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XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba

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“CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA SPP ISOLADAS DE PACIENTES HOSPITALIZADOS EM SÃO JOSÉ DO S CAMPOS/SP"

1Siqueira, F.S; 1 Belo, R.A.S; 1.2 Magalhães, L.M; 1.2Santos, L.S; 2Bernardes, R.C;

1 Khouri, S.

1 Universidade do Vale do Paraíba, Faculdade de Ciências da Saúde, NUFABI (Núcleo de estudos Farmacêuticos e Biomédicos) Av. Shishima Hifumi, 2911, CEP 12244-000, Urbanova, São José dos

Campos/ SP, [email protected]. 2 ValeClin Laboratório de Análises Clínicas S/S Ltda. Av. Adhemar de Barros, 1188, CEP 12245-011,

Vila Adyanna, São José dos Campos/ SP, [email protected]. [email protected]

Resumo - A ocorrência de candidúria entre as infecções fúngicas presentes em ambiente hospitalar, vem aumentando significativamente nos últimos anos. Problemas como dificuldades diagnósticas, permitem que infecções, de caráter local, tornem sistêmicas podendo ocasionar o aumento da letalidade em pacientes hospitalizados. O presente artigo aborda a caracterização de leveduras presentes em urina e a incidência destes microrganismos comparados aos demais patógenos causadores de infecção urinária. Amostras de leveduras, obtidas no período de fevereiro a abril de 2009, isoladas em ChromAgar® Candida foram identificadas através de provas clássicas de identificação fenotípica (Protocolo Instituto Adolfo Lutz) e kits comerciais (API 20C AUX) com provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Os resultados obtidos demonstraram que das 110 amostras analisadas (100%), cerca de 13 (11.8%) foram positivas para leveduras do gênero Candida spp, ocupando a 3ª posição entre os patógenos mais freqüentes em infecções urinárias hospitalares. Dentre as amostras positivas, a maior ocorrência foi de Candida albicans (61.5%), seguida de Candida glabrata (23.1%), Candida krusei (7.7%) e Candida tropicalis (7.7%). Palavras-chave: Candida, infecção urinária, caracterização fenotípica. Área do Conhecimento: Ciências biológicas Introdução Nos últimos tempos as infecções fúngicas têm se destacado entre as mais frequentes ocorridas em pacientes internados (FEBRÉ et al., 1999). Uma classe de patógenos de grande interesse, as leveduras do gênero Candida spp, vem sendo largamente estudada, uma vez que estas são causa de morbidade e mortalidade nestes pacientes (MIRANDA et al., 2003). Leveduras do gênero Candida spp fazem parte da microbiota normal de humanos e seu isolamento em cultura de urina não significa, necessariamente, um processo infeccioso (BUKHARY, 2008). Dentre as doenças fúngicas mais comuns, as infecções do trato urinário vêm apresentando um crescente aumento, originadas de contaminação, colonização ou infecção, associadas a fatores de risco como anormalidades no trato urinário, prematuridade, doenças subjacentes, tais como o diabetes melitus, entre outros fatores (CARVALHO et al., 2001). Diversas terapias buscam proporcionar ao paciente o melhor tratamento e uma maior expectativa de vida, mas o avanço tecnológico muitas vezes não evita o uso de métodos terapêuticos invasivos aumentando o risco de

infecções (SANTOS JUNIOR, 2005). A ocorrência das espécies varia de acordo com o local de estudo. Alguns trabalhos demonstram maior ocorrência de candidúria por Candida albicans e outros por espécies não- albicans (SOUTO; DIAS, 2003), podendo variar por exemplo, de acordo com a utilização de medicamentos antifúngicos (ODDS; BERNAERTS, 1994). Para que haja sucesso no diagnóstico e terapia da candidúria é necessário um bom conhecimento dos fatores de risco e da epidemiologia das infecções fúngicas (CARVALHO et al., 2001), associados à correta identificação das espécies de levedura e a testes de concentração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos comumente utilizados (FEBRÉ et al., 1999). Em estudo realizado por Mähnss et al. (2005) foram comparados diferentes métodos fenotípicos para identificação de Candida spp, entre eles o API 20C AUX (Biomerieux), entre outros métodos clássicos, utilizando como padrão cepas de leveduras já identificadas por PCR (Reação em cadeia da polimerase), e concluíram que não existe um único método capaz de diferenciar todas as espécies, principalmente quando elas possuem características


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semelhantes, como é o caso de Candida albicans e Candida dubliniensis, por exemplo. Dependendo da espécie é necessário o uso de pelo menos três provas fenotípicas diferentes ou o uso de PCR que pode ser complementado por outro teste molecular chamado RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism) que é um método curto, prático e confiável quando comparado aos métodos de identificação convencionais (CIRAK et al., 2003). Desta forma, o presente estudo, visa contribuir no sentido de auxiliar o isolamento e identificação destas leveduras emergentes, avaliando a incidência das mesmas para melhor diagnóstico e tratamento das infecções urinárias por espécies de Candida spp de origem hospitalar. Metodologia Foram investigadas as uroculturas realizadas no período de fevereiro a abril de 2009 em um laboratório particular situado em um hospital de médio porte de São José dos Campos/ SP. Os dados foram organizados de acordo com o número de ocorrências, resultado, se positivo ou negativo, quando positivo, o tipo de microrganismo causador e a contagem de colônias na urocultura. Além disso foi verificada a contagem de leucócitos no exame de urina tipo 1, a idade dos pacientes, sexo e setor de internação. Os critérios utilizados para seleção das amostras foram: urocultura positiva para levedura, e pacientes adultos hospitalizados. As amostras foram semeadas em Chromagar Candida® e em seguida em Agar Sabouraud Dextrose com Cloranfenicol e mantidas na Micoteca do Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos (NUFABI) da Univap por até quinze dias para posterior identificação. Para caracterização das leveduras foi utilizado um protocolo individual de identificação (Instituto Adolfo Lutz), contendo métodos clássicos. O exame realizado para caracterização fenotípica consistiu em um exame direto corado para observação de colônias leveduriformes. Confirmada a presença de leveduras realizou-se a prova do tubo germinativo que consistiu em inocular uma colônia da levedura em soro humano ou bovino e incubar por 3 horas em estufa a temperatura de 37°C, observando-se em seguida ao microscópio com objetiva de 400x. Seguindo o protocolo, realizou-se a prova de filamentação ou clamidoconídeo que consistiu em um laminocultivo feito em uma placa de Petri, contendo uma lâmina de vidro sobre a qual verteu -se 3 mL de Corn Meal Agar fundido acrescido de Tween 80 e esperou-se solidificar. Após, fez-se duas estrias finas, paralelas e horizontais e

recobriu-se a lâmina com uma lamínula. Incubou-se em estufa a 37°C por até 72 horas sendo que as leituras foram feitas com 24, 48 e 72 horas para confirmação da presença de clamidoconídeo. As amostras que apresentaram positividade em todas as provas do protocolo acima, foram caracterizadas como Candida albicans e as demais foram submetidas a outra prova de identificação com um kit comercial API 20 C AUX (Biomerieux) que baseia-se em provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Os inóculos foram preparados com 2mL de solução fisiológica 0.85% e frações de colônia de levedura de culturas recentes (24h) efetuando-se uma suspensão equivalente a 2 da escala de McFarland. Homogeneizou – se bem a suspensão e pipetou-se cerca de 100 µL da amostra em uma ampola contendo 2 mL de NaCl 0.85%. Homogeneizou-se novamente e preencheu-se as cúpulas da galeria formando uma superfície ligeiramente convexa com o cuidado de não formar bolhas. As galerias foram colocadas em caixas de incubação, previamente identificadas e preenchidas com água destilada estéril para obtenção de uma câmara úmida. Incubou-se em estufa a 30° C por até 72 horas realizando- se leituras com 48h e 72 h. Como controle negativo foi utilizada a cúpula 0 (zero) da galeria, considerando como reação positiva uma cúpula mais turva do que o controle negativo. A identificação foi concluída a partir de um perfil numérico comparado a um catálogo analítico ou programa apiweb, (https://apiweb.biomerieux.com) considerando como ponto de corte ou identificação aceitável porcentagens de identificação (% id) de no mínimo ≥ 90.0 e T ≥ 0.5, tendo como outros parâmetros identificações listadas como excelente (% id ≥ 99.9 e T≥ 0.75) e muito boa (% id ≥ 90.0 e T ≥ 0.5). Resultados

Dentre os pacientes que apresentaram candidúria, o perfil apresentado foi idade entre 38 e 98 anos sendo a mediana de 73 anos, predomínio do sexo feminino e o setor de maior internação de pacientes com urocultura positiva foi enfermaria clínica (Tabela 1). Foram analisadas 110 (100%) uroculturas no período de fevereiro a abril de 2009. Destas, 13 (11.8%) foram positivas para levedura (Tabela 2), ocupando a 3ª posição entre os agentes mais frequentemente encontrados, ficando atrás somente de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae.


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Tabela 1: Dados dos pacientes que apresentaram candidúria quanto ao sexo, idade e setor de internação. Paciente Sexo Idade Setor

internação 01 M 56 Enf. Clínica 02 F 61 Enf. Clínica 03 M 38 Nefrologia 04 F 81 Enf. Clínica 05 F 78 Enf. Clínica 06 M 56 Enf. Clínica 07 F 78 Enf. Clínica 08 M 67 Enf. Clínica 09 F 78 Enf. Clínica 10 F 76 Enf. Clínica 11 M 73 Enf. Clínica 12 F 73 UTI 13 F 98 Enf. Clínica

Tabela 2: Resultados das uroculturas positivas analisadas no período de Fevereiro a Abril de 2009.

Quanto à identificação, os resultados demostraram maior ocorrência de Candida albicans, seguida de Candida glabrata , Candida krusei e Candida tropicalis (Tabela 3) e na maioria presença de raras leveduras (Tabela 4). Tabela 3: Incidência das espécies de Candida spp nas uroculturas positivas.

N° Amostras

Espécie identificada

%

08 Candida albicans 61.5 03 Candida glabrata 23.1 01 Candida krusei 7.7 01 Candida tropicalis 7.7

Tabela 4: Casos de colonização e/ou infecção em amostras de pacientes com uroculturas positivas.

N°

Amostras Leveduras Leucócitos

/ mL. Interpretação

UFC/mL 01 Raras 16.000 ≤10.000 - C 02 Raras 144.000 ≤10.000 - C 03 Raras Incontáveis ≤10.000 - C 04 Raras 420.000 ≤10.000 - C 05 Raras 30.000 ≤10.000 - C 06 Raras 200.000 ≤10.000 - C 07 Raras >10.000 ≤10.000 - C 08 Moderadas 1.632.000 ≥10.000 - I 09 Moderadas 912.000 ≥10.000 - I 10 Raras 24.000 ≤10.000 - C 11 Moderadas 20.000 ≥10.000 - I 12 Freqüentes 40.000 ≥10.000 - I 13 Raras <10.000 ≤10.000 - C

* Contagem de leucócitos referentes ao exame de urina tipo1. *C - colonização; I - infecção. Discussão A necessidade de se estabelecer uma conduta terapêutica eficaz nos casos de candidúria torna os testes de identificação do agente causador da infecção, cada vez mais importantes (FEBRÉ et al., 1999). Neste estudo buscou-se avaliar pacientes hospitalizados que apresentaram quadro de infecção urinária, devido ao fato da internação ser um fator predisponente à candidúria, (OLIVEIRA et al., 2001) visto que em geral os pacientes estão debilitados, apresentam patologias de base, muitas vezes são idosos ou prematuros, entre outros fatores de risco que os expõem à infecção (CARVALHO et al., 2001). Em estudo realizado por Lucchetti et al. (2001) avaliando agentes causadores de infecção urinária, 858 uroculturas foram investigadas. O resultado apontou que espécies de Candida spp ocuparam a 3ª posição (7.68 %) entre os patógenos mais freqüentes, ficando atrás de Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, que juntas somaram 55.91% do total de infecções, sendo 42.77% e 13.14%, ocupando a 1ª e 2ª posições, respectivamente. Esses dados são condizentes com o presente estudo uma vez que os resultados demonstraram que as espécies de Candida spp também ocuparam a 3ª (11.8%) posição entre os demais patógenos, diferindo apenas em relação aos patógenos mais freqüentes que neste caso foram Escherichia coli (15.4%) e Klebsiella pneumoniae (12.7%). Quanto à predominância da espécie há interferência de vários fatores, porém este estudo evidenciou uma maior ocorrência de Candida

N° Amostras

%

Espécie

Identificada 17 15.4 Escherichia coli 14 12.7 Klebsiella pneumoniae 13 11.8 Leveduras 06 5.4 Enterococcus faecalis 04 3.6 Pseudomonas aeruginosa 04 3.6 Proteus rettgeri 01 0.9 Staphylococcus

epidermidis 01 0.9 Strenotrophomonas

maltophilia 01 0.9 Serratia marcens 01 0.9 Acinetobacter baumanii 01 0.9 Providencia stuartii

63 amostras 57.0 TOTAL


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albicans (61.5%) assim como os estudos de Silva et al. (2007), Carvalho et al. (2001) e Febré et al. (1999), entre outros, justificando o fato da Candida albicans ser a mais abundante e significante espécie encontrada no ambiente. (EGGIMANN et al., 2003). Diferentemente deste estudo, o trabalho realizado por Oliveira et al. (2001) demonstrou maior ocorrência de espécies não- albicans sendo a espécie prevalente a Candida tropicalis (53%), seguida por Candida albicans (36%), justificada pelo crescente aumento de pacientes que dão entrada nos ambientes hospitalares portando doenças graves, muitas vezes subjacentes à infecção fúngica, além de outros fatores de risco. O 2º patógeno mais freqüente em nosso estudo foi a Candida glabrata, espécie que vem ascendendo nos dias atuais podendo ser atribuído às modificações ocorridas em ambiente hospitalar, e à resistência intrínseca deste patógeno aos antifúngicos mais utilizados, como o Fluconazol (FEBRÉ et al., 1999). Nenhum diagnóstico laboratorial é específico ou sensível o suficiente para diferenciar infecção de colonização (BUKHARY, 2008). No presente estudo foi avaliada a quantidade (UFC/mL) de leveduras apresentadas no resultado da urocultura para interpretação do caso como possível colonização ou infecção. De acordo com Lundstrom e Sobel, (2001), altas contagens de colônias de leveduras associadas à piúria têm relação com o diagnóstico de infecção, no entanto, é necessário cuidado na avaliação porque a piúria pode estar relacionada a outros fatores, como traumas devido a procedimentos invasivos, bacteriúria, entre outros. No presente estudo os resultados que apresentaram contagens de colônias de levedura ≥ 10.000 UFC/mL associadas à presença de leucócitos no sedimento urinário com valor ≥ 10.000/ mL de urina foram interpretados como infecção, sendo que as amostras 8 e 9 respectivamente, apresentaram contagens iguais a 1.632.000 e 912.000 leucócitos/ mL de urina confirmando a presença de infecção. Em relação aos métodos de identificação o sistema API20C AUX (Biomerieux) mostrou-se mais prático do que os métodos fenotípicos tradicionais. O método exigiu menor tempo no processo de identificação e identificou corretamente 80% (4) das amostras testadas, necessitando de prova complementar em apenas 1 amostra, que quando confirmada pelo teste adicional de hifa positivo, apresentou uma melhora significativa no resultado passando de id= 70.2% e T= 0.22 para id= 95.7% e T= 0.5. A maioria das identificações foi considerada excelente e muito boa. No trabalho de Silva e Candido (2005), o

sistema API20C AUX (Biomerieux) conseguiu identificar sem a necessidade de testes adicionais 92% das amostras, sendo os resultados classificados como bom, muito bom e de excelente identificação. Em nosso estudo utilizamos como controle uma cepa de Candida albicans (ATCC: 10231) já identificada pelas provas clássicas de identificação fenotípica que quando testada pelo sistema comercial API 20C AUX (Biomerieux) apresentou como resultado excelente identificação. Em relação aos gêneros todas as amostras foram identificadas corretamente, garantindo a precisão do sistema. Conclusão Neste trabalho as espécies mais frequentemente isoladas foram: Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei e Candida tropicalis. Estes resultados demonstraram que leveduras do gênero Candida spp ocuparam o 3° lugar dentre os patógenos isolados dos casos positivos de uroculturas, demonstrando assim, ser um agente emergente em infecções urinárias hospitalares. As limitações observadas em nosso estudo foram referentes à preparação do inóculo e à necessidade de provas complementares que tornou o processo um pouco mais demorado, além do custo dos testes ainda ser alto quando consideramos laboratórios de pequeno e médio porte, o que reforça as dificuldades diagnósticas favorecendo assim, a terapêutica inadequada dos pacientes. Agradecimentos Ao laboratório Valeclin pela participação e por ter cedido as amostras clínicas e ao Núcleo de estudos Farmacêuticos e Biomédicos (NUFABI) da Faculdade de Ciências da Saúde UNIVAP pelo apoio. À pesquisadora Graziela Nuernberg Back Brito, do Laboratório de Genética Molecular e Genomas (UNESP) pela orientação e apoio. Referências - APIWEB (Biomerieux). Disponível em: https://apiweb.biomerieux.com/servlet/Authenticate?action=preparelogin. Acesso em 13 maio 2009. - BUKHARY, Z.A. Candiduria: A Review of Clinical Significance and Management. Saudi J Kidney Dis Transplant. V.19, n.3, p. 350-360, 2008.


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