Caracterização fenotípica da população de células T ... ?· recém-nascidos a termo e pré-termo…

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CAMILA RENN GUIMARES

Caracterizao fenotpica da populao de clulas

T reguladoras em sangue de cordo umbilical de

recm-nascidos a termo e pr-termo

Dissertao apresentada Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Mestre em Cincias

Programa de: Pediatria

Orientadora: Dra. Patricia Palmeira

So Paulo

2015

CAMILA RENN GUIMARES

Caracterizao fenotpica da populao de clulas

T reguladoras em sangue de cordo umbilical de

recm-nascidos a termo e pr-termo

Dissertao apresentada Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Mestre em Cincias

Programa de: Pediatria

Orientadora: Dra. Patricia Palmeira

So Paulo

2015

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Guimares, Camila Renn

Caracterizao fenotpica da populao de clulas T reguladoras em sangue de

cordo umbilical de recm-nascidos a termo e pr-termo / Camila Renn

Guimares. -- So Paulo, 2015.

Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo.

Programa de Pediatria.

Orientadora: Patricia Palmeira.

Descritores: 1.Linfcitos T reguladores 2.Antgeno CTLA-4 3.Integrina alfa4

4.Citometria de fluxo 5.Recm-nascido prematuro 6.Recm-nascido a termo

USP/FM/DBD-385/15

Dedico esse trabalho aos meus pais, que nunca deixaram de incentivar, de apoiar e me

levantar todas e inmeras vezes. eles, dedico meu crescimento pessoal e profissional

todos esses anos.

Agradecimentos especiais

Minha amiga e orientadora Patricia Palmeira Daenekas Jorge que me acolheu, ajudou

e aconselhou a todo instante. Pelos momentos disponibilizados e pelo tempo dedicado

a me ensinar a ser melhor.

Camila Quinello, Ana Lcia Lessa, Cludia Zago, Maria Isabel Valdomir Nadaf que

no se cansaram em me transmitir todo o ensinamento e todo o carinho que me faro

levar por todos os meus novos caminhos.

Letcia Zicari Boneder, pela alegria e companheirismo e que contriburam para o

desenvolvimento deste trabalho.

Equipe do Laboratrio de Investigao Mdica 36 (LIM-36) que me ajudou em

todos os momentos e com os quais pude contar em cada desafio.

Agradecimentos:

Profa. Dra. Magda Carneiro-Sampaio por ter disponibilizado seu Laboratrio

permitindo, assim, a realizao deste trabalho.

s secretrias da Ps-Graduao do Departamento de Pediatria, por estarem sempre

prontamente dispostas para auxiliar no que fosse preciso.

FAPESP (Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo) pelo apoio

financeiro.

Aos membros da Banca examinadora do Exame de Qualificao: Dra. Maria Notomi

Sato, Dra. Vera Lcia Jornada Krebs, Dra. Maria Esther Jurfest Rivero Ceccon que

aceitaram gentilmente meu convite e contriburam de forma construtiva com

sugestes para o melhor desenvolvimento do trabalho.

A todos os profissionais do Centro Obsttrico do Instituto Central do HC que sempre

estiveram disponveis, contribuindo com as coletas e me auxiliando quando fosse

necessrio, em especial enfermeira Silvana.

E, finalmente, s mes que cederam gentilmente as amostras de sangue de cordo

umbilical para que fosse possvel a realizao deste trabalho.

NORMALIZAO ADOTADA

Esta dissertao est de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta

publicao:

Referncias: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver).

Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Diviso de Biblioteca e

Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias. Elaborado

por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana,

Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso, Valria Vilhena. 3a ed. So Paulo:

Diviso de Biblioteca e Documentao; 2011.

Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals Indexed in Index

Medicus.

SUMRIO

LISTA DE SIGLAS, SMBOLOS E ABREVIATURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

SUMMARY

1. INTRODUO 1

1.1. Justificativa 19

2. OBJETIVOS 23

2.1. Objetivo geral 23

2.2. Objetivos especficos 23

3. CASUSTICA, MATERIAL E MTODOS 25

3.1. Aspectos ticos 25

3.2. Casustica 25

3.2.1. Obteno de amostras de sangue de cordo umbilical 25

3.2.2. Obteno de amostras de sangue perifrico de adultos 27

3.3. Delineamento metodolgico 27

3.4. Dosagem de citocinas nas amostras de soro de cordo umbilical 28

3.5. Caracterizao fenotpica dos linfcitos T reguladores 28

3.6. Anlise estatstica 31

4. RESULTADOS 33

4.1. Anlise do grupo amostral 33

4.2. Dosagem de citocinas nas amostras de soro de cordo umbilical 38

4.3. Caracterizao fenotpica das clulas T reguladoras nas amostras

de sangue de cordo umbilical

42

4.4. Expresso de CD45RA em clulas Treg neonatais 47

4.5. Expresso de CTLA-4 em clulas Treg neonatais 48

4.6. Expresso dos marcadores de homing 47 e 41 em clulas

Treg neonatais

50

5. DISCUSSO 53

6. CONCLUSES 66

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 68

ANEXOS

Anexo I. Aprovao Cappesq

Anexo II. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Anexo III. Ficha de Anamnese

Anexo IV.

LISTA DE SIGLAS, SMBOLOS E ABREVIATURAS

APC Antigen presenting cell (Clula apresentadora de antgeno)

ATP Adenosine triphosphate (Trifosfato de adenosina)

cAMP Cyclic adenosine monophosphate (Monofosfato de adenosina cclico)

CBA Cytometric bead array

CD Cluster of Differentiation (Grupamento de diferenciao)

CD122 Cadeia do receptor de IL-2

CD127 Cadeia do receptor de IL-7

CD25 Cadeia do receptor de IL-2

CMV Citomegalovrus

CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (Protena 4 associada a

linfcitos T citotxicos)

DC Dendritic cell (Clula Dendrtica)

DUM Data da ltima menstruao

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (cido etilenodiamino tetra-actico)

Foxp3 Forkhead box P3

FSC-A Forward-scatter (tamanho)

G1 Grupo 1

G2 Grupo 2

G3 Grupo 3

GBS Group B Streptococcus (Estreptococo do grupo B)

HIV Human immunodeficiency virus (Vrus da imunodeficincia humana)

HMC Hemocultura

HTLV I/II Human T lymphotropic virus type 1/2 (Vrus linfotrpico da clula T

humana do tipo 1/2)

ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1 (Molcula 1 de adeso intercelular)

IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase (Indoleamina 2,3-dioxigenase)

IG Idade gestacional

IL Interleucina

IFN Interferon

ITU Infeco do trato urinrio

LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen 1 (Antgeno 1 associado

funo leucocitria)

LPAM-1 Lymphocyte Peyers patch adhesion molecule 1 (Molcula 1 de adeso

linfocitria s Placas de Peyer)

MAdCAM-1 Mucosal addressin cell adhesion molecule 1 (Molcula 1 de adeso

celular de adressina de mucosa)

MBL Mannose-binding lectin (Lectina ligante de manose)

MFI Mean fluorescence intensity (Mdia de intensidade de fluorescncia)

N Nmero amostral

ND No detectado

NFAT Nuclear factor of activated T-cells (Fator nuclear de clulas T ativadas)

NICHD National Institute of Child Health and Human Development (Instituto

Nacional de Sade Infantil e Desenvolvimento Humano)

NR No realizado

PBS Phosphate-buffered saline (Tampo fosfato-salina)

PCR Protena C-reativa

PT Pr-termo

pTreg Treg derivada na periferia

RN Recm-nascido

RPM Rotaes por minuto

SFB Soro fetal bovino

sIL-6R Receptor solvel de IL-6

SSC-H Side-scatter (Granulosidade)

sTNF RI Receptor solvel I de TNF

sTNF RII Receptor solvel II de TNF

T Termo

TCR T cell receptor (Receptor de clula T)

TFG- Transforming growth factor (Fator de transformao de

crescimento)

TNF Tumor necrosis factor (Fator de necrose tumoral)

Treg Clula T reguladora

tTreg Treg derivada do timo

VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1 (Molcula 1 de adeso s clulas

vasculares)

VLA-4 Very late antigen 4 (Antgeno 4 de ativao tardia)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Caractersticas das clulas T reguladoras derivadas do timo e

induzidas na periferia............................................................................................

9

Tabela 2 - Mecanismos de supresso das clulas T reguladoras.......................... 15

Tabela 3 - Anlise de pronturio das parturientes e seus respectivos recm-

nascidos pr-termo pertencentes ao Grupo 1......................................................

33

Tabela 4 - Anlise de pronturio das parturientes e seus respectivos recm-

nascidos pr-termo pertencentes ao Grupo 2......................................................

34

Tabela 5 - Anlise de pronturio das parturientes e seus respectivos recm-

nascidos a termo pertencentes ao Grupo 3..........................................................

34

Tabela 6 - Dados dos pronturios das parturientes e seus respectivos recm-

nascidos pr-termo do Grupo 1............................................................................

35

Tabela 7 - Dados dos pronturios das parturientes e seus respectivos recm-

nascidos pr-termo do Grupo 2............................................................................

36

Tabela 8 - Dados dos pronturios das parturientes e seus respectivos recm-

nascidos a termo...................................................................................................

37

Tabela 9 - Caractersticas demogrficas e contagem de leuccitos totais dos

grupos de recm-nascidos....................................................................................

38

Tabela 10 - Dosagem de citocinas nas amostras de soro de recm-nascidos

pr-termo do Grupo 1...........................................................................................

39

Tabela 11 - Dosagem de citocinas nas amostras de soro de recm-nascidos

pr-termo do Grupo 2...........................................................................................

39

Tabela 12 - Dosagem de citocinas nas amostras de soro de recm-nascidos a

termo do Grupo 3.................................................................................................

40

Tabela 13 - Anlise da mdia do nmero absoluto e da frequncia de linfcitos

totais, de linfcitos TCD4+ e linfcitos TCD4+CD25hiCD127loFoxp3+ nas

amostras de sangue de cordo dos recm-nascidos dos Grupos 1, 2 e 3 e de

sangue de adultos.................................................................................................

45

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Concentraes sricas de IL-8, IL-6, IL-17A, TNF-, IL-1, IL-10, IL-2, IL-

4 e IL-12p70 em amostras de soro provenientes do cordo umbilical de recm-

nascidos pr-termo e a termo saudveis agrupados por tipo de parto..................

42

Figura 2 - Estratgia de gate para a anlise de clulas Treg no sangue de cordo

umbilical de recm-nascidos pr-termo e a termo saudveis e no sangue

perifrico de adultos...............................................................................................

43

Figura 3 - Mediana de intensidade de fluorescncia (MFI) de forkhead box P3

(Foxp3) em clulas Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+ do sangue de cordo

umbilical de recm-nascidos pr-termo (Grupos 1 e 2) e a termo (Grupo 3) e de

sangue de adultos, como controles.........................................................................

46

Figura 4 - Porcentagem de clulas Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+ em amostras

de sangue de cordo umbilical de recm-nascidos distribudas de acordo com

idade gestacional.....................................................................................................

47

Figura 5 - Porcentagem de clulas Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+CD45RA+ nas

amostras de sangue de cordo umbilical de recm-nascidos pr-termo (Grupos

1 e 2) e a termo (Grupo 3) e de sangue de adultos, como controles......................

48

Figura 6 - Frequncia de clulas Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+CTLA-4+ nas

amostras de sangue de cordo umbilical de recm-nascidos pr-termo (Grupos

1 e 2) e a termo (Grupo 3) e de sangue de adultos, como controles......................

49

Figura 7 - Mediana de intensidade de fluorescncia (MFI) de CTLA-4 expresso

em clulas Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+ nave (CD45RA+) e de memria

(CD45RA-) das amostras de sangue de cordo umbilical de recm-nascidos pr-

termo (Grupos 1 e 2) e a termo (Grupo 3) e de sangue de adultos, como

controles..................................................................................................................

50

Figura 8 - Clulas Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+ expressando os receptores de

homing para a mucosa intestinal 47 e 41 nas amostras de sangue de

cordo dos RN dos Grupos 1, 2 e 3 e de sangue de adultos....................................

51

RESUMO

Guimares CR. Caracterizao fenotpica da populao de clulas T reguladoras em sangue de cordo umbilical de recm-nascidos a termo e pr-termo [Dissertao]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015. A predisposio de recm-nascidos s doenas infecciosas atribuda, em parte, a falta da memria imunolgica pr-existente. Em recm-nascidos pr-termo, presumido que o sistema imune seja menos desenvolvido ao nascimento, mas pouco se sabe sobre o tamanho e as caractersticas das subpopulaes de linfcitos. Clulas T reguladoras (Treg) possuem papel crucial no controle do desenvolvimento de um sistema imune saudvel incluindo a manuteno da autotolerncia e, sua ausncia, responsvel pela gama de manifestaes inflamatrias e autoimunes observadas em pacientes com IPEX (Immunodeficiency, Poliendocrinopathy and Enteropathy X-linked Syndrome). Essas clulas so fenotipicamente caracterizadas pela presena do fator de transcrio Foxp3 (forkhead box P3) e pela alta expresso da cadeia do receptor de IL-2 (CD25), j que esta citocina essencial para a gerao, manuteno e funcionamento das clulas Treg. Pouco se sabe sobre a frequncia destas clulas em recm-nascidos, particularmente em recm-nascidos muito prematuros ou moderados e recm-nascidos prematuros tardios, estudados como grupos separados. Resultados preliminares do nosso grupo revelaram uma maior capacidade dos recm-nascidos de produzir resposta pr-inflamatria em comparao aos adultos, a qual foi ainda mais acentuada pela diminuio da produo de IL-10, o que sugere uma funo reguladora reduzida. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar fenotipicamente e quantificar a populao de...

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