caracterização e análise da diversidade dos genes codificadores
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CURSO DE DOUTORADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
RENATA FERNANDES FERREIRA
TESE DE DOUTORADO
CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA DIVERSIDADE DOS GENES CODIFICADORES
DAS PROTEÍNAS GP19 E GP36 DE Ehrlichia canis (DONATIEN E LESTOQUARD,
1935) DETECTADA EM SANGUE TOTAL DE CÃES (Canis familiaris)
NATURALMENTE INFECTADOS
NITERÓI
2012
RENATA FERNANDES FERREIRA
TESE DE DOUTORADO
CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA DIVERSIDADE DOS GENES CODIFICADORES
DAS PROTEÍNAS GP19 E GP36 DE Ehrlichia canis (DONATIEN E LESTOQUARD,
1935) DETECTADA EM SANGUE TOTAL DE CÃES (Canis familiaris)
NATURALMENTE INFECTADOS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução
Animal da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de
Doutor.
Orientador: Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA
Orientadora: Profª Drª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY
NITERÓI
2012
RENATA FERNANDES FERREIRA
CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA DIVERSIDADE DOS GENES CODIFICADORES
DAS PROTEÍNAS GP19 E GP36 DE Ehrlichia canis (DONATIEN E LESTOQUARD,
1935) DETECTADA EM SANGUE TOTAL DE CÃES (Canis familiaris)
NATURALMENTE INFECTADOS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução
Animal da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de
Doutor.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________________________
Prof Dr. Aloysio de Melo Figueiredo
Cerqueira – Universidade Federal Fluminense
_____________________________________________________________________
Prof. Drª Nadia Regina Pereira Almosny – Universidade Federal Fluminenese
______________________________________________________________________
Prof. Drª. Rita de Cassia A. A. de Menezes –Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. Huarrisson Azevedo Santos- Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
_____________________________________________________________________
Prof. Dr. Felipe Piedade Gonçalves Neves - Universidade Federal Fluminense
______________________________________________________________________
Prof. Drª Tatiana Xavier de Castro - Universidade Federal Fluminense
NITERÓI
2012
À Kaiko, ao meu lado por 17 anos,
vivendo um dia de cada vez.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, POR TUDO. Pelo que sou, pelo que penso, pelo que tenho. Não cabe numa
simples folha de papel.
À minha família querida, pai, vovó e Rachel, pela paciência e amor dedicados a mim.
Ao meu orientador e amigo Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira, pela sua compreensão
incondicional, sabendo sempre acreditar. Deixamos de ser aluno e mestre. Somos mais que
isso.
À minha orientadora e amiga Nádia Regina Pereira Almosny, pela orientação, confiança e
carinho. Devo a ela minha formação acadêmica.
À professora doutora Tatiana Xavier de Castro, pelas horas dedicadas a mim. Só grandes
amigos fazem isso. Tenho orgulho dela. Chegamos até aqui.
À professora e amiga Ingrid Lyrio Figueira Rodrigues, por lembrar de mim sempre.
À professora e amiga Marcia de Souza Xavier, pela compreensão em meus momentos de
instabilidade.
Ao professor doutor Felipe Piedade Gonçalves Neves, pelo bom humor sempre na hora de
me ajudar. Bom amigo número 1.
Ao técnico do seqüenciamento André Victor Barbosa, por estar sempre disponível. Nunca
ouvi um não. Bom amigo número 2.
À CAPES e ao Cnpq, pelo financiamento desse projeto, sem “eles” não seria viável.
À Coordenação do Curso de Doutorado em Clínica e Reprodução Animal.
A toda equipe do Laboratório de Enteropatógenos e Microbiologia de Alimentos do
Instituto Biomédico da UFF.
A toda equipe do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária da UFF, por fazer parte da
minha história na Universidade.
Aos Médicos Veterinários Ingrid Lyrio Figueira Rodrigues, Christiano Esposito e Luana
Félix, pela ajuda nas coletas e atendimentos aos cães.
À minha estagiária Juliana Macedo, a prova que, de onde menos se espera, a ajuda sempre
vem. Ela vai longe. Tem sempre lugar para pessoas como ela.
Aos meus queridos companheiros de trabalho, principalmente Bianca Barbosa, que são
uma lição de amizade e companheirismo no trabalho e na vida.
À Vet Care e à todos os meus amigos, Claudia Youle, Juliana Cukier, Élida Gripp, Flavia
Braz, Flávia Tavares, Renata Tostes, Gabriela Vieira, Sylvia Azevedo, Maurício Rodrigues,
Andrei Costa, Fabio Gondin, e Paula Carvalho, pelo reconhecimento e respeito pelo meu
trabalho. Feliz o médico veterinário patologista que trabalha com vocês.
À amiga Suzana Martins Gomes Leite por mais uma vez (desde o mestrado) dar um toque
final a tese.
Aos meus amigos que não me ajudaram diretamente neste trabalho, mas fizeram ou fazem
parte da minha vida. Sem nomes. Nenhum deles merece ser esquecido.
“Não sabendo que era impossível, foi lá e fez”
Jean Cocteau
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS xii
LISTA DE TABELAS xiii
LISTA DE QUADROS xv
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS xvi
RESUMO xvii
ABSTRACT xviii
1. INTRODUÇÃO 19
2. OBJETIVOS 22
2.1. OBJETIVO GERAL 22
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 22
3. REVISÃO DE LITERATURA 23
3.1. EHRLICHIOSE MONOCÍTICA CANINA 23
3.1.1. HISTÓRICO 23
3.1.2. TAXONOMIA 24
3.1.3. MORFOLOGIA 26
3.1.4. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA 26
3.1.5. TRANSMISSÃO 27
3.1.6. CICLO BIOLÓGICO 28
Página
3.1.7. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS 28
3.1.7.1. FASE AGUDA 28
3.1.7.2. FASE SUBCLÍNICA 30
3.1.7.3. FASE CRÔNICA 31
3.1.8. ACHADOS ANATOMO-PATOLÓGICOS 31
3.1.9. ASSOCIAÇÃO COM OUTROS HEMOPARASITAS 32
3.1.10 DIAGNÓSTICO 33
3.2. ESPÉCIES DO GÊNERO Ehrlichia QUE ACOMETEM CÃES 35
3.2.1. ANAPLASMA PLATYS (E. PLATYS) 35
3.2.2. EHRLICHIA EWINGII 37
3.2.3. EHRLICHIA CHAFFEENSIS 37
3.2.4. ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM (E. PHAGOCITOPHILA, E. EQUI E HGE) 37
3.2.5. NEORICKETTSIA RISTICII ( E. RISTICII) 38
3.3. MECANISMOS DE ESCAPE DO GÊNERO Ehrlichia 39
3.4.. GENES ESPECÍFICOS PARA ANÁLISE FILOGENÉTICA 40
3.5 GENES ESPECÍFICOS PARA TIPIFICAÇÃO MICROBIANA 41
3.6 FERRAMENTAS MOLECULARES PARA ESTUDO DE
IDENTIDADE E TIPIFICAÇÃO BACTERIANA 43
3.6.1. REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO 43
3.6.2. BIOINFORMÁTICA 43
3.6.3. ÁRVORES FILOGENÉTICAS 44
3.6.4. PROGRAMA DE ANÁLISE GENÉTICA E EVOLUCIONÁRIA MOLECULAR
- MEGA 44
4. MATERIAL E MÉTODOS 46
4.1. ESCOLHA DOS CÃES 46
4.2. OBTENÇÃO E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS 47
4.3. HEMOGRAMAS 47
4.4. EXTRAÇÃO DO DNA 48
Página
4.5. REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) 48
4.5.1. INICIADORES DE CADEIA UTILIZADOS NA PCR PARA CARACTERIZA-
ÇÃO MOLECULAR 48
4.5.1.1. PREPARO DA PRIMEIRA REAÇÃO (PCR1) 49
4.5.1.2. PREPARO DA REAÇÃO PARA DETECÇÃO DA ESPÉCIE (PCR2 E PCR3) 50
4.5.1.2.1. Ehrlichia canis (PCR1) 50
4.5.1.2.2. Anaplasma platys (PCR3) 50
4.5.2. INICIADORES DE UTILIZADOS NA PCR PARA IDENTIFICAÇÃO DOS GENES
QUE CODIFICAM AS PROTEÍNAS GP19 E GP36 DE E. canis 51
4.5.2.1. PREPARO DA REAÇÃO 51
4.5.2.1.1. Protocolo para reação de amplificação do gene das proteínas
gp19 e gp36 51
4.5.3. VISUALIZAÇÃO DOS RESULTADOS 52
4.5.4. CONTROLES 52
4.6. SEQUENCIAMENTO E SIMILARIDADE GENÉTICA 53
4.6.1. SEQUENCIAMENTO PARCIAL DO GENE CODIFICADOR DO RRNA 16S
DE E. canis E A.platys 53
4.6.2. SEQUENCIAMENTO DOS GENES CODIFICADORES DAS PROTEÍNAS GP19 E GP36 54
4.6.3. ANÁLISE DA SIMILARIDADE GENÉTICA ENTRE AS AMOSTRAS
DE E. CANIS E A.PLATYS 54
4.6.4. ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS SEQÜENCIAS GÊNICAS DA
GP19 E GP36 DAS AMOSTRAS DE E. CANIS 55
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA 57
5. RESULTADOS 59
5.1. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE E. CANIS E A. PLATYS 59
Página
5.2. SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DO PRODUTO 60
5.2.1. ANÁLISE DAS SEQUENCIAS PARCIAIS DO GENE RRNA 16S DE E.CANIS 60
5.2.2. ANÁLISE DAS SEQUENCIAS PARCIAIS DO GENE RRNA 16S DE A. PLATYS 62
5.2.3. ANÁLISE DASEQUENCIA PARCIAL DO GENE RRNA 16S COM OS INICIADORES
EHR16SR E EHR16SD 62
5.2.4. ANÁLISE DA SEQUENCIA COMPLETA DO GENE CODIFICADOR DA GP19 64
5.2.5. ANÁLISE DA SEQUENCIA COMPLETA DO GENE CODIFICADOR DA GP36 68
5.2.5.1. REGIÃO 1 (5’-TERMINAL-PRÉ REPETIÇÃO) 69
5.2.5.2. REGIÃO 2 (REGIÃO DE REPETIÇÃO EM TANDEM) 69
5.2.5.3. REGIÃO 3 (3’-TERMINAL PÓS REPETIÇÃO) 70
5.2.6. ANÁLISE DAS INCLUSÕES SUGESTIVAS DE E.CANIS E A.PLATYS 71
5.2.7. ANÁLISE DOS SINAIS CLÍNICOS E HEMATOLÓGICOS 72
.5.2.7.1. ALTERAÇÕES CLÍNICAS E HEMATOLÓGICAS OBSERVADAS
EM CÃES SUBMETIDOS AO DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA E.
canis NOS MUNICÍPIOS DE DUQUE DE CAXIAS, MARICÁ E CA-
CHOEIRAS DE MACACU 72
6. DISCUSSÃO 81
7. CONCLUSÃO 87
8. OBRAS CITADAS 88
ANEXOS 105
Página
LISTA DE FIGURAS
Figura Título Pág
Figura 1 Fluxograma das etapas de detecção, caracterização e análise de identidade
entre as amostras positivas para E.canis e A.platys
54
Figura 2
Ánálise de similaridade baseada em um fragmento de 345pb do gene que
codifica a região 16S rRNA comum a algumas espécies da família
Anaplasmataceae 10 seqüências do estudo, 7 sequencias de suas espécies
próximas obtidas da base de dados do GenBankTM
. As porcentagens do
“Bootstrap” são mostradas nos ramos e representam 50% em 1.000
repetições.
63
Figura 3
Ánálise de similaridade baseada em um fragmento de 414pb do gene que
codifica a proteína gp19, 11 sequencias do estudo e 6 sequencias obtidas da
base de dados do GenBankTM
As porcentagens do “Bootstrap” são mostradas
nos ramos e representam 50% em 1.000 repetições
65
Figura 4
Mutação sinônima no nucleotídeo 312. Em destaque a troca da Adenina pela
Timina permanecendo o mesmo aminoácido de origem
66
Figura 5 Ánálise de similaridade baseada no fragmento de tamanho variável (622-
840pb) que codifica a proteína gp36, 2 sequencias do estudo e 13 sequencias
obtidas da base de dados do GenBankTM
As porcentagens do “Bootstrap” são
mostradas nos ramos e representam 50% em 1.000 repetições
67
LISTA DE TABELAS
Tabela Título Pág
Tabela 1 Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia pela polimerase
(PCR) para identificação dos animais positivos e para a reação de
sequenciamento, com o tamanho em pares de base (pb) de seus respectivos
produtos.
48
Tabela 2 Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia da polimerase
(PCR) para identificação dos genes que codificam as proteínas de membrana
gp19 e gp36 dos animais positivos para E. canis, e seus respectivos alvos.
50
Tabela 3 Protótipos representantes dos tipos de E.canis, A.platys e outras espécies da
família Anaplasmataceae descritas em diferentes países, suas referências e
seus respectivos números de acesso no GenBankTM
55
Tabela 4
Protótipos representantes das sequências codificadoras dos genes das
proteínas gp19 e gp36 de E.canis, descritas em diferentes países, suas
referências e seus respectivos números de acesso no GenBankTM
56
Tabela 5
Similaridade entre as seqüências obtidas na PCR com os iniciadores
ECAN/HE3 específicos para o gene codificador dorRNA 16S de E canis com
amostras publicadas no GenBankTM
, e o valor da porcentagem de identidade
utilizando o programa Bioedit 4.0
60
Tabela 6 Similaridade entre as seqüências obtidas na PCR com os iniciadores
PLATYS/EHR16SR específicos para o gene codificador do rRNA 16S de de
A.platys com amostras publicadas no GenBank, e o valor da porcentagem de
identidade utilizando o programa Bioedit 4.0
61
Tabela 7 Similaridade entre as seqüências obtidas na PCR com os iniciadores
EHR16R/EHR16D específicos para o gene codificador do rRNA 16S comum a
algumas espécies da família Anaplasmataceae com amostras publicadas no
GenBank, e o valor da porcentagem de identidade utilizando o programa
Bioedit 4.0
64
Tabela 8
Similaridade entre as sequências obtidas na PCR com os iniciadores
GP19F/GP19R que codificam a proteína gp19 com amostras publicadas
no GenBankTM
e o valor da identidade utilizando o programa Bioedit 4.0
68
Tabela 9
Similaridade entre as sequências obtidas na PCR com os iniciadores
GP19F/GP19R que codificam a proteína gp36 (região 1) com amostras
publicadas no GenBankTM
e o valor da identidade utilizando o programa
Bioedit 4.0
65
Tabela 10 Similaridade entre as sequências obtidas na PCR com os iniciadores
GP19F/GP19R que codificam a proteína gp36 (região 3) com amostras
publicadas no GenBankTM
e o valor da identidade utilizando o programa
Bioedit 4.0
Tabela 11
Resultados obtidos na pesquisa de hemoparasitos e a PCR3, referente à
presença de algumas espécies pertencentes a família Anaplasmataceae
65
Tabela 12 Resultados obtidos na pesquisa de hemoparasitos e a PCR3, referente à
presença de Ehrlichia canis
Tabela 13 Resultados obtidos na pesquisa de hemoparasitos e a PCR3, referente à
presença de Anaplasma platys
Tabela 14 Queixa principal observada nos 300 cães que foram relatadas por seus
proprietários, separadas por região, referente aos animais de Duque de
Caxias, Maricá e Cachoeiras de Macacu
66
Tabela 15
Queixa principal observada nos 300 cães que foram relatadas por seus
proprietários referente aos animais de Duque de Caxias,Maricá e Cachoeiras
de Macacu
66
Tabela 16 Média e desvio padrão dos parâmetros hematológicos observados nos animais
positivos e negativos nos testes moleculares das regiões de Duque de Caxias,
Maricá e Cachoeiras de Macacu
67
Tabela 17 Achados clínicos observados em 100 cães e alterações hematológicas
encontradas amostras colhidas dos animais no município de Duque de Caxias
69
Tabela 18 Achados clínicos observados em 100 cães e alterações hematológicas
encontradas amostras colhidas dos animais no município de Maricá.
71
Tabela 19 Achados clínicos observados em 100 cães e alterações hematológicas
encontradas amostras colhidas dos animais no município de Cachoeiras de
Macacu.
73
LISTA DE QUADROS
Quadro
Página
Quadro 1 Nova classificação da ordem
Rickettsiales.
25
Quadro 2 Valores de referência para os
parâmetros hematológicos do
cão.
55
LISTAS DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Trifosfatos desoxirribonucleosídeos
EDTA Ácido etileno diamino tetracético
M Molar
mM Milimolar
PCR Do inglês “Polymerase Chain Reaction” ou reação em cadeia da polimerase
pb Pares de base
pH Potencial hidrogeniônico
RNA Ácido ribonucleico
rRNA Ácido ribonucléico ribossomal
sp. nov. Espécie nova
Taq Thermophilus aquaticus
U Unidade internacional de medida
RESUMO
A Ehrlichiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença transmitida por carrapatos da espécie
Riphicephalus sanguineus, altamente adaptados ao meio urbano. Com o aumento do
desmatamento, esse agente tornou-se comum nos cães domésticos. Uma dificuldade crescente
em se fazer o diagnóstico de forma correta associada a deficiência no tratamento e
apresentação da forma clínica da doença, tornou necessário um estudo relacionado a genética
do parasito. Com o objetivo de correlacionar os achados clínicos dos animais atendidos nas
clínicas veterinárias das regiões serrana e metropolitana da cidade do Rio de Janeiro com
linhagens diferentes de Ehrlichia canis a partir da caracterização dos genes codificadores das
proteínas gp19 e gp36, foram colhidas amostras de sangue e soro de 300 animais (100 de
Duque de Caxias, 100 de Maricá e 100 de Cachoeiras de Macacu) que foram atendidos em
clínicas veterinárias, juntamente com seus dados clínicos e o motivo de suas consultas. Como
diagnóstico, foi utilizada a metodologia da reação em cadeia pela polimerase (PCR), realizada
em duas etapas: A primeira delas consistiu na utilização de seqüências iniciadoras ou
“primers” específicos para detecção de algumas espécies da família Anaplasmataceae e na
utilização de “primers” específicos para detecção da espécie E.canis. Foram encontrados 23
animais positivos na primeira reação e 17 positivos para E. canis (sete de Duque de Caxias,
quatro de Maricá e seis de Cachoeiras de Macacu). O produto obtido foi sequenciado e a
análise da similaridade realizada apresentou identidade com valores variando entre 95,7% e
100%. A segunda etapa foi a análise da sequencia do gene codificador das proteínas gp19 e
gp36, que foi realizada utilizando iniciadores específicos intergênicos e apenas 11 seqüências
codificadoras da gp19 e 2 codificadoras da gp36 foram amplificadas. As seqüências
codificadoras da gp19 permaneceram altamente conservadas e as de gp36 apresentaram
características semelhantes a isolados diferentes (56C semelhante aos genotipos novos de
Formosa e 70C semelhante ao genotipo São Paulo e demais isolados do mundo) Após esse
estudo, a análise de significância entre os sinais clínicos e achados hematológicos foi
determinada por meio de tabelas de contingência através da prova do quiquadrado e Fisher
exato. Dos animais positivos em Duque de Caxias, os sinais clínicos que foram significativos
foram apatia, anorexia e perda de peso. Maricá e Cachoeiras de Macacu tiveram como sinais
clínicos significativos a dispnéia. Observando a queixa principal relacionada ao animal 56C e
seus sinais clínicos e hematológicos, nota-se que são característicos de uma possível infecção
por E. canis o que não acontece com o animal 70C. Considerando-se em conjunto as
diferentes características clínicas e hematológicas dos dois animais, as diferenças nas
seqüências do gene codificador da proteína gp36 e a descrição da co-existência de genótipos
diferentes em Formosa, conclui-se que fica a evidência da existência de dois genotipos no
Brasil uma vez que a amostra 56C é diferente da amostra de São Paulo e da 70C,
geneticamente similar a maioria dos isolados do mundo, mesmo mantendo características
clínicas e hematológicas clássicas da EMC.
Palavras-chave: Ehrlichia canis, PCR, sinais clínicos, gp19, gp36
ABSTRACT
The canine monocytic ehrlichiosis (CME) is a disease transmitted by ticks of the species
Riphicephalus sanguineus, highly adapted to the urban environment. With the increase of
deforestation, this agent has become common in domestic dogs. Increasing difficulty in
making the diagnosis correctly associated with disability in processing and presentation of the
clinical form of the disease, made necessary a related study the genetics of the parasite. . In
order to correlate the clinical findings of animals treated at veterinary clinics of mountainous
and metropolitan regions of the city of Rio de Janeiro with different strains of Ehrlichia canis,
blood and serum samples were taken from 300 animals (100 Duque de Caxias, 100 Marica
and 100 Cachoeiras de Macacu) which were treated in veterinary clinics, along with their
clinical data and the reason for their queries. As a diagnosis, the methodology of the
polymerase chain reaction (PCR), was performed in two stages: The first one consisted in the
use of initiator sequences or "primer" specific for the detection of some species of the family
Anaplasmataceae and the use of "primers "species-specific detection of E.canis. 23 animals
were found positive in the first reaction and 17 positive for E. canis (seven of Duque de
Caxias, Marica four and six of Cachoeiras de Macacu). The product was sequenced and
similarity analysis carried out showed identity with values ranging between 95.7% and 100%.
The second step was to analyze the sequence of the gene encoding the gp19 and gp36 protein,
which was performed using specific primers and 11 only encoding the gp19 and gp36 two
were amplified. The coding sequences of gp19 and remained highly conserved gp36 showed
similar characteristics of the different isolates (56C similar to the new genotypes of Taiwan
strains and 70C genotype similar to Sao Paulo strain and other isolates of the world) After this
study, the analysis of significance between the signs clinical and hematological findings were
determined by means of contingency tables by the chi-square test and Fisher exact test. Of
positive animals in Duque de Caxias, the clinical signs that were significant were apathy,
anorexia and weight loss. Marica and Cachoeiras de Macacu significant clinical signs were
dyspnea. Observing the main complaint related to the animal 56C and its clinical and
hematological notices that are characteristic of a possible infection by E. canis which does not
happen with the animal 70C. Considering together the different clinical and hematological
characteristics of the two animals, the differences in the sequences of the gene encoding the
protein gp36 and the description of the co-existence of different genotypes in Taiwan, it is
concluded that the evidence is the existence of two genotypes in Brazil since the sample is
different from the 56C sample of Sao Paulo and 70C, the most genetically similar isolates of
the world, while maintaining clinical and hematological features of classical EMC.
Key words: Ehrlichia canis, PCR, clinical signs, gp19, gp36
1. INTRODUÇÃO
A emergência de doenças parasitárias transmitidas por vetores artrópodes representa
novos desafios para a medicina veterinária e humana. Há uma ampliação na sua distribuição
geográfica devido a mudanças climáticas e acessos a outros nichos ecológicos que não os
habituais.
A presença de carrapatos no meio urbano por conta do desmatamento tem resultado
em uma associação entre reservatórios selvagens e vetores, e estes, com o homem e os
animais domésticos. Tais fatores somados ao advento da biologia molecular, em particular o
uso da Reação em Cadeia pela Polimerase (Polimerase Chain Reaction- PCR),
proporcionaram um melhor reconhecimento da doença e, com isso, comprovam seu aumento
crescente. Para elucidar as possíveis modificações na ocorrência dessas hemoparasitoses em
função das mudanças climáticas ocorridas, diversos estudos foram realizados na região
serrana e metropolitana do Estado do Rio de Janeiro envolvendo carrapatos e cães.
Alguns artrópodes adaptam-se muito bem ao meio urbano, como o carrapato
Rhipicephalus sanguineus e, por causa do desmatamento, seu contato com animais
domésticos se tornou freqüente. R. sanguineus é o principal vetor de Ehrlichia canis, bactéria
causadora da Ehrlichiose Monocítica Canina (EMC).
Ehrlichioses e anaplasmoses são doenças causadas por microorganismos Gram-
negativos, intracelulares obrigatórios que apresentam como vetores principais os carrapatos
(MADEWELL et al, 1982; EWING et al., 1997; INOKUMA et al, 2001). Acidentalmente
podem infectar o homem e animais domésticos, tendo um potencial zoonótico considerável
(RIKIHISA, 2003).
A EMC é considerada a mais comum hemoparasitose de caninos domésticos, sendo
fatal em alguns casos. É uma síndrome altamente variável, apresentando dificuldades
significativas no diagnóstico diferencial com outras doenças infecciosas e metabólicas
(BREITSCHWERDT, 1988; GRIDEM et al., 1991).
Sua manifestação ocorre de diversas maneiras, desde uma forma branda assintomática
a apresentação de sinais e sintomas clínicos evidentes como perda de peso, anorexia,
depressão, fraqueza, febre ou hipotermia, dores articulares, petéquias e, ocasionalmente,
esplenomegalia e hepatomegalia associados à anemia regenerativa e trombocitopenia
(COLES, 1986; HARVEY, 1998; TASKER, 2001, ALMOSNY e MASSARD, 2002).
O animal pode apresentar quadros clínicos similares a muitas enfermidades e a doença
também não tem um critério de diagnóstico padronizado. Alguns parâmetros clínicos não são
observados, especialmente em formas atípicas da doença ou ainda, quando são causados por
outros agentes diferentes da E. canis. Uma variação na linhagem isolada pode afetar a
severidade da doença e suas manifestações clinico-patológicas (HEGARTY et al., 1997,
HARRUS et al., 1999).
Na rotina veterinária, o diagnóstico é geralmente baseado na associação dos sinais
clínicos, alterações em exames laboratoriais consistentes e testes específicos para E. canis.
Diferenças na etiologia, potencial patogênico e susceptibilidade do hospedeiro,
heterogenicidade da amostra e a omissão freqüente no diagnóstico diferencial são fatores que
contribuem para a natureza confusa da EMC (COUTO et al., 1998; KAKOMA et al., 2000).
A diversidade antigênica entre agentes da família Anaplasmataceae pelo mundo pode
ser uma das razões para a variedade nos sinais clínicos descritos em diferentes regiões
geográficas. Com isso, tal diversidade contribui para a dificuldade de realização do
diagnóstico da doença em determinada região em relação à outra (HARRUS et al., 1999).
Com as técnicas de seqüenciamento e uma análise clínica dos animais que foram
atendidos nas regiões que sofreram com o desenvolvimento urbano, pode-se traçar um perfil
de comportamento da doença, esclarecendo o porquê de alguns animais desenvolverem uma
enfermidade de curso fatal e outros tornarem-se portadores ou muitas vezes, curarem
sozinhos.
O estudo das seqüências de genes específicos que codificam proteínas de membrana e
conferem imunogencidade e virulência as linhagens têm sido realizados e os resultados
obtidos são significativos (YU et al, 2007). Esse tipo de estudo pode vir a auxiliar no
diagnóstico e no tratamento dos cães porque, através deles, podemos tentar traçar um
prognóstico da infecção.
Os genes que codificam as proteínas gp36 (variável) e gp19 (414 pb) são amplamente
descritos e utilizados para identificar as diferentes variantes dentro da espécie E. canis.
Ambas são glicoproteínas de membrana, espécie-específicas e imunorreativas (CARDÉNAS
et al, 2007).
O gene que codifica a gp19 é mais conservado, e com isso, seu estudo é um grande
facilitador para fabricação de vacinas e testes sorológicos mais sensíveis quando relacionados
a esta proteína de melhor resposta imunológica (CARDÉNAS et al., 2007).
A gp36 é uma proteína de membrana que em amostras brasileiras seu gene tem
apresentado alguma variação, e no restante do mundo se mostra bastante conservado. Ele tem
sido utilizado para tipificação dentro da espécie E. canis (DOYLE et al, 2005).
Associando a variedade de formas apresentadas pela doença e as diferentes linhagens
ou isolados de E.canis encontrados, torna-se imprescindível um estudo que faça essa relação
para um melhor entendimento da enfermidade no Estado do Rio de Janeiro. A análise da
diversidade genética da E. canis envolvendo animais clinicamente saudáveis e animais
doentes em regiões geográficas diferentes é essencial para melhorar a abordagem com o
paciente e tentar realizar um bom trabalho profilático.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi identificar as seqüências dos genes codificadores das
proteínas gp19 e gp36 de E. canis em sangue total de cães, doentes e clinicamente sadios para
verificar se há alguma relação entre o(s) genótipo(s) encontrado(s) e os achados clínicos e
hematológicos do paciente.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Detectar e identificar material genômico (seqüência parcial do gene que codifica o
rRNA 16S) de agentes da família Anaplasmataceae de amostras com inclusões
sugestivas de Ehrlichia sp./Anaplasma sp.
2. Avaliar a diversidade entre as sequências dos genes que codificam as proteínas de
membrana gp19 e gp36 de amostras isoladas de cães das regiões metropolitana e serrana
do Estado do Rio de Janeiro.
3. Estudar a associação da infecção por E. canis com achados clínicos e hematológicos.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. EHRLICHIOSE MONOCITICA CANINA
3.1.1. HISTÓRICO
A ehrlichiose monocítica canina (EMC) foi primeiramente descrita por Donatien e
Lestoquard (1935), no Instituto Pasteur na Argélia. Eles observaram que animais que
apresentavam infestação por carrapatos da espécie R. sanguineus desenvolviam uma doença
de caráter febril algumas vezes, e tais achados foram atribuídos a um microrganismo que
possivelmente era transmitido pelo carrapato, que recebeu o nome de Rickettsia canis. Mais
tarde, no ano de 1945, foi renomeada por Moshkovshi para E. canis em homenagem ao
famoso bacteriologista Paul Ehrlich (RISTIC & HUXSOLL, 1984).
O primeiro caso no “Novo Mundo” foi descrito nas Antilhas Holandesas por Boll e
Sutmöller em 1957 e nos EUA descrito por Ewing em 1963 (EWING, 1969). Ao observar
Babesia canis em esfregaços sanguíneos, Ewing visualizou estruturas características de E.
canis em leucócitos.
Durante a guerra do Vietnã, cães americanos começaram a sofrer com a doença, que
causou o óbito de centenas de animais na década de 70 (HUXSOLL et al., 1969, HUXSOLL
et al. 1970) e desde então, outras espécies de rickettsias foram descritas em várias partes do
mundo (EWING, 1969, RIKIHISA 1991a). Há relatos em países da Ásia, África e Europa,
atribuindo caráter cosmopolita a doença (UNVER et al., 2001).
No Brasil, o primeiro relato de E. canis ocorreu em Belo Horizonte (COSTA et
al.1973) e no Estado do Rio de Janeiro foi descrito por Carrillo et al. em 1976.
No Estado de São Paulo, em 1979, foi descrita por Hagiwara (SEIBERT et al., 1997) e
em Jaboticabal por Maregati (KAVINSKI, 1988).
A partir daí a doença foi descrita em várias regiões do território brasileiro (YAMURA
e VIDOTTO, 1982; SILVEIRA et al., 1984; OLIVEIRA et al., 2000; DAGNONE et al.,
2003; CASTRO et al., 2004; MACIEIRA et al., 2005) e com frequência alta (ALMOSNY,
1998; ALMOSNY E MASSARD, 2002).
LABARTHE et al., (2003) realizaram um levantamento sorológico usando ELISA
comercial que pesquisa imunoglobulinas G contra E. canis em todo Brasil e encontraram uma
soroprevalência de 19,8%. Ao analisarem dados referentes à região do Estado do Rio de
Janeiro foi encontrada uma prevalência sorológica de 29,6%, e que, na verdade, mesmo sendo
alta a prevalência nesse studo, um resultado positivo na sorologia não indica necessariamente
infecção e sim exposição ao agente etiológico (NEER et al. 2002).
3.1.2. TAXONOMIA
E. canis foi, primeiramente, alocada na tribo Ehrlichiaeae, junto com os agentes
etiológicos da ehrlichiose canina, de acordo com Ristic e Huxsoll, 1984. Rikihisa (1991a),
posteriormente, acrescentou novas espécies sem que fossem feitas mudanças no sistema de
classificação.
Com a evolução dos estudos genômicos, o seqüenciamento de uma porção do gene
codificador da unidade 16S do RNA ribossomal e estudos diversos relacionados ao DNA,
novos horizontes foram abertos para a taxonomia das rickettsias. (OLSEN e WOESE, 1993;
DRANCOURT e RAOULT, 1994).
Com uso dessa nova ferramenta, foi possível agrupar as espécies da tribo Ehrlichiaeae
em três genogrupos distintos, (ANDERSON et al., 1991) sendo eles: genogrupo um ou da E.
canis; genogrupo dois ou da E. phagocytophila e genogrupo três ou da E. sennetsu, onde cada
agente que especifica o grupo foi primeiramente identificado. E. canis encontrava-se no
genogrupo um, juntamente com E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris e Cowdria ruminantium.
(DUMLER et al., 1995; POPOV et al., 1998).
Dumler et al., 2001, utilizando a análise dos genes codificadores da região 16S do
RNAr, gênese de proteínas de superfície e análise genética da proteína de choque térmico
groESL, propuseram uma nova classificação a partir da análise das seqüências genéticas: Os
membros das tribos Ehrlichiaeae e Wolbachiaeae foram transferidos para a família
Anaplasmataceae e a estrutura tribal da familia Rickettsiaceae foi eliminada. O gênero
Anaplasma passou a incluir a espécie A. phagocytophila (englobando as espécies E.
phagocytophila, E. equi e o agente da erliquiose granulocítica humana), as espécies A. platys
e A. bovis foram criadas para substituir as espécies E. platys e E. bovis respectivamente.
O gênero Ehrlichia foi corrigido para inclusão da espécie E. ruminantium no lugar de
Cowdria ruminantium, e o gênero Neorickettsia para inclusão das espécies N. risticii no lugar
de E. risticii e N. sennetsu no lugar de E. sennetsu. (DUMLER et al., 2001), quadro 1.
Estas alterações propostas por Dumler et al., (2001), foram homologadas em 20021
onde A. phagocytophila teve seu nome corrigido para A. phagocytophilum e A. bovis e A.
platys seriam novas espécies, pois seus antigos nomes não tinham nenhum suporte. Sendo
assim, após sua nomenclatura foi acrescido o complemento sp. nov.
Quadro 1: Classificação atual da ordem Rickettsiales.
Ordem Família Gênero Espécie
A. marginale
A. centrale
Anaplasma A. ovis
A. bovis
A. platys
A. phagocytophilum
E. ruminantium
Rickettsiales Anaplasmataceae E. canis
Ehrlichia E. chaffeensis
E. muris
E. ewingii
N. helminthoeca
Neorickettsia N. risticii
N. sennetsu
Wolbachia W. pipientis
Fonte: DUMLER et al., 2001
1 - LIST EDITOR: Notification list. Notification that new names and new combinations have appeared in volume 51, part 6 of the IJSEM.
IJSEM, vol 52, p 5-6, 2002.
3.1.3. MORFOLOGIA
As bactérias do gênero Ehrlichia são todas intracelulares obrigatórias, pequenas e
pleomórficas (cocóides ou elipsóides). Utilizando a coloração de Gram apresentam-se como
Gram-negativas, mas não se coram bem por este método (RISTIC E RUXSOLL, 1984).
Suas inclusões são intracitoplasmáticas e aparecem sozinhas ou agrupadas em
estruturas comumente chamadas de “mórulas”, que se formam no citoplasma dos leucócitos
de mamíferos susceptíveis. São imóveis e não cultiváveis em meios sem células ou em ovos
embrionados. Apresentam 0,5 µm de diâmetro e as mórulas podem chegar até 4,0 µm
(RISTIC E RUXSOLL, 1984).
As inclusões das bactérias que pertencem a esse gênero podem ser classificadas de três
formas: mórulas, corpúsculos elementares e corpúsculos iniciais. As mórulas são um conjunto
de corpúsculos elementares que se coram bem pelo método de Giemsa. Os corpúsculos
elementares são estruturas arredondadas de vários tamanhos que podem ser vistas dentro dos
vacúolos no citoplasma dos monócitos. Já os corpúsculos iniciais são formados por diversos
grânulos. Esses grânulos, tanto os iniciais quanto os elementares precisam ser diferenciados
de granulações azurofílicas presentes no citoplasma dos mononucleares de cães sadios
(ALMOSNY e MASSARD 2002). De acordo com Mcdade (1990) os corpúsculos
elementares podem medir até 0,5 µm de diâmetro e os inicias entre 1,5-2,5 µm.
Segundo Ewing (1969), o corpúsculo inicial é menos evidente que a mórula e os
elementares são facilmente identificáveis quando a mesma (mórula) está deixando a célula
parasitada ou por lise ou por exocitose.
3.1.4. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
A grande mobilidade dos animais pelo mundo gerou o aparecimento de novas doenças
em regiões geográficas diferentes, o que gerou um caráter cosmopolita a maioria delas,
principalmente aquelas que possuem o carrapato como vetor. Com esse fator, os carrapatos
estão encontrando novos nichos e em diferentes condições climáticas (SHAW et al., 2001).
A distribuição da E.canis é cosmopolita e está intimamente ligada a do seu carrapato
vetor, R. sanguineus (WOODY E HOSKINS, 1991; RIKIHISA, 1991a, NEER, 1998,
BREITSCHWERDT 2000).
A maior parte de sua ocorrência está nas regiões tropicais e subtropicais devido à
maior adaptação do carrapato (BREITSCHWERDT, 2000).
No Brasil, a EMC é de ampla ocorrência, principalmente em áreas urbanas, devido à
alta prevalência do R. sanguineus (AGUIAR et al. 2007b).
3.1.5. TRANSMISSÃO
A transmissão da E. canis ocorre principalmente através do carrapato R. sanguineus
(GROVES et al., 1975; WOODY E HOSKINS, 1991; RIKIHISA, 1991a, NEER, 1998;
BREITSCHWERDT, 2000). O carrapato vermelho do cão se torna infectado a partir da
ingestão de leucócitos infectados com o microrganismo (WOODY E HOSKINS, 1991) e
contamina os cães no momento do repasto sanguíneo, quando inocula sua saliva no local da
picada (GROVES et al., 1975). A reação inflamatória local provoca o deslocamento dos
leucócitos o que facilita a disseminação da bactéria no hospedeiro. O carrapato infectado pode
transmitir E. canis por até cinco meses (RIKIHISA, 1991a, DAGNONE et al., 2001,
ALMOSNY et al., 2002; MACEDO, 2007).
Embora E.canis não seja considerada uma zoonose, há relatos da identificação desse
microrganismo causando doença clínica em pacientes humanos. O papel do cão como
reservatório da infecção e do R. sanguineus como vetor acidental ainda não está bem
esclarecido (PEREZ et al., 1996; UNVER et al., 2001).
A transmissão do cão para o carrapato ocorre em duas a três semanas após a
inoculação e isso acontece porque os leucócitos no início da infecção permanecem infectados,
depois há sua destruição (WOODY E HOSKINS, 1991).
O carrapato infectado pode transmitir a doença de forma transestadial e qualquer
estágio de vida do mesmo transmite aos cães o agente durante 155 dias (LEWIS et al., 1977;
NEER, et al., 1998).
Em infecções experimentais houve sucesso utilizando carrapatos da espécie
Dermatocentor variabilis e este então é considerado vetor (JOHNSON et al., 1998).
Animais que participam de programas de doação de sangue devem ser sempre
monitorados uma vez que E. canis pode ser transmitida através de transfusões sanguíneas
(WOODY E HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1998a; BREISCHWERDT, 2000; NEER
etal., 2002).
3.1.6. CICLO BIOLÓGICO
O carrapato é infectado ao ingerir sangue contaminado por E. canis (WOODY &
HOSKINS, 1991). O microrganismo se multiplica dentro das células do sangue do carrapato
(hemócitos) e nas células da glândula salivar, podendo entrar no intestino infectando o
epitélio do mesmo (SMITH et al., 1976).
Após a picada do carrapato, os corpúsculos elementares entram nos monócitos por
fagocitose, sem haver formação do fagolisossomo. Há divisão binária dos corpúsculos e entre
os dias três e cinco da infecção os corpúsuclos elementares já formam estruturas de 1 a 2,5
µm de diâmetro chamados de corpúsculos iniciais. Durante os próximos sete a doze dias
ocorrem replicações e os corpúsculos iniciais passam a ser mórulas. A mórula é a estrutura
que identifica o gênero Ehrlichia. Quando a célula infectada se rompe ou quando há
exocitose, as mórulas se fragmentam em corpúsculos elementares e um novo ciclo celular
recomeça (McDADE, 1990).
Em infecções experimentais muitas mórulas tendem a se aproximar da membrana
citoplasmática da célula infectada alterando sua morfologia (ALMOSNY, 1998).
3.1.7. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Após a infecção pela picada do carrapato, a doença apresenta um período de incubação
de oito a vinte dias (HARRUS et al., 1997a). A partir daí, as alterações clínicas começam a
surgir e a doença se divide em três fases: aguda, subclínica e crônica (RIKIHISA, 1991a;
WOODY E HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997a; NEER, 1998; BREISCHWERDT,
2000).
3.1.7.1. FASE AGUDA
O período de duração da fase aguda vai de duas a quatro semanas
(BREISCHWERDT,2000) e em infecção experimental, os animais iniciaram a reação febril
entre o terceiro e 15º dia após a inoculação (ALMOSNY, 1998).
Nesta fase, os microrganismos se multiplicam nos mononucleares circulantes e nos
tecidos do sistema fagocítico monocitário do fígado, baço e linfonodos, causando aumento
dos mesmos. As células infectadas são transportadas via corrente sangüínea para pulmões,
rins e meninges. Essas células infectadas aderem ao endotélio vascular levando a vasculites e
infecção do tecido sub-endotelial (BREISCHWERDT, 2000).
Os sinais clínicos associados com fase aguda são febre, depressão, anorexia,
linfoadenopatia e perda de peso, podendo ser moderados ou até inaparentes (WOODY e
HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 1998; IQBAL et al., 1994; BREISCHWERDT, 2000).
Outros sinais menos frequentes também podem aparecer na fase aguda como
manifestações do sistema nervoso central, manifestações oculares e manifestações
respiratórias (WOODY E HOSKINS, 1991). Quadros agudos mais graves parecem ocorrer
em regiões onde a infecção dos animais por E. canis é mais recente (ALMOSNY &
MASSARD, 2002)
As alterações hematológicas observadas durante a fase aguda têm inicio com a
presença de macroplaquetas e plaquetas ativadas (ALMOSNY, 1998). A presença dessas
alterações está associada ao aumento na produção das plaquetas pela medula óssea (GRIDEM
et al., 1991). O achado de plaquetas atípicas durante a avaliação do esfregaço sanguíneo pode
ser o primeiro indicativo de distúrbios na trombopoiese ou na função plaquetária. Durante a
fase aguda, o consumo associado ao sequestro das plaquetas contribui para a trombocitopenia
(BREISCHWERDT,2000). A trombocitopenia tem sido um achado consistente em todas as
fases da EMC (NEER, 1998).
ALMOSNY (1998), não observou, durante a fase aguda, casos de acentuada
trombocitopenia, embora existisse uma variação cíclica na contagem. Isso sugeriu uma maior
adaptação do parasita ao hospedeiro.
A contagem de leucócitos é variável, e a anemia está relacionada com a supressão da
produção de eritrócitos e destruição acelerada dos mesmos, característica da evolução da
doença (BREISCHWERDT, 2000).
Em um estudo retrospectivo HARRUS et al., (1997b) demostraram que a maioria dos
cães apresentava trombocitopenia e anemia (75%) sendo que em 50% desses animais a
anemia era normocítica e normocrômica. No mesmo estudo, 50% dos animais também
apresentaram linfopenia e 37% apresentava leucopenia.
A anemia é um achado consistente na maioria dos casos, sendo descrita por diversos
autores (NEITZ E THOMAS, 1938; HUXSOLL et al., 1972; TROY E FORRESTER, 1990;
HOSKINS, 1991; WOODY E HOSKINS, 1991,ALMOSNY, 1998). A anemia parece ser
mais intensa entre a terceira e quarta semanas pós-infecção, quando se observa uma acentuada
palidez de mucosas (ALMOSNY, 1998).
Outros achados comuns nesta fase são hipoalbuminemia e aumento das enzimas
alanina-amino-transferase (ALT) e fosfatase alcalina (FAL) (LITTLE, 2010; OLIVEIRA et
al., 2008).
Ocasionalmente, observam-se desordens relacionadas a sangramentos com ou sem
presença de trombocitopenia. Entretanto, é comum não haver alterações em testes de
coagulação como Tempo de Protrombina (TP) e Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada
(TTPA) (KUEHN E GAUNT, 1985; HOSKINS, 1991; XAVIER et al., 2001). Um eventual
tempo de sangramento aumentado se justifica por uma trombocitopenia acentuada ou por
alterações quantitativas nas plaquetas (HOSKINS, 1991a).
Em relação à medula óssea, pode haver um aumento na quantidade de magacariócitos
(hiperplasia megacariocítica) assim como da linhagem mielóide. Há uma queda nos
precursosres eritróides, justificando a anemia normocítica e normocrômica (HOSKINS,
1991a).
Na fase aguda, os sinais são inespecíficos e se o animal for imunocompetente, estes
sinais desaparecem sem tratamento, e o cão pode ou não evoluir para a fase subclínica.
3.1.7.2. FASE SUBCLÍNICA
Os cães que não eliminaram o parasito podem permanecer na fase subclínica por anos
ou evoluir para fase crônica da doença (HARRUS 1997a).
Na fase subclínica, há uma normalização do peso do animal, a temperatura volta ao
normal e o cão parece estar curado. Algumas alterações laboratoriais podem persistir como a
trombocitopenia (WOODY E HOSKINS, 1991).
O período em que essa fase costuma ocorrer é entre a sexta e a oitava semana após a
inoculação e é caracterizada pela ausência de sinais clínicos e alterações persistentes no
hemograma como trombocitopenia, leucopenia e anemia. Animais imunocompetentes
eliminam o parasito sem entrar na fase crônica da doença (McDADE, 1990).
Essa fase ainda tem como característica altos títulos de anticorpos e em alguns casos
sinais clínico-patológicos condizentes com ehrlichiose (CODNER E FARRIS-SMITH, 1986).
Conforme a doença vai evoluindo, a anemia tende a se resolver, as plaquetas voltam
ao normal e a leucopenia cessa. Aparece uma neutropenia relativa associada à linfocitose
como característica (CODNER E FARRIS-SMITH, 1986). Uma elevação nas globulinas,
principalmente gama-globulinas também foi observada (WANER, 1997).
Cães na fase subclínica são carreadores da infecção podendo carregar o parasito por
anos sem desenvolver sinais clínicos da doença crônica. No caso dos animais serem incapazes
de responder a infecção, há ingresso na fase crônica da doença (CODNER E FARREL-
SMITH, 1986; HARRUS et al., 1998a; WOODY E HOSKINS, 1991, BREISCHWERDT,
2000).
3.1.7.3. FASE CRÔNICA
A fase crônica tem como característica o aparecimento de alterações clínicas e
hematológicas graves, mas isso pode variar com o caso em questão (NEER, 1998;
BREISCHWERDT, 2000).
Sangramentos, palidez de mucosas, perda de peso acentuada, debilidade, sensibilidade
abdominal, uveíte, hemorragias de retina, sinais neurológicos consistentes com
meningoencefalite e nefropatia por deposição de imunocomplexos são achados frequentes
(BREISCHWERDT, 2000).
Devido à imunossupressão causada pelo agente durante a fase crônica, infecções
oportunistas podem estar presentes e febre, emaciação e edemas periféricos também podem
aparecer (BREISCHEWERDT, 2000; HARRUS et al., 1997a).
Os achados hematológicos assemelham-se aos da fase aguda (KUEHN E GAUNT,
1985). São eles: monocitose, linfocitose, trombocitopenia grave e anemia arregenerativa
(HOSKINS, 1991).
A hipoplasia da medula óssea causada pela doença leva a uma pancitopenia, onde,
cães da raça Pastor Alemão têm maior sensibilidade (WOODY E HOSKINS, 1991; NEER,
1998).
Existe uma possível proposta de que E.canis induza a produção de um fator esplênico
que leva a supressão da hematopoiese. A ausência desse fator em cães que foram
esplenectomizados pode justificar uma possível melhora, quando comparados com cães
intactos. É possível que esse fator possa desempenhar um papel importante na supressão da
medula óssea que ocorre durante a fase crônica dessa doença (HARRUS et al., 1998b).
3.1.8. ACHADOS ANATOMO-PATOLÓGICOS
Os achados anatomo-patológicos durante a necropsia incluem hemorragia petequial no
tecido subcutâneo e na maioria dos órgãos afetados, esplenomegalia, hepatomegalia,
linfoadenopatia, generalizada e edema de membros. Os achados microscópicos são o
infiltrado de células do sistema reticuloendotelial e plasmocitose em vários órgãos e tecidos,
incluindo o sistema nervoso, rins, pulmões, fígado e tecido linfoide. Tais infiltrados celulares
e a proliferação linfocítica modificam a arquitetura de órgãos como linfonodos e baço
(CASTRO et al., 2004).
Estudos com infecção experimental por E. canis têm permitido avaliar alterações
imunológicas da doença. Há intensa infiltração de plasmócitos em órgãos parenquimatosos,
sendo que os animais comumente apresentam teste de Coombs e de autoaglutinação positivos
(HARRUS et al., 1999, CASTRO et al., 2004). A ativação de linfócitos T é necessária para a
interação entre a resposta imune humoral e celular e uma efetiva destruição intracelular do
parisito. Além disso, foi proposto que a imunidade celular desempenha um papel importante
na patogênese da ehrlichiose canina, determinada por um aumento dos linfóctios T citotóxicos
durante a infecção, o que resulta em aumento da citotoxidade mediada por células (CASTRO
et al., 2004).
Os fatores que aparentemente afetam o grau de virulência da infecção, bem como o
seu progresso incluem variações de cepas, raça do cão, idade, estado imunológico e a
presença ou não de outras doenças concomitantes (WOODY E HOSKINS, 1991; NEER,
1998).
3.1.9. ASSOCIAÇÃO COM OUTROS HEMOPARASITAS
Por ser possível a transmissão de vários hemoparasitas por carrapatos, a presença de
diversas espécies infectando o mesmo animal é freqüente. Murphy et al., (1998) relatam a
existência de evidências sorológicas e moleculares da presença de E. canis, E. chaffeensis e E.
ewingii em cães e carrapatos de Oklahoma. Sainz et al., (1999), relataram um caso clínico
onde o cão apresentou infecção por A. platys, E. canis e Babesia sp.
Infecções simultâneas podem ocorrer como resultado da transmissão de múltiplos
organismos pelo mesmo carrapato ou como resultado de transmissões independentes em
tempos diferentes, por carrapatos diferentes (KORDICK et al., 1999).
Suksawat et al., (2001b), relatam a existência de três agentes da ehrlichiose: E. canis,
E.equi e A. platys em cães na Tailândia e Venezuela, afirmando que o estado de co-infecção
potencializa as doenças e complica o diagnóstico assim como o manejo terapêutico dos
pacientes.
O diagnóstico clínico necessita de uma combinação entre o exame físico e o histórico
de contato com carrapatos (HARRUS et al., 1997a).
Para obter um acesso real ao controle de microrganismos patógenos, é necessário
reconhecer a manifestação clínica da doença no hospedeiro. As complicações da doença
muitas vezes não estão só relacionadas a um microrganismo, mas, a mais de um agente
etiológico. Dessa forma, é necessário que as manifestações clínicas específicas da doença
sejam observadas e, na medida do possível, diferenciadas com a identificação do agente
responsável (EWING E BUCKNER, 1965).
LOBETTI (2002) afirmou que a ehrlichiose associada à babesiose e a bartonelose
pode ser grave e levar o animal a óbito.
3.1.10 DIAGNÓSTICO
O diagnóstico da EMC é feito basicamente pela associação das alterações clínicas com
as alterações hematológicas. Para diagnóstico definitivo, alguns métodos já estão disponíveis,
desde a detecção do agente até a detecção de anticorpos específicos.
A pesquisa de mórulas intracitoplasmáticas em lâminas de esfregaço de sangue
periférico é o método mais simples e barato oferecido no mercado atualmente. Entretanto, a
sensibilidade do método é baixa já que o microrganismo está presente em apenas 1% ou
menos dos leucócitos (DAGNONE et al, 2001a, LAPPIN, 2001).
Outro método utilizado é o cultivo celular em células da linhagem DH-82 (histiócitos
caninos) (AGUIAR et al., 2007b). O método é sensível e definitivo para o diagnóstico da E.
canis porém não é conveniente para uso na rotina laboratorial por ser laboriosa, requerendo
estrutura física adequada. O tempo de crescimento das mórulas é de duas a seis semanas para
obtenção de resultados positivos, o que também inviabiliza o método como rotina (IQBAL et
al., 1994b).
A detecção de anticorpos para E. canis é o método que mais tem sido utilizado nas
clínicas veterinárias. O teste de reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é capaz de
detectar anticorpos anti-E. canis no sétimo dia pós-infecção. A desvantagem desse teste é que
a RIFI pode indicar apenas exposição prévia ao agente. Após o tratamento, os títulos de
anticorpos começam a cair levando de 15 a 30 meses mesmo com a eliminação do
microrganismo. Em áreas endêmicas, esses títulos (IgG) permanecem altos, sem o animal
demonstrar a doença clinicamente, aumentando o número de falsos positivos (BULLA et al.,
2004). Outra desvantagem é que o teste apresenta reação cruzada com outras espécies de
Ehrlichia (MURPHY etal., 1998, DAGNONE et al., 2001a). A interpretação dos resultados
de exames sorológicos deve considerar o curso da doença, a reatividade cruzada, infecções
múltiplas com outros agentes e títulos de anticorpos persistentes após o tratamento (WANER
et al., 2001).
Por último, a introdução de técnicas moleculares tem permitido um diagnóstico rápido,
sensível e específico para a ehrlichiose nas fases aguda e crônica da doença (IQBAL et al.,
1994; McBRIDE et al., 1996; WEN et al., 1997).
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica baseada na síntese
enzimática de milhões de cópias de uma parte da fita de DNA alvo. É uma técnica rápida,
sensível e específica para detecção de microorganismos (RODRIGUEZ, 1997) e vários
estudos recentes demonstram que a PCR é um método efetivo para detecção de rickettsias no
sangue de cães (IQBAL et al., 1994c; WEN et al.,1997; MURPHY et al., 1998; INOKUMA
et al., 2001; CHAE et al., 2003; MACIEIRA, 2003; FENOLLAR e RAOULT, 2004;
MANNA et al., 2004), detecção em material de cultivo celular (DAWSON et al., 1997),
diferenciação das espécies infectantes (HANCOCK et al., 2001) e análises filogenéticas (YU
et al., 2001; DRANCOURT e RAOULT, 1994).
McBride et al. (1996) concluíram que a PCR é uma excelente ferramenta para
distinguir a infecção crônica dos animais que apenas apresentam anticorpos contra E. canis
por exposição ao agente e enfatizaram que problemas relacionados à sensibilidade inadequada
e dificuldade com o diagnóstico diferencial são superados com a PCR.
Segundo Iqbal e Rikihisa (1994c), a PCR é eficaz na detecção de níveis baixos de
parasitemia em tecidos de cães.
Wen et al. (1997) indicaram a utilização da PCR junto a testes de imunofluorescência
indireta para auxilio no diagnóstico de infecção inicial ou avaliação do tratamento.
As limitações do teste são os custos elevados e uma grande chance de contaminação.
A presença de partículas inibidoras em uma reação de PCR pode inibir a atividade da enzima
Taq polimerase e, conseqüentemente, a amplificação de DNA, levando a resultados falso-
negativos (BARBER et al., 1999), por isso é importante manter os cuidados com o
procedimento e os controles durante o preparo da reação (FENOLLAR e RAOULT, 2004).
A PCR associada ao teste de ELISA comercial (4DX- IDEXX®
) atualmente tem se
mostrado bastante sensível na detecção E. canis. Esse tipo de ELISA sozinho não é
considerado um bom teste (HARRUS et al., 2002; HEGARTY et al., 2009).
A PCR-ELISA tem sido bastante utilizada no diagnóstico de agentes infecciosos,
como as leishmanioses cutânea e visceral, visto que a técnica da PCR isolada apresentava
baixa sensibilidade (MARTÍN-SÁNCHEZ et al., 2002). A associação das duas técnicas torna
possível diferenciar a infecção de exposição ao agente (DALY E DOYLE, 2003).
3.2. ESPÉCIES DO GÊNERO EHRLICHIA QUE ACOMETEM CÃES
Atualmente, já se sabe que diversas espécies do gênero Ehrlichia podem parasitar
diversos tipos de hospedeiro (BREITSCWERDT, 2000). Com isso, as espécies consideradas
infectantes para os cães vão desde as que causam doença clínica no mesmo até aquelas que
causam sintomatologia branda ou os mantém assintomáticos. Esses cães assintomáticos
podem servir de reservatório e serem responsáveis pela transmissão do microrganismo para
humanos (MURPHY et al., 1998).
As seguintes espécies do gênero Ehrlichia já foram citadas causando infecções em
cães: E. canis (DONATIEN e LESTOQUARD, 1935), E. platys (HARVEY et al., 1978), E.
risticii (KAKOMA et al., 1994), E. ewingii (ANDERSON et al, 1992a; STOCKHAM et al.,
1992), E. phagocytophila (JOHANSSON et al., 1995; PUSTERLA et al., 1997), E. equi
(LEWIS et al., 1975; MADWELL et al., 1982) e o agente da erliquiose granulocítica humana
(do inglês: “human granulocitic ehrlichiosis”-HGE) (GREIG et al., 1996).
E. platys, E. risticii, E. phagocytophila, E. equi e HGE foram reclassificadas e
reagrupadas na família Anaplasmataceae por Dumler et al. (2001), de acordo com o Quadro 1,
no ítem 3.2. e o tipo celular infectado (mononucleares, granulócitos ou plaquetas) varia de
acordo com a espécie descrita (RIKIHISA, 1991a).
3.2.1. ANAPLASMA PLATYS (E. PLATYS)
Agente da trombocitopenia cíclica, o microorganismo foi primeiramente descrito por
HARVEY et al., em 1978, na Florida, em plaquetas de um animal trombocitopênico.
Estudos epidemiológicos em relação ao parasito são ainda escassos, mas presume-se
que sua distribuição geográfica seja semelhante a outras espécies de rickettsias (BRADFIELD
et al., 1996), tendo sido este descrito nos EUA, na Grécia, França, Itália, Israel, China, Japão,
Tailândia e Venezuela. (BROWN et al., 2001).
A. platys também tem causado trombocitopenia em cães de várias regiões do Brasil
(MACHADO, 2004), não sendo rara a co-infecção com E. canis e B. canis, podendo o R.
sanguineus ser o mesmo vetor destas três espécies (KORDICK et al., 1999; HUA et al., 2000;
SUKSAWAT et al., 2001a), potencializando as enfermidades (KORDICK et al., 1999;
SUKSAWAT et al., 2001a; INOKUMA et al., 2003).
O período de incubação da doença vai de oito a quinze dias. Durante a infecção aguda
há uma alta porcentagem de plaquetas infectadas circulando. Vai haver um decréscimo das
plaquetas circulantes em alguns dias e esse número pode chegar até 20.000 plaquetas/µl ou
menos, sendo neste momento mínima a visualização do parasita. Após o desaparecimento dos
microorganismos, a plaquetometria volta ao normal em três ou quatro dias. Em sete a
quatorze dias, ocorre outra parasitemia onde, novamente, o número de plaquetas decresce.
Esta natureza cíclica das trombocitopenias e das parasitemias diminui com o tempo e
com a cronificação da doença, o que resulta em esporádicas aparições do parasito e
trombocitopenias medianas (HIBLER et al., 1986; HARVEY, 1990; SWANGO et al., 1989;
WOODY e HOSKINS, 1991).
Acredita-se que o mecanismo inicial da trombocitopenia esteja relacionado à
proliferação do parasito e as trombocitopenias subseqüentes são marcadas por mecanismos de
remoção imunomediados (WOODY e HOSKINS, 1991).
Megacariócitos ou qualquer outra célula precursora na medula óssea não apresentam
inclusões durante a parasitemia (HIBLER et al., 1986; RIKIHISA, 1991a).
Cães infectados naturalmente por A. platys não costumam apresentar doença clínica e
a evidência de hemorragias é rara. Em estudos experimentais, um aumento discreto na
temperatura retal é notado durante uma parasitemia inicial e um pouco de sangue nas fezes
também é observado em pacientes trombocitopênicos (HIBLER et al., 1986; HARVEY, 1990;
WOODY e HOSKINS 1991).
No entanto, achados como anorexia, letargia, depressão, perda de peso, descarga nasal
mucopurulenta, linfadenomegalia, mucosas hipocoradas e febre foram descritas (RIKIHISA,
1991a; HARRUS et al., 1997a). Um caso de uveíte também foi relatado em um animal com
alta titulação de anticorpos anti A. platys e nenhum título para E. canis (GLAZE e GAUNT,
1986).
A associação de A. platys a outros hemoparasitos como E. canis e B. canis,
potencializa a doença clínica e complica o diagnóstico e o manejo terapêutico dos cães
doentes (SUKSAWAT et al., 2001a).
3.2.2. EHRLICHIA EWINGII
A erliquiose granulocítica canina é causada por este agente e tem como característica
ser uma doença significativa em cães natural ou experimentalmente infectados (NEER, 1998).
Os sinais clínicos da doença incluem laminite, rigidez muscular, relutância em se
levantar, coluna arqueada, edema de membros e principalmente dor (BREITSCHWERDT,
2000).
Por causa da inflamação nas juntas, achados como neutrofilia acompanhada por febre
são as alterações mais frequentes de serem encontradas, mas as alterações hematológicas
observadas são semelhantes à da E. canis, como anemia, trombocitopenia, linfocitose,
monocitose e eosinofilia (NEER, 1998; BREITSCHWERDT, 2000).
.3.2.3. EHRLICHIA CHAFFEENSIS
Conhecida por causar a Ehrlichiose Monocítica Humana (do inglês: “Human
monocitic Ehrlichiosis” - HME), é responsável pelo mesmo tipo de infecção em cães
(BREITSCHWERDT, 2000).
Foi descrita primeiramente em 1992 por Dawson et al., através de infecção
experimental e caracterizada como uma zoonose emergente transmitida por carrapatos
(UNVER et al., 1999).
Por causa de seu cárater zoonótico, o cão pode ser considerado um reservatório de E.
chaffeensis para humanos (DAWSON et al., 1996; MURPHY et al., 1998).
Os achados clínicos e hematológicos são semelhantes aos da E.canis, principalmente
em relação à acentuada trombocitopenia (BREITSCHWERDT, 1998)
É uma doença agressiva em cães naturalmente infectados e seu diagnóstico é
complicado já que E.canis, E.ewingii e E.chaffeensis têm reação cruzada em testes
sorológicos e sua diferenciação por sinais clínicos e achados hematológicos é praticamente
impossível (BREITSCHWERDT 1998).
3.2.4. ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM (E. PHAGOCYTOPHILA, E. EQUI E HGE)
O Anaplasma phagocytophilum (anteriormente denominado de E. phagocytophila) é o
agente etiológico da anaplasmose granulocítica humana (do inglês:”Human Granulocytic
Anaplasmosis” -HGA) causando uma doença de curso agudo e autolimitante (SCORPIO et
al., 2004).
Sua primeira descrição em cães foi em 1975 por Lewis et al. de forma experimental,
ainda classificada com E. equi, e por Madewell e Gribble em 1982 de forma natural.
No Brasil, no município do Rio de Janeiro, foi descrita pela primeira vez em 2011, por
Santos et al, em Seropédica, após análise molecular utilizando PCR em tempo real de
amostras de sangue periférico de 253 cães.
Os sinais clínicos incluem febre, anorexia, depressão, edema de membros e problemas
no sistema nervoso central. Os achados laboratoriais incluem leucopenia e trombocitopenia
(NEER, 1998).
A co-infecção com mais de uma espécie de Ehrlichia ou com outros hemoparasitas é
comum (BREITSCHWERDT et al., 1998; SUKASAWAT et al. 2000; SUKASAWAT et al.
2001a). Babesia canis é encontrada com freqüência com a E. canis (EWING e BUCKNER,
1965; SIMPSON, 1972; MORAIS et al., 2003; TRAPP et al., 2006), mas pode estar associada
a A. phagocytophilum. Em casos de diferenciação, a presença de piroplasmas no esfregaço
sangüíneo é freqüente facilitando o diagnóstico, enquanto as mórulas são mais difíceis de
serem detectadas, devido à baixa parasitemia (DUPLESSIS et al., 1990).
3.2.5. NEORICKETTSIA RISTICII (E.RISTICII)
Descrita pela primeira vez em 1984, N. risticii é o agente causador da febre de
Potomoac dos cavalos (RIKIHISA, 1994).
Essa bactéria tem como característica usar um trematódeo como parte de seu ciclo de
vida onde se multiplica (BARLOUGH et al., 1998).
Alguns casos de ehrlichiose atípica foram descritos e os achados clínico-patológicos
foram letargia, anemia, trombocitopenia, poliartropatias e/ou febre sem presença de
anticorpos para E. canis.
Esses animais foram submetidos a novos testes e soroconverteram para N. risticii,
comprovando que não se pode descartar a infecção em cães por esse microrganismo
(KAKOMA 1994).
3.3. MECANISMOS DE EVASÃO DO GÊNERO EHRLICHIA
A diversidade antigênica entre organismos pode ser uma das razões para a variedade
nos sinais clínicos descritos em diferentes regiões geográficas (HARRUS et al., 1999).
Essa diversidade pode contribuir para a dificuldade de realização do diagnóstico da
doença em regiões diferentes e obtenção de sucesso no tratamento. Há locais onde há
descrição de ehrlichiose com sinais clínicos específicos e com comprovação laboratorial
(DAGNONE et al., 2003), porém, modificações antigênicas, moleculares e morfológicas em
amostras encontradas no Brasil poderiam levar a diferentes sintomatologias, quando
comparadas as clássicas descritas principalmente em outros países onde a variação é menor.
Quando se tem reação cruzada na resposta imune humoral não significa que o animal
que foi exposto a um microrganismo anteriormente está imunizado contra os outros. Um
estudo com cães infectados previamente com E. chaffeensis não preveniu o desenvolvimento
dos sinais clínicos da EMC após desafio com E. canis (DAWSON e EWING, 1992).
Devido à diversidade na resposta imunológica e patológica há uma dificuldade em
padronizar os meios diagnósticos, principalmente com o cultivo celular, que é uma ferramenta
importante na obtenção de antígenos para utilização em outros testes como a RIFI, PCR,
ELISA e Seqüenciamentos.
Ehrlichia sp e Anaplasma sp apresentam mecanismos sofisticados que auxiliam na
subversão da resposta imune inata do hospedeiro (RIKIHISA, 2006).
Algumas características importantes foram estudadas principalmente com o agente da
anaplasmose (ehrlichiose) granulocítica humana (HGA), que apresenta um mecanismo de
associação à prostaglandina-1, o qual, provavelmente, permite que a bactéria escape ou
modifique a via fagocítica do neutrófilo, para que, então, possa sobreviver e se multiplicar
dentro da célula neutrofílica infectada (RIKIHISA, 2006).
Os mecanismos que levam ao estabelecimento e manutenção das mórulas dentro das
células hospedeiras, e pelos quais as bactérias infectam diferentes tipos celulares são diversos
e ainda permanecem pouco conhecidos (TENG et al., 2003). Células susceptíveis ao agente da
HGA expressam um ligante para selectinas (CD15s), o qual facilita a infecção pelo agente da
HGA nas células neutrofílicas (BOJERSSON, 2000). O agente da HGA pode ter acesso ao
elemento ferro de outras fontes, em adição ao ferro normalmente disponível no “pool” de
ferro que outras ehrlichias como a E. chaffeensis e E. sennetsu, utilizam (BARNEWALL et
al., 1999).
3.4. GENES ESPECÍFICOS PARA ANÁLISE FILOGENÉTICA
O termo filogenia tem duas definições que se complementam: pode ser o conjunto de
história de ancestralidade entre todas as espécies ou, em um segundo plano, o diagrama que
representa essa história.
Qualquer diagrama ramificado que conecta espécies é um dendograma, que seria um
diagrama filogenético. Com isso, podemos considerar que uma árvore filogenética é um
dendograma que expressa relações genealógicas apenas entre táxons terminais. Os táxons
terminais são um conjunto de espécies, subespécies ou grupo de espécies que se agrupam por
semelhanças.
As árvores filogenéticas contêm mais afirmações que cladogramas/dendogramas e
correspondem a hipóteses mais complexas de semelhança (AMORIM, 2002)
O conhecimento do genoma bacteriano e sua associação às técnicas moleculares têm
permitido identificar sequências espécie-específicas para dignóstico e seu uso para embasar
estudos filogenéticos. (SUKSAWAT et al., 2001b).
O gene que codifica o rRNA 16S é um dos principais marcadores de filogenia
bacteriana e é amplamente utilizado para caracterização de cepas de várias localidades.
Como é extremamente conservado e ao mesmo tempo apresenta regiões de
hipervariabilidade, este gene pode fornecer seqüêcias úteis para identificação bacteriana. Para
membros do gênero Ehrlichia, níveis de divergência maiores que 0,5% já indicam uma
espécie nova justamente pelo alto grau de conservação e baixa taxa de evolução. (WEN et al.
2002b).
Suksawat et al. (2001b) consideram que apesar de existirem regiões com
microheterogenicidade dentro de um mesmo organismo, muitas vezes as diferenças devem-se
a erros no sequenciamento ou na reação da PCR.
Estudos de genes adicionais são realizados com o objetivo de aprimorar a identificação
e a classificação das espécies de Ehrlichia. A utilização de genes como o groESL confirma as
relações entre espécies de Ehrlichia, previamente determinadas pelo gene que codifica o
rRNA 16S. Outros genes como ankA, que codificam proteínas antigênicas associadas à
patogênese e genes de proteínas de superfície ajudam a complementar estudos filogenéticos
de linhagens do gênero Ehrlichia (OHASHI et al., 1998; INOKUMA et al., 2001; DUMLER
et al., 2001).
Quando se trata de variabilidade entre as espécies, o gene codificador do rRNA 16S
tem variabilidade limitada não permitindo a classificação em cepas e subtipos (OLIVE e
BEAN, 1999). Então, outros marcadores são necessários para a classificação de indivíduos
(tipificação) de uma mesma espécie.
3.5. GENES ESPECÍFICOS PARA TIPIFICAÇÃO MICROBIANA
Na epidemiologia, os microrganismos envolvidos em uma infecção têm uma relação
clonal, uma origem comum. Esses microrganismos compartilham fatores de virulência, traços
bioquímicos e características genômicas semelhantes. Alguns fatores como isolamento
geográfico, isolamento de diferentes fontes e em diferentes momentos podem promover
variabilidade genética em organismos de mesma espécie. Essa variabilidade classifica esses
agentes em subtipos, isolados ou cepas mediante marcadores moleculares específicos (OLIVE
E BEAN, 1999).
Recentemente, métodos baseados na análise de regiões de repetição em “tandem” do
genoma de microrganismos têm fornecido uma metodologia simples e de alta resolução na
identificação de isolados (CHANG et al., 2007).
Regiões de repetição em “tandem” no DNA correspondem a sequências de
nucleotídeos que se repetem em bloco e são adjacentes umas as outras, daí a denominação de
“tandem repeats”.
Essas regiões, inicialmente, foram definidas em minissatélites e microssatélites sendo
classificadas em “short sequence repeats”-SSR, “variable number of tandem repeats”-VNTR
que se encontram dispersas em várias regiões do genoma (VAN BELKUM et al., 1998)
A identificação da variabilidade nas regiões de repetição pode estar associada com
mudanças fenotípicas sugerindo sua importância funcional (O’DUSHLAINE E SHILEDS,
2006).
Em procariontes, algumas regiões de repetição no DNA parecem ter ligação com os
mecanismos de adaptação, virulência e patogenicidade das bactérias (VAN BELKUM et al.,
1998; BENSON, 1999). A frequente observação dos genes contendo regiões de repetições, na
grande maioria das vezes, relacionados a proteínas de membrana externas, corroboram para a
hipótese dos genes estarem diretamente ligados a adaptação ao ambiente, sendo dessa forma
pontos de mutação resultantes de uma adaptação positiva (DENOEUD E VERGNAUD
2004).
Com o surgimento da técnica da PCR, “primers” que delimitam a região de repetição
são construídos e o numero de repetições é calculado com base no tamanho das seqüências
amplificadas (VAN BELKUM, 1998; TITZE-DE-ALMEIDA et al., 2004).
Atualmente, o método vem sido utilizado para tipificação de diversas bactérias entre
elas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Mycobacterium turbeculosis e Neisseria
meningitidis (CHANG et al., 2007)
O genoma de E.canis tem 12 genes que identificam regiões de repetição em “tandem”
(MAVROMATIS et al., 2006) e a glicoproteína de membrana que expressa diferenças em sua
região de repetição é a gp36 (DOYLE et al., 2006).
Os genes que codificam a proteína gp36 (~840 pb) e a gp19 (414 pb) têm sido
amplamente estudados e utilizados para identificar as diferentes variantes dentro da espécie E.
canis. Ambas são glicoproteínas de membrana recombinantes espécie-específicas e
imunorreativas (CARDÉNAS et al, 2007).
O gene que codifica a proteína gp19 é mais conservado, e com isso, seu estudo é um
grande facilitador para fabricação de vacinas e testes sorológicos mais sensíveis quando
relacionados a esta proteína (DOYLE el al. 2006). A gp19 é formada por 137 aminoácidos e
está associada a membrana da mórula formada no citoplasma da célula do hospedeiro.
Recentemente foi caracterizada como ortólogo da proteína VLPT (“variable-length PCR
target protein”) de E. chaffeensis sendo sua diferença relacionada as regiões de repetição em
“tandem” pois a gp19 não apresenta essas regiões enquanto a VLPT apresenta um número
variável dessas regiões (McBRIDE et al., 2007).
Esta proteína está relacionada a uma melhor resposta imunológica aguda (ou precoce)
em cães (McBRIDE et al. 2003;AGUIAR, 2006) e apresenta uma reatividade que também é
demonstrada na gp200, outra proteína imunorreativa presente na E. canis (CARDÉNAS et al.,
2007).
A gp36 é uma glicoproteína de fase aguda (resposta precoce) que é exposta na
membrana na bactéria e é secretada para o citoplasma do hospedeiro (McBRIDE et al. 2003).
Baseado na sequência de nucleotídeos de isolados dos Estados Unidos (acesso no
GenBankTM
números DQ085427-DQ085429, DQ146151-DQ146153 e CP000107), o gene
codificador da proteína gp36 consiste em três regiões distintas: A 5’-terminal (429 pb)
seguida de uma região de repetição em “tandem” não variável formada por 9 aminoácidos e
rica em serina (TEDSVSAPA) onde T= treonina, E= Glutamato, D= Aspartato, S=Serina, V=
Valina, A= Alanina e P= Prolina, e uma 3’-terminal (80-93 pb) (DOYLE et al.2006). O
número de sequências em “tandem” varia de quatro a 18 cópias, dependendo do isolado
(McBRIDE et al., 2003).
Ela apresenta como ortólogo a proteína gp47 da E. chaffeensis e tem sido utilizada
para diferenciar as variantes existentes dentro da espécie E. canis (DOYLE et al, 2005).
Recentemente, em amostras de Formosa, apareceram quatro genotipos diferentes de E.canis
relacionados a variações no gene que codifica esta glicoproteína (HSIEH et al. 2010).
3.6. FERRAMENTAS MOLECULARES PARA ESTUDO DE IDENTIDADE E
TIPIFICAÇÃO BACTERIANA
3.6.1. REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
Em um sequenciamento, a amostra de DNA-molde é submetida a uma reação em
termociclador para hibridização dos iniciadores e extensão do produto. Os fragmentos
formados quando submetidos à eletroforese através de um método em capilares com
polímeros no seqüenciador, separam-se de acordo com os tamanhos moleculares. O
amplímero-marcado formado passa por uma janela de detecção no final do capilar, onde os
marcadores são estimulados e emitirão luz a um comprimento de onda específico para cada
terminação. Essa luz emitida é detectada, e os dados são, então, enviados para um computador
acoplado ao seqüenciador, que analisa esses sinais e gera os dados da seqüência lida, criando
o eletroferograma (DAGNONE, 2006).
Os “dados brutos”, isto é, os dados que saem do seqüenciador sofrem processo de
leitura denominada de “Base Calling”. Normalmente, cada seqüenciador tem o seu próprio
programa de “Base Calling”, sendo o PHRED o mais utilizado.(PRODOSCINI et al., 2002).
As seqüências normalmente são gravadas em arquivos em modo FASTA, sem espaços
e intervalos, que poderão ser utilizadas posteriormente para programas de alinhamentos
(DAGNONE, 2006).
3.6.2. BIOINFORMÁTICA
A Bioinformática é uma ciência que envolve a união de diversas linhas de
conhecimento: a engenharia de “softwares”, a matemática, a estatística, a ciência da
computação e a biologia molecular (DAGNONE, 2006).
O alinhamento de seqüências é uma das operações mais importantes da
Bioinformática. Por meio do alinhamento, procura-se determinar o grau de similaridade entre
duas ou mais seqüências, ou a similaridade desses fragmentos com mais de duas seqüências
(Alinhamento Múltiplo). O alinhamento indica o grau de similaridade entre seqüências e não
a homologia entres elas (PRODOSCINI et al., 2002).
3.6.3. ÁRVORES FILOGENÉTICAS
Árvores Filogenéticas são gráficos que ilustram as relações evolutivas entre organismos
individuais ou em grupos.
Uma árvore filogenética é composta de nós e galhos (também chamados de ramos). Os
nós são as unidades taxonômicas e os galhos ou ramos suas relações de ancestralidade.
Topologia é o estudo do padrão de ramificação que define essa ancestralidade. Os nós
internos de uma árvore filogenética representam as unidades ancestrais, e os nós externos, as
unidades taxonômicas que estão sendo comparadas, também denominadas de Unidades
Taxonômicas Operacionais - OTUs (“Operational Taxonomic Units”) (GRAUR e LI, 1999).
Para geração de uma árvore filogenética é preciso utilizar métodos de distância como
Distância-P; Jukes -Cantor; Kimura-2 parâmetros; Tajima e Nei; Tamura -3 parâmetros; Gama
Poison, ou Métodos de Caracteres Discretos: Máxima Parcimônia (MP); Máxima
Verossimilhança (MV).
Para a reconstrução gênica utilizam-se algoritmos, como UPMGA (“Underweighted Pair-
Group Method with Arithmetic Means”) e “Neighbor-Joining” (NJ). Esses algoritmos realizam
vários cálculos com a matriz de distância gerada a partir do alinhamento, para estimar a árvore
filogenética.
O “agrupamento entre vizinhos” ou NJ é o algoritmo mais utilizado e faz parte do grupo
de métodos de evolução mínima, em que a árvore com a menor soma dos ramos é procurada.
Cada vez que um programa de filogenia molecular é rodado para gerar uma árvore sobre
um conjunto de dados escolhidos, pode haver resultados diferentes. Um teste estatístico de
confiança em topologia bastante utilizado é o de “bootstrap”, uma técnica bastante simples de
reamostragem com reposição dos dados com o mesmo número total de bases (ou aminoácidos),
em que cada sítio tem a mesma probabilidade de ser mostrado. Esse método gera vários conjuntos
aleatórios dos dados obtidos e estima, a partir deles, uma árvore. Todas as árvores são então
analisadas, sendo escolhida aquela com maior probabilidade de ocorrência (DAGNONE, 2006).
3.6.4. PROGRAMA DE ANÁLISE GENÉTICA EVOLUCIONÁRIA MOLECULAR - MEGA
O Programa de Análise Genética Evolucionária Molecular-MEGA (“Molecular
Evolutionary Genetics Analysis Software”) é um programa desenvolvido para explorar e analisar
o alinhamento de DNA ou seqüências de proteínas sob uma perspectiva evolucionária. Ele recebe
dados diretamente salvos no programa Clustal e assim constrói a árvore filogenética (KUMAR et
al., 2001).
O programa MEGA utiliza o “bootstrap” para proporcionar as porcentagens com que cada
agrupamento aparece nas replicações e tem como opção de uso como explorador de matriz à
distância o “Neighbor Joining”. O princípo do método é encontrar pares de unidades taxonômicas
operacionais (OTUs), os denominados “vizinhos” (”neighbor”) e é muito eficiente na obtenção da
árvore de topologia correta (DAGNONE, 2006).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. ESCOLHA DOS CÃES:
O estudo foi desenvolvido em três municípios que fazem parte de um projeto maior
envolvendo as regiões Serrana e Metropolitana do estado do Rio de Janeiro. São eles:
Cachoeiras de Macacu, Maricá e Duque de Caxias.
Foram utilizados 300 cães, (100 de cada região descrita) atendidos em três clínicas
particulares, durante o período de novembro de 2009 à janeiro de 2011, independente de raça,
idade, sexo, condição de higiene, tipo de comportamento ou moradia. Os animais que
participaram do estudo possuíam proprietários e, por algum motivo, necessitaram de
atendimento ou serviço veterinário. Não houve exclusão de qualquer indivíduo salvo aqueles
que haviam feito uso de doxiciclina ou qualquer outra medicação para tratamento de
hemoparasitose no último mês.
Nesse estudo, após experimentos relacionados à epidemiologia do parasito, a
prevalência tem se mantido em torno de 5% (Xavier et al., 2011; Azevedo et al., 2010),
resultados obtidos de trabalhos anteriores, no Laboratório de Patologia Clínica da
Universidade Federal Fluminense (UFF). Com isso, foi escolhido um N suficiente para
conseguir pelo menos 15 amostras positivas, descartando a amostragem estabelecida a partir
do N mínimo estimado de 96 amostras necessárias para obter um erro de estimativa inferior a
10%, supondo-se uma prevalência de 50% dentro de uma população infinita de cães
(THURSFIELD, 1986).
Os cães foram incluídos no estudo após a assinatura pelo proprietário do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (anexo 1). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Animal da UFF, sob o número 0087/2011 (anexo 2).
47
Os dados clínicos e histórico do paciente foram armazenados em uma tabela (anexo 3)
que continha informações gerais coletadas durante o exame. Os sinais clínicos avaliados
foram: apatia, anorexia, perda de peso, episódios hemorrágicos (epistaxe, melena, petéquias),
dor articular, dispnéia, vômitos e diarréia. Os achados durante o exame físico, como
temperatura, coloração de mucosas, presença de ectoparasitas (carrapatos), hepatomegalia
e/ou esplenomegalia também foram relatados.
4.2. OBTENÇÃO E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS
As amostras de sangue foram coletadas no ato do atendimento ou admissão, por
venopunção cefálica ou jugular, utilizando-se seringas estéreis hipodérmicas descartáveis
agulhadas (calibre de 25 X 7mm). Uma alíquota foi armazenada em tubo próprio com ácido
etileno diamino tetracético (EDTA), para realização de hemograma e contagem de plaquetas,
e outra em tubo siliconizado sem anticoagulante para obtenção de soro. O transporte foi
realizado em caixas térmicas, refrigeradas, até o laboratório particular Prolab-diagnósticos
(Grajaú, Rio de Janeiro) no mesmo dia da coleta.
4.3. HEMOGRAMAS
Os hemogramas foram realizados por aparelho automático modelo COULTER T-890
e as lâminas coradas pelo método Diff-Quick, utilizado como rotina nos laboratórios
comerciais.
Após as contagens, as lâminas coradas foram avaliadas, a veracidade dos dados
automáticos foi conferida, e a leucometria específica juntamente com a pesquisa de
hemoparasitos foi realizada.
Após a realização dos exames, as amostras foram separadas, congeladas à -20°C e
enviadas ao Laboratório de Bactérias Enteropatogênicas e Microbiologia de Alimentos do
Instituto Biomédico da UFF.
48
4.4. EXTRAÇÃO DO DNA
A extração do DNA foi realizada em câmara de fluxo laminar vertical contínuo
(VECO-VLFS 9, Campinas, Brasil) utilizando o “Ilustra Blood Genomic Prep Mini Spin Kit”
(GE Healthcare do Brasil, São Paulo, Brasil) de acordo com as instruções de uso do
fabricante. O DNA purificado foi congelado à temperatura -20°C até o momento da PCR.
4.5. REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)
4.5.1. INICIADORES UTILIZADOS NA PCR PARA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
Primeiramente, as amostras foram testadas para a presença de algumas espécies da
família Anaplasmataceae seguindo o protocolo de Parola et al. (2000), descrito na Tabela 1.
As amostras positivas foram separadas e testadas para E. canis e A. platys utilizando as
seqüências iniciadoras igualmente descritas na Tabela 1, de acordo com o protocolo de
Murphy et al. (1998) e Brown et al. (2001) respectivamente.
49
Tabela 1. Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia pela polimerase (PCR)
para identificação dos animais positivos e para a reação de sequenciamento, com o tamanho
em pares de base (pb) de seus respectivos produtos.
Iniciador Sequencia Alvo
Tamanho
do
Amplicon
Reação com
EHR16SR
EHR16SD
TAGCACTCATCGTTTACAGC
GGTACCYACAGAAGAAGTCC
16SRNAr
345 pb
E. canis
E. chaffeensis
E. muris
E.ruminantium
A.phagocytophilum
A. platys
A. marginale
A. centrale,
W. pipientis
N. sennetsu,
N. risticii
N. helminthoeca
PLATYS
EHR16SR
GATTTTTGTCGTAGCTTGCTATG
TAGCACTCATCGTTTACAGC
16SRNAr
678 pb A. platys
ECAN
HE3
CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA
TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT
16SRNAr
389 pb E. canis
4.5.1.1. PREPARO DA PRIMEIRA REAÇÃO (PCR1)
O protocolo usado para a reação foi utilizado por PAROLA et al. (2000) onde obtem-
se uma mistura de 50 uL contendo 5uL de DNA purificado, 25pmol de cada “primer:”
EHR16SD e EHR16SR, 1,25 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada DNTP (100MM
DNTP SET, Invitrogen, São Paulo, Brasil) 20mM de Tris-HCL, 100 mM KCl e 3mM MgCl2,
preparada em câmara especial para evitar os riscos de contaminação. (PCR Chamber, plas
50
labs, Lansing, EUA)
O programa de amplificação consistiu em um passo inicial para uma desnaturação à
95°C por 2 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturação à 94°C por 60 segundos,
anelamento à 54°C por 30 segundos e extensão à 72°C por 30 segundos. Um último passo é
realizado à 72°C por 5 minutos para uma extensão final. As amplificações foram realizadas
em um termociclador programável PTC-100 TM (MJ research, INC, Waltham, EUA).
4.5.1.2. PREPARO DA REAÇÃO PARA DETECÇÃO DA ESPÉCIE (PCR2 E PCR3)
4.5.1.2.1. Ehrlichia canis (PCR2)
Para as reações de amplificação de E. canis foi utilizado o protocolo descrito por
MURPHY et al (1998) tndo como alvo o 16S RNA, onde utiliza-se uma mistura de 50 uL
contendo 5uL de DNA purificado, 25pmol de cada “primer”: ECAN e HE3, 1,25 U de Taq
DNA polimerase, 0,2 mM de cada DNTP (Invitrogen, São Paulo, Brasil) 20mM de Tris-HCl,
100 mM KCl e 3mM MgCl2, preparada em câmara especial (PCR Chamber, plas labs,
Lansing, EUA).
O programa de amplificação consistiu em um passo inicial para uma desnaturação de
três ciclos de desnaturação à 94°C por 1 minuto, anelamento a 55ºC por 2 minutos e extensão
a 72ºC por 1,5 minutos. O segundo passo consistiu em 37 ciclos de desnaturação à 92°C por 1
minuto, anelamento à 55°C por 2 minutos e extensão à 72°C por 1,5 minutos.
4.5.1.2.2. Anaplasma platys (PCR3)
Para as reações de amplificação de A.platys foi usado o mesmo protocolo de detecção
na PCR1, sendo que o “primer” “forward” EHR16SD foi substituido pelo “primer” PLATYS
combinado com o “reverse” EHR16SR. (INOKUMA, 2000; BROWN et al, 2001).
51
4.5.2. INICIADORES UTILIZADOS NA PCR PARA IDENTIFICAÇÃO DOS GENES QUE CODIFICAM
AS PROTEÍNAS GP19 E GP36 DE E.CANIS
Tabela 2. Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia da polimerase (PCR) para
identificação dos genes que codificam as proteínas de membrana gp19 e gp36 dos animais
positivos para E. canis, e seus respectivos alvos.
Iniciador Sequencia Tamanho (pb) Alvo
EC19F
EC19R
ATTAGTGTTGTGGTTATGCAA
TACGCTTGCTGAATATCATGA 414 pb gp19
GP36F
GP36R
AATCAATGTAGTATGTTTCTTTTA
ATTTTACAGGTTATATTTCAGTTA
622pb gp36
4.5.2.1. PREPARO DA REAÇÃO
4.5.2.1.1. Protocolo para reação de amplificação dos genes das proteínas gp19 e gp36
O protocolo usado para a reação de amplificação do gene que codifica a gp19 foi
descrito por Hsieh et al. (2010) onde obtem-se uma mistura de 25 uL contendo 5uL de DNA
purificado, 25pmol de cada “primer”: EC19F e EC19R (gp19), 0,125 U de Taq platinum
DNA polimerase (Invitrogen, São Paulo, Brasil) 0,2 mM de cada DNTP (100MM DNTP
SET, Invitrogen, São Paulo, Brasil) 20mM de Tris-HCl, 100 mM KCl e 2,5 mM MgCl2,
preparada em câmara especial para evitar os riscos de contaminação. (PCR Chamber, plas
labs, Lansing, EUA)
O programa de amplificação consistiu em um passo inicial para uma desnaturação à
94°C por 3 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturação à 94°C por 60 segundos,
anelamento à 55°C por 60 segundos e extensão à 72°C por 90 segundos. Um último passo é
realizado à 72°C por 5 minutos para uma extensão final. As amplificações foram realizadas
em um termocilcador programável PTC-100 TM (MJ research, INC, Waltham, EUA).
O protocolo usado para a reação de amplificação do gene que codifica a gp36 foi
descrito por Doyle et al. (2005) onde obtem-se uma mistura de 25 uL contendo 5uL de DNA
purificado, 25pmol de cada primer: gp36F e gp36R (gp36), 0,125 U de Taq DNA polimerase,
52
0,2 mM de cada DNTP (100MM DNTP SET, Invitrogen, São Paulo, Brasil) 20mM de Tris-
HCl, 100 mM KCl e 2,5 mM MgCl2, preparada em câmara especial para evitar os riscos de
contaminação. (PCR Chamber, plas labs, Lansing, EUA)
O programa de amplificação consistiu em um passo inicial para uma desnaturação à
95°C por 4 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação à 95°C por 30 segundos,
anelamento à 55°C por 30 segundos e extensão à 72°C por 60 segundos. Um último passo é
realizado à 72°C por 7 minutos para uma extensão final. As amplificações foram realizadas
em um termocilcador programável PTC-100 TM (MJ research, INC, Waltham, EUA).
4.5.3. VISUALIZAÇÃO DOS RESULTADOS
Os produtos obtidos receberam 8uL de uma solução contendo azul de bromofenol à
0,25% + glicerol à 60% e 15uL desta foi colocada em gel de agarose à 1% e submetida à
eletroforese por aproximadamente 40 minutos à 125 volts em cuba especial (CBS - MGV502
T, CBS Scientific Company Inc. Del mar, EUA). O tampão de corrida era formado por uma
solução de Tris à 0,5M - Borato à 0,045M - EDTA a 1mM e pH 8,2 (TBE 1X). O gel foi
corado por uma solução de Brometo de etídeo 0,01% (Invitrogen, Brasil) e posterior
visualização em transiluminador Ultra-Violeta (Vilber Lourmat modelo TCX20 - M). Para
estimar o tamanho do produto amplificado utilizou-se um marcador de peso molecular de
1000 pares de base (100 Kb plus, Ludwig, Rio Grande do SuL, Brasil).
4.5.4. CONTROLES
Os controles positivos da reação que tem como alvo o 16S RNA consistiram de uma
solução de DNA extraído de uma amostra de sangue total de cão, sabidamente infectado pelos
agentes em questão e devidamente sequenciados (E. canis – acesso JX392985 e A. platys -
acesso JX392984). Para controle da reação com o gene que codifica as proteínas de
membrana de E.canis foram utilizadas amostras de cultivo celular em DH82 da linhagem São
Paulo (acesso DQ146154), gentilmente cedida pelo Msc. Miguel Medeiros, professor da
Universidade Castelo Branco.
53
4.6. SEQUENCIAMENTO E IDENTIDADE GENÉTICA
4.6.1. SEQUENCIAMENTO PARCIAL DO GENE CODIFICADOR DO RRNA 16S DE E.CANIS E A.
PLATYS
As reações de amplificação com os iniciadores EHR16SR/EHR16SD, ECAN/HE3 e
EHR16SR/PLATYS foram realizadas para obtenção dos positivos e seus produtos finais
(amplicon) utilizados para sequenciamento.
Para análise dos produtos amplificados nas reações com os iniciadores descritos, 1µL
de corante azul de bromofenol foi adicionado a 10 µL de cada amostra e as mesmas foram
submetidas a eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TBE 0,5 % por 50 min a 84
volts. Os produtos amplificados foram visualizados em transiluminador UV e a quantificação
do DNA nas amostras foi realizada utilizando “Low DNA Mass” (Invitrogen, São Paulo,
Brasil).
Esses produtos foram purificados a partir da banda do gel de agarose em câmara de
fluxo laminar vertical contínuo (VECO-VLFS 9, Campinas, Brasil) utilizando o “Ilustra
GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification kit” (GE Healthcare do Brasil, São Paulo,
Brasil) de acordo com as instruções de uso do fabricante. O DNA purificado foi congelado à
temperatura -20°C até o momento do sequenciamento.
Os cromatogramas das sequências foram obtidos a partir do sequenciador automático
“ABI Prism 3130 Genetic Analyzer” (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) do serviço
da “Plataforma de Sequenciamento de DNA” do Instituto Biomédico da Universidade Federal
Fluminense conforme OTTO et al. (2008).
Todas as amostras foram sequenciadas nos dois sentidos (5’→ 3’e 3’→ 5’). Após o
alinhamento com as sequências padrões, as regiões correspondentes aos iniciadores foram
retiradas.
54
4.6.2. SEQUENCIAMENTO DOS GENES CODIFICADORES DAS PROTEÍNAS GP19 E GP36
As reações de amplificação com os iniciadores EC19F/EC19R, GP36F/GP36R, foi
realizada para obtenção dos positivos e seu produto final (amplicon) utilizado para
sequenciamento.
A sequência de procedimentos relacionados ao sequenciamento deste ponto em diante
foi descrita no tópico 4.6.1., anteriormente.
As sequências obtidas neste estudo foram depositadas no GenBankTM
(www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) e cada amostra foi identificada pelo número em seqüencia da coleta
seguida pela letra do município de origem.
4.6.3. ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS AMOSTRAS DE E. CANIS E A. PLATYS:
As sequências nucleotídicas foram alinhadas utilizando o método CLUSTAL W,
contido no programa Bio Edit (HALL et al., 1999). As sequências protótipos representantes
dos diferentes tipos de E. canis e A. platys, descritas em diferentes países, foram resgatadas no
site do NCBI (“National Center for Biotechnology Information”) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através
dos seus números de acesso ou mediante a utilização da ferramenta BLAST (“Basic Local
Aligment Search Tool”), disponível no GenBank.TM
Estas seqüências estão relacionadas na
Tabela 3.
55
Tabela 3: Protótipos representantes dos tipos de E.canis e A.platys relacionados ao gene que
codifica o rRNA 16S e outras espécies da família Anaplasmataceae descritas em diferentes
países, suas referências e seus respectivos números de acesso no GenBankTM
Número de acesso País de origem Espécie Referência
EF195135 Brasil E.canis DINIZ et al. (2007)
EF424612 México E. canis OSHIMA et al. (2007)
EU781695 Tunísia E.canis M’GHIRBI et al. (2009)
EU106856 Formosa1 E. canis HSIEH et al. (2010)
EU123923 Formosa2 E. canis HSIEH et al. (2010)
EU143636 Formosa3 E. canis HSIEH et al. (2010)
EU143637 Formosa4 E. canis HSIEH et al. (2010)
AF399917 Venezuela A.platys HUANG et al. (2001)
AY530806 Espanha A.platys AGUIRRE et al.(2006)
DQ401045 Brasil A.platys DAGNONE et al. (2006)
EF139459 Tailândia A.platys PINYOOWONG et al. (2008)
EU439943 Itália A.platys DINIZ et al. (2008)
JN558826 China Anaplasma sp. LIU et al. (2012)
AY570540 África Anaplasma sp. INOKUMA et al. (2005)
DQ647616 África E. ruminantium ALLSOPP et al. (2005)
M21293 Estados Unidos Rickettsia Rickettsii WEINSBURG et al. (1989)
4.6.4. ANÁLISE DA SIMILARIDADE ENTRE AS SEQÜENCIAS GÊNICAS DA GP19 E GP36 DAS
AMOSTRAS DE E. CANIS
As sequências nucleotídicas foram alinhadas utilizando o método CLUSTAL W,
contido no programa Bio Edit (HALL et al., 1999). As sequências protótipos representantes
dos diferentes tipos de gp19 e gp36, descritas em diferentes países, foram resgatadas no site
do NCBI (“National Center for Biotechnology Information”) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através dos
seus números de acesso ou mediante a utilização da ferramenta BLAST (“Basic Local
Aligment Search Tool”), disponível no GenBankTM
Estas seqüências estão relacionadas na
Tabela 4.
56
Tabela 4: Protótipos representantes das sequências codificadoras dos genes das proteínas
gp19 e gp36 de E.canis, descritas em diferentes países, suas referências e seus respectivos
números de acesso no GenBankTM
Número de acesso espécie Linhagem Proteína Referência
DQ858221.1 E.canis Jake gp19 McBRIDE et al. 2007
DQ860145.1 E.canis São Paulo gp19 McBRIDE et al. 2007
DQ858225.1 E.canis Florida gp19 McBRIDE et al. 2007
EF527402.1 E.canis Formosa1 gp19 HSIEH et al. 2010
EF560598.1 E.canis Formosa2 gp19 HSIEH et al. 2010
EF587270.1 E.canis Formosa3 gp19 HSIEH et al. 2010
EU139492.1 E.canis Formosa4 gp19 HSIEH et al. 2010
DQ085427.1 E.canis Jake gp36 DOYLE et al. 2005
DQ146154.1 E.canis São Paulo gp36 DOYLE et al. 2005
DQ146152.1 E.canis Florida gp36 DOYLE et al. 2005
EF551366.1 E.canis Formosa1 gp36 HSIEH et al. 2010
EF560599.1 E.canis Formosa2 gp36 HSIEH et al. 2010
EF651794.1 E.canis Formosa3 gp36 HSIEH et al. 2010
EU139491.1 E.canis Formosa4 gp36 HSIEH et al. 2010
DQ146158.1 E.chaffeensis Vanderbilt(V3) gp47 DOYLE et al. 2005
As relações de identidade entre as diferentes sequências foram determinadas mediante
a utilização do programa MEGA v.5 (TAMURA et al., 2011) através do método de
reconstrução filogenética “Neighbor-Joining”. A distância genética entre as diferentes
amostras foi calculada mediante o modelo “Kimura-dois-parâmetros” como modelo de
substituição nucleotídica. A significância estatística das diferentes identidades obtidas foi
estimada através de 1.000 réplicas de “bootstrap”.
Todas as etapas de detecção, caracterização e análise de identidade entre as amostras
de E.canis e A.platys utilizadas nesse estudo estão demonstradas na Figura 1.
57
Figura 1: Fluxograma das etapas de detecção, caracterização e análise de identidade entre as amostras
positivas para E.canis e A.platys
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Um banco de dados foi montado no módulo excel do Windows 2010 utilizando-se as
tabelas de identificação previamente preenchidas. A significância de diferenças entre as
variáveis analisadas foi determinada por meio de tabelas de contingência através da prova do
quiquadrado(2x ) e teste exato de Fisher, quando necessário, através do aplicativo “StatCalc”
do programa Epi-info 3.5.1, e um valor-p inferior a 0,05 (p<0,05) foi considerado
significativo.
Os valores considerados para as análises hematológicas (hemograma, contagem de
plaquetas e leucometria) basearam-se nos valores de referência para a espécie (quadro 2) de
acordo com MEINKOTH e CLINKENBEARD,( 2000).
Realização dos hemogramas
e pesquisa de hemoparasitos
Separação do soro
PCR com pares de iniciadores EHR16SR/EHR16SD
23 AMOSTRAS POSITIVAS:
Extração do DNA
(kit próprio de acordo com normas do fabricante)
PCR com pares de iniciadores EHR16SR/PLATYS
6 AMOSTRAS POSITIVAS
PCR com pares de iniciadores ECAN/HE3
16 AMOSTRAS POSITIVAS
Sequenciamento (Plataforma de Sequenciamento de DNA
Instituto Biomédico)
Análise da identidade entre seqüências
300 amostras de sangue de
cães
(2009-2011)
58
Quadro 2: Valores de referência para os parâmetros hematológicos do cão.
PARÂMETRO HEMATOLÓGICO VALOR DE REFERÊNCIA
Volume globular (%) 37-55
Eritrócitos (x10³/µL) 5,5-8,5
Hemoglobina (g/dL) 12,0-18,0
VGM (fL) 60-77
CHGM (%) 32-36
Leucometria global (/µL) 6.000-17.000
Plaquetometria (/µL) 200.000-500.000
Fonte: MEINKOTH e CLINKENBEARD, 2000
.
59
5. RESULTADOS
5.1. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE E. CANIS E A. PLATYS
Das 300 amostras clínicas analisadas após reação com os iniciadores EHR16SR e
EHR16SD foi amplificado um fragmento de 345 pb que codifica a região do RNA ribossomal 16S
em 23 amostras: sete de Duque de Caxias, oito de Cachoeiras de Macacu e oito de Maricá.
A partir do DNA extraído das amostras positivas, duas reações de amplificação foram
realizadas: Uma com o par de iniciadores ECAN e HE3 específicos para E. canis e outra com o par
de iniciadores PLATYS e EHR16SR específico para A. platys.
Das 23 amostras positivas, a infecção por E. canis foi confirmada em 15 animais (sete de
Duque de Caxias, quatro de Cachoeiras de Macacu e quatro de Maricá.) e a infecção por A.platys
foi confirmada em 6 amostras (2 em Cachoeiras de Macacu e 4 em Maricá), sendo que uma
amostra de um animal oriundo de Maricá (47M) foi positiva para ambos hemoparasitos,
caracterizando um caso de coinfecção.
Para as três amostras restantes que foram positivas para reação de PCR com os iniciadores
EHR16SR e EHR16SD, Não foram observadas amplificações em nenhuma das duas reações de
descritas anteriormente. Somente após sequenciamento dos produtos encontrados na PCR1 é que as
amostras foram definidas como E. canis (46CM e 48CM) e A.platys (48M). Seu estudo será
descrito no item 5.2.3., relacionado à análise do produto obtido com esses iniciadores.
60
5.2. SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DO PRODUTO
5.2.1. ANÁLISE DAS SEQUENCIAS PARCIAIS DO GENE RRNA 16S DE E. CANIS
O fragmento de 389 pb obtido do gene que codifica a região do RNA ribossomal 16S
usando os iniciadores ECAN/HE3 foi submetido a sequenciamento e as 15 amostras foram
caracterizadas como E. canis. A análise da similaridade dos fragmentos seqüenciados das
amostras positivas pela PCR revelou alto grau de identidade com sequências previamente
disponibilizadas no GenBankTM
variando de 95,7% a 100% (tabela 5).
61
Tabela 5: Similaridade entre as seqüências parciais obtidas na PCR com os iniciadores ECAN/HE3 específicos para o gene
codificador do rRNA 16S de E canis com amostras publicadas no GenBankTM
e o valor da porcentagem de identidade utilizando o
programa Bioedit 4.0
Protótipos 47M 66M 81M 97M 17C 38C 39C 56C 70C 71C 79C 17CM 20CM 38CM 48CM
EF195135 1 1 1 0.957 0.996 0.975 1 1 0.985 0.996 1 0.996 0.996 1 1
EF424612 0.996 0.996 0.996 0.954 0.992 0.971 0.996 0.996 0.982 0.992 0.996 0.992 0.992 0.996 0.996
EU781695 1 1 1 0.957 0.996 0.975 1 1 0.985 0.996 1 0.996 0.996 1 1
EF424612 1 1 1 0.957 0.996 0.975 1 1 0.985 0.996 1 0.996 0.996 1 1
EU106856 1 1 1 0.957 0.996 0.975 1 1 0.985 0.996 1 0.996 0.996 1 1
EU123923 1 1 1 0.957 0.996 0.975 1 1 0.985 0.996 1 0.996 0.996 1 1
EU143636 1 1 1 0,957 0.996 0.975 1 1 0.985 0,996 1 0.996 0.996 1 1
62
5.2.2. ANÁLISE DAS SEQUENCIAS PARCIAIS DO GENE RRNA 16S DE A. PLATYS
O fragmento de 678 pb obtido do gene que codifica a região do RNA ribossomal 16S
utilizando os iniciadores PLATYS/EHR16SR foi submetido a sequenciamento e as 6 amostras
foram caracterizadas como A. platys. A análise da homologia dos fragmentos seqüenciados
das amostras positivas pelo PCR revelou alto grau de identidade com seqüências previamente
disponibilizadas no GenBankTM
variando de 98,7% a 100% (tabela 6).
Tabela 6: Similaridade entre as seqüências obtidas na PCR com os iniciadores
PLATYS/EHR16SR específicos para o gene codificador do rRNA 16S de A.platys com
amostras depositadas no GenBankTM
e o valor da porcentagem de identidade utilizando o
programa Bioedit 4.0
Protótipos 41CM 37CM 83M 32M 47M 67M
EU439943 0,998 0,996 1 0,996 0,998 0,996
AF399917 0,996 0,995 0,998 0,995 0,996 0,995
AY530806 0,998 0,996 1 0,996 0,998 0,996
DQ401045 0,988 0,987 0,990 0,987 0,988 0,987
EF139459 0,998 0,996 1 0,996 0,998 0,996
5.2.3. ANÁLISE DA SEQUENCIA PARCIAL DO GENE RRNA 16S COM OS INICIADORES
EHR16SR/EHR16D
As três amostras que não apresentaram amplificação com os iniciadores específicos para
E. canis e A. platys foram submetidas a reação de sequenciamento a partir do produto da
reação realizada com os iniciadores que amplificam algumas espécies da família
Anaplasmataceae.
Duas amostras foram caracterizadas como E.canis (46CM e 48CM) após alinhamento no
programa BLAST e apresentaram 95,1% e 99,3% respectivamente de similaridade com outras
sequências de E. canis disponíveis no GenBankTM
. A terceira amostra (48M) foi igualmente
comparada e após 99,6% de similaridade com seqüências de A.platys disponíveis no
GenBankTM
foi caracterizada como tal (tabela 7).
Para confirmação do alinhamento no BLAST a análise de similaridade dessas três
amostras foi realizada juntamente com outras três amostras deste estudo anteriormente
63
caracterizadas como E. canis (49CM, 71C e 79C) quatro amostras anteriormente
caracterizadas como A. platys (32M, 67M, 83M, 47M), e seis protótipos obtidos no
GenBankTM
: três de Ehrlichia sp. e três de Anaplasma sp. (figura 4).
Os resultados obtidos após construção da árvore filogenética foram concordantes com o
alinhamento das seqüências no BLAST uma vez que as amostras 46CM e 48CM formaram
um “cluster” junto com as amostras e protótipos caracterizados como Ehrlichia sp. enquanto a
amostra 48M formou um segundo “cluster” junto com as amostras e protótipos caracterizados
como Anaplasma sp.
Figura 2: Análise de similaridade baseada em um fragmento de 345pb do gene que codifica a
região rRNA 16S comum a algumas espécies da família Anaplasmataceae, 10 seqüências do
estudo e 7 seqüências de suas espécies próximas obtidas da base de dados do GenBankTM
. As
porcentagens do “Bootstrap” são mostradas nos ramos e representam 50% em 1.000
repetições.
32M
67M
83M
47M
48M
Anaplasma sp. JN558826 Anaplasma platys AF399917 Anaplasma sp.AY570540
Ehrlichia ruminantium DQ647616
Ehrlichia canis EU143637
Ehrlichia canis EF195134
48CM
49CM
46CM
71C
79C
Rickettsia rickettsii M21293
82
79
87
81
98
99
72
67
0.02
64
Tabela 7: Similaridade entre as sequências obtidas na PCR com os iniciadores
EHR16SR/EHR16SD específicos para o gene codificador do rRNA 16S com algumas
sequencias parciais publicadas no GenBankTM
comum a algumas espécies da família
Anaplasmataceae, utilizando o programa Bioedit 4.0. As amostras em destaque são as
reagrupadas.
Protótipos 48M 46CM 48CM 71C 79C 32M 47M 49CM 83M 67M
JN558826 0,996 0,875 0,913 0,876 0,875 0,993 0,993 0,906 0,996 0,962
AF399917 0,996 0,875 0,913 0,876 0,875 0,993 0,993 0,906 0,996 0,962
AY570540 0,993 0,879 0,917 0,880 0,879 0,989 0,989 0,91 0,993 0,958
EU143637 0,910 0,951 0,993 0,955 0,955 0,907 0,907 0,986 0,910 0,879
EF195134 0,910 0,951 0,993 0,955 0,955 0,907 0,907 0,986 0,910 0,879
DQ647616 0,906 0,927 0,968 0,931 0,931 0,903 0,903 0,962 0,906 0,879
5.2.4. ANÁLISE DA SEQUENCIA COMPLETA DO GENE CODIFICADOR DA GLIPOPROTEÍNA DE
MEMBRANA DE E. CANIS GP19
Das 17 amostras positivas para E.canis, 11 apresentaram amplificação na reação de PCR
para o gene que codifica para a proteína gp19. Para outras 6 amostras, o sequenciamento não
foi realizado devido a dificuldades na recuperação do material genético ou esgotamento da
amostra.
A análise de similaridade deste estudo em comparação com isolados de E. canis
disponíveis no GenBankTM
evidenciou uma alta similaridade entre es seqüências. Três
amostras (uma de Cachoeira de Macacu e duas de Caxias) formaram um “cluster” isolado das
demais de mesma região e dos protótipos ( Figura 3).
65
39C
49CM
56C
81M
97M
E. canis Jake DQ858221
17C
47M
38C
E. canis Sao Paulo DQ860145
66M
79C
E. canis TWN1 EF527402
E. canis Florida DQ858225
48CM
E. canis TWN4 EU139492
E. canisTWN2 EF560598 96
63
0.001
Figura 3: Análise de similaridade baseada no gene de 414pb que codifica a proteína gp19, 11
seqüências do estudo e 6 seqüências obtidas da base de dados do GenBankTM
. As
porcentagens do “Bootstrap” são mostradas nos ramos e representam 50% em 1.000
repetições.
A análise dos nucleotídeos destas amostras revelou a presença de uma mutação
silenciosa no nucleotídeo 312 (figura 4) suficiente para agrupar as três amostras em um
“cluster” separado.
66
Figura 4: Mutação silenciosa no nucleotídeo 312. Em destaque a troca da Adenina pela Timina
permanecendo o mesmo aminoácido de origem.
A análise de similaridade das amostras deste estudo em comparação com sequencias
codificadoras da gp19 de E. canis disponíveis no GenBankTM
evidenciou uma alta identidade
entre os isolados, com porcentagens variando de 96,7% a 100% de acordo com a Tabela 8.
:
67
Tabela 8: Similaridade entre as sequências obtidas na PCR com os iniciadores GP19F/GP19R que codificam a proteína gp19 de E.
canis com amostras publicadas no GenBankTM
e o valor da porcentagem de identidade utilizando o programa Bioedit 4.0
Protótipos 17C 38C 39C 47M 48CM 49CM 56C 66M 79C 81M 97M
DQ860145 1 0,997 0,975 1 1 0,975 0,985 0,975 0,980 1 1
DQ858221 1 0,997 0,975 1 1 0,975 0,985 0,975 0,980 1 1
DQ858225 1 0,997 0,975 1 1 0,975 0,985 0,975 0,980 1 1
EU139492 0,992 0,99 0,967 0,992 0,992 0,967 0,977 0,967 0,972 0,992 0,992
EF560598 0,992 0,99 0,967 0,992 0,992 0,967 0,977 0,967 0,972 0,992 0,992
EF527402 1 0,997 0,975 1 1 0,975 0,985 0,975 0,98 1 1
68
5.2.5. ANÁLISE DA SEQUENCIA COMPLETA DO GENE CODIFICADOR DA GLIPOPROTEÍNA DE
MEMBRANA DE E. CANIS GP36
Das 17 amostras positivas para E.canis, duas (56C e 70C) apresentaram amplificação na
reação de PCR para o gene que codifica para a proteína gp36. Para outras 15 amostras, o
sequenciamento não foi possível devido a dificuldades na recuperação do material genético ou
esgotamento da amostra.
A análise de similaridade da região que codifica para o gene da proteína gp36 revelou
que a amostra 56C, permaneceu distante da amostra 70C, e dos demais protótipos obtidos no
GenBankTM
, incluindo o isolado São Paulo (DQ146154) (Figura 5)
Figura 5: Análise de similaridade baseada no gene de tamanho variável (622-840 pb) que
codifica a proteína gp36, 2 seqüências do estudo e 13 seqüências obtidas da base de dados do
GenBankTM
. As porcentagens do “Bootstrap” são mostradas nos ramos e representam 50% em
1.000 repetições.
E. canis Jake DQ085427
E. canis Demon DQ085429
E. canis Louisiana DQ146151
E. canis Oklahoma DQ085428
E. canis Florida DQ146152
E. canis North Carolina DQ146153
70C
E. canis Sao Paulo DQ146154
E. canis Cameroon 71 DQ146155
56C
E. canis TWN2 EF560599
E. canis TWN4 EU139491
E. canis TWN1 EF551366
E. canis TWN3 EF651794
E. chaffeensis V3 DQ146158
92
64
84
85
49
28
74
77
0.02
69
A seqüência completa do gene que codifica a proteína gp36 foi então dividida em três
regiões e analisada separadamente de acordo com Doyle et al., 2006.
5.2.5.1. REGIÃO 1 (5’ TERMINAL - PRÉ-REPETIÇÃO)
A análise obtida a partir do alinhamento do fragmento de 429 pb do gene codificador da
proteína gp36 das amostras 56C e 70C revelou que a amostra 70C apresenta maior
similaridade com o isolado de São Paulo, Brasil (DQ146154) (99.7%) seguido pelo isolado
Jake (DQ085427) Oklahoma (DQ085428) e Demon (DQ085429), Estados Unidos (99.2%).
A amostra 56C apresentou maior similaridade (91.5%) com outros quatro genótipos de
E.canis, descritos em Formosa (TWN1 EF551366; TWN2 EF560599; TWN3 EF651794;
TWN4 EU139491). A similaridade entre as amostras estudadas e os isolados obtidos no
GenBank é descrita na Tabela 7.
Tabela 9: Similaridade entre as sequências obtidas na PCR com os iniciadores GP36F/GP36R
do gene codificador da proteína gp36 (Região 1) com amostras publicadas no GenBankTM
, e o
valor da porcentagem de identidade utilizando o programa Bioedit 4.0
Protótipos Amostras
70C 56C
E. canis Jake DQ085427 0.992 0.898
E. canis Sao Paulo DQ146154 0.997 0.905
E. canis Florida DQ146152 0.990 0.896
E. canis TWN2 EF560599 0.820 0.915
E. canis TWN1 EF551366 0.820 0.915
E. canis TWN3 EF651794 0.820 0.915
E. canis TWN4 EU139491 0.820 0.915
E .canis Oklahoma DQ085428 0.992 0.898
E. canis Demon DQ085429 0.992 0.898
E. canis Louisiana DQ146151 0.992 0.898
E. canis North Carolina DQ146153 0.990 0.896
E. canis Cameroon 71 DQ146155 0.997 0.903
5.2.5.2. REGIÃO 2 (REGIÃO DE REPETIÇÃO EM TANDEM)
O número de repetições em tandem (TEDSVSAPA) variou de 5 (70C) a 8 cópias (56C).
Como conseqüência dessa variação, o gene completo que codifica a proteína gp36 apresentou
70
variações no número de nucleotídeos e de aminoácidos. Na amostra 70C o tamanho do gene
foi de 697pb, enquanto que para a amostra 56C, o fragmento seqüenciado apresentou 788 pb.
5.2.5.3. REGIÃO 3 (3’TERMINAL PÓS REPETIÇÃO)
A análise obtida a partir do alinhamento do fragmento 3’ terminal de aproximadamente
90 pb do gene codificador da proteína gp36 das amostras 56C e 70C revelou que a amostra
70C apresenta maior similaridade com o isolado de Florida (DQ146152), Oklahoma
(DQ085428) e Louisiana (DQ146151) (97,9%) todos descritos nos Estados Unidos .
A amostra 56C apresentou maior similaridade (99%) com os isolados Sao Paulo
(DQ146154) Jake (DQ085427), Demon (DQ085429), North Carolina (DQ146153) e
Cameroon 71 (DQ146155) além de outros quatro genótipos de E.canis, descritos em Formosa
(TWN1 EF551366; TWN2 EF560599; TWN3 EF651794; TWN4 EU139491). A similaridade
entre as amostras estudadas e os isolados obtidos no GenBankTM
é descrita na Tabela 10.
71
Tabela 10: Similaridade entre as seqüências obtidas na PCR com os iniciadores GP36F/GP36R
do gene codificador da proteína GP36 (Região 3) com amostras publicadas no GenBankTM
, e o
valor da porcentagem de identidade utilizando o programa Bioedit 4.0
Protótipos Amostras
70C 56C
E. canis Jake DQ085427 0.485 0.990
E. canis Florida DQ146152 0.979 0.475
E. canis Sao Paulo DQ146154 0.485 0.990
E. canis TWN1 EF551366 0.485 0.990
E. canis TWN2 EF560599 0.485 0.990
E. canis TWN3 EF651794 0.485 0.990
E. canis TWN4 EU139491 0.485 0.990
E .canis Oklahoma DQ085428 0.979 0.475
E. canis Demon DQ085429 0.485 0.990
E. canis Louisiana DQ146151 0.979 0.475
E. canis North Carolina DQ146153 0.485 0.990
E. canis Cameroon 71 DQ146155 0.485 0.990
5.2.6. ANÁLISE DAS INCLUSÕES SUGESTIVAS DE E. CANIS E A PLATYS
Dentre os 300 hemogramas com pesquisa de hemoparasitos realizados, cinco esfregaços
apresentaram inclusões sugestivas de E.canis/A.platys. Após a confirmação do diagnóstico por
métodos moleculares e sequenciamento, quatro animais foram positivos para A. platys. E um
único animal (47M) foi positivo para os dois agentes. A comparação entre os resultados obtidos
através de métodos moleculares e a pesquisa hemoparasitos é demostrada nas Tabelas 11, 12 e
13.
Tabela 11: Resultados obtidos na pesquisa de hemoparasitos e na PCR1, referente à
presença de algumas espécies pertencentes a família Anaplasmataceae
Mórula
PCR1
negativo positivo Total
Negativo 274 19 293
Positivo 3 4 7
Total 277 23 300
72
Tabela 12: Resultados obtidos na pesquisa de hemoparasitos e a PCR2, referente à
presença de Ehrlichia canis
Mórula
PCR2
negativo positivo Total
Negativo 281 14 295
Positivo 4 1 5
Total 285 15 300
Tabela 13: Resultados obtidos na pesquisa de hemoparasitos e a PCR3, referente à
presença de Anaplasma platys
Mórula
PCR3
negativo positivo Total
Negativo 293 2 295
Positivo 1 4 5
Total 294 6 300
5.2.7. ANÁLISE DOS SINAIS CLÍNICOS E HEMATOLÓGICOS
5.2.7.1. ALTERAÇÕES CLÍNICAS E HEMATOLÓGICAS OBSERVADAS EM CÃES SUBMETIDOS AO
DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA E. CANIS NO MUNICÍPIO DE DUQUE DE CAXIAS, MARICÁ E
CACHOEIRAS DE MACACU
Nas 300 amostras clínicas analisadas, 17 foram positivas (sete de Duque de Caxias,
quatro de Maricá e seis de Cachoeiras de Macacu) e a queixa principal, seus hemogramas e
sinais clínicos avaliados.
Correlacionando a queixa principal e os animais que realmente eram positivos, houve
significância somente no sinal clínico apatia e apenas na região de Duque de Caxias (tabela 14).
Analisando os 300 animais juntos, a queixa principal apatia continuou sendo significativa
juntamente com ferimentos (tabela 15).
73
Tabela 14. Queixa principal observada nos 300 cães, que foram relatadas por seus
proprietários, separadas por região, referente aos animais de Duque de Caxias, Maricá e
Cachoeiras de Macacu
Duque de Caxias Maricá Cachoeiras de Macacu
Queixa principal
Pos Neg P-valor Pos Neg P-valor Pos Neg P-valor
Apatia 4/7 2/93 0,00012 2/4 12/96 0,09306 2/6 6/94 0,71781
Rotina 0/7 30/93 0,09911 0/4 21/96 0,57649 2/6 20/94 0,61038
Diarréia 0/7 1/93 1,00000 0/4 5/96 1,00000 1/6 3/94 0,22230
Neoplasia 0/7 2/93 1,00000 0/4 4/96 1,00000 1/6 4/94 0,27091
Tosse 0/7 1/93 1,00000 1/4 4/96 0,18812 0/6 0/94 NCA
Ferimentos 1/7 3/93 0,25540 1/4 3/96 0,15282 0/6 4/94 1,00000
Vômitos 1/7 3/93 0,25540 0/4 5/96 1,00000 0/6 4/94 1,00000
Convulsões 1/7 0/93 0,07000
0/4 1/96 1,00000 0/6 0/94 NC
Outros 0/7 51/93 0,09582 0/4 41/96 0,14189 0/6 52/94 1,00000
p-valor <0,05 é significativo; A=Não Calculado
Tabela 15: Queixa principal observada nos 300 cães, que foram relatadas por seus
proprietários referente aos animais de Duque de Caxias,Maricá e Cachoeiras de Macacu.
TOTAL DE ANIMAIS DO EXPERIMENTO
Queixa Principal
Positivos Negativos p-valor
Apatia 8/17 20/283 0,00004
Rotina 2/17 71/283 0,23030
Diarréia 1/17 9/283 0,44709
Neoplasia 1/17 10/283 0,47950
Tosse 1/17 5/283 0,29746
Ferimentos 4/17 10/283 0,00503
Vômitos 1/17 11/283 0,51012
Convulsões 1/17 1/283 0,11030
Outros 0/17 144/283 1,00000
p-valor <0,05 é significativo
74
O grupo de animais infectados por E. canis apresentou valores de hematócrito e
contagem de plaquetas abaixo dos valores de referência e abaixo dos valores médios do grupo
dos animais negativos.
O grupo de animais infectados somente por A. platys apresentou valores médios de
hematócrito e contagem de plaquetas igualmente abaixo dos valores de referência, embora mais
próximos dos valores de referência quando comparados ao grupo de animais infectados por E.
canis. Os valores médios de leucometria global nos dois grupos descritos se mantiveram dentro
dos valores de referência.
O único animal coinfectado apresentou um quadro de anemia e trombocitopenia graves e
leucocitose moderada, com valores inferiores aos encontrados nos grupos de E. canis e A. platys
para o hematócrito e contagem de plaquetas e aumentados para os de leucometria global.
Os animais negativos apresentaram valores médios de hematócrito, leucometria global e
plaquetas dentro dos valores de referência. Na tabela 16, encontram-se os resultados das médias
e desvios padrões dos parâmetros hematológicos usados nesse estudo.
Tabela 16: Média e desvio padrão dos parâmetros hematológicos observados nos animais
positivos e negativos nos testes moleculares das regiões de Duque de Caxias, Maricá e
Cachoeiras de Macacu
Valores de
Referência
E. canis
(n=16)
A.platys
(n=6)
E.canis + A.platys
(n=1)
Negativos
(n=277)
Média DPA
Média DP Média DP Média DP
Hematócrito (%)
(37 a 55)
27,4 10,98 30,0 5,93 17 NCB 40,79 9,76
Leucometria (/μL)
(6.000 a 17.000)
15.413 11.897 15.617 11.081 21.300 NC 16.288 11.112
Plaquetas (x103/μL)
(200 a 500)
71,625 41,825 112,833 92,079 58,000 NC 238,491 132,037
A=Desvio padrão; B=Não calculado
Dos sete animais avaliados em Duque de Caxias positivos para a presença de E. canis,
os seguintes sinais clínicos foram estatisticamente significativos: apatia, anorexia, e perda de
peso. Durante o exame físico desses animais os achados clínicos como febre, palidez de
75
mucosas, esplenomegalia e hepatomegalia não foram considerados estatisticamente
significativos. Entretanto, foi observada uma tendência a associação entre cães positivos e
palidez de mucosas/esplenomegalia (p-valor= 0,055).
Em relação às alterações hematológicas observadas a anemia e trombocitopenia grave se
mostraram significativas, ou seja, p-valor < 0,05 e a leucometria global permaneceu inalterada
(tabela 17).
76
Tabela 17. Achados clínicos observados em 100 cães e alterações hematológicas encontradas
amostras colhidas dos animais no município de Duque de Caxias.
Cães PCR
positivos
Cães PCR negativos P-valor < 0,05
Achados clínicos associados
a E. canis
Apatia 7/7 17/93 0,000022
Anorexia 5/7 15/93 0,003200
Perda de peso 4/7 13/93 0,015000
Episódios hemorrágicos 1/7 15/93 1,000000
Dor articular 0/7 6/93 1,000000
Outros sinais clínicos
Dispnéia 1/7 6/93 0,408000
Vômito 1/7 5/93 0,360500
Diarréia 0/7 5/93 1,000000
Exame físico
Febre (>39,5 C) 3/7 14/93 0,093100
Presença de carrapatos 6/7 51/93 0,233000
Palidez de mucosas 3/7 11/93 0,055000
Esplenomegalia 2/7 4/93 0,055300
Hepatomegalia 1/7 3/93 0,255400
Hematócrito
< 31% 5/7 21/93 0,012200
31-47% 2/7 45/93 0,442300
>47% 0/7 22/93 1,000000
Plaquetas
<100.000 5/7 20/93 0,010000
100.000 - 200.000 2/7 29/93 1,000000
200.00 -500.000 0/7 44/93 1,000000
>500.000 0/7 0/93 1,000000
Leucometria global
< 6.000 1/7 4/93 0,390000
6.000 -17.000 3/7 66/93 0,198000
> 17.000 3/7 23/93 0,372000
Valor de p<0,05 é significativo
77
Dos animais avaliados em Maricá positivos para E. canis, nenhum dos sinais clínicos
associados a infecção pelo agente em questão foi considerada estatisticamente significativa.
Entretanto, inesperadamente a dispnéia foi um sinal clínico significativo neste grupo de animais.
Durante o exame clínico, febre e esplenomegalia foram considerados estatisticamente
associados à EMC.
Não foram observadas alterações no hematócrito e leucometria global e a
trombocitopenia grave foi o único achado hematológico significativo (tabela 18).
78
Tabela 18. Achados clínicos observados em 100 cães e alterações hematológicas encontradas
amostras colhidas dos animais no município de Maricá.
Cães PCR
positivos
Cães PCR
negativos
P-valor < 0,05
Achados clínicos associados a E.
canis
Apatia 3/4 35/96 0,152200
Anorexia 2/4 21/96 0,225000
Perda de peso 1/4 18/96 0,575700
Episódios hemorrágicos 0/4 7/96 1,000000
Dor articular 0/4 2/96 1,000000
Outros sinais clínicos
Dispnéia 2/4 3/96 0,011600
Vômito 1/4 7/96 0,287400
Diarréia 0/4 5/96 1,000000
Exame físico
Febre (>39,5 C) 3/4 17/96 0,024400
Presença de carrapatos 3/4 55/96 0,637000
Palidez de mucosas 2/4 16/96 0,147400
Esplenomegalia 3/4 9/96 0,005000
Hepatomegalia 2/4 10/96 0,069000
Hematócrito
< 31% 2/4 11/96 0,080000
31-47% 1/4 55/96 0,317000
>47% 1/4 30/96 1,000000
Plaquetas
<100.000 3/4 12/96 0,010200
100.000 - 200.000 1/4 11/96 0,405000
200.00 -500.000 0/4 67/96 1,000000
>500.000 0/4 6/96 1,000000
Leucometria global
< 6.000 0/4 8/96 1,000000
6.000 -17.000 2/4 56/96 1,000000
> 17.000 2/4 32/96 0,603000
Valor de p<0,05 é significativo
79
Em relação aos animais positivos em Cachoeiras de Macacu, um perfil clínico
semelhante aos animais de Maricá foi observado. No exame clínico a febre e hepatomegalia
foram significativos (p-valor<0,05). Leucopenia e trombocitopenia grave foram os sinais
hematológicos significativos nesse grupo (tabela 19).
80
Tabela 19. Achados clínicos observados em 100 cães e alterações hematológicas encontradas
amostras colhidas dos animais no município de Cachoeiras de Macacu.
Cães PCR
positivos
Cães PCR
negativos
P-valor < 0,05
Achados clínicos associados a E.
canis
Apatia 3/6 16/94 0,080000
Anorexia 0/6 14/94 0,595900
Perda de peso 0/6 10/94 1,000000
Episódios hemorrágicos 1/6 4/94 0,270900
Dor articular 0/6 2/94 1,000000
Outros sinais clínicos
Dispnéia 1/6 0/94 0,006259
Vômito 0/6 4/94 1,000000
Diarréia 1/6 2/94 0,1710328
Exame físico
Febre (>39,5 C) 2/6 4/94 0,040677
Presença de carrapatos 5/6 54/94 0,386210
Palidez de mucosas 2/6 7/94 0,0897179
Esplenomegalia 1/6 5/94 0,3169620
Hepatomegalia 2/6 2/94 0,007000
Hematócrito
< 31% 2/6 12/94 0,196576
31-47% 4/6 60/94 1,000000
>47% 0/6 22/94 0,333965
Plaquetas
<100.000 5/6 14/94 0,000810
100.000 - 200.000 1/6 16/94 1,000000
200.00 -500.000 0/6 58/94 1,000000
>500.000 0/6 6/94 1,000000
Leucometria global
< 6.000 2/6 0/94 0,003030
6.000 -17.000 1/6 60/94 0,025000
> 17.000 3/6 34/94 0,405915
Valor de p<0,05 é significativo
81
6. DISCUSSÃO
A EMC é uma doença com uma grande variação na apresentação de seus sinais
clínicos (BREITSCHEWERDT, 1988) e por isso apresenta dificuldades significativas no seu
diagnóstico (GRIDEM, 1991). Como sua manifestação ocorre desde uma forma branda
assintomática a uma forma mais agressiva (COLES, 1986; HARVEY, 1998; TASKER, 2001,
ALMOSNY e MASSARD, 2002), realizar um estudo relacionado a tipificação de E. canis
pode esclarecer uma das possíveis causas dessas variações.
Para isso, a PCR foi escolhida como ferramenta diagnóstica neste estudo por se tratar de
um teste efetivo para a detecção de rickettsias no sangue de cães (IQBAL et al., 1994; WEN
et al.,1997; MURPHY et al., 1998; INOKUMA et al., 2001; CHAE et al., 2003; MACIEIRA,
2003; FENOLLAR e RAOULT, 2004; MANNA et al., 2004), para detecção de espécies
coinfectantes (HANCOCK et al., 2001) e análise filogenética (YU et al., 2001;
DRANCOURT e RAOULT, 1994).
Fenollar e Raoult, (2004) afirmaram que as limitações do teste são os custos elevados,
mas, atualmente esta técnica tem se tornado mais acessível com o barateamento dos reagentes
e aprimoramento da técnica que já é utilizada de forma comercial.
Dos 300 animais testados, 5,7% (n=17) foram positivos para E. canis nas regiões
serrana e metropolitana do Rio de Janeiro. Na região de Duque de Caxias, 8% dos animais
testados foram positivos para E.canis, seguido por 6% em Cachoeiras de Macacu e 4% em
Maricá.
Macieira (2005) encontrou uma freqüência de 32,5% ao testar 359 animais
trombocitopênicos residentes em áreas metropolitanas. Das 100 amostras testadas para
E.canis de Duque de Caxias, 56 apresentaram trombocitopenia e desses, 14,3% eram
positivos. Como o número de amostras de animais trombocitopenicos testados era menor,
talvez a frequência
82
pudesse alcançar valores semelhantes aos encontrados por Macieira. Testes específicos
estatísticos devem ser realizados para confirmação desta hipótese que não é o objetivo deste
estudo.
Na Região de Cachoeiras de Macacu, 6% das amostras foram positivas para E. canis,
corroborando com os achados de Azevedo, (2009) que em estudos na região serrana do Rio de
Janeiro encontrou a mesma freqüência.
No município de Maricá, a freqüência encontrada foi de 4%, um pouco abaixo da
encontrada por Xavier, (2011) que foi de 7,1% em um estudo realizado com amostras de
animais de campanha de vacinação antirábica em bairros carentes deste município. Essa
diferença pode ter ocorrido em função da característica da população estudada, já que animais
de campanha de vacinação, em sua maioria, não têm atendimento adequado pois o poder
aquisitivo da maioria de seus proprietários não permite esse tipo de assistência.
Apesar do teste padrão para a detecção de E. canis ser a imunofluorescência indireta e
na rotina veterinária ser utilizado em associação com os achados clínicos e laboratoriais, a
escolha da PCR e sequenciamento se baseou no fato de que somente esta metodologia permite
a confirmação da presença do agente na amostra e não somente anticorpos que caracterizam
exposição (DAGNONE, 2006; HARRUS e WANER, 2011). Os iniciadores utilizados no
estudo tinham como alvo a região do gene que codifica o rRNA 16S pois é um gene altamente
conservado e tem se tornado o acesso de escolha para diagnóstico (FENOLLAR E RAOULT,
2004) e quando dados fenotípicos são inconclusivos (SUKASAWAT et al.,2001). Este gene
apresenta também regiões de variabilidade as quais podem fornecer seqüências espécie-
específicas úteis para identificação do agente associado ao sequenciamento (CÉSAR, 2008).
Analisando a matriz de identidade das amostras amplificadas com iniciadores
específicos para E.canis foi observada uma variação de similaridade entre os protótipos de
E.canis depositados no GenbankTM
de 95,7% a 100%. Baseando-se nesses resultados é
possível afirmar que os agentes encontrados nas amostras deste estudo são realmente E. canis
e os iniciadores ECAN e HE3 corresponderam bem a caracterização, não sendo necessário o
sequenciamento do gene completo.
Um dos fatores que agrava o quadro clínico dos animais com EMC é a coinfecção com
outros agentes da família Anaplasmataceae. Desses, o mais comum é o A.platys. Todas as
amostras onde foi identificado este agente seja por PCR ou pesquisa de hemoparasitas, foram
submetidas ao sequenciamento e análise parcial do gene que codifica a região rRNA 16S foi
83
feita. A preseça de um outro agente da mesma família poderia dificultar o diagnóstico
molecular, uma vez que a metodologia foi baseada na amplificação de uma região conservada
que é comum a mais de uma espécie (SUKSAWAT et al., 2001b). Por essa razão, os produtos
das quatro amostras consideradas positivas em lâmina e uma positiva somente na PCR foram
seqüenciados. A análise da similaridade dessas amostras com os isolados obtidos no
GenBankTM
variou de 98,7% a 100%, refletindo o mesmo perfil de E.canis.
Neste estudo, três amostras apresentaram amplificação na PCR1, mas, ao serem
submetidas a reações de amplificação espécie-específicas, não apresentaram amplificação
sugerindo ser uma terceira espécie já que o par de “primers” utilizado amplifica um fragmento
do gene codificador do rRNA16S das espécies da família Anaplasmataceae.
Para esclarecer esta dúvida, foi feito o sequenciamento destes fragmentos e as amostras
foram caracterizadas como E. canis (46CM e 48CM) e A.platys (48M) devido ao
agrupamento evidenciado na análise de similaridade com outros protótipos de E. canis,
.A.platys e amostras já caracterizadas neste mesmo estudo. A não amplificação dessas
amostras pelos iniciadores espécie-específicos pode ser explicada pela ocorrência de
variações nas seqüências de nucleotídeos na região de anelamento do “primer” no genoma
bacteriano, gerando um resultado falso negativo (MIRANDA et al., 2006).
Analisando as seqüências completas do gene codificador da glicoproteína de
membrana gp19 que foram amplificadas de 11 amostras positivas para E. canis deste estudo e
realizando a análise de similaridade com outros isolados disponíveis no GenBankTM,
observou-se a formação de um “cluster” entre três sequências de amostras de Caxias e
Cachoeiras de Macacu (39C, 56C e 49CM). As outras amostras permaneceram em um outro
“cluster” juntamente com a maioria dos protótipos obtidos no GenBankTM
. Essa alta
similaridade é esperada uma vez que o gene codifocador da gp19 é altamente conservado, por
isso seu estudo é aplicado para produção de testes sorológicos e vacinas,como descrito por
Doyle et al. 2006. Mesmo havendo uma mutação silenciosa no nucleotídeo 312, as seqüencias
ainda sim, continuam extremamente conservadas.
Das 17 amostras positivas para E.canis, duas (56C e 70C) apresentaram amplificação na
reação de PCR para o gene que codifica para a proteína gp36. A análise de similaridade da
região codificadora da proteína gp36 revelou que a amostra 56C permaneceu distante da
amostra 70C, e dos demais protótipos obtidos no GenBankTM
, incluindo o isolado São Paulo,
Brasil (DQ146154).
84
Quando observa-se o gráfico de similaridade a amostra 56C encontra-se separada
formando um “cluster” claramente distinto dos outros, onde se encontra a amostra 70C, o que
evidencia que a 56C é claramente distinta das outras, uma vez que o esperado era a formação
de um “cluster” junto com a amostra de São Paulo e a 70C.
Doyle et al. (2005) relataram que a região 5’-terminal de 429pb é conservada entre os
genotipos analisados (Jake, Louisiana, Florida, Demon, Carolina do Norte e Oklahoma)
enquanto os genotipos de São Paulo e Camarões contém as sequências mais divergentes com
quatro diferenças nos aminoácidos. Nesse estudo, as amostras encontradas foram comparadas
com os genótipos conservados entre eles depositados no GenBankTM
, o genótipo de São Paulo,
o genótipo de Camarões e os quatro genótipos diferentes encontrados em Formosa, com suas
sequências igualmente depositadas.
Analisando a similaridade entre as amostras quando comparamos a região 1 (5’-
terminal) altamente conservada, a amostra 56C aproximou-se mais das amostras de Formosa
(91,5%) que a a mostra 70C (82,0%) que por outro lado tem identidade maior com as demais
amostras variando de 99% a 99,7%. Isso implica em um estudo mais apurado entre essas
diferenças uma vez que a gp36 é umas das primeiras proteínas estudadas para elucidar a
resposta espécie-específica na fase aguda da infecção por E. canis (CARDENAS,et al. 2007) e
a amostra 56C sendo mais próxima de um genótipo diferente do que circula atualmente no
Brasil pode envolver uma mudança na manifestação antigênica dificultando a utilização desta
região para fabricação de testes sorológicos (HSIEH, et al. 2010).
Analisando a região 2, o número de repetições em tandem (TEDSVSAPA) variou de 5
(70C) a 8 cópias (56C). Como conseqüência dessa variação, o gene completo que codifica a
proteína gp36 apresentou variações no número de nucleotídeos e de aminoácidos. Na amostra
70C o tamanho do gene foi de 697pb, enquanto que para a amostra 56C, o fragmento
seqüenciado apresentou 788pb. Como descrito por McBride et al. (2006), as repetições dos
aminoácidos permaneceram conservadas (VNTR) nas duas amostras e a 56C apresentou
número de repetições diferentes das amostras de Formosa. Outro ponto importante a ser
discutido é que a variação no número de repetições em “tandem” pode resultar em mudança
na conformação da proteína alterando sua função e o comportamento biológico do agente
(ALBERT et al. 2002).
A análise obtida a partir do alinhamento do fragmento 3’ terminal de aproximadamente
90 pb do gene codificador da proteína gp36 das amostras 56C e 70C revelou que a amostra
85
70C apresenta maior similaridade com o isolado de Florida, Oklahoma e Louisiana (97,9%)
todos descritos nos Estados Unidos .
A amostra 56C apresentou maior similaridade (99%) com os isolados Sao Paulo,Jake,
Demon, North Carolina e Cameroon 71 além de outros quatro genótipos de E.canis, descritos
em Formosa o que não caracteriza que ela seja idêntica aos outros genótipos que surgiram em
Formosa e sim uma outra linhagem que se aproxima mais delas.
Ao confrontar os resultados obtidos nas reações de PCR com a observação de
inclusões em plaquetas, em uma amostra positiva na pesquisa de hemoparasitas e negativa em
todas as reações moleculares considerou-se a hipótese de erro na visualização (FRENCH e
HARVEY, 1983; HARRUS et al., 1997a; MYLONAKIS et al., 2003) e a inclusão estar
relacionada à ativação plaquetária (HARVEY, 2001).
Os resultados positivos para E.canis que não apresentaram inclusões, foram
relacionados à possibilidade do parasito não ser encontrado na fase crônica da doença e/ou
uma baixa parasitemia (FRENCH e HARVEY, 1983; HIBLER et al., 1986; WOODY e
HOSKINS, 1991; BREITSCHWERDT, 1995), descartando o erro de análise.
Em relação aos achados hematológicos encontrados, tanto o grupo infectado com E.
canis quanto A.platys apresentou valores médios para o hematócrito e contagem de plaquetas
abaixo do valor de referência.
Os animais infectados com A.platys apresentaram anemia e trombocitopenia discretas,
corroborando com Hoskins (1991), diferente dos infectados por E. canis, que apresentaram
valores médios de hematócrito moderadamente diminuídos (JAIN, 1993) Isso acontece
porque a infecção por A. platys geralmente é assintomática e a anemia que ocorre durante a
doença clínica é classificada como normocítica/normocrômica. As mudanças no eritrócito e
na concentração de ferro sérico são semelhantes à descrita na anemia da doença inflamatória,
que tem como característica ser discreta. (BAKER et al., 1988). A trombocitopenia ocorre de
forma cíclica, e é classificada como regenerativa, pois uma hiperplasia megacariocítica é
observada na medula óssea de cães infectados (BAKER et al., 1987).
Já o comportamento patogênico da E. canis foi diferente do A.platys, uma vez que a
pancitopenia geralmente se dá por hipoplasia da medula óssea (WOODY & HOSKINS, 1991;
NEER, 1998).
HARRUS et al. (1998b) propuseram que a E. canis induza a produção e/ou elaboração
de um fator esplênico, que irá suprimir a hematopoiese. É possível que esse fator possa
desempenhar um papel importante na supressão da medula óssea que ocorre durante a fase
86
crônica da infecção por E. canis.
Quando há associação entre os parasitas como no caso do animal 47M, os sinais
clínicos e os parâmetros hematológicos se agravam, podendo mudar o quadro do animal e
interferir na resposta a terapia de modo negativo (KLAG et al., 1991). A anemia e
trombocitopenia encontradas foram graves, com valores de 17% para o hematócrito e 58.000
para contagem de plaquetas (JAIN, 1993) confirmando o já descrito por Ewing e Buckner,
(1965), Klag et al., (1991) e Suksawat, (2001a).
Os valores médios das leucometrias globais nos quatro grupos analisados mativeram-
se dentro do intervalo de referência para a espécie. Breitschewerdt (2000) afirma que a
leucometria global na EMC tem caráter variável, não apresentando um padrão durante a
infecção.
Associando os achados clínicos e os resultados dos testes moleculares observa-se que
a amostra 56C foi coletada de um cão vacinado, vermifugado, apresentando carrapatos, tendo
como queixa principal apatia, e sinais clínicos característicos como diminuição de peso,
mucosas hipocoradas, hepatomegalia e esplenomegalia. Os achados hematológicos foram
anemia (hematócrito 12%) trombocitopenia (37.000/uL) e leucocitose (27.100/uL). A amostra
70C foi coletada de um filhote, não vacinado, vermifugado, sem carrapatos, apresentando
apenas como queixa principal vômitos, sem sinais clínicos evidentes. Como achado
hematológico apresentou apenas trombocitopenia (46.000/uL). Essas diferentes características
clínicas podem estar relacionadas a dois possíveis genótipos circulando por Duque de Caxias,
uma vez que em Formosa circulam 2 genótipos diferentes de E. canis (HSIEH et al. 2010).
Analisando a queixa principal relacionada ao animal 56C e seus sinais clínicos e
hematológicos, nota-se que são característicos de uma possível infecção por E. canis
corroborando com Woody & Hoskins, (1991) e Neer, (1998). O que não acontece com o
animal 70C. Unindo as diferentes características clínicas e hematológicas dos dois animais, as
diferenças nas seqüências do gene codificador da proteína gp36 e a descrição de Hsieh, et al.
(2010) da co-existência de genótipos diferentes em Formosa, fica a evidência da existência da
mesma situação no Brasil uma vez que a amostra 56C é diferente da amostra de São Paulo e
da 70C, geneticamente similar a maioria dos isolados do mundo, mesmo mantendo
características clínicas e hematológicas clássicas da EMC.
87
7. CONCLUSÃO
Com a caracterização dos genes codificadores da proteína gp36 foi possível afirmar
que circulam no Rio de Janeiro pelo menos 2 genotipos de E. canis.
Existe relação das características clínicas, curso da doença e comportamento biológico
do agente com esses genótipos existentes circulantes.
88
8. OBRAS CITADAS
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105
ANEXOS
106
Termo de autorização
Eu, _____________________________________________, autorizo a colheita de sangue
total do meu cão _____________________, raça _______________________, idade ___,
sexo ___, para fins de pesquisa relacionadas a hemoparasitoses, sem custo para a
Universidade Federal Fluminense e/ou para o proprietário e os demais responsáveis pela
pesquisa.
Rio de Janeiro,
data:_____________________
Ass.___________________________________________
Termo de autorização
Eu, _____________________________________________, autorizo a colheita de sangue
total do meu cão _____________________, raça _______________________, idade ___,
sexo ___, para fins de pesquisa relacionadas a hemoparasitoses, sem custo para a
Universidade Federal Fluminense e/ou para o proprietário e os demais responsáveis pela
pesquisa.
Rio de Janeiro,
data:_____________________
Ass.___________________________________________