por
rizóbios isolados de caupi. Ver. Ceres, Viçosa, v.56, n.6, p.812-817, 2009
CHAGAS Jr, A.F; OLIVEIRA, L.A; OLIVEIRA, A. N.; WILLERDING, A. L. Capacidade de
solubilização de fosfatos e eficiência simbiótica de rizóbios isolados de solos da Amazônia. Acta
Scientiarum. Agronomy. Maringá, v.32. n.2, p. 359-366, 2010.
CHAGAS Jr., A.F.; OLIVEIRA, L.A. Tolerância de bactérias solubilizadoras de fosfatos à acidez e
ao alumínio. Ciências Agrárias e Ambientais: Rev. Universidade Federal do Amazonas, 1(1/2):39-
51. 2001.
GORDON, S.A.; WEBER, R.P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant
Physiology,26:192-195. 1951.
SCHOENFELD, R.; ALVES, J.B.; SCHUH, C.; SILVEIRA, M.S.; BINZ, A.; ANZANELLO, R.;
SELBACH, P.A.; CAMARGO, F.A.O.; SÁ, E.L.S. Efeito da inoculação de rizóbios como bactérias
promotoras de crescimento em arroz irrigado (Oruza sativa). In: XXX Congresso Brasileiro de
Ciências do Solo. Recife. Anais.... Palestra. CD ROOM. 2005.
AGRADECIMENTOS
"O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT”